Radiofarmaci nella diagnostica e terapia tumorale

RADIOFARMACI NELLA DIAGNOSTICA E TERAPIA TUMORALE
Alla realizzazione di questo progetto di Ricerca concorreranno due unità operative, in cui sono localizzati
gruppi di ricerca con competenze specifiche e complementari, in particolare:
UNITÀ OPERATIVA DI PADOVA,
UNITÀ OPERATIVA DI BARI.
Composizione e Settore di Indagine
Questa tematica si avvale del contributo delle Unità di ricerca di Padova e Bari. La ricerca è orientata ai vari
aspetti inerenti la progettazione, la sintesi, la caratterizzazione chimico fisica e la determinazione delle
proprietà biologiche di radiofarmaci sia per il loro impiego nella diagnostica per immagini che nella
radioterapia dei tumori.
Le Unità del CIRCMSB si avvalgono, inoltre, di innumerevoli collaborazioni con Dipartimenti del CNR e
di diverse Università italiane ed europee.
I recenti progressi ottenuti nel campo della biologia molecolare e cellulare hanno modificato
sostanzialmente l'approccio diagnostico e terapeutico a molte patologie. L'evolversi di tecnologie d'imaging
multimodale non invasive e ad alta risoluzione quali SPECT/CT e PET/CT, nonché lo studio di sonde
molecolari dirette verso specifici bersagli hanno permesso lo sviluppo di un'area di ricerca denominata
imaging molecolare. Questa disciplina, si basa sul concetto di 'molecular targeting', inteso come la selettiva
concentrazione di un agente diagnostico o terapeutico in un tessuto bersaglio, determinata dalla sua
specifica interazione (legame a recettore, interazioni biochimiche e immunologiche) con specie molecolari
(proteine/altri prodotti di espressione genica) chiaramente espresse, o non, in un determinato stato
patologico e fornisce gli strumenti per studiare, qualitativamente e quantitativamente, in maniera non
invasiva, numerosi processi biologici a livello molecolare.
Il 'Molecular targeting', ha costituito il preludio all’espansione di un nuovo settore di ricerca volto alla
progettazione e sviluppo di una nuova classe di composti che combinano le potenzialità per l'imaging con
quelle della terapia: teranostici. La teranostica, dall’inglese ‘theragnostic’, ha origine dalla fusione di due
discipline: la terapia e la diagnostica, e costituisce la nuova frontiera della medicina oncologica.
Questa disciplina utilizza le informazioni ottenute da immagini mediche per stabilire come trattare dal punto
di vista terapeutico i singoli pazienti. Più in dettaglio, vediamo quindi, come le informazioni spaziali fornite
dall’imaging molecolare possono essere utilizzate per stabilire come trattare dal punto di vista terapeutico i
singoli pazienti, rivoluzionando i processi di pianificazione ed esecuzione della terapia oncologica1.
In relazione a ciò, i radionuclidi offrono l’enorme vantaggio di emettere radiazioni di utilità radiobiologica e
raggio d’azione diverse. In linea di principio, questo dà la possibilità di scegliere un radionuclide o una
coppia di radionuclidi che per le proprietà nucleari possono essere impiegati sia per l’ imaging molecolare
sia per la terapia, nello stesso paziente, introducendo il concetto di medicina personalizzata. Idealmente,
questa situazione richiede l’uso, quando è possibile, dello stesso radionuclide teranostico. In alternativa,
l’uso di una coppia di radionuclidi con la stessa struttura elettronica o chimicamente congeneri è
ugualmente adeguato.
Capiamo, quindi, come la teranostica costituisce l’orizzonte futuro di convergenza della diagnostica per
immagini e della radioterapia oncologica.
E’ importante sottolineare che per sfruttare appieno il potenziale curativo offerto dalla moderna radioterapia
di alta precisione, sono necessarie immagini di alta qualità diagnostica per l’identificazione dei volumi
bersaglio. D’altra parte, l’uso ottimale delle informazioni spaziali fornite dall’ imaging molecolare postula
l’estensione alla radioterapia. La radiazione diventa, quindi, un agente terapeutico che può essere modulato
nelle quattro dimensioni dello spazio e del tempo, e la dose può essere determinata con elevata precisione
per produrre localmente un effetto specifico di desiderata magnitudine2.
