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Cytonel-Plus Ultrarapid IHC kit
IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Codice CND: W01030711
Codice catalogo Bio-Optica: 15-CNP-100 (100 tests)
15-CNP-20 (20 tests)
Cytonel-Plus Ultrarapid IHC kit contiene reagenti per colorazioni immunoistochimiche di pan-citocheratina. Il
kit permette di effettuare la colorazione immunoistochimica di sezioni congelate in circa 6 minuti.
Background
Nella stadiazione e terapia chirurgica del carcinoma mammario,la tecnica del linfonodo sentinella sta
acquisendo un ruolo sempre più importante nell’ottica di una prevenzione delle complicanze post-chirurgiche
che di una riduzione della durata degli interventi e delle degenze ospedaliere. Questa tecnica trova la propria
giustificazione nell’osservazione che la diffusione metastatica delle cellule neoplastiche, dal focolaio tumorale
primitivo ai linfonodi ascellari, avviene in modo regolare e progressivo, senza cioè di solito salti di livello.
La negatività o positività istologica del primo linfonodo di drenaggio che riceve il flusso linfatico proveniente
dall’area della mammella interessata dalla neoplasia (il linfonodo sentinella appunto) consente di valutare con
ragionevole sicurezza un eventuale interessamento metastatico dell’intera catena linfonodale ascellare con
conseguente eventuale ricorso alla dissezione ascellare completa. Dalla sala operatoria la biopsia del linfonodo
sentinella viene mandata al patologo, il quale deve effettuare una rapida diagnosi intraoperatoria utilizzando
sezioni congelate; basandosi su questi risultati, in caso di positività, sia il tumore primario sia lo svuotamento del
cavo ascellare possono essere effettuati in un’ unica operazione, nel caso invece le metastasi nel linfonodo
sentinella vengano trovate solamente in un’ indagine post-operatoria (immunoistochimica su definitivo) si può
rendere necessaria una seconda operazione, aumentando da un lato i costi per l’ospedale dall’altro il disagio e
lo stress per il paziente. Purtroppo le difficoltà di una diagnosi intraoperatoria accurata sono notevoli, con le
colorazioni standard (ematossilina-eosina, blu di toluidina) è spesso difficoltoso diagnosticare piccole metastasi
di carcinoma; in particolare poche cellule isolate o piccole metastasi di carcinoma lobulare sono particolarmente
difficili da identificare.
Cytonel-Plus Ultrarapid IHC kit fornisce i reagenti necessari per una colorazione rapida immunoistochimica
della pan-citocheratina. Il kit comprende un frammento Fab2 di anticorpo anti pan-citocheratina coniugato con
perossidasi, ottimizzato per un protocollo di colorazione ultrarapido. L’anticorpo viene rivelato utilizzando il
cromogeno diamino benzidina (DAB). Il protocollo di colorazione richiede circa 6 minuti per essere completato.
Pubblicazione scientifiche riguardanti la colorazione intraoperatoria di pan-citocheratina su sezioni congelate
(aggiornata al 04/2009):
-
Krishnamurthy S et al. Cancer 2009 Apr;115:1555-1562 : "Frozen section analysis plus rapid cytokeratin
-
Choi YJ et al. Jpn J Clin Oncol. 2006 Aug;36(8):489-93:” N=178 ”ultrarapid IHC enhances intraoperative
detection of SN micrometastases”
Johnston E et al. Applied Immuno Mol Morphol 2006 Mar;14(1):57-62:”Rapid IHC improves sensitivity than
when using intraoperative H&E alone”
Lee IK et al. Eur J Surg Oncol 2006 May;32(4):405-9:”The authors found 7 of 90 sentinel nodes that were
intraoperatively IHC+ but negative on H&E. All these metastases were confirmed on paraffin sections”
Leikola J et al. Cancer 2005 Jul 1;104(1):14-9: ”So far the largest study (n=995 cases) evaluating the utility of
intraoperative pan-cytokeratin staining on frozen sections. IHC was found to significantly improve the detection of
micrometastases especially of lobular carcinomas. This study was done using an earlier version of Cytonel kit.
These kits have the same performance.”
Nährig J et al. Breast J. 2003 Jul-Aug;9(4):277-81:"Ultrarapid IHC was a very sensitive and rapid technique for the
intraoperative detection of metastatic involvement of sentinel lymph nodes"
immunostaining have a role in the intraoperative evaluation of sentinel lymph nodes."
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Revisione 100218 del 18/02/10
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Cytonel+ UItrarapid IHC kit
Step preanalici:
Preparazione fissativo : aggiungere 1 ml di perossido di idrogeno 3% (H2O2) a 0.5 ml di
peroxidase blocker” (incluso nel kit) in 100 ml di acetone. Il fissativo è utilizzabile per 6 ore.
“endogenous
Preparazione della “DAB working solution”: aggiungere 15 microlitri di cromogeno DAB a 0.5 ml di diluente DAB
e miscelare bene. La “DAB working solution” è utilizzabile per 2 giorni dopo la preparazione se conservata a
+4C. 0.5 ml è sufficiente per colorare 2 vetrini.
