Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 1 Biologia mole
Indice…
CORSO DI BIOLOGIA MOLECOLARE E
CELLULARE
II semestre 2007/2008
Prof.ssa Marina Colombi
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 2 Biologia mole
Introduzione.
I procarioti sono cellule estremamente semplici, per quanto riguarda
l’evoluzione. Il loro materiale genetico non è racchiuso in alcun tipo di
involucro, ma immerso nel citosol.
La Biologia è lo studio degli esseri viventi sulla terra, delle loro
strutture, dei loro meccanismi vitali.
Le cellule eucariotiche invece, possiedono un nucleo che è racchiuso
in un involucro, la membrana nucleare, che scambia informazioni con il
citoplasma della cellula.
Individua delle caratteristiche comuni e procede alla classificazione
degli esseri viventi e all’approfondimento delle specifiche
caratteristiche di ogni regno, classe, specie.
Per essere vivente si intende un qualsiasi sistema molecolare in grado
di nascere, crescere, dar vita a nuovi viventi con caratteristiche simili.
Ciascun vivente può raggiungere questo obbiettivo solamente perché
è in possesso di un materiale genetico, che contiene in sé tutte le
caratteristiche dell’individuo.
La vita è permessa da complessi meccanismi che avvengono a livello
delle macromolecole biologiche, che sono formate sostanzialmente da
pochi elementi chimici, con caratteristiche idonee alla vita:
-
carbonio
ossigeno
idrogeno
azoto
zolfo.
I regni
La teoria dell’evoluzione ha permesso di individuare le tappe con cui è
avvenuta la formazione dei singoli individui. La classificazione, quindi,
avviene su scala evolutiva e parte inizialmente in una divisione per
stadio macroevolutivo.
Si possono individuare due grandi regni cellulari: procarioti ed
eucarioti.
Le cellule eucariotiche formano due grandi regni dei viventi:
-
protisti: sono cellule eucariotiche che permangono nello stadio
unicelulare e non si associano in organismi complessi.
Organismi pluricellulari: sono dei complessi di cellule
specializzate e differenziate, che assieme concorrono per il
mantenimento e l’espletazione della vita.
L’evoluzione ha portato gli individui pluricellulari a suddividersi in tre
grandi regni:
-
animali
vegetali
funghi
L’origine della vita sulla terra.
4,6 miliardi di anni fa, l’atmosfera della terra era molto differente
rispetto a quella che si presenta adesso.
L’atmosfera terrestre era composta da:
-
vapore acqueo (H2O)
anidride carbonica CO2.
Monossido di carbonio CO.
Idrogeno molecolare H2.
Azoto molecolare N2.
Inoltre, la forte presenza di radiazioni UV permetteva la produzione di:
-
Ammoniaca NH3.
acido solfidrico H2S.
metano CH4.
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Formazione di molecole organiche.
Nell’atmosfera terrestre di quegli anni, vi era totale assenza di
ossigeno libero (O2), quindi la possibilità di formare molecole
organiche senza andare incontro ad ossidazione.
Biologia molecolare e cellulare 3 Biologia mole
Dal brodo primordiale si rese possibile la formazione di macromolecole
quali proteine, RNA, DNA, zuccheri, ecc…
La polimerizzazione, in assenza di O2, avvenne su rocce argillose e in
prossimità delle sorgenti sulfuree:
Vi erano, oltre all’assenza di ossigeno, altre condizioni molto favorevoli
alla formazione di molecole:
-
presenza di enormi fonti energetiche: c’erano innumerevoli
vulcani, tempeste di scariche elettriche, radiazioni ultraviolette
(UV) e continui bombardamenti da parte di meteoriti.
Presenza di precursori chimici: c’era acqua sottoforma di
vapore, minerali inorganici che fungevano da catalizzatori
(rocce argillose e numerose bocche idrotermali e sulfuree), ad
esempio Zn e Fe.
Tempo sufficientemente lungo: queste condizioni si protrassero
per un tempo adeguato.
-
-
-
-
L’esperimento che provò la probabilità della formazione di molecole
organiche da elementi inorganici fu fatto da due coppie di scienziati in
due epoche differenti:
-
1920, da Oparin e Haldane
1950, da Miller e Ury, da cui prese il nome.
L’esperienza di Miller e Ury, consisteva nel simulare, all’interno di
un’ampolla le condizioni dell’atmosfera primordiale:
Nascita dei viventi.
Grazie alla formazione dei polimeri di maggiori dimensioni, questi, si
associano, dopo un lunghissimo lasso di tempo. La prima cellula
procariote comparse circa 3,5 miliardi di anni fa:
-
-
Il risultato fu sorprendente: si trovarono degli amminoacidi, piccoli acidi
nucleici, altre piccole molecole organiche.
-
Questa dimostrazione permette di formulare la teoria dell’origine della
vita:
-
le prime molecole organiche si sono formate in piccole lagune
in seguito si accumularono in ciò che venne definito brodo
primordiale.
ebbero origine i procarioti che vivevano facendo respirazione
anaerobia.
Erano organismi eterotrofi, molto semplici.
Successivamente divengono autotrofi, ovvero capaci di
sintetizzare le proprie molecole vitali.
Gli eucarioti comparvero circa 2 miliardi di anni orsono, secondo la
teoria simbiotica, per internalizzazione e fusione di batteri, cloroplasti,
mitocondri:
misero vapore acqueo, metano, ammoniaca e idrogeno.
Li bombardarono con delle scariche elettriche.
-
si univano i monomeri con l’eliminazione di una molecola
d’acqua.
La reazione era catalizzata dai numerosi elementi metallici
presenti nelle rocce argillose, come zinco e ferro, rame
metallico, magnesio, ecc…
questi iniziano la produzione di ossigeno molecolare
Pian piano, si forma l’atmosfera odierna, ricca di ossigeno e di
azoto.
Col passare del tempo si estinguono gli anaerobi e nascono gli
organismi a respirazione aerobica.
In queste modalità si ha la nascita della vita, che dall’acqua, si sposta
sulla terra ferma.
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Biologia molecolare e cellulare 4 Biologia mole
dogma centrale della biologia.
Ciascun essere vivente ha una peculiarità, un proprio ciclo vitale, che è
scritto nel suo codice genetico:
-
racchiude il progetto biologico di ciascun individuo.
Ogni patrimonio genetico è unico.
Il patrimonio genetico è costituito da una o più molecole di
acido desossiribonucleico, il DNA.
Il dogma centrale della biologia, in cui è racchiuso il progetto biologico
di ciascun individuo, riassume le seguenti tappe:
-
il DNA può duplicare sé stesso (replicazione) o codificare per
RNA (trascrizione)
l’RNA codifica per le proteine (traduzione).
Il corretto funzionamento di uno di questi meccanismi può causare
aberrazioni cromosomiche, le quali possono avere sia effetti positivi
che negativi:
-
evoluzione
malattie genetiche.
La vita è garantita dal DNA, che codifica per le proteine, le quali
svolgono tutte le azioni di catalizzazione e di funzionamento per la
sopravvivenza di ogni cellula.
Il genoma umano.
Gli acidi nucleici
Il genoma di un individuo è l’insieme di geni e di informazioni circa la
sua struttura e le sue funzioni, con i relativi meccanismi che le
regolano.
Negli anni ‘40 s’iniziò a porre il quesito della natura chimica del
patrimonio genetico umano. Era chiaro, che il patrimonio genetico
dovesse risiedere in una qualche struttura molecolare.
Risultò, dopo esperimenti condotti da numerosi ricercatori, che il
genoma di qualsiasi cellula era composto di molecole di DNA: acidi
desossiribonucleici.
Prima della scoperta della struttura della molecola di DNA da parte di
Watson e Crick, era chiaro che il DNA era formato da una unità
chimica chiamata nucleotide, formato da:
-
Uno zucchero pentoso (a cinque atomi di C).
Un gruppo fosfato posizionato in posizione 5’ sullo zucchero
Una base azotata.
Zuccheri pentosi
Nel caso della molecola di DNA, lo
zucchero fondamentale è il D-2’
ribofuranosio, altresì detto
desossiribosio, poiché deriva dalla
deidrossilazione del carbonio 2’ del
ribosio.
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È altrettanto chiaro, oggi, che la molecola di RNA, che si origina a
stampo dal DNA è composta da ribosio, come zucchero pentoso.
Sia nel DNA che nell’RNA il
carbonio in 5’ è esterificato da un
gruppo fosfato, che consentirà
anche all’altro anello zuccherino
di legarsi allo zucchero
successivo.
Il legame tra il desossiribosio e lo
zucchero successivo avviene
sempre in posizione 3’:
-
si vedrà che sulla lunga
catena di DNA e di RNA si
possono individuare due estremità, una 3’ e l’altra 5’.
Basi azotate.
Biologia molecolare e cellulare 5 Biologia mole
Nell’RNA la pirimidina timina è sostituita dall’uracile, che differisce per
la mancanza di un metile sul C-2.
Nucleotidi.
I nucleotidi sono delle strutture formate da uno zucchero pentoso a cui
si legano una base azotata e un gruppo fosfato.
Sono presenti anche più gruppi fosfato, legati tra loro da legami
fosfodiesterici. Tra questi si può annoverare l’ATP (adenosintrifosfato)
e altri nucleotidi di o trifosfato, che svolgono funzioni differenti nella
cellula, non solamente quelle di codice genetico.
La nomenclatura dei nucleotidi prende il nome del nucleoside da cui
parte, cioè la parte di molecola formata dallo zucchero e dalla base,
che si lega in posizione 1 sullo zucchero.
Al nome del nucleoside si fa seguire il numero dell’atomo di carbonio
cui si lega il fosfato e mono-, di-, tri-fosfato.
Esistono due tipi di basi azotate nei nucleotidi:
-
pirimidine: ad anello singolo.
purine: ad anello doppio, uno esagonale e l’altro pentagonale.
Le purine sono due, identiche sia nel DNA che nell’RNA, e sono:
-
adenina
guanina
Le pirimidine sono due nel DNA:
-
citosina
timina
Base
azotata
Nucleoside
nucleotide
Adenina
(desossi)adenosina
(desossi)adenosina-5’ monofosfato
Guanina
(desossi)guanosina
(desossi)guanosina 5’-monofosfato
Citosina
(desossi)citidina
(desossi)citidina 5’-monofosfato
Timina
(desossi)timidina
(desossi)timidina 5’-monofosfato
Uracile
Uridina
Uridina-5’ monofosfato
Ovviamente, il prefisso desossi- si inserisce qualora lo zucchero che
costituisce il nucleoside sia il desossiribosio.
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La struttura della molecola di DNA.
I vari nucleotidi si dispongono ordinatamente tra loro, in un filamento
che costituisce la stampella primaria del DNA.
Il filamento singolo di DNA e RNA
Una molecola di oligonucleotide è formata da una catena di nucleotidi
che si dispongono in serie, che differiscono solamente per le basi
azotate.
I legami sono di tipo fosfodiesterico e si instaurano tra:
-
il carbonio in 3’ di uno zucchero
il fosfato posto in 5’ sullo zucchero precedente
Questo tipo di legame permette di individuare una certa polarità nella
molecola di DNA. Si individuano infatti, agli estremi della catena, due
estremità differenti:
-
l’estremità 3’ in cui si ha un –OH
l’estremità 5’ in cui si ha legato un –PO32-.
Le scoperte di Chargaff
Le prime analisi a diffrazione di raggi X dimostrarono che un nucleotide
impilato su un altro nell’ambito della molecola di DNA occupava uno
spazio verticale di 0,34 nm.
Si suggerì inoltre la presenza di una ripetizione ogni 10 nucleotidi,
circa, di 3,4 nm.
Erwin Chargaff, nel 1950, scoprì importanti informazioni che permisero
a Watson e Crick di elaborare il modello della molecola:
-
smentì la teoria del tetra nucleotide, che prevedeva che i
nucleotidi si ripetessero con la medesima sequenza di basi, il
che faceva pure dubitare del ruolo informazionale della
molecola.
Biologia molecolare e cellulare 6 Biologia mole
-
Studiando i rapporti della composizione in basi dei nucleotidi
scoprì che una purina si appaia sempre con una pirimidina,
nello specifico, in coppie:
o Adenina - timina
o Guanina - citosina
Era dunque presupposto, che la molecola era composta da coppie di
basi che si legavano tra loro.
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Biologia molecolare e cellulare 7 Biologia mole
Il modello di Watson e Crick
L’importanza del modello di Watson e Crick
Anche sulla base dei dati elaborati da diffrattometrie a raggi X da parte
di Franklin e Wilkins, i due scienziati che scoprirono la struttura della
molecola di DNA poterono formulare la loro ipotesi.
Affinché il materiale genetico sia effettivamente portatore
dell’informazione, deve soddisfare a tre fondamentali funzioni:
Il modello prevedeva:
-
-
-
-
-
la molecola è composta da due catene di nucleotidi.
Le catene si avvolgono a spirale formando una doppia elica
destrorsa.
I due filamenti scorrono in direzioni antiparallele, uno da 5’ a 3’,
l’altro da 3’ a 5’.
Lo scheletro formato dalle molecole zucchero – fosfato –
zucchero – fosfato, è situato all’esterno. Il fosfato porta una
carica negativa alla molecola.
Le basi sono impilate una sull’altra con un decorso
perpendicolare all’asse del filamento.
Le varie basi, seguendo la regola AT CG, sono appaiate
mediante legami idrogeno:
o Gli atomi di azoto legati a C4 della citosina e C6
dell’adenina sono nella configurazione amminica (-NH2),
piuttosto che in quell’imminica
o Gli atomi di ossigeno legati a C4 della timina e a C6
della guanina sono nella forma chetonica (-C=O),
piuttosto che in quell’enolica.
Ne consegue che i legami a idrogeno sono facili da scindere e
avvengono in numeri differenti:
o Tre per le coppie G-C
o Due per le coppie A-T.
La larghezza della catena, poiché un singolo nucleotide è largo
10 nm, è di 20 nm.
L’avvolgimento delle due catene avviene con un solco
maggiore e un solco minore. Nel solco maggiore si inseriscono
le proteine associate al DNA.
La doppia elica, forma un giro completo ogni 10 coppie di basi.
I due filamenti seguono la regola della complementarietà tra
basi azotate.
1) deposito dell’informazione genetica: deve contenere le
istruzioni precise per il mantenimento e l’espressione dei
caratteri dell’organismo.
2) Auto duplicazione ed ereditarietà: il DNA deve essere in
grado di essere trasmesso alla progenie.
3) Espressione del messaggio genetico: deve poter stabilire
l’ordine con cui alcuni amminoacidi che codificano per proteine
o enzimi, vengono espressi. Deve regolare il centro direzionale
delle attività cellulari.
Dal punto di vista del primo e del secondo punto Watson e Crick
avevano azzeccato:
-
-
la sequenza di basi azotate codificava per amminoacidi
corrisposti nell’ordine in cui comparivano nel peptide
corrispondente. Un certo numero di basi sarebbe un gene.
Anche per quanto riguarda la replicazione. Le due catene si
slegano e ognuna funge da stampo per la cellula figlia. Il DNA
risulterebbe quindi un materiale semiconservato.
Per quanto riguarda la regolazione dell’espressione genica e altre
specifiche funzioni regolative a livello cellulare, se si accetta la
proposta di Watson e Crick, ogni futura teoria sul DNA deve essere
coerente con tale modello.
Vi è da aggiungere che la conformazione del DNA come descritta da
Watson e Crick non è l’unica possibile, ma quella più stabile che
riguarda il DNA inattivo o in particolari condizioni.
Questa forma è detta B-DNA, mentre ne esistono altre, tra cui la forma
A e la forma Z:
-
la forma A è sempre una doppia elica destrorsa ma con un
passo più elevato
la forma Z è un avvolgimento sinistrorso e irregolare, senza
solchi difformi.
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Ordine e lunghezza dei nucleotidi
Biologia molecolare e cellulare 8 Biologia mole
-
Quanto DNA nell’uomo
sono segnali riconoscibili da proteine specifiche.
Attraverso queste sequenze il DNA è in grado di interagire con
le proteine specifiche per la sua regolazione, duplicazione,
espressione, ecc…
La unità di misura del DNA sono le coppie di basi. Un filamento di DNA
contiene miliardi di coppie di basi, infatti sono utilizzati i multipli del “B”:
-
chilo base (kb)
megabase (Mb)
gigabase (Gb).
Nel DNA umano sono presenti circa 6 gigabasi:
-
equivale a circa 60 libri di 600 pagine, ciascuna con circa 1000
caratteri per pagina.
come sono ordinati i nucleotidi
Le sequenze di basi portano in sé l’informazione genetica. Tutta
l’informazione contenuta in un nucleo è detta genoma.
L’ordine con cui le basi si dispongono è stato dato dall’evoluzione, che
attraverso la selezione naturale ha selezionato gli individui che
possedevano sequenze più vantaggiose.
i geni
cosa sono i geni?
Un gene è una specifica sequenza di DNA che codifica per un RNA
funzionale o per un RNA messaggero, quindi per una proteina.
Il quantitativo di geni presenti in una specie è sintomo della sua
complessità:
-
Negli umani (homo sapiens), il contenuto in geni nel nucleo è pari al
2% dell’intero genoma:
-
Ogni specie ha generalmente un assetto nucleotidico proprio.
I nucleotidi, all’interno del DNA sono ordinati con specifiche sequenze
che portano informazioni per la codifica delle proteine:
-
geni: sono sequenze di nucleotidi che codificano per una
proteina.
Cassette di sequenza con raggruppamenti specifici: sono
delle stringhe ripetute che portano informazioni non codificanti,
funzionali alla regolazione dell’espressione genica o
all’assunzione della conformazione della molecola stessa di
DNA.
Cassette di sequenza specifiche sono le TATA box, ad esempio, che
sono facilmente scindibili poiché hanno per lunghi tratti solo due
legami idrogeno da scindere:
se vi sono pochi geni, l’organismo sarà molto più semplice,
se ve ne sono molti, l’organismo avrà specifiche funzioni.
il restante 98% ha funzioni strutturali e regolative
i geni sono assai scarsi, se non assenti, a livello dei telomeri e
dei centromeri. Questo permette di evitare errori di delezione
degli estremi del DNA.
In organismi più semplici, con un minore rapporto geni/basi, il DNA è
utilizzato e sfruttato al massimo:
-
possono presentarsi i geni policistronici.
Omologia di sequenza: se due specie possiedono almeno un 20% di
genoma in comune, è un indice di origine comune dal punto di vista
evolutivo.
Solamente in seguito, l’evoluzione introdurrà delle differenze speciespecifiche.
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Il crossing-over ineguale
Il crossing-over ineguale è un sorprendente meccanismo che porta
talvolta alla duplicazione genica, su un filamento, e alla delezione su
un altro.
L’evento di crossing-over ineguale avviene quando nella meiosi i
cromosomi omologhi non si appaiano perfettamente, avendo uno
scambio genetico difforme, in cui:
-
un cromosoma possiede un tratto di DNA in più che può essere
un gene duplicato
l’altro possiede un tratto di DNA in meno, quindi la delezione
dei geni in esso contenuto.
La maggior parte delle duplicazioni viene persa nell’evoluzione, ma
alcune si rivelano vantaggiose e passano alla generazione successiva:
-
Gli ossigeni sono normalmente nella conformazione chetonica, ma per
azioni esterne o condizioni chimico-fisiche particolari, si possono
portare alla forma enolica, per quel fenomeno che si chiama
tautomeria cheto-enolica.
La medesima cosa avviene per le terminazioni dell’anello che
possiedono un gruppo amminico, che per eventi chimici o fisici
particolari si possono portare nella forma imminica, per quell’evento
che si chiama tautomeria immino-amminica.
Proprio per questa serie di fenomeni possono avvenire le mutazioni,
che coinvolgono le basi azotate:
-
-
si possono avere appaiamenti scorretti (AC, AG, TC, ecc..) a
seconda della configurazione atomica che si viene a creare sul
margine interno del filamento.
Sono eventi inevitabili, scritti nella natura stessa del DNA.
si origina un gruppo di geni disposti in tandem
successivamente, i geni possono subire delle mutazioni, che li
porta a codificare delle proteine che tra loro sono isoforme.
