Immunologia e Immunologia
Diagnostica
ANTICORPI:
STRUTTURA E FUNZIONE
Le due vie dell’immunità adattativa
• Microbi extracellulari:
immunità umorale
! Anticorpi
• Microbi fagocitati e
intracellulari:
immunità cellulare
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Caratteristiche dell’immunità
adattativa
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Anticorpi:
Specificità, Diversità, Espansione
• Specificità:
1 linfocita B (clone) 1
recettore 1 antigene
• Diversità:
ogni recettore è diverso
dagli altri (>109)
• Espansione clonale:
ogni antigene seleziona un
clone e lo moltiplica
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Anticorpi: proprietà generali
• Proteine plasmatiche della frazione gammaglobuline.
• Anticorpi = Immunoglobuline (Ig)
• Molecole specializzate per riconoscere un antigene.
• Uniche cellule produttrici: linfociti B.
• Due varianti biologiche:
- Anticorpi di membrana (recettore linfociti B)
- Anticorpi solubili (secrezione plasmacellule differenziate)
• Anticorpi solubili :
plasma, secrezioni mucosali e fluidi tissutali.
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Struttura degli Anticorpi
• Tutti gli anticorpi hanno la stessa struttura molecolare, ma
grande variabilità nella regione che lega l’antigene.
• Struttura simmetrica:
- 2 catene polipeptidiche leggere (catene L)
- 2 catene polipeptidiche pesanti (catene H)
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Struttura degli Anticorpi
• Le catene H e L sono costituite da una serie di domini
proteici ripetuti: il dominio immunoglobulinico (Ig), circa 110
aminoacidi.
• Le catene H e L sono caratterizzate da:
- Regioni variabili (legame antigene)
- Regioni costanti (funzioni effettrici)
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Struttura degli Anticorpi
• Le catene H e L sono legate tra di loro in maniera covalente
da ponti disolfuro.
• Anche le due catene H sono legate da ponti disolfuro:
Nelle IgG si trovano vicino la “regione cerniera”, importante
per la flessibilità dell’anticorpo.
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Il sito di legame per l’antigene
• È formato dalla disposizione tridimensionale delle regione
variabili di una catena H e di una catena L.
• Ogni monomero anticorpale possiede 2 siti di legame:
2 x (VH-VL)
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Denominazione delle regioni
funzionali
• Il trattamento degli anticorpi IgG con enzimi proteolitici
genera frammenti con caratteristiche distinte, che danno il
nome alle diverse regioni dell’immunoglobulina.
• Papaina:
- Frammento monovalente con il sito di legame per l’antigene
(Fragment antigen binding) = Fab
- Frammento cristallizabile = Fc
• Pepsina:
- Frammento bivalente con il sito di legame per l’antigene =
F(ab’)2
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Denominazione delle regioni
funzionali
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Caratteristiche delle regioni variabili
• La variabilità nelle sequenze aminoacidiche delle Ig si
concentra nelle regioni ipervariabili e determina la
specificità dei diversi anticorpi.
• Regioni ipervariabili (∼10 aa):
- 3 segmenti della regione VH
- 3 segmenti della regione VL
• Regioni ipervariabili = Regioni che determinano la
complementarità (CDR):
- CDR1, CDR2 e CDR3 (catena H)
- CDR1, CDR2 e CDR3 (catena L)
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Caratteristiche delle regioni variabili
• Le 6 regioni ipervariabili si
associano in una struttura
tridimensionale che forma il sito
di legame per l’Ag.
• L’impalcatura dell’Ig resta
sempre la stessa.
• La grande diversificazione delle
sequenze CDR cambia la
specificità di ogni anticorpo.
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Importanza delle regioni ipervariabili
• La capacità di legare l’Ag dipende principalmente dalle
regioni CDR.
• Gli aminoacidi che variano più frequentemente sono quelli
che entrano in contatto con la molecola bersaglio.
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Importanza delle regioni ipervariabili
Diversità delle regioni ipervariabili = Diversità del sito di legame
per l’antigene = Diversità anticorpale
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Caratteristiche delle regioni costanti
• Ogni molecola anticorpale contiene due tipi di regioni
costanti (C):
- Regioni CH catene pesanti
- Regioni CL catene leggere
• Le regioni CH determinano:
- la classe anticorpale (isotipo)
- la funzione effettrice dell’anticorpo
- la “flessibilità” dell’anticorpo (regione cerniera)
- la forma di secrezione o di membrana
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Forme secrete e di membrana
• La regione aminoacidica dell’ultima regione CH determina se
l’anticorpo è solubile o legato alla membrana citoplasmatica.
• A seconda dell’isotipo, le forme secrete possono essere
monomeriche o formare complessi multimerici.
• I complessi multimerici sono legati alla catena J, una proteina
che stabilizza e trasporta il complesso (epiteli).
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Le classi anticorpali
• Le immunoglobuline umane sono classificate in 5 isotipi:
- IgA, IgD, IgE, IgG e IgM
• Alcune classi sono ulteriormente suddivise in sottoclassi:
- IgA IgA1 e IgA2
- IgG IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4
• Per ogni isotipo/sottotipo: tutte le regioni costanti delle catene
H hanno la stessa sequenza aminoacidica.
