Microscopia Ottica ed Elettronica
Coerenza
sorgente-sistema ottico-rivelatore
•
•
•
•
Sorgenti
Luce visibile
UV
Raggi X
Elettroni
Rivelatori
Film
Scintillatori
Schermi flluorescenti
CCD
…
•
•
•
•
Sistemi ottici
Lenti di vetro
Lenti di vetro
… in via di sviluppo
Campi elettromagnetici
Confronto sorgenti
De Broglie:
Dualismo onda – corpuscolo
Luce
•
•
Onda: oscillazione campo e.m.
Elettroni
•
Onda: eq. Schrödinger
– Velocità (nel vuoto): fissa
– Velocità: variabile fino a ~ c
– Lunghezza d’onda: decimi di m
– Lunghezza d’onda: pm (=10-6m)
Corpuscolo: Fotone
– Massa = 0
– Carica = 0
– Energia: pochi eV
•
Corpuscolo
– Massa: ≠ 0
– Carica: ≠ 0
– Energia: keV ÷ MeV
Conseguenze pratiche
Luce
Elettroni
Massa e carica zero + Energia bassa
Massa e carica diversa da zero + Energia elevata
Scarsa interazione con la materia
Scarso assorbimento
in aria (n~1) e nel vetro (n~1.5)
Forte interazione con la materia
Forte assorbimento
Generazione elettroni secondari, raggi X, …
Strumenti funzionanti in aria
Lenti di vetro fuoco fisso
In trasmissione spessori decine di m
Strumenti operanti sotto vuoto
Lenti e.m. fuoco variabile
In trasmissione spessori decine di nm
====================================
Lunghezze d’onda
380 nm ÷ 780 nm
====================================
Lunghezze d’onda dipende dalla loro velocità
Picometri
0.0086 nm a 20kV
0.0025 nm a 200kV
Limite di risoluzione fisico attorno al m
(Max 2000 x)
Limite di risoluzione fisico a livello sub-atomico
Nonstante queste differenze…
… possiamo schematizzare i sistemi ottici in modo simile grazie
alla
Ottica geometrica
•
•
Costruzione geometrica dell’immagine tramite raggi, fasci e lenti idealizzate
Indipendente dalla natura del fenomeno (onda/corpuscolo, fotoni/elettroni)
Naturalmente questa astrazione andrà abbandonata non appena entrerà in
gioco la natura fisica del fenomeno
Lenti
Una lente è un elemento
ottico che ha la proprietà
di concentrare o divergere
i raggi di luce.
Normalmente è realizzata
in vetro o materiali
plastici.
Formazione delle immagini
Una lente positiva o convergente focalizza un fascio collimato
parallelo all'asse in un punto focale, a distanza f dalla lente.
se un oggetto è posto a distanza S1 sull'asse della lente positiva di
focale f, su uno schermo posto a distanza S2 si formerà l'immagine
dell'oggetto.
Ottica geometrica
A seconda delle posizioni dell’oggetto rispetto al fuoco della lente ottengo immagini
reali o virtuali, diritte o capovolte, ingrandimenti maggiori o minori di 1.
Possiamo calcolare l’ingrandimento: M
= dy(i) / dy(o)
Il microscopio ottico
Il miscoscopio ottico è uno
strumento che consente di
ingrandire l’immagine di
oggetti di piccole dimensioni
per permetterne
l'osservazione diretta o
indiretta per esempio
tramite fotografia
Anatomia di un microscopio
Fotocamera o
telecamera
Oculari
Revolver con
obiettivi
Stativo
Fonte di
illuminazione
Vite macrometrica e
micrometrica
Tavolino
traslatore
Condensatore
Diaframma di
campo
Schema microscopio ottico
7. oggetto da osservare
8. lente obiettivo
9. immagine reale
10. lente oculare
11. immagine virtuale
Combino le due situazioni precedenti:
la lente obiettivo crea un’immagine
reale che diventa “oggetto” per la
lente oculare. Da questa si forma un’
immagine virtuale e ingrandita.
Definizione di “INGRANDIMENTO”
Riportiamo un’ immagine del nostro microscopio su di una lastra fotografica avente
dimensioni 100 x 100 mm (L = 100 mm)
Immaginiamo che le dimensioni reali del campo
visivo riportato sulla lastra siano x = 0.20 mm.