L’imaging molecolare così come la radioterapia oncologica si avvale dell'uso di molecole radiomarcate
dette radiofarmaci "target-specifici".
L'approccio generalmente utilizzato nella progettazione e sviluppo di queste molecole richiede la sintesi di
radio-complessi, in cui il radionuclide è un metallo spesso appartenente alla serie di transizione, la cui biolocalizzazione è correlata alla capacità degli stessi di interagire con substrati biologici sfruttando le
caratteristiche della molecola nel suo insieme. Così sonde molecolari, opportunamente modificate, possono
essere coniugate a radio-complessi trasferendo a questi ultimi un'elevata biospecificità verso strutture
recettoriali coinvolte in processi infiammatori o degenerativi, permettendone la visualizzazione in ambito
diagnostico ( 99mTc, 64/67Cu, 68Ga, 111In) e la distruzione in ambito terapeutico (186/188Re, 64/67Cu, 90Y, 177Lu).
Il punto focale nello sviluppo di questo tipo di traccianti, risiede nella necessità di disporre di un metodo di
sintesi che non alteri la biospecificità della molecola nativa e che permetta di ottenere il radiofarmaco con
una elevata attività specifica. Gli isotopi radioattivi di metalli di transizione offrono molte opportunità nello
sviluppo di radiofarmaci, e tra di essi il 99mTc ed il 186/188Re giocano un ruolo importante in ambito,
rispettivamente, diagnostico e terapeutico.
A differenza di isotopi di atomi naturalmente presenti nelle molecole biologiche (O, C, N), che possono
essere incorporati nelle molecole direzionatrici/vettrici attraverso la formazione di un legame covalente, gli
isotopi di natura metallica per essere incorporati nelle biomolecole devono essere stabilizzati da un sistema
chelante in un complesso di coordinazione.
La letteratura descrive diverse metodologie sintetiche per la preparazione di radio farmaci target specifici
marcati con metalli radioattivi. In ogni caso, il primo step richiede l’identificazione di uno specifico
bersaglio seguito dalla selezione di una opportuna molecola biologicamente attiva con elevata affinità e
selettività per il substrato biologico precedentemente selezionato.
Queste molecole devono essere dotate di indicazioni cliniche per molti tipi di tumori con alta incidenza
(seno, colon, polmone).
In tutte le procedure riportate la molecola vettrice deve essere: i) modificata con un appropriato sistema
chelante in grado di coordinare il metallo in un opportuno stato di ossidazione; ii) marcata con elevata
attività specifica (bassa concentrazione di legante) e iii) in grado di conservare le sue proprietà chimicofisiche e l’affinità per il corrispondente sito recettoriale. Inoltre, per un uso clinico di routine la procedura
sintetica deve essere predisposta preferibilmente in un unico step e a temperatura ambiente.
Il 99mTc, grazie alle sue proprietà nucleari, basso costo e facile reperibilità, continua ad essere un
radionuclide molto interessante per la preparazione di peptidi radio marcati utilizzabili nella pratica mediconucleare. Negli ultimi anni sono stati sviluppati un elevato numero di approcci atti alla preparazione di
questo tipo di molecole in grado di garantire un’elevata stabilità e specificità del prodotto finale.
Considerando che Tc è un metallo di transizione, la marcatura di queste molecole implica l’uso di un
appropriato sistema chelante (chelante bi-funzionale; BFC) in grado, al contempo, di coordinare stabilmente
il radio-metallo e di legare la molecola biologicamente attiva attraverso legami di natura covalente (fig.1).
In questo approccio, chiamato ‘bifunctional chelate approach’, il complesso è coniugato alla molecola
vettrice direttamente o attraverso uno spaziatore o modificatore farmacocinetico (PKM) le cui funzioni
consistono nel: i)allontanare il complesso dalla biomolecola al fine di minimizzare le reciproche interazioni
che possono alterare la sua affinità/selettività nei confronti del sito recettoriale; ii) modificare il profilo
farmacocinetico del tracciante facilitando la sua eliminazione dai diversi distretti (basso background); iii)
ridurre il suo uptake in organi non bersaglio al fine di garantire un elevato rapporto Target/non Target o
Target/Background (T/B).
