Corso Avance III

Topspin 2.1 – introduzione
Corrado Dallacosta
[email protected]
1
Il mio primo esperimento
1. Introduzione all’uso di
2. Preparazione all’acquisizione
3. Scelta dell’esperimento NMR
2
•
Struttura base di
•
Parametri e comandi di acquisizione.
•
Parametri e comandi di processing.
•
Parametri e comandi di plot.
Cosa è
Dalla release letter…..TOPSPIN is an integrated software package for:
• Displaying, printing and plotting spectra
• Exporting displays and plots in various graphics and metafile formats
• Importing NMR data from files of various formats
• Archiving spectra in various formats such as JCAMP-DX and ZIP. E-mailing data
• Processing 1D-3D fids and spectra: window multiplication, various transforms (Fourier,
Hilbert, DOSY), phase correction, baseline correction, integration, peak picking, linear
prediction, smoothing, adding spectra etc.
• Displaying multiple superimposed spectra (1D and 2D).
• Simulating 1D and multi-dimensional fids, given a pulse program and a spinsystem
(“virtual spectrometer nmr-sim”)
• Calculating T1/T2 relaxation times, multiplet analysis. Automatic 1D, 2D and 3D peak
picking and integration
• Line shape analysis of solids spectra, fitting peaks with Lorentzian and Gaussian line shpe
models, deconvolve, overlapping peaks
• Data acquisition with Bruker Avance type spectrometers
• Supporting automated and walk-up spectrometers (ICON-NMR)
• Remote spectrometer control including web-enabled ICON-NMR
• Adding user defined functionalities to TOPSPIN (AU programs, Macros and Python
programs)
3
In altre parole
…..è un software che consente di
gestire lo spettrometro AVANCE, quindi
di acquisire, elaborare e analizzare dati
NMR.
4
COME LANCIARE TOPSPIN
Click sul’icona
5
sul desktop
E SE NON PIACE…..SI CAMBIA
con il comando
set
6
IL DATASET
Il DATASET rappresenta l’insieme di file e directory in cui il
FID, il corrispondente spettro e tutti i parametri di un
esperimento, vengono memorizzati sul computer. E’
definito dai seguenti parametri_
NAME
Nome del data set
EXPNO
Numero dell’esperimento (directory
contenente files per acquisizione fid, acqu,
acqus, etc..)
PROCNO
Numero del processing (directory contenente
files per processing 1r, 1i, proc, procs, etc..)
DU
Unita’ disco
USER
Utente
TYPE
nmr (sempre)
7
Come si definisce un dataset
Il comando edc (o new) consente di accedere ai parametri
che definiscono il dataset. Questi parametri sono
modificabili in modo da:
• Richiamare un data set preesistente
• Creare un nuovo dataset con i parametri d’acquisizione,
di processing di plot di quello originale.
• Creare un nuovo dataset con i parametri d’acquisizione, di
processing di plot di libreria (solo
8
)
TopSpin: apertura dataset
Ci sono diversi modi per aprire un dataset:
MENU: File --- > open
click su
Drag and drop da browser........
Visualizzare il dataset :
C:/Bruker/Topspin/data/CORSO/PROTONE1/1/pdata/1
9
TopSpin: ricerca dataset
VITA QUOTIDIANA DI UN LABORATORIO NMR
Il numero di dataset cresce, il disco si riempie e il dataset di
cui si ha bisogno non si trova …..
MENU: Edit--- > Find data [CTRL+F]
Cercare nella directory dell’utente corso tutti i dataset
acquisiti nel 2009.
10
TopSpin: creare un nuovo dataset
Ci sono diversi modi per creare un nuovo dataset:
•
MENU: File --- > new
•
click su
•
Digitare su linea di comando edc oppure new
Creare il dataset :
C:/Bruker/Topspin/data/CORSO/PROTONE1/2/pdata/1
Cosa succede con il comando iexpno ?
