BIOPOLIMERI
Come ogni anno, pubblichiamo sul Magazine un articolo dedicato al Premio Nobel per la Chimica. Il
Premio 2006 è stato assegnato a Roger Kornberg, figlio di un altro premio Nobel: Arthur. Entrambi gli
scienziati si sono dedicati allo studio degli acidi nucleici, biopolimeri che svolgono numerose funzioni
e non solo quella di “banca dati” della cellula. L’illustrazione del lavoro svolto da Roger Kornberg ci è
stata gentilmente offerta, nell’articolo che segue, dalla Dott.ssa Bruna Scaggiante, biologa molecolare
presso il Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Chimica della Macromolecole dell’Università di Trieste,
che ringrazio sentitamente. L’articolo di Bruna mette bene in risalto non solo le ricerche avanzate e la
mole di lavoro svolta da Kornberg, ma anche la complessità dei meccanismi biochimici che presiedono
a parte della sintesi delle proteine necessarie alla vita delle nostre cellule.
Roberto Rizzo
IL PREMIO NOBEL
PER LA CHIMICA 2006
Bruna Scaggiante*
l 4 ottobre 2006, Roger Kornberg, professore di
medicina presso la Stanford University
(California) e figlio d’arte del Premio Nobel
Arthur Kornberg, ha ricevuto il prestigioso premio
Nobel per la Chimica per il suo lavoro sulla trascrizione genetica degli eucarioti. Mentre il padre
ha scoperto le DNA polimerasi ed il modo in cui
l’informazione genetica è trasferita durante il processo della replicazione, il figlio Roger ha descritto
nel dettaglio come negli eucarioti (cellule che
hanno il nucleo) l’informazione genetica viene
copiata dal DNA nell’RNA messaggero (mRNA)
che poi sarà tradotto in proteine. La trascrizione è
un processo enzimatico eseguito dalla RNA polimerasi che è controllato e regolato finemente per
consentire alla cellula eucariotica di produrre solo
le proteine di cui ha bisogno in base al suo fenotipo, al suo stadio di sviluppo e differenziamento. Le
ricerche di R. Kornberg hanno posto le basi per
comprendere l’enorme flessibilità del sistema di
trascrizione degli eucarioti e come l’informazione
I
genetica sia selettivamente decodificata per portare alla specializzazione delle cellule dei diversi tessuti. Il professor Roger Kornberg con la tecnica
della diffrazione su cristallo è riuscito a dare un’immagine reale del funzionamento della trascrizione
* Dip. BBCM – Univ. Trieste, Via Licio Giorgieri 1, 34127 Trieste; E-mail: [email protected]
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a livello molecolare. La comprensione dettagliata
di come sono rese utilizzabili le informazioni contenute nel codice genetico negli eucarioti riveste
un’importanza fondamentale per la scienza in
quanto è alla base della comprensione della vita
degli organismi superiori, uomo compreso.
Kornberg, distinguendo molte delle interazioni tra i
singoli atomi, è riuscito a fare una ricostruzione
molecolare delle fasi essenziali del processo della
trascrizione e, di conseguenza, ha contribuito in
modo sostanziale a porre le basi per comprendere
meglio le anomalie che conducono a molte malattie dell’uomo quali il cancro, le patologie cardiache e infiammazioni di vario tipo. Inoltre, è proprio
il controllo della trascrizione uno dei meccanismi
indispensabili perché cellule immature e indifferenziate come le staminali possano svilupparsi e
trasformarsi in cellule adulte di tipo diverso e dalla
funzione ben definita. Anche in questo caso, le
ricerche di Kornberg potranno far progredire quelle sul controllo dello stato di differenziamento delle
cellule staminali affinchè diventino strumenti terapeutici nell’ambito della rigenerazione tissutale in
sostituzione dei trapianti d’organo e per la cura di
patologie degenerative.
