Il CLONAGGIO DEI GENI e´una delle principali applicazioni della

Il CLONAGGIO DEI GENI e´una delle principali applicazioni della
Tecnologia del DNA ricombinante
Una molecola di DNA ricombinante deriva dalla unione di due
molecole pre-esistenti che vengono ”ricombinate” tra di loro per
produrre una specie molecolare artificiale
L´evoluzione della tecnologia del DNA ricombinante e´stata
possibile quando si e´scoperto il modo per ”tagliare e ricucire”
molecole di DNA
La tecnologia del DNA ricombinante
Isolare
Analizzare
Modificare
i geni
Il clonaggio consente di ottenere un
gran numero di molecole di DNA da
una quantità limitata di materiale di
partenza
(da nanogrammi a microgrammi o
milligrammi)
Esistono due modi per clonare un
gene:
Cell-based gene cloning
e
PCR
CLONAGGIO DI UN GENE
Il clonaggio di un gene
•
Un frammento di DNA che contiene il gene da clonare viene inserito in
una molecola di DNA circolare (vettore) per produrre una molecola di
DNA ricombinante, cioe’ isolata dal suo contesto e introdotta in un
replicone (una unita’ di DNA capace di replicarsi detta vettore).
•
Questa molecola di DNA ricombinante e´in grado di trasportare il gene
in cellule ospiti, che di solito sono batteri, ma possono essere anche
altri tipi di cellule
•
La molecola di DNA ricombinante si duplica con velocita´generalmente
maggiore di quella del cromosoma della cellula ospite, producendo
copie multiple ed uguali di essse stessa e del gene che trasporta.
•
Quando la cellula ospite si divide, la progenie discendente da questa
singola cellula, conterra´ la medesima molecola di DNA ricombinante
originariamente isolata.
•
Dopo un gran numero di divisioni cellulari si produce una colonia, o
clone, costituita da cellule identiche, ciascuna delle quali contiene
copie multiple della molecola di DNA ricombinante.
Il clonaggio di un gene permette di produrre copie del gene di interesse in
quantita’ praticamente illimitate
Cell-based DNA cloning, cosa occorre?
Tecniche di purificazione ed estrazione del DNA
Vettori per il clonaggio: plasmidi, fagi
Enzimi di restrizione e ligasi (eventualmente DNAsi, terminal transferasi
DNA polimerasi)
Cellule ospiti in cui trasferire le molecole di vettore che trasportano il gene di interesse
ENZIMI DI RESTRIZIONE
Estremità piatte
Esempio: HaeIII (da Haemophilus
parainfluenzae)
Estremità coesive
Esempio: EcoRI
La sequenza di DNA in doppia elica:
La sequenza di DNA in doppia elica:
5’-NNNNGGCCNNNN-3’
3’-NNNNCCGGNNNN-5’
5’-NNNNGAATTCNNNN-3’
3’-NNNNCTTAAGNNNN-5’
viene tagliata nel seguente modo:
viene tagliata nel seguente modo:
5’-NNNNGG pCCNNNN-3’
3’-NNNNCCp GGNNNN-5’
5’-NNNNG pAATTCNNNN-3’
3’-NNNNCTTAAp GNNNN-5’
In questo caso il taglio è perfettamente simmetrico.
Le estremità piatte sono saldate in modo
inefficiente dalla DNA ligasi, perché non restano
associate a lungo.
Tutte le estremità generate dagli enzimi che
operano un taglio sfalsato, siano esse sporgenti
in 5’ o in 3’, sono “appiccicose”, cioè possono
formare ponti idrogeno tra le due code a
filamento singolo complementari.
Reazioni di ligasi: rapporti molari
E’ importante ricordare che si devono utilizzare i rapporti molari opportuni tra vettore
ed inserto.
A parità di quantità di DNA, 1 mole di molecole di DNA di PM diverso è costituita da
un numero differente di molecole
Per utilizzare i rapporti molari opportuni si calcola il rapporto tra i PM di vettore ed
inserto.