________________________________
11
Cosa fare prima di acquisire
Prima dell’acquisizione di uno spettro ci sono alcune
operazioni preliminari da seguire:
•
Il lock
• La sintonia del probe
• (controllo della temperatura)
• L’omogeneità del campo magnetico
12
Instabilità del campo magnetico
Il campo magnetico non è costante:
• temperatura ambiente
• pressione atmosferica
• intorno elettromagnetico
• drift del campo magnetico
Il campo deve essere controllato
⇓
“secondo spettrometro” dedicato al deuterio
13
Controllo tramite lock
LOCK DIGITALE ⇒ BSMS (Bruker Smart Magnet System):
Lavora a frequenza variabile e campo fisso (B0 costante): le distanze dal
TMS sono pressoché costanti e si può usare come riferimento la scala in
ppm
• Il circuito di lock effettua il controllo sul magnete osservando il
segnale NMR del deuterio del solvente;
• Affinché il circuito di controllo funzioni correttamente è necessario
porsi in risonanza con il solvente deuterato;
• Ogni solvente deuterato ha una diversa frequenza di risonanza,
pertanto è necessario modificare la frequenza di eccitazione.
• L’unità di lock controlla il drift del campo elaborando il segnale in
dispersione del deuterio
14
Controllo tramite lock
Il ricevitore nel sistema di lock è progettato in modo tale che quando l’intensità
del campo è corretta (cioè viene misurata una frequenza del deuterio corretta),
non vengono eseguite correzione sul campo. Viceversa, quando l’intensità del
campo cambia (“il campo si sposta”) una corrente in una bobina speciale (bobina
Ho) posizionata all’interno del sistema di shim del magnete viene cambiata, in
modo da far tornare l’intensità del campo magnetico al valore correttola qualità e
la velocità del controllo dipendono strettamente dal tipo di solvente utilizzato e,
in particolare, dalla larghezza del segnale del deuterio.
15
Parametri del lock
Il LOCK DIGITALE è controllato da 3 parametri, impostati
automaticamente per ogni solvente, è responsabilità dell’
amministratore dello spettrometro impostarli correttamente.
I parametri possono essere poi OTTIMIZZATI dall’utente durante
la sessione di lavoro.
Questi parametri permettono di ottenere le migliori condizioni di
controllo del campo magnetico per ogni singolo solvente e per
ogni condizione operativa:
LOOP GAIN
⇔
guadagno del lock (-80...0 dB)
LOOP TIME
⇔
costante di integrazione (0,001...1,0 s)
LOOP FILTER
⇔
frequenza filtro low-pass (1...200 Hz)
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Come agiscono i parametri di lock
LOOP GAIN: indica quanto è intensa la reazione alla perturbazione. Un valore
alto comporta una più intensa correzione, se il solvente ha un rapporto S/N
basso (sul 2H), un loop gain troppo elevato genera una modulazione sul H0,
che si ripercuote sullo spettro.
LOOP TIME: indica quanto è veloce la reazione alla perturbazione. Un tempo
lungo è necessario per stabilizzare il lock di solventi con un rapporto S/N del
deuterio basso.
LOOP FILTER: indica lo ‘smoothing’ del segnale di lock per eliminare rumore.
Questi parametri possono essere ottimizzati con il comando: “xau loopagj”.
Migliore è il rapporto S/N del 2H, migliore è lo spettro.
LOCK POWER: deve essere più alto possibile (3dB sotto la saturazione);
LOCK GAIN: deve essere tale per cui la linea del lock rimane nella parte alta
dello schermo;
17
Sistemi con lock digitale
I principali comandi per il lock sono:
lockdisp
per visualizzare la finestra del lock
edlock
mostra la tabella con i parametri i
lock di ciascun solvente che possono
eventualmente essere modificati
lock <solvente>
per agganciare il segnale di lock del
solvente
18
edlock
19
Selezionare il Solvente Corretto
Con il comando lock appare la
finestra con i vari solventi
oppure
si digita lock + solvente
20
Comandi & Parametri di lock
….
