Seminario
Seminario per
per ilil corso
corso “misure
“misure con
con biomarcatori”
biomarcatori”
A.A.
A.A. 2005-2006
2005-2006
Il biomonitoraggio
ambientale attraverso lo
studio della regolazione
genica della risposta allo
stress
Silvia
Franzellitti
ESITE
ESITE UNA
UNA GERARCHIA
GERARCHIA
DELLA
DELLA RISPOSTA
RISPOSTA ALLO
ALLO
STRESS AMBIENTALE
AMBIENTALE
Ecosystem STRESS
tempo
Relevance to Ecosystem ‘Health’
Perché utilizzare lo studio dell’alterazione
dell’espressione genica nella tossicologia ambientale?
Community
Population
Individual
M
STI
OLO
NUCLEO
NUCLEO
promotore
gene
RNA
polimerasi
Cell
TRASCRIZIONE
Organelle
mRNA
Molecular
AAAA
trasporto
trasporto
Dose/Concentration
mRNA
Le modificazioni a livello molecolare
rappresentano
il
primo
stadio,
estremamente precoce, della serie di
eventi che governano i meccanismi di
risposta.
AAAA
TRADUZIONE
proteina
proteina
RISPOSTA
S.
S. Franzellitti
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ambientale attraverso
attraverso lo
lo studio
studio della
della regolazione
regolazione genica
genica della
della risposta
risposta allo
allo stress
stress
1
Metodi per lo studio dell’espressione
genica
Basati
sull’ibridazione degli
acidi nucleici
Basati sulla PCR
(Reazione a catena
della DNA
polimerasi)
Southern/Northern
blotting
Ibridazione in situ
Microarray a DNA/cDNA
RT-PCR
PCR semi-quantitativa
PCR real-time
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Ibridazione
A-T
G-C
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2
TECNOLOGIA DEL MICROARRAY
CHIP
GENICI
Supporti in vetro su cui
sono collocati in posizioni
definite dei frammenti di
DNA.
Ogni posizione (spot)
rappresenta un singolo
gene.
Ogni vetrino può contenere
svariate migliaia di spot
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Preparazione dei
microarray
(spottaggio)
Preparazione dei
campioni
controllo
Acquisizione e analisi
delle immagini
trattato
Isolamento
dell’mRNA
AAA
AAA
AAA
AAA
Retrotrascrizione
e marcatura dei
cDNA
AAA
Cy3Cy3-dCTP
AAA
Cy5Cy5-dCTP
ibridazione
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3
Mytox-chip
Un microarray per studiare
la risposta allo stress in
M. galloprovincialis
2 SOTTO-ARRAYS con 50 oligonucleotidi
spottati su un supporto in vetro “attivato” di
dimensioni 26 mm x 76 mm
I 50
oligonucleotidi
rappresentano i
25 geni: 2 spots
diversi per ogni
gene in esame
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risposta
risposta allo
allo stress
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2+ (750 nM)
Hg2+
NSO (0.5ppm)
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allo stress
stress
4
Applicazione
Applicazione del
del mytox-chip
mytox-chip al
al
biomonitoraggio
biomonitoraggio del
del Visnes
Visnes fjord
fjord (Norvergia)
(Norvergia)
Stabilità delle membrane
lisosomiali
Rapporto volume
lisosoma/citoplasma
Accumulo lipidi
neutri
Accumulo
lipofuscine
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allo stress
stress
DAI DATI DEL
MICROARRAY….
Messa a punto
quantitativa
risposta allo
mediante
di metodiche di PCR
per
studiare
la
stress ambientale
GENI SENSIBILI ALLE
ALTERAZIONI AMBIENTALI
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5
I METODI BASATI SULLA REAZIONE A
CATENA DELLA DNA POLIMERASI (PCR)
Estensione
Permette l’amplificazione selettiva di singoli
tratti genici, cioè la produzione in vitro di un
elevato numero di copie di una specifica
sequenza di DNA.
La PCR si basa sulle proprietà dell’enzima
DNA polimerasi di ripetere in vitro ciò che
accade normalmente in vivo durante il
processo di duplicazione del DNA, ossia la
sintesi di nuovi filamenti complementari ad un
filamento stampo, e sulla possibilità di mirare
tale sintesi ad uno specifico tratto di DNA
scegliendo opportunamente gli inneschi o
primer.
I primers sono oligonucleotidi sintetici lunghi
10-30 pb, complementari alle regioni
fiancheggianti il frammento genico da
amplificare. Appaiandosi a tali regioni, i
primer costituiscono un piccolo tratto di
DNA a doppia catena, dal quale la DNA
polimerasi può iniziare la sintesi, ossia
formazione di legami fosfodiesterici tra
l'estremità 3' del segmento iniziatore e il
dNTP complementare allo stampo.
LA PCR
SEMI-QUANTITATIVA
[amplificato]
[amplificato]
la quantità di un determinato target
prodotto dalla duplicazione in vitro è
esponenzialmente proporzionale alla quantità
di cDNA inizialmente presente
Elettroforesi
n°
n° cicli
cicli di
di PCR
PCR
C
1
2
3
HSP70
HSC70
18s rRNA
Analisi
d’immagine
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stress
6
°C
35 h
1
**
fold induction
H
sh eat
oc
ke
d
tr
ol
Hsp 77
Hsp 72
Hsp 69
3,0
2,5
Co
n
M
ar
ke
r
Le Hsp70 e la risposta allo stress
termico
2,0
*
1,5
HSP70
1,0
HSC70
0,5
0
10
5
20
25
time of recovery (hour)
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risposta
risposta allo
allo stress
stress
LA RISPOSTA AI METALLI PESANTI
4,0
3,5
HSC70
*
L’espressione dei geni HSP70 è
modulata durante l’esposizione a
Hg2+
fold induction
3,0
2,5
*
2,0
*
1,5
1,0
HSP70
**
0,5
0,0
0
1
2
3
4
5
6
35000
time of exposure (days)
I geni MT sono
differentemente regolati
dall’esposizione a Hg2+
n° molecole
30000
25000
20000
15000
10000
5000
MT10
MT20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
tempo di esposizione a Hg (giorni)
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stress
7
rapporto d'induzione
ABC transporter
8
Pgp
*
6
4
2
0
rapporto d'induzione
ctr
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
24h
*
Mrp2
Mrp2
*
Hg2+
ctr
24h
CH3Hg+
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8