Fig.1
Questo tipo di approccio presenta alcune limitazioni in quanto può indurre notevoli perturbazioni delle
proprietà biologiche della molecola nativa (in particolare se si parla di piccoli peptidi) e risulta dipendente
dal tipo di chelante utilizzato per la coordinazione del metallo. Per ovviare a questi limiti recentemente,
sono state proposte nuove strategie di sintesi basate sulla produzione di complessi asimmetrici, caratterizzati
dalla presenza di due differenti leganti polidentati associati allo stesso centro metallico, di cui uno solo di
questi si presenta coniugato covalentemente ad una biomolecola selezionata entro classi di peptidi o di
gruppi farmacofori. Gli esempi più rappresentativi di questa tecnologia sono i sistemi [Tc(CO)3]+,3 e
[Tc(N)(PNP)]2+ (PNP=difosfinoamina). 4,5,6,7 (fig.2).
Fig. 2
Ciononostante l’introduzione in campo clinico di farmaci recettore specifici marcati con 99mTc/188Re rimane
ancora nel suo stadio iniziale: Neotec® (99mTc-depreotide), CEA-Scan® (99mTc-arcitumomab) e AcuTec®
(99mTc-Apcitide) rappresentano, infatti, i soli esempi di radiofarmaci tecneziati approvati da FDA (Food and
Drug Administration) e/o l'EMEA (European Medicines Agency) utilizzati nella pratica medico-nucleare
nella diagnosi di cancro e trombosi. D'altra parte, l'uso clinico di radio-complessi contenenti 188Re quali
potenziali agenti terapeutici è ancora molto limitato, probabilmente a causa della sua complicata chimica di
marcatura rispetto ad altri metalli come il 90Y e 177Lu.
Questo rende la ricerca di nuovi radiofarmaci che utilizza la coppia di radionuclidi 99mTc e 188Re un settore
di ricerca aperto.
UNITÀ DI RICERCA DI PADOVA
In quest’ambito, l’attività di ricerca dell’Unità del CIRCMSB di Padova nel prossimo triennio sarà rivolta
allo sviluppo di nuove molecole radiomarcate, contenenti ioni metallici, da utilizzare in ambito oncologico
quali potenziali agenti teranostici.
Utilizzando gli elementi del gruppo 7 della tavola periodica, il lavoro sarà così orientato: A) Studio
dell'applicabilità delle procedure sintetiche note che utilizzano il frammento molecolare [M(CO)3]+ e
[M(N)(PNP)]2+ (M= 99mTc, 188Re) per la preparazione di radiofarmaci target-specifici. B) Sviluppo di nuovi
metodi sintetici generali che permettano di incorporare un substrato biologicamente attivo (proteine, peptidi,
gruppi farmacofori) nella struttura di un complesso di Tc/Re, senza alterarne la sua biospecificità. A tal fine,
ci si propone di eseguire un minuzioso studio della chimica di base di questi elementi con leganti fosfinici
bi-dentati quali PX (X= SH, NH2) e polidentati quali PXP(difosfina, X= NR, O, S).
In particolare s'intende concentrare l'attività verso la possibilità di ottenere una nuova serie di
eterocomplessi in cui il metallo si trova nello stato di ossidazione 3+ e 1+.
Parallelamente attenzione sarà rivolta alla preparazione e studio di altri radiocomposti a base metallica
utilizzabili nella medicina oncologica come teranostici.
A) Sintesi, valutazione in vitro e in vivo di nuovi complessi monocationici
[99mTc(N)(NS-RGDfk)(PNPn)]+
Negli ultimi anni, in collaborazione con l’Università di Ferrara, l’Unità del CIRCMSB di Padova ha
sviluppato una nuova ed efficiente metodologia per la sintesi in alta resa di azoturo complessi asimmetrici di
Tc(V) utilizzabili nella preparazione di radiofarmaci di perfusione e recettore specifici. Tale metodo si basa
sulle proprietà chimiche del frammento molecolare [Tc(N)(PNP)]2+. Le sue spiccate caratteristiche
elettrofile lo rendono particolarmente reattivo verso specie nucleofile (YZ) contenenti atomi donatori quali
S, O e N dando così origine ad una serie di composti del tipo [Tc(N)(YZ)(PNP)]+/0 (YZ = ditiocarbammati,
DTC; cisteino derivati, cys~) [9].
