RADIOFARMACI NELLA DIAGNOSTICA E TERAPIA TUMORALE Alla realizzazione di questo progetto di Ricerca concorreranno due unità operative, in cui sono localizzati gruppi di ricerca con competenze specifiche e complementari, in particolare: UNITÀ OPERATIVA DI PADOVA, UNITÀ OPERATIVA DI BARI. Composizione e Settore di Indagine Questa tematica si avvale del contributo delle Unità di ricerca di Padova e Bari. La ricerca è orientata ai vari aspetti inerenti la progettazione, la sintesi, la caratterizzazione chimico fisica e la determinazione delle proprietà biologiche di radiofarmaci sia per il loro impiego nella diagnostica per immagini che nella radioterapia dei tumori. Le Unità del CIRCMSB si avvalgono, inoltre, di innumerevoli collaborazioni con Dipartimenti del CNR e di diverse Università italiane ed europee. I recenti progressi ottenuti nel campo della biologia molecolare e cellulare hanno modificato sostanzialmente l'approccio diagnostico e terapeutico a molte patologie. L'evolversi di tecnologie d'imaging multimodale non invasive e ad alta risoluzione quali SPECT/CT e PET/CT, nonché lo studio di sonde molecolari dirette verso specifici bersagli hanno permesso lo sviluppo di un'area di ricerca denominata imaging molecolare. Questa disciplina, si basa sul concetto di 'molecular targeting', inteso come la selettiva concentrazione di un agente diagnostico o terapeutico in un tessuto bersaglio, determinata dalla sua specifica interazione (legame a recettore, interazioni biochimiche e immunologiche) con specie molecolari (proteine/altri prodotti di espressione genica) chiaramente espresse, o non, in un determinato stato patologico e fornisce gli strumenti per studiare, qualitativamente e quantitativamente, in maniera non invasiva, numerosi processi biologici a livello molecolare. Il 'Molecular targeting', ha costituito il preludio all’espansione di un nuovo settore di ricerca volto alla progettazione e sviluppo di una nuova classe di composti che combinano le potenzialità per l'imaging con quelle della terapia: teranostici. La teranostica, dall’inglese ‘theragnostic’, ha origine dalla fusione di due discipline: la terapia e la diagnostica, e costituisce la nuova frontiera della medicina oncologica. Questa disciplina utilizza le informazioni ottenute da immagini mediche per stabilire come trattare dal punto di vista terapeutico i singoli pazienti. Più in dettaglio, vediamo quindi, come le informazioni spaziali fornite dall’imaging molecolare possono essere utilizzate per stabilire come trattare dal punto di vista terapeutico i singoli pazienti, rivoluzionando i processi di pianificazione ed esecuzione della terapia oncologica1. In relazione a ciò, i radionuclidi offrono l’enorme vantaggio di emettere radiazioni di utilità radiobiologica e raggio d’azione diverse. In linea di principio, questo dà la possibilità di scegliere un radionuclide o una coppia di radionuclidi che per le proprietà nucleari possono essere impiegati sia per l’ imaging molecolare sia per la terapia, nello stesso paziente, introducendo il concetto di medicina personalizzata. Idealmente, questa situazione richiede l’uso, quando è possibile, dello stesso radionuclide teranostico. In alternativa, l’uso di una coppia di radionuclidi con la stessa struttura elettronica o chimicamente congeneri è ugualmente adeguato. Capiamo, quindi, come la teranostica costituisce l’orizzonte futuro di convergenza della diagnostica per immagini e della radioterapia oncologica. E’ importante sottolineare che per sfruttare appieno il potenziale curativo offerto dalla moderna radioterapia di alta precisione, sono necessarie immagini di alta qualità diagnostica per l’identificazione dei volumi bersaglio. D’altra parte, l’uso ottimale delle informazioni spaziali fornite dall’ imaging molecolare postula l’estensione alla radioterapia. La radiazione diventa, quindi, un agente terapeutico che può essere modulato nelle quattro dimensioni dello spazio e del tempo, e la dose può essere determinata con elevata precisione per produrre localmente un effetto specifico di desiderata magnitudine2. L’imaging