Possiamo allora calcolare l’ingrandimento:
M = L / x = 100 / 0.20 = 500 x
Se immagino la lastra fotografica come un array da 1000
x 1000 pixel l’oggetto piu’ piccolo che posso
rappresentare avra’ dimensione
d = x/1000 = 0.20/1000 = 200 nm.
Come aumentare l’ingrandimento
dimensioni lastra fotografica 100 x 100 mm (L = 100 mm)
Potere risolutivo
Il potere risolutivo di un sistema ottico è la minima distanza
tra due punti che riesco ad osservare come distinti.
Per la luce visibile il principale fattore limitante e’ dovuto al
fenomeno della diffrazione che porta ad un limite del potere
risolutivo (Criterio di Rayleigh).
La minima distanza fra i dischi di Airy, perchè siano
distinguibili, deve essere uguale al loro raggio
Potere risolutivo
Puo’ essere definito dalla teoria di Abbe e dal criterio di Rayleigh
d = 1.22 λ / 2 n sin α
Per migliorare il potere
risolutivo dovrei
aumentare l’apertura del
diaframma (aumenta α)
ma questo introduce
maggiori aberrazioni
(raggi meno parassiali).
Potere risolutivo
Puo’ essere definito dalla teoria di Abbe e dal criterio di Rayleigh
d = 1.22 λ / 2 n sin α
potere risolutivo d = 187 nm
Massimo ingrandimento utile
dimensioni lastra fotografica 100 x 100 mm (L = 100 mm)
array di 1000 x 1000 punti immagine
Il potere risolutivo del microscopio, dalla legge di Abbe,
consentira’ al massimo di rappresentare un punto
oggetto di circa 200 nm.
Le dimensioni reali del campo visivo riportato sulla lastra
saranno quindi :
x = 1000 x 200 nm = 200 mm = 0.20 mm.
Possiamo allora calcolare l’ingrandimento:
M = L / x = 100 / 0.20 = 500 x
Che rappresenta quindi il massimo
ingrandimento utile.
NB sono numeri compatibili col potere risolutivo del nostro occhio = 0.1 mm
Risoluzione vista con la teoria di Abbe
• Lente obiettivo con grande NA (+diaframmi e illuminazione
“intelligenti”) perché raccolgo il massimo possibile di angoli di
diffrazione
Corollario: è inutile ingrandire oltre il limite consentito da NA. Se non aumento il numero di
spot di diffrazione raccolti, ingrandisco solo i dischi di airy
• Lunghezza d’onda piccola perché a parità di periodicità
l’angolo di diffrazione si riduce (a parità di lente me ne entra
un numero maggiore) Mic. El.
Eliminando zone di diffrazione in modo “intelligente” si possono
ottenere effetti di contrasto utili (contrasto di fase, campo
scuro, …)
•Nella microscopia ottica a campo chiaro, il campione è visualizzato grazie alla
luce che passa direttamente dal condensatore al vetrino. Si può optare per
diversi ingrandimenti: 10x (per visualizzare l'intero campione), 40x (utile per
osservare microrganismi di grosse dimensioni), 100x (per osservare batteri,
miceti e alcuni dettagli morfologici). Il potere di risoluzione della microscopia a
campo chiaro (determinato dalla lunghezza d'onda della luce usata per illuminare
il campione e dal suo angolo di entrata negli obiettivi) è il fattore limitante di
questa tecnica: può arrivare al massimo a discriminare dettagli nell'ordine del
decimo di micron, usando lenti a immersione in olio. Spesso sono usate delle
colorazioni, dato che gli indici di rifrazione degli organismi e dello sfondo spesso
sono simili e risulta difficile distinguere il campione.
•Nella microscopia a campo scuro, invece, viene usato un condensatore che
impedisce alla luce trasmessa di illuminare direttamente il campione: questo è
raggiunto dalla luce diffusa solo se obliqua e risulta stagliato su uno sfondo nero.
Il potere di risoluzione è 10 volte maggiore di quello della microscopia a campo
chiaro (arriva a distiunguere dettagli di 0,02 micron) e consente di identificare i
batteri più sottili. L'inconveniente è che la luce non attraversa i campioni: è
possibile quindi studiarne i contorni ma non la loro struttura interna.
Osservazione in campo scuro
Un particolare tipo di
condensatore nell’osservazione
in campo scuro consente di
deviare i fasci di luce in modo
che le lenti frontali dell’obiettivo
siano attraversati soltanto dai
raggi di luce diffratti o diffusi dal
preparato.