Questo valore va poi suddiviso per la quantità di vettore che si intende utilizzare per
avere un rapporto molecolare 1:1 vettore-inserto. Si moltiplica poi tale valore per il
numero che indica il rapporto vettore-inserto che si vuole perseguire (es 3 volte in
piu’ di inserto, 5 volte in più di inserto rispetto al vettore).
Esempio: Si vogliono ligare 20 ng di vettore (3000 bp) ad un inserto (300 bp).
3000bp:300bp=10
20 ng: 10=2 ng (per avere un rapporto 1:1 tra vettore ed inserto occorrono 20 ng di
vettore e 2ng di inserto; per avere un rapporto 1:5 occorrono 10 ng di inserto etc)
Reazioni di ligasi tra frammento e
vettore
♦ Si usano 20.0 ng di vettore.
La reazione, catalizzata dall’enzima T4 DNA ligasi avviene a pH 7.5, in presenza
di MgCl2e ATP
♦ La quantità di frammento da clonare viene stimata tenendo
conto che si useranno frammento e vettore nei rapporti
molari 5:1 e 20:1.
Vettore 5109 bp
Frammento 473 bp
20 ng : X = 5109 : 473
X (ng di frammento) = (20 x 473)/5109 = 1.85 ng
5X = 9.2 ng
Reazione di ligasi
1 (1:5)
2 (1:20)
20X = 37.0 ng
H2O
Buffer x T4 ligasi
Vettore (20 ng)
Frammento
T4 ligasi 400 U/µl
Totale
> 2h, 16°C
8 – (X+Y1)
1.0 µl
X µl
Y1 µl
1.0 µl
10.0 µl
8-(X+Y2)
1.0 µl
X µl
Y2 µl
1.0 µl
10.0 µl
3 (controllo)
8-X
1.0 µl
X µl
-1.0 µl
10.0 µl
Clonaggio con singola digestione
trattamento del vettore con fosfatasi
pAATTC
G
G
CTTAAp
AATTC
G
G
CTTAA
DNA ligasi
pAATTC
G
G
CTTAAp
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
C
TT G
AA A
G TTA
C
G
CT AAT
TA T
AG C
fosfatasi
Verifica dell’avvenuta inserzione del gene di interesse
nel vettore di clonaggio attraverso elettroforesi in gel
di agarosio
Rappresentazione schematica del clonaggio (II) - estremità coesive
con digestione singola
La molecola di
DNA esogeno
può inserirsi in
entrambe le
direzioni (5’-3’ o
3’-5’
reannealing
annealing
Il clonaggio di un gene in un sito di restrizione singolo
porta all’inserimento del gene con due possibili
orientamenti
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
Digestione con EcoRI
G
CTTAA
AATTC
G
Rotazione di 180°C
G
C T TAA
AATTC
G
AATTC
G
G
CTTAA
Il clonaggio di un gene in un sito di restrizione
singolo porta all’ inserimento del gene con due
possibili orientamenti
Per verificare l’orientamento bisogna effettuare una digestione di restrizione
con un enzima che possiede un sito di riconoscimento nel gene clonato ed
uno nel polylinker del vettore. La posizione del sito di riconoscimento nel gene
non deve essere centrale alla sequenza genica.