molecolare così come la radioterapia oncologica si avvale dell'uso di molecole radiomarcate dette radiofarmaci "target-specifici". L'approccio generalmente utilizzato nella progettazione e sviluppo di queste molecole richiede la sintesi di radio-complessi, in cui il radionuclide è un metallo spesso appartenente alla serie di transizione, la cui biolocalizzazione è correlata alla capacità degli stessi di interagire con substrati biologici sfruttando le caratteristiche della molecola nel suo insieme. Così sonde molecolari, opportunamente modificate, possono essere coniugate a radio-complessi trasferendo a questi ultimi un'elevata biospecificità verso strutture recettoriali coinvolte in processi infiammatori o degenerativi, permettendone la visualizzazione in ambito diagnostico ( 99mTc, 64/67Cu, 68Ga, 111In) e la distruzione in ambito terapeutico (186/188Re, 64/67Cu, 90Y, 177Lu). Il punto focale nello sviluppo di questo tipo di traccianti, risiede nella necessità di disporre di un metodo di sintesi che non alteri la biospecificità della molecola nativa e che permetta di ottenere il radiofarmaco con una elevata attività specifica. Gli isotopi radioattivi di metalli di transizione offrono molte opportunità nello sviluppo di radiofarmaci, e tra di essi il 99mTc ed il 186/188Re giocano un ruolo importante in ambito, rispettivamente, diagnostico e terapeutico. A differenza di isotopi di atomi naturalmente presenti nelle molecole biologiche (O, C, N), che possono essere incorporati nelle molecole direzionatrici/vettrici attraverso la formazione di un legame covalente, gli isotopi di natura metallica per essere incorporati nelle biomolecole devono essere stabilizzati da un sistema chelante in un complesso di coordinazione. La letteratura descrive diverse metodologie sintetiche per la preparazione di radio farmaci target specifici marcati con metalli radioattivi. In ogni caso, il primo step richiede l’identificazione di uno specifico bersaglio seguito dalla selezione di una opportuna molecola biologicamente attiva con elevata affinità e selettività per il substrato biologico precedentemente selezionato. Queste molecole devono essere dotate di indicazioni cliniche per molti tipi di tumori con alta incidenza (seno, colon, polmone). In tutte le procedure riportate la molecola vettrice deve essere: i) modificata con un appropriato sistema chelante in grado di coordinare il metallo in un opportuno stato di ossidazione; ii) marcata con elevata attività specifica (bassa concentrazione di legante) e iii) in grado di conservare le sue proprietà chimicofisiche e l’affinità per il corrispondente sito recettoriale. Inoltre, per un uso clinico di routine la procedura sintetica deve essere predisposta preferibilmente in un unico step e a temperatura ambiente. Il 99mTc, grazie alle sue proprietà nucleari, basso costo e facile reperibilità, continua ad essere un radionuclide molto interessante per la preparazione di peptidi radio marcati utilizzabili nella pratica mediconucleare. Negli ultimi anni sono stati sviluppati un elevato numero di approcci atti alla preparazione di questo tipo di molecole in grado di garantire un’elevata stabilità e specificità del prodotto finale. Considerando che Tc è un metallo di transizione, la marcatura di queste molecole implica l’uso di un appropriato sistema chelante (chelante bi-funzionale; BFC) in grado, al contempo, di coordinare stabilmente il radio-metallo e di legare la molecola biologicamente attiva attraverso legami di natura covalente (fig.1). In questo approccio, chiamato ‘bifunctional chelate approach’, il complesso è coniugato alla molecola vettrice direttamente o attraverso uno spaziatore o modificatore farmacocinetico (PKM) le cui funzioni consistono nel: i)allontanare il complesso dalla biomolecola al fine di minimizzare le reciproche interazioni che possono alterare la sua affinità/selettività nei confronti del sito recettoriale; ii) modificare il profilo farmacocinetico del tracciante facilitando la sua eliminazione dai diversi distretti (basso background); iii) ridurre il suo uptake in organi