Sono numerosi i casi in cui le proteine sono delle isoforme, che
formano monomeri a funzione più specializzata:
-
Biologia molecolare e cellulare 9 Biologia mole
tubuline
actine
globine,
I loro geni sono disposti in tandem o capita che possano trovarsi, in
seguito, anche su cromosomi differenti (come nel caso dei monomeri
dell’emoglobina), a causa di altri eventi sul DNA.
Pseudogeni: geni con sequenze analoghe a quelle funzionali che
hanno subito mutazioni che non gli permettono di funzionare
correttamente.
Perché possono avvenire gli errori?
Le basi azotate, formano i legami idrogeno con l’azoto e l’ossigeno
presenti nella parte interna della catena di DNA.
La molecola di RNA
Struttura e funzioni.
La molecola di acido ribonucleico è formata da nucleotidi che
comprendono:
-
uno zucchero a 5 atomi di carbonio, il ribosio;
un gruppo fosfato legato su 5’ del ribosio
una base azotata scelta tra due pirimidine (citosina e uracile) e
due purine (guanina e adenina), legata al carbonio in 1’.
L’RNA è una molecola a singolo filamento, legatosi con legami
fosfodiesterici tra il carbonio 5’ di uno zucchero e il 3’ del successivo.
Nonostante sia una molecola a singolo filamento, l’RNA può appaiarsi
in vari punti per formare delle strutture particolari che gli permettono di
svolgere le proprie funzioni.
Si classificano vari tipi di RNA, che possiedono funzioni specifiche:
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-
-
-
rRNA: il più frequente (80%), che si compone di differenti
frammenti che vanno a costituire i ribosomi.
tRNA: è la molecola che porta l’amminoacido al ribosoma
durante la sintesi proteica. È formato da 76 nucleotidi circa, a
forma di trifoglio, possiede varie anse. L’amminoacido si lega
sull’anticodone, un sito di legame sull’ansa complementare a
quello dell’mRNA che passa nel ribosoma, corrispondente
all’amminoacido che trasporta, al suo estremo terminale
(estremità 3’). Sono circa il15% degli RNA della cellula.
mRNA: è un RNA a un solo filamento, anche se può
effettivamente ripiegarsi a formare un loop, che porta
l’informazione per la proteina.
RNA serie U: sono molecole poco frequenti, la cui funzione
non è del tutto chiara.
microRNA: sono piccoli frammenti che possono legarsi
all’mRNA a formare porzioni di doppio filamento. Sembra che
abbiano la possibilità di inibire un punto di trascrizione.
Biologia molecolare e cellulare 10 Biologia mole
Trascrizione
La trascrizione è un fenomeno per cui dal DNA si trascrive un
filamento di RNA.
La trascrizione in generale
Gli enzimi responsabili della trascrizione, sia in procarioti che eucarioti,
sono detti RNA-polimerasi:
-
Le sequenze a cui si lega RNA polimerasi sono definite promotore:
-
Gli rRNA
Gli rRNA sono gli acidi ribonucleici più frequenti:
-
i tratti di DNA che li codificano sono sequenze mediamente
ripetitive disposte in tandem
esistono vari frammenti di rRNA che portano alla formazione di
un ribosoma, anche con modifiche post-trascrizionali.
Negli eucarioti, gli rRNA che formano un ribosoma, sono:
-
28 S
18 S
5,0 S
5,8 S
L’assemblamento e la modifica di questi rRNA di dimensioni e
caratteristiche differenti porta alla costituzione delle due subunità del
ribosoma eucariotico, con coefficiente di sedimentazione 80 S:
-
60 S (subunità maggiore)
40 S (subunità minore).
sono in grado di assemblare i nucleotidi uno alla volta, a partire
da un tratto di DNA che funge da stampo.
Le RNA polimerasi possono riconoscere e legare delle
specifiche sequenze sul DNA.
-
affinchè le RNA polimerasi si leghino ai promotori è necessaria
la presenza di numerosi fattori di trascrizione, delle proteine
ancillari es. GTF.
Il promotore contiene anche informazioni addizionali, ad
esempio il filamento su cui avviene la trascrizione.
La RNA polimerasi muove in direzione 3’ >> 5’ lungo il filamento di
stampo:
-
il filamento di DNA si srotola localmente
la polimerasi assembla un filamento complementare di RNA
che cresce dal suo 5’ in direzione 3’. (filamento antiparallelo al
DNA).
La reazione catalizzata dalla RNA polimerasi è:
RNAn + nuc-PPP RNAn+1 + PPi
In cui i ribonucleosidi trifosfato vengono idrolizzati in nucleosidi
monofosfati e polimerizzati covalentemente nell’RNA corrispondente.
Non appena la polimerasi ha oltrepassato una certa soglia di nucleotidi
funzionali, la doppia elica del DNA si riavvolge. La RNA-polimerasi,
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infatti, incorpora da 20 a 50 nucleotidi alla volta: dietro di sé non ha
alcun ibrido, ma la catena di DNA si riavvolge.
Più polimerasi funzionano contemporaneamente e trascrivono geni
differenti sulla medesima molecola di DNA.
La DNA polimerasi non ha una velocità prettamente costante nella
trascrizione:
-
può arrestarsi per vari motivi e riprendere
è più veloce quando ha a che fare con la rottura di basi
appaiate AT, piuttosto che CG sul DNA, poiché possiedono un
legame idrogeno in meno.
La RNA-polimerasi si slega quando incontra una sequenza di
nucleotidi sul DNA che porta un’informazione specifica di termine,
detta sequenza di termine.
Biologia molecolare e cellulare 11 Biologia mole
La sintesi avviene seguendo le seguenti tappe:
1) il fattore sigma interagisce con il promotore, quindi l’enzima
completo (2alfa, 2beta e sigma) si legano alla CAAT box
2) l’enzima completo, detto anche oloenzima, dopo alcuni
tentativi separa le due catene avvolte di DNA.
3) Dopo che vengono incorporati alcuni enzimi nel complesso di
RNA nascente (ricordare 3’ >> 5’), l’oloenzima subisce un
cambiamento conformazionale che lo fa diventare complesso
di allungamento della trascrizione, che si muove poi
processivamente lungo il DNA.
4) La trascrizione si interrompe a livello della sequenza di
termine.
Talvolta il termine della trascrizione avviene ad opera di una proteina
detta fattore rho (), un anello che scorre lungo l’RNA neosintetizzato
per poi scindere l’RNA poli dal DNA.
La trascrizione nei procarioti
Nei batteri come E. Coli è presente un solo tipo di RNA polimerasi, che
per legarsi correttamente al promotore necessita di alcuni fattori
opzionali, detti fattori sigma ().
Trascrizione negli eucarioti
La RNA polimerasi batterica è formata da un nucleo enzimatico
composto da 5 subunità proteiche (di cui 2 alfa e 2 beta).
Questi tre tipi di polimerasi sono identici in tutte le cellule eucariotiche:
Il nucleo enzimatico della polimerasi batterica è formato da una sorta
di chele che arpionano in mezzo il filamento di DNA, facendolo
scorrere in un canale carico positivamente.
I promotori batterici si trovano a monte del gene, subito in prossimità di
esso e sono composti da due sequenze di consenso:
-
CAAT box: è una sequenza che inizia a -35, sull’estremità 3’
rispetto al gene, ed è un tratto di circa 35 basi
TATA box: è la sequenza di consenso che indica precisamente
il punto in cui viene aperta la catena (notare che TATA è
formato per la maggior parte da nucleotidi con solo 2 legami
idrogeno, quindi più facili da scindere).
Possono esistere, a seconda delle condizioni, differenti fattori sigma.
Le cellule eucaristiche possiedono tre differenti tipi di RNA polimerasi,
ciascuna delle quali sintetizza per un determinato gruppo di RNA.
-
-
differiscono dalle procariotiche solamente per la presenza di
alcune subunità aggiuntive, mentre il nucleo resta
sostanzialmente lo stesso.
Le subunità aggiuntive hanno la principale funzione
nell’interazione con i numerosi fattori di trascrizione.
Le proteine accessorie, denominate fattori di trascrizione, svolgono un
ruolo fondamentale nella regolazione e nello svolgimento della
trascrizione negli eucarioti:
-
legame della polimerasi allo stampo
allungamento,
terminazione
inizio della trascrizione,
ecc…
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Biologia molecolare e cellulare 12 Biologia mole
I principali tipi di RNA derivano tutti da molecole di RNA-precursori,
detti preRNA, o trascritti primari:
-
è un segmento perfettamente complementare a quello del DNA
che è funto da stampo.
I trascritti primari sono subito associati a proteine, dopo la copia
dell’unità di trascrizione sul DNA.
Lo stadio finale in cui si possono raggiungere tRNA, mRNA, rRNA
viene raggiunto grazie ad operazioni di processing:
-
è una sorta di taglia e incolla in cui le catene di preRNA
vengono tagliate e ricucite in punti specifici.
Perché avvenga il processing è necessario che vi sia una gran
varietà di piccoli RNA, lunghi circa 90-300 basi, e le proteine
che vi si associano.
I tipi di RNA polimerasi eucaristica sono riassunti in tabella:
enzima
RNA di sintesi
RNA polimerasi I
RNA ribosomi ali più grandi (18, 28, 5,8 S)
RNA polimerasi II
mRNA, maggior parte dei piccoli snRNA e sno
RNA, microRNA e RNA delle telomerasi
RNA polimerasi III
Piccoli RNA, tRNA, rRNA 5S e RNA serie U6.
Sintesi e maturazione degli rRNA
Nelle cellule eucariote l’80% dell’RNA è RNA ribosomiale:
-
i ribosomi sono numerosissimi e devono continuamente
sintetizzare le proteine più disparate.
Nel DNA le sequenze che codificano per rRNA (dette anche
rDNA) sono sequenze mediamente ripetitive, ripetute circa 100
volte in tandem in 5 macroregioni
Le 5 regioni di rDNA sono responsabili della formazione dei nucleoli:
-
questi contengono le neo codificate subunità ribosomiali
hanno un aspetto granulare, di primo acchito.
Sintesi e precursori di rRNA
Nei nucleoli, seguendo l’analisi che Oscar Miller fece nel 1960, si può
osservare una grande fibra circolare che risulta composta da una
“catena di alberi di natale”:
1) i geni che codificano per gli rRNA sono disposti in tandem su
un filamento di DNA
2) l’albero di natale si compone di:
a. tronco: il DNA
b. rami: rRNA neo sintetizzato
c. base dei rami: RNA-poli I.
d. il tratto di DNA compreso tra il primo ramo (quello più
corto, con sintesi appena iniziata) e l’ultimo ramo (il più
lungo, con sintesi completata) si chiama unità di
trascrizione.
3) Le fibrille di rRNA precursore contengono gruppi di particelle
associate, che sono responsabili della formaizone delle
subunità ribosomiali:
a. Proteine
b. RNA
4) Tra le due unità di trascrizione è presente una fibra che non
codifica per nessun RNA, detta spacers non trascritto.
Gli spacers non trascritti sono spesso presenti tra i codificanti con
media ripetitività.
Maturazione dell’rRNA precursore.
I ribosomi eucaristici contengono quattro rRNA distinti:
-
subunità maggiore: 28S, 5,8S, 5S
subunità minore: 18S.
Sul DNA vi due sequenze differenti:
Enrico Colombo
-
preRNA: 28S, 18S, 5,8S
rDNA 5s: 5s.
Il preRNA è composto da un unico filamento che contiene in sé il 28S,
il 18S e il 5,8S, che poi vengono separati ad opera di varie nucleasi.
Biologia molecolare e cellulare 13 Biologia mole
Il nucleolo non è solamente il sito di elaborazione di rRNA ribosomiali,
ma anche quello del montaggio delle due subunità:
-
Le caratteristiche peculiari del preRNA sono:
-
gran numero di metilazioni e residui di pseudouridina.
Vengono aggiunti come modificazioni post-trascrizionali.
I nucleotidi metilati e i residui di pseudouridina sono rimasti sui preRNA
nel corso dell’evoluzione sulle sequenze immutate:
-
le nucleasi non tagliano in prossimità dei nucleotidi segnati con
metilazioni
discheratosi: mutazione mortale nell’enzima che promuove la
conversione di uridina in pseudouridina.
Nel processo di maturazione, dal trascritto 45S primario di preRNA di
circa 13000 nucleotidi ne rimangono circa 7000 nei tre segmenti
risultanti dalla maturazione.
Gli snoRNA: la maturazione del preRNA avviene grazie all’aiuto di
piccolo RNA nucleo lari (snoRNA) che, assieme ad altre proteine
formano le ribonucleoproteine piccole nucleolari:
-
queste snoRNP si associano all’rRNA ancora prima del termine
della trascrizione
alcuni possono recidere l’estremità 5’ del trascritto
altre recisioni sono ad opera di esonucleasi specifiche (circa 12
differenti).
Alcuni snoRNP presenti in quantità minore svolgono funzioni
quali:
o Indicare quali nucleotidi vengono metilati sul ribosio
o Indicare quali uridine devono essere convertite in
pseudo uridine.
Questi snoRNP contengono piccole sequenze di RNA, che possono
ibridarsi e formare, per brevi tratti, dei doppi filamenti di RNA con il
neotrascritto.
vi si associano due tipi di proteine:
o proteine ribosomiali: sono stabili e formano le subunità
o proteine accessorie: si associano in maniera transitoria
e catalizzano le reazioni di maturazione (elicasi x
riarrangiamenti strutturali, esonucleasi, ecc..)
Sintesi e maturazione dell’rRNA 5S
Una molecola di rRNA 5S, lunga circa 120 nucleotidi, è presente come
componente della subunità maggiore del ribosoma.
Negli eucarioti le molecole di rRNA 5S sono codificate fuori dal
nucleolo, su una serie di sequenze identiche inframezzate a quelle che
codificano per gli altri rRNA:
-
sono codificate dalla RNApoli III.
Vengono poi trasportate nel nucleolo e assemblate assieme
agli altri rRNA
La RNA polimerasi III è particolare poiché si lega ad un promotore
che si trova all’interno della sequenza che viene trascritta:
-
codifica per tipi differenti di RNA, compreso il tRNA, ma per
questi tipi il promotore si trova a monte
Gli RNA transfer (tRNA)
Le cellule animali hanno circa 50 tipi differenti di RNA transfer, uno per
tripletta codificante:
-
-
si trovano all’interno del genoma più sequenze che codificano
per lo stesso tRNA
i geni che codificano per tRNA sono raggruppati in cluster,
ovvero gruppi di sequenze brevi che codificano per differenti
tRNA
la sequenza che codifica per un dato tRNA si trova
generalmente in più di un cluster.
Enrico Colombo
I tRNA sono trascritti dalla RNA polimerasi III e la sequenza promotrice
si trova all’interno della parte codificante del gene, anziché
all’estremità 5’.
Il trascritto primario di una molecola di RNA transfer è più grande del
prodotto finale:
-
devono essere rimossi dei tratti sulle due estremità 5’ e 3’.
Uno degli enzimi che tagliano il pre-tRNA è la ribonucleasi P.
Biologia molecolare e cellulare 14 Biologia mole
-
è legato a fattori di trascrizione specifici, proteine che si legano
alla sequenza e ne permettono la regolazione.
I silencer sono sequenze a cui normalmente si lega un inibitore, che
quando si slega, al passaggio di fattori di trascrizione, reprimono la
trascrizione dell’mRNA o di altri RNA.
Il promotore prossimale
Il promotore prossimale si compone di due tipologie di sequenze:
Sintesi e maturazione degli mRNA (messaggeri).
Nella trascrizione dei messaggeri eucariotici sono presenti numerosi
fattori, sia sul DNA che a livello di proteine (fattori di trascrizione e
RNA polimerasi):
-
-
-
-
RNA poli II
Promotore distale
o Enhancer
o Silencer
Promotore prossimale
o Pseudo CAAT box
o TATA box
Fattori di trascrizione
o elementi in trans (non sul filamento di DNA)
o elementi in cis (sul filamento che deve essere trascritto).
sequenza di termine.
Il promotore distale
Il promotore distale si compone di sequenze sul DNA che si possono
trovare a notevole distanza dalla sequenza da trascrivere, da -500 a 10'000.
Possono essere presenti o non esserci. Quando ci sono possono
essere situati sia a valle che a monte del gene.
La sequenza enhancer è una sequenza di circa 200 nt che potenzia la
trascrizione:
-
delle pseudo CAAT box,
la TATA box.
Le CAAT box sono sequenze che consentono il legame delle proteine
che formano il complesso dell RNA polimerasi II:
-
sono elementi regolatori in cis, ovvero sul filamento che viene
trascritto
La TATA box è una sequenza di nucleotidi ricchi in adenina e timina
posta sul DNA tra -20 e -35:
-
è la cassetta di sequenza che indica il punto in cui deve essere
aperta la bolla di trascrizione.
Fattori di trascrizione o elementi in trans
I fattori di trascrizione in trans sono elementi che interagiscono con il
DNA, ma non appartengono al filamento:
-
si legano agli elementi regolativi in cis (promotore prossimale e
distale)
hanno una struttura quaternaria particolare.
I più comuni fattori di trascrizione in trans sono proteine che pinzano il
DNA e ne modificano la conformazione, quali:
-
zinc finger,
leucine-zipper
helix turn helix.
Enrico Colombo
Il processo di trascrizione.
Biologia molecolare e cellulare 15 Biologia mole
-
Il processo di trascrizione avviene in varie tappe, che comprendono:
-
l’ancoraggio di RNA poli II
la cascata di GTF sulla TATA box
l’elongazione del filamento di pre-mRNA
il termine della trascrizione.
-
La differenza tra endonucleasi e esonucleasi, quando tutte e due
sono impiegate nel taglio di una sequenza di nucleotidi è:
L’ancoraggio di RNApoli II sul filamento dipende dall’interazione di
fattori di trascrizione specifici in trans che si legano all’enhancer e al
promotore:
-
questi complessi proteici legati a enhancer e promotore
ripiegano la catena e si legano tra loro
formano una trappola sterica per l’RNApoli II
permettono la formazione dell’enhanceosome, un complesso
proteico di 12 proteine fondamentale per la trascrizione.
Con la formazione dell’enhanceosome si ha una cascata di GTF sulla
TATA box:
-
alla TATA box si lega una proteina detta TATA binding
protein (TBP)
Questa proteina richiama numerosi GTF (general transcription
factors) che si legano alla TBP, che sono chiamati TF II
(transcription factors II)
I TF II sono sette proteine che si legano al complesso TATATBP, che permettono il legame della RNA polimerasi II.
Quando la polimerasi si lega, la trascrizione ha inizio e numerosi TF II
si distaccano dal complesso.
L’elongazione è quel processo in cui la polimerasi allunga il filamento
di RNA, con la regola della complementarietà delle basi rispetto al
DNA.
Il termine della trascrizione avviene quando l’RNA polimerasi arriva
alla sequenza TTATTT, che è posta circa 25 nucleotidi a monte del 3’
del filamento da trascrivere:
sull’RNA si trascrive la sequenza AAUAAA, che richiama una
endonucleasi che taglia il filamento di RNA dopo il passaggio
della polimerasi.
Con il taglio, si ha il distacco della polimerasi.
-
Endonucleasi: sono enzimi che rompono i legami
fosfodiesterici tra due nucleotidi della catena.
Esonucleasi: sono enzimi che depolimerizzano una catena
nucleotidica dalle estremità del filamento.
-
Vi sono delle eccezioni alla regola dei promotori con TATA: dei geni
detti TATA-less promoters. Questi, a monte della sequenza, non
hanno una TATA box, ma delle sequenze analoghe ricche in C e G,
che occupano la medesima posizione della TATA:
-
sono più difficili da aprire
sono derivati da geni ripetuti in tandem
sono per le proteine in cui vi è un enorme bisogno in qualsiasi
momento (istoni, rRNA, ecc…)
hanno una efficienza generalmente minore per le proteine che
sono rare.
