Lorena Lilli
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UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PERUGIA DOTTORATO DI RICERCA IN “INCREMENTO DELLE PRODUZIONI ZOOTECNICHE E PATOLOGIA DEGLI ANIMALI DA REDDITO” “XXII” CICLO settore scientifico disciplinare “VET 02” "Nuovi aspetti della fisiologia riproduttiva nella coniglia: effetti della PGF2α e del GnRH sul corpo luteo e dello stress metabolico sull’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi." Lorena Lilli RELATORE: Cristiano Boiti COORDINATORE: Giovanni Vitellozzi A. A. 2008/09 1 2 3 Indice Elenco delle abbreviazioni Introduzione Asse ipotalamo-ipofisi-gonadi Ipotalamo Principali funzioni svolte dall’ipotalamo Ormoni secreti dall’ipotalamo e la loro funzione Regolazione dell’attività endocrina ipotalamica Ipofisi Secrezione degli ormoni adenoipofisari Ormoni secreti dall’ipofisi Azione biologica delle gonadotropine ipofisarie Controllo della secrezione di gonadotropine ipofisarie da parte dell’ipotalamo Regolazione della riproduzione nella femmina Fisiologia riproduttiva della coniglia Gravidanza e pseudogravidanza L’ormone rilasciante le gonadotropine: GnRH Recettore per il GnRH: GnRH-R Estrogeni Recettore degli estrogeni Pag. 5 6 6 6 7 9 10 12 13 13 14 15 17 19 20 21 23 32 33 Capitolo I 37 Il corpo luteo Risultati Discussione Conclusioni 37 37 39 41 43 47 56 58 58 59 70 88 95 Capitolo II 96 Bilancio energetico nella riproduzione 96 98 Generali azioni del progesterone Sviluppo del corpo luteo Pathway steroidogenico luteinico Regolazione trofica delle funzioni luteali Luteolisi Scopo I Materiali e metodi Reagenti Protocollo sperimentale Effetti energetici sul sistema ipotalamo-ipofisi-gonadi Effetti energetici sulla motivazione e sull’esecuzione dell’alimentazione e dei comportamenti riproduttivi Un sistema per organizzare i fattori che controllano il bilancio energetico ela riproduzione 103 103 4 Il sistema degli endocannabinoidi Endocannabinoidi Recettori per i cannabinoidi Sintesi, rilascio, assorbimento e degradazione degli endocannabinoidi: attivazione su richiesta del sistema degli endocannabinoidi Segnali inter e intracellulari mediati dagli endocannabinoidi Cannabinoidi esogeni e endogeni e il loro ruolo nella regolazione endocrina Il sistema degli endocannabinoidi nella modulazione del bilancio energetico Scopo II Materiali e metodi Reagenti Protocollo sperimentale Risultati Discussione Conclusioni 122 122 123 126 127 128 131 134 135 135 136 141 153 157 Ringraziamenti Bibliografia 158 159 5 Elenco delle abbreviazioni HPG: Hypothalamic-pituitary-gonadal axis, asse ipotalamo-ipofi-gonadi Arc: nucleo arcuato ipotalamico NTS: nucleo del tratto solitario, ipotalamo AP: area posteriore, ipotalamo PVN: nucleo paraventricolare, ipotalamo VMH: nucleo ipotalamico ventromediale RNA: acido ribonucleico POA: area preottica, ipotalamo mRNA: RNA messaggero DNA: acido desossiribunucleico cDNA:DNA complementare CL: corpo luteo OVX: ovariectomizzate P. progesterone E: estrogeni AL: coniglie alimentate ad libutum AL-E: coniglie alimentate ad libitum e tratatte con il 17β-estradiolo AL-OVX: coniglie alimentate ad libitum e ovariectomizzate AL-OVX-E: coniglie alimentate ad libitum,ovariectomizzate e tratatte con il 17β-estradiolo F: coniglie sottoposte a 48 ore di digiuno F-E: coniglie sottoposte a 48 ore di digiuno F-OVX: coniglie sottoposte a 48 ore di digiuno e ovariectomizzate F-OVX-E: coniglie sottoposte a 48 ore di digiuno ovariectomizzate e tratatte con il 17β-estradiolo ∆9-THC: ∆9-tetraidrocannabinolo, principio attivo della Cannabis sativa PCR: reazione a catena della polimerasi IHC: immunoistochimica WB: western blotting 6 Introduzione Asse ipotalamo ipofisi gonadi L’ipotalamo e l’ipofisi formano un’entità funzionale (sistema ipotalamoipofisario) che regola la maggior parte dei processi endocrini dei vertebrati. In particolare, l’ipotalamo secerne fattori rilascianti e inibenti attraverso le sinapsi neuroemali dell’eminenza mediana. I capillari presenti in questa regione si raccolgono in un sistema portale venoso che ha come unico bersaglio l’ipofisi anteriore o adenoipofisi, ove le vene si capillarizzano nuovamente. Questo particolare meccanismo impedisce alle sostanze secrete dall’ipotalamo di disperdersi nella circolazione generale, di conseguenza, esse possono agire anche a concentrazioni molto basse. Gli ormoni ipotalamici agiscono in maniera selettiva sui diversi tipi cellulari presenti nell’ipofisi stimolando o inibendo la secrezione dei rispettivi ormoni. Nella maggior parte dei casi gli ormoni ipofisari hanno come bersaglio ghiandole periferiche (gonadi, surrene, tiroide) che sono stimolate a secernere i loro ormoni. A livello ipotalamico e ipofisario sono presenti recettori per questi ormoni; la loro attivazione determina il blocco della secrezione, rispettivamente, degli ormoni ipotalamici e/o di quelli ipofisari. Il risultato è quello di un controllo a retroazione da parte dell’ipotalamo di (quasi) tutto il sistema endocrino. D’altra parte i nuclei ipotalamici ricevono importanti informazioni sensoriali, ad esempio visive (attraverso il nucleo soprachiasmatico), olfattive (nucleo preottico mediale e corpi mammillari) e viscerali (nucleo paraventricolare attraverso il lemnisco viscerale) e quindi l’attività dei neuroni ipotalamici viene fortemente influenzata anche da molteplici fattori, e la loro azione di controllo nei confronti dell’ipofisi viene modulata da tali informazioni. Ipotalamo L’ipotalamo è la porzione del diencefalo situata ventralmente al talamo, alla base dell’encefalo: questa regione svolge importanti funzioni di controllo nei confronti degli organi interni e di un’ampia gamma di comportamenti finalizzati alla sopravvivenza dell’organismo e della specie (funzioni vitali come l’acquisizione di cibo ed acqua, il mantenimento della temperatura corporea, la difesa del territorio, il corteggiamento, la scelta sessuale e le cure parentali). 7 Per le funzioni che svolge, l’ipotalamo è spesso considerato il punto di contatto tra il sistema nervoso e il sistema endocrino, ovvero tra i due sistemi che servono, nei vertebrati, a regolare le attività di tutto l’organismo. I confini di questa regione diencefalica sono segnati anteriormente dalla lamina terminale, inferiormente dal chiasma dei nervi ottici e dall’ipofisi, caudalmente dall’inizio dell’acquedotto di Silvio, mentre dorsalmente l’ipotalamo è compreso tra due commessure (anteriore e posteriore) ed è sovrastato e circondato lateralmente dalla massa del talamo. La regione compresa tra la commessura anteriore e la lamina terminale viene definita area preottica ed ha origine dalla vescicola telencefalica, ma, di norma, viene considerata legata funzionalmente all’ipotalamo. All’area preottica (POA) segue l’ipotalamo anteriore e successivamente l’ipotalamo medio basale o tuberale, ed i corpi mammillari. L’organizzazione dei nuclei ipotalamici è piuttosto complessa e molto spesso anche controversa in quanto, come in molte altre regioni del tronco encefalico, mancano chiari elementi di confine tra un nucleo ed un altro. [Panzica, dizionario di biologia]. Principali funzioni svolte dall’ipotalamo Regolazione cardiocircolatoria La stimolazione di differenti aree ipotalamiche è in grado di determinare qualunque tipo di effetto neurogeno noto sul sistema cardiocircolatorio, come aumento o diminuzione della pressione arteriosa, tachicardia oppure brachicardia. In generale, la stimolazione dell’ipotalamo fa aumentare la pressione arteriosa e la frequenza cardiaca, mentre la stimolazione dell’area preottica provoca spesso effetti opposti, ossia diminuzione della frequenza cardiaca e della pressione arteriosa. Questi fenomeni si attuano principalmente attraverso la mediazione dei centri di controllo cardiovascolari situati nella formazione reticolare del bulbo e del ponte. Regolazione della temperatura corporea Nell’ipotalamo anteriore, e specialmente nell’area preottica, vi sono ampie zone coinvolte nella regolazione della temperatura corporea. Quando la temperatura del sangue che circola attraverso queste aree aumenta, specifici neuroni termosensibili rispondono con un incremento di attività, mentre quando la temperatura diminuisce, anche la loro attività si riduce. Questi 8 neuroni a loro volta, controllano i meccanismi responsabili dell’aumento e della diminuzione della temperatura corporea. Regolazione del contenuto idrico dell’organismo L’ipotalamo regola il contenuto di acqua nel corpo attraverso due meccanismi: 1) generando la sensazione di sete, che spinge il soggetto ad introdurre liquidi e, 2) controllando l’eliminazione di acqua con le urine. Un’area denominata centro della sete è situata nell’ipotalamo laterale. Quando nei neuroni di questo nucleo (o di nuclei ipotalamici associati) la concentrazione di elettroliti aumenta, il soggetto avverte un forte desiderio di bere, che lo spingerà a cercare la sorgente più vicina di acqua ed a bere quanto basta per riportare ai valori normali la concentrazione elettrolitica nei neuroni del centro della sete. Il controllo dell’eliminazione renale di acqua viene invece assolto principalmente dai nuclei sopraottici. Quando i liquidi dell’organismo si fanno troppo concentrati, i neuroni di questi nuclei divengono più attivi e, utilizzando le connessioni che attraverso l’infundibulo ipotalamico raggiungono l’ipofisi posteriore, liberano a questo livello l’ormone antidiuretico (o vasopressina). Quest’ultimo passa nel sangue e va ad agire sui dotti collettori renali, promuovendo un riassorbimento massivo di acqua e riducendo l’eliminazione attraverso le urine. Regolazione della contrattilità uterina e dell’emissione di latte dalla ghiandola mammaria La stimolazione dei nuclei paraventricolari provoca la secrezione dell’ormone ossitocina da parte della neuroipofisi. L’ossitocina, a sua volta, aumenta la contrattilità dell’utero e provoca anche contrazione delle cellule mioepiteliali che circondano gli alveoli mammari, rendendo così possibile la fuoriuscita di latte attraverso i capezzoli. Alla fine della gravidanza vengono secrete quantità particolarmente elevate di ossitocina, che concorrono a promuovere le contrazioni uterine del parto. Successivamente, la suzione della mammella della madre da parte del neonato dà origine a segnali nervosi che dal capezzolo raggiungono l’ipotalamo dove provocano la liberazione di ossitocina. Questa, a sua volta, induce l’espulsione del latte ,rendendolo disponibile per il neonato. 9 Centri che regolano le funzioni gastrointestinali e l’assunzione di cibo La stimolazione di diverse aree ipotalamiche provoca nell’animale da esperimento una fame intensa, un appetito vorace, ed una spinta imperiosa a procacciarsi il cibo. L’area ipotalamica laterale appare particolarmente importante nell’insorgenza della sensazione di fame, ed una sua lesione causa la perdita del desiderio di cibo, talora fino a provocare un’inanizione mortale. Esiste anche un’area che inibisce il desiderio di cibo. Essa è chiamata centro della sazietà, e corrisponde al nucleo ventromediale dell’ipotalamo. Se viene stimolato, questo nucleo, in un animale che sta assumendo cibo, esso cessa immediatamente di mangiare e mostra una totale indifferenza al cibo. Dopo distruzione bilaterale di quest’area, invece, non solo l’animale diventa insaziabile, ma per un eccesso di attività dei suoi centri ipotalamici della fame, sviluppa un appetito vorace e va incontro a obesità di grado estremo. Un’altra area dell’ipotalamo che interviene nel controllo delle funzioni dell’alimentazione è rappresentata dai corpi mammillari, che controllano molti riflessi connessi all’assunzione di cibo, tra cui il leccamento delle labbra e la deglutizione. Il controllo ipotalamico della secrezione dell’ipofisi anteriore La stimolazione di specifiche aree ipotalamiche promuove la secrezione da parte di ormoni da parte dell’ipofisi anteriore. L’ipofisi anteriore riceve sangue principalmente dai vasi che provengono dalla parte inferiore dell’ipotalamo e vanno ad alimentare i seni capillari interposti tra le cellule ghiandolari. Nel sangue che scorre attraverso l’ipotalamo, prima che esso raggiunga l’ipofisi anteriore, vari nuclei ipotalamici riversano neuropetidi liberatori o inibitori. Questi ultimi a loro volta vengono trasportati con il sangue all’ipofisi anteriore, dove agiscono sulle cellule ghiandolari regolando il rilascio dei vari ormoni. Ormoni secreti dall’ipotalamo e loro funzione Speciali neuroni dell’ipotalamo sintetizzano e secernono gli ormoni ipotalamici liberatori e inibitori che regolano la secrezione dell’adenoipofisi. Questi neuroni, che hanno il corpo cellulare in varie zone dell’ipotalamo, inviano i loro assoni nell’eminenza mediana e nel tuber cinereum, quella parte dell’ipotalamo, cioè, che si continua nel peduncolo ipofisario. Le terminazioni di queste fibre si differenziano dalla maggior parte delle terminazioni nel sistema nervoso centrale; infatti, la loro funzione non è quella di trasmettere segnali da 10 un neurone all’altro, ma semplicemente quella di secernere nei liquidi tessutali gli ormoni ipotalamici liberatori o inibitori. Questi ormoni vengono immediatamente assorbiti nei capillari del sistema portale ipotalamico-ipofisario e trasportati direttamente ai sinusoidi dell’ipofisi anteriore. I principali ormoni ipotalamici liberatori e inibitori sono i seguenti: § L’ormone liberatore della tireotropina (TRH: thyroid-stimulating hormone re leasing hormone), che induce la liberazione dell’ormone tireotropo. § L’ormone liberatore della corticotropina (CRH: corticotropin releasing hormone), che promuove la liberazione di ormone crescita (GHRH: growth adrenocorticotropo. § L’ormone liberatore dell’ormone della hormone releasing hormone), che provoca la liberazione dell’ormone della crescita, e l’ormone inibitore dell’ormone della crescita (GHIH: growth hormone inhibitory hormone), chiamato anche somatostatina , che, invece, ne inibisce la liberazione. § L’ormone liberatore delle gonadotropine (GnRH: gonadotropin releasing hormone), che stimola la liberazione sia dell’ormone luteinizzante (LH) che dell’ormone follicolo stimolante (FSH). § Il fattore inibitore della prolattina (PIF: prolactin inhibitory factor), che inibisce la secrezione di prolattina. La maggior parte degli ormoni ipotalamici, se non tutti, viene secreta a livello delle terminazioni nervose nell’eminenza mediana per poi essere trasportata all’ipofisi anteriore. La stimolazione elettrica dell’eminenza mediana eccita queste terminazioni nervose e induce la liberazione di tutti gli ormoni ipotalamici. Però, i pirenofori dei neuroni da cui si originano le fibre che vanno a terminare nell’eminenza mediana si trovano in altre aree dell’ipotalamo o in zone della base del cervello strettamente correlate. [Guyton & Hall: Fisiologia medica]. Regolazione dell’attività endocrina ipotalamica Le cellule che secernono gli ormoni ipotalamici sono neuroni a tutti gli effetti e quindi ricevono numerose afferenze nervose, a carattere eccitatorio e inibitorio. Inoltre, risentono dell’azione e della concentrazione dei neuropeptidi 11 modulatori presenti nel liquido extracellulare e nel liquor. Essendo fuori o al limite della barriera ematoencefalica esse sono altresì sottoposte all’azione degli ormoni circolanti e degli ormoni ipofisari, forse anche per effetto della diffusione retrograda dal circolo portale. Infine, sempre per la loro posizione ai limiti della barriera concentrazione di ematoencefalica, metaboliti (glucosio, risentono corpi direttamente chetonici, acidi della grassi, concentrazione di Na2+ e di Ca2+), che ne influenzano l’attività. Una caratteristica comune è l’autoregolazione a feedback (generalmente negativo), esercitata dai prodotti della secrezione indotta sull’attività delle cellule ipotalamiche. Si parla di feedback a circuito lungo quando la secrezione ipotalamica viene inibita dall’ormone liberato all’ultimo anello della catena endocrina evocata. Si parla di feedback a circuito breve quando l’azione è esercitata sull’ipofisi, e di circuito brevissimo quando un ormone ipofisario influenza la secrezione del proprio principio di liberazione. Un’altra importante caratteristica della secrezione di alcuni ormoni ipotalamici è la liberazione ad impulsi ritmici. I ritmi di secrezione autonomi, probabilmente dovuti a feedback, sono influenzati da afferenze nervose connesse all’attività dei centri regolatori dei bioritmi. Gli esempi più noti riguardano la regolazione della liberazione di CRH, in relazione all’attività diurna e notturna; di GHRH, in relazione ai ritmi sonno-veglia; di TRH, in relazione ai ritmi alimentari; di PRL e, negli animali a riproduzione stagionale, del GnRH, in relazione a ritmi annuali dipendenti dal fotoperiodo. Nel caso del GnRH, la secrezione, caratteristicamente pulsatile, presenta frequenza ad ampiezza diverse in relazione alle variazioni della concentrazione plasmatica degli steroidi sessuali. Alle cellule neuroendocrine ipotalamiche confluiscono numerosissime terminazioni provenienti da neuroni situati in altre zone encefaliche o nell’ipotalamo stesso, i quali, liberando i loro neurotrasmettitori, regolano l’attività secretoria. La regolazione della secrezione dei neuro ormoni e dei fattori di liberazione ipotalamici è la risultante della sommazione degli stimoli attivanti o inibenti, mediati da diversi neurotrasmettitori e neuromodulatori. Le vie colinergiche hanno scarsa influenza diretta sull’attività endocrina ipotalamica. Stimoli colinergici provocano la liberazione di ADH e PRL; stimolano inoltre le attività corticali, determinando attenzione e aumento delle capacità mentali in genere. I neuroni delle principali vie catecolaminergiche e serotoninergiche che proiettano sull’ipotalamo sono localizzati in centri del tronco cerebrale, connessi 12 con la sostanza reticolare attivante. Hanno tutti importante azione di regolazione endocrina ipotalamica e importanti effetti comportamentali, determinando essenzialmente modificazioni dell’attenzione, delle motivazioni, dell’umore. [A. Debenedetti, Endocrinologia] Ipofisi La ghiandola pituitaria o ipofisi è posta alla base del cranio, in una nicchia ossea detta sella turgica, circondata dalla dura madre. L’ipofisi è strutturalmente e funzionalmente divisa in due porzioni: l’adenoipofisi, o lobo anteriore, è una vera e propria ghiandola endocrina preposta alla sintesi e secrezione di ormoni trofici; la neuroipofisi, o lobo posteriore, in diretta connessione con l’ipotalamo tramite l’infundibolo, è deputata al rilascio dei due peptidi prodotti dai nuclei magnocellulari dell’ipotalamo (ossitocina e vasopressina). La neuroipofisi viene irrorata direttamente da branche delle arterie ipofisarie mediane ed inferiori. L’adenoipofisi, nei mammiferi, è il tessuto più vascolarizzato. Il sangue arterioso è fornito dalle carotidi interne, tramite le arterie ipofisarie mediane e inferiori, che formano una rete di capillari a livello dell’eminenza mediana dell’ipotalamo, i quali a loro volta si ricombinano nelle vene del sistema portale. Esiste anche un certo flusso ematico retrogrado dall’ipofisi all’ipotalamo, che provvede al meccanismo di feedback degli ormoni ipofisari nei confronti del loro controllo neuroendocrino. La neuroipofisi è costituita da terminazioni assoniche dei neuroni dei nuclei sopraottico e paraventricolare dell’ipotalamo, disperse nella matrice gliare e intimamente addossate ai capillari. La popolazione cellulare dell’adenoipofisi è alquanto eterogenea: sulla base della affinità alla colorazione le cellule secernenti vengono distinte in basofile, acidofile e cromofobe, anche se tutte, durante la fase di attività secernente, si mostrano cromofobe o non assumono il colorante per l’assenza di granuli di secreto. L’immunocitochimica e la microscopia elettronica permettono di distinguere le cellule adenoipofisarie in base ai loro specifici prodotti di secrezione (somatotrofe, lattotrofe, tirotrofe, corticotrofe, gonadotrope). Tutte le cellule secernenti adenoipofisarie sono caratterizzate da un reticolo endoplasmatico molto sviluppato, con numerosi ribosomi per la sintesi degli ormoni, e da un imponente apparato del Golgi, che provvede all’impacchettamento degli ormoni stessi all’interno dei granuli. I granuli di 13 secrezione sono caratteristici delle cellule endocrine che sintetizzano polipeptidi e catecolamine, e costituiscono un importante e pronto deposito di ormoni preformati, in condizioni di non attività, al riparo dalla degradazione ad opera degli enzimi intracitoplasmatici. Secrezione degli ormoni adenoipofisari I fattori di liberazione ipotalamici agiscono sugli specifici recettori posti sulla membrana delle cellule secernenti ipofisarie, con un meccanismo simile a quello degli altri ormoni peptidici: il legame dell’ormone con il recettore determina l’attivazione dell’adenilato ciclasi e l’incremento di AMP ciclico intracellulare. L’AMP ciclico rende le cellule più permeabili agli ioni Ca2+, che vengono pertanto concentrati nel citoplasma. Il Ca2+ causa l’attivazione dei microfilamenti citoplasmatici, che determina lo spostamento dei granuli di secreto verso la periferia della cellula, la loro membrana si fonde con quella plasmatica, il contenuto viene riversato nell’interstizio per esocitosi e rapidamente passa nei capillari fenestrati per entrare in circolo. L’ormone sintetizzato in eccesso può essere degradato prima di venire secreto, mediante un processo detto crinofagia, caratterizzato dalla fusione della membrana dei granuli con quella lisosomale. [A. Debenedetti, Endocrinologia] Ormoni secreti dall’ipofisi Dai differenti tipi di cellule dell’adenoipofisi vengono secreti sei ormoni principali, e altri di importanza minore; mentre dalla neuroipofisi sono secreti solo due ormoni. Gli ormoni secreti dalla adenoipofisi hanno ruoli fondamentali nel controllo delle funzioni metaboliche e riproduttive dell’organismo e sono: 1) L’ormone della crescita (GH: growth hormone) che promuove la crescita corporea agendo su molte funzioni metaboliche, specialmente sulla formazione di proteine. 2) L’adrenocorticotropina (ACTH: adrenocorticotropic hormone) che controlla la secrezione di alcuni ormoni della corteccia surrenale, che a loro volta agiscono sul metabolismo del glucosio, delle proteine e dei lipidi. 3) L’ormone stimolante la tiroide (tireotropina, TSH: thyroid stimulating hormone) che regola la secrezione di tiroxina e triiodotironina da parte della tiroide, e questi a loro volta controllano una gran parte delle reazioni chimiche che avvengono nell’organismo . 14 4) La prolattina (PRL) che promuove lo sviluppo della ghiandola mammaria e la produzione di latte. 5) L’ormone follicolo stimolante (FSH: follicle stimulating hormone). 6) L’ormone luteinizzante (LH: luteinizing hormone). Questi ultimi due ormoni vengono detti ormoni gonadotropi e controllano lo sviluppo delle gonadi e la loro attività durante la funzione riproduttiva. I due ormoni che vengono secreti dalla neuroipofisi esercitano tutt’altre funzioni e sono: 1) L’ormone antidiuretico (ADH: antidiuretic hormone; chiamato anche vasopressina) che controlla la quantità di acqua escreta con le urine, e quindi concorre alla regolazione del contenuto in acqua dei liquidi corporei. 2) L’ossitocina che: a) promuove l’eiezione di latte dalle ghiandole mammarie attraverso i capezzoli durante la suzione e b) interviene, probabilmente, nel meccanismo del parto alla fine della gestazione. [Guyton & Hall: Fisiologia medica]. Azione biologica delle gonadotropine ipofisarie Le gonadotropine ipofisarie sono l’ormone luteinizzante (LH) e l’ormone follicolo-stimolante (FSH). Si tratta di glicoproteine prodotte dalle cellule basofile adenoipofisarie, dette gonadotrope. Entrambe sono formate da due catene polipeptidi che, sub unità α e β, di cui la α è identica per i due ormoni, ed è comune a quella del TSH. Le catene α presentano minime differenze fra specie diverse, mentre la subunità β, che conferisce la specificità all’ormone, può presentare differenze legate alla specie. Le gonadotropine circolano nel sangue in forma libera: l’emivita è di 30-50 minuti per l’LH e di 3-4 ore per l’FSH. Sia nei maschi che nelle femmine le gonadotropine sono essenziali per promuovere lo sviluppo delle gonadi, la steroidogenesi e la produzione dei gameti. La subunità β è responsabile dello specifico legame al recettore sulla membrana delle cellule bersaglio, legame che attiva l’adenilato ciclasi e quindi la produzione di AMP ciclico. L’AMP ciclico attiva una specifica proteinchinasi, che a sua volta determina la fosforilazione di altri enzimi, effettori dell’azione biologica . L’LH viene anche indicato come ICSH (interstitial cells stimulating hormone) dal momento che stimola le cellule del Leyding a produrre androgeni. A livello dell’ovaio l’LH stimola la produzione di progesterone da parte del corpo luteo e 15 la sintesi di androgeni ed estrogeni in combinazione con l’FSH; LH favorisce il passaggio colesterolo-pregnenolone, tappa precoce della sintesi di steroidi, e quindi stimola la produzione di testosterone sia da parte delle cellule del Leyding del testicolo, che delle cellule tecali dell’ovaio. Le cellule della granulosa convertono il testosterone in estradiolo grazie all’intervento dell’enzima aromatasi, sotto lo stimolo dell’FSH. L’FSH è determinante per la maturazione del follicolo,cioè durante il processo che dal follicolo primario porta al follicolo maturo, in particolare per la formazione dell’antro. Causa la formazione del liquido follicolare e, in sinergismo con gli estrogeni, stimola la moltiplicazione e la maturazione delle cellule della granulosa, nonché la formazione su di esse di recettori sia per l’FSH che per l’LH. Le elevate quantità di estrogeni prodotti dal follicolo maturo provocano la liberazione di gonadotropine, in particolare di LH, da parte dell’ipofisi: il picco preovulatorio di LH determina la deiscenza del follicolo e l’ovulazione. Nel maschio, l’effetto dell’LH sulla spermatogenesi è di tipo indiretto, legato cioè alla produzione di testosterone da parte delle cellule interstiziali. L’FSH agisce sulle cellule del Sertoli dei tubuli seminiferi, dove stimola la secrezione di proteine che trasportano gli androgeni (ABP: androgen binding protein). Queste proteine legano il testosterone, entrato nelle cellule per diffusione, e lo mantengono in elevata concentrazione nel lume dl tubulo seminifero, dove risulta determinante per la maturazione delle cellule germinali. Controllo della secrezione di gonadotropine ipofisarie da parte dell’ipotalamo La secrezione di gonadotropine da parte dell’ipofisi anteriore è controllata da un unico fattore ipotalamico, il decapeptide GnRH (gonadotropin releasig hormone). Giunto all’adenoipofisi tramite il sistema portale, il GnRH agisce stimolando sia la secrezione di gonadotropine che la loro sintesi, sia aumentando la sensibilità delle cellule gonadotrope al GnRH stesso. Tutti gli effetti sono mediati dall’aumento del Ca2+ intracellulare (entrata nelle cellule del LEC e mobilizzazione dai depositi intracellulari). La secrezione basale o tonica di GnRH, e quindi di gonadotropine, è di tipo pulsatile, specialmente per quanto riguarda l’LH, con emissioni intermittenti ad intervalli di circa un’ora, la cui frequenza e l’ampiezza è variabile a seconda della specie, dell’età, dello stadio del ciclo estrale e di molteplici fattori 16 ambientali (alimentazione, stagione, fotoperiodo, temperatura, tipo di allevamento, ecc.). Nelle femmine ad ovulazione spontanea, durante la fase estrale si verifica una caratteristica scarica di gonadotropine (prevalentemente LH), detta secrezione fasica o anche «picco preovulatorio dell’LH», che è responsabile dell’ovulazione. Tale aumento preovulatorio è indotto dalle elevate concentrazioni di estrogeni provenienti dal follicolo maturo, che agiscono a livello dell’asse ipotalamo-ipofisi con un meccanismo di feedback positivo. Esistono nell’ipotalamo due centri di controllo della liberazione di gonadotropine. Il centro per la secrezione tonica o basale è costituito da neuroni situati nel nucleo arcuato e nel nucleo ventromediale, con terminazioni distribuite nell’eminenza mediana. Tale centro è sensibile ad un feedback negativo esercitato dagli steroidi sessuali circolanti, e probabilmente, dalle stesse gonadotropine; il feedback negativo degli estrogeni può agire inoltre a livello ipofisario, sulle cellule gonadotrope. Il centro ipotalamico per la liberazione preovulatoria di gonadotropine è situato nelle aree ipotalamiche anteriori (preottiche e soprachiasmatiche) ed è invece regolato a feedback di tipo positivo da parte degli estrogeni. Durante il periodo di anestro post-partum delle femmine in lattazione questo feedback positivo può essere inibito da fattori neuroendocrini connessi allo stimolo della suzione. In alcune specie (gatto, coniglio, visone, furetto, scoiattolo, dromedario) il picco preovulatorio di LH e la conseguente deiscenza del follicolo non avvengono spontaneamente, ma sono provocati soltanto dalla stimolazione di recettori vaginali durante il coito («ovulazione indotta»). Si instaura infatti un riflesso neuroendocrino in cui gli impulsi nervosi afferenti giungono all’ipotalamo, sollecitando la liberazione di GnRH, cui segue quella delle gonadotropine ipofisarie. Nel maschio è noto da tempo un altro fattore di regolazione, l’inibina, che svolge azione inibitoria sul rilascio di FSH. L’inibina è una molecola proteica prodotta probabilmente dalle cellule del Sertoli che, con un meccanismo di feedback negativo sull’asse ipotalamo-ipofisi, modula la secrezione di FSH, inviando informazioni in base allo stato ed all’entità dell’attività spermatogenica dei tubuli seminiferi. L’inibina viene prodotta anche nella femmina, nel follicolo ovarico; la sua concentrazione è parallela a quella degli estrogeni e, analogamente al maschio, ha la funzione di inibire la secrezione di FSH senza modificare quella della LH. Le gonadotropine ipofisarie e quindi l’attività sessuale degli animali sono comunque regolate da una complessa e complicata varietà di fattori nervosi, 17 psichici, endocrini, metabolici, ambientali, che interagiscono a vari livelli dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi. [A. Debenedetti, Endocrinologia]. Regolazione della riproduzione nella femmina I periodi in cui non si svolgono attività cicliche regolari (anestro) costituiscono la maggior parte della vita di una femmina fertile normale. Il periodo giovanile e quelli di anestro gestazionale e di allattamento sono assai maggiori di quelli relativamente brevi dell’attività ciclica. I principi generali dell’endocrinologia della riproduzione nelle varie specie sono i medesimi, ma esistono comunque delle differenze: alcuni animali sono poliestrali annuali (bovini, suini), altri sono poliestrali stagionali (equini, ovini, felini). Il cane è monoestrale stagionale. Altre differenze sono riferibili al tipo di ovulazione. La maggior parte degli animali ha un’ovulazione spontanea mentre nel gatto, nel coniglio, e nel dromedario l’ovulazione è indotta dalla stimolazione dei recettori sensoriali della vagina e cervice durante il coito. Il processo riproduttivo nei mammiferi è regolato da una complessa e solo parzialmente compresa “cascata “ di processi, regolati dal sistema nervoso centrale (SNC), da un certo numero di tessuti secretori, tessuti bersaglio e numerosi ormoni. Il sistema nervoso centrale riceve informazioni dall’ambiente che circonda l’animale (segnali esterni: visivi, olfattivi, uditivi, tattili) e li convoglia, quando importanti ai fini riproduttivi, alle gonadi attraverso l’asse ipotalamo-ipofisigonadi. L’ipotalamo e l’ipofisi sono strutture strettamente connesse con la parte ventrale del cervello. Ambedue le strutture sono, non solo, organi produttori di ormoni ma, anche organi bersaglio che costituiscono un sistema omeostatico a feedback, grazie al quale la maggior parte degli ormoni regola il proprio livello di secrezione. Nell’ipotalamo i neuroni endocrini producono, stimolati dal SNC, il GnRH. Attraverso il sistema portale ipotalamo-ipofisario, il GnRH raggiunge il lobo anteriore dell’ipofisi, dove stimola le cellule gonadotrofe a secernere l’FSH e l’LH. GnRH, FSH, LH vengono secreti ad intervalli, con ritmo pulsatile. L’FSH stimola lo sviluppo dei follicoli ovarici, nella cui teca interna l’LH induce la sintesi dell’androstenedione a partire dal colesterolo. L’androstenedione viene convertito a testosterone che nelle cellule della granulosa del follicolo, sotto l’influsso del FSH viene trasformato in composto aromatico: il 17 β-estradiolo. 