In particolare, è stato dimostrato che la cisteina è un efficiente sistema chelante per il frammento
[99mTc(N)(PNP)]2+ fornendo un modo semplice per incorporare un vettore biologico in un Tc(N)-complesso.
Cys lega il [Tc(N)(PNP)]2+ attraverso la coppia [NH2,S-] o [O-,S-] dando così origine, rispettivamente a
complessi monocationci o neutri, in alta attività specifica (70 GBq/ mol) caratterizzati da una elevata
stabilità in-vitro ed in-vivo. 6, 9,10,11, 12
I vantaggi dell'applicazione di questa tecnologia sono:
i) alta efficienza di marcatura;
ii) alta resa radiochimica del complesso finale, ottenuto attraverso un percorso di sintesi facilmente
trasferibile ad un idoneo kit liofilizzato,
iii) alta stabilità in-vivo dei complessi;
iv) facile determinazione della natura chimica dei complessi mediante applicazione delle convenzionali
tecniche di analisi chimico-fisiche;
v) facile coniugazione della cisteina al vettore molecolare selezionato;
vi) elevata flessibilità del sistema.
Per questi composti, infatti, l'opportunità di saturare asimmetricamente la sfera di coordinazione del metallo,
attraverso l'uso di due sistemi leganti diversi, difosfina e YZ (DTC, cys~), consente di ottenere una grande
varietà di Tc(N)-agenti, neutri o monocationici. Inoltre, la possibilità di variare indipendentemente i
sostituenti agli atomi di P e N del legante PNP e del co-ligando, permette una fine regolazione delle
proprietà fisico-chimiche del composto finale offrendo un'importante possibilità per ottimizzare il profilo
farmacocinetico dello stesso e conseguentemente una buona opportunità per sviluppare il miglior agente.
L’applicazione della tecnologia [Tc(N)(PNP)]2+ alla marcatura di molecole biologicamente attive è stata
recentemente riportata.13,14,15
Studi biologici di differenti complessi che utilizzano il frammento [Tc(N)(PNP)]2+, dove PNP presenta
sostituenti ingombranti (e.i. CH3CH2OCH2CH2CH2- o CH3OCH2CH2CH2-), hanno mostrato che, mentre
l’elevato ingombro sterico del frammento molecolare non altera l’affinità della biomolecola al proprio
recettore, la sua spiccata lipofilicità è responsabile, in vivo, di un non soddisfacente profilo farmacocinetico
caratterizzato da un elevato accumulo di attività nel tratto gastrointesinale. 13-16
In generale, radiofarmaci target specifici sono progettati per accumularsi selettivamente nel tessuto
bersaglio. Le clearance dal sangue e da tessuti non bersaglio devono essere rapide così da dare un elevato
rapporto Target to Background (T/B) a brevi tempi di iniezione. Di conseguenza, in previsione di una
possibile applicazione della tecnologia [M(N)(PNP)] nell’imaging molecolare, si rende necessaria la
riduzione delle caratteristiche lipofile del frammento molecolare [Tc(N)(PNP)]2+ al fine di migliorare il
profilo farmacocinetico del composto. Questo traguardo potrebbe essere in parte conseguito mediante
l’introduzione di gruppi idrofilici nell’atomo di fosforo o azoto del legante PNP (e.i. CH3OCH2CH2-; CH3-,
HOCH2-). La parallela riduzione dell’elevato ingombro sterico del frammento [Tc(N)(PNP)]2+ dovrebbe
aumentare la specificità della molecola vettrice nei confronti del proprio recettore.
Lo scopo iniziale di questo studio è valutare l’impatto dell’ingombro sterico del frammento [Tc(N)PNP] 2+
sulla sintesi e sul profilo biologico di molecole radiomarcate selezionate all’interno di una classe di peptidi
bioattivi. In seguito, le informazioni ottenute potranno essere utilizzate nello sviluppo di nuovi peptidi
radio-marcati utili in ambito oncologico a scopo diagnostico e/o terapeutico.