non bersaglio al fine di garantire un elevato rapporto Target/non Target o Target/Background (T/B). Fig.1 Questo tipo di approccio presenta alcune limitazioni in quanto può indurre notevoli perturbazioni delle proprietà biologiche della molecola nativa (in particolare se si parla di piccoli peptidi) e risulta dipendente dal tipo di chelante utilizzato per la coordinazione del metallo. Per ovviare a questi limiti recentemente, sono state proposte nuove strategie di sintesi basate sulla produzione di complessi asimmetrici, caratterizzati dalla presenza di due differenti leganti polidentati associati allo stesso centro metallico, di cui uno solo di questi si presenta coniugato covalentemente ad una biomolecola selezionata entro classi di peptidi o di gruppi farmacofori. Gli esempi più rappresentativi di questa tecnologia sono i sistemi [Tc(CO)3]+,3 e [Tc(N)(PNP)]2+ (PNP=difosfinoamina). 4,5,6,7 (fig.2). Fig. 2 Ciononostante l’introduzione in campo clinico di farmaci recettore specifici marcati con 99mTc/188Re rimane ancora nel suo stadio iniziale: Neotec® (99mTc-depreotide), CEA-Scan® (99mTc-arcitumomab) e AcuTec® (99mTc-Apcitide) rappresentano, infatti, i soli esempi di radiofarmaci tecneziati approvati da FDA (Food and Drug Administration) e/o l'EMEA (European Medicines Agency) utilizzati nella pratica medico-nucleare nella diagnosi di cancro e trombosi. D'altra parte, l'uso clinico di radio-complessi contenenti 188Re quali potenziali agenti terapeutici è ancora molto limitato, probabilmente a causa della sua complicata chimica di marcatura rispetto ad altri metalli come il 90Y e 177Lu. Questo rende la ricerca di nuovi radiofarmaci che utilizza la coppia di radionuclidi 99mTc e 188Re un settore di ricerca aperto. UNITÀ DI RICERCA DI PADOVA In quest’ambito, l’attività di ricerca dell’Unità del CIRCMSB di Padova nel prossimo triennio sarà rivolta allo sviluppo di nuove molecole radiomarcate, contenenti ioni metallici, da utilizzare in ambito oncologico quali potenziali agenti teranostici. Utilizzando gli elementi del gruppo 7 della tavola periodica, il lavoro sarà così orientato: A) Studio dell'applicabilità delle procedure sintetiche note che utilizzano il frammento molecolare [M(CO)3]+ e [M(N)(PNP)]2+ (M= 99mTc, 188Re) per la preparazione di radiofarmaci target-specifici. B) Sviluppo di nuovi metodi sintetici generali che permettano di incorporare un substrato biologicamente attivo (proteine, peptidi, gruppi farmacofori) nella struttura di un complesso di Tc/Re, senza alterarne la sua biospecificità. A tal fine, ci si propone di eseguire un minuzioso studio della chimica di base di questi elementi con leganti fosfinici bi-dentati quali PX (X= SH, NH2) e polidentati quali PXP(difosfina, X= NR, O, S). In particolare s'intende concentrare l'attività verso la possibilità di ottenere una nuova serie di eterocomplessi in cui il metallo si trova nello stato di ossidazione 3+ e 1+. Parallelamente attenzione sarà rivolta alla preparazione e studio di altri radiocomposti a base metallica utilizzabili nella medicina oncologica come teranostici. A) Sintesi, valutazione in vitro e in vivo di nuovi complessi monocationici [99mTc(N)(NS-RGDfk)(PNPn)]+ Negli ultimi anni, in collaborazione con l’Università di Ferrara, l’Unità del CIRCMSB di Padova ha sviluppato una nuova ed efficiente metodologia per la sintesi in alta resa di azoturo complessi asimmetrici di Tc(V) utilizzabili nella preparazione di radiofarmaci di perfusione e recettore specifici. Tale metodo si basa sulle proprietà chimiche del frammento molecolare [Tc(N)(PNP)]2+. Le sue spiccate caratteristiche elettrofile lo rendono particolarmente reattivo verso specie nucleofile (YZ) contenenti atomi donatori quali S, O e N dando così origine ad una serie di composti del tipo [Tc(N)(YZ)(PNP)]+/0 (YZ = ditiocarbammati, DTC; cisteino derivati, cys~) [9]. In particolare, è stato dimostrato che la cisteina è un efficiente sistema chelante per il frammento [99mTc(N)(PNP)]2+ fornendo un modo semplice per incorporare un vettore biologico in un Tc(N)-complesso. Cys lega il [Tc(N)(PNP)]2+ attraverso la coppia [NH2,S-] o [O-,S-] dando così origine, rispettivamente a complessi monocationci o neutri, in alta attività specifica (70 GBq/ mol) caratterizzati da una elevata stabilità in-vitro ed in-vivo. 6, 9,10,11, 12 I vantaggi dell'applicazione di questa tecnologia sono: i) alta efficienza di marcatura; ii) alta resa radiochimica del complesso finale, ottenuto attraverso un percorso di sintesi facilmente trasferibile ad un idoneo kit liofilizzato, iii) alta stabilità in-vivo dei complessi; iv) facile determinazione della natura chimica dei complessi mediante applicazione delle convenzionali tecniche di analisi chimico-fisiche; v) facile coniugazione della cisteina al vettore molecolare selezionato; vi) elevata flessibilità del sistema. Per questi composti, infatti, l'opportunità di saturare asimmetricamente la sfera di coordinazione del metallo, attraverso l'uso di due sistemi leganti diversi, difosfina e YZ (DTC, cys~), consente di ottenere una grande varietà di Tc(N)-agenti, neutri o monocationici. Inoltre, la possibilità di variare indipendentemente i sostituenti agli atomi di P e N del legante PNP e del co-ligando, permette una fine regolazione delle proprietà fisico-chimiche del composto finale offrendo un'importante possibilità per ottimizzare il profilo farmacocinetico dello stesso e conseguentemente una buona opportunità per sviluppare il miglior agente. L’applicazione della tecnologia [Tc(N)(PNP)]2+ alla marcatura di molecole biologicamente attive è stata recentemente riportata.13,14,15 Studi biologici di differenti complessi che utilizzano il frammento [Tc(N)(PNP)]2+, dove PNP presenta sostituenti ingombranti (e.i. CH3CH2OCH2CH2CH2- o CH3OCH2CH2CH2-), hanno mostrato che, mentre l’elevato ingombro sterico del frammento molecolare non altera l’affinità della biomolecola al proprio recettore, la sua spiccata lipofilicità è responsabile, in vivo, di un non soddisfacente profilo farmacocinetico caratterizzato da un elevato accumulo di attività nel tratto gastrointesinale. 13-16 In generale, radiofarmaci target specifici sono progettati per accumularsi selettivamente nel tessuto bersaglio. Le clearance dal sangue e da tessuti non bersaglio devono essere rapide così da dare un elevato rapporto Target to Background (T/B) a brevi tempi di iniezione. Di conseguenza, in previsione di una possibile applicazione della tecnologia [M(N)(PNP)] nell’imaging molecolare, si rende necessaria la riduzione delle caratteristiche lipofile del frammento molecolare [Tc(N)(PNP)]2+ al fine di migliorare il profilo farmacocinetico del composto. Questo traguardo potrebbe essere in parte conseguito mediante l’introduzione di gruppi idrofilici nell’atomo di fosforo o azoto del legante PNP (e.i. CH3OCH2CH2-; CH3-, HOCH2-). La parallela riduzione dell’elevato ingombro sterico del frammento [Tc(N)(PNP)]2+ dovrebbe aumentare la specificità della molecola vettrice nei confronti del proprio recettore. Lo scopo iniziale di questo studio è valutare l’impatto dell’ingombro sterico del frammento [Tc(N)PNP] 2+ sulla sintesi e sul profilo biologico di molecole radiomarcate selezionate all’interno di una classe di peptidi bioattivi. In seguito, le informazioni ottenute potranno essere utilizzate nello sviluppo di nuovi peptidi radio-marcati utili in ambito oncologico a scopo diagnostico e/o terapeutico. Peptidi che si associano a recettori di tipo ‘integrina’ costituiscono un interessante vettore per trasportare radionuclidi all’interno di cellule tumorali. Questi recettori, in particolare il recettore αvß3, sovra-espressi sulla superficie di cellule di numerosi tumori solidi, rappresentano un interessante bersaglio per lo sviluppo di nuovi radio farmaci per la diagnosi precoce e per il trattamento del tumore solido.16 In questo contesto, sequenze peptidiche antagoniste RGD lineari e cicliche sono in grado di associarsi in modo estremamente selettivo e con alta affinità all’integrina αvß3. L’attenzione sarà rivolta verso piccole sequenze RGD cicliche come RGDfK . I leganti usati in questo studio sono riportati in Figura 3. Il progetto si avvarrà della