Clonaggio con doppia digestione
EcoRI HindIII
GAATTC AAGCTT
CTTAAG TTCGAA
DNA ligasi
AATTC
G
A
TTCGA
EcoRI
HindIII
GAATTC
CTTAAG
AAGCTT
TTCGAA
TT
GC AA
AATCG
T
G
CT AAT
TA T
AG C
AGCTT
G
A
CTTAA
Rappresentazione schematica del clonaggio (III) - estremità coesive
Siti di
restrizione
BAMH1
gene per resistenza
ad antibiotico
plasmide
DNA estraneo
Siti di
restrizione
ECOR1
BAMH1
ECOR1
BAMH1
ECOR1
BAMH1
GATCC
G
G
CCTAG
ECOR1
G
CTTAA
C
TC G
A
G
G
CTTAA
estremità coesive
non complementari
G
TAG
CC
AATTC
G
Ibridazione delle
estremità e ligazione
annealing
reannealing
AATTC
G
FILLING IN
NEL CORSO DEI CLONAGGI PUÒ CAPITARE DI DOVER
TRASFORMARE ESTREMITÀ COESIVE SPORGENTI AL 5’
IN ESTREMITÀ PIATTE, SINTETIZZANDO LE BASI
MANCANTI NEL FILAMENTO INCOMPLETO AL 5’
ESEMPIO ESTREMITÀ “STICKY” 5’ PROTUDING (ES.EcoRI)
LA TECNICA DEL “ FILLING IN” CONSISTE NEL
“RIEMPIRE”
l’ ESTREMITÀ SPORGENTE AL 5’ CON IL FRAMMENTO DI
KLENOW, UNA DNA POLIMERASI I MODIFICATA PRIVA
DELL’ATTIVITÀ 5’-3’ ESONUCLEASICA
dTTP
dATP
dGTP
3’OH
5’P
3’OH
G
C AATTC
5’P
5’P
3’OH
G TTAAG
C AATTC
3’OH
5’P
Struttura schematica della DNA
polimerasi I di E. coli
Frammento di Klenow
Il frammento di Klenow sintetizza DNA in direzione 5’-3’
e non possiede attività 5’-3’ esonucleasica
Meccanismo di azione della DNApol
Rappresentazione schematica del clonaggio - estremità coesive e blunt
BAMHI
plasmide
ECORI
BAMH1
SAL I
gene per resistenza
ad antibiotico
DNA estraneo
Siti di
restrizione
Siti di
restrizione
ECORI
SALI
Fill in
ECORI
BAMH1
GGATC
CCTAG
Fill in
estremità blunt
ECORI
GATCC
CTAGG
G
CTTAA
AATTC
G
estremità protruding
TC
A
GG
TAG
CC
AATTC
G
Ibridazione delle
estremità e ligazione
annealing
reannealing
Sulla molecola di DNA ricombinante i siti di restrizione BamH1 sul plasmide e Sal I sull’inserto vengono persi
LE ESTREMITA’ 3’ PROTRUDING NON POSSONO ESSERE
CONVERTITE IN “BLUNT” DALLA KLENOW
OH
P
La T4 DNA Polymerase oltre a catalizzare la sintesi del DNA in
direzione 5´→ 3´, ha un’ attività esonucleasica 3´→ 5´ sul singolo
filamento molto più efficiente di quella della DNA pol I e della Klenow.
Per questo viene impiegata per rimuovere le estremità sporgenti 3’ e
dunque per produrre estremità blunt.
Il sito di restrizione viene deleto in questa reazione.
Trattamento del DNA con estremità piatte
La ligazione di frammenti con estremità piatte non è efficiente quanto quella di frammenti con estremità
coesive, perciò prima di unire il DNA con il vettore di clonaggio si possono eseguire alcune procedure per
aumentare l’efficienza della reazione di ligasi:
1.
AGGIUNTA DEL LINKER
5’ pGGGATCCC
3 CCCTAGGG
DNA a estremità
piatte
linker
Unione del linker al DNA con estremità
piatte mediante DNA ligasi
5’ pGGGATCCC
3’ CCCTAGGG
plasmide
GGGATCCC
CCCTAGGG
Taglio con BamHI
5’p
GA
TC
p
3’
G
CTA
Taglio con BamHI
5’ pGATCCC
3’
GG
GG
CCCTAGp
Unione delle estremità
coesive mediante DNA ligasi
CCG
C
AT G
G TAG
C
G
C GG
C
C AT
TA C
G
The reaction takes place in the presence of 20 to 100 fold molar excess of
linker over vector or fragment, in a small volume, at high enzyme
concentration and at room temperature (25 °C)
Vettori per il clonaggio (III)
pBR322 (15-20 copie per cellula)
La sigla indica: p=plasmide BR= ricercatori che crearono il plasmide nel
1977(Bolivar e Rodriguez) 322=il numero del plasmide nella loro collezione
di DNA. Il numero di copie può essere incrementato con cloramfenicolo
Batteri adesi alla nitrocellulosa
Nitrocellulosa
Plasmidi (ii) : pUC
• gene per la resistenza alla ampicillina;
• origine di replicazione per E.Coli; (Alto
numero di copie: mutazione in ori produce
500-600 copie)
• Multiple Cloning Site (MCS) o polylinker: siti
di restrizione unici più comuni;
• MCS è parte del gene lacZ che codifica per
la β-galattosidasi;
Plasmidi (iii) : pUC
Quando si trasformano cellule di E.coli con il plasmide pUC, il
gene può essere attivato aggiungnedo nel terreno l’induttore
isopropil-β-D-tiogalattopiranoside (IPTG), la cui presenza
induce l’espressione della β-galattosidasi. L’enzima funzionale
idrolizza una sostanza incolore detta 5-bromo-4-cloro-3indolil-β-galattopiranoside (X-Gal) producendo un composto
blu insolubile.