Gli oggetti appariranno chiari su
uno sfondo scuro.
In questo modo è possibile
osservare oggetti anche al di
sotto del potere di risoluzione
del microscopio ottico
Campo chiaro (Bright-field illumination)
Le superfici ortogonali al fascio di luce incidente appaiono chiare se esenti
da difetti. I raggi diffusi in direzioni non ortogonali appaiono scuri.
Campo scuro (Dark-field illumination)
In questo caso le superfici ortogonali all’asse ottico appaiono scure, mentre
le superfici oblique all’asse ottico appaiono chiare.
A seconda della disposizione del piano
“lucidato” (superficie da analizzare)
del campione rispetto al sistema di lenti:
MICROSCOPIO OTTICO METALLOGRAFICO (OM)
• Ingrandimenti: fino a 2000x.
• Limitato potere risolutivo (~ 1 μm) dovuto all’impiego della luce, con
lunghezza d’onda all’interno del campo del visibile.
• Bassa profondità di campo: impossibilità di mettere a fuoco dettagli
posti
su piani differenti (i provini devono essere necessariamente resi piani!).
Non consente di osservare superfici di frattura.
Poiché la microscopia ottica funziona in luce riflessa,
necessita di un’opportuna preparazione metallografica
(superfici lucidate e spesso attaccate con opportuni reattivi)!
1. SCELTA DEL CAMPIONE
• Il campione deve essere rappresentativo
del manufatto da cui viene ricavato.
• E’ bene prelevare più campioni dallo
stesso pezzo.
• L’operazione di prelievo deve essere
effettuata in maniera tale da non alterare
strutturalmente il materiale.
2. TAGLIO
• Il taglio viene eseguito in presenza
di fluidi refrigeranti al fine di evitare
alterazioni termiche.
• Altre tecniche di prelievo:
frattura;
taglio ossiacetilenico;
taglio ad arco elettrico;
taglio laser;
taglio a getto d’acqua.
3. MONTAGGIO O INGLOBAMENTO
• I provini vengono inglobati in
formelle in resina.
• Lo scopo è quello di facilitare la
manipolazione del campione e
bloccarlo efficacemente durante le
operazioni di spianatura e
lucidatura.
5. ATTACCO METALLOGRAFICO
• Evidenzia la struttura cristallina attraverso la
corrosione selettiva operata
dai reattivi sulle zone superficiali dotate di
4. LEVIGATURA E LAPPATURA
• Levigatura: passaggi su carte abrasive maggiore energia (es. bordi dei
grani).
a granulometria controllata fino a
• La composizione chimica dei reattivi dipende
150÷2000 grit.
dalla natura della lega
150 grit = granuli abrasivi di diametro pari a 5÷8 μm
2000 grit = granuli abrasivi di diametro pari a 88÷105 μm
• Lappatura: passaggi su dischi in
tessuto cosparsi con soluzioni acquose
abrasive (a base di allumina/pasta
diamantata).
diametro da 5÷6 μm fino a 0.20÷0.15 μm
metallica o delle fasi da mettere in risalto.
• L’attacco chimico svolge una duplice
funzione:
ossidante nei confronti delle zone a maggiore
contenuto energetico;
lisciviante verso i prodotti di ossidazione per
staccarli dalla superficie
SEM:
Scanning Electon Microscopy
SEM usato per topografia campioni a alti ingrandimenti, può arrivare a più di
300 kX. Usata spesso per ispezionare superfici di frattura, package cracks,
difetti ecc.
Durante la misura un fascio di elettroni è focalizzato su uno spot del
campione, trasferendo energia allo spot. Questi producono degli altri
elettroni, chiamati elettroni secondari, questi sono attratti da una griglia
caricata positivamente e poi tradotti in un segnale.
Il fascio è poi fatto passare su tutti i punti della superficie del campione,
formando così un’immagine della superificie.
L’energie del fascio primario determina la quantità di secondari che possono
essere raccolti dal rilevatore. Più alta l’energia del primario più è alto il
numero di secondari emessi, fino ad un limite. Superato questo limite
l’emissione di elettroni secondati diminuisce all’aumentare dell’energia del
fascio, in quanto il fascio comincia ad attivare fenomeni che molto al disotto
della superficie. Questi elettroni molto spesso ricombinano prima di arrivare
in suuperficie.