18 L’estradiolo possiede un feedback positivo su ipotalamo e ipofisi, aumentando la frequenza di emissione pulsatile del GnRH. Al di sopra del livello soglia di estradiolo, l’ipotalamo risponde con la produzione di GnRH che induce a sua volta la produzione di LH e questo dà inizio alla ovulazione. Un altro effetto importante dell’estradiolo è l’induzione dei segni dell’estro. L’estro può essere definito come l’insieme dei sintomi comportamentali e fisici che segnalano ai soggetti della stessa specie che la femmine è in fase fertile e che consentirà all’accoppiamento. Le cellule della granulosa producono anche sostanze inibenti (inibina). Non sono conosciuti tutti gli effetti di questo ormone, ma il suo nome si deve all’effetto di feedback negativo sul rilascio del FSH da parte dell’ipofisi, che controlla in tal modo lo sviluppo follicolare. Dopo l’ovulazione ciò che resta del follicolo viene trasformato in corpo luteo sotto l’effetto dell’LH. La cavità follicolare viene riempita da vasi sanguigni e le cellule della granulosa aumentano il proprio volume. Il corpo luteo è soprattutto un organo secernente che produce progesterone e ossitocina. Il progesterone è l’ormone maggiormente responsabile del mantenimento della gravidanza. Esso fa diminuire il rilascio pulsatile di GnRH e inibisce così nuove ovulazioni, inoltre prepara l’endometrio all’annidamento dell’embrione in formazione e inibisce contrazioni incontrollate della parete uterina. Se l’ovulo che viene rilasciato dal follicolo durante l’ovulazione non viene fecondato, l’animale non riceverà un segnale di gravidanza dall’embrione e, a circa 16 giorni dall’ovulazione, l’endometrio dell’utero non gravido secernerà la prostaglandina F2α (PGF2α), ormone luteolitico che avvia la regressione del corpo luteo. Il meccanismo luteolitico delle prostaglandine non è del tutto spiegato, ma implica una riduzione dell’irrorazione sanguigna del corpo luteo per vasocostrizione e un effetto diretto della PGF2α sulle cellule luteali. Anche l’ossitocina prodotta nel corpo luteo si pensa possa giocare un ruolo nella luteolisi. Come risultato della regressione del corpo luteo la concentrazione di progesterone nel sangue diminuirà e il blocco del progesterone sul rilascio del GnRH ipotalamico cesserà. Ciò da inizio ad una nuova fase follicolare e infine allo sviluppo di un follicolo pre-ovulatorio. Il periodo della maturazione del follicolo, dall’estro e dell’ovulazione, che sono caratterizzati da produzione di estradiolo, viene chiamata fase follicolare del ciclo. La fase dominata dal progesterone, che va dall’ovulazione fino alla luteolisi, viene denominata fase luteale. 19 Fisiologia riproduttiva della coniglia La fisiologia riproduttiva della coniglia è caratterizzata da un’ovulazione non spontanea ma indotta dall’accoppiamento. La femmina viene considerata in estro più o meno permanente, e l’ovulazione si verifica in concomitanza con l’accoppiamento: si definisce in estro se accetta il maschio; in diestro se lo rifiuta. Numerose osservazioni hanno evidenziato un’alternanza di periodi di estro e di diestro, ma è difficile prevederne la durata e individuare tutti quei fattori ambientali e ormonali che l’influenzano. È stato comunque accertato che il 90% delle femmine con vulva rossa accettano il maschio e ovulano, mentre questi eventi si verificano solo nel 10% delle coniglie con vulva bianca. Quindi, il colore della vulva è un buon indicatore dell’estro ed esprime la recettività delle femmine, confermata dalla posizione di lordosi che assume in presenza del maschio. La coniglia può restare in estro parecchi giorni consecutivi; successivamente i follicoli che hanno raggiunto lo stadio finale di maturazione regrediscono e vengono rimpiazzati da nuovi follicoli, che restano qualche giorno allo stadio preovulatorio prima di regredire anch’essi. Le condizioni di estro e l’accettazione del maschio possono verificarsi anche durante la gestazione, soprattutto nella seconda metà; l’accoppiamento non ha conseguenze negative sui feti e non è mai seguito da una nuova gravidanza, come si verifica nella lepre (superfetazione). Normalmente l’ovulazione è indotta dagli stimoli associati al coito. Il riflesso ovulatorio si esplica attraverso due vie: la via nervosa o afferente che trasmette lo stimolo al sistema nervoso centrale; la via umorale o efferente che trasferisce l’ordine all’ovaia. La sede di destinazione delle via afferente è l’ipotalamo (campo copulocettivo) che integra l’informazione con altri messaggi interni (livello di steroidi) ed esterni (olfattivi, gustativi, visivi, uditivi); nella femmina pluripara questo insieme è confrontato con gli elementi contenuti nella memoria. L’ipotalamo libera allora picogrammi di ormone rilasciante le gonadotropine (GnRH) che, attraverso il circolo sanguigno, raggiunge l’ipofisi anteriore stimolando il rilascio, da parte delle cellule basofile, delle gonadotropine FSH e LH. L’FSH determina la maturazione finale del follicolo (1,2-1,5 mm), con formazione di un ovulo aploide; sembra inoltre che influenzi il riflesso ovulatorio amplificando l’azione dell’LH. L’aumento del livello plasmatico di FSH è evidente nel 2° minuto dopo il coito, ma il valore massimo viene raggiunto tra 50 minuti e 2 ore dallo stesso. 20 L’LH è responsabile dell’ovulazione che avviene 10-12 ore dopo l’accoppiamento per deiscenza del follicolo di Graaf. L’LH stimola, inoltre, la produzione di estradiolo, progesterone, 20α diidrossiprogesterone e prostaglandine. Il GnRH induce anche la liberazione di ossitocina che favorisce l’ovulazione. Dopo 4-5 ore dal coito il livello di LH è tornato al valore minimo, mentre tra le 16 e le 22 ore si riscontra un altro picco di FSH, che induce la formazione di nuovi follicoli, pronti per le successive ovulazioni. Questi follicoli avranno una funzione luteotrofa fondamentale, mediata dall’17-β estradiolo, sui corpi lutei già a partire dalla quinta o sesta giornata dall’ovulazione. Gravidanza e Pseudogravidanza Nel coniglio la gestazione ha una durata di 30-33 giorni. La razza ha una certa incidenza sulla sua variabilità. Il mantenimento della gravidanza, durante tutto il periodo di gestazione, è garantito dal progesterone. Nel coniglio, l’unica fonte di progesterone è il corpo luteo (CL). La durata dell’attività steroidogenica del CL, si mantiene approssimativamente per 30-32 giorni, durante i quali assicura la sintesi del progesterone necessario al mantenimento della gravidanza. Se all’ovulazione non è associata la fertilizzazione, nelle coniglie s’instaura una pseudogravidanza, con un blocco dell’attività riproduttiva per 15-18 giorni, poiché i CL, che si formano in seguito all’ovulazione, persistono e continuano a sintetizzare e rilasciare progesterone, e regrediscono solamente verso il 15-18° giorno. 21 L’ormone rilasciante le gonadotropine: GnRH Il GnRH è il regolatore centrale della cascata ormonale riproduttiva ed è stato isolato per la prima volta dall’ipotalamo di mammifero come decapeptide (pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly.NH2) [Schally et al.,1971, Matsuo et al.,1971, Baba et al.,1971]. Il GnRH è processato enzimaticamente nei neuroni ipotalamici da un polipeptide precursore ed immagazzinato in granuli di accumulo trasportati lungo gli assoni alle zone esterne dell’eminenza mediana [Fink et al.,1988, Seeburg et al.,1987]. Il peptide è rilasciato in impulsi sincronizzati dalle terminazioni nervose di circa 1000 neuroni nel sistema ipofisario portale ogni 30-120 minuti per stimolare la biosintesi e la secrezione di LH ed FSH dalle cellule gonadotrofe ipofisarie [Fink et al., 1988]. Ogni impluso di GnRH stimola un impulso di rilascio di LH, ma gli impulsi di FSH sono meno distinti. Nonostante LH sia conservato ed altamente dipendente da GnRH per la secrezione, FSH tende ad essere secreto costitutivamente ed è più dipendente dalla biosintesi per la sua secrezione. La frequenza degli impulsi è maggiore nella scarica ovulatoria di LH e minore durante la fase luteale del ciclo ovario. Lo schema asincrono del rilascio di LH e FSH risulta da cambiamenti nella frequenza degli impulsi di GnRH, modulando gli effetti degli steroidi gonadali e degli ormoni peptidici sulle risposte di LH e FSH a GnRH, e sulle differenze nelle emivite dei due ormoni. Basse dosi di GnRH sintetico, somministrato in maniera pulsatile per simulare i livelli endogeni di GnRH nei vasi portali (pg/mL) ripristinano la fertilità in donne ed uomini ipogonadici e sono anche effettivi nel trattamento dei testicoli non discesi e della pubertà ritardata. Al contrario, alte dosi di GnRH, o di agonisti analoghi, desensibilizzano le cellule gonadotrope con il risultante calo di LH e FSH e la diminuzione nelle funzioni ovariche e testicolari. Questo fenomeno di desensibilizzazione è spesso applicato nella medicina clinica per la terapia di un’ampia gamma di patologie[Millar et al., 1987; Casper,1991; Conn e Crowley,1991, Barbieri,1992; Moghissi,1992; Conn e Crowley,1994; Filicori,1994; Emons e Schally,1994] . Gli antagonisti del peptide GnRH inibiscono il sistema riproduttivo tramite competizione con il GnRH endogeno per il legame con i propri recettori [Millar et al.,2000]. 22 In aggiunta alle applicazioni terapeutiche, gli analoghi del GnRH possono essere utilizzati come un nuova generazione di contraccettivi maschili e femminili sostituendo gli ormoni steroidei [Nieschlang et al.,1992; Fraser,1993; Anderson e Baird,2002]. Le varie applicazioni degli analoghi di GnRH hanno attivato molti studi sulla fisiologia, biologia cellulare, e funzione molecolare di questo ormone. Il clonaggio dei recettori per il GnRH (GnRH-R) ha accelerato i progressi nella comprensione delle relazioni attività-struttura del complesso recettori-ligandi dovute a mutagenesi e nello sviluppo di molecole non peptidiche antagoniste [Seaflon et al.,1997; Flanagan et al.,1997; Millar,2001; Millar,2002]. Struttura di GnRH Nonostante si ritenesse che il GnRH di mammifero isolato dall’ipotalamo fosse una struttura unica con un ruolo primario nella regolazione di LH e FSH, è diventato sempre più chiaro che nei vertebrati coesistono diverse forme [King e Millar,1979; King e Millar,1980] Ciò ha portato all’identificazione di strutturale di 23 differenti forme di GnRH [Millar,2001; Millar,2002;King e Millar,1995; King e Millar,1997;Millar e King,1988; King e Millar,1987;Millar et al.,1997;Sherwood,1987;Sherwood e Lovejoy,1989; Sherwood et al.,1993;Yoo et al., 2000;Okubo et al.,2000; Iwakoshi et al.,2002]. Queste molecole sono distribuite in un’ampia gamma di tessuti nei vertebrati nei quali apparentemente svolgono diverse funzioni di tipo neroendocrino (come per il rilascio di GH in alcune specie di pesce), paracrino (nella placenta e nelle gonadi), autocrino (nei neuroni GnRH, nelle cellule immunitarie, nei tumori della prostata e della mammella), e ruoli neurotrasmettitori/neuromodulatori nel sistema nervoso centrale e periferico [Millar et al.,2004]. Poiché nessuna di queste comunicazioni tra cellula segnalatrice e cellula bersaglio è mediata dalla secrezione di GnRH nella circolazione generale, una singola forma di GnRH è teoricamente capace di servire tutti questi ruoli. Comunque, è evidente che almeno due, e generalmente tre, forme di GnRH sono presenti nella maggioranza delle specie di vertebrati fin qui studiate. La più ubiquitaria è il GnRH II “di pollo” (così denominato perché isolato la prima volta dal cervello di questo animale). Poiché il GnRH II ha una struttura conservata dagli osteitti all’uomo, è probabile che sia la forma che si è evoluta per prima e che sia quella dal ruolo principale. Questa forma è stata definita 23 GnRH II, mentre la forma ipotalamica è definita tipo I. Una terza forma di GnRH è presente solo negli osteitti ed è definita GnRH III. Gli amminoacidi N-terminali (pGlu-His-TrP-Ser) e quelli COOH-terminali (Pro-Gly.NH2) si sono conservati per circa i 600 milioni d’anni d’evoluzione dei cordati. Il GnRH I mostra una variazione considerevole nelle posizioni 5, 7, ed 8, il che influenza la selettività del ligando [Millar et al.,2004;Iwakoshy et al.,2002]. La conservazione della lunghezza del peptide e dell’estremità ammino e carbossi terminale indicano che queste caratteristiche sono molto importanti per il legame e l’attivazione dei recettori. Viceversa, la considerevole variabilità nella posizione 8 del GnRH naturale (Arg, Gln, Trp, Ser, Thr, Asn, Leu, Tyr, Lys, Ala, Trp) suggerisce che, virtualmente, in questa posizione ogni residuo è tollerato. Tuttavia, non è questo il caso del recettore di tipo I ipofisiario di mammifero, il quale richide l’arginina in posizione 8 per legami ad alta affinità [Seaflon et al.,1997;Karten e Rivier,1986]. I peptidi corti, come il GnRH, sono altamente flessibili in soluzione ed esistono come in equilibrio fra numerose conformazioni in funzione delle interazioni molecolari, delle influenze locali dei solventi come l’acqua, dei lipidi, e anche in relazione all’iniziale interazione col recettore stesso [Maliekai et al.,1997;Chary et al.,1986; Guarnieri e Weinstein,1996]. Comunque, tra queste conformazioni, ce ne sono di cosiddette bioattive che rappresentano strutture più favorevoli per l’interazione con il recettore. I residui ammino-terminali di GnRH sono coinvolti nell’attivazione del recettore, e modificazioni di questi residui in GnRH portano alla produzione di analoghi con proprietà antagonistiche [Seaflon et al.,1997; Karten e Rivier,1986]. Recettore per il GnRH: GnRH-R Diversi aspetti del recettore per il GnRH (GnRH-R) è le sue proprietà di trasduzione del segnale sono stati descritti [Clayton et al.,1981; Conn et al,1986; Huckle et al.,1988; Hazum et al.,1988; Naor et al.,1990]. Il ruolo del Ca2+ come secondo messaggero e del diacilglicerolo (DAG) [Clayton et al,1981] come potenziale amplificatore della segnalazione di Ca2+ in cellule stimolate da GnRH sono stati oggetto di numerosi studi [Conn et al.,1986]. Inoltre, la trasduzione del segnale in cellule bersaglio stimolate da GnRH è un esempio di via fosfolipide-indipendente: è stata descritta un’interazione fra il Ca2+ citoplasmatico e la proteina chinasi C (PKC) nel controllo della sintesi di 24 gonadotropine e nel loro rilascio, così come la partecipazione della fosfolipasi D (PLD), l’acido arachidonico (AA) e i suoi metaboliti nella segnalazione indotta da GnRH. [Naor et al., 1990] Dall’inizio degli anni ’90 c’è stato un aumento esplosivo nell’informazione riguardante il GnRH-R e le proprietà di segnalazione. Il DNA complementare (cDNA) del recettore GnRH umano è stato clonato e isolato per codificare un'unica variante della struttura a sette domini transmembrana che è caratteristica dei recettori per gli ormoni peptidici che segnalano attraverso proteine G eterotrimeriche. Il legame del GnRH ai suoi recettori porta alla stimolazione di molteplici attività fosfolipasiche nella membrana plasmatica. Gli agonisti del GnRH, legandosi al GnRH-R, portano all’attivazione di diverse vie di trasduzione del segnale. Nelle cellule gonadotrofe, GnRH attiva la PLC, via Gq/11α, portando all’idrolisi del fosfatidilinositolo 4,5 bifosfato legato alla membrana, ad inositolo 1,4,5 trifosfato e al diacilglicerolo, che mobilizza il calcio intracellulare ed attiva le PKC, rispettivamente. Queste a loro volta stimolano la biosintesi e la secrezione delle gonadotropine, LH e FSH. Queste vie di segnalazione intracellulare sono ben note. Tuttavia, ci sono nuove prove sperimentali che indicano come differenti ligandi GnRH (o analoghi del GnRH) portino ad interazioni preferenziali con diverse proteine intracellulari attraverso la stabilizzazione del recettore GnRH in varie conformazioni. [Pawson et al.,2003; Heding et al.,1998] Lo scambio di comunicazioni attraverso queste vie causa una modulazione differenziale dell’inositolo 1,4,5 trifosfato e dei segnali del DAG, coerentemente con le specifiche richieste di questi secondi messaggeri durante la fase iniziale e sostenuta della risposta del calcio citoplasmatico indotta dal GnRH. In aggiunta, le cellule gonadotrofe possiedono canali per il calcio sensibili al voltaggi. L’espressione di numerosi sottotipi di PKC nelle cellule gonadotrope ipofisarie indica, inoltre, la complessità delle vie di trasduzione del segnale coinvolte nei meccanismi di segnalazione attivati dai recettori GnRH. Recentemente, è stato dimostrato che l’attivazione dei recettori GnRH induce l’espressione di diversi geni di risposta primaria (PRG). Distribuzione E’ stato possibile determinare la distribuzione tissutale ed i livelli basali di mRNA che codificano il GnRH-R grazie al cDNA del recettore. I northern blots di mRNA di ipofisi di topo e in cellule αT3-1 hanno rilevato due specie ibridizzzanti di 3.5 e 1.6 kb [Tsutsumi et al.,1992; Reinhart et al.,1992; Kaiser et al.,1992]. 25 Ipofisi I recettori di GnRH sono stati caratterizzati nell’ipofisi di diverse specie, cosi come in cellule αT3 gonadotrofe immortalizzate, [Naor et al.,1980; Wormland et al.,1985; Pal et al.,1992; Limonta,1986; Weil et al.,1992; Peter et al.,1992,; Schulz et al.,1993] come siti di legame molto specifici con alta affinità per il GnRH e i suoi analoghi, agonisti ed antagonisti. Tra i tipi di cellule ipofisarie di ratto, i siti di legame sono localizzati esclusivamente nelle gonadotrofe (vedi Figura. 1). [Hyde et al.,1982] I dati indicano che i GnRH-R nei vertebrati non sono ristretti alla popolazione di cellule gonadotrope. GnRH si lega sia alle cellule biormonali (che esprimono LH e FSH) che alle monormonali (che esprimono LH oppure FSH). [Childs et al.,1984; Naor et al., 1986] I complessi covalenti recettore-ligando dei recettori di GnRH ipofisari di differenti specie possiedono proprietà simili, con variazioni minime. [Iwashita e Catt, 1985] Cervello La presenza di specifici legami per il GnRH è stata localizzata, mediante tecniche autoradiografiche, nell’ippocampo, nel nucleo settale laterale, nella corteccia anteriore. [Millan et al.,1985] GnRH si lega anche con alta affinità a recettori specifici in cellule ipotalamiche che secernono GnRH (GT1) in maniera dose-, tempo- e temperatura-dipendente. La specificità di tali recettori è confermata dalla capacità del GnRH, e degli analoghi agonisti ed antagonisti, di inibire il legame con i radioligandi fino al 97%. Gonadi Nei testicoli, il GnRH-R è espresso nelle cellule di Leydig ma non in quelle di Sertoli. Nell’ovaio, GnRH-R sono stati identificati in cellule della granulosa e in cellule luteali [Clayton et al.,1979; Hazum et a.l,1982; Pati et al.,1992]. Nelle gonadi di ratto, sono stati identificati due differenti e distinte componenti di GnRH-R di 53 e 43 kDa simili a quelli della ipofisi di ratto. [Iwashita e Catt,1985] Placenta La placenta umana contiene siti di legame a bassa affinità che interagiscono con analoghi agonisti ed antagonisti di GnRH. [Curie et al.,1981] Questi siti differiscono dai recettori ipofisari di GnRH in numerosi aspetti. Comunque, la similarità nei loro siti di legame a quelli delle gonadotrope indica che questi recettori sono una probabile variante dei recettori GnRH. [Iwashita et al.,1986] 26 Inoltre, il GnRH stimola la sintesi ed il rilascio di gonadotropine bioattive nelle cellule placentali umane [Curie et al., 1993] Cellule che esprimono GnRH I neuroni che producono GnRH sono espressi in tutti i vertebrati. In contrasto con la struttura relativamente conservata dei peptidi GnRH nei vertebrati, [Sherwood et al., 1987] ci sono notevoli differenze interspecifiche nella localizzazione delle cellule nervose GnRH ergiche [Halasz et al.,1989]. La caratteristica distribuzione delle cellule che producono GnRH nel cervello è probabilmente un riflesso delle loro funzioni specifiche: il GnRH può agire come un neurormone, un neurotrasmetitore, ed anche come un ormone locale nel cervello. La scoperta che i neuroni GnRH nell’ipotalamo dell’uomo e delle scimmie inviano terminazioni, non solo nell’eminenza mediana ma anche ad altri neuroni GnRH, e che tali cellule nervose esprimano abbondanti recettori per GnRH, indicano una regolazione autocrina del rilascio di GnRH, che può avvenire all’interno del cervello [Halasz et al.,1989; Krsmanovich et al., 1993]. Questo schema di regolazione locale tramite neuropeptidi non è unico dei neuroni GnRH. GnRH è anche presente in cellule di tumore al seno [Seppiala et al.,1980; Harris et al.,1991; Sarda et al.,1981; Butzow et al.,1987], ed una proteina GnRH-simile, con un mRNA messaggero di prepro GnRH, è stata trovata in cellule della granulosa [Clayton et al.,1992; Behrman et al.,1989;Ireland et al.,1988; Oikawa et al.,1990] ed in tessuti testicolari [Chieffi et al.,1991, van Minne et al.,1988]. Il GnRH è anche presente nella placenta umana [Tan et al.,1982], nel sistema immunitario [Blalock et al, 1989] e nella ghiandola ipofisaria [Kerdelhue et al.,1990; Pagesy et al.;1992] ed è prodotto da cellule del tumore al pancreas [Szende et al., 1991]. Mentre la presenza di GnRH nei linfociti indica un’interazione tra sistema neuroendocrino e immunitario, il significato fisiologico della produzione di GnRH nella ipofisi non è ancora chiaro. Altri studi sono richiesti per identificare le cellule ipofisarie che producono GnRH e per definire neuropeptidi sintetizzati localmente [Qayum et al.,1990]. la funzione dei 27 Figura 1: Il diagramma schematizza l’azione putativa di GnRH nelle cellule gonadotrofe (microaggregazione e successiva attivazione delle proteine G e mobilizzazione del calcio). La macroaggregazione dei recettori porta alla loro down-regolazione. I recettori down-regolati possono tornare alla superficie cellulare.[Stanislaus et al.,1998] Struttura molecolare I recettori per il GnRH sono caratterizzati da una struttura composta da sette domini transmembrana accoppiati alle proteine-G e l’assenza del dominio carbossiterminale citoplasmatico (vedi Figura 2). Il peso molecolare della proteina è 37.684. Studi sulla proteina nativa parlano di un peso intorno ai 5060.000 [Clayton et al.,1989], lasciando supporre che la proteina sia glicosilata. La presenza di tre forme di GnRH nella maggior parte dei vertebrati suggerisce l’esistenza di tre recettori GnRH affini. Poiché il dominio EC3 è il determinante maggiore della selettività per le varianti strutturali di GnRH, oligonucleotidi degenerati al dominio transmembrana di legame sono stati usati per amplificare DNA genomico da vari vertebrati. Questa tecnica ha rivelato l’esistenza di un nuovo recettore di tipo II e la sua sequenza. Queste sequenze sono state quindi usate per identificare il presunto GnRH II umano e di altre specie. Tali scoperte, assieme al clonaggio di altri recettori per il GnRH, suggeriscono una evoluzione precoce dei tre sottotipi di GnRH-R nei vertebrati parallelamente a quella dei ligandi. Non è 28 stato possibile clonare il GnRH-R II umano a causa del frame shift e del codone di stop, che non permettono di ottenere una forma funzionale del recettore di tipo II. Questo apparente silenziamento del GnRH II è accoppiato alla paradossale conservazione di GnRH II dai pesci all’uomo. Simili siti di stop o delezioni sono anche presenti nello scimpanzé, nel bovino, e nell’ovino, mentre un recettore di tipo II del tutto funzionale è presente nelle scimmie del vecchio e nuovo mondo, nel suino, nei rettili e negli anfibi. Il gene è andato perduto nel topo ed assente nei pesci. Questa interessante plasticità nell’inattivazione del tipo II è probabilmente legata alla duttilità nell’uso dei sottotipi dei recettori GnRH per la segnalazione dei diversi tipi di GnRH. GnRH I, GnRH II e GnRH-R I sono universalmente conservati; GnRH-R II è sporadicamente assente o silenziato. Questo potrebbe essere attribuito al fatto che il recettore di tipo I è in grado di legare GnRH II con grande affinità e quindi assumere il ruolo di GnRH II, mentre l’inverso non può avvenire (GnRH-R II è molto selettivo per il GnRH II). Sono state proposte due spiegazioni per il caso dell’uomo: q La prima è che il frame shift ed il codone di stop siano aggiustati post- trascrizionalmente durante la traduzione (meccanismi simili sono stati descritti, come trascritti che escludono lo stop o stop tradotti con un tRNA alla selenocisteina; non sono stati dimostrati nel caso specifico, comunque). q La seconda è che un recettore di tipo II parziale sia prodotto e sia funzionale. E’ stato osservato come la sequenza dopo lo stop (con sequenza consenso di Kozac ) espressa in linee cellulari di rene di scimmia immortalizzata (COS) downregola l’espressione del recettore di tipo I. Il codone di stop è sorto indipendentemente nell’evoluzione nella stessa zona e non in altre. Questo potrebbe suggerire che c’è un vantaggio nel possedere un codone di stop e nel produrre sequenze parziali di recettore. La presenza, però, del recettore II con o senza tale codone in specie correlate suggerisce che questo vantaggio può essere solo marginale [Neil et al.,2001;Low et al., 1996;Hauser et al.,1998;Faurholm et al., 2001; Morgan et al.,2003;Millar et al.,2003]. 29 Figura 2 - Rappresentazione bidimensionale del recettore GnRH umano che mostra i domini tranmembrana connessi allo spazio intra ed extracellulare. In rosso i siti di legame col ligando (putativi) in verde le tasche di legame, in blu i residui coinvolti nell’attivazione del recettore. I residui nei riquadri sono i soli conservati nelle rodopsine. In arancio i residui che interagiscono con la proteina G. Sono indicati i siti dove agiscono le chinasi C ed A. La sequenza di GnRH-R di Oryctolagus cuniculus non è ancora stata definita completamente [Millar et al, 2003]. Regolazione di GnRH-R L’abilità di GnRH di regolare l’espressione dei propri recettori nelle cellule ipofisarie è dimostrata da differenti evidenze sperimentali riassumibili in questo modo: 1. Il numero di recettori del GnRH ipofisario cambiano durante l’ontogenesi e variano durante il ciclo estrale, la gravidanza e l’allattamento [Savoy-Moore et al.,1980; Clayton et al.,1980; Clayton et al.,1980; Clayton et al.,1981; Chan et al.,1981; Duncan et al.,1986]; 2. La castrazione e le lesioni ipotalamiche inducono cambiamenti nel numero di recettori GnRH [Clayton et al.,1982; Barman et al.,1983]; 3. La somministrazione di agonisti del GnRH e di anticorpi contro GnRH è anche associata a cambiamenti nel numero di GnRH-R. [Loumaye et al.,1983]; 4. La stimolazione con GnRH in vitro è seguita da due fasi di cambiamenti nel numero di recettori; inizialmente, l’attivazione di recettori porta ad una 30 down-regulazione, che poi è seguita da una up-regulazione [Loumaye et al.,1983]; 5. L’up-regulazione dei recettori indotta, dal GnRH, è stimolata anche dalla depolarizzazione e dall’attivazione del PKC [Naor et al.,1987; Huckle et al.,1988, Clayton et al.1989]; 6. Ormoni steroidei ovarici esercitano effetti diretti sulle cellule gonadotrofe e influenzano l’espressione dei recettori di GnRH in culture di cellule ipofisarie [Emons et al.,1991]; 7. In aggiunta a tali cambiamenti nei recettori ipofisari, la riduzione del numero di recettori dopo trattamento con GnRH è stato osservato anche nel testicolo e nell’ippocampo [Ban et al.,1990]; 8. In un primo momento, l’esposizione iniziale al GnRH up-regola GnRH-R, che poi va incontro ad una successiva fase di down-regolazione [Hapgood et al.,2005]. Studi topografici sulla localizzazione dei recettori GnRH sulla superficie di cellule ipofisarie dissociate hanno dimostrato una distribuzione uniforme durante l’incubazione a breve termine con analoghi del GnRH. Dopo periodi di incubazione più lunghi, il GnRH legato a recettori è internalizzato con cinetiche determinate dalla potenza degli analoghi e dalla temperatura di incubazione [Hopkins et al.,1977; Hazum et al.,1980; Naor et al., 1981]. Studi sulla regolazione del mRNA dei GnRH-R, usando il cDNA come prova delle analisi di ibridazione, hanno mostrato effetti prominenti del GnRH sull’espressione dei suoi recettori nella ipofisi. Nonostante una stimolazione continua di cellule di ipofisi coltivate in vitro non abbia causato cambiamenti rilevabili dell’espressione dell’mRNA dei recettori, la somministrazione a intervalli di GnRH ne ha aumentati i livelli di diversi ordini [Kaiser et al.,1993]. Questi dati sono coerenti con la nota abilità del GnRH di regolare l’espressione del suo proprio recettore e dimostra l’importanza della modalità di secrezione del GnRH [Savoy-Moore et al.,1980; Clayton et al.,1982; Loumaye et al.,1983]. Coerentemente con precedenti scoperte che mostravano come il numero di recettori di GnRH cambiasse durante il ciclo estrale [Clayton et al.,1980], i livelli di mRNA dei recettori di GnRH nella ipofisi di ratto sono 3 volte più elevati nel pomeriggio del pro-estro che nella mattina del meta-estro. Questo aumento precede di diverse ore l’inizio della scarica di LH e prosegue anche dopo per alcune ore, seguita da una marcata riduzione nel metaestro. Un aumento addizionale, anche se inferiore, si osserva durante il giorno nell’estro 31 [Illing et al.,1993]. Quindi, l’espressione di GnRH-R è altamente regolata durante il ciclo estrale, con una correlazione generale tra i livelli di mRNA e cambiamenti della sensibilità alle risposte gonadotrofe del GnRH. Diversi fattori endocrini potrebbero essere responsabili dei cambiamenti nei livelli del mRNA dei recettori GnRH durante il ciclo estrale, inclusi gli stessi ormoni steroidei ovarici. In accordo con ciò, l’mRNA del recettore del GnRH aumenta rispettivamente di 2 e 5 volte nelle ghiandole ipofisarie di ratti femmina ovariectomizzate (OVX) e in ratti maschi orchiectomizzati, dopo 21 giorni. Il trattamento delle femmine con estradiolo e dei maschi con testosterone diminuisce i livelli di mRNA in 7 giorni [Kaise et al.,1993]. Come osservato nei ratti, il Northern blot del mRNA dell’ipofisi di pecora mostra un aumento del mRNA di tutti i recettori di GnRH negli animali castrati [Illing et al.,1993]. La regolazione steroidea di GnRH è stata anche dimostrata in cellule di ipofisi di pecora coltivate in vitro [Seaflon et al.,1990]. Cellule ipofisarie trattate con estradiolo aumentano la densità dei recettori del GnRH di 7-8 volte. Il trattamento con progesterone diminuisce i livelli anche del 80%. Internalizzazione Come in altre cellule stimolate da ligandi [Suarez-Quian et al.,1986], l’internalizzazione di agonisti del GnRH nelle cellule gonadotrofe avviene via endocitosi mediata da recettori. Il complesso internalizzato va incontro a dissociazione, seguito da degradazione del ligando e dal parziale riciclo dei recettori. In contrasto con la rapida internalizzazione degli agonisti di GnRH [Loumaye et al.,1982], gli antagonisti potenti di GnRH rimangono legati alla superficie per un periodo molto più lungo [Loumaye et al.,1984]. Nonostante l’endocitosi dei complesso recettore-ligando sia correlata temporalmente con l’esocitosi delle gonadotropine, essa non è richiesta per la secrezione di gonadotropine. Inoltre, la de-sensibilizzazione delle cellule gonadotrofe tramite alte concentrazioni di agonista (ma non di antagonista) può essere dissociata dall’internalizzazione. Quindi, è possibile che il complesso internalizzato ormone-recettore sia coinvolto in qualche azione intracellulare non ancora identificata [Conn et al.,1981; Catt et al.,1988; Smith et al., 1981; Goropse et al.,1987; Clayton et al., 1988]. 