1. Vettori non ricombinanti (senza inserto)
INDUZIONE CON IPTG
MCS
X-Gal idrolizzato: placca blu
GENE PER LA β-GALATTOSIDASI
2. Vettori ricombinanti (senza inserto)
INDUZIONE CON IPTG
GENE INSERITO
INSERIMENTO DEL DNA NEL
MCS CON INTERRUZIONE DEL
GENE β-GAL
X-Gal NON idrolizzato: placca bianca
Vettori derivati da virus (II)
DNA
testa
coda
I fagi sono stati utilizzati per la costruzione di librerie geniche perchè hanno permesso di introdurre
frammenti più grandi di DNA rispetto ai plasmidi. Il DNA del batteriofago λ è lungo circa 50 kb,
approssimativamente 20 dei quali risultano indispensabili agli eventi di integrazione-escissione (I/E). Per
formare le genoteche si è ragionato sulla possibilità di sostituire queste 20 kb con altrettante kb di DNA
clonato. Una simile molecola di DNA si potrebbe perpetuare sotto forma di batteriofago λ
“ricombinante” tramite successivi cicli litici.
Vettori derivati da virus (I)
-
Per inserti lunghi (più di 5kb) si usano vettori derivanti dal batteriofago λ in quanto offrono una
efficienza di clonaggio superiore di circa 16 volte rispetto ai vettori plasmidici;
il batteriofago λ è un fago con DNA lineare a doppia elica, lungo circa 49 kb in grado di infettare
E.Coli, inserendogli il proprio DNA attraverso la membrana cellulare
il DNA del fago λ può replicarsi secondo due modalità:
1.
2.
si integra nel cromosoma di E. coli dove resta quiesciente fino a quando un segnale ne
promuove l’escissione (ciclo lisogenico)
si replica appena infetta la cellula, sintetizza le proteine della testa e della coda, si
formano nuove particelle fagiche (ciclo litico)
Le due isoforme del genoma del fago λ
I processi di taglio e di impacchettamento riconoscono solo i siti cos
La mappa genetica del fago λ
Il cambiamento della struttura delle regioni interne del genoma del fago, ad
esempio per inserzione di nuovi geni, non ha effetto sugli eventi di taglio e di
impacchettamento se non si altera eccessivamente la lunghezza totale del
genoma
I due problemi che si sono dovuti risolvere
prima di poter sviluppare vettori di clonaggio λ
Schema per l’ uso del fago λ come vettore di clonaggio
Frammenti di ≅15 kbp possono essere clonati in vettori λ
Il batteriofago λ
come vettore
Il sistema di impacchettamento di λ può inserire nella struttura della
testa soltanto molecole di DNA di lunghezza compresa tra 37 e 52 Kb
Clonaggio di geni con vettori basati sul fago λ
Trasferimento
del DNA
circolare
ricombinante per
trasformazione
chimica
Packaging in
vitro
Infezione di
E.coli con le
particelle
fagiche
ricombinanti
Selezione dei ricombinanti attraverso isolamento delle placche fagiche. Ciascuna
placca deriva da una singola cellula infettata e contiene particelle fagiche identiche.