La derivazione di questa tipologia di promotore è arcaica ed
eucariotica.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 16 Biologia mole
-
Maturazione del RNA messaggero
Le modifiche che avvengono per la maturazione di un RNA
messaggero sono:
1) capping
2) poliadenilazione
3) splicing
Il capping di un mRNA
Il capping consiste nell’aggiunta di una 7-metil-guanosina
sull’estremità 5’ del filamento di RNA neotrascritto, appena è iniziata la
trascrizione:
-
una guanosinatrifosfato (GTP) viene metilata ad opera di
numerosi enzimi in 7-metil-guanosina
la 7-metil guanosina si lega con il suo gruppo fosfato al fosfato
del 5’ del filamento di RNA
si ha un legame fosfodiesterico 5’ – 5’ invertito al capo dell’RNA
nascente.
La funzione del capping è multipla:
-
protezione dalle esonucleasi, per impedire che il filamento
venga depolimerizzato
esportazione e riconoscimento dal nucleo al citoplasma
inizio della sintesi proteica, permettendo il riconoscimento al
ribosoma.
Poliadenilazione della coda del mRNA
La poliadenilazione è un avvento post-trascrizionale che permette di
portare tranquillamente l’mRNA nel citoplasma:
-
dopo la sequenza AAUAAA sul filamento neotrascritto vengono
aggiunti da 50 a 250 nucleotidi di adenina, formando la coda
poli(A).
Questa non è codificata da alcun gene, ed è aggiunta un
enzima chiamato poli(A)polimerasi.
Le sue funzioni sono di protezione dall’azione di esonucleasi e di
trasporto nel citoplasma.
I geni sprovvisti della TATA box non subiscono la poliadenilazione,
poiché vengono subito tradotti, appena sono trascritti.
Splicing
Lo splicing è un evento post trascrizionale che avviene nel nucleo:
-
comporta la rimozione degli introni dal filamento.
Il procedimento avviene nel seguente ordine:
-
l’hnRNA (mRNA nucleare) si associa con un complesso detto
spliceosoma, che riconosce gli introni tagliando le estremità 5’
e 3’ di questi
lo spliceosoma, poi, riunisce le estremità degli esoni, a dare l
filamento di mRNA maturo.
Nel processo di splicing intervengon numerose molecole:
-
snRNA che con proteine formano le snRNP
(ribonucleoproteine nucleari)
U-RNA, altri complessi ribonucleoproteici.
Lo splicing alternativo è un procedimento di regolazione
dell’espressione genica che permette la formazione di proteine
differenti ma analoghe a partire da un solo trascritto:
-
avviene nel 60 % dei trascritti
il meccanismo comporta una scelta differente degli introni da
tagliare.
Solitamente la scelta degli esoni avviene in base alla specificità
del tessuto.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 17 Biologia mole
Sequenze UTR.
Negli mRNA maturi sono presenti spesso delle sequenze non
tradotte (UTR, untranslated regions):
-
sono regioni che si trovano alle estremità degli RNA
proteggono questi filamenti dalle RNAasi (esonucleasi che
degradano gli introni eliminati)
vengono trascritte, ma non tradotte.
La traduzione
Il codice genetico
Il codice genetico è una tabella che mette in relazione le triplette di
nucleotidi su un filamento di RNA con gli amminoacidi corrispondenti
per la sintesi delle proteine.
Le triplette che si trovano sugli mRNA sono dette codoni, che hanno
sequenze complementari sui tRNA, dette anticodoni.
Sul fondo dei tRNA si trovano gli amminoacidi corrispondenti agli
anticodoni, montati sui trifogli di tRNA dagli enzimi amminoaciltRNAsintetasi.
Il codice genetico gode di determinate proprietà:
-
-
è degenerato: codoni differenti possono codificare per lo
stesso amminoacido. Fanno eccezione met e trp e i codoni di
STOP.
Non è ambiguo: a ogni codone corrisponde perfettamente un
aa o uno STOP.
È universale: è presente ugualmente in tutti i nuclei di tutti gli
organismi cellulari. Fanno eccezione solamente i mitocondri,
che nel loro unico filamento circolare hanno dei geni con
differenti codici genetici a seconda delle classi di appartenenza
degli organismi.
Mutazioni geniche o puntiformi.
Le mutazioni geniche sono mutazioni che coinvolgono solamente un
nucleotide. Si contrappongono a quelle cromosomiche, in cui si ha la
mutazione di un tratto di nucleotidi consistente.
Enrico Colombo
Le mutazioni sono modificazioni permanenti spontanee del DNA,
dovute alla tautomeria delle basi azotate, in cui si ha l’appaiamento
scorretto di determinate basi.
Biologia molecolare e cellulare 18 Biologia mole
-
I tipi di mutazione puntiforme sono:
-
-
sostituzione: è la più frequente, e può essere casualmente
reversibile. Può portare a:
o codoni missenso: triplette che codificano per un altro
amminoacido, poco gravi.
o Codoni non senso: codoni che codificano per uno
stop. Hanno una discreta gravità.
Inserzione, delezione o duplicazione: sono spostamenti
reciproci dei due filamenti. Possono provocare delle frame shift,
ovvero lo slittamento dell’intera cornice di lettura nel DNA.
Molto spesso si ha un ptc, codone di terminazione prematura.
Può capitare, che proprio la proprietà di essere degenerato del codice
genetico, non porti ad una mutazione significativa:
-
molto spesso, un codone può trasformarsi in un codone
degenere, che codifica per lo stesso aa, pur essendo differente.
il ruolo dei tRNA.
La struttura tridimensionale della molecola invece presenta una forma
di L rovesciata con due doppie eliche.
In realtà non esistono 61 tRNA, tanti quanti i codoni del messaggero,
ma in minore quantità:
-
da un lato sono legati ad un aa, formando u aa-tRNA
dall’altro possiedono l’anticodone, che può riconoscere la
sequenza sull’mRNA corrispondente all’aa.
Bidimensionalmente, le molecole di tRNA hanno una struttura a
trifoglio, con:
-
3 anse in cui non v’è complementarietà delle basi appaiate
quattro bracci in cui le basi si appaiano
La molecola di tRNA presenta inoltre numerose particolarità:
-
possiedono spesso dei nucleotidi modificati, che permettono il
legame di specifiche proteine.
questo è reso possibile dalla regola del vacillamento in
relazione alla degenerazione del codice genetico:
o l’amminoacido codificato da più codoni è caratterizzato
dalle prime due basi, mentre la terza è meno
importante.
o Quindi vi sono tRNA che possono instaurare legami
differenti con la terza base.
Gli aa sono legati covalentemente al tRNA corrispondente da un
enzima chiamato amminoacil-tRNAsintetasi:
-
Gli RNA sono gli intermediari del processo di traduzione:
-
all’estremità 3’ hanno sempre la sequenza CCA – OH, a cui si
lega l’aminoacido
sull’ansa centrale presenta un anticodone formato da una
tripletta complementare al filamento di DNA.
-
Ve n’è uno per ogni aa
Utilizza ATP per formare prima amminoacil-AMP, poi
amminoacil-tRNA e AMP
il legame tra l’aa e il tRNA è un legame altamente energetico,
che permette di attuare facilmente la formazione dei futuri
legami peptidici.
se avviene l’appaiamento sbagliato, l’amminoacil-tRNAsintetasi
è in grado di correggere le bozze, tramite un meccanismo detto
di proofreading.
Il procedimento di traduzione
Il processo di traduzione è uno dei processi più complessi che si
verificano all’interno della cellula, che porta alla sintesi dei componenti
funzionali della cellula stessa: le proteine.
Per la sintesi proteica sono necessari:
Enrico Colombo
-
tutti gli amminoacil-tRNA
i ribosomi
l’mRNA
proteine con funzioni ausiliarie
cationi e GTP.
Il processo può essere diviso in varie fasi:
-
inizio della catena
elongazione della catena
terminazione.
L’inizio della sintesi.
Affinchè il ribosoma si leghi nel punto di lettura corretto, esso deve
riconoscere la sequenza d’inizio AUG, codone sull’mRNA che
codifica per la metionina:
-
una volta che il ribosoma ha riconosciuto il punto d’inizio si è
posto nell’appropriato modulo di lettura.
Proseguirà leggendo una tripletta alla volta e codificando e
sintetizzando gli amminoacidi del peptide.
Il processo avviene in varie fasi che si sintetizzano di seguito.
Fase 1. La subunità minore del ribosoma si porta al sito d’inizio.
L’mRNA si lega prima alla subunità minore del ribosoma, con il suo
codone AUG, che è la sequenza d’inizio.
Per riconoscere la sequenza d’inizio corretta e non una all’interno della
catena che codificherebbe per la proteina i ribosomi si avvalgono di
una sequenza che si trova 5 o 10 nucleotidi prima dell’AUG:
-
per gli eucarioti è detta sequenza Kozak ed è ACCAUGG
per i procarioti è la sequenza Shine-Dalgarno, GGAGGA
Le sequenze tipo Shine-Dalgarno sono poste all’estremità 3’
dell’mRNA e vengono ricononosciute da una sequenza
complementare presente sul ribosoma.
Fattori di inizio. La sintesi, per iniziare necessitano di proteine
solubili, dette fattori di inizio (IF o eIF per eucarioti).
Biologia molecolare e cellulare 19 Biologia mole
Nei procarioti si trovano:
-
IF1: facilita l’attacco della subunità minore all’mRNA e
impedisce un aggancio errato.
IF2: lega GTP richiesta per legare il primo amminoacil-tRNA
IF3: impedisce il legame prematuro della subunità maggiore.
Negli eucarioti son presenti invece 8 IF.
Fase 2. Il primo aa-tRNA si inserisce sul ribosoma. AUG è l’unico
codone che codifica per la metionina. Infatti, la metionina è sempre il
primo amminoacido incorporato in una catena peptidica, anche se
nella maggior parte dei casi viene poi rimosso enzimaticamente.
Nei procarioti solitamente la met N-terminale viene formilata, mentre
negli eucarioti non si presenta formilazione.
Esistono però due distinti tRNA:
-
uno per la metionina d’inizio
e l’altro per incorporare la metionina in una catena.
La sintesi inizia quando il tRNAMet iniziatore si lega ad AUG sull’mRNA:
-
si lega a IF2
vengono rilasciati IF1 e IF3.
Fase 3. Assemblaggio del complesso d’inizio completato. Quando
il tRNA iniziatore si lega alla subunità minore si ha l’idrolisi di GTP su
IF2:
-
si lega la subunità maggiore
si rilascia il complesso IF2 GTP.
Particolarità negli eucarioti. Negli eucarioti gli eIF sono 12, ma
anche in questo caso si ha il legame di eIF2-GTP, quando il tRNA
iniziatore si lega alla sequenza d’inizio.
La subunità minore cerca quindi il cap metilguanosinico sull’estremità
5’ di mRNA e avviene il legame.
Quando il complesso 43S che si è formato dall’aggancio del cap, il
messaggero scorre fino alla sequenza Kozak (5’ – CCACCAUGC – 3’):
Enrico Colombo
-
viene raggiunto il codone appropriato AUG
eIF2-GTP viene idrolizzato e
la subunità maggiore si lega al complesso.
Il ruolo dei ribosomi. I ribosomi sono macchine molecolari che con
funzione meccaniche ripetitive permettono lo scorrimento del filamento
di mRNA, la selezione dei tRNA, la formazione dei legami peptidici,
tramite l’utilizzo di energia rilasciata dall’idrolisi di GTP.
La peculiarità dei ribosomi è il contenuto di rRNA, che permette:
-
accuratezza della traduzione
lega fattori proteici
seleziona i corretti tRNA
polimerizzano gli amminoacidi.
Ogni ribosoma presenta tre siti in cui i tRNA scorrono nei vari passaggi
della sintesi e dell’elongazione della catena peptidica:
-
sito A, amminoacidico
sito P, peptidico
sito E, di uscita, exit.
Biologia molecolare e cellulare 20 Biologia mole
-
-
Fase 2. Formazione del legame peptidico. I due amminoacidi legati
ai loro tRNA sono vicini l’uno all’altro e possono reagire tra loro:
-
-
-
codone legato alla subunità minore >> decodificazione delle
informazioni contenute nell’mRNA
sito amminoacidico a contatto con la subunità maggiore >>
catalizza la formazione del legame peptidico.
Elongazione
La elongazione è il vero e proprio processo di costruzione della catena
polipeptidica della proteina.
Fase1. Selezione dell’amminoacil-tRnA. Quando il tRNA iniziatore è
nel sito P, il sito A è pronto ad accettare il secondo amminoacil-tRNA.
Per poter essere idrolizzato, l’amminoacil-tRNA deve essere legato ad
un altro fattore di elongazione detto EF-Tu-GTP, che possiede GTP:
L’estremo N-terminale dell’amminoacido nel sito A reagisce con
il carbonile dell’aa nel sito P.
Si forma il legame peptidico catalizzato dalla peptidil
transferasi, complesso enzimatico (ribozima) della subunità
maggiore
A legame formato il tRNA del sito P si distacca
dall’amminoacido.
Fase 3. Traslocazione. La traslocazione è un processo mediante il
quale il ribosoma slitta di tre nucleotidi sull’mRNA:
-
I tRNA che si legano a questi siti hanno:
-
tutti i tRNA legati a EF-Tu possono essere immagazzinati nel
sito A, ma solamente quel tRNA complementare al codone si
lega
quando amminoacil-tRNA-EF-Tu-GTP è legato viene idrolizzato
GTP e rilasciato il fattore di elongazione.
-
è catalizzato da EF-G, che attua una modifica conformazionale
con l’utilizzo di GTP.
Si rompono i legami idrogeno e il tRNA con legato il dipeptide si
sposta nel sito P
Il tRNA deacilato si sposta dal sito P al sito E.
Fase 4. Rilascio del tRNA deacilato. Nella tappa finale, il tRNA
deacilato si sposta ed esce dal ribosoma liberando il sito E:
-
nel processo di elongazione vengono utilizzate 2 GTP per ogni
aa.
Ogni ciclo dura circa un ventesimo di secondo.
Il sito A è nuovamente libero per poter iniziare un altro ciclo.
Terminazione.
La terminazione ha inizio quando sul messaggero sono presenti uno
dei tre condoni di STOP, che inducono il ribosoma a slegare l’ultimo
Enrico Colombo
amminoacido dal tRNA nel sito P, anche senza la presenza di un
nuovo tRNA.
Biologia molecolare e cellulare 21 Biologia mole
-
quando un mRNA possiede ancora EJC dopo essere stato
tradotto viene identificato come aberrante e distrutto
enzimaticamente.
Affinchè la terminazione abbia fine, è necessaria la presenza di fattori
di rilascio, RF o eRF per gli eucarioti, che riconoscono i codoni di
stop.
Poliribosomi
Quando entrano nel sito A del ribosoma e riconoscono un codone di
stop (UAA, UAG, UGA), inducono la rottura del legame estereo tra
l’ultimo tRNA e la catena polipeptidica ad esso legata.
Il filamento di mRNA, quando è trascritto, può esserlo ad opera di
numerosi ribosomi contemporaneamente, poiché questi si legano al
cap e si dirigono verso il 3’ uno dopo l’altro.
Per la rottura del legame è necessaria la presenza di un altro EF, EFG, che lega ed idrolizza GTP.
Il complesso che si forma con i numerosi ribosomi sul filamento di
mRNA è detto poliribosoma.
Dispositivi di correzione degli errori
In caso del cambiamento di una base o dell’inserzione di un nucleotide
nel mRNA o nel DNA sono facilmente pervenibili delle mutazioni
nonsenso, che comportano la presenza di un codone di STOP
prematuro:
-
-
le cellule possiedono un meccanismo di sorveglianza
dell’mRNA in grado di rivelare la presenza di codoni di stop
prematuri
sono tradotte solitamente una sola volta prima di andare
incontro a distruzione ad opera di un meccanismo chiamato
nonsense-mediated decay o NMD.
L’NMD protegge le cellule dalla produzione di proteine tronche e non
funzionali.
Quando si ha l’unione tra due esoni ad opera dello spliceosoma, un
agglomerato di proteine detto complesso di giunzione esonica
(EJC), rimane associato all’mRNA fino a che non viene tradotto:
-
quando passa nel ribosoma, prima dell’ingresso, l’attività
elicasica e altre attività lo rimuovono
se si inserisce un codone di stop prematuro, parte del filamento
resta attaccato al ribosoma con addosso alcuni EJC
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 22 Biologia mole
-
La replicazione del DNA
La replicazione del materiale genetico è un evento unico, che ha
permesso il tramandarsi della vita stessa e l’evoluzione ad organismi
complessi.
Infatti, la vita in sé, non sarebbe potuta progredire se non avesse
conservato il proprio patrimonio informazionale:
-
inizialmente si aveva tramite RNA,
solo successivamente l’informazione venne tramandata tramite
DNA.
Teorie sul tipo di replicazione.
La replicazione dei due filamenti di DNA, che sono complementari tra
loro lasciava intendere a Watson e Crick dei diversi modelli di
comportamento re plicativo, che potevano essere:
-
-
replicazione semiconservativa: ogni doppia elica figlia riceve
metà della struttura parentale.
Replicazione conservativa: ogni filamento avrebbe fatto da
stampo per un nuovo filamento. I nuovi si uniscono tra loro e i
vecchi ritornano uniti. Una cellula figlia ha ancora il vecchio
patrimonio genetico.
Replicazione dispersiva: il DNA si replica a tratti, l’integrità
dei filamenti parentali viene dispersa.
Il modello semiconservativo, a seguito degli esperimenti di Mesleson e
Stahl, prevalse:
-
fecero crescere e riprodurre dei batteri in terreno di coltura con
un isotopo pesante dell’azoto
quando posero in coltura batteri in terreno neutro, con azoto14, si vide, analizzando la densità dopo centrifugazione, che si
ottenevano degli ibridi pesante-leggero, senza il mantenimento
di una molecola di DNA pesante
l’esperimento si confermò valido anche nelle generazioni
successive e si concluse che il DNA si replica con un modello
semiconservativo.
La replicazione nei procarioti
Con lo sviluppo delle tecniche biochimiche di laboratorio, oggi è
possibile studiare anche i meccanismi di replicazione del DNA
eucariotico.
Tuttavia, alcuni anni fa, non era possibile fare per gli eucarioti due
passi fondamentali per lo studio del processo di replicazione:
1) avere disponibilità di mutanti incapaci di sintetizzare qualche
proteina necessaria per il processo di replicazione
2) avere sistemi di coltivazione in vitro che consentissero di
studiare la replicazione in cellule purificate di determinate
proteine.
In questo modo, si poté conoscere le proteine che intervengono nella
replicazione dei batteri (circa 30 in E. Coli). Oggi è possibile studiare
anche il processo in cellule eucariotiche e si dimostra sensibilmente
simile.
Forcella di replicazione e replicazione bidirezionale.
Nella molecola circolare di DNA double strend batterico la replicazione
inizia in un punto detto origine, in cui sono presenti sequenze dette
oriC:
-
il doppio filamento si apre ad opera di proteine specifiche
si forma la forcella di replicazione.
La replicazione avviene in entrambe le direzioni rispetto all’ori,
è quindi una replicazione bidirezionale.
A livello della forcella di replicazione corrispondono punti in cui:
-
la doppia elica va incontro a separazione dei due filamenti
paterni
Enrico Colombo
-
i nucleotidi complementari a quelli paterni vengono incorporati
nel DNA della cellula figlia.
La forcella di replicazione si ampia fino a quando i due filamenti neo
sintetizzati si incontrano dalla parte opposta e si staccano dal DNA
paterno.
Biologia molecolare e cellulare 23 Biologia mole
Affinché la DNA polimerasi possa formare l’inizio, sono necessarie due
condizioni:
-
un filamento di DNA da cui copiare i nucleotidi (stampo)
una breve sequenza che fornisce una estremità 3’ OH alla
polimerasi, detta sequenza primer.
Le sequenze di origine sono generalmente ricche in T e A, poiché
sono più facili da scindere i legami idrogeno che le tengono unite.
Solamente una doppia elica con l’apertura di una bolla di replicazione
può soddisfare queste condizioni.
Srotolamento della doppia elica e separazione dei filamenti.
Con la scoperta delle varie DNA polimerasi si vide che l’unica
direzione di replicazione consentita era quella della scrittura da 5’ a 3’
e della lettura del filamento stampo 3’ > 5’.