Peptidi che si associano a recettori di tipo ‘integrina’ costituiscono un interessante vettore per trasportare
radionuclidi all’interno di cellule tumorali. Questi recettori, in particolare il recettore αvß3, sovra-espressi
sulla superficie di cellule di numerosi tumori solidi, rappresentano un interessante bersaglio per lo sviluppo
di nuovi radio farmaci per la diagnosi precoce e per il trattamento del tumore solido.16
In questo contesto, sequenze peptidiche antagoniste RGD lineari e cicliche sono in grado di associarsi in
modo estremamente selettivo e con alta affinità all’integrina αvß3.
L’attenzione sarà rivolta verso piccole sequenze RGD cicliche come RGDfK .
I leganti usati in questo studio sono riportati in Figura 3.
Il progetto si avvarrà della collaborazione con il Dr.Ruzza, ICB/CNR di Padova e con il gruppo del Dr
Rosato IOV/Padova.
UNITÀ DI RICERCA DI BARI
L’attività di ricerca dell’Unità del CIRCMSB di Bari nel prossimo triennio sarà rivolta alla sintesi e
caratterizzazione di complessi di metalli di transizione con leganti affini e selettivi per la proteina TSPO, da
utilizzare come agenti diagnostici e teranostici delle patologie tumorali.
La "proteina di translocazione 18 kDa" (TSPO), precedentemente nota come recettore periferico delle
benzodiazepine (PBR), è coinvolta in una grande varietà di processi biologici che includono la
proliferazione cellulare, l’apoptosi, la steroidogenesi e l’immunomodulazione.17
L’espressione del TSPO aumenta anche in numerose patologie, quali la sclerosi multipla, l’epilessia, la
corea di Huntington, l’ansia, l’ictus e le malattie neurodegenerative, quali morbo di Alzheimer e morbo di
Parkinson, caratterizzate dall’attivazione della microglia. Il TSPO risulta anche sovraespresso in alcuni tipi
di tumore e in diverse linee cellulari neoplastiche, con una diretta proporzionalità tra sovraespressione del
recettore e malignità del tumore. Infatti, un drammatico incremento nei livelli di TSPO è stato evidenziato
in caso di tumore cerebrale (glioma), carcinoma colon-rettale, epatocarcinoma, adenocarcinoma prostatico e
carcinoma mammario. Inoltre, numerosi studi hanno evidenziato che ligandi per il TSPO, quali PK11195 e
Ro-5-4864, sono in grado di indurre l’apoptosi in cellule cancerose. Tutte queste evidenze hanno portato
all'individuazione del TSPO come struttura bersaglio sfruttabile per:
i) il direzionamento di farmaci antitumorali, quali ad esempio quelli a base di Platino(II),
ii) la preparazione di radiofarmaci per la diagnosi precoce mediante tecniche che prevedano l’uso di metalli
di transizione come il Tecnezio-99m e, infine,
iii) lo sviluppo di agenti teranostici in grado di curare e contestualmente monitorare l’azione dell’agente
chemioterapico.
Tra i numerosi ligandi di sintesi del TSPO, i composti a struttura 2-fenilimidazopiridinacetamidica sono
caratterizzati da alta affinità e selettività per tale recettore.18
L'Unità di Ricerca di Bari possiede le necessarie competenze per disegnare, sintetizzare e caratterizzare
complessi metallici a base di Pt o Re, quest'ultimo utilizzato come modello del 99mTc, con leganti ad elevata
affinità e selettività per il TSPO. Detti leganti sono caratterizzati dalla presenza di un nucleo a struttura 2fenilimidazopiridinica e posso non essere sfruttati per veicolare il farmaco o l'agente diagnostico in maniera
selettiva a livello di determinate cellule o tessuti cancerosi sovraesprimenti il TSPO. 19,20
L'Unità di Ricerca di Bari, basandosi sulla collaborazione con il Dr. Nunzio Denora (Dipartimento
Farmaco-Chimico, Università di Bari), si impegnerà nella sintesi e caratterizzazione spettroscopica e
microanalitica di appropriati leganti altamente affini e selettivi per il TSPO specificatamente disegnati per
formare complessi di coordinazione con Platino(II), Platino(IV) e con metalli di transizione come Renio e
Tecnezio-99m, veicolandoli esclusivamente a livello di determinate cellule o tessuti cancerosi esprimenti
alte concentrazioni di TSPO.
L'utilizzo del Platino è giustificato dal fatto che uno dei farmaci maggiormente usati nella chemioterapia del
cancro è il cisplatino, ovvero cis-diamminodicloroplatino(II).