collaborazione con il Dr.Ruzza, ICB/CNR di Padova e con il gruppo del Dr Rosato IOV/Padova. UNITÀ DI RICERCA DI BARI L’attività di ricerca dell’Unità del CIRCMSB di Bari nel prossimo triennio sarà rivolta alla sintesi e caratterizzazione di complessi di metalli di transizione con leganti affini e selettivi per la proteina TSPO, da utilizzare come agenti diagnostici e teranostici delle patologie tumorali. La "proteina di translocazione 18 kDa" (TSPO), precedentemente nota come recettore periferico delle benzodiazepine (PBR), è coinvolta in una grande varietà di processi biologici che includono la proliferazione cellulare, l’apoptosi, la steroidogenesi e l’immunomodulazione.17 L’espressione del TSPO aumenta anche in numerose patologie, quali la sclerosi multipla, l’epilessia, la corea di Huntington, l’ansia, l’ictus e le malattie neurodegenerative, quali morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson, caratterizzate dall’attivazione della microglia. Il TSPO risulta anche sovraespresso in alcuni tipi di tumore e in diverse linee cellulari neoplastiche, con una diretta proporzionalità tra sovraespressione del recettore e malignità del tumore. Infatti, un drammatico incremento nei livelli di TSPO è stato evidenziato in caso di tumore cerebrale (glioma), carcinoma colon-rettale, epatocarcinoma, adenocarcinoma prostatico e carcinoma mammario. Inoltre, numerosi studi hanno evidenziato che ligandi per il TSPO, quali PK11195 e Ro-5-4864, sono in grado di indurre l’apoptosi in cellule cancerose. Tutte queste evidenze hanno portato all'individuazione del TSPO come struttura bersaglio sfruttabile per: i) il direzionamento di farmaci antitumorali, quali ad esempio quelli a base di Platino(II), ii) la preparazione di radiofarmaci per la diagnosi precoce mediante tecniche che prevedano l’uso di metalli di transizione come il Tecnezio-99m e, infine, iii) lo sviluppo di agenti teranostici in grado di curare e contestualmente monitorare l’azione dell’agente chemioterapico. Tra i numerosi ligandi di sintesi del TSPO, i composti a struttura 2-fenilimidazopiridinacetamidica sono caratterizzati da alta affinità e selettività per tale recettore.18 L'Unità di Ricerca di Bari possiede le necessarie competenze per disegnare, sintetizzare e caratterizzare complessi metallici a base di Pt o Re, quest'ultimo utilizzato come modello del 99mTc, con leganti ad elevata affinità e selettività per il TSPO. Detti leganti sono caratterizzati dalla presenza di un nucleo a struttura 2fenilimidazopiridinica e posso non essere sfruttati per veicolare il farmaco o l'agente diagnostico in maniera selettiva a livello di determinate cellule o tessuti cancerosi sovraesprimenti il TSPO. 19,20 L'Unità di Ricerca di Bari, basandosi sulla collaborazione con il Dr. Nunzio Denora (Dipartimento Farmaco-Chimico, Università di Bari), si impegnerà nella sintesi e caratterizzazione spettroscopica e microanalitica di appropriati leganti altamente affini e selettivi per il TSPO specificatamente disegnati per formare complessi di coordinazione con Platino(II), Platino(IV) e con metalli di transizione come Renio e Tecnezio-99m, veicolandoli esclusivamente a livello di determinate cellule o tessuti cancerosi esprimenti alte concentrazioni di TSPO. L'utilizzo del Platino è giustificato dal fatto che uno dei farmaci maggiormente usati nella chemioterapia del cancro è il cisplatino, ovvero cis-diamminodicloroplatino(II). Introdotto in clinica a livello mondiale nel 1978, è impiegato soprattutto per la terapia dei tumori solidi e semi-solidi. L’uso di tale farmaco è però limitato dall’insorgenza di alcuni effetti collaterali come nausea, vomito, mielosoppressione, ototossicità e nefrotossicità concentrazione dipendente. Un altro limite all'impiego del cisplatino è rappresentato dall'insorgenza di cisplatino-resistenza. Gli studi condotti negli ultimi trent’anni hanno mirato al raggiungimento di obiettivi quali l’ampliamento dello spettro d’azione e la riduzione dell’insorgenza di effetti tossici; questi sforzi hanno portato alla sintesi di complessi di seconda generazione, come