Aspetti molecolari di
Klebsiella pneumoniae
resistente ai carbapenemi
Alessandra Carattoli
Istituto Superiore di Sanità, Roma
in breve
1.
2.
3.
4.
a)
b)
c)
d)
Meccanismo d’azione beta-lattamici
Meccanismi di resistenza ai carbapenemi
Tipizzazione molecolare dei ceppi
Le carbapenemasi di successo
VIM-1
OXA-48
KPC
NDM-1
Meccanismo d’azione dei beta-lattamici
interazione con proteine della sintesi del peptidoglicano
(transpeptidasi, endopeptidasi e carbossipeptidasi)
“penicillin binding proteins”
LPS
PORINA
PBP
Spazio Periplasmico
GRAM +
GRAM -
+
Resistenza ai carbapenemi in
Klebsiella pneumoniae
MEM
Hodge Test
1- Produzione di beta-lattamasi e
ridotta permeabilità al farmaco
Produzione di beta-lattamasi e
ridotta permeabilità al farmaco
MW
ETP R
MEM R
IMP I
ETP R
WT
82644937-
Ceppi
ESBL
ERT
IMP
MEM
ERT-R
POS
R≥8
R≥8
R≥8
ERT-R
POS
R≥8
S≤1
S=1
ERT- S
POS
S ≤ 0.5
S≤1
S ≤ 0.5
-porina
2619-
Outer membrane
proteins (OMPs)
porine
+
Resistenza ai carbapenemi in
Klebsiella pneumoniae
MEM
Hodge Test
2- Produzione di carbapenemasi
b-lactamasi
Penicillins
Early
generation
cephalosporins
Second and
b-lactam/ Carbapenems
third
b-lactamase
generation
inhibitor
cephalosporins combinations
ESBL
SHV, TEM, CTX-M
Metallo-beta Lattamasi
Cephalosporinasi, o AmpC
KPC, GES
IMP, VIM, NDM
CMY, FOX, MOX, LAT
Oxacillinase
OXA1
OXA48
OXA58
OXA23
a)
Identificazione geni delle carbapenemasi.- PCR- sequenza
Primer
IMP-F
Sequence, 5′ → 3′
GGAATAGAGTGGCTTAAYTC
IMP-R
TCGGTTTAAYAAAACAACCACC
VIM-F
GATGGTGTTTGGTCGCATA
VIM-R
CGAATGCGCAGCACCAG
OXA-48-F
GCGTGGTTAAGGATGAACAC
OXA-48-R
CATCAAGTTCAACCCAACCG
NDM-F
GGTTTGGCGATCTGGTTTTC
NDM-R
CGGAATGGCTCATCACGATC
KPC-Fm
CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG
KPC-Rm
CTTGTCATCCTTGTTAGGCG
Gene
blaIMP
Product size, bp
232
blaVIM
390
blaOXA-48
438
blaNDM
621
blaKPC
798
Plasmidi :
Molecole di DNA circolari extracromosomali che replicano
autonomamente dal cromosoma batterico
Non portano geni essenziali per la vita del batterio, ma
geni accessori (resistenze) di cui promuovono il
trasferimento orizzontale
nuc
tnpA
IS26
aacA4
blaVIM-1
intI1
uvp1
hyp
hyp
DLocus Tra
KJI
EcoRII
kikA
korB
korA
blaSHV-12
tnpA
IS26
tnpR
tnpA
tnpM
int1
dfrA14
hyp
IS6100
tnpA
IS26
DIS26
qnrS1
DfipA
IncN rep
ardK
mpr
mucB
mucA
ardB
ardR
ccgEIII
ardA
ccgAI
ccgAII
stbC
stbB
stbA
oriT
DLocus Tra
L MABCDENOFG
korA
korB