La storia della comprensione della trascrizione
negli eucarioti ebbe inizio nel 1959 con la scoperta di Weiss e Gladstone dell’enzima RNA polimerasi nei nuclei di fegato di ratto (Weiss and
Gladstone, 1959). In seguito si passò allo studio
nei procarioti per la difficoltà di purificazione della
RNA polimerasi dal fegato dei ratti. Nel 1965 lo
studio della regolazione della trascrizione nei batteri portò al Nobel Jacob, Monod e Lwoff. A lungo
rimase il preconcetto che la struttura dei geni e
l’apparato trascrizionale fosse lo stesso in tutte le
cellule fino a quando non emerse che, al contrario
dei batteri, negli eucarioti il DNA è legato a proteine che costringono la lunghissima catena del DNA
a raggomitolarsi prima in nucleosomi ed infine in
cromatina. La trascrizione in questi organismi
doveva perciò avere alti livelli di regolazione per
superare la complessità della struttura organizzata
del DNA. Al contrario dei batteri, gli eucarioti
hanno tre diverse RNA polimerasi (I, II e III) e tutti
i geni che codificano per proteine sono trascritti
dalla RNA polimerasi II (RNA pol II) che quindi
doveva essere il principale bersaglio della regolazione della trascrizione. Durante gli anni 70 si
dimostrò che la RNA pol II era composta da più
subunità, ma al contrario di quella batterica, una
volta purificata non era in grado di eseguire una
trascrizione selettiva di un DNA. Nella RNA pol
batterica era stata identificata una subunità detta
sigma richiesta per riconoscere un promotore ed
iniziare la trascrizione, che negli eucarioti non
Figura 1: Processo di trascrizione. Bianco: RNA-polimerasi; Blu: elica del DNA; Rosso: filamento di RNA in crescita.
c’era. L’unico modo per far attivare la trascrizione
con la RNA pol II era metterla in presenza di un
estratto cellulare e il frazionamento biochimico di
tale estratto portò in evidenza fattori multipli che
erano importanti per la trascrizione (Matsui et al.,
1980). Questi furono chiamati fattori trascrizionali
generali (General Transcription Factors, GTFs),
cioè coinvolti nella trascrizione di tutti i geni (i.e.
TFII B, D, E, F e H), e con queste proteine la RNA
pol II era in grado di riconoscere il sito di inizio di
un gene, separare i due filamenti di DNA, copiarne uno in mRNA ed alla fine riunire i due filamenti di DNA dietro a lei, mentre avanzava lungo il
gene.
Roger Kornberg iniziò a lavorare come studente di
post-dottorato alla struttura della cromatina al
MRC di Cambridge con Francis Crick e Aaron
Klug. All’epoca, gli studi di diffrazione ai raggi X
avevano dimostrato che la cromatina è formata di
unità ripetitive di circa 100 Å. Nel 1974 Kornberg
e Thomas (1974) dimostrarono che gli istoni H3 e
H4 in soluzione formano un tetramero (H3)2(H4)2.
Nello stesso anno Kornberg propose che l’unità di
base della cromatina, il nucleosoma, fosse composto da un ottamero di istoni e da 200 paia di
basi di DNA. Tornato nel suo laboratorio di
Stanford, Kornberg continuò le sue ricerche per
capire la regolazione della trascrizione usando
come modello un eucariote semplice, il lievito di
birra (Saccharomyces cerevisiae), e sviluppando
con questo organismo un sistema di trascrizione in
vitro che conteneva la RNA pol II altamente purificata, i fattori generali della trascrizione TFIIB, E, F
e H e la TATA-binding protein (TBP) che però pro-
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muovevano la trascrizione basale, ma non quella
specifica. Questo portò alla scoperta inaspettata
di un complesso multimerico di circa 20 proteine
diverse, che fu chiamato Mediatore (Kelleher et
al., 1990, Flanagan et al, 1991, Kim et al., 1994).