32 Estrogeni Gli estrogeni sono potenti regolatori delle funzioni riproduttive. Il classico modello dell’azione del 17β-estradiolo (vedi figura 3) è stato descritto tradizionalmente come mediato da proteine recettoriali che si trovano principalmente nel nucleo e che stimolano la trascrizione genica. Numerosi studi che mettono in evidenza una rapida azione non genomica degli steroidi hanno portato a supporre l’esistenza di recettori localizzati sulla superficie della cellula. Il fatto che esista o no tale recettore degli estrogeni è ancora materia di controversia, ma diversi studi hanno messo in evidenza la presenza di proteine presenti sulla membrana plasmatica in grado di legare estrogeni. Indipendentemente da ciò, gli effetti diretti conosciuti di vari steroidi sulla trascrizione dei geni mitocondriali rinforzano l’idea di un contatto dei recettori con il genoma mitocondriale. Nonostante le indagini iniziali abbiano stabilito che la gran parte delle proteine extranucleari che legano estrogeni siano reperite nei sovranatanti delle frazioni di centrifugazioni ottenute da omogeneizzazioni di tessuto uterino, è stato anche presto chiarito come siti di legame specifico con gli estrogeni siano associati con strutture cromosomiche e microsomiche [Monje et al.,2001]. Gli estrogeni svolgono un effetto importante sulla crescita, lo sviluppo e il mantenimento dello scheletro. La significativa perdita di massa ossea in seguito a menopausa ed in seguito ad ovariectomia indica il ruolo fondamentale degli estrogeni in questo processo. Topi privi di ER funzionali, creati con tecniche di gene knockout, mostrano cambiamenti nel fenotipo con una minore densità delle ossa in entrambi i sessi. Gli estrogeni influenzano la crescita, la differenziazione e lo sviluppo di numerosi tessuti bersaglio. Tra questi includiamo i tessuti del sistema riproduttivo maschile e femminile come la ghiandola mammaria, l’utero, l’ovaio, il testicolo, e la prostata. Gli estrogeni giocano anche un ruolo importante nel mantenimento del sistema cardiovascolare, dove hanno sicuramente effetti cardioprotettivi. La concentrazione di estrogeni nel plasma si correla inversamente con l’assunzione di cibo nelle femmine di molte specie. L’ovariectomia produce un immediato aumento dell’assunzione di cibo e del peso corporeo. Tale situazione nei ratti viene normalizzata con successiva somministrazione di estradiolo [Geari,2001]. 33 Gli estrogeni sono principalmente prodotti nell’ovaio, e vengono prodotti anche nei testicoli. Essi diffondono fuori e dentro le cellule, ma sono trattenute in cellule specifiche da una proteina di legame intranucleare, definita recettore degli estrogeni (ER) [Monje e Boland, 2001]. Figura 3 - Struttura chimica del 17-β Estradiolo (E2 ). Recettori degli estrogeni Quasi 50 anni fa, Jensen e Jacobsen (1962) giunsero alla conclusione che (basandosi su specifici legami con l’estradiolo-17β (E2) nell’utero) l’effetto biologico degli estrogeni fosse mediato da una proteina recettoriale [Jensen et al.,1962]. Per molti anni questa proteina è stata oggetto di studio in numerosi laboratori [Chamnes et al.,1974;Gorsky et al.,1984] e nel 1986 due gruppi riportarono il clonaggio del recettore degli estrogeni (ER) [Greene et al.,1986]. Fino al 1995, si assumeva che esistesse un solo tipo di ER e che questo fosse responsabile della mediazione di tutti gli effetti fisiologici e farmacologici degli estrogeni e degli antiestrogeni naturali. Comunque, nel 1995, un secondo ER, ERβ, è stato clonato dalla libreria genomica della prostata di ratto [Kuiper et al.,1996]. 34 Il primo ER venne quindi chiamato ERα. Sin da allora numerosi gruppi di ricerca hanno clonato ERβ da numerose specie [Enmark et al.,1997;Mosselman et al.,1996; Tchoudakova et al., 1999; Todo et al.,1996,Tremblay et al.,1997], identificandone diverse isoforme. La scoperta di ERβ ha portato ad una rivalutazione della biologia degli estrogeni e, a causa dell’abbondanza di ERβ nel tratto urogenitale umano, ha rifocalizzato l’attenzione del ruolo degli estrogeni negli individui di sesso maschile [Chu et al.,1997; Maruyama et al.,1998; Moore et al.,1998; Ogawa et al., 1998]. Domini funzionali ERα e ERβ appartengono alla superfamiglia dei recettori nucleari per gli ormoni steroidei/tiroidei con i quali condividono una comune architettura strutturale [Giguere et al.,1988; Gronemeyer et al.,1995;Katzenellenbogen et al.,1996]. ERa ed ERß sono composti da tre domini indipendenti ma interagenti fra di loro: Quello NH2 terminale o A/B, quello C o di legame al DNA, ed il dominio D/E/F o di legame al ligando (LBD, vedi Figura 4). Il legame del ligando ad ER innesca cambi conformazionali nel recettore e questo porta attraverso una serie di eventi a modificazioni nel tasso di trascrizione dei geni estrogeno- correlati. Questi eventi non sono completamente chiari, ma includono la dimerizzazione del recettore, l’interazione di questo col DNA, il reclutamento di coattivatori e l’interazione con essi e altri fattori di trascrizione, e la formazione di un complesso di preinizio, che favorisce il legame della RNA polimerasi [Katzenellenbogen et al.,1996; Beaton et al.,1989; Beekman et al.,1993; Kraus et al.,1995; Kraus et al.,1998]. Il dominio N-terminale dei recettori nucleari codifica una funzione di attivazione ligando-indipendente (AF1), una regione del recettore coinvolta nell’interazione-proteina-proteina, e l’attivazione trascrizionale dell’espressione di geni bersaglio [Tora et al.,1989; Kraus et al.,1995]. Entrambi i sottotipi di ER condividono molte proprietà funzionali, possono legare il 17β-estradiolo con un alta affinità e possono iniziare la trascrizione di un gene sotto il controllo di elementi di risposta simili. Nonostante il significato biologico dell’esistenza di isoforme di recettori non sia stato stabilito, la differenza nel dominio di transattivazione mostrata dalle due isoforme di ER suggerisce uno specifico comportamento a livello cellulare. Mentre un analisi della distribuzione basata sull’mRNA ha mostrato come l’espressione del ERβ 35 possa sovrapporsi, ma non risultare esattamente uguale all’espressione di ERα, maggior attenzione è stata data ai pattern di espressione proteica nei vari tessuti e sotto distinti ambienti ormonali. La distribuzione di proteine ERβ può differire da quella predetta dalla rispettiva analisi del mRNA. La presenza in cellule bersaglio di attività di legame degli estrogeni in una serie di frazioni subcellulari inclusi mitocondri, lisosomi, membrana plasmatica e microsomi, sono state indicate, ma la localizzazione subcellulare sia della proteina α che dellla β non è stata oggetto di molti studi. Un indagine recente in questo senso ha mostrato come una sostanziale proporzione dei siti nativi leganti estradiolo nell’utero di coniglio, corrispondenti alle proteine α e β, siano differenzialmente associati a membrane microsomali e mitocondriali. Finora si è ritenuto che ERα sia l’isoforma di recettore maggiormente predominante negli organi riproduttivi, ed ERβ sia un recettore la cui espressione è dimostrata ampiamente in differenti tipi di tessuto. Tuttavia, studi recenti hanno mostrato un’ampia espressione di ERβ nell’utero, nonostante i siti in cui esso è stato identificato siano differentemente localizzati in confronto ad ERα. Oltre ciò, proteine collegate a ERβ leganti estrogeno sembrano essere espresse ampiamente sia nell’utero che nell’ovaio di coniglio [Monje e Boland, 2001]. 36 Figura 4:Struttura del dominio LBD del recettore ER. In rosso, giallo e viola i domini ad elica, l’hairpin è colorato di verde. La zona occupata dal ligando è evidenziata con il colore blu. Distribuzione ERα è ampiamente distribuito nel cervello, e l’ipotalamo è una regione particolarmente ricca di questo recettore. All’interno dell’ipotalamo ERα è concentrato nella fascia di Broca, nell’area preottica, nel nucleo paraventricolare, nell’ipotalamo laterale, nel nucleo ventromediale. Ci sono differenze sessuali nella distribuzione. ERα è diffuso nell’ipofisi, nel tessuto osseo e mRNA di ERα è stato reperito in cellule del sangue periferico [Pinzone et al.,2004]. Regolazione Ci sono esempi in molti organi di up-regolazione dei livelli di ERα mediati da estradiolo. La risposta generale all’estradiolo è una degradazione acuta del recettore seguita da attivazione trascriziolale del mRNA di ERα estradiolodipendente. L’esposizione a lungo termine all’estradiolo mantiene tessuti come cervello, tessuti nervosi periferici e fegato in condizione estrogeno-responsiva, up-regolando lo stato di equilibrio di espressione di ERα Molti studi dimostrano che il progesterone down-regola l’espressione di ERα [Pinzone et al.,2004]. 37 Capitolo I Il corpo luteo Il corpo luteo (CL) svolge un ruolo centrale nella regolazione del ciclo estrale e nel mantenimento della gravidanza. Questa funzione è svolta principalmente dal progesterone, che è il principale steroide sintetizzato da questa ghiandola endocrina transitoria. Se l’oocita non viene fertilizzato, il CL regredisce, permettendo, in questo modo, che inizi un nuovo ciclo estrale. L’impianto, l’accoppiamento o anche la stimolazione cervicale in alcune specie di mammiferi, iniziano un complesso meccanismo adattato al mantenimento delle funzioni del CL, assicurando una continua secrezione di progesterone necessario per la sopravvivenza del feto. Neri mammiferi sono stati trovati quattro tipi di CL che differiscono tra loro per la durata e per la produzione steroidogenica: 1) ciclico, 2) pseudogravidico, 3) gravidico e 4) dell’allattamento. Solo il CL della gravidanza è presente in tutte le specie dei mammiferi, mentre tutti e quattro i tipi possono essere trovati nei roditori. Il CL del ciclo non esiste nelle specie ad ovulazione indotta, e il CL della pseudogravidanza non si forma nei primati, mentre il CL dell’allattamento è stato trovato solo nelle specie che ovulano dopo il parto.[Stocco et al.,2007]. Generali azioni del progesterone I principali bersagli del progesterone sono il tratto riproduttivo e l’asse ipotalamo-ipofisi. In generale, il progesterone agisce nel tratto riproduttivo preparandolo all’inizio e al mantenimento della gravidanza. Il progesterone, sembra esercitare molti dei suoi effetti regolando direttamente la trascrizione di geni attraverso specifici recettori nucleari che agiscono come Sekeris,1997]. fattori Dopo il di trascrizione legame del ligando-inducibile ligando, questi [Moutsatsou recettori e modulano l’espressione dei geni attraverso legami specifici progesterone-elementi di risposta nel DNA. È richiesta una precedente esposizione agli estrogeni, che inducono la produzione dei recettori per il progesterone [Ing e Tornesi,1997; Kaneko et al.,1993; Kraus e Katzenellenbogen,1993], affinché gli estrogeni possano agire nel tratto riproduttivo. Al contrario, il progesterone down-regola i recettori per l’estradiolo [Brenner et al.,1974; Evans e Leavitt,1980; Laws et 38 al.,1990;West et al.,1987] e blocca molte delle azioni svolte dagli estrogeni, che generalmente agiscono come fattori mitogeni. Nell’utero, il progesterone agisce sull’endometrio come fattore di differenziazione [Cummings e Yochim,1984]. Durante la fase follicolare, gli estrogeni inducono la proliferazione delle cellule dell’endometrio, ed una elevata concentrazione di progesterone durante la fase luteale del ciclo riproduttivo inibisce la mitosi nell’endometrio [Padycula et al.,1989]. Il progesterone induce, anche, la differenziazione stromale, stimola le secrezioni ghiandolari in associazione con l’accumulo di vacuoli basali nell’epitelio ghiandolare [Maslar et al.,1986], e cambi di pattern di proteine secrete dalle cellule dell’endometrio [Maslar et al.,1986; Strinden e Shapiro,1983]. Queste proteine uterine provvedono all’ambiente che supporta lo sviluppo iniziale dell’embrione. Nell’utero, il progesterone induce la quiescenza del miometrio. Questo effetto sembra dipendere da un aumento del potenziale di riposo e dall’impedimento della propagazione dell’impulso elettrico tra le cellule del miometrio [Parkington,1983]. In aggiunta, il progesterone diminuisce l’assorbimento di calcio extracellulare, che è richiesto per la contrazione delle cellule del miometrio [Batra,1986], attraverso una down-regolazione dell’espressione dei geni che codificano per le subunità dei canali del calcio voltaggio-dipendenti [Tezuka et al.,1995]. Il progesterone previene anche le contrazioni uterine bloccando la capacità dell’estradiolo di indurre i recettori αadrenergici, la cui attivazione causa le contrazioni [Bottari et al.,1983]. Infine, anche la lunghezza del ciclo riproduttivo è governata, in parte, dal progesterone. La concentrazione ematica di progesterone è bassa durante la fase follicolare. Durante questa fase, aumenta la concentrazione di estradiolo che va ad agire sull’ipotalamo e sull’ipofisi stimolando gli impulsi a bassa ampiezza e alta frequenza dell’ormone luteinizzante LH, che conduce allo sviluppo follicolare fino all’ovulazione [Lucy et al.,1992]. Dopo l’ovulazione, quando inizia a svilupparsi il corpo luteo (CL), una elevata concentrazione di progesterone circolante limita la secrezione di LH ad impulsi a bassa frequenza e alta ampiezza provocando una sostanziale riduzione della concentrazione dell’LH. Questo effetto è il risultato dell’azione del progesterone sia sull’ipotalamo che sull’ipofisi. Il progesterone blocca la fonte del GnRH da parte dell’ipotalamo [Attardi e Happe,1986; Kasa-Vubu et al.,1992]. Nell’ipofisi, il progesterone riduce il numero dei recettori per il GnRH [Laws et al.,1990] down-regolando l’mRNA che codifica per i recettori del GnRH [Bauer-Dantoin et al.,1995]. Inoltre, il progesterone diminuisce la quantità di LH rilasciato in 39 risposta al GnRH [Janovick e Conn,1996], in parte, come risultato del ridotto numero di recettori per il GnRH nell’ipofisi. Alti livelli di progesterone provocano una diminuzione dell’espressione del gene che codifica per le subunità β sia dell’FSH [Brann et al.,1993; Digregorio e Nett,1995] che dell’LH [Brann et al.,1993] e le comuni α-subunità delle gonadotropine [Attardi et al.,1997; Brann et al.,1993; Digregorio e Nett,1995]. Questo effetto del progesterone sulla secrezione delle gonadotropine sembra essere dipendente dall’intero ambiente endocrino poiché, in qualche caso il progesterone può facilitare la fonte di gonadotropine indotte dall’estradiolo [Attardi e Happe,1986; BauerDantoin et al.,1995; Brann e Mahesh,1991; Brann et al.,1991; Krey et al.,1993]. Sviluppo del corpo luteo La fonte preovulatoria di gonadotropine induce l’ovulazione e la differenziazione delle cellule follicolari residue, che formano il corpo luteo, e iniziano a produrre progesterone. Prima di questo, l’estradiolo è lo steroide primario secreto dall’ovaio. Le cellule della granulosa e della teca del follicolo producono in maniera coordinata estrogeni [Bao e Garverick,1998; Fortune e Quirk,1988]. Le cellule della teca esprimono gli enzimi necessari per convertire il colesterolo in androgeni ma mancano degli enzimi necessari per convertire gli androgeni in estradiolo [Bao e Garverick,1998]. Al contrario, le cellule della granulosa producono progesterone, ma non sono in grado di convertire pregnenolone o progesterone in androgeni. Tuttavia, le cellule della granulosa possono convertire gli androgeni in estradiolo. Quindi gli androgeni prodotti dalle cellule della teca vengono aromatizzati ad estradiolo dalle cellule della granulosa. L’estradiolo è un importante mitogeno e stimola la divisione delle cellule della granulosa [Richards et al.,1987]. La fonte preovulatoria di LH comporta una luteinizzazione delle cellule della granulosa e della teca e altera il pathway steroidogenico in modo che il progesterone risulta essere l’ormone principale prodotto da tutte e due i tipi cellulari dopo la luteinizzazione. Tuttavia, il corpo luteo di molte specie, inclusi uomo, suini, e ratti, conserva la capacità di produrre un po’ di estradiolo [Richards e Hedin,1988; Wuttke et al.,1997; Wuttke et al.,1998]. La sintesi del progesterone è il pathway meno complesso nell’ovaio. La differenziazione in cellule capaci di produrre progesterone è accompagnata dall’aumento dell’espressione di enzimi necessari per la conversione del colesterolo in progesterone, per esempio il complesso del citocromo P-450 che 40 scinde la catena laterale del colesterolo (P-450scc) e il 3β-idrossisteroide deidrogenasi/∆5,∆4 isomerasi (3β-HSD), e dlla diminuizione dell’espressione degli enzimi che convertono il progesterone in estrogeni, per esempio il citocromo P-450 17 α-idrossilasi e il citocromo P 450 aromatasi [Bao e Garverick,1998]. Le cellule luteiniche derivate dalle cellule della teca e della granulosa danno origine a due distinti tipi di cellule luteali che differiscono sia morfologicamente che fisiologicamente. In molti mammiferi non-primati, le cellule che derivano prevalentemente dalla granulosa vengono chiamate cellule luteiniche grandi (LLC: large luteal cell), e quelle che derivano dalla teca vengono denominate cellule luteiniche piccole (SLC: small luteal cell). Il corpo luteo, oltre alle cellule steroidogeniche, contiene cellule endoteliali, fibroblasti, periciti e cellule che si originano dal circolo sanguigno [Channing,1969; Channing,1969 (a)]. Il grado di migrazione e di mescolamento delle cellule derivate dai follicoli, durante la formazione del corpo luteo, differisce tra le specie. Le cellule luteiniche derivanti dalle cellule della granulosa rimangono separate dalle cellule luteiniche derivanti dalle cellule della teca, e alcune membrane basali follicolari rimangono a formare una barriera tra le cellule granulosa-luteiniche e le cellule della teca-luteiniche [Guraya,1971]. Al contrario, il tessuto follicolare è estesamente riorganizzato durante la migrazione delle cellule della teca, dei fibroblasti, e delle cellule endoteliali durante lo sviluppo del corpo luteo nei mammiferi non primati [Niswender e Nett,1994]. In queste specie, le cellule del corpo luteo sono frammiste nella misura in cui LLC, SLC, fibroblasti e cellule endoteliali siano in prossimità l’una all’altra [Dharmarajan et al.,1985; farin et al.,1986]. La proliferazione cellulare nel corpo luteo che si sta sviluppando ha un tasso mitotico elevato che è uguale alla rapidità di crescita dei tumori [JablonkaShariff et al.,1993]. I fattori che regolano la proliferazione delle SLC e dei fibroblasti non son stati ancora ben caratterizzati, ma possono coinvolgere il fattore di crescita dei fibroblasti [Redmer e Reynolds,1996], l’ormone della crescita (GH) [Jungel et al.,1995] e l’LH [Grazul-Bilska et al.,1995]. Il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), è un fattore mitogeno specifico per le cellule endoteliali [Ferrara,1993], ed è probabilmente il principale regolatore della proliferazione delle cellule endoteliali luteiniche all’inizio del ciclo [Behrman et al.,1971]. L’LH e la gonadotropina corionica umana (hCG) inducono l’espressine di VEGF da parte dei follicoli preovulatori e dalle cellule della granulosa isolate [Garrido et 41 al.,1993; Koos,1995]; l’immunoneutralizzazione di VEGF abolisce l’attività mitogena delle cellule endoteliali nei CL in sviluppo [Doraiswamy et al.,1995]. La proliferazione delle cellule endoteliali è necessaria per la neovascolarizzazione durante lo sviluppo luteinico, da cui deriva un’estesa rete di capillari nel corpo luteo [Redmer e Reynolds,1996; Reynolds et al.,1992]. Il lume dei capillari rappresenta il 22% del volume totale del corpo luteo [Dharmarajan et al.,1985], e ciò è in accordo con l’alto tasso del flusso sanguigno, presente nel corpo luteo, che è maggiore a quello di qualunque altro tessuto. direttamente strettamente Inoltre, adiacenti vicini ai molte ai membrane capillari, capillari o delle adiacenti [Dharmarajan cellule luteiniche allo spazio et al.,1985]. sono interstiziale, Così la giustapposizione delle cellule luteiniche con i capillari provvede all’alta richiesta metabolica dei corpi lutei, i quali consumano da 2 a 6 volte più ossigeno, per unità di peso, rispetto al fegato , reni o cuore [Swann e Bruce,1987]. Pathway steroidogenico luteinico Substrati steroidogenici Il substrato per la steroidogenesi è il colesterolo. In condizioni normali la maggior parte del colesterolo è sintetizzata nel fegato [Krisans,1996] e trasportata ai tessuti steroidogenici, come la corteccia surrenale, il follicolo, il corpo luteo e i testicoli, sotto forma di lipoproteine. Le lipoproteine a bassa densità (LDL: low-density lipoprotein) e le lipoproteine ad alta densità (HDL: hight-density lipoprotein) sono le più comuni fonti di colesterolo per la produzione di ormoni steroidei da parte del corpo luteo [Hwang e Menon,1983; Ohashi et al.,1982; Pate e Condon, 1982]. In condizioni normali, la maggior parte del colesterolo, utilizzato per la steroidogenesi, è ottenuta dalla circolazione sanguigna sotto forma di LLD e HLD. L’assorbimento di LDL da parte delle cellule luteiniche avviene attraverso una endocitosi mediata da recettori [Brown e Goldstein,1986]. Una volta internalizzato, gli endosomi si combinano con i lisosomi, dove le LDL si dissociano dal recettore e questa scissione rende disponibile alle cellule il colesterolo libero. Il recettore delle LDL viene reciclato o degradato [Grummer e Carroll,1988]. L’assorbimento delle HDL extracellulari avviene attraverso il legame ad una proteina legata alla membrana plasmatica che lega le HLD, e il colesterolo è trasportato dentro la cellula da un meccanismo non ancora compreso che però 42 sembra non essere un’endocitosi mediata da recettore [Lestavel e Fruchart,1994]. Una volta che il colesterolo libero è presente all’interno del citoplasma della cellula, questo può essere utilizzato per la steroidogenesi o per la formazione delle membrane cellulari, o può essere esterificato con acidi grassi, per formare esteri del colesterolo ad opera della colesterolo estere sintasi e immagazzinato [Johnson et al.,1997]. Gli esteri del colesterolo formano spesso delle gocce lipidiche che sono state spesso utilizzate come caratteristiche morfologiche per riconoscere i tipi di cellule steroidogeniche. La colesterolo esterasi idrolizza gli esteri del colesterolo immagazzinati e libera il colesterolo per essere utilizzato dalle cellule. Questo è uno dei primi step della steroidogenesi che viene estremamente controllato dai pathways de secondi messaggeri. La colesterolo esterasi è attivata dalla fosforilazione ad opera della proteinchinasi A (PKA) [Caffrey et al.,1979; Pittman et al.,1975; Trzeciak e Boyd,1974]. Trasporto del colesterolo La sintesi di tutti gli steroidi è dipendente dal trasporto del colesterolo ai mitocondri e poi dalla membrana mitocondriale più esterna a quella più interna dove il complesso enzimatico che taglia le catene laterali del colesterolo per formare pregnolone [Stone e Hechter,1954]. Il primo step di questo processo, cioè il trasporto alla membrana mitocondriale esterna, sembra richiedere un citoscheletro intatto, dal momento che gli inibitori delle funzioni sia dei microtuboli che dei microfilamenti [Crivello e Jefcoate,1978] prevengono l’accumulo mitocondriale del colesterolo. Lo stato di fosforilazione delle proteine del citoscheletro probabilmente influenza il tasso di trasporto del colesterolo. Le proteine che legano gli steroli sembrano avere, anche, un ruolo nel trasporto del colesterolo ai mitocondri [Ikonen,1997; Scallen et al.,1985]. La stimolazione della steroidogenesi da parte degli ormoni trofici che aumentano il trasporto di colesterolo ai mitocondri, che sembra essere un processo complicato che non può essere spiegato dalla semplice diffusione del colesterolo attraverso il citoplasma. Lo step limitante, nel pathway steroidogenico, sembra essere il trasporto di colesterolo dalla membrana mitocondriale esterna a quella interna [Stevens et al.,1993]. Questo step sembra essere il principale punto di regolazione, sia positivo che negativo, della steroidogenesi attraverso il sistema dei secondi messaggeri [Simpson e Waterman,1983]. Da tempo è noto che la stimolazione del pathway steroidogenico da parte degli ormoni trofici , richiede la sintesi di 43 una proteina con un emivita molto breve. La fosforilazione di questa proteina è associata all’aumento della secrezione degli steroidi [Epstein et al.,1991; Pon et al.,1986]. Questa proteina, chiamata StAR (steroidogenic acute regulatory protein), viene tagliata in due forme, una acida e una basica, durante l’inserzione nella membrana mitocondriale. È stato ipotizzato che è proprio durante l’inserzione di questa proteina, nella membrana mitocondriale, che il colesterolo viene trasportato verso il complesso enzimatico, che taglia la catena laterale del colesterolo, per formare il pregnolone [Waterman,1995]. Conversione del colesterolo a progesterone Una volta che il colesterolo viene trasportato alla matrice mitocondriale, l’azione del P-450scc, adrenodossina e l’adrenodossina riduttasi tagliano la catena laterale del colesterolo per formare pregnolone [Stone e Hechter,1954]. Il pregnolone viene poi trasportato al reticolo endoplasmatico liscio, che è generalmente associato ai mitocondri, dove la 3β-HSD converte il pregnolone in progesterone [Hanukoglu,1992]. Regolazione trofica delle funzioni luteali Gli ormoni luteotrofici sono quelli che supportano la crescita e/o le funzioni dei corpi lutei. Durante la normale fase luteale, il corpo luteo aumenta le proprie dimensioni e la capacità di secernere progesterone. Una volta che il corpo luteo ha ottenuto una dimensione matura, e ha raggiunto il suo massimo potenziale di secrezione del progesterone, le funzioni luteali vengono mantenute da pochi a molti giorni, a seconda della specie, e poi se l’animale non diviene gravido, deve avvenire la regressione del corpo luteo per permettere una nuova ovulazione e quindi un’altra occasione per una gravidanza. La concentrazione di progesterone nel plasma dipende dalla quantità di tessuto steroidogenico, dal flusso sanguigno, e dalla capacità del tessuto steroidogenico di sintetizzare il progesterone. La quantità di tessuto steroidogenico è dipendente dal numero e dalla dimensione delle cellule luteiniche steroidogeniche, che aumentano entrambe durante lo sviluppo luteinico. Aumenta, anche, il flusso sanguigno nel corpo luteo, e di conseguenza aumenta la concentrazione di progesterone circolante. Gli ormoni che supportano la crescita e/o le funzioni del corpo luteo vengono chiamati luteotropici e includono: l’LH, il GH, la prolattina, fattore di crescita 44 insulina-simile (IGF-I: insulin-like growth factor), l’ossitocina, la prostaglandina E2 (PGE2) e la prostaglandina I2 (PGI2). Sviluppo luteinico L’importanza degli ormoni secreti dall’ipofisi per un normale sviluppo e funzionamento del CL [Astwood,1941;Denamur e è stata dimostrata Martinet,1973;Farin et in molte specie al.,1990;Hutchinson e Zeleznik,1984;Snook et al.,1969; Spies et al.,1967;Vande Wiele et al.,1970]. Se viene rimossa l’ipofisi al 5° giorno del ciclo estrale, nella pecora, il corpo luteo smette di accrescere il suo peso, e la concentrazione del progesterone nel siero rimane o agli stessi livelli osservati al 5° o al di sotto [Farin et al.,1990;Juengel et al, 1995]. Questa perdita di peso luteinico, se comparata con animali intatti, è associata con una diminuzione del numero delle SLC e dei fibroblasti e ad una diminuzione della grandezza delle cellule luteiniche steroidogeniche sia piccole che grandi [Farin et al.,1990]. La diminuzione della concentrazione di progesterone nel plasma non sembra essere associata con la diminuzione dell’assunzione di lipoproteine intesa come concentrazione di mRNA che codifica sia per i recettori delle LDL che di quello che codifica per le proteine che legano l’HDL (BP), e presumibilmente le loro proteine non diminuiscono [Tandeski et al.,1996]. Tuttavia, la rimozione dell’ipofisi è seguita da una riduzione dei livelli di mRNA che codifica per le proteine steroidogeniche StAR, P-450ssc e 3β-HSD [Juengel et al.,1995 (a); Juengel et al.,1995]. La diminuzione del numero e della grandezza delle cellule steroidogeniche e la diminuzione della capacità di sintetizzare progesterone da parte delle cellule steroidogeniche, ha come conseguenza che il corpo luteo ha una ridotta capacità di secernere il progesterone. L’ipofisectomia rimuove tutti gli ormoni dalla circolazione; tuttavia, negli ovini, la somministrazione fisiologica di LH e GH è sufficiente a supportare il normale sviluppo del corpo luteo. Dopo che il corpo luteo si è formato, la rimozione dell’ipofisi provoca la regressione del CL [Denamur,1966; Denamur et al.,1973;Haworth,1997]. Ruolo degli estrogeni nelle funzioni luteiniche In alcune specie come coniglio, ratto, e suini, gli estrogeni sono luteotropi. Tuttavia, l’entità della dipendenza del corpo luteo dall’estradiolo, come supporto, varia in queste specie. 