modalita` di replicazione

MODALITA’ DI REPLICAZIONE
In teoria è ipotizzabile che il DNA possa
duplicarsi con modalità:
1) semi-conservativa se alla generazione
successiva passano due doppie eliche
entrambi costituite da un'elica vecchia ed
una nuova
2) conservativa se alla generazione
successiva passano una doppia elica
vecchia ed una doppia elica neosintetizzata.
3) dispersiva se alla generazione successiva
passano frammenti di elica neosintetizzate interposti casualmente con
frammenti delle eliche materne
preesistenti.
MESELSON & STAHL’S EXPERIMENT
Meselson e Stahl utilizzarono una colonia di Escherichia coli, in crescita
lineare e sincrona. I batteri furono esposti ad un brodo contenente cloruro
di ammonio NH4Cl, come unica fonte di azoto per l’organicazione. In questo
sale l'atomo di N era sostituito con l'isotopo 14N o 15N.
MESELSON & STAHL’S EXPERIMENT
La sintesi del DNA avviene ad opera
della DNA polimerasi in direzione 5’ 3’.
La replicazione
semiconservativa del DNA
comporta la formazione di
legami covalenti tra un
deossinucleoside trifosfato
entrante ed il terminale 3’
del deossiribosio di un
nucleotide pre-esistente.
Da ciò consegue che la
direzione di replicazione
del DNA procede sempre
nella direzione 5’ – 3’
(relativamente alla polarità
del nucleotide entrante).
DNA replication
Replicone è la zona occupata dalle sequenze di inizio della replicazione
rispetto alla quale le forcelle divaricano in direzione opposte. Nel
cromosoma eucariotico sono presenti più repliconi. Il tempo di replicazione
è tanto più ridotto quanto più elevato è il numero dei repliconi attivi.
Problema 1
Perché una sola attività
enzimatica della DNApolimerasi possa render
conto della
unidirezionalità della
replicazione su
entrambi i filamenti
della doppia elica è
necessario assumere
che la replicazione
proceda in modo
continuo su un
filamento (leading
strand), ed in modo
discontinuo e a ritroso
sull’altro (lagging
strand)
FRAMMENTI DI OKAZAKI
Il terminale 3' del filamento guida (leading strand ) è
sintetizzato in modo continuo, mentre il terminale 5' del
filamento in ritardo (lagging strand) è sintetizzato in
modo discontinuo con i frammenti di Okazaki. Nuovi
frammenti di Okasaki si inseriscono a mano a mano
che la forcella di replicazione si apre, fino ad estendersi
a tutta l'elica da replicare.
Problema 2
La sintesi di DNA necessita di un
“iniziatore” o “primer”….
•
La DNA polimerasi necessità di un
innesco
(primer),
un
breve
polinucleotide appaiato al filamento
stampo. La DNA polimerasi può
soltanto continuare ad addizionare
nucleotidi a partire dall'ossidrile
libero in 3' di questo primer. L'enzima
che è in grado di addizionare
nucleotidi di innesco ad un filamento
di DNA a singola elica è una RNA
polimerasi (primasi). L'innesco è
quindi costituito da ribonucleotidi
anziché da deossiribonucleotidi, ciò
che rende ibridi i frammenti di
Okazaki.
DNA ligase
I frammenti ibridi di Okazaki persistono soltanto per tempi brevi. I ribonucleotidi sono
rimossi ancor prima che la DNA ligasi congiunga covalentemente i restanti deossiribonucleotidi per formare un filamento unico. È la stessa DNA polimerasi che è in
grado di rimuovere i ribonucleotidi procedendo a ritroso lungo il filamento già
sintetizzato.
La duplicazione del DNA si esplica attraverso
il meccanismo della replicazione.
I step: separazione dei filamenti complementari di
DNA mediante l’intervento della DNA elicasi.
II step: l’intervento delle proteine destabilizzatrici
dell’elica.
III step: le topoisomerasi operano il “taglia e cuci”
RUOLO DELL’ELICASI
L'elicasi separa le due eliche cambiando conformazione. Le eliche separate
tenderebbero di nuovo ad avvolgersi laddove casualmente complementari. Le
proteine, SSBP (single strand binding proteins) si legano al DNA a singola
elica mantenendolo disteso.
EFFETTO DI PROTEINE CHE LEGANO IL FILAMENTO
SINGOLO SULLA STRUTTURA DEL DNA
La soluzione per un simile
compattamento è il
superavvolgimento del DNA
• La struttura elicoidale e fibrosa del DNA crea problemi topologici.
Quando la molecola viene avvolta da una parte o dall’altra viene generata
una energia torsionale che provoca il superavvolgimento della molecola.
É come un
Cavo telefonico
IL PROBLEMA DELL’AVVOLGIMENTO DELL’ELICA
PARENTALE DURANTE LA REPLICAZIONE
Una forcella di replicazione batterica
Si muove a 500 nt al secondo
L’elica parentale davanti alla forcella
Deve ruotare a 50 giri al secondo
Ruolo della topoisomerasi I
REAZIONE
DI
TAGLIO
REVERSIBILE
CATALIZZATA
DA
UNA
DNA TOPOISOMERASI I
EUCARIOTICA
L’ENZIMA FORMA UN LEGAME
COVALENTE TEMPORANEO CON IL
DNA IN MODO DA PERMETTERE
UNA LIBERA ROTAZIONE INTORNO
AI LEGAMI COLAVELNTI DEL
FOSFATO
Ruolo della topoisomerasi II
REAZIONE DI ATTRAVERSAMENTO
DELL’ELICA CATALIZZATA DALLA DNA
TOPOISOMERASI II
-RICHIEDE IDROLISI DI ATP
-FORMA LEGAME COVALENTE
ENTRAMBI I FILAMENTI
CON
-PERMETTE
PASSAGGIO
DI
UNA
DOPPIA
ELICA
ATTRAVERSO
LA
ROTTURA
-RISALDA
LA
ROTTURA
DISSOCIA DAL DNA
E
SI
Duplicazione del DNA