Protocollo di lavoro
1. Tagliare una sezione al criostato riferendosi alle procedure standard del laboratorio e posizionarla su un
vetrino da microscopio. Asciugare all’aria per 1-2 min.
- Si raccomanda di aggiungere un vetrino di controllo al vetrino da testare da questo step in avanti.
(vd. il paragrafo preparazione dei vetrini di controllo, Appendice 1)
2. Fissare il vetrino nella soluzione acetone-0.03%H2O2-“peroxidase blocker” per 2 min (±20 sec) a
temperatura
ambiente. Dopo la fissazione asciugare i vetrini all’aria a temperature ambiente.
NOTA . L’attività delle perossidasi endogene è bloccata durante questo step
o
3. Posizionare i vetrini su una piastra precedentemente riscaldata (42±2 C) ed applicare “anti-cytokeratinHRP antibody conjugate” (ready-to-use). Incubare per 3 min (±10 sec).
4. Lavare i vetrini in PBS (agitare la vaschetta manualmente per 10 secondi).
o
5. Posizionare i vetrini su una piastra precedentemente riscaldata (42±2 C) ed applicare “DAB working
solution”. Incubare per 1.5 min (±10 sec).
6. Lavare i vetrini in acqua corrente (5-10 sec.)
7. Controcolorare con ematossilina (5-10 sec), lavare i vetrini con acqua corrente, e montare riferendosi alle
procedure standard del laboratorio. Può essere utilizzato sia un montante a base acquosa sia un montante
permanente.
Principali step della metodica di Cytonel-Plus Ultrarapid IHC kit:
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Interpretazione dei risultati
I precipitate marroni di DAB localizzano le cellule positive alla citocheratina
Un linfonodo sentinella metastasi-positivo ( sezione congelata
intraoperatoria).
Sezione congelata di linfonodo sentinella colorata con
pan-citocheratina
Controlli positivi e negativi (prostata normale).
Sezione colorata con H&E. notare la difficoltà di identificare
le cellule del carcinoma
Contenuto del Cytonel-Plus Ultrarapid IHC kit (store at +4C) [kit da 20 test e 100 test]
Bloccante perossidasi endogene
Contiene composti chimici che,quando aggiunti al fissativo acetone-H2O2,bloccano l’attività delle
perossidasi endogene. Fare riferimento alla scheda di sicurezza per ulteriori informazioni.
Anti-pancitcheratina coniugato con polimero perossidasi (ready-to-use)
Il reattivo è compost da una frazione Fab2 di anticorpo monoclonale di topo che reagisce con i
peptidi umani delle citocheratine 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18, e 19.
Anticorpo di controllo negativo
Utilizzare al posto dell’anticorpo anti-pancitocheratina come controllo negative di colorazione.
Cromogeno DAB concentrato
Per favore tenere presente che la DAB è un sospetto cancerogeno.Evitare il contatto con pelle e
vestiti. Gestire i rifiuti in accordo con le leggi vigenti. Fare riferimento alla scheda di sicurezza per
ulteriori informazioni.
Buffer diluente DAB
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Materiale necessario ma non fornito :
- Piastra calda +42C (+/- 2C)
- Acetone
- Perossido di idrogeno
- Ematossilina
- Torrette porta vetrini, vetrini coprioggetto, pipette
- Montante acquoso o a basa di xylene
Come montante acquoso si raccomanda di utilizzare Ultra Mount Plus (ThemoFisher Scientific, Labvision cod.
15-TA-125- UMX), il montante acquoso può essere applicato immediatamente dopo aver lavato l’eccesso di ematossilina
Come montante permanente si raccomanda di disidratare i vetrini con etanolo 70%, 94% ed etanolo assoluto (10 sec.), seguiti da
xylene (20 sec) e montante a base di xylene (Bio Mount, Bio-Optica Milano s.p.a., cod 05-BM500)
APPENDICE 1. Preparazione dei vetrini di controllo
- Tagliare le sezioni al criostato da tessuti freschi congelati che contengono certamente cellule epiteliali citocheratine positive.
La prostata o l’appendicite sono molto utili a questo scopo.
- Posizionare le sezioni su un vetrino da microscopio utilizzando le procedure in uso nel laboratorio.
- Asciugare all’aria per 2 min e stoccare in freezer a -20C fino all’utilizzo. I vetrini sono utilizzabili per 3 settimane.
Utilizzo dei vetrini di controllo: prendere un vetrino di controllo dal freezer e fissarlo insieme ai vetrini da testare; eseguire
tutti gli step successivi come indicato nel protocollo di lavoro.
APPENDICE 2. Preparazione del linfonodo sentinella per le sezioni congelate
Fare riferimento a: Krogerus L et al.: Towards reasonable workload in diagnosis of sentinel lymph nodes: comparison of
two frozen section methods. Histopathology 2004, 44:29-34.
Produttore: Jilab Inc. Biokatu 6, Tampere, Finland
codice per ordinare Cytonel+ Ultrapid IHC kit
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