COSMIDI
PLASMIDI RICOMBINANTI CHE UNISCONO
LE CARATTERISTICHE DEI PLASMIDI
TRADIZIONALI E QUELLE DEL
BATTERIOFAGO λ
SONO PICCOLE MOLECOLE DI DNA
CIRCOLARE (5000-7000 bp) CHE
CONTENGONO:
♦UN ORIGINE DI REPLICAZIONE
♦UNO O PIU’ MARCATORI DI SELEZIONE
♦UN POLYLINKER
♦UN SITO COS
CONSENTONO IL CLONAGGIO DI
FRAMMENTI DI DNA MOLTO LUNGHI
(FINO A 45000 bp)
NELLA CELLULA INFETTATA IL
COSMIDE TORNA A MOLTIPLICARSI
COME UN NORMALE PLASMIDE
NON PUO’ FORMARE PARTICELLE
FAGICHE IN QUANTO NON POSSIEDE I
GENI STRUTTURALI DI λ
I BATTERIOFAGI ED I COSMIDI
SONO UTILIZZATI COME VETTORI
PER LA COSTRUZIONE DI LIBRERIE
GENOMICHE
Cosmidi
Possono trasportare 40 kb di DNA clonato e possono essere mantenuti come plasmidi in E. Coli.
Vettori di clonaggio
Vector system
Host cell
Insert capacity (kb)
Plasmid
E. coli
0.1-10
Bacteriophage l
E. coli
10-20
Cosmid
E. coli
35-45
Bacteriophage P1
E. coli
80-100
BAC (bacterial artificial
chromosome)
E. coli
50-300
P1 bacteriophage-derived
AC
E. coli
100-300
YAC
Yeast
100-2,000
Genoma e trascrittoma
Vettori per il clonaggio (I)
Per clonare una qualsiasi molecola di DNA è necessario inserirla in un vettore per il clonaggio.
Questi elementi di DNA possono essere mantenuti e propagati in un organismo ospite in cui il vettore
possa replicarsi. Un tipico ospite è Escherichia Coli che cresce e si divide rapidamente. Qualsiasi vettore
con un origine di replicazione adatta si replica con successo in E.Coli (assieme al DNA inserito). Quindi,
qualsiasi DNA inserito in un vettore può essere amplificato (se ne possono produrre quantità illimitate)
e usato per successive analisi
Libreria genica: ogni vettore
contiene un frammento diverso di
DNA estraneo
Isolamento di un clone mediante
screening della libreria
Amplificazione
del singolo clone
FASI GENERALI PER LA COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA
GENOMICA
• 1- Frammentazione del genoma (Digestione con endonuclesi
di restrizione, Frammentazione meccanica)
• 2- Ligazione con il vettore (Ligazione con estremità coesive,
estremità piatte)
• 3- Introduzione nella cellula ospite (Trasformazione con DNA
plasmidico ricombinante, Trasfezione con DNA fagico,
Impacchettamento in vitro capsidi fagici)
• 4- Screening dei cloni di interesse (Ibridazione, PCR) F
Le digestioni parziali di un genoma garantiscono la produzione
di una collezione di cloni sovrapposti
Estrazione del DNA dal gel dopo
digestione per restrizione
Library genomica o genoteca
Una libreria genomica è costituita da una serie di cloni ricombinanti che che
include tutto il DNA genomico di una certo organismo
Rappresentatività: una libreria si dice rappresentativa quando contiene, in
almeno una copia, tutte le possibili sequenze
Quanti cloni sono necessari per costruire una intera libreria genomica?
N = ln(1 − P )/ ln(1 − a/b)
N è il numero dei cloni necessari
P è la probabilità che un gene qualunque sia presente
A è la dimensione media dei frammenti di DNA inseriti nel vettore e b è la
lunghezza totale del genoma
Negli organismi superiori i geni sono
differenzialmente espressi nei vari tipi
cellulari
Passaggi per la costruzione di una genoteca di cDNA