La doppia elica batterica, essendo circolare, presenta il problema dello
srotolamento:
-
quando si apre la forcella di replicazione, infatti, la doppia elica
tende a super avvolgersi a seguito della trazione esercitata
dalle porzioni di filamento scisse all’origine
Il problema di questo eccessivo avvolgimento è risolto da un corredo
enzimatico detto di topoisomerasi, tra cui la DNAgirasi:
-
è una proteina che è in grado di eliminare, in E. Coli, lo stress
torsionale derivato dallo svolgimento dell’elica
taglia i due filamenti del duplex, li fa passare dalla parte
opposta e li risalda perfettamente.
Il processo necessita di energia, fornita mediante l’idrolisi di
ATP.
Le proprietà delle DNA polimerasi
La replicazione del DNA avviene ad opera di enzimi chiamati DNA
polimerasi, che sono presenti in varie forme sia negli eucarioti che nei
procarioti.
Nei procarioti vi sono tre DNA polimerasi principali: la I, la II, la III.
Quest’ultima è la principale artefice del processo di replicazione.
Affinché avvenga la reazione di replicazione del DNA è necessaria la
presenza di tutti i desossiribonucleotidi trifosfato, che vengono poi
incorporati nei nuovi filamenti (GTP, ATP, CTP, TTP).
La replicazione è semidiscontinua
Entrambi i nuovi filamenti sul filamento stampo vengono sintetizzati in
direzione 5’ > 3’, poiché la polimerasi non è capace di sintetizzare nella
direzione opposta.
Nella replicazione il gruppo fosfato del desossiribonucleotide trifosfato
si lega all’estremità 3’ OH del filamento in sintesi, muovendosi lungo lo
stampo.
Il filamento che viene sintetizzato in maniera continua, secondo la
direzione della forcella di replicazione, è detto filamento guida, e
procede senza interruzioni.
L’altro filamento, detto filamento in ritardo, avanza nella direzione
opposta rispetto a quella della forcella di replicazione:
-
-
viene sintetizzato a frammenti, detti frammenti di Okazaki.
Solo in seguito, la DNA polimerasi si porta indietro per
reiniziare, partendo da una nuova sequenza primer, dalla
forcella replicativa.
A quel punto, la sequenza primer verrà rimossa e si avrà la
sintesi di DNA che si collega al filamento precedentemente
trascritto, grazie all’enzima DNA ligasi.
Enrico Colombo
Appunto perché la sintesi del filamento che ha come stampo di DNA la
direzione 5’ > 3’ avviene a piccoli frammenti di 1000/2000 nucleotidi, la
replicazione viene detta semidiscontinua.
Biologia molecolare e cellulare 24 Biologia mole
-
Ma se la DNA polimerasi da sola non è capace di dare inizio ad un
filamento, l’inizio è dovuto da un altro particolare enzima, la RNA
primasi:
-
-
questa sintetizza una sequenza di RNA detta sequenza primer
queste sequenze primer servono come inizio per la DNA
polimerasi, la quale poi inizia dal primer a sintetizzare il
filamento di DNA.
I primer vengono poi rimossi e viene sintetizzato DNA e unito al
filamento mediante DNA ligasi.
-
si ritiene che le due DNA polimerasi dei due filamenti si
muovano assieme, legate una all’altra.
Si possono muovere assieme, nonostante si sintetizzi in
direzione opposta, poiché sul filamento in ritardo si forma un
occhiello (ansa circolare) che permette di portare il filamento
in cui si sta sintetizzando il frammento nella stessa direzione
del filamento stampo guida (3’ > 5’ sul DNA)
Questo meccanismo permette alle due polimerasi di muoversi
assieme senza violare il meccanismo della direzione 5’ – 3’.
Quando la polimerasi che forma il filamento in ritardo raggiunge
l’estremità 5’ del frammento di Okazaki sintetizzato durante il
ciclo precedente, abbandona il filamento stampo, sposta
l’occhiello e si dirige, assieme alla primasi, su un nuovo
stampo.
Il macchinario che opera a livello della forcella replicativa.
La replicazione richiede non solo l’incorporazione dei nucleotidi, ma
moltissimi altri processi che avvengono a livello del DNA.
Uno tra i processi più complessi è lo srotolamento del duplex e il
mantenimento dei filamenti slegati. Questi compiti sono attuati da:
-
elicasi: srotolano il duplex ad elica del DNA mediante l’energia
fornita dall’idrolisi di ATP.
Proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSB):
coadiuvano l’azione dell’elicasi legandosi al filamento singolo e
mantenendolo slegato, impedendone il riavvolgimento.
L’azione dell’elicasi avviene in contemporanea con quella della
primasi, poiché i due enzimi si associano formando un complesso
detto primosoma:
-
l’elicasi si muove in direzione 5’ > 3’ sul filamento stampo
(DNA) in ritardo
la primasi si lega a intervalli regolari sulla elicasi rilasciando le
sequenze primer.
È stato dimostrato inoltre che i differenti frammenti di Okazaki sono
sintetizzati dalla medesima DNA polimerasi III. Affinché ciò avvenga è
necessario un meccanismo particolare:
Strutture e funzioni delle DNA polimerasi.
L’enzima che opera nella formazione del filamento di DNA nella
replicazione di E. Coli è la DNA polimerasi III, che è parte di un grande
complesso chiamato repli soma o oloenzima DNA polimerasi III,
formato da varie subunità:
-
-
-
pinze ß: Sono pinze che circondano il filamento di DNA e
restano associate allo stampo. Hanno una struttura a ciambella
che formano una pinza scorrevole formata da due subunità.
o Le pinze sul filamento in ritardo vengono costantemente
sostituite ad opera di una pinza caricatore.
Pinza caricatore: pinza legata ad ATP, che permette il cambio
della pinza ß a livello del filamento in ritardo, al termine della
sintesi del frammento di Okazaki.
Polimerasi: è la parte funzionale nella sintesi dei nucleotidi sul
complesso enzimatico. Addossata alla pinza ß.
La DNA polimerasi I ha sostanzialmente alcune funzioni di
riparazione, ma la maggiore funzione che ha è quella di rimuovere i
primers.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 25 Biologia mole
o
La DNA polimerasi II è invece impiegata interamente nel riparo e
nella correzione del DNA neosintetizzato.
o
Attività esonucleasica della DNA polimerasi I
La DNA polimerasi I ha tre tipi di attività:
-
polimerizzazione
esonucleasica nelle due direzioni.
L’attività esonucleasica 5’ – 3’ viene esplicata quando la DNA poli I
deve rimuovere i primer:
-
degrada le sequenze primer che prima sono state lasciate dalla
primasi.
Dopo aver degradato l’RNA primer, la polimerasi sintetizza per la
sequenza mancante al posto del primer un filamento di DNA.
Alta fedeltà della replicazione del DNA
Un errore nella replicazione del DNA rappresenta un fatto molto più
grave rispetto ad un errore di trascrizione su un filamento di mRNA:
-
sull’mRNA un errore incide per un solo ciclo sintetico di una
proteina.
Sul DNA invece, si trasforma in una mutazione ereditaria.
A causa della tautomeria cheto-enolica e di quella immino-amminica,
le basi possono essere riconosciute in maniera scorretta dalla DNA
polimerasi, che le prova una ad una:
-
-
la polimerasi ruota come le dita di una mano, mentre ha il
filamento nel palmo.
Se l’appaiamento avviene in modo errato, si ha una
conformazione scorretta, e la polimerasi non può attuare il
cambiamento conformazionale corretto per l’attività catalitica.
se nel tentativo di appaiamento una base che non rispetta AT
CG è in una conformazione tautomerica scorretta si ha un
appaiamento errato,
o la frequenza è di uno ogni 10’000 nucleotidi incorporati
o
le tre polimerasi batteriche possiedono un sito di
esonucleasi 3’-5’.
La catena tende automaticamente a spostarsi in basso
verso il sito esonucleasico poiché preferisce restare a
filamento singolo.
Questo meccanismo di correzione di bozze funziona
nel 99% dei casi.
Tuttavia i batteri prevedono anche la possibilità di un altro meccanismo
detto riparazione dell’appaiamento scorretto:
-
entra in azione dopo la replicazione
corregge quasi tutti gli errori sfuggiti alla correzione di bozze
abbassa a 10-9 il tasso di mutazione spontanea.
In definitiva, la precisione e la fedeltà della replicazione del DNA è
dovuta a:
-
accurata selezione dei nucleotidi
immediata correzione di bozze (sito esonucleasico 3’-5’)
riparazione dell’appaiamento scorretto (post-replicazione)
Replicazione nelle cellule eucariotiche
L’analisi della replicazione nelle cellule eucariotiche è stata molto più
difficile rispetto a quella dei batteri per la maggiore complessità e per i
minori meccanismi a disposizione dei ricercatori.
Oggi, con nuove tecniche e scoperte di metodiche, è stato possibile
conoscere più a fondo la replicazione del patrimonio genetico di una
cellula eucariotica.
Inizio della replicazione
La replicazione di un batterio inizia in un solo punto chiamato origine,
mentre nelle cellule degli organismi superiori, che possiedono un DNA
molto più complesso, avviene in più punti, detti repliconi:
-
ciascun replicone ha una propria origine di replicazione
Enrico Colombo
-
-
apre una forcella replicativa e la sintesi avviene in entrambe le
direzioni.
In una fase S di un ciclo cellulare sono attivi un 10-15% dei
repliconi, che iniziano la loro sintesi nello stesso momento
anche nei cicli successivi.
Probabilmente, nella scelta dei repliconi, è implicato lo stato di
condensazione della cromatina e l’eventuale acetilazione degli
istoni ad essa legati.
Mentre nelle cellule eucariotiche di lievito la replicazione inizia su delle
specifiche sequenze, dette ARS, negli eucarioti dei vertebrati il punto
di inizio non sembra avere delle sequenze preferenziali, ma dipende
probabilmente da:
-
dallo stato di condensazione
dal tipo di modificazione istonica
dallo stato di metilazione del DNA
dal grado di superavvolgimento,
ecc…
Restrizione della replicazione a un unico evento per ciclo
cellulare
È fondamentale che durante la duplicazione, poiché l’origine avviene in
più punti, ogni parte del genoma venga replicata una volta sola.
Deve quindi esistere un meccanismo che eviti che si apra una forcella
su un filamento che si è già duplicato, che consiste pressappoco in:
-
-
un complesso di riconoscimento dell’origine (ORC) lega
l’origine di replicazione e resta associato durante tutto il ciclo
cellulare
proteine autorizzanti (fattori Mcm2 – Mcm7) legano l’ORC,
costituendo un complesso di pre replicazione (pre-RC),
autorizzando l’inizio della replicazione.
Una ciclina protein-chinasi, la Cdk, durante la fase S resta
attivata ad alta concentrazione durante la fase S della mitosi,
impedendo la formazione di nuovi complessi di replicazione.
Biologia molecolare e cellulare 26 Biologia mole
-
Una sola volta per ciclo si ha il legame di una Cdk, quindi non
si avrà apertura di nuove origini.
Una volta che il complesso pre-RC è stato attivato le Mcm2 e Mcm7 si
attivano e formano un complesso attivo durante la replicazione:
-
si ritiene che possano avere attività elicasica.
Nei mammiferi, le proteine Mcm si dissociano e restano nel
nucleo quando hanno finito la loro attività.
Non si possono associare ad un pre-RC già attivato.
La forcella di replicazione negli eucarioti
La replicazione degli eucarioti è praticamente identica a quella dei
procarioti, la replicazione effettiva avviene sempre nello stesso modo.
Gli attori di questo meccanismo non sono proprio gli stessi in termini
molecolari, ma sono totalmente analoghi:
-
elicasi
proteine che si legano al filamento singolo (RPA)
topoisomerasi
primasi
DNA polimerasi (sono maggiori e differenti)
DNA ligasi.
Come avviene nei procarioti, il Dna delle cellule eucariotiche è
sintetizzato in maniera semidiscontinua, con differenze minime:
-
-
il replisoma è anche in questo caso formato da un dimero di
DNA polimerasi, che sintetizza con lo stesso metodo i
frammenti di Okazaki (formazione dell’ansa per rendere
complementari i due filamenti).
I frammenti di Okazaki sono sensibilmente più corti (150 nt).
Nelle cellule eucariotiche sono finora state individuate cinque DNA
polimerasi classiche, ovvero presenti in tutte le cellule eucariotiche:
-
solamente due di queste 5 non sono coinvolte nella
replicazione del DNA nucleare
Enrico Colombo
La DNA polimerasi è coinvolta nella replicazione del
DNA mitocondriale.
o La DNA polimerasi è implicata nei processi di
riparazione del DNA.
Le altre tre DNA polimerasi hanno invece funzioni di sintesi
particolari:
o La DNA polimerasi è associata all’RNA primasi,
codifica un piccolo tratto di DNA dopo il primer (20 nt)
poi abbandona la replicazione.
o La DNA polimerasi si pensa che sia la principale
polimerasi implicata nella sintesi del DNA. Come nei
batteri, questa è formata da:
Una pinza scorrevole, simile alle subunità ß dei
batteri, chiamata PCNA
Un caricatore della pinza sulla polimerasi
chiamato RFC.
Questa polimerasi completa la sintesi dei
frammenti di Okazaki sul filamento in ritardo, che
poi vengono uniti tra loro da una DNA ligasi.
o La DNA polimerasi è ancora non ben definita. Ha
comunque funzione sintetica di nuovo DNA e possiede
un sito esonucleasico per la correzione degli errori.
o
-
Come nei batteri, le polimerasi sintetiche ( hanno caratteristiche
triplici:
-
Allungano il filamento neosintetizzato in direzione 5’ – 3’
Non possono iniziare replicazione senza un primer.
Possiedono dei siti esonucleasici per la correzione degli errori
di appaiamento.
La funzione delle telomerasi
I frammenti di RNA primer posti alle estremità dei cromosomi lineari
lasciano un gap di DNA non sintetizzato quando sono rimossi dal sito:
-
Nessuna DNA polimerasi è in grado di sintetizzare nuovo DNA
su quelle sequenze senza la presenza di un Primer.
Biologia molecolare e cellulare 27 Biologia mole
-
Le estremità 3’ dei filamenti sono sempre più corte.
Al margine dei cromosomi sono sempre presenti delle sequenze non
codificanti, dette telomeri, che servono appunto per proteggere
l’informazione da delezioni o rimozioni locali nei punti più esposti:
-
Nell’uomo sono formati da circa 100-1500 unità di sequenze
ripetute
ad esempio TTAGGG.
Per ovviare all’inconveniente dei “buchi” di DNA al termine 3’ dei
filamenti neo sintetizzati vi sono degli enzimi detti telomerasi:
-
Aggiungono le stesse sequenze di desossiribonucleotidi
trifosfato.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 28 Biologia mole
Riparazione per escissione nucleolitica.
La riparazione del DNA
All’interno della cellula, il DNA è la molecola più importante, ma anche
la più fragile.
Delle alterazioni alle basi azotate o delle rotture nella catena
nucleotidica si possono verificare in qualsiasi momento (una cellula ne
subisce circa 10000 al giorno), ad opera di differenti fattori:
-
La cellula ha dei sistemi di riparazione formidabili e molto vari, quasi
capaci di recuperare qualsiasi danno subito:
-
-
solo 1 lesione su mille circa sfugge ai sistemi di riparazione
cellulare
vi sono numerosi sistemi enzimatici capaci di riparare i danni
subiti dal DNA, che funzionano secondo differenti meccanismi:
o riparazione istantanea
o escissione
La grande proprietà che permette al DNA una possibile correzione
delle aberrazioni è la sua complementarietà delle basi, che permette di
ricostruire il filamento che deve essere corretto su stampo delle basi
del filamento complementare.
Il processo tuttavia è complesso e richiede il rimodellamento della
cromatina, poiché questa limita l’accessibilità ai complessi enzimatici
di correzione.
dimeri di pirimidina
nucleotidi con legati gruppi chimici non propri
Questo sistema di riparazione può procedere per due vie:
-
agenti chimici
radiazioni termiche
radiazioni ultraviolette
onde elettromagnetiche
ecc…
Se queste lesioni non vengono riparate si trasformano
automaticamente in mutazioni, che si trasmettono alla progenie della
cellula.
-
I sistemi di riparazione per escissione nucleolitica (NER) agiscono
attraverso la rimozione di un piccolo tratto di filamento di DNA che
contiene una grossa lesione, quale ad esempio:
-
via associata alla trascrizione: viene di preferenza riparato il
filamento stampo che contiene i geni che vengono trascritti.
o La riparazione del filamento stampo avviene in
contemporanea alla trascrizione del DNA
o La segnalazione avviene attraverso il meccanismo della
RNA polimerasi.
o I geni che vengono trascritti maggiormente, ovvero
quelli più importanti, hanno la massima priorità
nell’ordine di riparazione.
via globale: più lenta e meno efficiente che corregge i filamenti
di DNA nel resto del genoma.
Il fulcro di questo meccanismo è il fattore di trascrizione TFII H, che
legge le sequenze scorrette del DNA durante la trascrizione. Questa
proteina possiede tra le sue subunità due siti elicasici, che qualora
venga ravvisato un errore separano il duplex e inizia il processo:
-
il filamento viene tagliato ai lati della sequenza scorretta dalle
endonucleasi e viene rimosso
la DNA polimerasi riempie il gap
delle DNA ligasi legano a livello dei nicks.
Nei procarioti vi è un sistema simile, che è ad opera di due proteine
Mut (H, L e S).
Enrico Colombo
Riparazione per escissione di base
Per la rimozione di singoli nucleotidi alterati dovuti a composti chimici
alterati introdotti con la dieta o prodotti dal catabolismo cellulare
interviene un meccanismo chiamato riparazione per excisione di
base (BER).
La BER inizia attraverso una DNA glicosidasi che legge il DNA e
rimuove, attraverso rottura del legame glicosidico, la base scorretta:
-
esistono DNA glicosidasi per ogni possibile base alterata.
La DNA glicosidasi scorre lungo il filamento di DNA facendo
flippare di 180° le basi ed analizzandole
Quando trova una base scorretta, la recide, lasciando soli lo
zucchero e il fosfato.
Il meccanismo, dopo la rimozione della base alterata, prosegue nel
seguente modo:
-
una particolare endonucleasi (AP) taglia lo scheletro del DNA
la DNA polimerasi ß reinserisce il nucleotide corretto
una DNA ligasi ripara i legami.
Nei procarioti come E. Coli, il meccanismo per excisione di base
avviene ad opera di proteine Uvr A, B e C.
Riparazione degli appaiamenti scorretti.
Si è già visto come nel successivamente alla replicazione del DNA vi
sia un meccanismo di controllo che si chiama meccanismo di
riparazione degli appaiamenti scorretti:
-
questo prosegue risistemando le basi male appaiate che sono
sfuggite alla correzione di bozze fatta dalla polimerasi
riconosce le distorsioni della catena causate dal mal
appaiamento delle basi.
In E. Coli, il riconoscimento del filamento neosintetizzato avviene
grazie alla metilazione del filamento stampo, quindi il complesso
enzimatico di riparazione non può sbagliare.
Biologia molecolare e cellulare 29 Biologia mole
Nelle cellule eucariotiche non esiste la metilazione del DNA, quindi è
probabile che vi siano altri meccanismi per permettere di riconoscere il
filamento idoneo.
Riparazione delle rotture a doppio filamento
Quando radiazioni ionizzanti attraversano la cellula e colpiscono il
DNA o quando vengono introdotti degli agenti chimici che causano
rotture, può avvenire che il doppio filamento si rompa.
Le rotture del doppio filamento (DSB) possono essere riparati
attraverso vari meccanismi di riparazione.
Il più comune meccanismo di riparazione è chiamato unione delle
estremità non omologhe (NHEJ), in cui in complesso di proteine
catalizza una serie di reazioni per unire le estremità rotte del DNA:
-
-
-
se non è possibile appaiarsi al punto corretto intervengono
proteine Ku, che hanno attività elicasica sui due filamenti e
attività chinasica
permettono alle due estremità del DNA ss di trovare delle
regioni di micromologia, attraverso le quali i due filamenti si
appaiano.