Insieme agli elettroni secondari, il fascio di elettroni primari produce l’emissione di
elettroni retrodiffusi o riflessi (backscattered). Questi hanno più energia dei secondari e
vengono diffusi verso la sorgente, così c’è bisogno di un diverso detector in una differente
posizione. Gli elettroni con energia maggiore di 50eV sono considerati backscattered.
Immagini ottenute tramite elettroni backscattered sono utili per distinguire i materiali, in
quanto essi dipendono fortemente dal numero atomico dell’elemento. Per avere un buon
contrasto la differenza in numero atomico deve essere circa 3.
Un SEM può anche essere equipaggiato con un EDX. Questo strumento permette di
ottenere un’analisi composizionale del campione. Può essere utile per identificare il
materiale l’eventuale presenza di contaminanti ed estimare la concetrazione superficiale
degli elementi in superficie.
SEM: zone di provenienza dei segnali prodotti
Fascio incidente
SEM~5-50keV
superficie
e- Auger
E ~ 10-100 eV
e- secondari (SE)
E ~ 1-10 eV
e- retrodiffusi
(BSE) E~10 keV
raggi X
caratteristici
raggi X
spettro continuo
~ 1 mm
Volume di interazione
SEM: Elettroni secondari
Efficenza (intensità) = SE/ in
SE= n. elettroni secondari
in= n.elettroni incidenti
• maggiore per angoli grandi tra fascio e
superficie Contrasto topografico
• scarsa dipendenza da Z
Bassa energia piccola profondità di uscita
Rivelatore
maggiore per E minore (a causa della
minor penetrazione)
SEM: Elettroni retrodiffusi (backscattered BS)
Dipendenza del volume di provenienza da E (fascio incidente) e da Z e ρ (campione)
BS Scarsa risoluzione spaziale
Secondary electron image
Backscattered electron image
Preparazione campioni SEM
Generalmente semplice
Problema:
Campioni non conduttori Caricamento elettrostatico
Metallizzazione
Basso vuoto
Situazioni particolari:
Campioni fragili in sezione
Inglobamento in resina
Levigatura - lucidatura
Campioni metallici
Taglio
Levigatura - lucidatura
Campioni polimerici frattura o taglio a freddo
Caricamento del campione sotto il fascio
Contaminazione del campione sotto il fascio
Più risoluzione
Meno danneggiamento
Piccola
Immagine sgranata
Dimensione
fascio
Corrente
Più danneggiamento
Grande
Piccolo
Immagine definita
Grande
Meno risoluzione
Dettagli superficiali chiari
Meno risoluzione
Meno effetti di bordo
Meno danneggiamento
Piccola
Meno caricamento
Dimensione
fascio
Energia
Più danneggiamento
Grande
Grande
Più caricamento
Più effetti di bordo
Dettagli superficiali poco chiari
Piccolo
Più risoluzione
La profondità di campo è limitata
dalla risoluzione del sistema di
raccolta: all’interno di una certa
distanza sopra e sotto il fuoco non si
hanno dettagli all’interno del pixel sul
campione.
Tuttavia la dimensione del pixel
dipende dall’ingrandimento:
Aumentando l’ingrandimento
diminuisce la profondità di campo.
La profondità di campo aumenta
•riducendo la dimensione della apertura finale
•aumentando la distanza di lavoro
Più risoluzione
Più profondità di campo
Piccola
Immagine sgranata
Diametro
fenditura
Meno profondità di campo
Grande
Meno risoluzione
Immagine definita
Piccola
Più risoluzione
Meno profondità di campo
Distanza di lavoro
Meno risoluzione
Grande
Più profondità di campo
(Anche per scendere agli ingrandimenti
più bassi possibili)
EDS (o EDX): Energy Dispersive X-ray Spectroscopy Microanalisi
Ionizzazione dei gusci interni
Notazione
incidente E = Ein
Stati non occupati
emesso
Energy Loss
diffuso E = Ein - E
Li K: 55 eV per eccitare un elettrone K
U K: 99 keV per eccitare un elettrone K
Diseccitazione: emissione di fotone X
caratteristico
Emissione isotropa
Nomenclatura:
Struttura fine:
fotone X - K (L -->K)
fotone X - K1 (LIII-->K)
fotone X - K (M-->K)
fotone X - K2 (LII-->K)
fotone X - L (M-->L)
(con ELIII > ELII)
ecc….