Nel 1981 gli studi di Schaffner (Banerji et al.,
1981) e Chambon (Moreau et al., 1981) avevano
messo in evidenza che negli eucarioti alcuni elementi genici, detti enhancer, erano in grado di
legare proteine attivatrici che modulavano la trascrizione di specifici geni. Il ruolo del Mediatore
risultò quello di trasferire i segnali positivi e negativi sui siti di legame sul DNA per i fattori di trascrizione gene-specifici alla RNA pol II ed ai fattori di trascrizione generici. A questo punto era chiaro che mentre i batteri hanno repressori o attivatori trascrizionali che prendono contatto diretto con
la RNA pol influenzandone il legame al promotore,
negli eucarioti cromatina e Mediatore costituivano
la base per la regolazione gene-specifica, ma non
era ancora noto come questa regolazione poteva
avvenire. Negli anni 1993-95 venne risolta la
struttura cristallografica della TBP complessata
con una regione di DNA contenente la sequenza
nucleotidica consenso TATA, in complesso ternario con la TFIIB, definendo così il legame al promotore (Kim JL et al., 1993, Kim Y et al., 1993,
Chasman et al., 1993, Nikolov et al., 1995).
Kornberg intuì che la RNA pol II poteva essere la
piattaforma sulla quale tutta la macchina trascrizionale veniva assemblata, ma la notevole grandezza molecolare della RNA pol II (12 subunità per
complessivi 0.5 x 106 Da), la scarsità della quantità di proteina purificata, nonché l’instabilità del
complesso proteico resero gli studi molto difficili.
Per risolvere questo problema Kornberg pensò di
utilizzare la microscopia elettronica e la risoluzione in 2-D delle proteine su doppio strato lipidico e
poi combinare il tutto con la cristallografia a raggi
X per ottenere dopo 20 anni di lavoro biochimico
la struttura in 3-D delle proteine.
Roger Kornberg grazie ai raggi X prodotti dalla
sorgente di sincrotone di Stanford ed ai software
sofisticati per la valutazione dei dati di diffrazione,
ha risolto la struttura della RNA pol II. Inoltre ha
capito a livello atomico come la RNA pol II si complessa con il DNA, con il suo prodotto l’mRNA e
con i nucleotidi substrati, nonché con alcune proteine regolatrici. In particolare, grazie ai suoi studi
si è avuta la prima comprensione a livello molecolare del meccanismo di riconoscimento del promotore, dell’inizio della trascrizione e di come l’ibrido DNA-RNA trasloca dopo l’aggiunta di un
nucleotide, come il filamento neo-sintetizzato di
mRNA viene separato dal DNA stampo e quali
sono le basi strutturali per una selezione accurata
del ribonucleotide entrante che deve essere complementare allo stampo del DNA.
Il DNA degli eucarioti è assemblato attorno ad un
ottamero di proteine istoniche che costituisce il
nucleosoma e di per sé impedisce la sua trascrizione agendo quindi da repressore generale ma
senza regolarne l’attivazione. Gli istoni possono
essere modificati mediante acetilazioni, metilazioni e fosforilazioni di alcuni residui amminoacidici e
quindi, cambiando la loro struttura, possono conseguentemente modificare l’accessibilità del DNA
per la trascrizione. Tali modifiche sono la fase
intermedia di un processo dinamico nel quale i
nucleosomi sono continuamente rimossi dal promotore attivato e poi riassemblati grazie all’intervento di complessi proteici (Boeger H et al. 2005).