21
Oppure dalla barra delle applicazioni
La sintonia del probe
All’interno del probe esiste un circuito risonante per
ciascuno canale: si può osservare e/o disaccoppiare.
• Cosa vuol dire fare la sintonia?
• Sintonizzare
(TUNING) alla frequenza di lavoro il
circuito di RF (probe, HPPR, cavi, Amplificatori).
• Accordare
l’impedenza del circuito pari a quella della
linea di trasmissione ad essa connessa, cioè 50Ω per
avere
max
(MATCHING).
22
potenza
assorbita
e
riflessa
nulla
Come si fa la sintonia ?
Con il comando edasp si definiscono i nuclei su cui
lavorare
Con i comandi atma / atmm / wobb
un segnale a bassa potenza e frequenza variabile viene
trasmesso
al
probe
e
tuning
ottimizzati
[automaticamente
via
a
matching
software
vengono
con
atma,
manualmente via software con atmm, manualmente con
wobb] minimizzando la potenza riflessa che è mostrata
nella finestra di acquisizione in funzione della frequenza da
SFO1+wbsw/2 e SFO1-wbsw/2 e dai led del display
dell’HPPR (High Performance PReamplifier).
23
Cosa si vede?
HPPR
Schermo PC
Probe
24
Il controllo della temperatura: EDTE
• In alcuni esperimenti e per alcuni campioni è importante
lavorare a temperatura nota e controllata
• La variazione di temperatura influenza a volte il tuning e
spesso lo shimming del campione, raramente l’impulso
• Per attivare il controllo di temperatura si digita EDTE da
riga di comando
Disomogeneità di Campo
Il campo magnetico statico non è perfettamente omogeneo
all’ interno della sonda
La rotazione media la
disomogeneità sul piano XY
28
Correzione del Campo Magnetico
È necessario correggere le disomogeneità introducendo
delle correnti aggiuntive (shim), modificabili dall’ operatore
e ottimizzate in funzione della sonda, del campione, del
solvente, della temperatura etc.
Le correnti aggiuntive operano nello spazio tridimensionale
introducendo delle correzioni di tipo armonico
29
Ottimizzare omogeneità campo magnetico:
manualmente
Per ottimizzare le shim tipicamente si procede in base a un
criterio empirico: si variano le singole shim e si osserva se la
variazione comporta un miglioramento valutando il livello di
lock, un FID / lo spettro acquisito successivamente. Il problema
è complicato in quanto le correnti si influenzano l’una con
l’altra: una shim già ottimizzata deve essere verificata dopo le
successive ottimizzazione alle altre shim.
In generale si parte delle shim assiali con campione in
rotazione, quindi le radiali con campione fermo, poi le assiali
con campione in rotazione o statico a seconda delle condizioni
ottenute, …………………
30
Ottimizzare omogeneità campo magnetico:
automaticamente
gradshim
31
topshim
Effetti delle shim assiali…
32
…e radiali
33
Spettro acquisito con shim buone
spettro 1H ciclosporina in benzene-d6
7.7
ppm
7.30
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
ppm
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
ppm
Spettro acquisito con shim z non corrette
spettro 1H ciclosporina in benzene-d6
Correggibile con topshim!!!
7.8
7.6 ppm
7.3
ppm
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5
ppm
Spettro acquisito con shim x e y non corrette
spettro 1H con shim X e Y "sbagliate"
NON Correggibile con topshim!!!