Introdotto in clinica a livello mondiale nel 1978, è impiegato soprattutto per la terapia dei tumori solidi e
semi-solidi. L’uso di tale farmaco è però limitato dall’insorgenza di alcuni effetti collaterali come nausea,
vomito, mielosoppressione, ototossicità e nefrotossicità concentrazione dipendente. Un altro limite
all'impiego del cisplatino è rappresentato dall'insorgenza di cisplatino-resistenza. Gli studi condotti negli
ultimi trent’anni hanno mirato al raggiungimento di obiettivi quali l’ampliamento dello spettro d’azione e la
riduzione dell’insorgenza di effetti tossici; questi sforzi hanno portato alla sintesi di complessi di seconda
generazione, come il carboplatino, e di terza generazione, come l’ossaliplatino, caratterizzati dalla presenza
di leganti carrier e leganti labili diversi, rispettivamente, dall’ammoniaca e dal cloruro. Sono stati inoltre
preparati complessi di platino(IV) (tetraplatino, iproplatino e satraplatino) per ottenere farmaci
potenzialmente somministrabili per via orale in maniera da ridurre i costi di ospedalizzazione e ottenere una
migliore accettabilità della chemioterapia da parte dei pazienti. La progettazione di complessi di Pt(IV),
dotati di sei siti di coordinazione, offre una più ampia possibilità di modulare alcune proprietà come lipofilia,
stabilità ad agenti specifici (pH, temperatura, radiazioni) etc. In particolare, modulando la lipofilia, si
possono preparare complessi in grado di attraversare più facilmente la membrana cellulare. Inoltre, i
complessi di platino(IV), in seguito a riduzione intracellulare, portano alla formazione di complessi di
platino(II) dotati di attività antitumorale e al contestuale rilascio dei due leganti presenti nelle posizioni
assiali. Pertanto l'utilizzo di leganti bioattivi nelle suddette posizioni, come i ligandi del TSPO dotati di
attività pro-apoptotica, consente di ottenere complessi con un effetto sinergico fra il residuo metallico e
l'attività del legante.
La stessa strategia adottata per il delivery selettivo di complessi di Platino ai tumori che sovraesprimono il
TSPO, sarà adottata per la diagnosi precoce mediante tecniche che prevedono l’uso di metalli di transizione
come il Tecnezio-99m e per lo sviluppo di agenti teranostici in grado di curare e contestualmente
monitorare l’azione dell’agente chemioterapico. Le indagini preliminari verranno condotte utilizzando
isotopi freddi del renio (185/187Re), successivamente le stesse metodiche saranno utilizzate per preparare i
derivati con 99mTc o gli isotopi caldi 186/188Re. Complessi contenenti solo tecnezio potranno essere sfruttati
solo come agenti diagnostici, mentre i complessi dinucleari contenenti Pt e Tc potranno trovare applicazione
come agenti teranostici.
Particolare attenzione sarà anche rivolta alle procedure sintetiche utilizzate per la preparazione di detti
complessi. Infatti, dove possibile, saranno utilizzate condizioni che possano essere adattate alla
formulazione di un kit diagnostico per il quale sono richiesti reazioni semplici, sicure (praticabili ad
esempio in un reparto di medicina nucleare), rapide, che avvengano con ottime rese e che portino a prodotti
a purezza tale da non richiedere successive purificazioni. Il complesso [Re(CO)3(H2O)3]+ ha dimostrato di
essere un eccellente precursore per la sintesi di altri complessi di renio, inoltre la stessa tipologia di
complessi può essere utilizzata per sintetizzare analoghi complessi di tecnezio.21
Successivamente alla fase di caratterizzazione dei complessi preparati sarà condotta la valutazione in vitro
dell’affinità dei complessi mononucleari di platino e di Renio nei confronti del TSPO. Questi saggi saranno
necessari per valutare il mantenimento dell'affinità e della selettività recettoriale del ligando dopo
complessazione del residuo metallico. I risultati di binding recettoriale consentiranno di selezionare i
composti con le migliori caratteristiche di targeting. Successivamente, le stesse reazioni verranno estese agli
isotopi caldi presso l'Unità di Ricerca di Padova o presso istituzioni straniere dotate delle facilities e delle
autorizzazioni necessarie.
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