Frenamento per interazione col nucleo “diseccitazione”: Bremsstrahlung
incidente E = Ein
L
fotone X
(continuo)
K
L
K
E~ 100 eV - 10 keV
diffuso E = Ein-E
Fondo
molto assorbiti nel campione
emissione dalla superficie
(pochi nm);
Competitivo con RX
Analisi quantitativa
Basata sulla misura delle energie dei picchi di intensità
Tutti i picchi coerenti con l’energia di eccitazione devono essere presenti
Mappatura degli elementi
Basata sulla distribuzione spaziale dell’emissione X
Permessa dalla scansione
Immagini rumorose a causa della scarsa emissione
Analisi quantitativa
Basata sul confronto delle intensità con campioni standard di riferimento
Richiede correzioni per differente peso atomico, assorbimento e fluorescenza
indotta
TEM:
Trasmission Electon Microscopy
Microscopio elettronico in trasmissione (TEM)
Aumentare il contrasto
Selezionare riflessi diffrazione Apertura del condensatore
Selezionare zone campione
Apertura dell’obiettivo
Il microscopio elettronico “in riflessione”, detto a
scansione (SEM), ha la sola apertura del
condensatore
Apertura dell’“oculare”
(area selector)
Nel TEM un campione sottile viene irradiato con un fascio elettronico con una
densità di corrente uniforme. Elettroni emessi dal gun e condensati e collimati
tramite lenti magnetiche. Le lenti provvedono alla formazione di un’immagine o un
pattern di diffrazione del campione. La distribuzione di intensità degli elettroni è
aumentata tramite altre lenti e mostrata su uno schermo fluorescente.
Strumenti per analisi di routine hanno voltaggi trai 120 ai 200 kV. Mediumvoltage instruments lavorano a 200-500 kV per avere una migliore trasmissione o
risoluzione, negli High Voltage Electron Microscopy (HVEM) il range va da 500 kV
to 3 MV. Il voltaggio determina la velocità, la lunghezza d’onda e quindi la
risoluzione del microscopio.
I TEM possono essere suddivisi in:
Conventional Transmission Electron Microscopy
High Resolution Electron Microscopy
Analytical Electron Microscopy
Energy-Filtering Electron Microscopy
High Voltage Electron Microscopy
Dedicated Scanning Transmission Electron Microscopy
TEM Aberration Correction
L’aberrazione cromatica è una distorione che si ha quando le lenti non riescono a
focalizzare tutte le lunghezze d’onda nello stesso punto:
• È necessario correggere l’aberrazione, altrimenti l’immagine risultante
potrebbe essere offuscata;
• Alcune migliorie hanno migliorato la qualità dell’immagine e le
informazioni ottenibili sui campioni;
Le aberrazioni sferiche invece si vedono quando i raggi paralleli che passano nella
regione centrale della lente vengono focalizzati più lontano dei raggi che passano
attraverso i bordi:
• Questo comporta la comparsa di punti focali multipli e di un’immagine
sfocata.
Imaging mode
Diffraction mode
Punti differenti corrispono a punti differenti.
Direzioni differenti corrispondono a
Diffrazione dovuta dagli stessi punti convergono punti differenti del piano focale.
nella stessa imagine.
Rappresentativo
Sottile
Campione per
analisi TEM
Omogeneo
Pulito
Opportunamento
posizionato su
griglia
Necessaria preparativa dei campioni:
• Campione potrebbe dover essere inglobato:
• Paraffina;
• Resina;
• Mix paraffina e resine;
• Campioni vanno assottigliati preventivamente:
• Criomicrotomo;
• FIB.
retino
Taglio dei campioni inclusi con un ultramicrotomo dotato di lama al diamante (a
volte vetro).
– La superfice da analizzare deve essere di circa
0.2 mm.
– Lo spessore della sezione varia da 40 a 100
nm (di solito 65-80 nm).
Con metalli pesanti come uranio e piombo si aumenta
lo scattering elastico di membrane e inclusi nelle
cellule
I retini su cui sono state deposte le sezioni vengono
immerse prima in acetato di uranile, lavati e
successivamente in citrato di piombo
Montaggio delle sezioni su di
una griglia.
Colorazione delle sezioni con
nitrato o acetato di uranile
e citrato di piombo.
Visualizzazione al TEM
Fotografia, sviluppo ed analisi
delle immagini