Le porzioni di filamenti che restano esclusi vengono rimossi.
La DNA ligasi salda i Nick.
Si ha perdita di un tratto di gene.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 30 Biologia mole
Le divisioni cellulari
La vita della cellula e la trasmissione del patrimonio
ereditario.
Negli organismi sessuati, le divisioni cellulari differiscono a seconda
del tipo di cellule che si prendono in considerazione:
-
Il patrimonio genetico umano sta racchiuso nel nucleo e, durante le
fasi di divisione meiotica o mitotica, si organizza in strutture allungate
in cui il filamento di DNA sta ripiegato su se stesso e su uno scheletro
proteico, mediante vari superavvolgimenti.
le cellule somatiche si dividono per mitosi, processo in cui da
una cellula madre 2n derivano due cellule figlie 2n
le cellule sessuali (gameti) sono invece generate dagli oogoni e
dagli spermatogoni mediante meiosi, in cui da un patrimonio
2n, mediante due successive divisioni, vengono generate
quattro cellule figlie con patrimonio aploide n.
-
Queste strutture allungate sono i cromosomi.
Un cromosoma è formato da due cromatidi fratelli, dopo che è
avvenuta la replicazione del patrimonio genetico nella fase S:
-
i due cromatidi contengono una molecola di DNA identica
sono il risultato della replicazione del patrimonio genetico.
Sono uniti tra loro in un punto detto centromero, in cui le fibre
del fuso si legano per separare i due cromatidi.
I due estremi dei cromosomi sono detti telomeri.
Il cariotipo umano
Il corredo cromosomico umano è, nelle cellule somatiche, diploide:
-
è formato da due coppie di cromosomi omologhi, uno di
origine materna e uno paterna
due cromosomi omologhi contengono le medesime sequenze
di geni e solitamente, solo uno è utilizzato come filamento di
stampo per la sintesi delle proteine, l’altro è di riserva.
L’Homo sapiens ha un corredo cromosomico di 22 coppie di
cromosomi omologhi, più una coppia di cromosomi sessuali:
-
ha in totale 46 cromosomi, 23 derivanti dal padre e 23 dalla
madre.
I cromosomi sessuali differiscono tra maschio e femmina:
o Un maschio avrà una coppia detta XY
o Una femmina una coppia XX.
La mitosi.
Formazione dell’apparato mitotico
All’inizio della fase M:
-
i cromosomi si spiralizzano
si formano i costituenti dell’apparato mitotico
L’apparato mitotico si compone di:
-
centrioli
materiale pericentriolare
fuso mitotico (fasci di microtubuli che collegano i due
centrioli)
All’inizio della mitosi i diplosomi (coppie di centrioli disposti
perpendicolarmente) sono già stati duplicati:
-
sono circondati da un’area tondeggiante detta centrosoma
all’inizio della mitosi i centrosomi sono circondati da raggi di
microtubuli che formano le astrosfere.
I due centrosomi della cellula si vanno separando e tra loro si
evidenzia una struttura fusiforme, è il fuso mitotico.
Il fuso mitotico è costituito da due gruppi di microtubuli polari che
partono da ciascun centrosoma e si incontrano al centro del fuso:
Enrico Colombo
-
-
-
quando la membrana nucleare scompare, compare un
secondo fuso che parte dai centrosomi e si lega ai cinetocori
dei cromosomi
i cromosomi si dispongono al termine della profuse lungo
l’asse equatoriale della cellula, lungo un piano che viene
definito equatoriale, ortogonale alle fibre del fuso.
In metafase è completo l’apparato mitotico.
Biologia molecolare e cellulare 31 Biologia mole
La localizzazione dei cromosomi al piano equatoriale dipende dalla
capacità dei cinetocori di legarsi ai microtubuli del fuso e dall’azione di
proteine motore.
La terza fase è definita anafase e viene distinta in due sotto-momenti:
-
Fasi e significato della mitosi
Il primo stadio del processo mitotico è denominato profase:
-
-
nel citoplasma si organizza l’apparato mitotico
tutta la cromatina si trova sotto forma di cromosomi al
termine della profase.
Ogni cromosoma appare come un duplice filamento, poiché
costituito da due cromatidi fratelli uniti a livello del
centromero.
Verso la fine i nucleoli si disintegrano legandosi ai cromosomi
Si disgrega l’involucro nucleare (si disperde nel reticolo
endoplasmatico o si addossa alle fibre del fuso)
-
L’ultimo stadio è rappresentato dalla telofase, in cui si ha la
ricostruzione dell’involucro nucleare:
-
la dissoluzione dell’involucro nucleare
l’organizzazione dei cromosomi sul piano equatoriale da
opera dei microtubuli del fuso
-
Il secondo stadio è detto metafase, in cui i cromosomi si trovano
allineati sul piano equatoriale della cellula con i centromero diretti
verso il centro:
-
i cromosomi costituiscono una figura a forma di stella detta
aster o piastra metafasica.
I cromosomi raggiungono il massimo livello di spiralizzazione,
salvo che a livello del centromero.
Ai due cinetocori del centromero di ogni cromosoma sono
collegate le fibre del fuso mitotico che dividono i due
cromatidi
i cromatidi sono diventati cromosomi delle cellule figlie
ogni polo possiede un corredo cromatidico identico
i cromatidi si vanno despiralizzando
si riforma il nucleolo
La formazione della membrana nucleare avviene per la fusione di:
Con il termine prometafase si individua uno stato intermedio che
intercore tra:
-
anafase I: i cromosomi sono tirati verso i due poli dalle fibre
del fuso, verso i centrosomi. I cromatidi identici si scindono e
ognuno migra verso un polo differente
anafase II: all’allontanamento dei cromosomi dal piano
equatoriale si somma anche un allontanamento dei due poli,
che divergono.
lamine defosforilate che ricreano la lamina nucleare (strato
proteico sottostante al nucleo)
vescicole sintetizzate nuovamente nel RER
vescicole appartenenti al vecchio nucleo
Con la formazione dei due nuovi nuclei intorno ai cromosomi figli si
riformano anche i pori nucleari e tutte le proteine di membrana
presenti nel nucleo:
-
l’apparato mitotico si va depolimerizzando
i centrioli restano inalterati.
L’ultimo processo che completa la divisione delle cellule è quello di
citodieresi:
Enrico Colombo
-
-
la cellula presenta una strozzatura in posizione equatoriale,
ad opera di fibre di actina e miosina disposte a circonferenza
sotto la membrana nucleare.
le membrane si introflettono, si fondono e si staccano le due
nuove cellule con i nuclei figli.
le nuove cellule sono geneticamente identiche, la mitosi è un
processo conservativo.
Biologia molecolare e cellulare 32 Biologia mole
Le cellule somatiche degli organismi pluricellulari sono generalmente
diploidi:
-
I gameti, dopo la divisione meiotica, possiedono solamente metà del
patrimonio genico della cellula diploide che li ha formati:
La meiosi
-
La divisione meiotica avviene esclusivamente per le cellule germinali,
quelle destinate alla formazione dei gameti:
-
-
è l’ultimo evento di divisione della gametogenesi
ha come scopo la formazione di cellule aploidi, differenti tra
loro per quanto riguarda il patrimonio genico.
La meiosi è quindi la base della riproduzione sessuata, che consente
un ampio rimescolamento del patrimonio genico:
-
ha determinato la scelta di questo meccanismo riproduttivo
nell’evoluzione
La fonte di diversità tra gli individui figli rispetto ai genitori è data da:
-
rimescolamento delle informazioni presenti
unione di due genomi differenti
mutazioni.
La riproduzione sessuale di un individuo è data dalla fusione di due
cellule aploidi dette gameti:
-
il gamete maschile è lo spermatozoo
il gamete femminile è l’ovulo, una cellula di grandi
dimensioni poiché contenente parecchi materiali di riserva.
L’unione tra i due gameti è detta fecondazione, che da origine ad una
cellula diploide detta zigote:
-
dallo zigote, per successive mitosi si origina il nuovo
individuo
i cromosomi sono sempre presenti in doppia copia
si presentano copie di cromosomi omologhi, corrispondenti
per forma, dimensioni e contenuto genico.
di ciascuna coppia dei cromosomi omologhi viene ereditato
solamente uno
ricostituendosi con il gamete dell’altro sesso, si ricostruisce il
patrimonio genetico diploide nello zigote
Ciascuna delle coppie di omologhi presenti nelle cellule di un
organismo a riproduzione sessuale è costituita da:
-
un cromosoma di origine materna
un cromosoma di origine paterna
La meiosi porta alla formazione di quattro cellule aploidi a partire da
una cellula diploide che ha solamente una fase S, mentre vede due
divisioni nucleari consecutive.
Il passaggio di un cromosoma paterno o materno in un gamete è
totalmente casuale, cosicché si possono ottenere 223 combinazioni
differenti solamente in un gamete.
Un altro processo di rimescolamento dei geni è dato dal crossingover:
-
geni presenti su cromosomi differenti possono in seguito
trovarsi su un solo cromosoma
permette un ampio rimescolamento genico.
Né deriva che i gameti di un individuo sono sempre differenti tra di loro
dal punto di vista genetico:
-
si possono avere eventi che danno luogo ad una ampia
variabilità anche tra loro
questo processo aiuta enormemente il processo di selezione
naturale.
Enrico Colombo
IL MECCANISMO DELLA MEIOSI
Il meccanismo della meiosi porta alla formazione di un gamete aploide,
con patrimonio genetico 1n, dopo una sola fase S seguita da due
divisioni nucleari cosecutive.
I processi delle divisioni consecutive sono simili a quelli meiotici
(profase, metafase, anafase, telofase), tuttavia presentano
caratteristiche peculiari. Si parla di:
-
prima divisione meiotica (meiosi I)
seconda divisione meiotica (meiosi II).
Il primo stadio della meiosi I è la profase I, che è un processo molto
lento che si può dividere in 5 parti:
-
-
-
-
leptotene: inizio della spiralizzazione della cromatina che si
avvolge in filamenti. I telomeri sono tutti rivolti verso un polo
dell’involucro nucleare
zigotene: i cromosomi iniziano ad appaiarsi e ogni
cromosoma (formato da una coppia di cromatidi fratelli) si
sovrappone al suo omologo mediante una struttura proteica
chiamata complesso sinaptemale (CS), formando i bivalenti
o tetradi (formati da 4 cromatidi dei due cromosomi
omologhi)
pachitene: i bivalenti si spiralizzano ulteriormente pur
rimanendo gli omologhi appaiati. Avviene il crossing-over.
Diplotene: i bivalenti iniziano a separarsi e rimangono in
contatto solamente nei punti in cui è avvenuto il crossingover, detto chiasmo.
Diacinesi: i chiasmi scorrono verso le estremità e si
distaccano tra loro. Scompare l’involucro nucleare e i
cromosomi iniziano a legarsi ale fibre del fuso.
Il secondo stadio è lo stadio della metafase I:
-
le tetradi (o bivalenti) si orientano sul piano equatoriale della
cellula
Biologia molecolare e cellulare 33 Biologia mole
-
i cinetocori delle tetradi sono orientati verso un polo cellulare
a ogni coppia di omologhi si attacca una fibra del fuso.
La terza fase è la anafase I:
-
i due cromosomi di ogni coppia si separano e si muovono
verso i poli opposti
ogni cromosoma è ancora formato da due cromatidi fratelli
uniti a livello del centromero.
Segue la telofase I:
-
-
la cellula di partenza si divide in due cellule figlie, ciascuna
contenente un numero aploide di cromosomi con una
quantità 2c di DNA.
si forma un involucro nucleare
ha inizio la citodieresi
Tra la prima e la seconda divisione meiotica v’è una intercinesi molto
breve poiché i cromosomi non si sono ancora despiralizzate ed è
necessario solamente costruire un nuovo apparato mitotico in
ciascuna cellula figlia.
La profase II:
-
i centrioli migrano ai poli opposti della cellula
si riforma l’apparato del fuso
La metafase II comporta l’allineamento del numero aploide di
cromosomi all’equatore della cellula.
Con l’anafase II i cromosomi figli (cromatidi fratelli) migrano verso i poli
opposti della cellula.
Il processo meiotico si conclude con la telofase II, in cui:
-
si riforma l’involucro nucleare
avviene una seconda citodieresi
la seconda divisione meiotca è equazionale, ha cioè il solo scopo di
smistare ai gameti la metà ordinata dei cromatidi fratelli presenti nelle
cellule della prima divisione.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 34 Biologia mole
I quattro gameti che si formano sono tutti geneticamente differenti tra
di loro, poiché hanno subito una ricombinazione casuale con lo
scambio di quelli paterni e materni, oltre che al crossing-over.
Il ciclo cellulare
Fase M
Il crossing-over è un meccanismo di ricombinazione che avviene nel
pachitene della profase I:
-
-
Fase G2
i cromatidi corrispondenti di due cromosomi omologhi
possono subire ricombinazioni, scambiandosi porzioni di
cromosoma tra loro
il punto di incontro è detto chiasma.
Vengono scambiati segmenti corrispondenti tra cromatidi non
fratelli appartenenti a cromosomi differenti.
Fase G1
Fase S
Fase G1
Fase S
Fase G2
Fase M
Il ciclo cellulare eucariotico.
In una popolazione di cellule, ciascuna cellula passa attraverso
numerosi stadi ben definiti, che nel complesso individuano il ciclo
cellulare.
Il ciclo cellulare si può dividere inizialmente in due principali fasi:
-
fase M: include il processo di mitosi, in cui i cromosomi si
separano, e di citodieresi.
Interfase: è una fase che può avere varia durata (o essere
addirittura permanente) in cui la cellula svolge le proprie
attività metaboliche, di sintesi e di duplicazione del proprio
patrimonio genetico.
L’interfase si compone di tre differenti fasi:
-
fase G1.
Fase S
Fase G2
La fase G1 è una fase compresa tra la fase M e la fase S, in cui:
-
la cellula accresce le proprie dimensioni
svolge le sue attività si sintesi di RNA e proteine.
La fase S è la fase in cui la cellula duplica il DNA e sintetizza gli istoni
che devono duplicare il numero di nucleosomi.
La fase G2 è la fase che precede la fase M e si costituisce di un
periodo in cui la cellula prepara il proprio apparato mitotico:
-
sintesi del fuso mitotico
formazione dei cromosomi.
In base alla durata e alle peculiarità del ciclo cellulare, che
corrispondono alle funzioni delle cellule, si possono individuare tre
grandi categorie di cellule:
Enrico Colombo
⇀ cellule estremamente specializzate (nervose,
muscolari, globuli rossi) che perdono la capacità di
dividersi
⇀ cellule che non si dividono in condizioni normali, ma
possono rigenerarsi in seguito a stimoli appropriati
(epatociti, linfociti)
⇀ cellule che possiedono normalmente un livello
relativamente alto di attività mitotica.
La notevole variabilità della durata del ciclo cellulare ha permesso di
individuare una nuova fase particolare, che è presente nelle cellule che
temporaneamente si bloccano in fase G1:
-
questa fase, che precede la replicazione del DNA è detta
fase G0
in G0 la cellula è temporaneamente ferma, si porta in fase S
solamente a seguito di uno stimolo, quando ciò è possibile.
Meccanismi di controllo del ciclo cellulare
Numerosi esperimenti condotti nel 1970 da Rao e Johnson in
Colorado, dimostrarono che le cellule subiscono meccanismi di
controllo positivo, quindi con presenza di fattori di stimolazione in
due passaggi:
-
dalla fase G1 alla fase S
dalla fase G2 alla fase M
Questi due passaggi erano dunque indotti da fattori che stimolavano,
nel primo caso la replicazione e nel secondo la divisione cellulare
(mitosi o meiosi).
I check-point del ciclo cellulare
Nella cellula sono presenti due punti di controllo principali, che, come
si è già detto, provvedono a verificare che vi siano le condizioni per il
passaggio alla fase successiva.
Biologia molecolare e cellulare 35 Biologia mole
Inoltre, un tale meccanismo di controllo, permette anche lo
svolgimento delle attività di crescita e di ciclo cellulare nell’ordine
corretto.
La stimolazione di un passaggio e l’attivazione del check point dipende
da condizioni esterne quali ad esempio:
-
presenza di fattori di crescita
quantità di nutrienti
stimolazione ormonale.
Il primo punto di controllo è al termine della fase G1 e verifica:
-
la dimensione della cellula
la presenza di nutrienti
la presenza di fattori di crescita
l’assenza di danni al DNA
Il primo punto di controllo, in assenza di queste condizioni, può anche
indurre il passaggio in fase G0.
Il secondo punto di controllo è situato al termine della G2 e verifica:
-
dimensione della cellula
completamento della replicazione del DNA
assemblaggio dei cromosomi
Esiste in realtà un terzo punto di controllo che però si trova all’interno
della fase M:
-
verifica il corretto appaiamento delle fibre del fuso ai
centromeri dei cromosomi.
Il ruolo delle protein-chinasi
La maturazione e i passaggi attraverso le fasi del ciclo cellulare sono
regolati da dei fattori di promozione della maturazione (MPF), che
sono composti da:
-
proteina chinasica: proteina responsabile del trasferimento
di gruppi fosfato (fosforilazione) di specifici substrati proteici
cicline: subunità di tipo regolatorio.
Enrico Colombo
La concentrazione della ciclina varia da una fase all’altra e, quando si
trova a concentrazione sufficientemente elevata si ha l’attivazione della
protein-chinasi corrispondente.
La protein chinasi attivata fosforila determinati substrati che
intervengono nelle fasi di replicazione o di divisione.
Negli ultimi anni si è scoperto che il ciclo cellulare è controllato da
chinasi ciclina-dipendenti (Cdk):
-
si attivano in seguito alla concentrazione di cicline
fosforilano determinati substrati, attivandoli o inattivandoli.
Nei due punti di regolazione principali (al termine delle fasi G1 e G2)
intervengono rispettivamente:
-
ciclina G1
ciclina mitotica
La ciclina mitotica viene sintetizzata nel periodo che va da G1 a G2
ed aumenta costantemente di concentrazione:
-
ha una specifica Cdk che al termine del ciclo lega la ciclina
mitotica per fosforilazione
forma il complesso Cdk-ciclina mitotica che promuove il
passaggio dal check point G2 alla mitosi.
Biologia molecolare e cellulare 36 Biologia mole
L’apoptosi
L’apoptosi è un processo che avviene normalmente negli organismi e
segue una sequenza ben precisa di eventi che portano alla morte
cellulare programmata.
È un processo pulito, ordinato e naturale, che prevede:
-
Perché avviene l’apoptosi
Il significato dell’apoptosi è molto ampio e generalmente è quello di
eliminare cellule invecchiate o dannose all’organismo:
-
Le proteine che vengono fosforilate (con ATP) dal complesso Cdkciclina mitotica sono:
-
lamine nucleari, permettendo quindi la disintegrazione della
membrana nucleare.
Istoni H1, inducendo la condensazione della cromatina.
La ciclina G1 con la sua Cdk controlla il check-point G1 attraverso la
fosforilazione della proteina Rb:
-
-
la proteina Rb, quando non è fosforilata, inibisce il fattore di
trascrizione E2F, che promuove la trascrizione e la sintesi
degli enzimi necessari per la replicazione
quando la proteina Rb viene fosforilata, libera l’E2F
sequestrato e rende possibile la sintesi degli enzimi
replicativi, permettendone la trascrizione dei geni.
diminuzione complessiva del volume della cellula
scomparsa del nucleo e frammentazione del DNA
perdita di adesione alle molecole e rottura delle membrane
cellulari
rilascio di enzimi idrolitici dai lisosomi e idrolisi generalizzata
la membrana plasmatica si mantiene intatta
fagocitosi da parte dei macrofagi.
-
durante l’embiogenesi ha un’azione morfogena, ovvero serve
ad eliminare strutture transitorie
nell’adulto di homo sapiens, vi sono parecchi esempi di
apoptosi:
⇀ regressione della ghiandola mammaria dopo
l’allattamento
⇀ perdita di capelli
⇀ formazioni delle superfici cornee nella pelle.
Eliminazione di neuroni che non terminano correttamente
sugli organi bersaglio
Eliminazione di linfociti T potenzialmente autoimmuni
Eliminazione di qualsiasi cellula invecchiata.