45 Nel coniglio, la rimozione dell’estradiolo provoca l’arresto della secrezione del progesterone, quindi, l’estradiolo viene considerato il principale ormone luteotropo. In questa specie l’LH svolge un ruolo secondario, ed è quello di stimolare la sintesi di estradiolo da parte dei follicoli [Holt,1989]. Allo stesso modo, nei ratti, l’estradiolo sembra essere direttamente coinvolto nella stimolazione della secrezione del progesterone. Tuttavia, nei ratti, sia LH che la prolattina sono necessari per mantenere la funzionalità del corpo luteo, ma il loro ruolo è comunque secondario. La prolattina è essenziale per mantenere l’espressione dei recettori dell’estradiolo e dell’LH nel corpo luteo [Gibori et al.,1988]. Sia nei ratti che nel coniglio, gli estrogeni stimolano anche, direttamente o indirettamente, l’ipertrofia delle cellule luteiniche durante la gravidanza [Gibori et al.,1988; Holt,1989]. Nei suini il ruolo degli estrogeni è meno definito. L’impianto di capsule contenenti estradiolo, nei corpi lutei provoca la crescita dei CL e l’aumento della secrezione del progesterone [Conley e Ford,1989]. Inoltre, l’estradiolo riduce la secrezione di prostaglandina 2α (PGF2α) da parte dell’utero, prevenendo, in questo modo la luteolisi [Ford et al.,1982]. Un altro potenziale meccanismo attraverso il quale gli ormoni luteotropi sono in grado di supportare le funzioni luteiniche è attraverso la diminuizione l’espressione dei recettori per l’ormone luteolitico PGF2α. Tuttavia, LH sembra up-regolare l’espressione dell’mRNA che codifica per i recettori della PGF2α [Juengel et al.,1996; Tsai et al.,1996], e l’ipofisectomia , durante la fase luteale intermedia, non ha effetto sulla concentrazione luteinica di questo mRNA [Haworth,1997]. Perciò, gli ormoni luteotropi non supportano le funzioni luteiniche attraverso la soppressione dell’espressione dei recettori per la PGF2α. Controllo della secrezione di progesterone Le SLC e le LLC differiscono per la loro capacità di secrezione del progesterone, e le LLC producono da 2 a 40 volte più progesterone delle SLC non stimolate. I due tipi cellulari differiscono anche nella loro risposta a differenti stimoli ormonali e/o dai secondi messaggeri [Niswender e Nett,1994]. Effetto dell’LH sulla secrezione del progesterone Nelle ovini [Hoyer et al.,1984;Rodgers et al.,1983], nei bovini [Alila et al.,1988], nei suini [Tekpetey e Armstrong,1991], una concentrazione fisiologica di LH aumenta la secrezione di progesterone da parte delle SLC, ma non da LLC. Tuttavia, è stato dimostrato che negli ovini e nelle bovini, entrambi 46 tipi cellulari esprimono i recettori per l’LH [Chegini et al.,1991;Harrison et al.,1987]. Nei tessuti o nelle cellule luteiniche negli ovini e nei bovini, il legame dell’LH ai suoi recettori attiva l’adenilato ciclasi, e ciò conduce all’aumento della concentrazione dell’AMP ciclico e infine all’attivazione della PKA [Davis et al.,1996; Hoyer et al.,1984; Marsh,1976]. L’attivazione della PKA nelle SLC aumenta lievemente il rilascio di colesterolo dagli esteri del colesterolo [Wiltbank et al.,1993] ma non influenza la concentrazione dell’mRNA o l’attività del P-450ssc o del 3β-HSD [Belfiore et al., 1994; Wiltbank et al.,1993]. Il modesto incremento dell’attività della colesterolo esterasi non è sufficiente a provocare l’aumento da 5 a 20 volte della secrezione di progesterone osservata dopo il trattamento delle SLC con LH [Wiltbank et al.,1993]. Quindi, l’effetto steroidogenico del’LH non sembra essere modulato dai cambiamenti dei tre enzimi steroidogenici coinvolti nella biosintesi del progesterone. Pertanto è stato ipotizato che l’LH aumenta la produzione degli steroidi facilitando il trasporto del colesterolo attraverso le cellule in prossimità del complesso enzimatico P-450ssc [Wiltbank et al.,1993]. Effetto stimolatore delle prostaglandine sulla secrezione di progesterone È stato supposto che le prostaglandine della serie E e I possono essere importanti per le normali funzioni luteiniche [Hansel et al.,1991; Milvae e Hansel, 1980; Milvae e Hansel,1983]. Queste prostaglandine sono prodotte in maggior quantità durante la fase luteale precoce rispetto alla fase luteinica tardiva, e quindi è stato proposto che queste prostaglandine possano avere un ruolo nello sviluppo dell CL [Milvae e Hansel,1983]. Forti evidenze supportano un ruolo per la PGI2 nello sviluppo del corpo luteo [Homeida e El-Eknah,1992]. La somministrazione di PGI2 al tessuto luteinico dei bovini, ovini incrementa la secrezione del progesterone [Alila et al., 1988; Bennegard et al.,1990; Fitz, Hoyer et al.,1984; Fitz et al.,1984; Milvae e Hansel,1980]. È stato mostrato che anche la prostaglandina E2 incrementa la produzione di progesterone nelle cellule luteali dei bovini e degli ovini [Alila et al.,1988; Fitz, Hoyer et al.,1984; Fitz et al.,1984; Shelton et a.,1990]. Meccanismo attraverso il quale gli ormoni luteotropi incrementano la produzione di progesterone da parte delle cellule luteiniche Nelle SLC di molte specie, e nelle LLC dei ratti e dei primati non umani, gli ormoni luteotropi, come l’LH e la PGI2, incrementano, di molto, la sintesi del progesterone attraverso l’attivazione della PKA. L’attivazione della PKA probabilmente stimola il progesterone, attraverso l’aumento del trasporto del 47 colesterolo verso il complesso enzimatico P-450ssc [Wiltbank et al.,1993]. Al contrario, nelle LLC degli ovini, suini, bovini, l’aumento della sintesi di progesterone, in risposta alle luteotropine come PGI2,PGE2, GH e IGF-I, non è provocata dall’attivazione della PKA [Hoyer et al.,1984]. Luteolisi La luteolisi viene definita come la lisi o la morte strutturale del corpo luteo. Durante la luteolisi avvengono due eventi correlati: all’inizio c’è una perdita della capacità di sintetizzare e secernere progesterone [McGuire et al.,1994] seguita, poi, dalla perdita delle cellule che compongono il corpo luteo [Knickerbocker et al.,1988; Pate,1994]. In molte specie di mammiferi la luteolisi è dipendente dalla presenza dell’utero. L’isterectomia nelle giovenche [Anderson et al.,1961;Malven e Hansel,1964;Wiltbank e Casida,1956], negli ovini [Wiltbank e Casida,1956], nei suini [Anderson et al.,1961] e in altre specie di mammiferi provoca una luteolisi ritardata. Tuttavia, l’isterectomia nei primati non ritarda la luteolisi. La prostaglandina 2α (PGF2α) è il fattore che, prodotto dall’utero, inizia la luteolisi [Hansel et al.,1973; McCracken et al.,1970] in molte specie di non primati. Per alcune specie è stato ipotizzato che la PGF2α entra nell’arteria ovarica dalla vena utero-ovarica, attraverso un meccanismo di scambio contro-corrente [Ginther,1974]. Questo permette alla PGF2α di viaggiare nell’arteria ovarica senza entrare nella circolazione polmonare, dove verrebbe inattivata dagli enzimi presenti nei polmoni [Piper et al.,1970]. Durante la regressione luteale, l’iniziale diminuzione della concentrazione plasmatica di progesterone, sembra non essere dovuta alla perdita delle cellule luteiniche steroidogeniche. Infatti è stato visto che il numero delle cellule luteiniche diminuisce in seguito alla riduzione della concentrazione plasmatica di progesterone [Braden et al.,1988]. La diminuzione della secrezione di progesterone è, molto probabilmente, dovuta alla diminuzione del flusso di sangue luteinico e alla diminuzione della capacità steroidogenica delle singole cellule luteiniche. È stato proposto che l’estradiolo, proveniente dai follicoli in sviluppo, provoca il rilascio della ossitocina ipofisaria, che a sua volta stimola il rilascio di piccole quantità di PGF2α dall’utero [Fairclough et al.,1980]. In seguito la PGF2α inizia un loop di feebak positivo che coinvolge il rilascio supplementare 48 di ossitocina luteinica e di PGF2α sia di origine luteinica [Tsai et al.,1997] che uterina [Silvia et al.,1991]. È stato, recentemente, proposto che il rilascio di PGF2α da parte del corpo luteo amplifica il segnale luteolitico in maniera autocrina e paracrina [Olofsson et al.,1992, Tsai e Wiltbank,1997; Tsai e Wiltbank,1998]. Flusso sanguigno e cambiamenti vascolari La PGF2α riduce il flusso sanguigno nel CL e questo può causare la luteolisi privando la ghiandola dei nutrienti, dei substrati per la steroidogenesi e dei supporti luteotropi [Phariss et al.,1970]. La somministrazione di PGF2α agli ovini riduce il flusso sanguigno nel corpo luteo e parallelamente diminuiscela secrezione di progesterone [Nett et al.,1976; Niswender et al.,1973]. Poiché le cellule endoteliali esprimono i recettori per la PGF2α [Mamluk et al.,1998], la PGF2α, probabilmente, agisce direttamente su questa popolazione cellulare. La PGF2α causa la degenerazione delle cellule endoteliali del corpo luteo [O’Schea et al.,1977; Sawyer et al.,1990], e ciò provoca una marcata riduzione della densità dei capillari [Azmi e O’Shea,1984; Braden et al.,1988; Nett et al.,1976], in tal modo riducendo il flusso sanguigno nel parenchima luteinico. Sembra che anche bassi livelli di PGF2α possono indurre l’apoptosi nelle cellule endoteliali dei capillari luteinici. Recentemente l’endotelina-1 è stata indicata come possibile mediatore degli effetti della PGF2α sul flusso sanguigno nel CL [Girsh,Milvae et al., 1996; Girsh,Wang et al 1996]. La PGF2α stimola le cellule endoteliali del CL a produrre endotelina-1 in vitro [Girsh,Wang et al 1996] e in vivo [Ohtani et al.,1998]. Inoltre, per la sua potente attività vasocostrittrice, l’endotelina-1 inibisce l’attività steroidogenica delle cellule steroidogeniche del CL [Girsh,Wang et al 1996]. Inoltre, l’endotelina-1 può ridurre il flusso sanguigno durante l’inizio della luteolisi, causando una la costrizione delle arteriole [Ohtani et al.,1988] e provocando così ipossia, che può causare il rilascio addizionale di endotelina-1 [Rakugi et al.,1990]. Le proprietà antiluteolitiche delle PGE2 possono, in parte, attenuare l’azione vasocostrittrice dell’endotelina-1 [Silldorff et al.,1995]. Cambiamenti morfologici La PGF2α stimola una straordinaria serie di cambiamenti morfologici. La proporzione delle cellule luteiniche steroidogeniche, che compongono il CL, 49 diminuisce, entro le 24 ore, negli ovini trattate con la PGF2α durante la fase luteale media [Braden et al.,1988]. Il numero delle cellule che può essere raccolto da Cl dispersi enzimaticamente diminuisce, e questo calo precede la riduzione del numero delle SLC [Braden et al.,1988]. Allo steso tempo si verifica anche una riduzione della grandezza delle LLC [Braden et al.,1988; Gemmell et al.,1976]. I cambiamenti morfologici, sia nelle LLC che nelle SLC, non divengono evidenti fino a 24-36 ore dopo l’esposizione alla PGF2α [Sawyer et al.,1990], tuttavia, in questo periodo, la capacità steroidogenica delle cellule è marcatamente ridotta. È interessante notare che le cellule endoteliali, nei capillari dei CL degli ovini trattate con la PGF2α, sono la prima popolazione di cellule che esibiscono drammatici cambi morfologici [Sawyer et al.,1990] indicativi dell’apoptosi [Kerr et al.,1972]. Si sospetta che la degenerazione delle cellule endoteliali sia un effetto diretto della PGF2α, ma non è stato ancora provato. Segnali intracellulari La PGF2α agisce attraverso il suo legame a specifici recettori localizzati sulle LLC [Fitz et al.,1982; Juengel et al.,1996]. Questi recettori appartengono alla famiglia dei recettori, caratterizzati da sette domini transmembrana, accoppiati alle proteine G [Abramovitz et al.,1994; Grave set al.,1995; Sakamoto et al.,1994; Sugimoto et al.,1994]. Dopo il legame al recettore ad alta affinità, la PGF2α induce l’attivazione delle fosfolipasi C (PLC) legate alla membrana [Berridge e Irvine,1984], attraverso la stimolazione delle proteine G [Miwa et al.,1990]. La PLC catalizza l’idrolisi del fosfstidilinositolo-4,5-difosfato a inositolo-1,4,5trifosfato (IP3) [Davis et al.,1988] e a 1,2-diacilglicerolo (DAG) [Berridge e Irvine,1984]. L’aumento della concentrazione citosolica di IP3, induce il rilascio di Ca2+ dal reticolo endoplasmatico liscio al compartimento citoplasmatico [Berridge e Irvine,1984]. L’aumento di Ca2+ libero e di DAG (localizzato nella membrana plasmatica) stimola l’attività catalitica della protein chinasi Ca2+ dipendente (PKC, anch’essa localizzata nella membrana plasmatica) [Nishizuka,1987]. Si pensa che la PKC medi molte delle azioni antisteroidogeniche della PGF2α nelle LLC [McGuire et al.,1994; Wiltbank et al.,1990; Wiltbank et al.,1991]. L’accumulo, di Ca2+ derivato dai microsomi e di origine extracellulare, indotto dalla PGF2α, aumenta l’attività catalitica della PKC. Si pensa che 50 l’attivazione della PKC nelle LLC provochi una modificazione post-traduzionali delle proteine cellulari coinvolte nella steroidogenesi [McGuire et al.,1994; Wiltbank et al.,1990], nella disponibilità di colesterolo [Behrmanet al.,1971], e nel mantenimento della matrice extracellulare [Wojtowicz-Praga et al.,1997; Lum e Malik, 1996]. L’attivazione della PKC induce l’espressione e l’attivazione di proteine coinvolte nell’apoptosi in altri tipi cellulari [Schwartzman e Cidlowski,1993]. È possibile che l’attivazione della PKC favorisca l’apoptosi nelle LLC. PGF2α di origine luteinica La PGF2α può essere sintetizzata dai CL nelle donne [Mitchell et al.,1991], nelle scrofe [Guthrie et al.,1978], negli ovini [Rexroad e Guthrie,1979;Tsai e Wiltbank,1997] nei bovini [Pate,1988], e nei roditori [Olofsson et al.,1992]. Durante la fase luteale tardiva del ciclo estrale, la PGF2α, proveniente da fonti periferiche, può stimolare la sintesi della PGF2α nei corpi lutei degli ovini [Tsai e Wiltbank,1997]. È stato proposto che la PGF2α, prodotta localmente nel CL, agisca attraverso un meccanismo che, per via paracrina e/o autocrina, induce l’apoptosi [Auletta e Flint,1988].La PGF2α e la PGE2 sono sintetizzate utilizzando i fosfolipidi di membrana come substrato in una serie di reazioni caratterizzate da tre step chiamati pathways della ciclo ossigenasi. La fosfolipasi A2 e la fosfolipasi C, localizzate nella membrana plasmatica, idrolizzano i fosfolipidi di membrana, liberando acido arachidonico che può essere utilizzato come substrato per la sintesi della PGF2α [Kaneko et al.,1993]. La cicloossigenasi (prostaglandine G/H sintasi) catalizza lo step tasso-limitante nella biosintesi delle prostaglandine, che è la conversione dell’acido arachidonico in PGH2 [Dewitt e Smith,1995]. In fine la PGH2 è rapidamente convertita in PGF2α dalla prostaglandina F sintasi [Watanabe et al.,1985]. Le fosfolipasi A2 e C esibiscono un aumento della loro attività in presenza di elevate concentrazioni di Ca2+ libero intracellulare [Abdel-Latif,1986; Flower e Blackwell, 1976]. La PGF2α down-regola l’mRNA che codifica per la cicloossigenasi nei CL di bovini, durante le prime fasi del ciclo estrale [Tsai e Wiltbank,1998]. Questo periodo coincide con l’intervallo di tempo in cui la PGF2α non è in grado di causare la luteolisi, suggerendo che la sintesi locale di PGF2α potrebbe essere importante in questo processo. 51 Queste osservazioni supportano l’ipotesi che la PGF2α può autoregolare la propria sintesi mediante stimolazione della liberazione di acido arachidonico attraverso l’idrolisi dei fosfolipidi di membrana, e ciò provoca: 1) che il recettore della PGF2α legato alle proteine G, attiva la fosfolipasi C, e la conseguente conversione dell’acido arachidonico in PGH2, e 2) l’aumento di Ca2+ citosolico. La disponibilità di acido arachidonico e l’attività della cicloossigenasi, le quali determinano la capacità cellulare di sintetizzare le prostaglandine, vengono entrambe incrementate nel CL, in risposta alla PGF2α. La PGF2α provoca l’inibizione della sintesi di progesterone La prostaglandina 2α diminuisce la sintesi di progesterone nel CL nei bovini, negli ovini, nei suini,nei primati, e nei ratti e conigli pseudogravidi/ gravidi in vivo [Niswender e Nett,1994]. Se alle cellule luteiniche, dalla fase intermedia alla fase tardiva luteale, vengono fornite lipoproteine come fonte di colesterolo per aumentare la secrezione di progesterone, il trattamento con la PGF2α provoca un diminuzione della sintesi e della secrezione di progesterone [Fitz et al.,1993; Pate e Condon,1989; Pitzel et al.,1993;Wiltbank et al.,1991;Yuan et al.,1993]. Probabilmente ci sono molteplici meccanismi attraverso i quali la PGF2α riduce la sintesi di progesterone; tuttavia, dal momento che la PGF2α riduce la secrezione di progesterone nelle LLC provenienti da preparazioni purificate di corpi lutei sia bovini che ovini [Wiltbank et al.,1991], è chiaro che la PGF2α influenza direttamente queste cellule. La prostaglandina 2α può diminuire la sintesi di progesterone attraverso molti meccanismi intracellulari compresi: Effetti della PGF2α sui recettori per gli ormoni luteotropi Dal momento che il tasso di sintesi del progesterone è dipendente dagli ormoni luteotropi, la PGF2α potrebbe ridurre la capacità del corpo luteo di rispondere a questi ormoni. Il trattamento con PGF2α, negli ovini, provoca una rapida diminuzione dei livelli d mRNA che codificano per i recettori dell’LH [Guy et al.,1995;Smith et al.,1996]. Questa riduzione dei livelli di mRNA, che codifica per il recettore dell’LH, sembra essere preceduta da una riduzione del legame dell’LH alle membrane luteiniche [Diekman et al.,1978]. 52 La down-regolazione dei recettori per gli ormoni luteotropi non sembra essere il meccanismo attraverso il quale la PGF2α provoca la diminuzione della secrezione di progesterone da parte del CL. La PGF2α potrebbe interferire con la capacità dell’LH di attivare la PKA, così come l’attività dell’adenilato ciclasi diminuisce dopo la somministrazione della PGF2α. La PGF2α può ridurre l’attività della PKA aumentando la degradazione del cAMP, che causa un aumento dell’attività della fosfodiesterasi [Agudo et al.,1984;Garverick et al.,1985]. Inoltre, se la PKA è attivata costitutivamente nelle LLC, come è stato suggerito, la capacità della PGF2α di sopprimere l’attività della PKA può condurre alla diminuzione della secrezione di progesterone da parte delle LLC. Effetti della PGF2α sull’utilizzo delle lipoproteine e sul rilascio di colesterolo Se gli effetti antisteroidogenici della PGF2α vengono mediati dalla regolazione dell’assunzione delle lipoproteine o dallo stoccaggio e dal rilascio di colesterolo, ci si aspetterebbe una riduzione dei recettori delle lipoproteine e/o dell’attività della colesterolo esterasi. In vivo, la PGF2α provoca la diminuzione della concentrazione luteinica dell’mRNA che codifica per il recettore delle LDL [Rodgers et al.,1987; Tandesski et al.,1996], ma aumenta i livelli dell’mRNA che codifica per le proteine che legano le HDL [Tandesski et al.,1996]. Sembra che la PGF2α non regoli l’utilizzo del colesterolo da fonti extracellulari. Tuttavia, l’attività della colesterolo esterasi non viene colpita dal trattamento con la PGF2α nelle LLC degli ovini [Wiltbank et al.,1993]. Eventi immunomediati Ci sono notevoli evidenze a sostegno del ruolo critico svolto dal sistema immunitario nel processo della luteolisi. I leucociti infiltrano il corpo luteo durante la luteolisi [Brännstrom e Norman,1993;Murdoch et al.,1988]. Gli eosinofili, come i macrofagi, si accumulano nel CL in regressione, prima che la concentrazione di progesterone nel plasma inizi a diminuire in risposta ad un fattore chemiotassico, non ancora identificato [Murdoch,1987]. Tuttavia, gli eosinofili non sono richiesti per far progredire la regressione del CL indotta dalla PGF2α [Murdoch e Steadman,1988]. Il ruolo principale dei macrofagi, durante la regressione del CL, sembra essere di fagocitare le cellule luteiniche degenerate [Adams e Hertig,1969;Bulmer,1964; Paavola,1979;Pepperell et al.,1992] e degradare la matrice extracellulare [Parker,1991; Tscheshe et al.,1986]. I macrofagi svolgono tre funzioni durante le prime fasi della luteolisi: 53 1. fagocitano le cellule luteiniche degenerate; 2. inibiscono la steroidogenesi mediata dalle citochine; 3. stimolano la secrezione di PGF2α da parte del CL. Durante la luteolisi i linfociti T invadono il CL e secernono l’interferone γ (INF-γ), che stimola la presentazione degli antigeni al complesso maggiore di istocompatibilità sulla superficie delle cellule luteiniche [Fairchild e Pate,1989]. L’interleuchina-1 (IL-1), prodotta dai macrofagi, dai fibroblasti e dalle cellule endoteliali [Paavola,1979], stimola la produzione di PGF2α nelle colture di cellule luteiniche bovine [Nothnick e Pate,1990]. Inoltre, il fattore necrotico tumorale α (TFN-α), prodotto dai macrofagi, inibisce la secrezione basale di progesterone, e stimola la secrezione di PGF2α [Fairchild-Benyo e Pate,1992]. L’attrazione e l’infiltrazione dei leucociti nel parenchima luteinico, provoca un aumento della produzione locale di citochine (in particolare di IL-1,di TNF-α, e di IFN-γ), che stimolano, in fine , la sintesi di PGF2α da parte del CL e attivano i macrofagi. In sintesi, le cellule immunitarie e le citochine, sembrano avere un ruolo nella luteolisi, regolando la sintesi della PGF2α, la steroidogenesi e la fagocitosi. Apoptosi L’apoptosi [Martin et al.,1994;Schwartzman e Cidlowski,1993] è un processo attivo attraverso il quale vengono eliminate popolazioni di cellule non essenziali dagli stessi tessuti [Kerr et al.,1972]. Diversi cambiamenti, sia morfologici che biochimici, sono caratteristici delle cellule apoptotiche, inclusi: la frammentazione nucleare, la comparsa di vescicole legate alla membrana che contengono citoplasma, la frammentazione del DNA genomico e cambiamenti nell’espressione genica. L’involuzione di alcune ghiandole endocrine, dopo la rimozione del supporto o dell’attivazione degli ormoni trofici, attraverso uno stimolo negativo, è realizzata attraverso l’apoptosi. Le cellule della granulosa, private dell’FSH, vanno incontro al processo apoptotico durante l’atresia follicolare [Hurwitz e Adashi,1992; Tilly,1997]. La PGF2α promuove l’apoptosi nelle cellule, compreso il corpo luteo [Sawyer et al.,1990]. Le prime evidenze morfologiche che la cellula è apoptotica sono la comparsa di frammenti nucleari che contengono la cromatina degenerata [Sawyer et al.,1990], la riduzione del volume cellulare e la comparsa di frazioni 54 citoplasmatiche legate alla membrana [Kerr et al.,1972]. Questi frammenti cellulari, o corpi apoptotici, sono bersagli per le cellule fagocitotiche del sistema immunitario. I macrofagi aumentano il processo apoptotico nelle popolazioni di cellule luteiniche attraverso la fagocitosi dei frammenti di queste cellule che vengono avvolte da vescicole di membrana [Gemmell et al.,1976]. Un altro caratteristico comportamento dell’apoptosi è il taglio nucleosomale del DNA genomico in frammenti di circa 185 bp (oligonucleosomi) [Arends et al.,1990]. Le prove per un ruolo della PGF2α nell’apoptosi delle cellule luteiniche, sono la comparsa degli oligonucleosomi, in risposta al trattamento con la PGF2α, nei bovini [Juengel et al.,1993;Zheng et al.,1994], negli ovini [McGuire et al.,1994;Rueda et al.,1995], negli uomini [Shikone et al.,1996], nei ratti [Matsuyama et al.,1996] e nei suini [Bacci et al.,1996]. Recentemente si è sviluppato un crescente interesse intorno ai geni (famiglia delle bcl-2) coinvolti nella regolazione dell’apoptosi [Martin e Green,1995; Reed,1994; Korsmeyer,1995]. La prima proteina identificata che regola l’apoptosi è bcl-2 (B cell lymphoma 2)[Korsmeyer,1992]. Bcl-2, associata alla membrana, previene la morte cellulare regolando il mantenimento del meccanismo omeostatico del Ca2+ [Baffy et al.,1993], attenuando lo stress ossidativo [Hockenberry et al.,1993], e interagendo con ras [Fernandez e Bischoff,1993] e bax [Kosmeyer,1995]. Bax (bcl-2 associated-gene-x) promuove l’apoptosi legandosi con bcl-2, e impedendole, così, di svolgere le sue funzioni antiapoptotiche [Oltvai et al.,1993] e promuovendo direttamente l’apoptosi [Kosmeyer,1995]. La proporzione tra bcl-2 e bax, nella cellula, è relazionata con il potenziale che ha questa cellula di divenire apoptotica. La proteina nucleare p53 stimola la morte cellulare attraverso l’apoptosi incrementando il tasso di trascrizione del gene bax [Miyashita et al.,1994; Miyashita e Reed,1995], il quale reprime la trascrizione di bcl-2 [Kosmeyer,1995]. Sono stati identificati due omologhi di bcl-2, rispettivamente: bcl-xl e bcl-xs, prodotte dallo splicing alternativo del gene bcl-x [Boise et al.,1993]. Bcl-xl funziona come repressore dell’apoptosi (azione simile a bcl-2) mentre bcl-xs mima l’azione di bax [Boise et al.,1993]. Durante la luteolisi nei bovini, l’mRNA che codifica per bax è elevata, mentre l’mRNA che codifica per bcl-2rimane invariato [Rueda et al.,1997]; da ciò risulta un incremento del rapporto tra bax e bcl-2, una situazione che provoca l’apoptosi mediata da bax. Rimane ancora sconosciuto se l’aumento della 55 trascrizione dell’mRNA di bax sia mediato da p53. I livelli dell’mRNA di p53 non aumentano durante la luteolisi [Rueda et al.,1997;Trott et al.,1997], tuttavia l’attività di p53 può essere regolata principalmente a livello post-traduzionale [Zambetti e Levine,1993]. Stress ossidativo Le specie reattive dell’ossigeno sono integralmente coinvolte nella luteolisi e nell’apoptosi [Carlson et al.,1993;Riley e Behrman,1991]. Gli anioni superossidi, i radicali idrossilici e il perossido d’idrogeno (H2O2) sono le specie reattive dell’ossigeno prodotte principalmente nelle cellule steroidogeniche [Hornsby e Crivello,1983 (a); Hornsby e Crivello,1983]. Durante la luteolisi si assiste ad un incremento dello stress ossidativo e sembra che siano i macrofagi i principali artefici di questo aumento [Simpson et al.,1987]. 56 Scopo I La coniglia è un animale poliestrale ad ovulazione indotta dall’accoppiamento o da trattamenti ormonali. Se all’ovulazione non si associano la fecondazione e la fertilizzazione, nella coniglia, si instaura una fase di pseudogravidanza, che si prolunga per un periodo di 15-18 giorni, al termine dei quali si ha la regressione del CL. Il ruolo dei fattori luteolitici nella coniglia è di estrema importanza, poiché, riducendo la lunghezza della pseudogravidanza, acquisisce una capacità riproduttiva molto elevata che le consente di riprodursi durante tutto l’arco dell’anno senza periodi di anestro. Ridurre i periodi di interparto è determinante a livello zootecnico e a fini economici. Nel coniglio la regressione del CL è indotta dalla PGF2α di origine uterina. Da precedenti studi, effettuati nei nostri laboratori, si è appreso che i CL divengono sensibili all’azione luteolitica della PGF2α solo dopo alcuni giorni dall’ovulazione. Per quanto riguarda le coniglie, l’aumento della sensibilità alla PGF2α è direttamente proporzionale alla maturità dei CL. Si è visto che i corpi lutei sono refrattari (o quasi) al trattamento con la PGF2α quando si trovano tra il 3° e il 5° giorno di pseudogravidanza, mentre la sensibilità al trattamento aumenta proporzionalmente all’età dei CL, fino a divenirne completamente sensibili dal 9° giorno di pseudogravidanza [Boiti et al., 1998]. Tuttavia, come avviene anche in altre specie [Diaz e Wiltbank, 2005; Tsai e Wiltbank, 1998], il CL delle coniglie non è completamente refrattario al trattamento con la PGF2α durante le fasi iniziali del suo sviluppo, ma anche se avvengono molti cambiamenti a livello molecolare e genetico la capacità steroidogenica dei CL non risulta compromessa [Boiti et al., 2007; Zerani et al., 2007]. Ancora, però, non si conoscono quali fattori sono attivati dalla PGF2α per promuovere la regressione luteinica. La regressione dei corpi lutei mediante il pathway apoptotico è stata dimostrata in diverse specie [Sugino e Okuda,2007;Dharmarajan et al.,2004; Nicosia et al.,1995]. L’obiettivo di questo studio è stato indagare se questa diversa sensibilità alla PGF2α sia dovuta a meccanismi apoptotici o infiammatori o ad entrambi, andando a confrontare gli effetti del trattamento della PGFα sull’espressione di geni target per il processo apoptotico e del processo infiammatorio (IL-1β), in CL nella fase luteinica precoce (4 giorni) e intermedia (9 giorni), al fine anche di capire meglio, quali sono i meccanismi che proteggono i CL dalla regressione, durante la fase iniziale del suo sviluppo. Inoltre, dal momento che 57 molte evidenze sperimentali hanno dimostrato che il 17β- estradiolo esercita azioni sia luteotrofiche che luteolitiche, a seconda delle specie, attraverso regolazione genica mediata dal suo recettore ER [Schams e Berisha, 2001], siamo andati a studiare se il trattamento con la PGF2α sia in grado di influenzare l’espressione genica di ERα, che è l’isoforma predominante nell’ovaio di coniglio. L’ormone rilasciante le gonadotropine (GnRH) è un decapeptide secreto dall’ipotalamo che svolge un ruolo centrale di regolatore nella fisiologia riproduttiva dei mammiferi. Il GnRH influenza i processi riproduttivi regolando la sintesi e il rilascio delle gonadotropine ipofisarie, che a loro volta modulano la steroidogenesi e la gametogenesi [Conn e Crowley,1994]. Le principali fonti e i siti di azione del GnRH sono l’ipotalamo e l’ipofisi, ma molti studi hanno riportato la presenza di un origine extraipotalamica del GnRH e anche la presenza dei suoi recettori (GnRH-R) in numerosi organi periferici, inclusi gli organi riproduttivi [Ramakrishnappa et al., 2005]. Tutti i recettori per il GnRH sono proteine transmembrana legate alle proteine G che agiscono attivando la trasduzione del segnale mediante i pathways delle fosfolipasi (PL): C (PLC), A2 (PLA2), D (PLD) o dell’adenilato ciclasi (AC) [Millar,2005]. L’attivazione delle fosfolipasi potrebbe generare acido arachidonico, che è convertito in prostaglandine dall’azione delle cicloossigenasi 1 e 2, così come da altri enzimi prostaglandine sintasi [Naor,2009]. Molti studi hanno evidenziato un effetto diretto del GnRH sui CL nei conigli, ma hanno prodotto risultati contraddittori. L’obiettivo di questo studio è stato quello di esaminare in vitro gli effetti modulatori del GnRH nei CL di coniglie durante tre stadi luteali della pseudogravidanza: la fase precoce (4 giorni), la fase intermedia (9 giorni) e la fase tardiva (13 giorni). 58 Materiali e Metodi Reagenti I primer random esameri, la deossiribonucleasi I (DNAase I Amp.Grade), La trascrittasi inversa RNAsi-H (SuperScript III Reverse Trascriptase), la RNAsi H di Escherichia coli, i ladder di DNA, e anche i reagenti per l’isolamento e la purificazione dell’RNA totale (TRIzol), la Taq DNA polimerasi (Taq Platinum), il buffer PCR 10X, il MgCl2 50 mM, le provette RNAsi free, l’acqua RNAsi free e i deossinucleotiditrifosfato (dNTPs), così come i primer disegnati sull’mRNA di IL1β , di ERα, di p53, di Bcl-x e di Bax sono stati ottenuti dall’ Invitrogen (S.Giuliano Milanese, Milano, Italia).I primers costruiti su parte dell’RNA ribosomiale (rRNA) della subunità 18S e i corrispondenti competimeri (QuantumRNA 18S Internal Standard) sono stati acquistati dall’ Applied Biosystem (Monza,MI, Italia). Il kit Nucleospin Extract II, è stato acquistato dalla Macherey Nagel Inc. (Bethlehem, PA, USA). La [2,3-3H]L-arginina triziata, che ha un‘attività di 30-40 Ci/mmol, è stata acquistata dall’Amersham Biosciences (Amersham Biosciences Ltd, Little Chalfont, Bucks, UK). Il NOS detectTM Assay Kit è stato comprato da Alexis Corp. (Läufelfingen, Svizzera). L’anticorpo primario monoclonale di topo anti-ERα , utilizzato per l’immunoistichimica (IHC) è stato acquistato dalla Zymed (San Francisco, Ca, USA). Dalla Santa Cruz Byotechnology (Santa Cruz, CA, USA) sono stati comperati: gli anticorpi monoclonali di topo anti-p53, anti-Bcl-x e anti-Bax utilizzati per l’ IHC e per il western blotting (WB), così come il reagente Luminol per il WB, utilizzato per la rivelazione delle bande. L’anticorpo secondario biotinilato di capra anti-topo, utilizzato per l’IHC è stato acquistato dalla Vector Laboratories (Burlingame,CA,USA). Il complesso avidina-biotina (ABC, Vector Elite Kit) e il cromogeno 3,3’-diaminobenzidina tetracloride (DAB) è stato comprato dalla Vector Laboratories. Il kit per il dosaggio delle proteine è stato acquistato da Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA). Il ladder per il WB PageRulerTM è stato ottenuto da Fermentas (Burlington, Ontario, Canada). L’anticorpo secondario anti-topo, coniugato con la perossidasi di rafano, utilizzato per il WB e le pellicole per la chemioluminescenza sono stati acquistati dalla Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA). 