kikA
EcoRII
uvp1
Locus Tra
KJI
IS6100
tnpA
nuc
IS6100
IS26
int1
blaVIM-1
aacA7
dfr1
aadA1
IS26
tnpA
tnpA
IS1222
IS903B
strB
strA
IS1133
int1
dfr1
aadA1
IS1
IS26
aph
IS26
int1
dfrA12
aadA2
Mer locus
tnpA
DfipA
IncN rep
ardK
mpr
mucB
mucA
ardB
ardR
ccgEIII
ccgD
ccgB
ardA
ccgAI
ccgAII
stbC
stbB
stbA
oriT
DLocus Tra
VIM-1: Epidemia di un plasmide IncN
Nordmann et al. EID 17, 2011
pNL194- VIM-1
GFOENDCBAM L
pKOX105- VIM-1
VIM-1
Elementi mobili
Altri geni di resistenza
Replicazione
Geni plasmidici
(Miriagou et al 2010, Carattoli et al. 2010)
Oxa-48: Epidemia di un plasmide IncL/M
Nordmann et al. EID 17, 2011
pOXA-48a
Locus Tra
excA
korC
ssb
mobC
mobA
nikB
nikA
resolvase
parA
parB
nuc
pemI, pemK
mucA
mucB
lysR
blaOXA-48
IS1999
IS1999
trbC,B,A,N
HIJK priLMNOPQRUWXY
IncL/M rep
Klebsiella pneumoniae,
61,881 bp
JN626286
K. pneumoniae KPC-positive 2010-2011
% di ceppi isolati
Ceppi ES-Kp
70
Ceppi ER-Kp
60
Ceppi KPC-3-Kp
50
40
30
20
10
0
Giugno 2008 Dicembre 2009
Ottobre 2010 - Maggio
2011
Tipizzazione dei ceppi
TYPING
MLST:
Basato sulle sequenze
7 Geni housekeeping
Potere discriminante moderato
Brisse et al. PlosOne 2009
FINGERPRINTING
AFLP, PFGE:
Basato sulle bande
Genoma intero
Potere discriminante alto
Tipizzazione dei ceppi
ST512/ST258
MK
gap
infB
mdh
pgi
phoE
rpoB
tonB
ST
2
9
2
1
13
1
16
37
54
3
1
1
1
1
79
512
3
3
1
1
1
1
79
258
Multi Locus Sequence Typing (MLST)
PCR e sequenza di 7 geni conservati
ST37
Multiplex Real-Time PCR for Detection of an Epidemic KPCProducing Klebsiella pneumoniaeST258 Clone
Chen et al. Antimicrob. Agents Chemother.June 2012 vol. 56 no.
6 3444-3447
Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
IS6100
dfrA14
intI1
tnpM
tnpR
uvp1
EcoRII
korA
korB
kikA
GFOENDCB
finO
WU N FQ
trbB
trbF
trbE
MJY ALEKBPV
trbC
tnpA
arsC
arsB
arsA
arsD
arsR
DLocus Tra
KJI
trbI
oriT
P12-KPC-3
tnpA
tnpA
ISkpn7
blaKPC-3
ISkpn6
tnpA
tnpA
nuc
IncN rep
ardK
mpr
mucB
mucA
ardB
ardR
ccgEIII
hyp
ccgAI
ccgAII
stbC
stbB
stbA
oriT
DLocus Tra
DfipA
tnpA
IS26
tnpA
tnpA
sul1
aph
DtnpA
tnpA
blaTEM
blaOXA-9
aadA1
aacA4
res Tn3
excA
ISEc8
pndR
ISkpn6
blaKPC-2
ISkpn7
tnpA
tnpR
Glut. locus
tnpA
ISkpn7
blaKPC-2
ISKpn6
tnpA
uvp1
tnpR
korA
korB
kikA
EcoRII
Locus Tra
fipA
nuc
IncN rep
ardK
mpr
mucB
mucA
ardB
ardR
ccgEIII
ccgD
ccgC
ardA
ccgAI
stbC
stbB
stbA
oriT
KJI
TypeI restr
parB
parA
FIBK rep
umuC
umuD
stbA
stbB
DNA meth.