L’apoptosi può essere indotta o repressa, da differenti segnali:
-
segnali antiapoptotici:
⇀ segnali di adesione tissutale
Enrico Colombo
-
⇀ fattori di crescita
⇀ segnali di adesione alla matrice extracellulare
segnali apoptotici:
⇀ TNF, tumor necrosis factor
⇀ Virus (granzimi)
⇀ Anoikis (integrine)
⇀ Danni del DNA
L’azione delle caspasi.
L’apoptosi è causata da una serie di enzimi che è oggi denominata
caspasi.
Le caspasi sono una serie di enzimi proteolitici che sono attivati dai
vari fattori apoptotici. Agiscono tagliando un gruppo selezionato di
proteine e strutture bersaglio nella cellula quali:
-
-
alcune protiein chinasi: la distruzione fa saltare le adesioni
intercellulari
lamine: distruzione dell’involucro nucleare.
Proteine del citoscheletro: actina, tubulina, gelsolina, ecc…
vengono tagliate, devastando la forma della cellula e delle
sue strutture.
Attivazione della DNasi attivata da caspasi: è un enzima
che viene attivato dalle caspasi e frammenta in piccoli pezzi
la cromatina.
Le vie dell’apoptosi
L’apoptosi può essere indotta da due differenti vie, una estrinseca, e
una intrinseca.
La via estrinseca è attivata da stimoli esterni alla cellula, come ad
esempio i TNF, che invitano la cellula ad andare a farsi fottere.
Nella via intrinseca la cellula si accorge da sola di essere ormai inutile
e dannosa al tessuto e, grazie a stimoli interni, si fa fuori da sola.
Biologia molecolare e cellulare 37 Biologia mole
La necrosi
La necrosi, a differenza dell’apoptosi, è un processo che è dovuto a
stimoli esterni e non è programmato: presume che vi sia un danno.
Le cause di necrosi possono essere danni causati da:
-
urti meccanici
radiazioni elettromagnetiche radioattive
corrosioni chimiche.
In seguito al danno subito, la cellula inizia la sua distruzione:
-
scoppia e rilascia nell’ambiente le sue macromolecole,
provocando una risposta infiammatoria
il tessuto leso si trasforma in una massa amorfa friabile
secerne pus.
Viene a crearsi una zona scura.
Il sistema immunitario di macrofagi provvede, quando possibile, a
riparare il danno subito.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 38 Biologia mole
Le tipologie di infezioni virali.
I virus
Il virus può infettare la cellula con due differenti modalità:
I virus sono degli oggetti macromolecolari dotati di patrimonio
genetico, che ne dirige il ciclo vitale una volta che ha infettato una
cellula ospite:
-
i virus sono infatti definiti parassiti, ovvero riproducono sé
stessi sfruttando i meccanismi sintetici delle cellule ospiti.
I virus sono sostanzialmente formati da:
-
molecola di RNA o DNA, a doppio o a singolo filamento, a
doppia elica o lineare.
involucro proteico detto capside, che comunemente ha
forma di icosaedro.
-
Infezione litica
Nella maggior parte dei casi il virus che penetra nella cellula ospite vi
inserisce il proprio patrimonio genetico e sfrutta gli apparati di sintesi
della cellula:
-
Quando il virus si trova al di fuori di una cellula vivente si dice che è
sottoforma di virione:
-
-
un virione può avere nel proprio patrimonio genetico da pochi
ad alcune centinaia di geni.
Il capside è solitamente formato da subunità tutte uguali.
⇀ Può avvenire, come nel caso del virus HIV nell’uomo,
che il virione abbia anche un rivestimento fosfolipidico,
derivante dalla membrana plasmatica della cellula che
lo ha prodotto e esocitato.
Ogni virus ha sulla sua superficie alcune proteine che
sporgono e interagiscono con le proteine di membrana della
cellula ospite.
-
può accadere che un virus abbia numerosissime cellule che
lo possono accogliere
nella maggior parte dei casi, però, sono solamente alcuni tipi
di cellula che possono ospitare un dato virus.
duplica il proprio patrimonio genetico
sintetizza le proteine del proprio capside.
La cellula, alla fine viene indotta a rompersi (lisi cellulare) e
a liberare i virioni neosintetizzati.
Formazione di provirus
In alcuni casi, tuttavia, i virus non infettano la cellula inducendola alla
lisi, ma si inseriscono integrandosi nel patrimonio genetico della cellula
ospite.
Il DNA virale integrato si chiama provirus e ha differenti effetti a
seconda del tipo di virus e della cellula ospite:
-
Ogni virus ha una propria gamma di cellule ospiti:
-
rubando le attività sintetiche
inserendosi nel DNA della cellula ospite, diventando cioè
provirus.
-
le cellule batteriche che contengono un provirus:
⇀ il Dna virale è solitamente silente
⇀ viene attivata la sintesi dei geni virali solamente a
seguito di stimoli esterni come radiazioni UV o
innalzamenti della temperatura.
Alcune cellule animali infettate da provirus, sintetizzano una
nuova progenie sfruttando la cellula ospite senza indurla a
lisi:
⇀ Il virus HIV infetta le cellule continuando a produrre
virioni che infettano le cellule vicine.
Enrico Colombo
-
Alcune cellule animali che contengono un provirus divengono
cellule maligne:
⇀ Perdono il controllo della loro crescita
⇀ Questo tipo di virus causa l’insorgenza di tumori.
I batteriofagi
I virus batterici, o batteriofagi, sono virus che infettano le cellule
procariote e sono generalmente formati da:
-
capside proteico a forma di icosaedro
lunga coda proteica
placca di adesione con alcune punte.
Biologia molecolare e cellulare 39 Biologia mole
-
Fagi della serie .
I fagi di questa serie hanno una interazione più mite con la cellula che
li ospita:
-
Vi sono differenti classi di virus che, ad esempio, infettano il caro E.
Coli:
-
T2, T6, T4: virus con DNA a doppio filamento lineare molto
lungo
Fago : virus a DNA ds lineare più breve.
T1, T3, T5: fagi con DNA ds lineare intorno alle 38 000 nt.
X174: è un virus a DNA con singolo filamento circolare. Il
genoma virale è molto corto. Non possiede la coda.
Il fago T4
Il DNA a doppio filamento del fago T4 è formato da 166000 bp che
codificano per 130 geni. È un virus abbastanza complesso.
Il meccanismo di azione di questo batteriofago è quello della lisi
cellulare:
-
-
viene assorbito dalla cellula ospite: la cellula batterica deve
possedere i recettori di membrana adeguati per il fago in
questione.
nel batterio penetra il genoma virale
vengono trascritti i messaggeri del DNA virale e sintetizzate
le proteine dell’involucro
si assemblano i virioni con il patrimonio genetico duplicato
si ha la lisi batterica e l’espulsione di nuovi virioni.
immettono il loro DNA nella cellula
questo DNA si integra con il DNA batterico, restando nello
stato di profago.
La lisi deve venire indotta da agenti esterni, come ad
esempio radiazioni UV.
⇀ In presenza di radiazioni UV i virioni vengono prodotti e
viene indotta la lisi.
Virus animali
I virus animali sono di differente natura ed hanno delle specificità
proprie, come ad esempio la possibilità di effettuare la retro
trascrizione da RNA a DNA.
Vi sono alcuni virus a DNA, quali l’Herpesvirus o i numerosi virus
oncogeni (SV40, Adenovirus, Epstein-Barr, ecc…).
I Virus a RNA comprendono il virus dell’HIV o il retrovirus del
sarcoma di Rous, (oncogeno).
SV40 – simian vacuolating virus 40.
Il SV40 è un virus a DNA circolare formato da 5240 bp e da istoni.
Possiede due classi di geni dette:
-
geni precoci: codificano per 2 proteine T, funzionali alla
replicazione del DNA.
geni tardivi: codificano per VP1, VP2, VP3.
Nell’uomo il suo ciclo si struttura nelle seguenti tappe:
1. la cellula viene infettata e rilascia la sua molecola di DNA
Enrico Colombo
2. il DNA viene trasferito nel nucleo, in cui vengono trascritti gli
antigeni T, che codificano per proteine funzionali alla
replicazione del DNA virale.
3. Viene degradato il DNA cellulare e vengono utilizzati i
nucleotidi per la replicazione del DNA virale.
4. Vengono sintetizzate le proteine del capside VP1, VP2, VP3.
5. Si assemblano i nuovi virioni e vengono rilasciati all’esterno
della cellula.
Nel criceto, l’interazione con l’SV40 ha un effetto differente:
-
l’immissione del DNA nel nucleo della cellula e la sintesi degli
antigeni precoci induce la duplicazione cellulare
ha l’effetto di virus oncogeno.
Biologia molecolare e cellulare 40 Biologia mole
Virus a RNA e retrovirus
I retrovirus RNA sono una famiglia di virus provvisti di un genoma
diploide a RNA monocatenario con polarità negativa.
La peculiarità dei virus a RNA è quella di poter fare la trascrizione
inversa, da RNA a DNA, attraverso un enzima detto trascrittasi
inversa:
-
Provirus a DNA e integrazione.
è una DNA polimerasi RNA dipendente
forma una molecola di doppio filamento ibrida DNA-RNA a
partire dal genoma virale a RNA
mentre sintetizza il primo filamento di cDNA depolimerizza
l’RNA virale
in seguito sintetizza anche il secondo filamento, in modo da
formare il cDNA a doppio filamento.
L’integrazione del DNA virale nel genoma della cellula ospite può
avvenire in due differenti modalità:
-
-
ricombinazione: si ha la rottura di sequenze omologhe
presenti in entrambi i DNA e la loro ricombinazione
scambiandole.
Inserimento in siti fragili: nei siti di rottura del DNA
genomico si inserisce il DNA virale.
Anche le cellule animali, come quelle batteriche, possono avere
un’interazione temperata con la cellula ospite:
-
il Dna virale si integra con la cellula ospite e rimane latente
fino a quando non è scatenato da fattori esterni
si trova nello stato di provirus
Nel caso dell’Herpesvirus, virus a DNA, il genoma virale è integrato
nel genoma ospite:
-
resta normalmente inattivo trascrizionalmente
ha proprietà litiche qualora sia attivato da cause esterne
come stress, farmaci, raggi UV, antibiotici, ecc…
Il genoma di un retrovirus RNA è formato da tre sequenze particolari
che sono:
-
gag: codifica per le proteine strutturali del capside, i
capsomeri
pol: codifica per la trascrittasi inversa.
Env: codifica per le glicoproteine del pericapside.
Le sequenze LTR stanno per long terminal repeat:
-
la LTR sul 5’ costituisce il promotore per la sintesi del
messaggero
quella sul 3’ è la sequenza di termine.
Il ciclo di un retrovirus a RNA prevede:
1. penetrazione del pericapside per endocitosi.
2. liberazione dell’acido nucleico.
Enrico Colombo
3. Retro trascrizione e sintesi del doppio filamento di cDNA
4. Trasporto nel nucleo della cellula e integrazione con il DNA
con la formazione di un provirus.
5. Traduzione delle proteine virali.
6. Sintesi di nuovi RNA
7. Assemblaggio del capside
8. Esocitosi dei virioni.
Un famoso virus con retro trascrizione è quello del sarcoma di Rous,
che induce sarcomi nel pollo, comportandosi come un virus
oncogeno.
Biologia molecolare e cellulare 41 Biologia mole
Enrico Colombo
Regolazione dell’espressione genica nei procarioti
Biologia molecolare e cellulare 42 Biologia mole
Gli operoni batterici operano secondo meccanismi ben precisi e
possiedono tutti delle determinate sequenze chiave quali:
-
Una cellula batterica è strettamente legata all’ambiente in cui vive, il
quale può mutare la propria composizione chimica in ogni momento:
-
un composto può essere presente in determinati periodi,
mentre non esserci in altri.
Si considerano ora due casi in cui dal terreno minimo si aggiungono:
-
1. lattosio
2. triptofano.
Il lattosio è un disaccaride che viene scisso in due monosaccaridi dal
batterio mediante l’enzima ß-galattosidasi:
-
-
in condizioni minime la presenza di tale enzima è bassissima
all’aggiunta di lattosio al terreno la presenza dell’enzima ßgalattosidasi e dell’mRNA che lo codifica aumentano
sensibilmente.
Il lattosio ha indotto la produzione dell’enzima funzionale
alla propria digestione.
Il triptofano è un amminoacido necesario per la sintesi delle proteine.
Se nel terreno di coltura questo amminoacido non è presente, il
batterio spende determinata energia per sintetizzarlo:
-
-
qualora si immettesse del triptofano nel terreno di coltura, le
cellule non producono più gli enzimi adatti alla sintesi del
triptofano.
In presenza del triptofano, la sintesi degli enzimi è stata
repressa.
-
geni strutturali: son i geni che codificano effettivamente per
gli enzimi. Tutte le sequenze che codificano per gli enzimi
della via metabolica sono disposte una a fianco all’altra,
senza alcun introne, e vengono trascritte generalmente in un
unico filamento di mRNA.
Promotore: è il sito in cui la RNA polimerasi si lega al DNA
prima di iniziare la trascrizione.
Operatore: è una sequenza associata al promotore che
serve come legame per il repressore. Il repressore è una
proteina regolatrice di geni, ovvero che può selettivamente
legare una sequenza di DNA, regolandone la trascrizione
dell’operone.
Gene regolatore: codifica per la proteina repressore.
La chiave di controllo dell’espressione genica è quindi il repressore:
-
-
quando esso è legato all’operatore, non permette alla RNA
polimerasi di legarsi al promotore, quindi di trascrivere i geni
strutturali.
Quando la concentrazione del metabolita invece è alta, il
repressore viene stericamente indotto a slegarsi dalla
sequenza per permettere la trascrizione dei geni strutturali.
L’operone lattosio, inducibile.
L’operone lattosio è un esempio di operone inducibile, ovvero che
induce la trascrizione dei messaggeri necessari per produrre gli enzimi
funzionali alla digestione del lattosio.
L’operone lattosio contiene tre geni strutturali disposti in tandem che
codificano per la ß-galattosidasi e altri enzimi:
L’operone batterico
-
Nei batteri, i geni che codificano gli enzimi per una determinata attività
metabolica sono raccolti insieme in un unico complesso funzionale
detto operone.
-
se il lattosio è disponibile nel terreno di coltura, all’aumentare
della sua concentrazione nella cellula, questo si lega al
repressore, modificandone la conformazione.
Il repressore, normalmente legato all’operatore sul DNA, si
stacca e permette la trascrizione dei tre geni strutturali.
Enrico Colombo
La proteina repressore, in un operone inducibile, si lega all’operatore
in assenza di lattosio, l quale è un induttore.
Biologia molecolare e cellulare 43 Biologia mole
-
Quando la concentrazione di lattosio scende, il repressore torna a
legarsi alla molecola di DNA.
Controllo positivo mediante cAMP
I repressori come quelli degli operoni lac e trp esercitano la loro
influenza mediante controllo negativo, poiché quando interagiscono
con il DNA la trascrizione è repressa.
L’operone lac è anche sotto il controllo positivo dell’AMP ciclico, in
presenza di un fenomeno detto effetto del glucosio:
-
-
quando nel terreno di coltura è presente il glucosio in
contemporanea ad altri substrati (lattosio o galattosio, ecc…)
il batterio ignora gli altri substrati e metabolizza il glucosio.
Il glucosio nel terreno di coltura, determina quindi la
soppressione della produzione degli altri enzimi
catabolici.
Con studi effettuati su E. Coli nel 1965, si scoprì che nel metabolismo
era coinvolto il cAMP:
-
maggiore era la concentrazione di glucosio, minore era
quella di cAMP
con l’aggiunta di cAMP nel terreno di coltura, la cellula
produceva rapidamente tutti gli enzimi per il metabolismo
degli altri nutrienti (enzimi per lattosio, galattosio, ecc…)
Una molecola di cAMP non è in grado di stimolare direttamente
l’espressione di una batteria di geni:
-
-
nei procarioti agisce legandosi ad una proteina recettore
del cAMP (CAP) che è capace di legare il DNA quando è
associata al cAMP.
In presenza di cAMP la CAP lega una regione di controllo
sull’operone lac, che determina un cambiamento
conformazionale del DNA.
Il DNA con la nuova conformazione indotta da cAMP-CAP è
in grado di trascrivere i geni strutturali del lattosio anche
quando il repressore è inattivo per la presenza comunque di
lattosio.
Fino a quando i livelli di glucosio sono elevati, l’enzima adenilatociclasi non produce cAMP:
-
i livellli di AMP ciclico restano al di sotto della soglia di
trascrizione dell’operone.
Operone triptofano, operone reprimibile.
L’operone triptofano è un classico esempio di operone reprimibile:
-
il repressore non è in grado di legare da solo il DNA, ma
deve essere complessato con un co-repressore.
Il co-repressore, in questo caso, è lo stesso triptofano.
In assenza di triptofano l’operatore non possiede legato il repressore:
-
il DNA è libero di fare trascrivere i geni strutturali alla RNA
polimerasi
vengono sintetizzati gli enzimi per la sintesi del triptofano.
Quando il triptofano diventa disponibile, gli enzimi della via sintetica
non sono più necessari:
-
il complesso triptofano-repressore si lega al DNA
la trascrizione dei geni strutturali dell’operone trp è repressa.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 44 Biologia mole
Meccanismo degli ormoni steroidei.
La regolazione genica negli eucarioti.
Ogni cellula possiede l’intero patrimonio genetico dell’individuo, ma in
seguito a specializzazione, ne trascrive solo una parte per poi
codificare le proteine che vi sono necessarie.
Questo significa che vi sono alcuni geni che vengono trascritti ed altri
che vengono repressi:
-
ci si accinge quindi a capire quali siano gli stimolatori della
trascrizione di determinati geni.
Devono esserci segnali dall’esterno che inducono una
regolazione interna della cellula specializzata.
Meccanismi di trasduzione del segnale.
I segnali
I segnali tra una cellula e l’altra possono essere di varia natura:
-
ormoni steroidei
ormoni proteici
fattori circolanti o secreti
fattori derivati dall’ambiente:
⇀ contatti tra cellule mediante molecole di adesione
⇀ segnali nutrizionali
⇀ shock termico.
Ognuno di questi segnali ha una precisa tipologia di trasduzione
all’interno della cellula:
-
in seguito attiva dei meccanismi che intervengono nei vari
livelli della regolazione dell’espressione genica.
La peculiarità degli ormoni steroidei è quella di oltrepassare senza
ostacoli la membrana plasmatica:
-
il loro recettore si trova nel citoplasma.
L’ormone si lega al recettore, il quale interagisce
direttamente con la cromatina.
Il recettore citoplasmatico per gli ormoni steroidei è costituito
generalmente da una proteina o da una lipoproteina che possiede due
siti specifici:
-
sito per l’ormone: sequenza di amminoacidi idrofobici che
lega stericamente l’ormone.
Sito per il legame del DNA: è un sito che si lega ad una
sequenza specifica sul DNA a monte del gene, nel
promotore.
Sul DNA, di contro, sono presenti delle specifiche sequenze, dette
elementi di risposta, secondo l’ormone che ne deve regolare la
trascrizione:
-
GRE: sequenza promotrice per i glicocorticoidi.
ERE: sequenza di regolazione per gli estrogeni.
TRE: sequenza di regolazione per il testosterone.
La sequenza GRE, per esempio, è presente prima di vari geni, quindi
un solo stimolo può attivare la trascrizione di più geni, quindi la
sintesi di differenti proteine.
Ormoni proteici
Un ormone proteico, a differenza di uno steroideo, non riesce a
attraversare il plasmalemma, quindi necessita della presenza di
recettori di membrana.
Quando il ligando si lega al recettore di membrana, nel citoplasma si
verificano una serie di reazioni che portano all’attivazione dei
secondi messaggeri:
Enrico Colombo
-
vi sono proteine che vengono fosforilate, quindi
attivate/disattivate da protein-chinasi, che poi intervengono
come fattori di trascrizione all’interno del nucleo.
