Dopo aver effettuato la PCR,
all’interno della soluzione oltre
al tratto amplificato sono
presenti: primers, dNTPs, Taq
polimerasi e tampone di
reazione
Inizialmente i 20 µl dell’amplificato
vengono trasferiti in una provetta da 1,5
ml, a cui si aggiungono :
§ 30 µl di H2O bidistillata e autoclavata,
per ottenere un volume di 50 µl.
§ 5 µl di ammonio acetato 5 M
§ 100 µl di etanolo al 100%
§ 20 minuti a -20°
§ centrifugazione a 14.000 RPM per 15
minuti
§ Aspirare la fase liquida
§ 200 µl di etanolo 80%
§ Si effettua una seconda
centrifugazione a 14.000 RPM
per 15 minuti, nuovamente si
aspira la fase liquida senza
toccare il pellet
§ Liofilizzare
Marcatura
La reazione di marcatura è una variante della
reazione a catena della polimerasi (PCR).
Big Dye:
• dNTPs,
• dideossinucleotidi (ddNTPS ) mancanti del
3’-OH oltre che del 2’-OH,
• Buffer per stabilizzare la reazione,
• MgCl2 che si inserisce nel sito attivo della
Taq favorendo l’attacco al gruppo 3’-OH,
• Taq polimerasi.
Nella reazione di sequenza inoltre
viene usato un solo primer, che per
convenzione è il primer L.
L15996 per il tratto HVS-1 e L29 per
HVS-2.
I ddNTPs sono marcati con
fluorocromi, ognuno diverso per ogni
base.
I quattro fluorocromi daranno una
diversa emissione quando saranno letti
dalla macchina del sequenziatore
Precipitazione dei prodotti marcati
L’amplificato viene trasferito s una provetta
da 1,5ml a cui si aggiungono
§ 2 µl di sodio acetato 3 M
§ 50 µl di etanolo al 95%.
§ T ambiente per 15 minuti.
§ centrifuga per 30 minuti a 2500 RPM. Al
termine dei 30 minuti
§ 150 µl di etanolo al 70%
§ nuova centrifugazione a 14.000 RPM per 10
minuti.
§ Liofilizzare
Preparazione del prodotto marcato per il
sequenziamento
§ Il templato liofilizzato ottenuto dalla
precipitazione deve essere denaturato
prima di essere portato al sequenziatore
automatico. Le condizioni per questa
preparazione sono le seguenti:
§ Si aggiungono 20 µl di formammide al
materiale liofilizzato;
§ Si conserva in un ambiente fresco per
evitare una rinaturazione e si porta al
sequenziatore.
SEQUENZIAMENTO
Il sequenziamento permette di
ricostruire l’ordine delle basi
azotate che si susseguono
all’interno di un tratto di DNA. La
tecnica del sequenziamento
automatico prende spunto dal
metodo Sanger,
dove si ha l’utilizzo di un isotopo
radioattivo dello zolfo.
Metodo Sanger
Il metodo di Sanger prevede la sintesi di
nuovi filamenti usando ddNTPs marcati di
solito con 35S.
La reazione di sequenza è suddivisa in
provette ciascuna contenente DNA stampo,
primer, DNA polimerasi, 4 dNTPs e un
ddNTPs radioattivo.
Al termine della reazione si ottengono tanti
frammenti tutti con l’estremità 5’ in comune
ma con diversa lunghezza perché ognuno
bloccato in posizione diversa durante
l’allungamento.
Il sequenziamento automatico usato per questo
lavoro usa fluorocromi non radioattivi e non
tossici per marcare i diversi ddNTPs e prevede
l’uso dell’elettroforesi capillare.
Il sequenziatore automatico che è stato usato,
ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Perkin Elmir
Applied Biosystem), possiede 4 capillari.
Questo strumento effettua un sequenziamento
mediante un'elettroforesi capillare usando come
mezzo di separazione un polimero incluso nel
capillare di silice.
La soluzione contenente l’amplificato è
posta a contatto con l’anodo del capillare a
cui viene applicato un potenziale elettrico.
Le molecole del campione cominciano quindi
a migrare con velocità differenti lungo il
capillare. I frammenti migreranno nel
capillare dal più piccolo al più
lungo fin quando non arriveranno a una zona
detta “finestra del capillare” dotata di un
colore più trasparente rispetto al resto del
capillare.
I frammenti di DNA marcati, colpiti da una
sorgente luminosa (laser ad Argon),
emettono una fluorescenza che viene
rilevata, man mano che si spostano lungo il
gel elettroforetico, da un sensore. La
fluorescenza rilevata dal sensore proviene
da quattro differenti colori ognuno dei quali è
associato ad una base nucleotidica:
adenina, citosina, timina e guaina.
La rappresentazione dei risultati
ottenuti viene effettuata tramite un
elettroferogramma. In esso ogni picco
rappresenta una base letta durante il
passaggio nel capillare in base alla
remissione dei fotoni di DNA in seguito
a sollecitazione con laser. Inoltre più
molecole saranno colpite dal laser e
più alto sarà il picco. È così possibile,
con l’aiuto di programmi appositi,
individuare la successione delle basi
che formano la sequenza.
Aplotipo: set di mutazioni ereditate insieme
(diverso dal concetto di aplotipo in senso
genetico).
Aplogruppo : un insieme di aplotipi tra loro
differenti, tutti però originati dallo stesso
aplotipo ancestrale. In particolare, tutti gli
aplotipi di un aplogruppo
presentano mutazioni a singolo nucleotide
(SNPs) presenti nella forma ancestrale, più
ulteriori polimorfismi che li rendono specifici e
differenti tra di loro.