59 L’anticorpo primario monoclonale diretto contro il recettore del GnRH (GnRHR) è stato acquistato dalla BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA). Il progesterone triziato, la PGF2α e la PGE2 sono stati comperati da Amersham Biosciences (Amersham Biosciences Ltd, Little Chalfont, Bucks, UK), mentre gli ormoni non radioattivi e gli antisieri specifici provengono dalla Sigma (St. Luis, MO, USA). Le piastre per l’incubazione dei tessuti luteali, provengono dalla Becton Dickinson Co. (Clifton, NJ, USA), mentre, il medium 199 e la soluzione salina bilanciata di Earle sono state acquistate dalla GIBCO (Grand Island, NY, USA). L’HEPES (acido 4-2-idrossietil-1-piperazinil-etansolfonico) e l’albumina sierica bovina (BSA) sono state comperati dalla Sigma. I seguenti preparati ormonali sono stati iniettati per via intramuscolare: l’analogo dell’ormone che rilascia le gonadotropine (GnRH) (Receptal, Hoechst-Russel Vet, Milano, Italia), e la PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin; Folligon Intervet, Milano, Italia). L’antagonista per il GnRH, antide, è stato acquistato dalla Sigma. Gli altri reagenti sono stati ottenuti a livello locale Protocollo sperimentale I protocolli che coinvolgono il trattamento e l’uso degli animali, per questi esperimenti, sono stati approvati dal Comitato di Bioetica dell’Università di Perugia. Valutazione degli effetti della PGF2α Animali e regime ormonale Sono state selezionate delle coniglie di razza New Zeland White, nullipare, di circa 5 mesi di età e dal peso compreso tra 3,5 e 3,8 Kg. Le coniglie, sono state allevate in gabbie singole, in condizioni controllate di luce (14 ore di luce, 10 ore di oscurità) e di temperatura (18°C). Gli animali sono stati alimentati ad libitum con mangime commerciale. Tutte le coniglie, al fine di indurre la pseudogravidanza, sono state trattate per via intramuscolare, dapprima con 20 UI di PMSG, seguite, due giorni dopo, da 0.8 µg di un analogo del GnRH (buserelin). Precedenti esperimenti, effettuati nei nostri laboratori, hanno dimostrato che questo trattamento 60 ormonale induce effettivamente l’ovulazione nelle coniglie [Stradaioli et al.,1997]. Il giorno in cui è stato somministrato il GnRH viene o indicato come giorno 0. Trattamento con la PGF2α e raccolta dei tessuti luteali Al 4° o al 9° giorno di pseudogravidanza, alle coniglie (18 animali per gruppo), sono stati somministrati per via intramuscolare 200 µg di alfaprostolo (un analogo della PGF2α). Per ogni stadio luteinico, sono state sacrificate tre coniglie, mediante dislocazione cervicale, subito prima (tempo 0) e ad 1.5, 3, 6, 12 e 24 ore dopo la somministrazione della PGF2α. Subito dopo il sacrificio, da ogni animale, è stato rimosso il tratto riproduttivo e lavato con soluzione salina. Entro pochi minuti, i corpi lutei (CL) sono stati estratti dalle ovaie e, grazie ad un ingrandimento stereoscopico, sono stati separati attentamente dal tessuto non luteale. Per la successiva valutazione dell’espressione genica e proteica, i CL, sono stati lavati con PBS privo di Rnasi e immediatamente congelati a -80°C. Per il rilevamento immunistochimico di ERα, p53, Bcl-xL e Bax, sono state sacrificate altre due coniglie, prima della somministrazione della PGF2α e dopo 6 ore dall’iniezione, sia a 4 giorni che a 9 giorni di pseudogravidanza. Le ovaie, immediatamente dopo il sacrificio, sono state rimosse e fissate in PBS (pH 7,4) contenente di formaldeide al 4% (w/v) per 24 ore a temperatura ambiente, e successivamente trattate per l’inclusione in paraffina e seguite dalle procedure di routine per la preparazione dei tessuti. Da ogni coniglia sono stati prelevati tre campioni di sangue attraverso prelievo a livello della vena marginale dell’orecchio, il primo dei quali, prima del trattamento con il GnRH, il secondo prima della somministrazione della PGF2α e il terzo immediatamente prima del sacrificio. I campioni di sangue sono stati raccolti in provette vacutainer contenenti EDTA (acido etilendiamminotetraacetico.) e centrifugati a 3000 giri per 15 minuti, al fine di separare il plasma dalla parte corpuscolata. Il plasma, così ottenuto, è stato immediatamente congelato e, successivamente, utilizzato per la valutazione dello stato funzionale del CL tramite dosaggio della concentrazione del progesterone. Ai fini di questa tesi di dottorato, si definiscono a) luteolisi funzionale, quando vi sia il riscontro di una diminuzione del 50% della concentrazione plasmatica di progesterone rispetto ai valori osservati prima del trattamento (cioè prima della somministrazione della PGF2α) e b) luteolisi 61 completa, quando si apprezza una diminuzione dei livelli plasmatici di progesterone al di sotto di 1,0 ng/ml (corrispondenti ai valori riscontrati nelle coniglie in estro), cioè vi sia una incapacità del CL di secernere il progesterone [Browning et al.,1980]. Immunoistochimica di ERα, p53, Bcl-x e Bax Gli esperimenti di IHC sono stati effettuati su sezioni seriali di CL spesse 5 µm, con lo scopo di identificare la localizzazione cellulare di ERα, p53, Bcl-xL e Bax, utilizzando i corrispondenti anticorpi primari monoclonali di topo diluiti 1:80, 1:100, 1:100, e 1:100, rispettivamente, e poi è stato aggiunto l’anticorpo secondario biotinilato diluito 1:200 [Dall’Aglio et al.,2006]. Le sezioni, in cui non è stato aggiunto l’anticorpo primario, o è stato sostituito da una pre-immunizzazione con le immunoglobuline gamma di topo, sono state utilizzate come controllo negativo (colorazione aspecifica). L’intensità della colorazione è convenzionalmente considerata come: assente, debole, moderata e forte, quando la percentuale di positività delle cellule di CL nelle sezioni per campo ottico del microscopio a fluorescenza è rispettivamente di: <1, 1-10, 10-50, 50-100. Estrazione dell’RNA e trascrizione inversa L’RNA totale è stato estratto dai CL di tre coniglie per ogni stadio luteinico [Boiti et al., 2004]. Le contaminazioni da DNA genomico sono state evitate attraverso il trattamento con l’enzima deossiribonucleasi I, utilizzato secondo le istruzioni date dalla casa produttrice. 5 µg di RNA totale (1 µg/µl) sono stati retro-trascritti in cDNA, in un volume finale di 20 µl della mix di sintesi SuperScript III Reverse Trascriptase, utilizzando esameri casuali, seguendo il protocollo fornito dalla casa produttrice. Le eventuali contaminazioni di DNA genomico vengono controllate attraverso una PCR effettuata col cDNA ottenuto da una retrotrascrizione nella quale non è stato utilizzato l’enzima trascrittasi inversa (RT-). Amplificazione mediante RT-PCR multiplex Il protocollo per l’amplificazione mediante PCR multiplex è stato illustrato in Boiti et al.,2004. Per la PCR è stato utilizzato, come stampo per i primer ERα, IL-1β, p53, Bcl-x, Bax, e per il 18S (vedi tabella 1), 1 µl di cDNA luteinico 62 Le PCR eseguite per amplificare un frammento del cDNA di ERα, IL-1β, p53, Bcl-x, Bax, consistono in un primo ciclo di denaturazione a 94 °C per 75 secondi, seguito da un numero variabile di cicli di amplificazione (vedi tabella 1) caratterizzati da un primo ciclo di denaturazione a 94 °C per 15 secondi, seguito da uno di annealing a 60 °C per 30 secondi, e da uno di estensione a 72 °C per 45 secondi, ed uno step finale di estensione a 72 °C per 10 minuti. All’interno di ogni esperimento e per ogni gene analizzato, l’intero set di campioni è stato analizzato in parallelo in una singola PCR, utilizzando aliquote della stessa mix di PCR. Ogni set di determinazioni è stato eseguito in triplicato. L’rRNA 18S è un controllo interno ideale per l’analisi quantitativa dell’ RNA poiché la sua concentrazione rimane invariata a prescindere dai tessuti e dai trattamenti, anche se la sua quantità relativamente elevata, lo rende difficile da usare in esperimenti di RT-PCR poiché gli mRNA bersaglio sono di gran lunga meno abbondanti. Comunque, per ovviare a questo problema e diminuire l’efficienza della PCR a favore dell’amplificazione del cDNA per il 18S rendendola comparabile a quella del gene studiato, viene mescolata l’appropriata quantità di Primer 18S con il rispettivo competimero, che non è altro che un primer modificato all’ estremità 3’ e che blocca l’estensione della DNA polimerasi. 63 Tabella 1: Sequenza dei primers per ERα, IL-1β, p53, Bcl-x, Bax, e per 18S utilizzato come standard interno. Lunghezza Gene ERα bande bp 147 35 TGAGGCCGATGGTCCCAATTA 183 antisenso 35 AAGGCCTGTGGGCAGGGAAC senso GCTGCTCCGACAGCGATGGT 300 antisenso 30 CCCTCCCAGGACAGGCACAC senso ACAGCAGTGAAGCAGGCTCT 228 Bcl-x antisenso 30 CATCTCCTTGTCCACGCTTT CCTTTTGCTTCAGGGTTTCA senso 165 Bax cicli CTGCGGCGTTGAACTCATA senso P53 Numero di AGATCCAAGGGAATGAGCTG senso antisenso IL-1β Primers (5’-3’) 32 ATCCTCTGCAGCTCCATGTT antisenso TCAAGAACGAAAGTCGGAGGTT Senso 489 18S antisenso GGACATCTAAGGGCATCA Analisi dei prodotti di amplificazione I prodotti amplificati, generati dalla PCR, sono stati analizzati (18 µl dei 25 µl totali della reazione), tramite elettroforesi su gel di agarosio al 2% utilizzando una colorazione al bromuro di etidio (0,5 µg/ml). Ogni gruppo di campioni su gel è stato caricato assieme ad un controllo negativo privo di RNA e di ladder. Le immagini dei gel sono state acquisite usando una fotocamera digitale Kodak DC290. Per ogni prodotto di PCR, l’intensità della banda, corretta rispetto all’intensità del background (OD assoluto sottratto dai livelli di background dalle linee corrispondenti), è stata quantificata utilizzando il software Quantity One (Bio-Rad). Per quantificare l’mRNA relativo al gene d’interesse, l’intensità della banda ottenuta da ciascun prodotto di PCR, è stata normalizzata con quella del gene housekeeping 18S, coamplificata nella stessa aliquota, e il valore espresso in unità arbitrarie. 64 Sequenziamento Gli amplificati di tutte e tre le reazioni di PCR sono stati purificati con il Kit Nucleospin Extract II. Il sequenziamento è stato eseguito con il metodo di Sanger, che ha confermato la reale amplificazione della sequenza prefissata. Western Blotting per p53, Bcl-xL e Bax Per ogni coniglia, le proteine luteali totali, sono state estratte da un pool di 8 CL come descrito da Zerani e collaboratori [Zerani et al.,2004]. I CL sono stati omogeneizzati in 1 ml di RIPA buffer freddo (PBS contenente 1% Igepal CA630, 0,5% sodio desossicolato, 0,1% SDS). Dopo incubazione a 4°C per 20 minuti, l’omogenato è stato centrifugato a 12.000 giri per 60 minuti a 4°C. La concentrazione proteica del sopranatante è stata quantificata utilizzando un kit per il saggio proteico e la BSA come standard. Un quantitativo di proteine pari a 20 µg, sono state separate mediante elettroforesi su SDS-PAGE, in un gel di poliacrilammide al 10% e con staking gel al 4%, per 40 minuti a 200V e 500mA. In seguito, le proteine, sono state trasferite su membrane di nitrocellulosa, per 1 ora a 100 V e 350 mA. Le membrane sono state poi bloccate con TBS contenente 0,05% di Tween 20 e il 5% di latte scremato in polvere. In seguito, le membrane sono state incubate, sequenzialmente, con gli anticorpi monoclonali anti-p53, anti-Bcl-xL e anti-Bax, tutti diluiti 1:500, overnight a 4°C. Poi le membrane sono state incubate per 60 minuti a temperatura ambiente, sotto lieve agitazione,con l’anticorpo secondario antitopo (1:20.000), coniugato con la perossidasi di rafano (HRP). Tutti gli anticorpi son stati diluiti in TBS contenente il 5% latte scremato in polvere, e i lavaggi, dopo ogni incubazione, sono stati fatti con PBS contenente lo 0.05% di Tween-20. Le bande sono state rilevate usando il kit per ECL (Enhanced chemiluminescent) ed esposte su pellicole per raggi-X. La densità delle bande è stata esaminata con il software Quantity One della Bio-Rad. Dopo ogni incubazione con l’anticorpo secondario, le membrane sono state immerse nella strip solution e poi incubate con l’anticorpo primario monoclonale di topo anti β-tubulina (0.5 µg/ml), overnight a 4°C. La densità di ciascuna banda è stata normalizzata con quella della β-tubulina corrispondente, utilizzata come controllo interno, e i valori espressi in unità arbitrarie. 65 Determinazione dell’attività enzimatica della NOS L’attività della NOS è stata determinata attraverso il monitoraggio della reazione di conversione dell’ [3H]L-arginina a [3H]L-citrullina con un kit commerciale di rilevazione della NOS, in accordo con le procedure sperimentali descritte da Boiti e collaboratori nel 2004 [Boiti et al.,2004]. Dosaggio della concentrazione plasmatica del progesterone La concentrazione del progesterone è stata determinata attraverso dosaggio radioimmunologico (RIA), utilizzando specifici anticorpi in accordo con il protocollo riportato nel lavoro di Boiti e collaboratori del 2000 [Boiti et al.,2000]. Il progesterone viene estratto da 0,1 ml di plasma con etere etilico e ogni campione viene saggiato in duplicato. La sensibilità del saggio è di 0,08 ng/ml, per il progesterone mentre i coefficienti di variazione intra e intersaggio sono, rispettivamente, di 5,3% e 10,2%. Analisi statistica I dati dell’espressione genica e proteica, dei livelli plasmatici di progesterone e dell’attività enzimatica della NOS, sono stati analizzati con il test ANOVA seguito dal test di Student-Newman-Keuls t-test. Le differenze sono considerate significative per valori di P<0.01. Valutazione della regolazione luteinica da parte del GnRH Animali e regime ormonale Le coniglie, di razza New Zeland White, dal peso compreso tra 3,5 e 4 Kg, sono state selezionate e allevate in gabbie singole,in condizioni controllate di luce (14 ore di luce, 10 ore di oscurità) e di temperatura (18°-24°C). Gli animali sono stati alimentati ad libitum con mangime commerciale e hanno avuto libero accesso all’acqua. Tutte le coniglie sono state trattate, al fine di indurre la pseudogravidanza, con 20 UI di PMSG, seguite, tre giorni dopo, da una iniezione intramuscolare di 0.8 µg di un analogo del GnRH (buserelin). Il giorno della somministrazione del buserelin è stato indicato come giorno 0. 66 Prelievo dei tessuti Dopo il sacrificio è stato rimosso, da ogni coniglia, il tratto riproduttivo, e lavato con soluzione salina. Pochi minuti dopo il sacrificio, dalle ovaie sono stati prelevati i CL, e ubito processati per le incubazioni in vitro. Per la rilevazione immunoistochimica di GnRH-R, le ovaie prelevate (da due coniglie per stadio luteinico) sono state fissate mediante immersione in una soluzione di PBS (pH 7,4) contenete formaldeide al 4% (w/v) per 24 ore, a temperatura ambiente, e successivamente sono state incluse in paraffina e trattate con le procedure di routine per la preparazione dei tessuti. Incubazione in vitro Per lo studio in vitro i CL appartenenti ai tre stadi luteinici: 4, 9 e 13 giorni di pseudogravidanza, sono stati distribuiti (n=1/pozzetto) nelle piastre. In ogni pozzetto è stato aggiunto 1 ml di medium 199 e soluzione salina bilanciata di Earle (2,2 mg/ml di bicarbonato di sodio, 2,3 mg di HEPES) con BSA al 3%. Prima del trattamento ogni CL è stato tagliato in 4 parti con delle forbicine. Ad ogni gruppo sperimentale (totale 12 gruppi) e per ogni stadio luteinico, sono stati assegnati 5 CL. I 12 gruppi sperimentali sono stati così suddivisi: (I) Medium come controllo; (II) Agonista del GnRH (Buserelin 200 nM); (III) Buserelin+antagonista del GnRH (antide, 100 nM); (IV) Buserelin+ inibitore della fosfolipasi A2 (PLA2) (4-bromofenacil bromide, 2 µM); (V) Buserelin+ inibitore della fosfolipasi C (PLC) (composto48/80, 2 µM); (VI) Buserelin+ inibitore della fosfolipasi D (PLD) (propanololo, 10 µM); (VII) Buserelin+ inibitore dell’adenilato ciclasi (2-O-metiladenosina, 2 µM); (VIII) Buserelin+antagonista dell’inositolo-1,4,5-trifosfato (IP3) (2- aminoetil difenilborinato, 100 µM); (IX) Buserelin+ antagonista del diacilglicerolo (DAG) (1-esadecil-2- acetil glicerolo, 100 µM); (X) Buserelin+ inibitore della PKC (starosporine, 20 µM); (XI) Buserelin+ inibitore della COX (acido acetilsalicilico, 100 µM); 67 (XII) Buserelin+ inibitore della NOS (N-nitro-L-arginina metil estere, 100 µM). Ogni piastra di coltura è stata incubata a 37°C in atmosfera d’aria contenente il 5% di CO2 per 4 ore, come descritto da Boiti e collaboratori [Boiti et al.,2001]. Dopo 4 ore, da ogni pozzetto, è stato prelevato il medium di coltura e questo è stato immediatamente congelato a -20°C per la successiva rilevazione della concentrazione di progesterone. Dosaggio radioimmunologico degli ormoni La concentrazione di progesterone, di PGF2α e di PGE2 sono state determinate mediante RIA [Boiti et al.,2000]. La concentrazione del progesterone è stata saggiata nel medium di coltura dei 12 gruppi sperimentali, mentre la concentrazione della PGF2α e della PGE2 è stata saggiata solamente nel medium dei gruppi controllo e dei gruppi trattati con il GnRH. I coefficienti di variazione intra e inter-saggio e la dose minima rilevabile sono rispettivamente per la PGF2α: 8%, 12% e 19 pg, per la PGE2: 7%, 13%, 18 pg e per il progesterone: 5%, 9%, 10 pg. Determinazione dell’attività enzimatica L’attività enzimatica delle COX 1 e 2, è stata determinata attraverso la misurazione della scomparsa del substrato marcato radioattivamente [H3]AA [Zerani et al.,2007]. Sono stati impiegati l’inibitore selettivo della COX-2 (NS398, 1 µM) e l’inibitore non selettivo della COX (acido acetilsalicilico, ASA, 1 mM). Per ogni campione, l’attività della COX-1 è stata determinata calcolando la velocità di scomparsa del [H3]AA incubato con inibitore selettivo della COX-2. Al contrario, l’attività enzimatica della COX-2 è stata determinata calcolando la velocità di scomparsa del [H3]AA incubato senza l’inibitore selettivo della COX2, e al valore ottenuto è stato sottratto quello della COX-1. I valori ottenuti per COX-1 e per la COX-2 sono stati corretti mediante sottrazione dei valori della scomparsa del substrato [H3]AA, ottenuti da altre reazioni enzimatiche e non enzimatiche. L’attività di NOS è stata determinata attraverso il monitoraggio della reazione di conversione dell’[3H]L-arginina a [3H]L-citrullina commerciale di rilevazione della NOS [Boiti et al.,2000]. con kit 68 Immunoistochimica: recettore del GnRH di tipo I (GnRH-RI) Le sezioni di tessuto sono state deparaffinate in xylene, reidratate con etanolo e risciacquate in acqua distillata. Le stesse sezioni sono state, sottoposte al recupero dell’antigene in una soluzione di citrato (10mM, pH6), e messe nel forno a microonde per 10 minuti a 700 W. Le sezioni sono state fatte raffreddare a temperatura ambiente e sottoposte a lavaggio con TBS buffer. I campioni sono stati immersi in metanolo contenente H2O2 al 3% per 1 ora, per attenuare l’attività endogena della per ossidasi, e successivamente sciacquati sottoposti a lavaggio con TBS. La colorazione di fondo è stata prevenuta incubando le sezioni con un siero normale di coniglio, diluito 1:10, per 30 minuti a temperatura ambiente. Poi i vetrini sono state incubate con l’anticorpo primario monoclonale di capra anti-GnRH-R I (diluito 1:200 in TBS contenente 0,1 % di BSA), per 1 ora a 37°C e poi overnight a 4°C in una camera umida. Il giorno dopo le sezioni sono state sottoposte a 3 lavaggi con TBS (5 minuti ciascuno). Alla fine dei lavaggi sono state trattate di nuovo con un siero normale di coniglio e poi incubate per 30 minuti, a temperatura ambiente, con l’anticorpo secondario biotinilato anti-capra di coniglio, diluito 1:200 in TBS. Dopo i lavaggi in TBS, le sezioni son state esposte al complesso ABC per 30 minuti, e di nuovo sciacquate con TBS. I siti di attività della perossidasi sono stati visualizzati utilizzando come cromogeno il DAB kit, e successivamente i campioni sono stati sciacquati 2 volte con acqua distillata per 5 minuti ,poi colorati con ematossilina, lavati con acqua e in fine disidratati attraverso passaggi in soluzioni di etanolo al 70, 95 e 100%, schiariti con xilene e assemblati con un medium per microscopio a fluorescenza. Come controlli negativi sono state utilizzate le sezioni di tessuto, non trattate con l’articorpo primario, ma con TBS. Retrotrascrizione del GnRH-R nei CL Questo esperimento è stato effettuato per verificare la presenza del GnRH-R nel CL di coniglio. Precedentemente le normali tecniche di retrotrascrizione e PCR, fin qui utilizzate, non avevano mostrato una sensibilità tale da rilevare la presenza del trascritto per il GnRH-R nei CL. Per ovviare a questo problema ed aumentare la sensibilità dell’amplificazione, abbiamo sostituito, durante la retrotrascrizione, i random esameri con una coppia di primers specifica per GnRH-R. Il cDNA ottenuto con questa retrotrascrizione è stato utilizzato per 69 una PCR con i primers specifici per il GnRH-R (Tabella 2), che riconoscevano una sequenza interna a quella amplificata con la prima coppia di primers. Come ulteriore prova è stata effettuata una retrotrascrizione utilizzando gli oligo(dT) al posto dei random esameri. Come stampo per la prima retrotrascrizione è stato utilizzato RNA totale estratto da CL di 4 giorni di pseudogravidanza a 0, 6, 12 ore di trattamento con la PGF2α (Figura 17). Analisi statistica I dati relativi agli effetti dei trattamenti in vitro sui livelli ormonali, e sulle attività enzimatiche sono stati analizzati con il test ANOVA seguito dal t-test di Student-Newman-Keuls. Le differenze sono state considerate significative a P<0,01. 70 Risultati Valutazione degli effetti della PGF2α Induzione in vivo della luteolisi La concentrazione plasmatica di progesterone, utilizzata come marker dell’attività funzionale del CL, era bassa (0,6±0.3 ng/ml) in tutte le coniglie prima dell’induzione dell’ovulazione. La concentrazione plasmatica di progesterone diminuisce dopo 12 ore (P< 0,01) dal trattamento con la PGF2α nelle coniglie a 9 giorni di pseudogravidanza, e la completa regressione funzionale viene raggiunta 24 ore (P<0,01) più tardi quando i livelli di progesterone diminuiscono fino ai valori basali trovati durante l’estro (Figura: 5). Come ci si aspettava, la PGF2α non è in grado di indurre la regressione funzionale quando viene somministrata a 4 giorni di pseudogravidanza. Plasma progesterone after PGF2α analogue injection 14 Progesterone (ng/mL) Day 9 Day 4 12 10 8 6 4 2 0 0 1.5 3 6 * * 12 24 Hours post-treatment Figura:5. Concentrazione plasmatica di progesterone in campioni sangue raccolti a 0, 1.5, 3, 6, 12 e 24 ore dopo la somministrazione dell’analogo sintetico della PGF2α, a 4 e 9 giorni di pseudogravidanza. Oltre al punto 0, ciascun dato rappresenta la media±SD del valore derivato da tre coniglie diverse. Gli asterischi indicano valori di concentrazione, del progesterone, significatamene differenti (P<0,01) rispetto al tempo 0 71 CL a 4 giorni ERα CL a 9 giorni ERα 50 µm ERα ERα ERα 50 µm 50 µm 50 µm A B C D p53 3 p53 50 µm 50 µm E Bax Bax L 0 50 µm H Bax 50 µm 50 µm I 50 µm G F p53 x p53 Bax 50 µm 50 µm M N 6 0 Ore dopo il trattamento con la PGF2α 6 Figura:6. Dettagli di microfotografie di CL derivati dall’analisi immunoistochimica di ERα, p53 e Bax in ovaie di coniglio prelevate a 4 e 9 giorni di pseudogravidanza prima (ora 0) e 6 ore dopo la somministrazione di PGF2α. Le reazioni positive sono mostrate colorate di marrone. ERα, p53 e Bax mostrano reazioni positive nucleari di diverse intensità all’interno delle cellule luteiniche. Scala a barra: 50 µm. Immunolocalizzazione di ERα, p53, Bcl-xl e Bax Utilizzando anticorpi monoclonali, le reazioni positive per ERα e p53 sono state osservate nel nucleo delle cellule luteiniche sia nei CL di 4 che in quelli di 9 giorni (Figura:6). Inoltre, sia ERα che p53 sono visibili sia prima che dopo la somministrazione della PGF2α. Nei CL di 4 giorni di pseudogravidanza (Figura:6, pannelli A e B) la reazione immunitaria è più intensa e il numero delle cellule immunoreattive (IR) per ERα è molto maggiore che in quelle nei CL di 9 giorni di pseudogravidanza (Figura:6 pannelli C e D) dopo 6 ore dal trattamento con la PGF2α. Prima del trattamento, il numero delle cellule IR per 72 p53 è simile sia nei CL di 4 e di 9 giorni, ma diminuisce dopo 6 ore, mentre l’intensità delle IR rimane invariata (Figura:6 pannelli E-F). La colorazione positiva per Bax è stata osservata nel citoplasma delle cellule luteiniche sia nei CL di 4 che di 9 giorni. Prima della somministrazione della PGF2α. la reazione immunoreattiva è più evidente, nei CL di 4 rispetto a quelli di 9 giorni, così come il numero delle cellule IR per Bax è molto maggiore nei CL di 4 giorni (Figura:6, pannelli I-N). Ad entrambi gli stadi luteali, dopo 6 ore dall’iniezione diminuisce sia il numero che l’intensità delle cellule IR per Bax (Figura:6, pannelli L e N). Indipendentemente dalla fase luteinica, non è stata osservata una colorazione per Bcl-xL, sia prima che dopo la somministrazione della PGF2α. Nelle sezioni in cui al posto dell’anticorpo primario è stato aggiunto un siero normale, non si è verificata nessuna colorazione. 50 µm Figura: 7. Immunocolorazione per Bcl-xL nell’ovaio di coniglio prelevato a 4 giorni di pseudogravidanza. I segnali positivi sono rilevati da colorazione marrone. La reazione positiva è visibile nel citoplasma dell’ovocita, all’interno del follicolo primario. Scala a barra: 50 µm 73 ERα mRNA levels in rabbit CL after PGF2α injection 1.2 Day-4 Day-9 ERα/18S Ratio Arbitrary units 1.0 0.8 a * a a a a 0.6 a aa a 0.4 c 0.2 c b 0.0 0 1.5 3 6 12 24 Hours post-treatment Giorno 4 18S 489 bp ERα 147 bp Giorno 9 18S 489 bp ERα 147 bp LD PCR- 0 1.5 3 6 12 24 Figura: 8. Abbondanza relativa dell’mRNA di ERα nei CL prelevati subito prima e a differenti intervalli di tempo dopo l’iniezione di PGF2α a 4 e 9 giorni di pseudogravidanza. Il pannello in basso mostra una tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per Erα (147 bp) e 18S (489 bp). LD: indica il marker per la lunghezza del DNA, PCR-:indica il controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono alle ore dopo la somministrazione della PGF2α. Per ogni stadio luteale, il valore (media±SD) deriva da analisi densitometrica di ERα, riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del 18S, combinate con i risultati provenienti da tre diverse coniglie, per ogni ora di trattamento. Per ogni stadio luteinico, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente diverso (P<0,01). L’asterisco indica una significativa differenza (P<0,01) dei valori prima del trattamento (ora 0) tra gli stadi luteinici. 74 IL-1β mRNA levels in rabbit CL after PGF2α injection 2.0 Day-4 Day-9 d IL-1β/18S Ratio Arbitrary units 1.6 c c 1.2 bb b b a b a 0.8 a a 0.4 0.0 0 1.5 3 6 12 24 Hours post-treatment Giorno 4 18S 489 bp IL-1β 183 bp Giorno 9 18S 489 bp IL-1β 183 bp LD PCR- 0 1.5 3 6 12 24 Figura:9. Abbondanza relativa dell’mRNA di IL-1β nei CL prelevati subito prima e a differenti intervalli di tempo dopo l’iniezione di PGF2α a 4 e 9 giorni di pseudogravidanza. Il pannello in basso mostra una tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per IL-1β (183 bp) e 18S (489 bp). LD: indica il marker per la lunghezza del DNA, PCR-: indica il controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono alle ore dopo la somministrazione della PGF2α. Per ogni stadio luteale, il valore (media±SD) deriva da analisi densitometrica di IL-1β, riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del 18S, combinate con i risultati provenienti da tre diverse coniglie, per ogni ora di trattamento. Per ogni stadio luteinico, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente diverso (P<0,01). Espressione genica di ERα e IL-1β Prima del trattamento i livelli di mRNA di ERα son più bassi (p<0,01) nei CL di 4 giorni rispetto a quelli di 9 giorni di pseudogravidanza (Figura: 8). Nei CL di 4 giorni la concentrazione dell’mRNA di ERα rimane approssimativamente costante durante le 24 ore dal trattamento. Invece, a 9 75 giorni di pseudogravidanza i livelli dell’mRNA diminuiscono gradualmente fino a valori prossimi allo zero (P<0,01) entro le 6 ore dalla somministrazione della PGF2α, e nelle ore successive rimangono, comunque, a livelli bassi (Figura: 8). Prima della somministrazione di PGF2α la quantità relativa dell’mRNA dell’IL1β, è simile nei CL di entrambe le fasi luteiniche (Figura:9). In seguito al trattamento i livelli di mRNA dell’Il-1β aumentano gradualmente durante le prime 3 ore dal trattamento, sia nei CL di 4 che in quelli di 9 giorni (Figura:9). A 4 giorni di pseudogravidanza, l’abbondanza relativa dell’mRNA dell’IL-1β aumenta di 2 volte (P<0,01), rispetto ai livelli basali, dopo 3 ore dalla somministrazione della PGF2α, e poi diminuisce durante le ore successive fino a tornare ai livelli prima del trattamento. Mentre nei CL di 9 giorni il picco si registra a 6 ore dall’iniezione della PGF2α, e nelle ore successive i livelli di mRNA diminuiscono gradualmente fino a tornare ai livelli prima della somministrazione della PGF2α. Espressione genica di p53, Bcl-xL e Bax. Prima della somministrazione della PGF2α i livelli di mRNA di p53 sono comparabili sia nei CL di 4 che in quelli di 9 giorni (Figura:10, A e B). A 4 giorni di pseudogravidanza l’abbondanza relativa di mRNA di p53 diminuisce gradualmente durante le 24 ore dopo il trattamento. Nei CL di 9 giorni i livelli di mRNA di p53 aumentano (P<0,01) fino a 3 ore dopo la somministrazione della PGF2α, e nelle ore successive diminuiscono gradualmente fino a valori inferiori a quelli prima del trattamento (Figura:10, A e B). I livelli basali di mRNA di Bcl-x sono più alti (P<0,01) nei CL di 4 giorni che in quelli di 9 giorni (Figura:11 C e D). A 4 giorni di pseudogravidanza, l’abbondanza relativa di mRNA di Bcl-x rimane pressoché costante durante le 24 ore successive alla somministrazione della PGF2α. Mentre nei Cl nella fase tardiva luteinica, i livelli dei trascritti di Bcl-x iniziano a diminuire (P<0,01) 6 ore dopo il trattamento fino a raggiungere valori molto bassi (P<0,01) 24 ore dopo la somministrazione di PGF2α (Figura: 11 C e D). L’abbondanza relativa dei trascritti di Bax, prima del trattamento, è simile in entrambe le fasi luteiniche. A 4 giorni di pseudogravidanza, i livelli di mRNA di Bax non sono colpiti dal trattamento (Figura: 11, A e B). Nei CL di 9 giorni, l’espressione dell’mRNA di Bax rimane agli stessi livelli per le prime 3 ore dal trattamento, nelle ore successive diminuisce (P<0,01) fino a dimezzare la propria espressione (Figura:11, A e B). 76 A 18S 489 bp Giorno 4 p53 300 bp 18S 489 bp Giorno 9 p53 300 bp LD PCR- 1.6 0 1.5 B p53/18S Ratio Arbitrary units 1.2 1.0 6 12 24 Day-4 Day-9 c c 1.4 3 a a a a b 0.8 b b b 0.6 b b 12 24 0.4 0.2 0.0 0 1.5 3 6 Hours post-treatment C 0.6 D Day-4 Day-9 c Giorno 4 p53 (53 kDa) Giorno 9 p53/β-tubulin Arbitrary units 0.5 c c c 0.4 0.3 b b 0.2 b d Giorno 4 β-tubulina Giorno 9 0.1 a 0.0 0 1.5 3 6 12 24 a a d 0 1.5 3 6 12 24 Hours post-treatment Figura:10. Abbondanza relativa dell’mRNA dell’espressione proteica di p53, in CL prelevati subito prima e a differenti intervalli di tempo dopo l’iniezione di PGF2α a 4 e 9 giorni di pseudogravidanza. Il pannello A mostra una tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per p53 (300 bp) e 18S (489 bp). LD: indica il marker per la lunghezza del DNA, PCR-:indica il controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono alle ore dopo la somministrazione della PGF2α. Per ogni stadio luteale, il valore (media±SD) deriva da analisi densitometrica di p53, in B, riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del 18S. In C è rappresentato l’immunoblot di p53 e della β-tubolina; in D, è rappresentata l’analisi densitometrica riportata in unità relative, normalizzata con la βtubolina. Per ogni stadio luteinico, i valori sono conbinati con i risultati provenienti da tre diverse coniglie, per ogni ora di trattamento. Per ogni stadio luteinico, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente diverso (P<0,01). 77 A Giorno 4 1.0 18S 489 bp Bax 165 bp 0.8 Bax/18S Ratio Arbitrary units Giorno 9 18S 489 bp Bax 165 bp LD PCR- 0 1.5 3 6 12 B 24 a Day-4 Day-9 a a a a a a a 0.6 a b b b 0.4 0.2 0.0 Giorno 4 LD PCR- 0 1.5 3 6 12 0 1.5 3 6 12 24 Hours post-treatment 24 18S 489 bp C Bcl-x 228 bp Giorno 9 18S 489 bp Bcl-x 228 bp 0 2.0 1.5 3 6 D 12 Bcl-x/18S Ratio Arbitrary units *a a a a 3 a a 0.8 a a a b 0.4 0.0 PCR- Day-4 Day-9 1.6 1.2 24 0 1.5 3 6 b b 12 24 Hours post-treatment Bax/Bcl-x mRNA ratio LD E Day 4 Day 9 b 2 a a 1 0 a a a a *a a 0 1.5 a 3 a a 6 12 24 Hours post-treatment Figura:11. Abbondanza relativa dell’mRNA di Bax e Bcl-xL nei CL prelevati subito prima e a differenti intervalli di tempo dopo l’iniezione di PGF2α a 4 e 9 giorni di pseudogravidanza. A e C mostrano una tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per Bax (165 bp), e per Bcl-xL (228 bp) e per 18S (489 bp). LD: indica il marker per la lunghezza del DNA, PCR-:indica il controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono alle ore dopo la somministrazione della PGF2α. B e D mostrano i dati dell’analisi densitometrica di Bax e Bcl-xL, riportati in unità arbitrarie relative all’espressione del 18S. Il pannello E, mostra i cambiamenti quantitativi dell’espressione dell’mRNA di Bax e BCl-xL, espressi dal rapporto Bax/Bcl-xL. Per ogni stadio lutenico, il valore dell’espressione genica (media±SD) combina i risultati provenienti da tre diverse coniglie, per ogni ora di trattamento. Per ogni stadio luteinico, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente diverso (P<0,01). L’asterisco indica una significativa differenza (P<0,01) dei valori prima del trattamento (ora 0) tra gli stadi luteinici. 