L’attivazione di un secondo messaggero è attuata con il comune
meccanismo di fosforilazione o di de fosforilazione:
-
-
per fosforilare una proteina è necessaria l’azione di un fattore
proteico detto protein-chinasi, che catalizza l’aggiunta dei
gruppi fosfato su residui di serina, treonina o tirosina della
proteina effettrice
la defosforilazioine, invece, avviene ad opera dell’enzima
fosfatasi, che rimuove i gruppi fosfato, inattivando la
proteina effettrice.
Biologia molecolare e cellulare 45 Biologia mole
Le tirosin-chinasi recettoriali sono direttamente attivate da ligandi
extracellulari, come ad esempio:
-
Dimerizzazione del recettore. Il ligando induce la dimerizzazione del
recettore, la quale, permetterà poi di giungere alla auto fosforilazione
delle code tirosin-chinasiche.
Il recettore per EGF, una volta legato all’EGF, si accoppia con un suo
simile recettore EGF - ligando EGF appaiando, sul versante citosolico
le code tirosiniche:
Struttura e attivazione di un recettore con attività tirosinchinasica.
-
Le tirosin-chinasi sono enzimi che fosforilano residui di tirosina su
substrati proteici:
-
-
la fosforilazione della tirosina è un meccanismo per la
trasduzione del segnale proprio degli eucarioti
coinvolge differenti processi cellulari quali:
⇀ crescita
⇀ proliferazione
⇀ differenziamento
⇀ sopravvivenza (segnali antiapoptotici)
⇀ adesione alla matrice extracellulare
⇀ migrazione
Le tirosin-chinasi si dividono in due principali categorie:
-
-
recettori tirosin-chinasi: sono proteine transmenmbrana
con un dominio extracellulare in cui si lega un ligando e un
dominio tirosin-chinasico intracitoplasmatico
tirosina chinasi citoplasmatiche: non possiedono recettori
nell’ambiente extracellulare.
EGF, epidermal growth factor
PDGF, fattore di crescita delle piastrine
Insulina
Altri regolatori metabolici.
i due domini tirosin-chinasici delle molecole procedono alla
trans auto fosforilazione, ovvero un dominio chinasico
fosforila la coda dell’altro
e vice versa.
Attivazione della proteina chinasi. I siti di auto fosforilazione hanno
una doppia funzione:
-
regolano l’attività chinasica
sono sito di legame per le proteine citoplasmatiche.
La fosforilazione della tirosina modula il rapporto con le proteine
citoplasmatiche:
-
-
l’ansa di attivazione, in assenza di fosforilazione, chiude il
dominio di legame per ATP e le altre molecole
citoplasmatiche
con la coda fosforilata, si ha la progressiva fosforilazione di
tutti i residui tirosinici, che permette di liberare il sito di
legame per i secondi messaggeri.
Interazioni proteina-proteina dipendenti dalle fosfo-tirosine. Le vie
di segnalazione intracitoplasmatiche sono catene di proteine segnale
che interagiscono l’una con le altre in modo sequenziale.
Enrico Colombo
Le proteine segnale sono in grado di associarsi ai recettori tirosinchinasi attivati perche contengono dei domini che si legano
specificamente a residui tirosina fosforilati.
Una particolarità di questo meccanismo sta nel fatto che si legano a
precise sequenze amminoacidiche a partire dal pTyr.
Attivazione delle vie di segnalazione a valle. Nel caso del recettore
per EGF, la proteina che interagisce con le code fosfo-tirosiniche del
recettore è la proteina Grb2:
-
-
-
-
questa si lega alla tirosina fosforilata ed ha legata a sé un
complesso Sos o uno Gab.
Sos attiva una piccola proteina, Ras, che fa parte della
superfamiglia delle proteine G ed è associata alla membrana
plasmatica sul versante citosolico.
La proteina Ras è presente in due forme:
⇀ Attiva: legata a GTP
⇀ Inattiva: legata a GDP.
La Ras-GTP lega e attiva le proteine segnali e si disattiva
idrolizzando GTP a GDP, tornando nella forma inattiva
⇀ L’idrolisi GTP >> GDP è mediata e accelerata da
proteine GAP, che inducono e favoriscono la fosfatasi.
Lo scambio in Ras tra GTP e GDP induce l’attivazione di una
proteina Raf, una proteina-chinasi per serina-treonina che
induce il ciclo delle Map chinasi
Il ciclo delle MAP-chinasi è una serie di reazioni a catena che portano
varie proteine MAP ad interagire direttamente con il nucleo:
-
il termine della catena interagisce, nel nucleo, con geni che
possono indurre la proliferazione cellulare.
Vengono quindi sintetizzate cicline, Cdk, ecc… segnali che
inducono la cellula a duplicarsi.
Biologia molecolare e cellulare 46 Biologia mole
Altri sistemi di trasferimento di segnale dal recettore a proteine
situate più a valle
Sono noti altri sistemi di trasduizione del segnale associati ad attività
protein-chinasica. Fosforilati da:
-
-
proteine fosforilanti di tipo G: sono proteine GTPasi che
dissociano GTP, si legano a recettori-ligandi e trasducono il
segnale mediante interazioni con altre proteine
adenilato ciclasi: converte ATP in cAMP, mediatore della
risposta cellulare.
Fosfolipasi C: converte dei precursori in inositolo-3-fosfato e
Diacilglicerolo (DAG) che mediano altre risposte cellulari.
Modello di un’integrina recettrice per la fibronectina.
Le integrine sono molecole che legano le cellule alle fibre della matrice
extracellulare.
La specificità di alcune integrine è anche quella di essere un recettore
di segnali dall’ambiente esterno:
-
-
associata a sé ha spesso meccanismi macromolecolari sul
versante citosolico
in seguito a particolari stimoli, probabilmente meccanici,
l’integrina attiva la fosforilazione di tirosina, che interagisce
con Grb2
Grb2 è legata a Sos, che attiva Ras-GTP, che attivano la
cascata delle MAP chinasi, inducendo la proliferazione
cellulare.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 47 Biologia mole
-
-
L’insorgenza di tumori legata alla regolazione
dell’espressione genica
Cicline e Cdk: possono essere espresse a livelli troppo
elevati, o possono mancare i loro inibitori.
Oncogeni e onco-soppressori.
I geni implicati nella cancerogenesi sono di due categorie:
I fattori di crescita implicati nell’insorgenza del cancro.
Il controllo della crescita cellulare, dal punto di vista della stimolazione,
si avvale di 5 classi di geni che codificano per proteine quali:
-
-
questi geni, nella loro attività regolare sono definiti protooncogeni
nella loro attività scorretta diventano oncogeni.
Questi fattori che regolano il ciclo cellulare, in seguito a delle
mutazioni, possono comportare l’insorgenza di tumori. Alcuni esempi:
-
-
-
-
sis: fattori di crescita
erb: recettori per fattori di crescita
ras: trasduttori intracellulari
myc, jun: fattori di trascrizione
cicline, Cdk e loro inibitori.
I geni che codificano per queste proteine regolatrici del ciclo cellulare
possono essere causa dell’insorgenza del tumore se la produzione
delle proteine non è correttamente regolata:
-
-
Sis: i fattori di crescita come PDGF o EGF possono venir
prodotti senza regolazione ed indurre la proliferazione
barbara.
Erb: i recettori per i fattori di crescita possono avere, dietro
mutazione del proto-oncogene, il recettore tronco, quindi
trasdurre il segnale anche senza ligando.
Ras: nelle cellule tumorali, ras può essere costitutivamente
attiva e non indotta!
Myc, jun: questi fattori di trascrizione sono espressi nelle
cellule tumorali senza controllo, inducendo continuamente la
trascrizione
onco-soppressori: agiscono da freni. Codificano per
proteine che limitano e regolano la crescita cellulare e
impediscono alla cellula di diventare maligna.
Oncogeni: codificano per proteine che favoriscono la perdita
del controllo della proliferazione cellulare. Possono indurre la
cellula a raggiungere uno stato maligno.
⇀ Le cellule possiedono normalmente alcuni geni che in
seguito a piccole e brevi mutazioni si possono
trasformare in oncogeni. Tali geni sono detti protooncogeni.
Una mutazione sola, al proto-oncogene o all’onco-soppressore non
basta normalmente a far insorgere il tumore:
-
il cancro si sviluppa quando si hanno mutazioni simultanee
di proto-oncogeni in oncogeni e di onco-soppressori incapaci
di svolgere la propria attività.
I virus possono inserire nel DNA dell’ospite degli oncogeni già
precostituiti e causare insorgenza del cancro.
Attivazione di proto-oncogeni a oncogeni.
L’attivazione dei proto-oncogeni a oncogeni può avvenire per varie
cause:
-
Amplificazione genica che aumenta il numero di copie del
gene trascritto.
Mutazioni puntiformi che mantengono la proteina ras
(trasduttrice del segnale) costitutivamente attiva.
Traslocazione cromosomica, che crea un nuovo gene
chimerico che codifica per una proteina costitutivamente
attiva
Enrico Colombo
-
Traslocazione cromosomica che genera un gene chimerico
trascritto sotto il controllo di un enhancer forte.
Inserzioni virali nel genoma della cellula ospite, in cui
vengono inseriti direttamente degli oncogeni.
Biologia molecolare e cellulare 48 Biologia mole
-
-
Inattivazione di onco-soppressori
La trasformazione di una cellula sana in una cellula tumorale è
associata alla perdita di funzione dei geni onco-soppressori:
-
-
in un modo o nell’altro, i vari geni onco-soppressori (ne sono
identificati 24 nell’uomo) agiscono regolando negativamente
la proliferazione cellulare.
La loro eliminazione promuove la crescita incontrollata.
Sono anche garanti della stabilità genetica.
RB, il retino blastoma. Tumore ereditario.
Il gene che codifica per pRB è stato il primo onco-soppressore che sia
stato riscontrato e studiato. Una alterazione di questo gene causa
l’insorgenza del tumore della retina, detto retinoblastoma.
Questo tipo di tumore si verifica se entrambi i geni sono alterati, poiché
se ne è alterato solamente uno, l’altro cromosoma 13 può codificare
per pRB.
Si dimostrò che vi sono alcune famiglie che hanno ereditariamente un
cromosoma Rb mutato:
-
-
hanno, nel 90% dei casi la possibilità di sviluppare il tumore.
Questo avviene se nelle cellule somatiche avviene una
mutazione spontanea al gene RB del cromosoma sano
la possibilità di sviluppare il retinoblastoma nelle famiglie non
a rischio scende notevolmente, poiché devono avvenire
mutazioni spontanee su entrambe i cromosomi.
La proteina RB è una proteina che controlla negativamente
l’espressione dei geni necessari per il passaggio G1>>S:
lega, ad esempio, il fattore di trascrizione E2F, agendo da
repressore sui geni che codificano per enzimi implicati nella
replicazione.
Quando le cicline-Cdk G1 alzano il loro livello, RB viene
fosforilata e rilascia E2F, permettendo la trascrizione degli
enzimi replicativi
Qualora la proteina RB sia assente o non sia funzionale, a causa della
mutazione di entrambi i geni RB, il passaggio G1>S non può essere
inibito, quindi si ha una crescita incontrollata della popolazione
cellulare.
La proteina p53.
La proteina p53 è una proteina che ha funzioni rilevantissime nella
protezione della cellula e nella sua regolazione:
-
blocca il ciclo cellulare per consentire riparazioni del DNA
induce all’apoptosi se le mutazioni sono troppo
compromettenti
La sua azione inibitrice del ciclo cellulare è data dalla capacità di
indurre la produzione di CDK p21, che causa direttamente l’arresto del
ciclo cellulare:
-
questo spiega perché nel 50 % dei tumori, sono mutati
entrambi i geni TP53.
p21, se non è presente nella cellula a causa di mutazioni di
p53, permette alle cellule di proliferare con il DNA non
riparato, divulgando le aberrazioni cromosomiche.
Inoltre, la mancata produzione di p53, la quale è in grado di indurre
apoptosi, blocca il suicidio della cellula a seguito di mutazioni molto
dannose:
-
dimostrato dal fatto che se vi è un genoma danneggiato, i
livelli di p53 sono molto alti.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 49 Biologia mole
I vari livelli della regolazione dell’espressione genica
-
La regolazione dell’espressione genica può avvenire a vari livelli, non
solamente sulla trascrizione, ma:
-
1) cambiamenti del DNA: metilazione, amplificazione, mutazione
somatica, ricombinazione somatica, trasposizione
2) trascrizione: struttura della cromatina, inizio e termine della
trascrizione.
3) Maturazione post trascrizionale: capping, poliadenilazione,
metilazione, splicing, editing.
4) Stabilità dei messaggeri maturi.
5) Modificazioni post traduzionali: modificazione dei prodotti
proteici.
Tutto l’insieme di processi che regolano l’espressione genica sono
codificati e regolati geneticamente dal DNA.
Cambiamenti del DNA.
Regolazione a livello della trascrizione
Le proteine che legano il DNA e lo condensano in eucromatina non lo
rendono accessibile alla trascrizione:
-
-
ha la funzione di inibire la trascrizione
vengono metilate le citosine a cui seguono delle guanine in
una sequenza ripetuta CpG.
La metilazione varia a seconda dei periodi della vita di un individuo:
-
differenti siti possono essere metlati nel feto e de metilati
nell’adulto.
Uno degli esempi più lampanti è quello delle globine, che
hanno differente forma nel feto (due catene alfa e due
gamma) nell’embrione (due catene chi e due epsilon) e
nell’adulto (due alfa e due beta).
-
geni che devono essere trascritti più volte
vi sono enzimi deputati al rilascio di istoni che vengono
attivati a seguito di stimoli del ciclo cellulare (istone
acetiltransferasi, HAT)
Anche la conformazione che il DNA assume è un fattore che può
influire sulla trascrivibilità di un dato segmento:
-
nella forma Z il DNA tende a srotolarsi ed è maggiormente
facile raggiungere i nucleotidi
nella forma B, invece, il DNA è ordinato ed è idonea a legare
proteine.
L’inizio di una trascrizione è finemente regolato da vari fattori, detti
promotori distale e prossimale.
Il promotore distale si compone di:
-
Un altro meccanismo di controllo, che però avviene a livello più
evolutivo, è quello della amplificazione dei geni:
-
gli istoni sono le proteine deputate all’organizzazione della
cromatina e non permettono la trascrizione quando sono
legati al DNA.
In fase G1 gli istoni devono essere rilasciati per permettere la
trascrizione dei geni.
Gli istoni sono slegati dal DNA mediante metilazione, acetilazione e
fosforilazione:
Una delle più semplici regolazioni geniche a livello del DNA è quella
della metilazione:
-
vengono replicate un maggior numero di volte le catene che
necessitano di maggior trascrizione (formazione di double
minuts), poi vengono ricombinate nel cromosoma.
Nell’uomo ciò avviene con l’rRNA.
-
enhancer: elemento del DNA situato molto distante dalla
sequenza promotrice distale e dal gene, lungo circa 200
nucleotidi. È intensificatore della trascrizione.
Coattivatori: si legano all’enhancer e al promotore
prossimale. Sono di due tipi:
Enrico Colombo
⇀ Coattivatori in trans: sono elementi proteici che
interagiscono sulla cromatina permettendone il
ripiegamento del filamento e l’accessibilità alla
trascrizione.
⇀ Coattivatori in cis: elementi che interagiscono
direttamente con l’apparato di trascrizione.
Il ripiegamento a livello dell’enhancer sul promotore prossimale
favorisce la formazione dell’enhanceosoma, a cui si lega il complesso
di proteine GTF (TF II e TBP) e la RNA polimerasi.
Induzione da elevata concentrazione di metalli pesanti. Il gene che
codifica per una proteina detta metallotioneina è codificato da
sequenze MRE, mettallic response elements:
-
codificata da fattori basali di trascrizione.
Modificazione post-trascrizionale dei messaggeri.
La modificazione post-trascrizionale dei messaggeri è sostanzialmente
legata ai meccanismi di splicing.
Del meccanismo di splicing si è già parlato, ma ciò che regola ancora
di più la trascrizione di un determinato gene è il meccanismo dello
splicing alternativo:
-
permette da un solo pre-mRNA di ottenere proteine differenti
è in funzione di:
⇀ stadio di sviluppo della cellula
⇀ tessuto in cui fa parte.
Lo splicing alternativo avviene grazie a specifiche proteine presenti nel
nucleo della cellula che vengono sintetizzate nel particolare tipo
cellulare:
-
se in una cellula sono presenti alcune proteine regolatrici
specifiche, queste si legano a siti di splicing deboli e ne
impediscono il taglio da parte dello spliceosoma.
Biologia molecolare e cellulare 50 Biologia mole
-
Se nella cellula non viene prodotta alcuna proteina
regolatoria, in presenza degli stessi siti può avvenire il taglio.
Un esempio lampante, negli organismi procarioti, è quello dello splicing
del pre-mRNA della fibronectina:
-
nel fegato vengono rimosse due specifiche sequenze (EDB e
EDA) che invece sono prodotte nei fibroblasti.
La fibronectina in circolo sarà quindi differente rispetto a
quella che si trova a livello della matrice extracellulare.
Una cosa simile avviene nelle proteine di troponina T e tropomiosina di
ratto:
-
tra il ratto e l’uomo vi sono differenti meccanismi di splicing,
nonostante il gene sia molto simile.
Un altro caso è il pre-mRNA del gene per la calcitonina, che in
tessuti differenti produce:
-
calcitonina nelle ghiandole della tiroide.
CGRP nei neuroni
Livello di stabilità dei messaggeri.
Il controllo a livello della traduzione degli mRNA già trasportati nel
citoplasma avviene su tre livelli:
-
localizzazione degli mRNA nel citoplasma
capacità di controllare la frequenza di traduzione e la quantità
di proteine tradotte.
La longevità del filamento di mRNA.
I meccanismi di controllo a livello della traduzione generalmente
operano tramite interazione tra il filamento di mRNA e proteine.
Determinanti nel controllo della stabilità e della traduzione di un mRNA
sono le sequenze UTR (sequenze non tradotte):
-
5’-UTR si estende dal cappuccio di metilguanosina fino ad
AUG
3’ –UTR va dal codone di stop al termine della coda poliA.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 51 Biologia mole
Localizzazione citoplasmatica degli mRNA. Verrà trattata in seguito,
parlando dello sviluppo embrionale.
Controllo della stabilità dell’mRNA. La lunghezza della vita di un
RNA dipende dalla necessità della cellula ad avere pronta sintesi nel
citoplasma.
Controllo della traduzione dell’mRNA. Nelle cellule eucariotiche
umane vi sono differenti meccanismi che regolano la traduzione
dell’mRNA in proteine.
Uno dei principali meccanismi di controllo è quello della coda poli(A):
Alcuni meccanismi possono essere definiti globali, poiché influenzano
la traduzione di tutti gli mRNA.
-
Un meccanismo è quello che influenza eIF2:
-
questa proteina, in seguito a stress della cellula, è fosforilata
da una particolare chinasi.
La fosforilazione inibisce la traduzione di tutti gli altri trascritti.
Esistono quattro tipi di chinasi per diversi stress:
⇀ Termico
⇀ Infezione virale
⇀ Presenza di proteine mal piegate
⇀ Carenza di amminoacidi
Altri meccanismi agiscono alterando la frequenza di traduzione di
mRNA specifici. Uno degli esempi è quello del mRNA per la ferritina,
proteina che regola la quantità di ferro nel citoplasma:
-
-
-
la traduzione è regolata da una proteina regolatrice del
ferro (IRP), che dipende dalla concentrazione di ferro nella
cellula.
Quando la concentrazione di ferro è bassa, il repressore si
lega ad un UTR dell’mRNA chiamato elemento di risposta
al ferro.
Questo impedisce fisicamente la sintesi di altre ferritine.
Quando la concentrazione di Fe resta elevata, viene rimosso
IRP dal 5’ dell’UTR e sintetizzate nuove ferritine.
È ancora in fase di studio il ruolo dei microRNA.
un mRNA che è necessario per maggior tempo, esce con
una maggiore coda poliA
la coda viene gradualmente degradata dall’enzima poli(A)
ribonucleasi.
Quando la coda si riduce a meno di 30 residui di adenosina,
il messaggero viene rapidamente degradato da ribonucleasi
generiche.