7.8
7.6 ppm
7.3
8
7
6
5
ppm
4
3
2
ppm
Piccola precisazione
•
La shimmatura automatica sui 3 assi è possibile MA:
• Richiede una particolare scheda elettronica
• Richiede campioni in acqua
•
In pratica, si può:
• Verificare la shimmatura sui 3 assi con un campione in acqua
• Ottimizzarla a mano sul campione standard per la lineshape o
• Direttamente sul campione
•
N.B. non è necessario ricontrollare le shim x e y su tutti i campioni
Scelta dell’esperimento: one pulse
L’esperimento più semplice che si può effettuare con uno
spettrometro
NMR
e’
l’acquisizione
di
uno
spettro
protonico mediante l’applicazione di un singolo impulso di
eccitazione.
L’esperimento e’ semplice in quanto si perturba la
magnetizzazione di un solo nucleo, il protone, con elevata
abbondanza naturale e ottima sensibilità.
38
Esperimento singolo impulso: zg
L’esperimento può essere schematizzato nel modo
seguente:
D1
D1 = Relaxation Delay
P1 = Impulso 90°
AQ = Acquisition time
39
P1
AQ
Impulso di radiofrequenza
In tutti gli esperimenti NMR l’impulso gioca un ruolo
fondamentale in quanto dalla sua frequenza, dalla sua
potenza e dalla sua durata dipende la perturbazione del
sistema e quindi la magnetizzazione osservabile.
In TOPSPIN questi parametri sono definiti come:
p0-p31
Durata dell’impulso in [µs]
SFO1
Frequenza dell’impulso [MHz]
pl0pl0-pl31
Potenza (attenuazione)[dB]
40
Calibrazione dell’impulso
La combinazione della durata dell’impulso e della sua
potenza determinano di quanto viene ruotato il vettore
magnetizzazione (flip-angle).
Definita quindi la potenza, si acquisiscono una serie di
spettri modificando la durata dell’impulso e osservando
come varia l'intensità del segnale:
AU program: PAROPT o POPT
41
Calibrazione dell’impulso
Per calibrare il segnale bisogna cercare di mantenere le
seguenti condizioni sperimentali:
•
NS = 1
•
Impostare O1P in corrispondenza del segnale che si vuole
osservare.
•
Usare un campione sufficientemente concentrato per
avere un segnale con una sola scansione, ma non troppo
concentrato onde evitare effetti di diffusione molecolare.
•
il probe deve essere sintonizzato
•Attenzione
42
al D1
Calibrazione dell’impulso
α = 30o
z
α = 180o
z
Mz
Mz
My
x
y
y
x
α = 120o
z
Mz
Mz
My
x
43
α = 270o
z
y
My
x
y
AU-Programme PULSECAL
pulses (10% duty cycle)
acquisition
MC
P.S.C. Wu et al: J. Magn. Reson. 176, 115 (2005)
PROSOL
Lunghezza degli impulsi e livelli di potenza sono parametri che dipendono
dal tipo di probe e dal solvente. Questi parametri possono essere salvati
nella tabella del prosol. Si richiama questa tabella con il comando
edprosol
45
Durata e potenza dell’impulso
La durata e la potenza dell’impulso sono correlati da una
relazione di proporzionalità inversa: maggiore e’ la potenza, più
corto è l’impulso per ruotare la magnetizzazione dello stesso
angolo.
Gli amplificatori degli strumenti Avance hanno una risposta
lineare: ogni 6dB di attenuazione l’impulso raddoppia:
PL1 (Db)
P1 (µs)
-6
5
0
10
6
20
La finestra spettrale eccitata e’ correlato da una relazione di
proporzionalità inversa con l’impulso a 90 gradi.
AU program: PULSE
46
Banda di eccitazione: impulsi rettangolari
Uno spettro NMR è in generale composto da
più righe a frequenze diverse
tp
time
RF
Ω -1/tp
Ω +1/tp
frequency
160
140
120
100
80
60
40
20
0
-20
-40
ppm
Ω
Excitation profile = (sinc(0.5(
(sinc(0.5(ω
ω-Ω)tp)
La banda di frequenze
eccitate dipende
dall’inverso del tp.
Il profilo di eccitazione
è definito dalla
funzione sinc.