ardB
ardA
ssb
parB
IS1
Tox-AntiTox
res
tnpA
res
tnpA
Locus mer
IS26
blaTEM-1
tnpA
FII K2 rep
res
tnpA
ISKpn7
blaKPC-3
ISKpn6
tnpA
tnpA
tnpA
KPC- in un trasposone
P9-KPC-2
GFOENDCBAM L
(Gootz et al. 2009)
KPC
AM L
HGSTDIX
(Gootz et al. 2009)
pKpQIL
(Leavitt, et al. 2010)
moB
moC
ropB
relE
M-transf
Tn3 tnpA
Tn3 tnpR
aac6
IS26
cloacin
aminoglicosidi
KPC
Elementi mobili
Altri geni di resistenza
macrolidi
arsenico
ColEST258, Italy, 13640 bp, JN247853
Replicazione
Geni virulenza
Geni plasmidici
rame e argento
EKBPV WU N FQ
finO
trbB
trbF
trbE
MJY
trbC
finO
trbB
trbF
HGSTDIX
trbI
oriT
tnpA
WU N FQ
finO
trbB
trbF
trbE
trbC
trbI
oriT
WU N FQ
parB
SOS
umuC
umuD
Rev transcr
ssb
trbE
MJY ALEKBPV
trbC
trbI
oriT
TypeI restr
parB
parA
FIBK rep
umuC
umuD
stbA
stbB
DNA meth.
ardB
ardA
ssb
parB
IS1
Tox-AntiTox
res
tnpA
res
tnpA
Locus mer
IS26
blaTEM-1
tnpA
FII K2 rep
res
tnpA
ISKpn7
blaKPC-3
ISKpn6
tnpA
tnpA
tnpA
MJY ALEKBPV
IS903
FIB rep
sopA
sopB
tnpA
Locus silver
Locus copper
tnpA
tnpA
Locus Ars
TypeI restr
parB
parA
FIBK rep
umuC
umuD
stbA
stbB
DNA meth.
ardB
ardA
ssb
parB
IS1
Tox-AntiTox
res
tnpA
res
tnpA
KPC-3
Locus mer
IS26
aph
IS26
blaTEM-1
tnpA
FII K2 rep
res
tnpA
ISKpn7
blaKPC-3
ISKpn6
tnpA
tnpA
pKpQIL,
IS66
IS1
cat
Tn21
intI1
dhfrA12
aadA2
sul1
IS6100
mrx
mphA
IS26
ABC
IS5
IS1
tnpA
ABC glut
Iron(3)uptake
FII K1 rep
IS903D
lacY, Z, I
Plasmidi di K. pneumoniae ST258 Garcia-Fernandez et al. 2012 AAC 56(4):2143-5
Israel, 113637 bp, NC_014016
Leavitt, et al. 2010. Antimicrob.
Agents Chemother. 54: 4493-4496.