78 A 2.0 1.8 Giorno 4 Giorno 9 Giorno 4 β-tubulina Giorno 9 Day-4 Day-9 *a 1.6 Bax/β-tubulin Arbitrary units Bax (21 kDa) B 1.4 1.0 0.8 0.6 a 0.4 0.0 1.5 3 6 12 b a b b 0 24 1.5 b a a 0.2 0 c c 1.2 3 6 a 12 24 Hours post-treatment C 0.8 β-tubulina Giorno 4 0 1.5 3 6 12 24 Day-4 b Bcl-xL/β-tubulin Arbitrary units Bcl-xL (30 kDa) Giorno 4 D 0.7 0.6 0.5 0.4 a 0.3 a 0.2 0.1 0.0 0 1.5 3 6 12 24 Hours post-treatment Figura:12. Abbondanza relativa delle proteine di Bax e Bcl-xL nei CL prelevati subito prima e a differenti intervalli di tempo dopo l’iniezione di PGF2α a 4 e 9 giorni di pseudogravidanza. A e C rappresentano, rispettivamente, l’immunoblot di Bax e Bcl-xL, e della β-tubolina; B e C mostrano l’analisi densitometrica , rispettivamente di Bax e di Bcl-xL, riportata in unità arbitrarie relative alla β-tubulina. Per ogni stadio lutenico, il valore dell’espressione proteica (media±SD) combina i risultati provenienti da tre diverse coniglie, per ogni ora di trattamento. Per ogni stadio luteinico, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente diverso (P<0,01). L’asterisco indica una significativa differenza (P<0,01) dei valori prima del trattamento (ora 0) tra gli stadi luteinici Espressione proteica di p53, Bcl-x e Bax Le variazioni dell’espressione delle proteine di p53,di Bcl-x e di Bax sono state analizzate mediante western blotting dopo il trattamento con la PGF2α, nei CL di entrambe le fasi luteiniche (Figura:10, 12). Prima del trattamento le proteine p53 sono poco espresse sia nei CL di 4 che di 9 giorni. Dopo la somministrazione della PGF2α si registra un aumento (P<0,01) dell’espressione proteica in entrambe le fasi luteiniche (Figura:10, C e D). A 4 giorni l’espressione della proteina p53 aumenta (P<0,01) di circa 30 volte 3 ore dopo il trattamento, e nelle ore successive, diminuisce fino a valori 8 volte maggiori 79 (P<0,01) rispetto a quelli prima del trattamento (Figura:10 C e D). Nei Cl della tarda fase luteale, i livelli dell’espressione proteica di p53 aumentano gradualmente (P<0,01) dopo la somministrazione della PGF2α, fino a raggiungere livelli 12 volte maggiori dopo 12 ore rispetto a quelli prima del trattamento, e poi diminuiscono fino a 24 ore dopo l’iniezione della PGF2α raggiungendo valori 3 volte maggiori rispetto a quelli osservati prima della somministrazione (Figura:10, C e D). Prima del trattamento l’espressione della proteina Bax è 5 volte maggiore (P<0,01) nei CL di 4 giorni rispetto a quelli di 9 (Figura:12, A e B). A 4 giorni di pseudogravidanza, l’espressione proteica di Bax diminuisce di 4 volte (P<0,01) 1,5 ore dopo la somministrazione di PGF2α e nelle ore successive rimane più o meno agli stessi bassi livelli, ma a 12 ore dopo il trattamento si registra un picco (Figura:12, A e B). Nei CL di 9 giorni, i livelli di espressione proteica di Bax rimangono relativamente simili a quelli osservati prima del trattamento, ma dopo 24 ore dall’iniezione della PGF2α si osserva un aumento di 5 volte (P<0,01) rispetto ai valori precedenti (Figura:12,A e B). Prima del trattamento non sono state rilevate bande per BCL-xL, sia nei CL di 4 che di 9 giorni (Figura:12, C e D). Nei CL a 4 giorni di pseudogravidanza è stata rilevata una debole espressione proteica di Bcl-xL solo dopo 6, 12 e 24 ore dopo il trattamento, e a 12 ore c’è un incremento dell’espressione proteica di PGF2α. A 9 giorni di pseudogravidanza non è stata rilevata nessuna reattività verso questa proteina (Figura:12, C e D). Attività enzimatica della NOS L’attività enzimatica totale della NOS luteinica, prima del trattamento, è comparabile in entrambe le fasi luteiniche (Figura:13).Durante le prime 3 ore dalla somministrazione della PGF2α, l’attività enzimatica di NOS aumenta di circa 2 volte (P<0,01) sia nei CL di 4 che di 9 giorni (Figura:13). Nelle ore successive, l’attività enzimatica diminuisce (P<0,01) fino a raggiungere i valori osservati prima del trattamento nei Cl di 4 giorni, mentre nei CL di 9 giorni continua ad aumentare(P<0,01) fino a 6 ore dopo la somministrazione della PGF2α, e poi diminuisce (P<0,01) raggiungendo i valori basali (Figura:13). 80 Total NOS activity in rabbit CL after PGF2α injection 40000 dpm mg/protein Day-4 Day-9 c b 30000 b b b 20000 a a 10000 0 a a 0 a a 12 24 c 1.5 3 6 Hours post-treatment Figura:13. Attività totale di NOS nei CL prelevati subito prima e a differenti intervalli di tempo dopo l’iniezione di PGF2α a 4 e 9 giorni di pseudogravidanza. Per ogni stadio lutenico, i valori (media±SD) combinano i risultati provenienti da tre diverse coniglie, per ogni ora di trattamento. Per ogni stadio luteinico, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente diverso (P<0,01). Valutazione della regolazione luteinica da parte del GnRH Esperimenti in vitro La secrezione basale di progesterone, in vitro, è più alta nei CL di 9 giorni (P<0,01) rispetto a quelli di 4 e 13 giorni, ma la secrezione nei CL di 13 giorni è più alta (P<0,01) rispetto a quella dei CL di 4 giorni (Figura 14, A). Il buserelin riduce (P<0,01) la secrezione di progesterone in vitro sia nei CL di 9 e di 13 giorni, ma non ha effetto sui CL di 4 giorni (Figura 14, A). La coincubazione del buserelin con l’antide, con il composto 48/80, con il 2-aminoetil difenilborinato, con 1-esadecil-2-acetil-sn-glicerolo o con staurosporine neutralizza (P<0,01) gli effetti del solo buserelin sui CL di 9 e 13 giorni (Figura__). Il co-trattamento con buserelin e acido salicilico o con l’inibitore della metil estere N-nitro-L-arginina aumenta la secrezione di progesterone (P<0,01) sia nei CL di 9 e di 13 giorni (Figura 14, A). La co-incubazione del 81 buserelin con il 4-bromofenacil bromide, con propanololo o con 2-O- metiladenosina non neutralizza gli effetti del solo buserelin sui CL di 9 e di 13 giorni. La secrezione basale di PGF2α, in vitro, è più alta (P<0,01) nei CL di 13 giorni rispetto a quelli di 4 e di 9 giorni, ma la secrezione della PGF2α è più elevata (P<0,01) nei CL di 9 giorni rispetto a quelli di 4 giorni (Figura 14, C). Il trattamento con il buserelin aumenta (P<0,01) la secrezione della PGF2α, in vitro, sia a 9 che a 13 giorni di pseudogravidanza (Figura 14, C). Il cotrattamento del buserelin con antide, con l’inibitore della PLC, con l’antagonista di IP3, con l’antagonista del DAG o con l’inibitore della PKA non contrasta (P<0,01) gli effetti del solo buserelin nei CL di 9 e 13 giorni (Figura 14, C). Il co-trattaemento con buserelin e l’inibitore della COX diminuisce (P<0,01) la secrezione di PGF2α nei CL di tutte e tre le fasi luteali, mentre la coincubazione con l’inibitore della NOS non provoca effetti sulla secrezione, indotta dal buserelin, della PGF2α (Figura 14, C). La secrezione basale della PGE2, in vitro, è più elevata (P<0,01) nei CL di 4 giorni rispetto a quelli di 9 e di 13 giorni (Figura 14, B). Il trattamento con il buserelin riduce (P<0,01) la secrezione, in vitro, della PGE2 nei CL di 13 giorni (Figura 14, B). Il co-trattamento del buserelin con antide, con l’inibitore della PLC , con l’antagonista di IP3, con l’antagonista del DAG o con l’inibitore della PKA contrasta (P<0,01) gli effetti del buserelin da solo sui CL di 13 giorni (Figura 14, B). Il co-trattamento con l’inibitore della COX diminuisce (P<0,01) la secrezione della PGE2 nei CL di tutte e tre le fasi luteali, mentre il cotrattaemnto con l’inibitore della NOS non provoca nessun effetto sulla secrezione, indotta dal buserelin, della PGE2 (Figura 14, B). Attività enzimatica L’attività enzimatica basale della COX-1 è più alta (P<0,01) nei CL di 13 giorni rispetto a quella dei CL di 4 e 9 giorni (Figura 15, A). Tutti i trattamenti non provocano alcun effetto sull’attività enzimatica della COX-1 in tutti e tre i tipi di CL, ad eccezione dell’inibitore della COX-1 che, invece, provoca la diminuzione (P<0,01) dell’attività enzimatica (Figura 15, A). L’attività enzimatica basale della COX-2, dei CL di 13 giorni, è più alta (P<0,01) rispetto a quella dei CL di 4 e 9 giorni; tuttavia l’attività enzimatica della COX-2 è comunque più alta (P<0,01) nei CL di 9 giorni rispetto a quella dei CL a 4 giorni di pseudogravidanza (Figura 15, B).Il buserelin aumenta (P<0,01) l’attività enzimatica della COX-2 in tutti gli stadi luteinici (Figura 15, 82 B). Il co-trattamento del buserelin con antide, con l’inibitore della PLC , con l’antagonista di IP3, con l’antagonista del DAG o con l’inibitore della PKA contrasta (P<0,01) gli effetti del buserelin da solo (Figura 15, B). Il cotrattaemento con l’inibitore della COX diminuisce (P<0,01) l’attività enzimaticain tutti e tre i tipi di CL; mentre la co-incubazione del buserelin con l’inibitore della NOS non ha effetti sull’aumento, indotto dal buserelin, dell’attività enzimatica di COX-2 (Figura 15, B). L’attività enzimatica basale di NOS è più elevata (P<0,01) nei CL di 4 giorni rispetto a quelli di 9 giorni (Figura 15, C). Il trattamento con il buserelin aumenta (P<0,01) l’attività enzimatica della NOS sia nei CL di 9 che di 13 giorni (Figura 15, C). Il co-trattamento del buserelin con antide, con l’inibitore della PLC , con l’antagonista di IP3, con l’antagonista del DAG o con l’inibitore della PKA contrasta (P<0,01) gli effetti del buserelin da solo sia nei CL di 9 che in quelli di 13 giorni (Figura 15, C).Il co-trattamento con l’inibitore della NOS diminuisce (P<0,01) l’attività enzimatica della NOS in tutte e tre gli stadi luteinici, mentre il co-trattamento con buserelin e l’inibitore della COX ne provoca la diminuzione (P<0,01) sia nei CL di 9 che in quelli di 13 giorni (Figura 15, C). Immunolocalizzazione di GnRH-R tipo I L’immunopositività per GnRH-R I è stata rilevata nel citoplasma delle cellule luteiniche e endoteliali (Figura 16, 1a);inoltre è stata trovata nel citoplasma degli ovociti e nel citoplasma delle cellule follicolari e della teca presenti sia nei follicoli antrali che nei follicoli pre-antrali (Figura 16, 1b). L’immunopositività è stata evidenziata anche nel citoplasma degli ovociti delle cellule follicolari allo stadio di follicoli primordiali (Figura 16), nell’epitelio ovario (Figura 16), e nelle cellule endocrine interstiziali (Figura 16). Le cellule dei fibroblasi intermedi entro i CL non hanno mai mostrato segnali di positività. Durante le tre fasi luteiniche, non sono state osservate differenze nella localizzazione e nell’intensità. Le procedure di colorazione controllo non hanno rilevato un segnale positivo apprezzabile in nessuno dei siti descritti per il GnRH-R (inserto Figura 16). Espressione genica del GnRH-R nel CL Attraverso questa modifica del protocollo standard per la retrotascrizione siamo riusciti a rilevare con elevata specificità la presenza del GnRH-R nei CL di 83 coniglio e aumentare la sensibilità della PCR. Il trascritto non è stato rilevato nel campione di CL retrotrascritto con random esameri mentre è ben visibile sia nei campioni retrotrascritti con gli oligo(dT) che in quelli rettrotrascritti con la coppia di primers specifica per il GnRH-R (Figura 17). 84 A Progesterone (pg/mg of protein) 10000 Day 4 Day 9 Day 13 8000 6000 a α a PGE2 (pg/mg of protein) 1000 a a PGF2α (pg/mg of protein) a a a a a a a Day 4 Day 9 a Day 13 α a a a a a 500 β βa a a a a a ab 0 6000 C a a a aa a a b a b a 2000 0 1500 B a γ a c c β a 4000 c c 3000 a a β a a a a α a a a b bb b b a a a 2000 1000 a b γ a 4000 a Day 4 Day 9 Day 13 b 5000 a a a a a a a a a a a a a bcc 0 l i i i i i i 1 ntro H tide LC IP3 AG KC OX OS Co GnR1+an H1+PRH1+ H1+D H1+PH1+C 1+N H RH GnR Gn GnR GnR GnR GnR Gn Figura: 14. Effetti in vitro del trattamento con l’agonista del GnRH-1 (buserelin, GnRH-1), da solo e co-incubato con l’antagonista del GnRH-1 (antide), del IP3 (2-aminoetil difenilborinato,IP3a) e del DAG (1-esadecil-2acetil glicerolo,DAGa), e con gli inibitori per la PLC (composto 48/80, PLCi), per la PKC (stautosporine, PKCi), della COX (acido acetilsalicilico, COXi),e della NOS (N-nitro-L-arginina metil estere, NOSi) sul rilascio del progesterone (pannello A), della PGE2 (pannello B), e della PGF2α (pannello C), da parte di CL di coniglio a 4, 9 e 13 giorni di pseudogravidanza. I valori ottenuti rappresentano la media±SD dei dati ottenuti da cinque replicati. Le differenti lettere, presenti sopra le colonne, rappresentano valori significativamente diversi (P<0,01). Le lettere greche indicano valori significativi per i controlli, mentre le lettere latine indicano valori significativi per i gruppi sperimentali. (I dati relativi alle co-incubazioni con gli inibitori della PLA2, della PLD e dell’AC, non sono stati inseriti perché non provocavano nessuna variazione rispetto agli effetti del buserelin da solo) 85 COX-1 (dpm/mg of protein) 30000 A 25000 Day 4 Day 9 Day 13 β a a 20000 a a a a a a 15000 10000 αα aa a a a a aa aa aa a aa a 5000 bb b COX-2 (dpm/mg of protein) B 0 60000 bb 50000 40000 Day 4 Day 9 Day 13 γ a a a 30000 b b a a a 20000 10000 β a α a b a a a a a a a a 0 50000 NOS (dpm/mg of protein) C b a a cc c Day 4 Day 9 Day 13 bb 40000 30000 20000 10000 α a αβ a βa a a a a a a a a a a aaa a a a a cc ddd 0 l i i i i i i 1 ntro H tide LC IP3 AG KC OX OS Co GnR1+an H1+PRH1+ H1+D H1+PH1+C H1+N H R n R R Gn G GnR Gn GnR GnR Gn Figura: 15. Effetti in vitro del trattamento con l’agonista del GnRH-1 (buserelin, GnRH-1), da solo e co-incubato con l’antagonista del GnRH-1 (antide), del IP3 (2-aminoetil difenilborinato,IP3a) e del DAG (1-esadecil-2acetil glicerolo,DAGa), e con gli inibitori per la PLC (composto 48/80, PLCi), per la PKC (stautosporine, PKCi), della COX (acido acetilsalicilico, COXi),e della NOS (N-nitro-L-arginina metil estere, NOSi) sull’attività enzimatica della COX-1 (pannello A), della COX-2 (pannello B), e della NOS (pannello C), da parte di CL di coniglio a 4, 9 e 13 giorni di pseudogravidanza. I valori ottenuti rappresentano la media±SD dei dati ottenuti da cinque replicati. Le differenti lettere, presenti sopra le colonne, rappresentano valori significativamente diversi (P<0,01). Le lettere greche indicano valori significativi per i controlli, mentre le lettere latine indicano valori significativi per i gruppi sperimentali. (I dati relativi alle co-incubazioni con gli inibitori della PLA2, della PLD e dell’AC, non sono stati inseriti perché non provocavano nessuna variazione rispetto agli effetti del buserelin da solo) 86 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm Figura:16. Immunoistochimica delle ovaie di coniglio durante la fase intermedioa di pseudogravidanza. 1a) L’immunopositività è evidente nel citoplasma delle cellule luteiniche (L) e nelle cellule endoteliali (freccie), (inserto: controllo della sezione in assenza dell’antoicorpo primario); 1b) il segnale per GnRH è rilevato nel citoplasma dell’ovocita (O) e nel citolasma delle cellule follicolari (F), delle cellule della teca (T) e nelle cellule endocrine interstiziali presenti (I) nel follicoli antrale (inserto: controllo sezione); 1c) la colorazione è localizzata nel citoplasma dell’ovocita O) e nel citolasma delle cellule follicolari (F), delle cellule della teca (T) presenti nei follicoli pre-antrali 1d) la colorazione è evidente nel citoplasma dell’ovocita e nel citoplasma dei follicoli presenti nel follicolo primario (freccie) e nell’epitelio ovarico (testa della freccia), (inserto: controllo). Scala: 20 µm 87 GnRH-R 121 bp LD PCR- 0 6 RT GnRH-R 12 0 6 12 RT oligo(dT) 0 Ipf RT random esameri Figura:17. Tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, che mostra la presenza delle bande di lunghezza attese, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per il GnRH-R (121 bp), nei CL di coniglie. LD: indica il marker per la lunghezza del DNA; PCR-: indica il controllo negativo; 0, 6, 12 RT GnRH-R indicano l’utilizzo per la PCR di cDNA di CL di 4 giorni a 0, 6, 12 ore di trattamento con la PGF2α retrotrascritti con i primers specifici per il GnRH-R; 0, 6, 12 RT oligo(dT) indicano l’utilizzo per la PCR di cDNA di CL di 4 giorni a 0, 6, 12 ore di trattamento con la PGF2α retrotrascritti con oligo(dT); 0 e Ipf RT random esameri indicano l’utilizzo per la PCR di cDNA di CL a 4 giorni a 0 ore e cDNA di adenoipofisi retrotrascritti con random esameri. 88 Discussione Molte evidenze sperimentali suggeriscono che il 17β-estradiolo esercita azioni sia luteotrofiche che luteolitiche, a seconda delle specie, attraverso regolazione genica mediata dal suo recettore ER [Schams e Berisha,2002]. Nell’ovaio di coniglio la forma predominante, del recettore degli estrogeni, è α, l’isoforma che è associata al compartimento citosolico [Monje e Boland,2001]. Nel nostro studio si evidenza una chiara differenza, nei livelli dell’espressione basale, dei trascritti di ERα, tra lo stadio luteinico precoce e quello intermedio, e l’espressione è minore nei CL a 4 giorni di pseudogravidanza. Tuttavia, mentre a 4 giorni l’abbondanza relativa dell’mRNA non viene influenzata dal trattamento con la PGF2α, a 9 giorni l’mRNA di ERα è ampiamente dawn-regolata già 6 ore dopo la somministrazione della PGF2α. La diminuzione dei trascritti di ERα coincide con la diminuzione della concentrazione plasmatica del progesterone, che si riscontra 6 ore dopo l’iniezione della PGF2α nel tessuto luteinico della fase luteinica intermedia, e 8 ore dopo nella circolazione sanguigna periferica [Boiti et al.,2004]. Studi precedenti indicano che la perdita della capacità steroidogenica dei CL è associata con la contemporanea diminuzione dei recettori luteinici per gli estrogeni, e che c’è una relazione tra il contenuto dei recettori per gli estrogeni luteinici e la sintesi di progesterone stimolata dall’estradiolo [Yuh e Keyes,1982]. In base al loro aspetto morfologico, molte delle cellule ERα immunoreattive sono steroidogeniche, caratterizzate da nuclei rotondi e citoplasma vacuolizzato. Tuttavia, alcune cellule positive per ERα presentano nuclei allungati, suggerendo che, anche, altre cellule luteiniche possono esprimere il recettore ERα. Dati recenti suggeriscono che la luteolisi potrebbe essere un evento mediato dalle cellule immunitarie, e le cellule del sistema immunitario che normalmente risiedono nel CL vengono ora identificate come mediatori chiave della durata del CL, agendo nelle vicinanze delle cellule luteiniche, endoteliali, stromali e immunitarie attraverso un’ampia schiera di citochine comprese: TNFα, MCP-1 e IL-2 [Boiti et a.,2004; Adashi,1990; Bagavandoss et al.,1990]. Tra queste, l’IL1 è stata identificata nell’ovaio di molte specie incluso il coniglio [Takehara et al.,1994], dove svolge un ruolo nello sviluppo follicolare, nell’ovulazione, e nella steroidogenesi [Bréard et al.,1998]. Nel nostro studio, in seguito alla somministrazione della PGF2α, l’mRNA dell’IL-1β aumenta entro le 3 ore dal trattamento sia a 4 che a 9 giorni di pseudogravidanza, ma in seguito il profilo 89 di espressione cambia a seconda della fase luteinica. Questa differenza potrebbe dipendere dal cambiamento nella composizione cellulare dei CL e dalla variazione dell’ambiente endocrino all’interno dei CL. Tuttavia, il sistema monociti/macrofagi, normale componente del CL del coniglio durante il suo sviluppo [Koering,1974; Bagavandoss et al.,1990],è la fonte primaria di IL-1β . Questa citochina è rilasciata anche dall'ovaio, dai fibroblasti , dalle cellule endoteliali e luteiniche [Estevez et al.,2002] e anche dalle cellule della teca e della granulosa [Bréard et al.,1998]. Durante la spontanea regressione dei CL è stato rilevato un aumento del numero delle cellule immunitarie [Takehara et al.,1994; Krusche et al.,2002]. Quindi, l’aumento dell’espressione genica dell’IL-1β, dopo la somministrazione della PGF2α, osservato nei CL di 9 giorni di pseudogravidanza, potrebbe essere correlato all’influsso dei macrofagi, a questo stadio, come riscontrato nei bovini [Townson et al.,2002]. L’interleuchina-1β svolge molteplici funzioni nell’ovaio [Gérard et al.,2004]: diminuisce la secrezione di progesterone, aumenta la sintesi delle prostaglandine, induce l’espressione dei recettori per la PGF2α, inibisce la degradazione dell’mRNA di COX-2 [Narko et al.,1997], e aumenta la produzione di ossido nitrico (NO), attivando l’ossido nitrico sintasi (NOS) costitutivo e/o inducibile [Estevez et al.,2002]. Recentemente, abbiamo osservato che la somministrazione di PGF2α provoca una marcata upregolazione dell’espressione e dell’attività di COX-2 e un aumento del rilascio di PGF2α solo nei CL che hanno acquisito una capacità luteolitica a 9 giorni di pseudogravidanza [Zerani et al.,2007]. Ciò suggerisce, anche se indirettamente, che questa citochina potrebbe essere coinvolta nell’attivazione del pathway della sintesi intra-luteinica della PGF2α, up-regolando l’attività della NOS e della COX-2. Quindi, questi risultati indicano che l’IL-1β svolge un ruolo centrale nel promuovere la regressione funzionale dei corpi lutei che hanno acquisito una capacità luteolitica. Dopo 1,5 ore dal trattamento con la PGF2α si osserva un marcato aumento dell’attività luteinica della NOS sia a 4 che a 9 giorni di pseudogravidanza. Tuttavia si hanno differenze nell’attività enzimatica di NOS tra la fase luteinica precoce e quella intermedia. Infatti nei CL di 4 giorni l’attività enzimatica di NOS diminuisce, mentre nei CL di 9 giorni aumenta 6 ore dopo il trattamento, e poi diminuisce nelle ore successive. L’NO è ora noto per svolgere molteplici funzioni, infatti esso è coinvolto nella risposta immunitaria, nella differenziazione cellulare e nell’apoptosi in numerosi sistemi dove modula funzioni chiave in molti processi fisiologici e patologici [Ignarro,1996]. Studi sia in vitro che in vivo hanno mostrato che l’NO, nell’ovaio, controlla l’ovulazione e 90 regola la steroidogenesi luteinica così come la regressione dei CL, attraverso la nitrazione e l’ossidazione di specifiche proteine [Motta et al.,2001]. L’attività totale della NOS in vitro dopo la somministrazione della PGF2α è maggiore nei CL di 9 che in quelli di 4 giorni di pseudogravidanza [Boiti et al.,2000].È stato osservato che, nelle cellule luteiniche bovine, le specie reattive dell’ossigeno (ROS) modulano l’attivazione dei segnali che promuovono l’apoptosi up-regolando l’espressione dell’mRNA della COX-2, di p53 e di Bax [Nakamura e Sakamoto,2001]. Il fattore di trascrizione p53, tra le sue molteplici funzioni agisce come soppressore dei tumori causando l’arresto della crescita o l’apoptosi in risposta ad una varietà stress cellulari [Liebermann et al.,2007]. La proteina p53 interagisce con almeno 6 membri della famiglia delle Bcl-2. La trascrizione del gene Bcl-x, appartenente alla famiglia delle Bcl-2, produce, per splicing alternativo, due proteine, di lunghezza e funzioni diverse, la forma lunga ha funzioni anti-apoptotiche (Bcl-xL, isoforma lunga) mentre la forma breve (Bclxs, isoforma breve) promuove il processo apoptotico. La proteina p53 interagisce con i membri della famiglia Bcl-2 inibendo l’attività antiapoptotica di Bcl-xL e attivando l’attività pro-apoptotica di Bax [Sot et al.,2007]. Nel nostro studio si osserva che i livelli di espressione, prima del trattamento, dell’mRNA di p53 e di Bax sono confrontabili sia a 4 che a 9 giorni di pseudogravidanza, mentre i trascritti per il gene anti-apoptotico Bcl-xL sono più elevati nei CL di 4 giorni rispetto a quelli di 9 giorni. Il rapporto tra i livelli dell’mRNA di Bax/Bcl-x , è un indice utilizzato per indicare la suscettibilità di un sistema cellulare verso i segnali apoptotici, se questo rapporto è basso ci sono meno possibilità che venga attivato il pathway apoptotico. I nostri dati indicano che questo rapporto è basso per i CL di 4 giorni, mentre è più elevato in quelli di 9 giorni di pseudogravidanza. Tuttavia, analizzando l’espressione proteica osserviamo che i livelli proteici di p53 sono molto bassi in entrambe le fasi luteiniche, mentre la quantità relativa della proteina di Bax è più elevata a 4 giorni che a 9 giorni di pseudogravidanza, e che l’espressione proteica di Bcl-xL non è rilevabile in entrambe le fasi luteiniche. Mediante la tecnica dell’immunoistochimica, sono state trovate reazioni positive per p53 e Bax, anche se a differenti livelli di intensità, nelle cellule dei CL di 4 e 9 giorni prima del trattamento con la PGF2α. Al contrario, nei CL non sono state trovate reazioni positive per Bcl-xL, mentre son state rilevate colorazioni positive solo negli ovociti dei follicoli primari, suggerendo che questa proteina protegge queste cellule dagli stimoli apoptotici. I nostri dati confermano che le proteine p53 e Bax sono costitutivamente espresse nel CL di coniglio indipendentemente dallo stadio di 91 sviluppo, e questo è in accordo con quanto è stato osservato in altre specie [Rueda et al.,1997; Yadav et al.,2005; Gürsoy et al.,2008]. Tuttavia il ruolo di p53, Bax e Bcl-xL, nella regolazione della cascata luteolitica è ancora controverso, questi risultati suggeriscono che i CL sia di 4 che di 9 giorni sono intrinsecamente suscettibili all’apoptosi. Il progesterone è anche conosciuto per esercitare un’azione protettiva sulla sopravvivenza delle cellule luteiniche e contrasta la regressione funzionale del CL [Goyeneche et al.,2003]. Tuttavia dei fattori luteinici che agiscono localmente, con modalità paracrina e/o autocrina, potrebbero essere coinvolti nella modulazione dell’espressione dei geni pro e anti-apoptotici. Nei CL di 4 giorni di pseudogravidanza si verifica una diminuzione dei livelli dell’mRNA di p53 dopo la somministrazione della PGF2α, mentre gli mRNA di Bax e Bcl-xL rimangono pressoché costanti e il loro rapporto rimane costantemente basso. Tuttavia l’espressione proteica dei p53 aumenta, mentre quella di Bax diminuisce 1,5 ore dopo il trattamento. Un simile comportamento si osserva anche durante le ore successive alla somministrazione della PGF2α, anche se a differenti livelli. È interessante notare che Bcl-xL, che prima del trattamento non era rilevabile, viene espressa dopo 6 ore dal trattamento. Inoltre si evidenziano chiaramente delle bande per Bcl-XL a 12 e a 24 ore dalla somministrazione di PGF2α, che sono correlate con la resistenza all’azione luteolitica della PGF2α dei CL nella fase precoce di sviluppo. Al contrario nei CL di 9 giorni di pseudogravidanza, l’espressione genica di p53 è inizialmente upregolata fino a 3 ore dopo l’iniezione della PGF2α, ma poi, durante il corso della luteolisi funzionale, diminuisce ritornando ai valori prima del trattamento. L’espressione dei trascritti di Bax è marcatamente down-regolta 6 ore dopo il trattamento, e un simile profilo è stato osservato per Bcl-xL. Nei CL dei bovini, durante la regressione, non si osservano variazioni dell’espressione genica di Bcl-xL e di p53 durante la luteolisi funzionale rispetto ai CL regrediti [Rueda et al.,1997]. Anche nei CL di ratto, durante la regressione spontanea, questi due geni apoptotici non variano la loro espressione [Trott et al.,1997]. Nel presente studio, sia le proteine di p53 che di Bax aumentano durante la fase luteinica intermedia in seguito al trattamento con la PGF2α, ai differenti intervalli di tempo e a differenti livelli, ma il prodotto proteico di p53 diviene non rilevabile 24 ore dopo il trattamento. Invece, non si rileva un segnale apprezzabile per Bcl-xL né mediante western blotting, durante la luteolisi indotta dalla PGF2α e neanche mediante la tecnica immunoistichimica negli intervalli di tempo analizzati. Durante la regressione luteale nei CL di ratto, si rileva una graduale riduzione dell’espressione proteica di p53 [Trott et 92 al.,1997]. Negli uomini la proteina Bax viene espressa costantemente durante la fase lutale [Vaskivuo et al.,2002]. La somministrazione della PGF2α provoca un aumento del rapporto di Bax e Bcl-2 nei Cl dei bufali e dei bovini, sia prima che 4 ore dopo il trattamento, che rimane elevato fino a dopo18 ore [Yadav et al.,2005]. I nostri dati suggeriscono che l’apoptosi viene controllata da questi geni e che son attivamente coinvolti in maniera opposta,essi inibiscono o promuovono questo processo in dipendenza dllo stadio di sviluppo luteinico. Questi risultati contrastanti, presi insieme, suggeriscono che il meccanismo che conduce all’apoptosi nei CL dei mammiferi può differire tra le specie. La presenza del recettore per il GnRH è stata evidenziata nel citoplasma delle cellule luteali durante tutte le fasi della pseudogravidanza. La presenza del GnRH-R, così come in altre specie, supporta un ruolo diretto del GnRH nella regolazione delle funzioni luteiniche nei conigli. Inoltre reazioni positive sono state osservate in altre cellule dell’ovaio di coniglio, come negli ovociti, nelle cellule della teca e follicolari, sottolineando così un potenziale ruolo del sistema GnRH/GnRH-R nella modulazione delle funzioni ovariche nei mammiferi [Ramakrishnappa et al.,2005]. È stato dimostrato che il GnRH esercita sia effetti inibitori che stimolatori nelle gonadi, causando sia effetti inibitori che stimolatori sulla produzione di steroidi da parte delle cellule ovariche [Ramakrishnappa et al.,2005]. Nei bovini, il trattamento con due antagonisti del GnRH, buserelin e deslorelin, provoca sia, in vivo che in vitro, effetti inibitori sul rilascio di progesterone [Milvae et al.,1984; D’Occhio e Aspden,1999]. Mentre, è stato dimostrato che il GnRH ha effetti stimolatori sulla produzione di progesterone nelle scimmie e nelle cellule della granulosa nell’uomo [Liu et al.,1991; Bussenot et al., 1993; Casper et al.,1984]. Nei conigli, l’antagonista del GnRH influenza direttamente l’ovaio inducendo l’ovulazione, sia negli animali ipofisectomizzati che in vitro [Koos e LeMarie, 1985]. All’11° giorno di pseudogravidanza, la somministrazione del GnRH induce la luteinizzazione dei follicoli ovarici e la regressione funzionale dei CL e ciò è provato dalla diminuzione dei livelli di progesterone in 3 giorni [Rippel et al.,1976]. I nostri dati supportano l’idea che il GnRH abbia un ruolo diretto nella downregolazione della produzione di progesterone da parte del CL. Gli esperimenti in vitro mostrano che il buserelin riduce la produzione di progesterone in colture di CL a 9 e 13 giorni di pseudogravidanza. Questo ruolo del GnRH è supportato, anche, dai dati provenienti dalla co-incubazione con un antagonista del GnRH, l’antide, che neutralizza la diminuzione del progesterone indotta dal buserelin. 93 Recentemente, abbiamo dimostrato, attraverso studi in vitro di CL di coniglie pseudogravide, che la PGF2α e la PGE2 influenzano, in maniera differente, il rilascio di progesterone, a seconda dello fase luteinica [Boiti e al.,2001]. La PGE2 deprime l’attività enzimatica di NOS e aumenta la produzione di progesterone nei CL di 4 giorni, ma non ha effetti nei CL di 9 giorni; al contrario, la PGF2α up-regola l’attività enzimatica di NOS e induce la luteolisi funzionale nei CL di 9 giorni, ma non ha alcun effetto nei CL nella fase precoce luteinica. Questo meccanismo fisiologico protegge la crescita dei CL dalla luteolisi funzionale durante la fase luteinica intermedia, fino a 6 giorni di pseudogravidanza, quando il CL , da refrattario diventa parzialmente suscettibile alla PGF2α esogena, e acquisisce una competenza luteolitica [Boiti et al.,2001; Boiti et al.,2003; Boiti et al.,1998]. I dati sulla inefficacia del buserelin durante la fase precoce luteinica, suggerisce che il meccanismo che protegge dalla luteolisi, include anche il sistema GnRH/GnRH-R I, almeno in vitro. Molti studi indicano che il GnRH, complessato con il suo recettore, attiva principalmente la PLC via Gq/11, appartiente alla famiglia delle proteine G. la PLC catalizza l’idrolisi del IP3 e DAG [Millar,2005]. I nostri dati confermano che questo meccanismo, post-recettoriale, è presente anche nei CL di coniglio. Infatti, gli effetti del buserelin sulla diminuzione del rilascio del progesterone, da parte dei CL di 9 e 13 giorni, vengono neutralizzati dalla co-incubazione con gli inibitori della PLCe della PKC e con gli antagonisti dell’IP3 e DAG, mentre gli inibitori di AC, PLA2 e PLD non hanno alcuna influenza. Uno studio recente mostra che nelle cellule gonadotrofe della linea LβT2, il GnRH produce una induzione, tempo-dipendente, dell’espressione della COX-2 e aumenta la produzione di PGE2 e PGF2α [Naor et al.,2007]. Questi autori ipotizzano un nuovo pathway di segnalazione mediato dalla PGF2α, che agisce attraverso una modalità autocrina/paracrina. Il nostro lavoro suggerisce che gli effetti del GnRH sulla produzione di progesterone da parte del CL di coniglio sono mediati dall’attivazione del pathway COX-2/PGF2α/NOS. Infatti, il buserelin aumenta, in vitro, l’attività della COX-2, la produzione della PGF2α e l’attività della NOS nei CL sia a 9 che a 13 giorni di pseudogravidanza, e ciò coincide con la diminuzione del rilascio di progesterone. Inoltre, il cotrattamento con antide, con l’inibitore della PLC e della PLK o con gli antagonisti dell’IP3 e del DAG, neutralizza le azioni del buserelin sulla COX-2, sulla PGF2α, sulla NOS e sul progesterone, mentre l’inibitore della COX neutralizza gli effetti del buserelin sulla NOS e sul progesterone, e a sua volta l’inibitore della NOS ha effetti solo sul progesterone. La diminuzione della 94 PGE2, indotta dal buserelin nei CL di 13 giorni, è probabilmente dovuta all’aumento della conversione, di questa prostaglandina, in PGF2α attraverso l’attivazione dell’enzima PGE2-9-chetoriduttasi, e/o l’attivazione della PGE2 sintasi. Un simile meccanismo intracellulare è stato riportato per il loop auto amplificante della PGF2α, utilizzato dal CL durante il processo luteolico [Zerani et al.,2007]. I nostri risultati indicano, anche, che i CL nella fase precoce, refrattari ai fattori luteolici lo sono anche agli effetti del GnRH, dal momento che gli effetti del buserelin sulla produzione ormonale e sull’attività enzimatica si verifica solo nei CL di 9 e 13 giorni di pseudogravidanza. 