Un tp corto mi serve
per avere una
eccitazione uniforme su
tutta la banda di
frequenze centrate
sulla portante Ώ.
IMPULSO 1H
Calibrazione impulso a 0 dB:
PAROPT:
__________________________
POPT:
__________________________
PULSECAL:
__________________________
Calcolo impulsi 1H:
35 us @ ______ dB
Banda eccitazione: ____________________
100 us @ _____ dB
Banda eccitazione: ____________________
48
I parametri di acquisizione
Diversi comandi di TOPSPIN consentono di impostare i
parametri d'acquisizione
• EDA
EDit Acquisition Parameters
• ASED
Automatic Setup EDditor
• WRPA
Crea una copia del dataset
• RPAR
Richiama i parametri
Oppure click sulla finestra AcquPars
49
EDA
50
EDA
Trova un parametro
“Compatta” i sottomenu della pagina
Modifica le dimensioni del dataset
edasp
getprosol
Mostra i parametri di status
51
ALCUNI PARAMETRI IN EDA
•
PULPROG
PULse PROGram
•
TD
Time Domain
•
NS
Number of Scans
•
DS
Dummy Scans
•
D0-D63
Delay [s]
•
P0-P63
Impulsi [µs]
•
SW,SWH
Spectral Width
•
AQ
Aquisition Time = DW*TD
•
RG
Receiver Gain
52
ALCUNI PARAMETRI IN IN EDA
•NUCLEI
EDASP
•
NUC1-8
Nucleo su canale 1-8
•
BF1-8
Basic Frequency NUC1-8
•
SFO1-8
Spectrometer Frequency
•
O1-8,O1-8P
frequency Offset NUC1-8
in Hz o in ppm
NOTA: SFO1-8 = BF1-8 + O1-8
•
PL0-31
Power Level (AVANCE) PL si misurano
in attenuazione -6…120dB
•
CPDPRG1-8
Composite Pulse Decoupling PRoGram
•
PCPD1-8
Impulso per CPDPRG1-8
53
ASED
54
Sintassi pulseprogram: zg
55
Sintassi pulseprogram: zg
;zg
;avance-version
;1D sequence
D1
P1
AQ
#include <Avance.incl>
1 ze
2 d1
p1 ph1
go=2 ph31
wr #0
exit
ph1=0 2 2 0 1 3 3 1
ph31=0 2 2 0 1 3 3 1
;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default)
;p1 : f1 channel - high power pulse
;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1
56
RPAR
Il comando RPAR permette di caricare automaticamente tutti i
parametri (acquisizione, processing, plot ...) in un dataset.
Nella libreria standard Bruker sono già inclusi numerosi set di
parametri. ATTENZIONE: Alcuni parametri di acquisizione sono
specifici di ciascuno strumento e di ciascuna configurazione
(impulsi e livelli di potenza corrispondenti), questi sono salvati
secondo criteri di sicurezza (massima attenuazione) e devono
quindi essere impostati dall’utente prima dell’acquisizione
dell’esperimento.
L’utente può salvare i parametri specifici che ha determinato
per un esperimento mediante il comando WPAR e poi
richiamarli con RPAR.
57
DATASET DA ACQUISIRE – 1 -
CREARE IL DATASET
C:/Bruker/Topspin/data/corso/protone1/10/pdata/1
E IMPOSTARE GLI OPPORTUNI PARAMETRI DI
ACQUISIZIONE per acquisire uno spettro protonico da -2
a 11 ppm, accumulando 32 scansioni, salvando il dato
acquisito ogni 8 scansioni.
ALTRI PARAMETRI?