• La sequenza aminoacidica è invece diversa nei vari isotipi/
sottotipi.
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Immunoglobuline A (IgA)
• Catene pesanti α (alfa).
• Forme secrete: monomero, dimero, trimero.
• Ruolo nell’immunità delle mucose:
- secrete nel lume intestinale e respiratorio
- neutralizzazione di microbi e tossine
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Immunoglobuline D (IgD)
• Catene pesanti δ (delta).
• Nessuna forma secreta.
• Immunoglobulina di membrana dei linfociti B naïve =
Recettore dei linfociti B (BCR)
• Ruolo nell’attivazione dei linfociti B plasmacellule
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Immunoglobuline E (IgE)
• Catene pesanti ε (epsilon).
• Forma secreta: monomero.
• Ruolo fisiologico: difesa contro gli elminti
• Ruolo immunopatologico:
reazioni di ipersensibilità immediata
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Immunoglobuline G (IgG)
• Catene pesanti γ (gamma).
• Forma secreta: monomero.
• Isotipo maggiormente abbondante nel siero
• Molteplici funzioni effettrici
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Immunoglobuline G (IgG)
• Ruolo fisiologico:
- Neutralizzazione microbi e tossine
- Opsonizzazione antigeni
- Attivazione classica del complemento
- Citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC)
- Immunità neonatale (via placenta)
• Ruolo immunopatologico:
- Autoimmunità
- Ipersensibilità tipo II e III
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Immunoglobuline M (IgM)
• Catene pesanti µ (mu).
• Due forme alternative:
- Ig di membrana dei linfociti B naïve (BCR).
- Forma secreta: pentamero.
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Immunoglobuline M (IgM)
• Ruolo fisiologico:
- Attivazione dei linfociti B plasmacellule
- Attivazione classica del complemento
• Ruolo immunopatologico:
- Autoimmunità
- Ipersensibilità tipo II e III
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Sintesi ed espressione degli anticorpi
L’espressione dei geni per le Ig varia in dipendenza dello stadio di
maturazione e attivazione dei linfociti B.
1. Linfocita pre-B: catene pesanti µ + catene leggere surrogate
2. Linfocita B immaturo: IgM complete di membrana
3. Linfocita B maturo: IgM e IgD di membrana
4. Linfocita B attivato: scambio isotipico e basso livello di secrezione
5. Plasmacellula: elevato livello di secrezione anticorpale
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Sintesi ed espressione degli anticorpi
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Risposta primaria e secondaria dei
linfociti B
• La risposta primaria è la prima risposta ad un antigene, che attiva i
linfociti naïve in grado di riconoscerlo.
• Gli incontri successivi con lo stesso antigene stimolano le risposte
secondarie, mediate dall’attivazione dei linfociti della memoria:
- più rapide
- più intense
- più efficaci
Ottimizzazione della risposta immunitaria:
ogni incontro successivo con il patogeno genera nuove cellule
memoria e attiva quelle ancora presenti.
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Risposta primaria e secondaria dei
linfociti B
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Immunità Attiva e Passiva
• Esposizione ad un antigene Risposta immunitaria Immunità
Attiva
• Trasferimento di siero (anticorpi) o di cellule (linfociti) da un individuo
immune ad uno non immune Immunità Passiva
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Immunità Attiva: Esempi
• Fisiologico: tutte le risposte dell’immunità adattativa contro
patogeni e tossine.
• Clinico: vaccinazioni contro le malattie infettive.
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Immunità Passiva: Esempi
• Fisiologico: trasferimento degli anticorpi materni al feto (IgG via
placenta) e al neonato (IgA via latte).
• Clinico:
- Anticorpi anti-tossina (tetano, botulino, etc.)
- Anticorpi anti-ofidici (veleno di serpenti)
Caratteristiche del principio attivo
Frammenti di immunoglobulina purificati Fab o F(ab’)2
Preparazione plasmatica di origine equina o ovina.
Rischio effetti collaterali: reazioni di ipersensibiltà, reazione
anafilattica.
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Anticorpi Monoclonali e Policlonali
• Ogni cellula B naïve (clone) esprime un recettore per l’antigene (BCR) con
specificità diversa.
• Ogni clone attivato differenzia in plasmacellule che secernono
un’immunoglobulina con la stessa specificità.
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Anticorpi Monoclonali e Policlonali
• Ogni recettore/immunoglobulina riconosce un determinante antigenico
diverso (epitopo)
• Ogni antigene possiede numerosi epitopi.
1 clone = 1 epitopo = 1 antigene
1 antigene = n epitopi = n cloni
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Generazione di Anticorpi Monoclonali
• Presupposto: i mielomi sono tumori delle plasmacellule e producono
anticorpi monoclonali.
• Conseguenza: immortalizzando i linfociti B specifici per un dato
antigene, si possono generare anticorpi monoclonali specifici.
• Metodo:
1. Creare una fusione cellulare tra linfociti B e linee di mieloma.
2. Selezionare le cellule fuse Ibridomi.
3. Separare i singoli cloni di ibridoma.
4. Analizzare gli anticorpi prodotti da ciascun clone di ibridoma.
5. Individuare il clone/anticorpo di interesse.
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