95 Conclusioni I nostri dati indicano che nei CL di conigli, durante la luteolisi indotta dalla PGF2α, si verifica un cambiamento dinamico dell’espressione genica e proteica di geni direttamente coinvolti nel controllo del processo apoptotico. Questo avviene nei CL che hanno acquisito una capacità luteolitica, (CL a 9 giorni di pseudogravidanza). Inoltre, a questo stadio luteinico, si assiste ad una simultanea up-regolazione dei trascritti dei geni p53 e IL-1 e l’aumento dell’attività enzimatica della NOS precede la down-regolazione dei geni che codificano per ERα e per Bcl-xL. Quindi la regressione, indotta dal trattamento con la PGF2α, sembra esere dovuta a distinti processi che coinvolgono sia il pathway steroidogenico, come viene dimostrato dalla down-regolazione dell’espressione genica del recettore per gli estrogeni (ERα), che i segnali apoptotici, poiché si verifica un dinamico cambiamento dell’espressione genica e proteica di p53 e Bcl-xL. Inoltre l’aumento dell’attività enzimatica della NOS, provoca un aumento della formazione di ossido nitrico (NO), che è coinvolto nella risposta immunitaria, nella differenziazione cellulare e nell’apoptosi, e che è anche una specie reattiva dell’ossigeno (ROS). Ciò ci fa ipotizzare che le ROS, provocate dall’azione della PGF2α, possano avere un ruolo di regolazione durante le distinte fasi dell’attivazione/modulazione dei singoli geni coinvolti nel processo apoptotico. Per quanto riguarda lo studio sugli effetti, in vitro, del GnRH sulla regolazione delle funzioni del CL, i nostri dati indicano che il GnRH downregola, direttamente, la produzione del progesterone da parte dei CL che hanno acquisito una capacità luteolitica. Questo effetto sembra essere dovuto ad un meccanismo recettoriale o post recettoriale. In base ai nostri risultati è stato ipotizzato un meccanismo d’azione per il GnRH: il GnRH si lega al suo recettore attivando la PLC, con conseguente rilascio di IP3 e di DAG. Questi due messaggeri intracellulari, attivando la PKC, determinano l’attivazione della COX-2, con conseguente aumento della produzione di PGF2α. Questa prostaglandina induce un aumento dell’attività enzimatica di NOS [Boiti et al.,2003], e avviene la sintesi di ossido nitrico che down regola la produzione di progesterone [Boiti et al.,2000]. 96 Capitolo II Bilancio energetico nella riproduzione Il legame tra il bilancio energetico e la riproduzione deriva direttamente dalla teoria dell’evoluzione. In accordo con questa teoria, i meccanismi fisiologici che si osservano nelle popolazioni ancora esistenti sono il risultato di una selezione naturale che si è attuata grazie a variazioni genetiche casuali in popolazioni ancestrali. Quindi, i meccanismi che controllano l’assunzione, l’immagazzinamento e il consumo di energia, esistono perché questi meccanismi sono in certa misura ereditari e permettono agli animali di sopravvivere alla maturità riproduttiva, conferendo loro un vantaggio riproduttivo. Le cellule viventi hanno bisogno di un continuo apporto di nutrienti per la biosintesi e per il metabolismo, ma la disponibilità di cibo e la richiesta energetica fluttuano in molti habitat, e molti animali smettono di mangiare quando si dedicano a comportamenti per la perpetuazione della specie. Quando il tratto digestivo è vuoto, l’organismo dipende da riserve energetiche sia interne che esterne (rispettivamente grasso corporeo e cibo accumulato). Durante l’evoluzione degli animali, l’abilità di depositare grandi quantità di energia all’intero dell’organismo e i meccanismi che inibiscono comportamenti d’ingestione devono aver permesso agli animali di impegnarsi in altre attività che hanno migliorato il successo riproduttivo. È stato ipotizzato che i meccanismi che controbilanciano attività energeticamente dispendiose associate alle cure parentali, abbiano conferito un vantaggio riproduttivo. Per esempio, molte specie incrementano l’assunzione di cibo durante il periodo di intense cure parentali, mentre altre incrementano sia l’assunzione che l’accumulo energetico in previsione della nascita della prole. Prima della nascita dei figli, le femmine di alcune specie di mammiferi mangiano molto e depositano grandi quantità di nutrienti sotto forma di lipidi nel tessuto adiposo, e queste riserve energetiche verranno utilizzate durante l’allattamento. In altre specie di mammifero, l’assunzione di cibo rimane bassa per tutto il tempo della gravidanza, mentre aumenta l’accumulo di provviste di cibo che verranno consumate durante il periodo dell’ allattamento. Quindi i meccanismi che controllano il bilancio energetico sono integrati con i meccanismi che controllano la riproduzione [Bronson,1989; Bronson,2000; Schneider et al.,2002; Wade et al.,1992; Wade et al.,1996]; di conseguenza non si può comprendere la fisiologia del bilancio energetico e l’inclinazione di 97 ogni specie ad accumulare riserve energetiche se non le si mette in relazione con il successo riproduttivo. L’abilità di monitorare la disponibilità energetica sia interna che esterna deve essere centrale per il legame tra la riproduzione e il bilancio energetico. Questa abilità permette agli animali di dare priorità a quei comportamenti che si accordano alle fluttuazioni energetiche e alle condizioni riproduttive. Per esempio, quando c’è abbondanza di cibo e le richieste energetiche sono basse, l’energia è disponibile per tutti i processi necessari a un’immediata sopravvivenza, incluso biosintesi delle proteine, mantenimento del gradiente ionico, rimozione delle sostanze di rifiuto, termogenesi, locomozione, ricerca del cibo, ingestione e digestione. Le priorità energetiche includono investimenti a lungo termine, come la crescita, funzioni immunitarie, e la riproduzione. Comportamenti legati alla difesa del territorio, corteggiamento, accoppiamento e cure parentali ricevono un’elevata priorità, e la disponibilità energetica in eccesso viene immagazzinata come lipidi nel tessuto adiposo o conservata come provviste nella tana, nel nido o nel cunicolo. I segnali metabolici, i mediatori ormonali, i modulatori e i neuropeptidi danno espressione a queste priorità in almeno due vie collegate. Primo: sono permissivi per gli eventi neuroendocrini che controllano la spermatogenesi, i cicli ovulatori e la fertilità. Secondo: in molte specie gli stessi segnali metabolici e i messaggeri chimici che aumentano la motivazione ad assumere comportamenti riproduttivi attenuano anche la spinta ad impegnarsi nella ricerca di cibo, nell’ accumulare cibo e nel mangiare [Schneider et al., 2002; Wade et al., 1996]. Al contrario quando le risorse energetiche sono scarse, i meccanismi fisiologici che ripartiscono l’utilizzazione energetica tenderanno a favorire quei processi che assicurano la sopravvivenza dell’individuo, soprattutto quei processi che favoriscono la crescita, la longevità e la riproduzione. Tuttavia, i processi fisiologici che promuovono la ricerca, l’accumulo e l’ingestione di cibo ricevono priorità rispetto alla riproduzione, poiché i processi riproduttivi sono energeticamente dispendiosi e possono essere ritardati quando è in pericolo la sopravvivenza dell’individuo [Bronson, 1986; Bronson, 1988; Bronson, 1989; Bronson, 2000]. Per esempio, durante le stagioni in cui la disponibilità di cibo è bassa e le esigenze di termoregolazione sono alte, i membri di alcune specie di mammiferi subiscono una regressione delle gonadi e diventano sessualmente inattivi. Anche nelle specie che si riproducono durante tutto l’anno, quando c’è scarsa disponibilità di cibo o quando si è in presenza di un’aumentata richiesta 98 energetica che non può essere soddisfatta dall’apporto di sostanze nutrienti, i processi riproduttivi vengono inibiti [Bronson, 1989]. Durante questi cambiamenti energetici, gli animali sono predisposti al mangiare, alla ricerca e alla raccolta di cibo, da una varietà di stimoli sensoriali metabolici (per esempio: diminuita disponibilità di glucosio e dei suoi metaboliti), dagli ormoni periferici (bassa concentrazione plasmatica di insulina e di leptina) e dai circuiti centrali che stimolano l’alimentazione (es.: circuiti che coinvolgono il neuro peptide Y). Il significato adattativo dei circuiti che stimolano l’alimentazione è relativo alla sopravvivenza (apportare energia metabolica, nutrienti, acqua, sale e altri minerali nell’organismo per mantenere la struttura e la funzione cellulare) in quanto la sopravvivenza è un prerequisito per il successo riproduttivo. I neuropeptidi che stimolano l’animale a mangiare e a ricercare il cibo, aumentano anche la spinta alla sopravvivenza durante le fluttuazioni energetiche, inibendo il sistema ipotalamo-ipofisi-gonadi, e questo è molto importante in prospettiva evoluzionistica. Al contrario, quando c’è abbondanza di cibo e la richiesta energetica è bassa, gli stessi circuiti centrali che inibiscono lo stimolo a mangiare tendono a facilitare gli aspetti della riproduzione. La selezione naturale favorisce quegli animali che riducono la ricerca del cibo e l’alimentazione aumentando il loro successo riproduttivo [Schneider et al.,2002]. L’alternanza tra i periodi riproduttivi e quelli quiescenti differisce a seconda delle specie animali, ma in generale la maggior parte degli organismi è più predisposta alla riproduzione quando c’è abbondanza di cibo piuttosto che quando questo scarseggia. Effetti energetici sul sistema ipotalamico-ipofisario-gonadico Una vasta schiera di messaggeri chimici e di processi metabolici sono coinvolti nel mantenimento del bilancio energetico. In accordo con l’idea che i meccanismi che controllano l’omeostasi energetica sono correlati con il successo riproduttivo, molti di questi fattori influenzano anche i processi riproduttivi, come il sistema ipotalamico-ipofisario-gonadico (HPG: Hypothalamic-Pituitary-Gonadal axis)- Le funzioni del sistema HPG, quando le femmine non sono sottoposte a stress metabolico, sono illustrate nella Figura 18. 99 Figura: 18. Quando c’è un’abbondanza di riserve metaboliche, i cicli ovulatori sono caratterizzati da secrezione pulsatile di GnRH rilasciato dai terminali di cellule secretorie ipotalamiche. Ogni impulso di GnRH è rilasciato da nella circolazione portale ipofisaria e stimola la secrezione di un impulso di ormone luteinizzante (LH) dall’ipofisi anteriore alla circolazione generale. Lo sviluppo del follicolo è stimolato da impulsi di LH e FSH che legano i loro rispettivi recettori nel follicolo ovario. Durante lo sviluppo follicolare (la fase follicolare del ciclo ovulatorio) le concentrazioni relativamente basse di E hanno un feedback negativo sulla secrezione di GnRH ipotalamico e di gonadotropine ipofisarie. Gli E hanno anche effetti stimolatori sulla propria sintesi e secrezione, e quindi, la concentrazione di E continua a salire nella circolazione sistemica. A concentrazioni più alte, E ha un feedback positivo sul GnRH ipotalamico e sulla secrezione di gonadotropine ipofisarie. Einduce scariche di LH, che a sua volta induce l’ovulazione. 100 Figura:19. Gli effetti primari del deficit metabolico di disponibilità di risorse è l’inibizione degli impulsi ipotalamici di GnRH. (1) Questo porta ad una cascata di eventi, come l’inibizione della secrezione di gonadotropine ipofisarie (2), inibizione dello sviluppo del follicolo e la secrezione di E e P (3). Gli effetti della secrezione inibita di steroidi sono l’inibizione del comportamento estrale (4a) e l’inibizione del rilascio di LH (4b). Nelle donne, quando gli steroidi ovarici rimangono cronicamente bassi, si verifica perdita di massa ossea ed anche problemi alle funzioni cognitive. Si sa che il generatore di impulsi di GnRH è i luogo primario di effetto in quanto il trattamento esogeno con impulsi specie specifici di GnRH ripristina la secrezione ipofisaria normale di gonadotropine 101 Figura: 20. Il deficit di sostanze ossidabili ha effetti diretti sul sistema riproduttivo oltre che sul generatore di impulsi. Questi effetti sono stati dimostrati provvedendo a GnRh esogeno, o E e P ad animali privati del cibo temporaneamente o cronicamente. Per esempio, criceti ovariectomizzati privatio del cibo trattati con E e P mostrano un comportamento estrale con lo stesso corto tempo di ritardo, ma rimangono in posizione di lordosi per un durata significativamente più corta di tempo rispetto a criceti nutriti ad libitum. [Da Schneider et al, 2004] 102 Ogni impulso di GnRH conduce al rilascio pulsatile di LH da parte dell’ipofisi anteriore [Clarke et al., 1982]. Viene rilasciato anche l’FSH. Gli impulsi di FSH e LH sono critici per lo sviluppo follicolare e per la secrezione degli steroidi. L’aumento dei livelli di estrogeni provoca un feedback positivo sul GnRH e sull’LH, e questa azione degli estrogeni è richiesta per la secrezione di LH, che scatena l’ovulazione (Figura 18). I cambiamenti metabolici, così come la privazione di cibo, inibiscono il sistema HPG a vari livelli (Figure 19 e 20). Il locus principale, tuttavia, è il generatore d’impulsi del GnRH, e questi effetti sono simili nei maschi e nelle femmine (Figura 19) [Bronson, 2000]. In condizioni di privazione o di restrizione di cibo, la secrezione pulsatile di LH, lo sviluppo dei follicoli e l’ovulazione possono essere reintegrate dal trattamento pulsatile con GnRH in ratti, ovini, suini, bovini, primati e umani [Armstrong and Britt, 1987; Bronson, 1986; Cameron,1996; Cameron and Nosbisch, 1991;Day et al., 1986;Foster et al.,1985; Kile et a.,1991;Manning et al.,1991;Nillius, 1975]. I cambiamenti metabolici inibiscono il sistema HPG, in parte aumentando la sensibilità agli effetti feedback negativi degli estrogeni, e in parte attraverso gli effetti steroidi-indipendenti. In più, i cambiamenti metabolici alterano la fonte di GnRH, LH e FSH, indipendentemente dai loro effetti sulla secrezione pulsatile di LH [Crump et al.,1982;Howland, 1980;Medina et al.,1998]. L’inibizione della secrezione di GnRH conduce ad una cascata di eventi inibitori che incluono una diminuzione della secrezione delle gonadotropine, ritardato sviluppo follicolare, inibizione della sintesi di steroidi gonadici e, nei roditori e primati, una diminuzione del comportamento riproduttivo indotto dagli steroidi. Tuttavia, i deficit in molti di questi aspetti del sistema HPG possono essere attribuiti all’inibizione metabolica della secrezione del GnRH. Ci si potrebbe aspettare che la trascrizione e la traduzione del GnRH sia un importante punto di regolazione nei mammiferi che hanno un ovulazione indotta. Questi risultati sottolineano gli effetti diretti dei cambiamenti metabolici sui neuroni GnRH. I meccanismi neurali che controllano il comportamento sessuale sono condizionati da cambiamenti metabolici in animali che non hanno cicli ovulatori spontanei [Schneider et al.,2004]. 103 Effetti energetici sulla motivazione e sull’esecuzione dell’alimentazione e dei comportamenti riproduttivi I meccanismi del cervello che controllano il comportamento sessuale e la spinta ad alimentarsi agiscono alterando gli aspetti motivazionali. Per esempio, in molte specie i segnali metabolici, gli ormoni periferici e i neuropeptidi centrali influenzano la spinta alla ricerca di cibo senza necessariamente influenzare la quantità di cibo che viene ingerita [Schneider et al.,2002]. È verosimile che gli ormoni, i neuropeptidi e i segnali metabolici non influenzano universalmente l’ingestione di cibo o l’attività sessuale, ma piuttosto influenzano la motivazione ad assumere comportamenti specie-specifici che assicurano la sopravvivenza e il successo riproduttivo. Ci sono prove che i cambiamenti metabolici inibiscono la riproduzione a diversi livelli, incluso il generatore di impulsi del GnRH (Figura. 19), le fluttuazioni di GnRH, di LH, di FSH (Figura. 20), e in fine , mediante effetti diretti dalla disponibilità di nutrienti sui meccanismi del cervello che danno priorità al corteggiamento, all’accoppiamento e all’ingestione di cibo. (Figura 20) I segnali neurali periferici provenienti dal nervo vago vengono trasmessi al nucleo del tratto solitario (NTS), e i segnali metabolici vengono riconosciuti nell’area posteriore (AP) o NTS mediale e trasmessa all’area ipotalamica, così come al nucleo paraventricolare (PVN), o all’area preottica (POA) attraverso il nucleo parabrachiale. È stato ipotizzato che le proiezioni neurali che partono dal nucleo paraventricolare influenzino la secrezione del GnRH attraverso il contatto con gli assoni GnRH nel nucleo arcuato. I neuroni GnRH, inoltre, ricevono impulsi dal nucleo anteroventrale [Gu and Simerly,1997]. Altri ormoni e neuropeptidi possono agire più direttamente nell’ipotalamo per influenzare i neuroni GnRH nell’arco o nell’area preottica. Un sistema per organizzare i fattori che controllano il bilancio energetico e la riproduzione I sistemi extrasensoriali sono quelli associati con il gusto, l’olfatto e la composizione del cibo, così come i segnali sociali, temporali e spaziali associati con l’alimentazione con i membri della stessa specie del sesso opposto. I sistemi intrasensoriali sono correlati agli stimoli, come quelli rilevati dai meccanorecettori, dai recettori nello stomaco, da recettori osmotici e di nutrienti nell’intestino e nel fegato, e agli stimoli che avvengono dopo 104 l’assimilazione, e che sono generati dai cambiamenti nell’ossidazione delle sostanze metaboliche. Esempi degli stimoli metabolici primari sono quelli che provengono dai cambiamenti della disponibilità e dell’ossidazione del glucosio e degli acidi grassi o dal rapporto tra l’adenosina trifosfato (ATP) e gli altri nucleotidi adeninici con i fosfati inorganici [Friedman,1990; Friedman,1991; Friedman,1997; Friedman, 1998; Friedman,1995]. Gli ormoni informano il cervello sullo stato energetico e riproduttivo dell’animale; in tal modo stimolano il verificarsi di aggiustamenti comportamentali e metabolici per le condizioni ambientali, riproduttive e energetiche. Per esempio, la secrezione di leptina è correlata con il numero di adipociti e con il flusso di metaboliti ossidabili negli adipociti [Levy et al.,2000;Wang et al.,1998]. In molti casi, l’animale ha la possibilità di ignorare le informazioni ormonali se c’è un’urgente necessità energetica connessa alla sopravvivenza e alla riproduzione. Stimoli sensoriali metabolici primari Gli stimoli metabolici primari sono generati dai cambiamenti nello stato di ossidazione dei nutrienti metabolici [Friedman,1990; Friedman,1991; Friedman,1997; Friedman,1998; Friedman,1995]. Inoltre, gli stimoli sensoriali primari derivano dalla distensione meccanica del lume, contrazione intestinale e variazioni chimiche tra il lume e l’intestino [Schwartz,2000]. È utile distinguere questi eventi sensoriali da quelli endocrini. Un esempio di un evento endocrino è il legame di un ormone, come la leptina, al suo recettore funzionale (Ob-Rb). In contrasto agli eventi endocrini, gli stimoli sensoriali metabolici primari derivano dall’ossidazione di substrati metabolici, come il glucosio, gli acidi grassi liberi e i corpi chetonici o da una sequela di ossidazioni metaboliche. Per esempio, gli stimoli sensoriali primari possono derivare dagli intermediari del ciclo di Krebs, dal trasporto di elettroni dell’energia libera che conduce alla formazione di ATP, da cambiamenti del contenuto di ATP, o variazioni nel potenziale di fosforilazione (il rapporto tra ATP e gli altri nucleotidi adeninici con i fosfati inorganici) [Friedman,1998]. Un sistema sensoriale metabolico, che monitora la disponibilità energetica e invia segnali al generatore di impulsi del GnRH, induce una risposta del sistema HPG alla disponibilità di risorse metaboliche durante la privazione di cibo e la rialimentazione. 105 Gli effetti dei cambiamenti metabolici sul rilascio pulsatile dell’LH avvengono molto più rapidamente dei cambiamenti nel contenuto di grassi corporei in una grande varietà di specie [Armstrong and Britt, 1987;Bronson, 1986; Bronson, 1988; Bronson, 1990; Cameron,1996; Cameron and Nosbisch, 1991; Clarke et al., 1990; Schreihofer et al., 1993; Szymanski et al., 2003]. Cambiamenti nel contenuto di grasso corporeo nella secrezione ormonale non possono tenere conto dell’aumento della secrezione pulsatile dell’LH, che avviene entro 60 minuti dalla rialimentazione [Szymanski et al., 2003]. Molti studi dimostrano che il generatore di impulsi del GnRH e il comportamento sessuale sono influenzati dalla disponibilità di risorse metaboliche ossidabili minuto dopo minuto [Berry and Peters, 1975;Schneider et al., 2000]. In accordo con l’ipotesi metabolica, il contenuto corporeo di grassi, l’apporto e la spesa energetica controllano le funzioni riproduttive agendo attraverso uno stimolo sensoriale comune che proviene dalla disponibilità di risorse metaboliche ossidabili. La riserva corporea di grasso, in accordo con l’ipotesi metabolica, invece di provvedere ai segnali a lungo termine, serve a tamponare i cambiamenti energetici, in virtù delle scorte energetiche sotto forma di tessuto adiposo. Quando queste scorte sono terminate, una limitata disponibilità di cibo genera dei segnali che inibiscono il sistema HPG. Il sistema HPG viene riattivato dalla disponibilità di sostanze ossidabili prima che vengano ripristinate le scorte energetiche sotto forma di tessuto adiposo. Poco è conosciuto riguardo alla natura dei rilevatori sensoriali della disponibilità di cibo. Tuttavia, l’esistenza di questi sistemi sensoriali è rilevata dall’inibizione della riproduzione e dall’incremento dell’ assunzione di cibo quando vengono inibiti specifici pathways metabolici. Ricerche sul controllo metabolico del sistema sensoriale che controlla l’assunzione di cibo conducono ad alcuni importanti principi che possono essere applicati al sistema sensoriale che controlla la riproduzione [Friedman,1991; Friedman,1991(a); Friedman, 1997; Friedman, 1995; Friedman, 1995(a)]. Primo, lo stimolo sensoriale è generato dai cambiamenti delle risorse metaboliche ossidabili o dalle variazioni della sequenza delle ossidazione metaboliche, e non da un particolare tipo di substrato. Secondo, lo stimolo sensoriale interagisce con il sistema di rilevazione che percepisce la concentrazione nel circolo dei substrati metabolizzabili, piuttosto che con un recettore di membrana. Terzo, lo stimolo può essere rilevato sia centralmente che perifericamente. Infine, gli effetti degli ormoni come l’insulina e la leptina 106 possono intervenire influenzando indirettamente l’ossidazione metabolica a livello periferico. L’assunzione di cibo può essere aumentata e i processi riproduttivi inibiti dal trattamento con agenti che bloccano specifici pathways metabolici, come l’ossidazione del glucosio e degli acidi grassi liberi. Il trattamento sistematico con il 2-deossi-D-glucosio (2DG)o con il 5-tioglucosio (5TG) induce un grande aumento nell’assunzione di cibo nei ratti e in altri mammiferi (con pochissime eccezioni, una delle quali è rappresentata dal criceto siriano) [Friedman e Todoff, 1986; Lazzarini et al.,1988; Novin et al., 1973; Ritter e Slusser, 1980]. Trattamenti con alte dosi di insulina incrementano l’assunzione di cibo inducendo ipoglicemia nei ratti, nei criceti e in altri mammiferi [Geary, 1999]. È importante notare che l’insulina sistemica e il 2DG stimolano l’assunzione di cibo ma hanno effetti opposti sulla concentrazione plasmatica di glucosio, dimostrando che l’assunzione di cibo è sensibile alla diminuzione dell’ossidazione del glucosio o alla sequenza di reazioni metaboliche, e non alla concentrazione plasmatica di glucosio in sè. Il controllo metabolico sensoriale della riproduzione è notevolmente simile al controllo sensoriale metabolico dell’assunzione di cibo. Il trattamento sistematico con 2DG aumenta l’immissione di cibo nei ratti, inibisce i cicli estrali nei criceti e inibisce la secrezione pulsatile dell’LH nei ratti e negli ovini, nonostante il fatto che questi trattamenti hanno effetti trascurabili sul contenuto corporeo di grassi [Bucholtz et al.,1996; Foster e Bocholtz,1995; Friedman,1998; Friedman, 1986; Howland,1980; Murahashi et al.,1996; Nagatani et al.,1996; Schneider et al.,1993; Schneider e Wade, 1989; Schneider e Wade, 1990]. I rilevatori sensoriali metabolici sono sensibili ad altri stimoli metabolici oltre a quelli generati dai cambiamenti dell’ossidazione di glucosio. Per esempio, l’assunzione di cibo che aumenta l’attività riproduttiva, è inibita da trattamenti con molecole che riducono l’ossidazione degli acidi grassi liberi, come ad esempio il metil palmoxirato (MP) o il mercaptoacetato (MA) [Calingasan et al, 1993, Langhans et al, 1997]. Questi studi illustrano che l’informazione correlata alla disponibilità di substrati metabolici specifici è probabilmente integrata a livello intra-cellulare e/o intra-mitocondriale. E’ stato suggerito che i sensori recettoriali responsabili dell’ossidazione degli acidi grassi liberi influenzano l’assunzione di cibo poiché diminuiscono la disponibilità generale formazione di ATP [Scharrer et al, 1999]. delle riserve metaboliche per la 107 I processi riproduttivi, come l’assunzione di cibo, sono anche sensibili ai cambiamenti nell’ossidazione degli acidi grassi liberi, specialmente quando gli animali sono predisposti all’utilizzazione dei grassi di riserva. I criceti “grassi” non mostrano anestro indotto da digiuno; viceversa, il trattamento con MP inibisce la ciclicità estrale, ma non induce iperfagia [Friedman et al., 1995, 1998]. Questi risultati sono illustrati dall’ipotesi metabolica. Durante il digiuno, l’omeostasi calorica è mantenuta dall’idrolisi dei trigliceridi in acidi grassi liberi e glicerolo. Gli acidi grassi liberi vengono trasportati ai vari tessuti periferici dove sono principalmente ossidati, risparmiando perciò glucosio per l’ossidazione nel sistema nervoso centrale (SNC). In accordo con l’ipotesi metabolica, i cicli estrali continuano nei criceti “grassi” anche a digiuno poiché i loro depositi nel tessuto adiposo danno origine agli acidi grassi liberi per l’ossidazione cellulare durante il digiuno. Nei criceti “grassi” trattati con MP, tale sostanza blocca l’ossidazione degli acidi grassi liberi, neutralizzando quindi il vantaggio di un alto contenuto corporeo di grassi. Similmente, in criceti trattati con MP nutriti ad libitum, il normale ciclo estrale continua poiché i carboidrati possono essere usati come una risorsa alternativa per mantenere la ciclicità estrale. Quando l’utilizzazione di entrambe le riserve è bloccata da simultaneo trattamento di MP e 2DG, il ciclo estrale è inibito. Il segnale metabolico può essere correlato a diversi eventi metabolici, o ad un evento finale metabolico, come la formazione di ATP [Friedman et al, 1997]. Il ruolo dell’ossidazione di glucosio e acidi grassi liberi differisce dipendentemente dalle specie e dal loro ciclo vitale. Per esempio, i toporagni muschiati hanno un tasso metabolico eccezionalmente alto. Essi mangiano quasi costantemente durante la loro fase attiva, e conservano meno grasso corporeo di topi, ratti e criceti. In questa specie, il comportamento sessuale è inibito dalla restrizione calorica alimentare, ed è ripristinato dopo solo tre ore di alimentazione ad libitum [Temple JL et al, 2002]. Riassumendo, i segnali metabolici periferici e centrali influenzano attitudini alimentari e riproduttive. Quando gli ormoni influenzano la disponibilità di risorse metaboliche e l’ossidazione che ha effetti sul comportamento, gli ormoni agiscono come mediatori dello stimolo metabolico. Come discusso di seguito, diversi ormoni e neuropeptidi centrali che influenzano il comportamento alimentare hanno un notevole effetto sull’impiego dell’energia e sulla sua distribuzione (termogenesi, resa cardiaca, tasso metabolico, ossidazione di glucosio e degli acidi grassi liberi, sintesi dei trigliceridi). Quindi, 108 è spesso difficile discernere tra gli effetti diretti degli ormoni e dei neuropeptidi sui circuiti centrali che controllano il comportamento e gli effetti indiretti sulla disponibilità di cibo e sull’ossidazione. Mediatori ormonali Si è stabilito che gli ormoni servono come mediatori tra gli eventi stimolatori metabolici e i meccanismi del cervello che controllano il bilancio energetico e la riproduzione, quando la loro concentrazione nel sangue, e il legame con i propri recettori, riflettono la quantità dell’energia immagazzinata e la disponibilità di sostanze metaboliche ossidabili. È stato ipotizzato che gli ormoni attraversano il cervello e si legano ai propri recettori, in tal modo informano il cervello sulla disponibilità interna di energia. La concentrazione degli ormoni circolanti è anche associata con particolari stagioni e con lo stato riproduttivo, e così, possono modulare la disposizione delle risorse e dare priorità a quei comportamenti che ottimizzano il successo riproduttivo. Agli ormoni si possono applicare dei principi generali sulla relazione ormonecomportamento. Primo, non vengono innescati dal comportamento. Loro provvedono ad un milieu o ad un contesto che cambia la probabilità che un particolare comportamento si verifichi attraverso la modulazione degli stimoli metaboliche, alterando la percezione degli stimoli sensoriali, o agendo a vari livelli di integrazione nel sistema nervoso centrale. Secondo, la motivazione o la spinta ad un comportamento possono avvenire anche in assenza degli ormoni. Terzo, gli ormoni possono coadattarsi, durante l’evoluzione nel controllo di svariate funzioni e di processi fisiologici che sono importanti per sopravvivere alla maturità sessuale e per il successo riproduttivo. Quarto, differenti ormoni servono alla stessa funzione in differenti specie, mentre lo stesso ormone può avere ruoli diversi in specie diverse. Ormoni sessuali Gli ormoni sessuali bene illustrano il contrasto fra modulatori ormonali ed attivatori ormonali. Nei roditori da laboratorio, il desiderio del maschio di accoppiarsi è inibita dalla castrazione, ma può essere ripristinato attraverso il trattamento con testosterone, ed inibito di nuovo da antagonisti dei recettori degli androgeni impiantati nell’ipotalamo nell’area mediale preottica. La concentrazione plasmatica di testosterone, tipica nel maschio, non innesca un impulso copulatorio. In seguito la concentrazione plasmatica di testosterone aumenta la probabilità che un maschio inizi il corteggiamento, e che abbia un 109 impulso all’accoppiamento in presenza di una femmina sessualmente motivata, necessità metaboliche ed altri fattori ambientali che minaccino la sopravvivenza. Tuttavia l’impulso sessuale può esistere e può essere espresso senza stimoli ormonali. Per