La macchina trascrizionale ha tre componenti
principali: una RNA polimerasi, capace di sintetizzare mRNA e provare la fedeltà degli appaiamenti
del trascritto nascente, cinque fattori di trascrizione generali (TFIIB, D, E, F e H) che riconoscono il
promotore e il complesso del Mediatore, che trasferisce le informazioni sulla regolazione da parte
di proteine attivatrici o di repressori alla RNA pol
II. Il Mediatore si trova solo negli eucarioti ed è perciò la chiave della complessa regolazione genica
che sottende allo sviluppo ed al differenziamento
degli organismi multicellulari; esso agisce come
co-attivatore, co-repressore e fattore generale di
trascrizione. In pratica il flusso secondo cui l’informazione di attivazione viene trasmessa è: enhancer->attivatore->Mediatore->RNA pol II->promotore. La macchina trascrizionale della RNA pol II è
in totale un complesso di circa 60 subunità proteiche con più di 3 x 106 Da, che è perciò molto difficile da risolvere con analisi strutturali. Per questo
motivo Kornberg si è soffermato a capire come
funziona il cuore di questa macchina complessa,
cioè la piattaforma dove tutti questi fattori si
assemblano. Ci sono stati molti ostacoli tecnici da
superare, come la cristallizzazione in 3-D su una
matrice lipidica, e con un duro lavoro, iniziato nel
1971, è riuscito nel 2000 ad ottenere il primo cristallo e nel 2001 a pubblicare due lavori su
Science (Cramer et al, 2001, Gnatt et al., 2001).
L’alta omologia di sequenza tra la RNA pol II del
lievito e quella dell’uomo, nonché l’elevata somiglianza strutturale e morfologica del Mediatore del
lievito rispetto a quello dei mammiferi, ha reso
questa scoperta importantissima per la comprensione di molti meccanismi molecolari legati a stati
fisiologici e patologici delle cellule.
Nella prima struttura che Kornberg ha risolto
(Cramer et al., 2001; Gnatt et al., 2001) le due
subunità maggiori della RNA pol II occupano il
centro del sito di legame per gli acidi nucleici che
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ha forma di fenditura, con molte delle subunità più
piccole all’esterno ed una struttura ad alfa elica,
che parte da una delle due subunità maggiori e
passa a ponte attraverso il sito attivo dove avviene la formazione del legame fosfodiestereo e l’allungamento della catena di RNA. Nelle pubblicazioni successive del laboratorio di Kornberg, quasi
una dozzina di nuovi cristalli di RNA pol II complessata con DNA, RNA, nucleotidi ed altre proteine hanno potuto dare la risposta a come avviene
nel dettaglio la dinamica della trascrizione.
Kornberg e collaboratori hanno costruito un
modello di complesso di inizio della trascrizione
con cinque fattori di trascrizione generali (Bushnell
et al., 2004) mettendo in evidenza come questi
fattori si legano direttamente al promotore a doppio filamento, mentre la RNA polimerasi può legare il DNA solo dopo la separazione dei due filamenti. La struttura del complesso di trascrizione
subito dopo l’allungamento della catena di mRNA,
e prima della traslocazione dell’ibrido DNA-RNA,
mostra la molecola di polimerasi che si ferma in
un sito specifico sullo stampo di DNA trattenendo
uno dei quattro ribonucleotidi. Il DNA svolto e 9
paia di basi di ibrido DNA-RNA stanno nel centro
attivo della regione di trascrizione.
Il problema di come fattori intrinseci od estrinseci
regolino la trascrizione negli eucarioti risiede nei
bersagli delle proteine regolatrici ed il fattore che
funge da intermediario è il Mediatore, un complesso di proteine che si interpone tra la RNA pol II e
le proteine regolatrici (Kornberg R, 2005). La trascrizione si attiva solo in presenza di un attivatore
e del Mediatore, essendo quest’ultimo richiesto per
la trascrizione da quasi tutti i promotori della RNA
pol II. La comprensione dell’interazione diretta tra
attivatori e Mediatore deriva dagli studi sulla trascrizione nella tiroide dove il recettore per l’ormone della tiroide è stato isolato sottoforma di complesso con il Mediatore in cellule indotte da stimolazione ormonale. In pratica il Mediatore attraverso la sua interazione con l’attivatore promuove la
formazione di un complesso con la RNA polimerasi II e i fattori generali di trascrizione. Il Mediatore
ha ovviamente anche un ruolo nella repressione
della trascrizione, ma molto meno chiaro in quanto la limitazione maggiore nello studio di tale meccanismo è la mancanza di un sistema di induzione
di repressione specifica in vitro, data l’abbondanza di repressori generici. È plausibile che il
Mediatore partecipi anche ad eventi come il rimodellamento della cromatina del promotore prima
che il complesso di inizio della trascrizione si
assembli sul DNA. Si pensa che il Mediatore
rimanga sul promotore insieme ai GTF seguendo
le fasi iniziali del processo e dirigendo anche un
nuovo reiinizio di trascrizione. Su questo complesso multiproteico e sulle sue funzioni rimane ancora molto da chiarire.