La longevità di un mRNA non dipende solo dalla coda poli(A), ma
anche da specifiche sequenze che ne regolano il tempo di
accorciamento a livello dell’estremità 3’-UTR:
-
-
se un mRNA deve avere un’emivita lunga, la sua coda UTR
sarà ricca di sequenze CCUCC, che legano proteine che
stabilizzano il messaggero
se deve avere vita breve, la coda UTR sarà ricca di
sequenze AUUUA, che legano proteine destabilizzanti.
Se una coda AUUUA viene rimossa, la proteina di cui ne serve una
modica quantità viene prodotta in maniera superiore alla necessità:
-
la cellula può diventare maligna.
Controllo post-traduzionale.
Le modificazioni post-traduzionali di proteine sintetizzate possono
essere di varia natura. Tra i più comuni processi vi sono:
-
l’acetilazione (aggiunta di – CH3 - OH) come protezione
della degradazione
la fosforilazione su residui di serina, treonina e tirosina
l’aggiunta di gruppi lipidici.
La glicosilazione, che conferisce proprietà funzionali e
recettoriali.
Enrico Colombo
Alcune proteine, poi, appena sono sintetizzate possono andare
incontro al taglio proteolitico di alcune sue estremità e di parte delle
sequenze amminoacidiche:
-
-
il pre-pro collagene, ad esempio necessita del taglio delle
sequenze che gli impedivano di essere dannoso
nell’apparato di Golgi per poter funzionare
altri enzimi o ormoni possono andare incontro a questo
destino.
La degradazione di alcuni peptidi in una proteina ne può modificare la
conformazione, ma ottenere una proteina comunque funzionale,
talvolta anche dannosa.
Biologia molecolare e cellulare 52 Biologia mole
Esistono due tipi di risposte immunitarie acquisite:
-
La risposta umorale è mediata dai linfociti B, che quando vengono
attivati si differenziano in cellule che secernono anticorpi
(plasmacellule), i quali sono diretti verso agenti estranei alla cellula:
-
-
La ricombinazione somatica dei geni delle immunoglobuline
Negli organismi vertebrati sono presenti degli efficaci meccanismi di
difesa contro agenti estranei agli organismi.
Vi sono generalmente due tipi di difesa:
-
-
immunità innata: è una risposta aspecifica, mediata da TLR,
proteine recettori che si scagliano contro qualsiasi agente
ritenuto estraneo all’organismo.
Immunità acquisita: è una risposta specifica e dotata di
memoria.
La risposta immunitaria acquisita
A differenza dei meccanismi aspecifici della risposta innata, che
vedono cellule killer sempre pronte a degradare qualsiasi non self,
l’immunità acquisita richiede un tempo di preparazione:
-
deve essere organizzato un attacco specifico contro il
patogeno in questione.
Le cellule che mediano la risposta acquisita sono cellule
capaci di memoria.
immunità umorale: assicurata dagli anticorpi, proteine della
superfamiglia delle immunoglobuline. Mediata dai linfociti B
immunità cellulare (cellulo-mediata): assicurata da cellule
quali i linfociti T.
alcune volte gli anticorpi si legano a capsidi virali, particelle
proteiche, ecc… e ne impediscono l’ingresso nella cellula
ospite.
Altre volte le Ig marcano dei patogeni per indicarne la
distruzione a macrofagi.
La risposta cellulo-mediata è invece mediata dal linfociti T, che quando
sono attivati sono in grado di riconoscere una cellula infetta in maniera
specifica e ucciderla.
Le cellule B e T originano da una unica cellula staminale
ematopoietica, nel midollo osseo:
-
in seguito si differenziano maturando nel timo (linfociti T) o
nel midollo osseo (linfociti B)
La selezione clonale per cellule B.
Nel 1955, Jerne propose un processo per la selezione degli antigeni
che prevedeva che i linfociti producessero degli anticorpi, che vengono
poi selezionati a seconda del loro rapporto con l’antigene.
La teoria venne poi perfezionata ed accettata da Brunet, come teoria
della selezione clonale, che prevede che:
1. ogni cellula B produce un tipo di anticorpo: i linfociti B
originano da cellule non differenziate, ma appena si
differenziano, grazie a riarrangiamenti del DNA, possono
produrre anticorpi differenti.
Enrico Colombo
2. Le cellule B producono anticorpi in assenza di antigene: le
cellule B producono anticorpi e li espongono con la porzione
recettoriale sulla loro membrana. Vengono prodotti prima della
stimolazione di un dato ag, e sono pronti a legarsi ad esso.
3. La produzione di antucorpi segue la selezione delle cellule
B da parte degli ag: il legame di una cellula B con il
determinato antigene ne stimola la proliferazione che da vita a
due popolazioni di cellule clonali:
a. Plasmacellule: estremamente differenziate, che
producono notevole quantità di anticorpi.
b. Cellule B memoria: alcune cellule che sono poco
differenziate ma mantengono la memoria del dato clone.
4. La memoria immunologica produce immunità a lungo
termine: le cellule B memoria possono rispondere rapidamente
a una successiva comparsa del dato antigene. Se stimolate
nuovamente dall’antigene, producono una risposta immune
secondaria, che dura solo poche ore, a differenza dei giorni
necessari per la prima
5. La tolleranza immunologica previene anticorpi contro sé
stessi: I geni che codificano per anticorpi sono combinati a
caso per ottenere la variabilità quindi esiste una possibilità di
sintetizzare degli autoanticorpi. Per la necessaria tolleranza
immunologica verso il self le cellule che riconoscono come
antigene il proprio organismo vengono subito inattivate o
distrutte.
Biologia molecolare e cellulare 53 Biologia mole
-
Contrariamente alle cellule B, le cellule T interagiscono direttamente
con altre cellule (macrofagi, altre cellule T, cellule B, ecc…), inducendo
l’inattivazione o la morte della cellula bersaglio come risultato finale:
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Linfociti T. Attivazione e meccanismo d’azione.
Come le cellule B, anche i linfociti T possono essere attivate da un
processo di selezione clonale:
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possiedono sulla loro membrana il recettore delle cellule T,
che permette loro di interagire con un dato antigene. Ogni
cellula T possiede un solo TCR.
Le cellule T sono attivate da frammenti di antigeni che sono
presentati da cellule presentanti l’antigene (APC) che
possono essere mostrati in differenti modalità:
⇀ Sulla superficie di cellule infettate da virus il linfocita T
può riconoscere particelle del capside
⇀ In altri casi l’APC è un macrofago o una cellula
dendritica che ha degradato enzimaticamente
l’antigene e lo presenta sulla sua membrana in piccoli
pezzi.
L’antigene presentato dalle APC viene poi riconosciuto dalle
cellule T, che attivano la risposta.
A risposta terminata alcune cellule T clonali vengono
mantenute come cellule T memoria, mentre altre vengono
degradate o muoiono per apoptosi.
i mediatori chimici di queste risposte sono le citochine, una
classe di proteine molto attive che funzionano a
concentrazioni basse:
⇀ sono prodotte da vari tipi di cellule e comprendono gli
interferoni (IFN), le interleuchine (IL) e i fattori necrotici
tumorali TNF.
⇀ Queste citochine si legano alle cellule bersaglio,
modificandone l’attività, inducendo produzione di altre
citochine o la proliferazione cellulare.
⇀ Una classe particolare, le chemiochine, inducono la
migrazione dei linfociti nelle zone infiammate.
Esistono differenti tipi di cellule T, le cui classi più importanti sono:
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linfociti T citotossici: sono cellule che controllano la
presenza di anomalie nelle cellule del corpo. Inducono
apoptosi nelle cellule bersaglio, secernendo perforine e
granzimi (questi attivano le caspasi, segnali apoptotici).
Identificate dal CD8.
Linfociti T helper: riconosciuti da CD4, sono attivate da
APC professionali (macrofagi, cellule dendritiche, ecc…)
Enrico Colombo
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regolano l’attivazione delle cellule B o di altre cellule T
secernendo interleuchine.
Linfociti T regler: complesso CD4+ CD25. Sopprimono
l’attività di altre cellule immunitarie, soprattutto per evirare
fenomeni autoimmuni.
La struttura modulare degli anticorpi.
L’organismo umano produce milioni di molecole anticorpali differenti,
capaci di legarsi praticamente a qualunque sostanza estranea si
inserisca nel corpo.
Nonostante la grande diversità e complessità del sistema immunitario,
una specifica Ig può interagire solamente con uno o pochi antigeni.
Gli anticorpi sono proteine globulari chiamate immunoglobuline,
costituite da differenti catene unite da ponti disolfuro, a livello delle
cisteine:
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Biologia molecolare e cellulare 54 Biologia mole
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Le catene leggere sono composte:
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I siti di legame per l’antigene sono situati alla fine di ogni braccio della
molecola a forma di Y e sono identici da entrambe i lati:
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Vi sono 5 tipi di Ig: A, D, E, G, M:L
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Una molcola di IgG è composta, formando una Y, da:
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due catene pesanti identiche
due catene leggere identiche.
Vi sono due tipi di catene leggere presenti in tutti gli anticorpi:
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kappa: metà di ogni catena ha una sequenza identica in tutte
le Ig, l’altra metà differisce.
lambda: avviene la medesima cosa che in kappa.
Anche le catene pesanti possiedono:
nel quarto distale da catene variabili VH.
per i tre quarti prossimali da 3 catene costanti CH1, CH2, CH3.
Ogni porzione costante di una catena si lega tramite ponti disolfuro con
l’omologo della catena pesante o leggera che ha a fianco.
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ogni tipologia di Ig è sintetizzata in tempi differenti di
esposizione alla sostanza estranea.
Hanno differente funzione biologica.
Ogni tipo di Ig ha una catena pesante
Ogni Ig ha due tipi di catene leggere.
metà da una parte variabile, situata all’estremo dell’Fc, VL.
metà da una parte costante CL.
Le catene pesanti sono formate:
catene pesanti.
catene leggere.
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parte costante (C)
parte variabile (V).
-
sono costituiti dalla porzione variabile della catena pesante
unita con quella della catena leggera
l’assemblaggio delle differenti porzioni variabili causa la
enorme variabilità delle Ig.
La porzione terminale delle due catene variabili (pesanti e
leggere) presenta delle porzioni ipervariabili, che giocano il
ruolo chiave nel riconoscimento di Ag.
Il sito di legame per un particolare antigene si chiama
epitopo.
Le porzioni costanti delle catene pesanti, giocano un ruolo
determinante nella determinazione della classe di Ig, che ne determina
la specifica funzione.
Base genetica per le sequenze condivise e differenti nelle Ig.
L’ipotesi prevalente in materia di formazione delle Ig è quella del
riarrangiamento del DNA.
Si scoprì che nell’embrione le sequenze che codificavano per sequeze
V e C erano molto separate sul Dna, ma erano molto vicine nelle
cellule mieloidi che secernevano anticorpi.
Enrico Colombo
Ad esempio, si possono considerare le sequenze del DNA umano in
cui sono comprese le catene leggere k:
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-
-
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una sequenza di geni Vk differenti e ripetuti sono separati da
un singolo gene Ck posto ad una certa distanza.
Si scoprì che le catene leggere V sono più corte della
sequenza necessaria per la sintesi di una catena leggera k
completa.
⇀ Vi è una certa regione che codifica per i 13
amminoacidi rimanenti ad una certa distanza da Vk,
chiamata segmento J.
⇀ Il segmento J è formato da 5 distinti segmenti Jk
disposti in tandem.
L’intero gene completo Vk è formato dall’unione di uno
specifico gene Vk con una cassetta Jk, mediante un
complesso proteico chiamato V(D)J ricombinasi, che piega
il DNA in un anello in modo da appaiare il gene Vk scelto
casualmente con il gene Jk scelto casualmente.
Vengono tagliati gli estremi dell’anello mediante due proteine
associate al V(D)J ricombinasi, dette RAG1 e RAG2:
⇀ I Vk e Jk scelti vengono uniti tra loro ed entrano a fare
parte del trascritto mRNA
⇀ I geni che facevano parte dell’anello formano una
catena di DNA circolare che viene allontanata dal
cromosoma.
Nel processo di splicing, dall’mRNA vengono allontanati gli
introni, che si frappongono in maniera consistente tra VJ e C.
Viene poi tradotta la catena dell’IgG corrispondente.
Da quando vengono allontanate le sequenze dell’anello, la cellula che
ha subito questa trasformazione è in grado di produrre un solo
clone di Ig.
Per le catene pesanti il riarrangiamento avviene con simili modalità,
ma sono 3 i frammenti genici che compongono VH: V, D, J.
Biologia molecolare e cellulare 55 Biologia mole
Con la formazione di catene pesanti e catene leggere e una variazione
enzimatica, unita allo splicing alternativo si possono ottenere circa
200’000'000 di combinazioni.
Ulteriori variazioni possono per giungere a livello delle mutazioni
ipersomatiche, che avvengono parecchio tempo dopo la formazione
del DNA riarrangiato:
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il tasso di mutazione è di circa 100 000 volte più alto in quel
luogo rispetto al resto del genoma
ciò avviene a opera di specifici enzimi, come la terminaldeosossi-nucleotidil-transferasi (TDT), che aggiunge nei
punti di rottura dei nucleotidi in modo casuale, comportando
delle mutazioni di piccola entità.
Queste mutazioni possono avere effetti di sensibile
miglioramento nel riconoscimento dell’antigene.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 56 Biologia mole
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Differenziamento cellulare
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cellule specializzate come quelle della retina, dei denti, della
tuba uditiva.
Midollare del surrene
Il mesoderma da origine a notevoli tessuti differenti:
Gli stadi del differenziamento
Il differenziamento cellulare è un processo che avviene quando la
cellula uovo viene fecondata dal gamete maschile ed avvengono le
condizioni per la crescita del nuovo individuo.
La fusione dei due pronuclei da vita allo zigote, che è formato da
poche cellule indifferenziate e totipotenti.
Lo stadio successivo è quello di blastula, in cui le cellule iniziano ad
assumere una forma differente, ma sono ancora multi potenti.
Il differenziamento dei tre foglietti embrionali primitivi avviene a livello
della gastrula, in cui si possono individuare:
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endoderma
ectoderma
mesoderma: il mesoderma è ancora composto da cellule
indifferenziate che potranno poi sviluppare linee
notevolmente differenti.
Al termine dell’embiogenesi, ll neonato avrà una notevole quantità di
tessuti diffrenziati, che si calcolano intorno ai 210 differenti.
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i morfogeni.
Hans Spemann si mise a cercare nella cellula uovo dei fattori
citoplasmatici che influenzassero lo sviluppo.
Prese due uova di salamandra e le divise in maniera differente:
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Il foglietto embrionale endodermico da origine a:
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epatociti, da cui derivano anche le cellule della tiroide
trachea
polmoni
vescica
pancreas esocrino
L’ectoderma forma:
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tessuto nervoso
cellule ghiandolari
osseo
cartilagine
gonadi
reni
muscoli
corticale del surrene
cuore, cellule endoteliali
cellule sanguigne
ecc…
una cellula uovo venne divisa in due metà comprendenti
uguale quantità di citoplasma > si ottenevano due individui
normali
l’altra venne divisa lasciando solamente il nucleo in una e
nell’altra il nucleo con la gran parte del citoplasma. >> si
ottennero un individuo normale e uno anormale.
Spemann fu il primo ad elaborare la teoria del trasferimento del
Nucleo, e ne ottenne una formidabile prova di validità:
-
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i nuclei erano trasferibili da una cellula somatica ad uno
zigote senza alcun problema, ma importante era il citoplasma
per lo sviluppo effettivo dell’individuo
gettò le basi della clonazione.
Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare 57 Biologia mole
Nelle cellule uovo di Drosophila melanogaster, si scoprì che
determinati mRNA prodotti ancora prima della fecondazione si
situavano in posizioni specifiche:
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il gene bicoid aveva il suo trascritto posizionato nella parte
anteriore dell’uovo
il gene oskar si situava nella parte posteriore.
Questa differente disposizione degli
mRNA materni nel citoplasma
dell’uovo viene detta gradiente
morfogenetico, poiché vede la
disposizione ordinata di determinati
morfogeni.
Un morfogene è un gene che
specifica per la forma di un organi
nell’individuo in fase di sviluppo.
Nella Drosophila si individuarono
tre morfogeni, che si disponevano a
gradienti:
-
- bicoid: specificava per la
regione cefalica
nanos: specificava per la regione caudale
Toll: determinava lo sviluppo ventrale non legando un altro
fattore Dorsal.
In relazione allo sviluppo della drosophila si scoprì che esistono dei
geni del differenziamento:
-
si attivano a cascata tra loro, per permettere di codificare per
fattori di crescita specifici al momento giusto.
I morfogeni si esprimono con una sequenza specifica, perché
deve esserci una specifica gerarchia nell’espressione di
geni che regolano lo sviluppo embrionale.
Tre tipi di geni del differenziamento per la Drosophila.
Il moscerino della frutta si scoprì che aveva uno sviluppo controllato da
tre tipologie di geni:
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-
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geni materni: sono mRNA presenti nella cellula uovo,
espressi durante l’oogenesi. Esprimono la polarità di sviluppo
e l’organizzazione spaziale.
Geni di segmentazione: regolano lo sviluppo dei vari
segmenti (la drosophila è un animale segmentato, l’uomo
no). Sono espressi dopo la fecondazione in seguito
all’attivazione dei geni materni.
Geni omeotici: sono geni che specificano l’identità, la forma
e la funzione dei segmenti corporei. Si esprimono nella
gastrula in seguito all’attivazione dai geni di segmentazione
(nella drosophila) o dei geni materni (nell’uomo).
Queste tipologie di geni che codificano per proteine di sviluppo hanno
anche la capacità, una volta prodotti, di indurre il bloccaggio,
l’eliminazione o l’inattivazione dei geni della tappa precedente.
La specificità di questi geni attiva una cascata di fattori di
trascrizione che codificano per le proteine necessarie allo sviluppo
della parte del corpo individuata dal morfogeno.
Nell’uomo, dopo i geni materni, sono utilizzati i geni omeotici, che
sono disposti su 4 cromosomi con funzioni simili a quelli della
Drosophila:
-
sono direzionati in senso cranio-caudale. Infatti lo sviluppo
della maggior parte dei mammiferi ha un indice cefalico.
Se messi in fila i 4 string del DNA che possiedono i
morfogeni, questi
⇀ iniziano al 3’ con i morfogeni cefalici
⇀ Proseguono con quelli toracici
⇀ Al 5’ vi sono quelli caudali.
Enrico Colombo
Il differenziamento nell’uomo e il mantenimento dello stato
differenziato
Durante lo sviluppo dell’individuo umano si esprime nel giusto ordine
una cascata di fattori di trascrizione a gradiente, che sono
espressione dei morfogeni.
Il differenziamento è un processo che si attua per la maggiore durante
lo sviluppo embrionale, ma prosegue nell’adulto attraverso il
mantenimento dello stato differenziato:
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cellule permanenti: alcuni tessuti non si rinnovano mai più,
hanno cellule eterne (nervoso, muscolare, cellule del
cristallino…)
tessuti che si rinnovano per duplicazione semplice:
epatociti, cellule endoteliali. Possiedono già nel loro
citoplasma le cellule differenziate.
Tessuti rinnovati da cellule staminali: epiteli, midollo
osseo, ecc… Devono subire determinati segnali che gli
impongono una specializzazione e un differenziamento.
Negli adulti il mantenimento dello stato differenziato è ancora regolato
dall’espressione di geni che codificano per fattori di differenziamento:
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attivati da fattori di crescita e ormoni
la cellula ha specifici recettori che, in presenza di questi
segnali, inducono la trascrizione dei geni caratteristici del
tessuto.
Biologia molecolare e cellulare 58 Biologia mole
Mantenimento dello stadio differenziato
Il mantenimento dello stadio differenziato ad opera di ormoni o altri
stimoli può seguire diverse modalità:
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endocrina: gli stimoli giungono attraverso il flusso
sanguigno, con ormoni che si legano a specifici recettori sulle
cellule
paracrina: il mantenimento della specializzazione può
essere indotto dalle cellule vicine attraverso vari meccanismi
autocrina: la cellula stessa produce segnali che auto
impongono il mantenimento dello stato differenziato.