mercurio
pKpQIL, Italy, 114986 bp, JN233705
HGSTDIX
Iron (3) uptake, ABC transporter
trimethoprim, sulfonamidi, streptomicina, cloramphenicolo
pKPN-IT, Italy 208193 bp, JN233704
HGSTDIX
KP e New Delhi Metallo Beta Lactamase
Epidemia di un gene: NDM-1
Elementi
Cloni
diversi
mobili diversi
Giske C G et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2012;56:2735-2738
Tn7
rhs delta
insE
groEL
groES
dsbC
trpF
bleMBL
blaNDM-1
ISKpn14-like
DIS30
aphA6
istA
tniA
DtniB
tnpA
aac3
insA
insB
rmtC
nth
dmc
sul1
qacDE1
aac(6’)-Ib
intI1
Tn21tnpR
Tn21tnpA
IS4321
DNApri
IncA/C rep
stbA
traG
traH
traF
elicase
ter
exonuclease
phage- int
hsdM
hsdS
elicase
hsdR
excisionase
RmtC
sulfonamidi, aminoglicosidi
NDM-1
Elementi mobili
Altri geni di resistenza
parB
dsbA
sppA
DNApolIII
DNA methylase
Methyl-transferase
korB
parA
DNA methylase
DANpolIII
DNA methylase
ISEc23
sugE
blc
blaCMY-6
ISEcp1
hyp
dsbC
parB
dsbA
sppA
korB
parA
DNA methylase
Methyl-transferase
sulfonamidi, aminoglicosidi,
cloramphenicolo, eritromicina, rifampina
parB
dsbA
sppA
hyp
sugE
blc
blaCMY-4
ISEcp1
traN
traU
traW
trhF
traC
dsbC
traN
traU
traW
trhF
traC
ATPase
ssb
ybA
Phage- hyp
Phage- hyp
ngrC
rhs delta
groEL
groES
Oxidoreductase
bleMBL
blaNDM-1
ISKpn14
rmtC
Methyl-transferase
endonucIII
sul1
cmlA
aadA
ereA
arr2
intI1
Tn1696tnpR
Tn1696tnpA
IS4321
DNApri
Tn7
phage- int
TypeI restriction
nuclease
Type I restriction
recF
hsdR
traG
traH
traF
ter
yacC
stbA
IncA/C rep
16SKenya,
rRNA
methylase RmtC
IncA/C pNDM-KN, Klebsiella pneumoniae,
162746 bp, JN157804, Carattoli et al. 2011
DNApolIII
DNA methylase
Methyl-transferase
korB
parA
DNA methylase
hyp
sugE
blc
blaCMY-2
ISEcp1
ATPase
ssb
DNA restriction
Phage- hyp
ybA
DNA methylase
DNA methylase
ArmA
ssb
ATPase
traN
traU
traW
trhF
traC
dsbC
NDM-1
ngrC
rhs
IS4321R
merR
Tn3tnpA
Tn3tnpR
blaTEM-1
IS903
blaNDM-1
bleMBL
trpF
DgroES
groEL
insE
IS903
IS1
tnp
mph2
mel
tnpD
IS5
armA
IS5
sul1
qacDE1
aadA2
dfrA12
intI1
Tn1696tnpR
Tn1696tnpA
IS4321L
DNApri
Tn7
IncA/C rep
stbA
traG
traH
traF
elicase
kfrA
exonuclease
phage- int
TypeI restriction
Type I restriction
hsdR
I plasmidi più diffusi con NDM-1
CMY
Locus Tra
IncA/C pNDM-1_Dok01, Escherichia coli , Japan, 195560 bp, AP012208, Sekizuka et al. 2011
Locus Tra
IncA/C pNDM10505, Escherichia coli , Canada, 166744 bp, JF503991, Boyd et al. 2011
Locus Tra
Replicazione
Metilasi, restrizione
Geni plasmidici
Conclusioni
•Clone dominante ST37 con difetto di porine e
produzione ESBL fino alla comparsa del primo
ceppo di K. pneumoniae positivo per KPC-3
•Produttori
di
carbapenemasi
hanno
sopraffatto quelli ESBL-porine mutanti
•Espansione di un clone di successo: epidemia
KPC-3::ST258
• Tipizzazione molecolare necessaria ma in caso di
ceppo clonale insufficiente
• Diffusione orizzontale dei geni delle carbapenemasi
mediata da plasmidi
• L’associazione fisica di geni che conferiscono
resistenza a classi diverse di antibiotici sui plasmidi
viene positivamente selezionata da ognuno dei
singoli antibiotici codificati
• Epidemia di geni (NDM-1), di plasmidi (VIM-1, OXA48), di cloni (KPC-3::ST258)