il carboplatino, e di terza generazione, come l’ossaliplatino, caratterizzati dalla presenza di leganti carrier e leganti labili diversi, rispettivamente, dall’ammoniaca e dal cloruro. Sono stati inoltre preparati complessi di platino(IV) (tetraplatino, iproplatino e satraplatino) per ottenere farmaci potenzialmente somministrabili per via orale in maniera da ridurre i costi di ospedalizzazione e ottenere una migliore accettabilità della chemioterapia da parte dei pazienti. La progettazione di complessi di Pt(IV), dotati di sei siti di coordinazione, offre una più ampia possibilità di modulare alcune proprietà come lipofilia, stabilità ad agenti specifici (pH, temperatura, radiazioni) etc. In particolare, modulando la lipofilia, si possono preparare complessi in grado di attraversare più facilmente la membrana cellulare. Inoltre, i complessi di platino(IV), in seguito a riduzione intracellulare, portano alla formazione di complessi di platino(II) dotati di attività antitumorale e al contestuale rilascio dei due leganti presenti nelle posizioni assiali. Pertanto l'utilizzo di leganti bioattivi nelle suddette posizioni, come i ligandi del TSPO dotati di attività pro-apoptotica, consente di ottenere complessi con un effetto sinergico fra il residuo metallico e l'attività del legante. La stessa strategia adottata per il delivery selettivo di complessi di Platino ai tumori che sovraesprimono il TSPO, sarà adottata per la diagnosi precoce mediante tecniche che prevedono l’uso di metalli di transizione come il Tecnezio-99m e per lo sviluppo di agenti teranostici in grado di curare e contestualmente monitorare l’azione dell’agente chemioterapico. Le indagini preliminari verranno condotte utilizzando isotopi freddi del renio (185/187Re), successivamente le stesse metodiche saranno utilizzate per preparare i derivati con 99mTc o gli isotopi caldi 186/188Re. Complessi contenenti solo tecnezio potranno essere sfruttati solo come agenti diagnostici, mentre i complessi dinucleari contenenti Pt e Tc potranno trovare applicazione come agenti teranostici. Particolare attenzione sarà anche rivolta alle procedure sintetiche utilizzate per la preparazione di detti complessi. Infatti, dove possibile, saranno utilizzate condizioni che possano essere adattate alla formulazione di un kit diagnostico per il quale sono richiesti reazioni semplici, sicure (praticabili ad esempio in un reparto di medicina nucleare), rapide, che avvengano con ottime rese e che portino a prodotti a purezza tale da non richiedere successive purificazioni. Il complesso [Re(CO)3(H2O)3]+ ha dimostrato di essere un eccellente precursore per la sintesi di altri complessi di renio, inoltre la stessa tipologia di complessi può essere utilizzata per sintetizzare analoghi complessi di tecnezio.21 Successivamente alla fase di caratterizzazione dei complessi preparati sarà condotta la valutazione in vitro dell’affinità dei complessi mononucleari di platino e di Renio nei confronti del TSPO. Questi saggi saranno necessari per valutare il mantenimento dell'affinità e della selettività recettoriale del ligando dopo complessazione del residuo metallico. I risultati di binding recettoriale consentiranno di selezionare i composti con le migliori caratteristiche di targeting. Successivamente, le stesse reazioni verranno estese agli isotopi caldi presso l'Unità di Ricerca di Padova o presso istituzioni straniere dotate delle facilities e delle autorizzazioni necessarie. BIBLIOGRAFIA 1. Bentzen, SM. (2005),Theragnostic imaging for radiation oncology: dose-painting by numbers. Lancet Oncology , 6, 112. 2. Srivrastava, SC, (2010) Theragnostic radiometals: getting closer to personalized medicine. Technetium and other metals in Chemistry and Medicine. Eds by Mazzi, U, Eckelman WC , Volkert W.A. 2010, XXXV-XLIV. 3. Alberto R., (2005) New organometallic technetium complexes for radiopharmaceutical imaging Top Curr Chem 252, 1-44 and literature therein. 4. Bolzati C, Boschi A, Duatti A, Prakash S, Uccelli L, Refosco F, Tisato F, Bandoli G. 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