La recente espressione e purificazione delle molecole funzionali principali che compongono il
Meiatore ha portato alla scoperta che questo in
complesso ci sono 7 subunità corrispondenti a
223 kDa (Tagaki et al., 2006) e l’interazione tra
queste e la RNA pol II richiede la presenza del fattore generale TFIIF. In futuro lo studio cristallografico dell’interazione tra la RNA pol II ed il complesso del Mediatore potrà chiarire meglio tali interazioni molecolari e perciò aggiungere ulteriori
dettagli sulla regolazione della trascrizione.
Sito web:
Roger Kornberg: http://kornberg.stanford.edu/
Filmato
del
processo
di
trascrizione:
http://www.dnalc.org/home.html.
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PICCOLO
GLOSSARIO*
Cromatina. Sostanza visibile al microscopio ottico
all’interno del nucleo delle cellule eucarioti. Essa
si colora intensamente con i coloranti basici (blu di
metilene, ematossilina) utilizzati comunemente
negli studi istologici. La cromatina è formata dal
DNA avvolto su gruppi di proteine dette istoni
(proteine basiche) e non-istoni (proteine neutre o
acide, più o meno fosforilate); esso è poi ripiegato
in vario modo. Utilizzando particolari tecniche, è
possibile svolgere questi “rocchetti” di acido
nucleico; al microscopio elettronico allora si
osserva una tipica struttura a forma di collana, in
cui al “filo” di acido nucleico sono attaccate le proteine.
DNA o acido desossiribonucleico. Polimero organico presente nelle cellule di tutti gli organismi
viventi e appartenente alla classe degli acidi
nucleici. Ogni nucleotide è formato da tre parti:
una molecola di uno zucchero (desossiribosio) cui
sono legati un gruppo fosfato ed una base azotata
del gruppo delle purine (adenina, A; guanina, G) o
delle pirimidine (citosina, C; timina, T). Il legame
tra un nucleotide e il successivo è un legame
fosfodiestere: l’atomo di carbonio in 3’ sull’anello
del desossiribosio lega il gruppo -OH di un residuo
fosforico che, a sua volta, lega in posizione 5’ l’anello di ribosio appartenente al monomero adiacente. Di solito il DNA è a doppio filamento: è formato, cioè, da due catene (eliche) orientate in
verso opposto, unite da legami idrogeno tra le basi
azotate. Il DNA svolge un ruolo fondamentale di
controllo dell’attività della cellula in quanto costituisce i geni dell’organismo e attraverso questi
presiede alla sintesi delle proteine. Tratti di molecole di DNA, avvolgendosi su particolari proteine
dette istoni, formano i cromosomi.
28
DNA polimerasi. Enzima in grado di sintetizzare
un filamento di DNA utilizzando come template un
altro filamento di DNA, generando quindi un filamento complementare al primo nel processo di
replicazione. Le differenze fra le polimerasi delle
varie specie viventi sono piuttosto piccole rispetto
alla diversità biologica degli organismi cui appartengono.
Nucleosoma. Unità di strutturazione fondamentale
della cromatina, è costituito dagli istoni ed ha la
forma di una piccola sfera. Serve a compattare il
DNA in una cellula eucariota.