58
DATASET DA ACQUISIRE – 2 -
CREARE IL DATASET
C:/Bruker/Topspin/data/corso/protone1/11/pdata/1
ACQUISIRE uno spettro protonico da -2 a 11 ppm,
usando il comando rpar
59
TopSpin: acquisizione mediante icone
Parte acquisizione [zg]
Ferma acquisizione e
salva FID [halt]
Ferma acquisizione e
NON salva FID[stop]
Mostra finestra
acquisizione [acqu]
Lock display
[lockdisp]
60
Calcolo tempo
esperimento [expt]
Imposta RF da posizione
cursore [.setof123]
Imposta SW uguale
all’attuale regione del
display e SFO1
al centro della regione
[.setsw]
Apre la lista di
frequenze [.freqlist]
FID
61
Spettro
62
FID ---> SPETTRO
Mediante il comando ft si applica una trasformata di Fourir al FID e si
ottiene lo spettro, tipicamente questo non si presenta nell’aspetto
atteso/desiderato.
Per questo vedremo ora e principali operazioni di elaborazione del fid e di
analisi dello spettro:
- Applicazione di funzioni di pesatura del FID
- correzione di fase
- peak picking
- integrazione
- plotting
- ……………………
- ……………………
63
Processing
•
SI
Size SI=TD/2
•
SR
Solvent Reference
•
HZpPT
Resolution
•
WDW
window type (EM, GM, SINE, QSINE, …)
•
LB
Line broadening
•
GB
Gaussian moltiplication
•
SSB
Sine bell shift
•
PH_mod
phase correction (PK, MC, PS)
•
CY
fattore di scala verticale
•
PSCAL
interpreta il fattore di scala verticale CY
64
Effetti sul FID
Risoluzione
Omogeneità del magnete
Risoluzione digitale
Natura del campione
Rapporto S/N Omogeneità del magnete
Sensibilità probe e ricevitore
Concentrazione del campione
Condizioni di acquisizione
SI POSSONO APPLICARE FUNZIONI AL FID PER AUMENTARE
RISOLUZIONE E S/N.
65
Funzioni per migliorare la sensibilità
em
LB = 5
LB = 0
66
Funzioni per migliorare la risoluzione
sin2
sin
gm
FID
FID + GM
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
(sec)
0.6
0.7
0.8
0.9
9.30
9.20
9.10
(ppm)
9.00
8.90
Analisi delle funzioni: Processing – window function [wm]
67
CORREZIONE DI FASE
Le righe dello spettro NMR sono composte da una componente in
assorbimento e da una in dispersione. Questa NON IDEALITA’deriva:
- dalla differenza di fase degli impulsi RF e del ricevitore (PHC0:
questa correzione è indipendente dalla frequenza, cioè è uguale per
tutti i segnali).
- dal fatto che l’acquisizione del segnale NMR non comincia subito al
termine dell’impulso RF, ma dopo un delay D (PHC1: dipende
linearmente dalla frequenza).
Entrambe le correzioni usano i dati reali ed immaginari che sono
stati memorizzati indipendentemente in modo da combinarli ed
ottenere lo spettro in assorbimento puro
68
CORREZIONE DI FASE
Richiamare il dataset
C:/Bruker/Topspin/data/corso/protone1/10/pdata/1
Correggere manualmente la fase e determinare i
parametri di correzione di fase:
___________________ ; ______________________
Ritrasformare il FID e correggere automaticamente la
fase
Ritrasformare il FID mantenendo la stessa correzione di
fase e salvando il risultato in
69
PEAK PICKING
Richiamare il dataset
C:/Bruker/Topspin/data/corso/protone1/10/pdata/1
Fare il pick picking mediante il comando pp
Fare il pick picking mediante la subroutine
Analizzare la peak list
70
INTEGRAZIONE
L’integrazione degli spettri NMR + usata per determinare l’area
delle singole risonanze e calcolare i rapporti relativi
Richiamare il dataset
C:/Bruker/Topspin/data/corso/protone1/10/pdata/1
Fare il pick picking mediante il comando int
Fare il pick picking mediante la subroutine
Analizzare la integral list
71
E PER PLOTTARE ?
72
73