RNA o acido ribonucleico. Polimero organico
simile per composizione al DNA in cui lo zucchero è il ribosio e le basi azotate sono purine (adenina, A; guanina, G) o pirimidine (citosina, C;
uracile, U). Questo acido nucleico, presente negli
eucarioti, nei procarioti e in alcuni virus, è di solito a filamento singolo e non è in grado di replicarsi da solo (come il DNA); i diversi tipi di RNA
sono elaborati a partire da un filamento di DNA,
che agisce da template, attraverso un processo
detto trascrizione. Nei procarioti e negli eucarioti, l’RNA è presente in diverse forme, ciascuna
delle quali adibita ad una funzione specifica: RNA
messaggero (mRNA, mediatore dell’informazione genetica tra DNA ed amminoacidi) che presiede alla sintesi delle proteine, che avviene
mediante la traduzione; RNA di trascrizione
(tRNA, necessario per la traduzione nei ribosomi)
e RNA ribosomiale (rRNA, entra nella struttura
dei ribosomi) che si legano a molecole proteiche
e formano i ribosomi, organuli delle cellule procarioti ed eucarioti.
Eucarioti e Procarioti. Gli Eucarioti (la maggior
parte delle specie di organismi viventi) sono costituti da cellule compartimentate in cui le regioni
che presiedono alle diverse funzioni sono delimitate da membrane interne. In particolare, la membrana nucleare delimita una porzione in cui si
trova il materiale genetico che controlla le attività
della cellula stessa. Nei Procarioti (es., batteri) il
materiale nucleare è disperso nel citoplasma
(sostanza presente nelle cellule di tutti i viventi e
separata dall’ambente circostante da una membrana cellulare) e le varie funzioni cellulari sono
svolte da complessi molecolari ed enzimi.
Gene. Unità ereditaria degli organismi viventi. I
geni sono contenuti nel genoma di un organismo,
che può essere composto di DNA o di RNA, e dirigono lo sviluppo fisico e comportamentale dell’organismo. La maggior parte dei geni codifica proteine, le macromolecole maggiormente coinvolte
nei processi biochimici e metabolici della cellula.
GTFs (General Transcription Factors). Fattori di
trascrizione delle proteine: sono coinvolti nel processo di trascrizione dei geni e presiedono a vari
processi indispensabili per mantenere in vita gli
organismi viventi. Ad esempio, la trascrizione è
uno dei meccanismi che fa sì che cellule immature e indifferenziate quali le staminali possano svilupparsi e trasformarsi in cellule adulte di tipo
diverso e dalla funzione ben definita.
Traduzione. Sintesi proteica (nota anche come
traduzione genica) che costituisce la seconda fase
del processo in cui l’informazione contenuta nel
DNA dei geni viene convertita in proteine che
svolgono nella cellula un’ampia gamma di funzioni. Nella sintesi proteica un filamento di RNA messaggero, prodotto a partire da un gene sul DNA
attraverso il processo di trascrizione, è usato come
template per la produzione di una specifica proteina. La relazione tra triplette di basi dell’RNA e gli
amminoacidi delle proteine è definito codice genetico.
Istoni. Proteine basiche, tipiche degli organismi
eucarioti, che interagiscono con il DNA. Sono una
delle famiglie di proteine meglio evolutivamente
conservate in tutti gli eucarioti. Il ruolo fondamentale degli istoni è quello di organizzare il DNA,
compattare la cromatina e il DNA, in modo tale
che possa essere conservati dalle cellule nel volume ristretto del nucleo.
Trascrizione. Processo mediante il quale le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte
enzimaticamente in una molecola complementare di RNA. Nel caso in cui il DNA codifichi una
proteina, la trascrizione è l’inizio del processo
che porta, attraverso la produzione intermedia di
un mRNA, alla sintesi di peptidi o proteine funzionali.
*Fonti: http://it.wikipedia.org; en.wikipedia.org; Microsoft® Encarta® 2006 [CD]. Microsoft Corporation 2005
29