esempio in individui, di diverse specie, con esperienza sessuale l’impulso all’accoppiamento continua anche dopo la rimozione degli organi genitali, e gli ormoni gonadici sono dissociati dall’impulso sessuale in altre specie. Inoltre, gli ormoni sessuali sono utili per illustrare l’idea che gli ormoni possano coordinarsi, durante l’evoluzione, per controllare una varietà di processi fisiologici e comportamentali che sono importanti per la sopravvivenza, per la maturità sessuale e per il successo riproduttivo. Per esempio nei roditori e in altre specie, la secrezione ovarica di estrogeni è necessaria per l’aumento improvviso dell’LH e per l’ovulazione. Gli estrogeni ovarici il progesterone si sono coordinati durante l’evoluzione per aumentare le probabilità che avvenga l’accoppiamento durante il periodo in cui c’è una più alta probabilità che la fertilizzazione dell’ovulo abbia successo. Gli ormoni sessuali servono anche ad illustrare il concetto correlato che le specie hanno ormoni differenti che controllano i comportamenti. In alcune specie, infatti, gli estrogeni e il progesterone sono critici per indurre l’impulso sessuale tipico femminile, mentre in altre gli androgeni e i glucocorticoidi sono critici per loa sincronizzazione dell’impulso sessuale e dell’ovulazione,così come avviene nel topo muschiato. Analogamente, il tipico impulso sessuale maschile è influenzato dagli estrogeni, dagli androgeni o dal progesterone o da nessuno di questi steroidi, ciò dipende dalle specie. Durante l’evoluzione, il progesterone si è adattato nel facilitare il comportamento tipico maschile in certe specie che mancano di testosterone. Il progesterone ha il potenziale di influenzare il comportamento sessuale maschile in tutti i mammiferi compreso l’uomo [Crews, 2000]. In modo simile, gli ormoni riproduttivi si sono adattati nel modulare l’ingestione di cibo, lo stoccaggio energetico e la spesa energetica in relazione alla sopravvivenza e al successo riproduttivo. La spinta a mangiare può essere ottenuta direttamente dai cambiamenti nella disponibilità di cibo senza che ci siano delle variazioni nella concentrazione degli ormoni sessuali. In alcune specie gli ormoni per la gravidanza e per l’allattamento si sono adattati nel facilitare l’aumento dell’assunzione di cibo. Per esempio in molte specie, la concentrazione sanguigna di progesterone aumenta drammaticamente durante la gravidanza mentre i livelli degli estrogeni aumentano ma meno rapidamente. Nelle femmine di ratto ovariectomizzate, il 110 trattamento con moderate quantità di estrogeni diminuisce l’assunzione di cibo, mentre il trattamento con elevate quantità di progesterone lo aumenta [Wade and Schneider,1992]. In queste specie sembra che gli ormoni della gravidanza possono incrementare l’assunzione e lo stoccaggio energetico in preparazione alla richiesta energetica della lattazione. La lattazione , al contrario, è caratterizzata da alti livelli di prolattina, un ormone secreto dalla ipofisi anteriore. Non a sorpresa il trattamento di femmine di ratto ovariectomizzate preparate con gli estrogeni il trattamento con la prolattina induce un incremento dose-dipendente nell’assunzione di cibo [Gerardo-Gettens et al, 1989(a); Gerardo-Gettens et al, 1989(b)]. Tuttavia, cambiamenti nei livelli di questi ormoni non spiegano pienamente i cambiamenti nell’assunzione di cibo. L’incremento nel consumo di cibo durante l’allattamento è di gran lunga maggiore di quello indotto dal trattamento con ormoni esogeni. Loro informano il cervello sullo stato riproduttivo dell’animale, e favoriscono una regolazione comportamentale e metabolica che sia appropriata per quella fase della riproduzione in quella particolare specie. Durante l’allattamento, quando grandi quantità di energia vengono spese per la produzione di latte, si ha la produzione di forti segnali sensoriali, derivanti, probabilmente, direttamente dai cambiamenti nello stato energetico nel sistema nervoso centrale o periferico della madre, e questi potrebbero spiegare il drammatico incremento nel consumo di cibo. Gli ormoni della gravidanza agiscono in concerto o accentuano i segnali sensoriali metabolici primari che derivano dalla domanda energetica della riproduzione. In più, i segnali sensoriali metabolici e i mediatori ormonali influiscono non solo nel consumo di cibo,ma anche l’utilizzazione e la ripartizione dell’energia conservata, e ci sono differenze tra le specie nel modo in cui questi ormoni modulano il consumo, il deposito e l’utilizzo del cibo [Wade and Schneider,1992]. Durante la gravidanza, le femmine di ratto e di topo aumentano l’immissione di energia, in eccesso rispetto alla domanda energetica del feto che sta crescendo, rinforzando, in tal modo, le scorte energetiche materne, in previsione della richiesta energetica della lattazione. Al contrario le femmine di altre specie, come il criceto siriano, non aumentano le proprie scorte energetiche durante la gravidanza. Piuttosto continuano a mangiare la stessa quantità di cibo di prima della gravidanza, e impegnano le proprie scorte di grasso nella crescita del feto [Wade et al., 1986]. Invece il criceto siberiano, durante la gravidanza non aumenta l’assunzione di cibo, e come conseguenza perde le proprie riserve energetiche (grasso corporeo) [Schneider and Wade,1987],ma allo stesso tempo aumenta 111 l’accaparramento di cibo, un comportamento che spinge all’accumulo di scorte energetiche esterne [Bartness,1997]. Questi esempi indicano che specie differenti utilizzano una varietà di strategie energetiche, impiegando diversi segnali ormonali, con diversi metodi di assunzione, stoccaggio e consumo, per soddisfare le loro richieste energetiche al fine di assicurarsi il successo riproduttivo. Gli effetti dei cambiamenti energetici sulla fisiologia e sul comportamento non sono sempre mediati da variazioni nella secrezione degli ormoni sessuali, ma piuttosto, da modificazioni della sensibilità agli ormoni, probabilmente attraverso la modulazione dell’espressione genica dei recettori di quegli ormoni. I cambiamenti metabolici inibiscono i cicli ovulatori e il sistema HPG aumentando, in parte, la sensibilità dell’ipotalamo al feedback negativo degli estrogeni. La privazione di cibo inibisce la secrezione di LH nei ratti ovariectomizzati trattati con gli estrogeni [Cagampang et al., 1990;Nagatani et al., 1996; Nagatani et al., 1994]. Molte prove suggeriscono che il feedback negativo degli estrogeni sul GnRH avviene trans-sinapticamente attraverso i neuroni che si proiettano dal GnRH, o tramite le cellule gliali, non avviene attraverso il recettore degli estrogeni di tipo alfa (ERα) localizzati sui neuroni GnRH [Herbison,1998]. Il feedback negativo degli estrogeni, durante i cambiamenti energetici,potrebbe avvenire nel PVN dell’ipotalamo, poiché microinfusioni di estrogeni in questa zona accentuano la soppressione, indotta dal digiuno, della secrezione pilsatile di LH nei ratti ovariectomizzati [Nagatani et al.,1994], e aumentano le ER-IR nel PVN nei ratti a digiuno [Estacio et l., 1996]. Queste aree del cervello contengono i neuroni GnRH (mPOA), o contengono i nuclei che si proiettano verso gli assoni del GnRH nell’arco della eminenza mediana. Dati recenti indicano che gli estrogeni possono esercitare alcuni effetti sui neuroni GnRH direttamente attraverso il recettore per gli estrogeni di tipo beta (ERβ) [Abraham et al.,2003;Herbison and Pape,2001;Hrabovszky et al., 2001]. I neuroni GnRH esprimono bassi livelli di ERβ e di proteine, ed molti studiosi hanno utilizzato questi dati per discutere a favore o contro un ruolo funzionale dell’ERβ [Herbison and Pape, 2001;Hrabovszky et al., 2000; Hrabovszky et al., 2001; Kallo et al., 2001;Skynner et al., 1999]. Il trattamento con gli estrogeni provoca una rapida fosforilazione delle proteine che legano gli elementi di risposta al cAMP (CREB) nei neuroni GnRH dei topi wild-type, nei topi KO per ERα, ma non nei topi KO per ERβ. 112 La fosforilazione di CREB è un indice dei cambiamenti dei segnali intracellulari. Quindi, questi risultati suggeriscono che ERβ può mediare il rapido effetto degli estrogeni sul GnRH [Abraham et al.,2003]. I meccanismi neurali che controllano il comportamento sessuale sono anche influenzati dai cambiamenti metabolici e questi effetti sono indipendenti dagli effetti provocati dai cambiamenti metabolici sul sistema HPG e sulla concentrazione degli steroidi gonadici. I criceti siriani ovariectomizzati, indotti all’estro attraverso il trattamento con gli estrogeni e con il progesterone, mostrano una diminuzione della durata della lordosi in risposta alla privazione di cibo, al trattamento con inibitori metabolici o con insulina e all’alloggiamento in ambienti con basse temperature [Dickerman et al.,1993;Panicker and Wade, 1998]. Variazioni nella durata della lordosi in risposta a questi cambiamenti metabolici sono strettamente associati ad una significativa diminuzione del’espressione di ERα nel nucleo ipotalamico ventromediale (VMH) [Estacio et al., 1996(a); Estacio et al., 1996;Li et al., 1994;Panicker and Wade, 1998;Roemmich et al.,1997]. La Leptina Il trattamento con leptina diminuisce l’appetito, aumenta il dispendio energetico, la disponibilità di risorse e facilita i processi riproduttivi [Bai et al,1996,Clarke et al,1999, Cunningham et al,1999,Finn et al, 1998,Henry et al,1999, Schneider et al, 2000]. E’ stato più volte ipotizzato che la concentrazione di leptina nel plasma informa il cervello riguardo il livello di lipidi nel sangue ed il livello di risorse metaboliche disponibili. Tuttavia, la prova del ruolo funzionale della leptina è ampiamente circostanziale. La leptina non ha superato il test critico come segnale di sazietà e difatti, gli effetti di sazietà della leptina non sono invertiti da un antagonista che sia specifico per un suo recettore [Brunner et al, 1999]. I topi che sono omozigoti per una mutazione del gene della leptina, il gene ob, sono sia obesi che non fertili, ma entrambe queste condizioni sono invertite dal trattamento con leptina. La somministrazione di leptina previene gli effetti della sottoalimentazione su diversi aspetti della riproduzione in roditori da laboratorio sia obesi che magri [Ahima et al, 1996, 1997, 1999, Barash et al, 1999, Chehab et al, 1997, Gruaz-Gumowsky et al, 1998, Schneider et al, 1998, Wade et al, 1997]. A tale riguardo, è stato ipotizzato che gli effetti della leptina, sul generatore di impulsi di GnRH o sulle scariche di GnRH e LH avvengano attraverso neuroni 113 intermediari che si proiettano da neuroni contenenti Ob-Rb [Mercer et al, 1998] ad altri neuroni che a loro volta si proiettano verso i neuroni GnRH [Herbison et al, 1998]. Ormoni pancreatici L’importanza degli ormoni pancreatici, insulina e glucagone, nel controllo del sistema HPG è ancora oggetto di controversie. Alte dosi di insulina influenzano indirettamente i processi riproduttivi, indirizzando le risorse metaboliche nelle riserve. Il trattamento con insulina, a dosi sufficienti da causare ipoglicemia inibisce la secrezione di LH e la ciclicità estrale, mentre allo stesso tempo aumenta l’appetito, il contenuto dei grassi nel sangue e la concentrazione di leptina [Blum and Schneider, 2000, Wade et al, 1991]. Allo stesso modo, un trattamento con basse dosi di insulina, direttamente nei ventricoli cerebrali, tende a diminuire lo stimolo dell’appetito e a facilitare la secrezione pulsatile di LH [Arias et al, 1992, Baskin et al, 1987, Dong et al, 1991, Miller et al, 1995]. Ghrelina e Colecistochinina (CKK) I peptidi orexigenici rilasciati dal tratto gastroenterico tendono ad inibire la secrezione di GnRH e, conseguentemente, di LH. La secrezione di ghrelina, un peptide di 28 amminoacidi sintetizzato dallo stomaco, [Kojima et al, 1999] è inibita dai pasti e aumenta gradualmente durante gli intervalli tra i pasti. Il trattamento sistemico con ghrelina induce iperfagia e obesità. [Tschop et al, 2000, Wren et al, 2001] La ghrelina potrebbe agire sui meccanismi del cervello che controllano il comportamento alimentare e la riproduzione poiché la ghrelina, somministrata intracerebroventricolarmente o per microiniezione nel PVN ipotalamico, stimola l’assunzione di cibo in ratti intatti ed inibisce la secrezione pulsatile di LH in ratti OVX. [Furuta e al, 2001, Melis et al, 2002, Nakazato et al, 2001]. L’iniezione intravenosa di CCK inibisce l’appetito e stimola il rilascio di GnRH nelle scimmie maschio, [Perera et al, 1993] mentre il peptide intestinale, motilina, diminuisce anche la secrezione di LH pulsatile nei ratti [Tsukamura et al, 2000]. Ormoni Corticosurrenalici I glucocorticoidi, cortisolo e corticosterone, così come le catecolamine surrenaliche, sono secreti in risposta alla privazione di cibo, stress generalizzato ed emergenza metabolica cerebrale. Questi ormoni hanno effetti inibitori sui processi riproduttivi. Si potrebbe ipotizzare, quindi, che gli ormoni 114 corticosurrenalici medino gli effetti delle richieste metaboliche del sistema HPG anche se la maggior parte delle prove non riesce ad evidenziare un ruolo specifico dei glucocorticoidi [Nagatani et al, 2001]. Modulatori ormonali Gli ormoni come la leptina e l’insulina possono influenzare la riproduzione in virtù dell’abilità di questi ormoni a modulare la disponibilità intracellulare e l’ossidazione del glucosio e degli acidi grassi liberi. La leptina come modulatore È stato più volte assunto che la leptina agisce direttamente sul meccanismo ipotalamico che controlla i sistema HPG. Tuttavia è importante notare che la leptina se somministrata perifericamente o centralmente, up- regola drammaticamente la spesa energetica, la termogenesi, l’ossidazione dei substrati e quindi, ha la capacità di influenzare indirettamente l’assunzione di cibo e la riproduzione provocando una maggiore disponibilità di substrati per l’ossidazione, che determina un cambiamento degli stimoli metabolici primari [Bai et al.,1996;Ceddia et al.,2001;Kamuhara et al.,1997;Rossetti et al.,1997;Unger et al.,1999;William et al.,2002;Zhou et al.,1997]. Trattamenti esogeni con la leptina prevengono gli effetti della privazione di cibo in una grande varietà di specie. È possibile che alcuni o tutti gli effetti dei trattamenti esogeni di leptina avvengono attraverso gli effetti che la leptina ha sull’ossidazione dei substrati. A supporto di tale ipotesi, l’anestro indotto dal digiuno nel criceto siriano non è significatamene attenuato dal trattamento sia intraperitoneale che intracerebroventricolare con la leptina, se ogni iniezione di leptina è preceduta da un’iniezione degli inibitori metabolici 2DG o MP, tuttavia queste dosi di 2DG o di MP non inducono anesto nei criceti siriani alimentati ad libitum [Schneider et al.,1998; Tritos e Maratos-Flier, 1999]. Questi risultati possono riflettere un’interazione tra la leptina e gli inibitori metabolici a livello dell’ossidazione intracellulare dei substrati metabolici, tuttavia sono possibili interazioni ad altri livelli. Pochi studi suggeriscono che la leptina aumenta la disponibilità e l’ossidazione del glucosio [Kamohara et al., 1997; Minokoshi et al., 1999], mentre il trattamento con il 2DG ha effetti opposti [Brown, 1962]. Ci sono ora una grande quantità di evidenze in accordo con l’ipotesi che la leptina aumenta la disponibilità e l’ossidazione intracellulare degli acidi grassi 115 liberi. Gli acidi grassi liberi possono essere resi disponibili per l’ossidazione attraverso: (1) diminuzione della sintesi de novo degli acidi grassi liberi, (2) diminuzione dell’esterificazione intracellulare degli acidi grassi liberi a trigliceridi, (3) aumento della ripartizione dell’ossidazione e i trigliceridi e degli acidi grassi liberi e (4) esportazione degli acidi grassi liberi ai tessuti non adiposi. Il trattamento degli adipociti con leptina diminuisce la sintesi di nuovi acidi grassi liberi, aumenta l’esterificazione intracellulare degli acidi grassi liberi a trigliceridi, aumenta la ripartizione dei trigliceridi e l’ossidazione degli acidi grassi, incrementa l’esportazione degli acidi grassi liberi alle cellule non adipose. Il risultato netto è un aumento del 30% dell’efflusso degli acidi grassi liberi dagli adipociti, e si pensa che questo prevenga l’ossidazione all’interno degli adipociti e che invece la promuova nelle cellule non adipose [William et al., 2002]. Se la leptina migliora le funzioni riproduttive, in virtù della sua capacità di promuovere l’ossidazione dei substrati, si potrebbe sostenere che la leptina potrebbe non riuscire a migliorare le funzioni riproduttive se i substrati non sono a lungo disponibili. A supporto di questa ipotesi, trattamenti con la leptina possono completamente invertire gli effetti del digiuno nella pubertà nei ratti che vengono limitati nell’80% nel loro apporto di cibo ad libitum [Cheung et al., 1997]. La privazione di cibo potrebbe limitare l’abilità della leptina di facilitare il comportamento sessuale attraverso l’aumento della disponibilità energetica e dell’ossidazione. Inoltre, il trattamento con la leptina può abbreviare la durata del diestro dovuto all’allattamento nei ratti esposti a una prolungata e cronica restrizione calorica [Woodside et al.,1998; Woodside et al.,2000], e ciò è in accordo con l’idea che la leptina non può facilitare la riproduzione se c’è un deficit nella disponibilità di cibo. Allo stesso modo il trattamento con la letina può attenuare ma non completamente superare gli effetti della privazione di cibo sulla secrezione indotta dagli estrogeni dell’LH e della prolattina nei ratti [Watanobe et al., 1999]. Trattamento con insulina come modulatore L'idea che l’infertilità derivi da un eccesso nello stoccaggio di energia (come avviene in alcuni tipi di obesità), e il relativo deficit nella disponibilità e nell’ossidazione di substrati metabolici è illustrato da esperimenti che impiegano trattamenti con alte dosi di insulina come uno strumento per lo smistamento dei combustibili metabolici endogeni fuori dalla circolazione nei 116 tessuti in cui sono stati stoccati. Il trattamento sistematico con alte dosi di insulina incrementa l’ingestione di cibo e promuove lo stoccaggio dei grassi nelle specie dei mammiferi. Il trattamento con insulina inibisce i cicli estrali nel criceto siriano a cui viene limitato l’assunzione di cibo e nei criceti controllo trattati solo con soluzione salina, ma la stessa dose di insulina non è in grado di inibire i cicli estrali quando i criceti possono mangiare a volontà per compensare la conservazione energetica [Wade et al., 1991]. Quindi, l’insulina promuove l’obesità e inibisce la ciclicità estrale. Gli effetti inibitori dell’insulina non sono effetti diretti sulla riproduzione, poiché i criceti trattati con insulina e alimentati ad libitum mostrano cicli estrali regolari. L’insulina inibisce la riproduzione, solamente, nei criceti a cui non viene permesso di mangiare in modo esagerato in risposta al trattamento con insulina. L’idea che la riproduzione è controllata da cambiamenti di alcuni mediatori ormonali del contenuto corporeo di grassi, indica che i criceti trattati con insulina sia alimentati ad libitum che sottoposti a limitazioni nel cibo, mostrano una ciclicità estrale regolare, perché entrambi i gruppi guadagnano grasso corporeo e entrambi hanno elevate concentrazioni plasmatiche di leptina. Al contrario , l’insulina inibisce la ciclicità estrale solo nei criceti sottoposti a limitazioni di cibo, pur determinando in entrambi i gruppi il guadagno di grasso corporeo e elevate concentrazioni di leptina [Blum e Schneider,2000]. Questo fenomeno non è limitato solo ai criceti siriani, poiché nei ratti e negli ovini la secrezione pulsatile di LH viene inibita da infusioni di insulina, ma non quando gli effetti metabolici dell’insulina vengono controbilanciati dall’infusione simultanea di glucosio [Clarke et al., 1990; He et al., 1999; Rodriguez et al., 1999]. È interessante notare che i criceti trattati con insulina sono non fertili nonostante il loro elevato contenuto corporeo di grassi e l’elevata concentrazione plasmatica di leptina. Questo modello sperimentale illustra come l’infertilità può accompagnare certi tipi di obesità. Se l’obesità e l’iperfagia derivano da una predisposizione per l’immagazzinamento di energia che impedisce di disporre di una sufficiente quantità di substrato per le ossidazioni intracellulari, ci si aspetterebbe che si crei un deficit nella disponibilità di substrati metabolici che potrebbero generare stimoli di natura inibitoria per il sistema HPG [Wade e Schneider, 1992; Wade e Schneider, 1996]. 117 I risultati degli esperimenti che hanno esaminato la leptina e l’insulina enfatizzano l’idea che gli ormoni possono influenzare indirettamente la riproduzione e il bilancio energetico, attraverso gli effetti sugli stimoli sensoriali metabolici. In questo senso, questi sono dei modulatori degli stimoli metabolici, piuttosto che mediatori tra i livelli dell’energia interna e gli effettori centrali. Effettori centrali Gli ormoni e gli stimoli sensoriali influenzano il bilancio energetico e la riproduzione agendo sul sistema degli effettori nel tronco cerebrale e nell’ipotalamo. L’effettore centrale per il controllo dell’asse HPG e della ciclicità estrale è il circuito dei neuroni GnRH localizzati nell’ipotalamo medio basale (incluso il nucleo arcuato), nell’ipotalamo anteriore e nel POA. Gli effettori per il comportamento sessuale femminile sono meno definiti ma probabilmente includono il VMH, PVN e il mPOA. Gli effettori per l’assunzione di cibo son ancora più diffusi e includono le aree menzionate nel controllo del comportamento sessuale femminile, più l’ipotalamo laterale, l’ipotalamo dorsomediale e altre aree. L’informazione sensoriale metabolica raggiunge queste aree ipotalamiche coinvolte nel sistema HPG, nell’impulso ad ingerire cibo e nel comportamento sessuale attraverso il tronco encefalico caudale. Gli ormoni possono influenzare gli effettori centrali attraverso la modulazione dello stimolo metabolico, o mediante un’azione diretta sui neuroni nelle aree ipotalamiche [Schneider e Watts,2002]. Catecolamine Ricerche sul controllo dell’assunzione del cibo hanno portato ad una scoperta di un circuito attraverso il quale cambiamenti nella disponibilità di glucosio e nell’ossidazione sono rilevati nel AP (area postrema) e nel NTS (nucleo del tratto solitario) e viaggiano tramite segnale noradrenergico dalle aree anteriori del cervello coinvolte nel meccanismo della fame ed il sistema HPG. L’AP ha connessioni reciproche con l’NTS. Dal NTS, nell’area A2 i neuroni catecolaminergici si proiettano interamente in direzione rostrale, e molti di loro si proiettano verso PVN [Sawchenko et al, 1985]. 118 Neuropetide Y La secrezione di NPY aumenta in risposta a richieste metaboliche, come privazione del cibo ed aumento dell’impiego energetico [Kalra et al, 1991, Lewis et al, 1993]. La secrezione di NPY è elevata durante le richieste metaboliche che inibiscono la secrezione pulsatile di LH [Kalra et al, 1991, Lewis et al, 1993] ed i livelli di NPY diminuiscono con i trattamenti che migliorano i deficit metabolici e reinseriscono la funzione HPG [Kalra et al, 1997]. Per esempio, in animali nutriti, NPY è essenziale per la secrezione di LH, che normalmente avviene in risposta a prolungate ed elevate concentrazioni di E. Comunque, NPY è inibitorio del modo pulsatile di secrezione del LH [McDonald et al, 1989]. Il ruolo di NPY nell’inibizione del sistema HPG, del comportamento sessuale e e della stimolazione dell’assunzione del cibo è osservato in specie diverse come i roditori, i pesci e i serpenti. Insieme questi dati portano ad un idea che i neurotrasmettitori permettano agli animali di stabilire priorità influenzando la motivazione a intraprendere un determinato comportamento. Questi dati suggeriscono come potremmo fare maggiormente progressi nel comprendere questi sistemi centrali di effettori studiando gli aspetti motivazionali del comportamento sessuale e ingestivo [Ammar et al, 2000, Morris et al, 1990, Narnaware et al, 2001]. Colecistochinina Il peptide del sistema digerente, CCK, è secreto come neuropeptide nelle regioni del CNS contenenti recettori steroidei gonadali e neuroni GnRH, come l’mPOA. [Simerly et al, 1986] Si ritiene che i neuroni contenenti GnRH nel mPOA ricevano proiezioni da fibre CCK, [Simerly et al, 1986] e CCK immessa in quest’area ha sia influenze stimolatorie che inibitorie sulla secrezione di LH e GnRH [Hashimoto et al, 1986, Kimura et al, 1983, Perera et al, 1993]. Peptide Glucagone-simile Il trattamento con un altro peptide dell’apparato digerente, GLP-1, aumenta la secrezione di LH entro i primi 5 minuti di iniezione nei ratti maschi adulti [Beak et al, 1998]. GLP-1, come CCK, diminuisce l’assunzione di cibo ed è anche secreta nel CNS [Van Dijk et al, 1999]. Inoltre, un digiuno di 48 h diminuisce il contenuto ipotalamico di GLP-1 in confronto a quello di ratti nutriti. Neuroni CCK nel AP e neuroni GLP-1 nel NTS caudale si proiettano al PVN, un area dove si ritiene che la privazione del cibo 119 aumenti la sensibilità al feedback steroide-negativo sul generatore di impulsi GnRH [Yamamoto et al, 2003]. Ormone rilasciante le Corticotropine Si ritiene che gli effetti del legame di steroidi al PVN aumentino la secrezione di CRH in neuroni che proiettano in vicinanza di neuroni GnRH. [MacLusky et al, 1988, Maeda et al, 1994, Tsukamura et al, 1999] Il trattamento centrale con CRH ha influenze inibitorie sulla secrezione di LH, ed il trattamento con antagonisti al CRH previene gli effetti del digiuno sugli impulsi di LH in ratti OVX trattati con steroidi [Maeda et al, 1994]. Il trattamento con CRH inibisce la generazione di impulsi di GnRH da azione diretta sui neuroni GnRH [MacLusky et al, 1988]. E’ difficile inserire il peptide correlato urocortina in questo quadro; contrariamente ad un trattamento con CRH, il trattamento con urocortina aumenta la secrezione di LH mentre alle stesse dosi diminuisce l’assunzione di cibo negli ovini [Holmberg et al, 2001]. Sarebbe forse più utile possedere dati riguardo il ruolo dell’urocortina nel controllo del sistema HPG in una varietà di specie più ampia [Wingfield et al, 2000] . β-Endorfine Il rilascio di oppiacei endogeni, in particolare della β-endorfina, è un altro aspetto della risposta a stress che inibisce il comportamento sessuale. In femmine obese del ratto di Zucker, il trattamento con antagonisti degli oppioidi ha attenuato l’obesità e migliorato la performance sessuale [Marin-Bivens et al, 1999]. Orexine Le orexine, conosciute anche come ipocretine, aumentano sia l’assunzione di cibo sia l’impiego energetico aumentando il periodo di veglia e prevenendo il normale periodo di sonno [Lubkin et al, 1998,Willie et al, 2001]. In aggiunta, l’orexina stimola la secrezione di LH in ratti OVX trattai con steroidi, ed inibisce la secrezione di LH in ratti trattati con soluzione o con basse dosi di E [Furuta et al, 2002, Pu et al, 1998, Tamura et al, 1999]. Melanocortine Un punto di divergenza fra i meccanismi che controllano l’assunzione di cibo e quelli che controllano la riproduzione è che la leptina influenza l’assunzione di cibo attraverso la via melanocortinergica , laddove gli effetti della leptina sugli 120 impulsi di LH e sulla ciclicità estrale sembrano essere indipendenti dal sistema della melanocortina [Hohmann et al, 2000, Schneider et al, 1999] Ormone inducente il rilascio di Gonadotropine (GnRH) La maggior parte delle evidenze sperimentali indica che i segnali sensoriali metabolici e gli ormoni influenzano i neuroni GnRH-ergici indirettamente attraverso vie centrali e periferiche. Nei criceti, lesioni AP/mTNS prevengono gli effetti inibitori da glucoprivazione sistemica (trattamento 2DG) o da ipoglicemia (trattamento con insulina) sul ciclo estrale [Panicker e Wade, 1998; Panicker et al.,1998; Schneider et al, 1994]. Il deficit sistemico nella disponibilità di glucosio ossidabile non è, quindi, rilevato direttamente da neuroni GnRH-ergici, ma piuttosto in zone periferiche o nel nucleo caudale e ridiretti alla parte anteriore. Nei ratti e nei criceti, la maggior parte dei neuroni GnRH-ergici è localizzata nell’AH, POA, ed Arc, aree del cervello anteriori rispetto a quelle ricche in recettori della leptina (Ob-Rb) e dell’insulina. E’ improbabile, quindi, che la secrezione di GnRH sia direttamente modulata dalla leptina o dall’insulina. I recettori per ER-α, NPY, Ob-Rb ed insulina non sono stati segnalati nei corpi cellulari dei neuroni GnRH-ergici. Quindi, è più probabile che le aree ipotalamiche ed extraipotalamiche ricche di recettori come ER-α ed Ob-Rb indirizzano il segnale verso aree che contengono i neuroni GnRH [Herbison et al, 1998]. 121 Figura 21. Schema riassuntivo Il controllo metabolico della riproduzione e dell’ appetito coinvolgono il sistema nervoso centrale e periferico ed i tessuti periferici. I riquadri con il contorno più spesso rappresentano aree conosciute per essere importanti per il controllo metabolico della riproduzione. Lo stimolo sensoriale primario è la disponibilità di riserve metaboliche ossidabili come il glucosio e gli acidi grassi liberi. Questi sono rilevati nel nucleo caudale. In aggiunta, è possibile che la disponibilità si rilevata anche nei tessuti periferici, come il fegato ed il tubo digerente, e che il segnale si rediretto al cervello tramite il motore dorsale del vago. La secrezione degli ormoni, come l’insulina e la leptina, è stimolata dall’influsso delle riserve metaboliche nei tessuti, come il pancreas ed il tessuto adiposo, rispettivamente. (I triangoli indicano presenza di recettori per steroidi gonadali, i trapezi recettori di leptina ed insulina). [Schneider et al, 2004] 122 Il sistema degli endocannabinoidi Negli ultimi anni il sistema degli endocannabinoidi è emerso essere un argomento molto importante nella comunità scientifica. A questo sistema sono state attribuite differenti azioni di regolazione e il suo coinvolgimento in molteplici situazioni pato-fisiologiche viene costantemente monitorato. Il sistema degli endocannabinoidi comprende:gli endocannabinoidi, i recettori per i cannabinoidi e l’apparato per la loro sintesi e degradazione, e rappresenta un nuovo sistema di segnalazione endogeno [Piomelli,2003; De Petrocellis et al.,2004]. In generale, il sistema degli endocannabinoidi è coinvolto in molte differenti funzioni fisiologiche molte delle quali correlate con i sistemi di recupero dallo stress e con il mantenimento del bilancio omeostatico [Di Marzo et al.,1998].Tra le altre funzioni, è coinvolto nella neuroprotezione [Panikashvili et al.,2001;Marsicano et al.,2003; Panikashvili et al.,2005], nella nocicezione [Cravatte e Lichtman,2004], nella regolazione dell’attività motoria (Van der Stelt e Di Marzo,2003), e nel controllo di certe fasi della memorizzazione [Wotjak,2005; Marscano et al.,2002;Varvel e Lichtman,2002]. Inoltre, il sistema degli endocannabinoidi è coinvolto nella modulazione della risposta immunitaria e infiammatoria [Walter et al.,2003;lei net al.,2003;Massa et al.,2004], è in grado di influenzare i sistemi cardiocircolatorio e respiratorio attraverso il controllo della frequenza cardiaca, della pressione sanguigna e delle funzioni bronchiali [Mendizabal e Adler-Graschinsky,2003]. In fine, gli endocannabinoidi sono conosciuti per esercitare un’importante azione antiproliferativa nelle cellule tumorali [Bifulco e Di Marzo,2002]. Endocannabinoidi Gli endocannabinoidi rappresentano una nuova classe di mediatori lipidici, eicosanoidi, isolati dal cervello e dai tessuti periferici nel corso dell'ultimo decennio. Il primo cannabinoide endogeno è stato identificato nel 1992 e si tratta dell’anandamide (arachidonoiletanolammide, AEA) [Devane et al.,1992] (Figura 22). Successivamente, è stato scoperto un secondo endocannabinoide: il 2-arachidonoilglicerolo (2-AG) [Mechoulam et al.,1995; Sugiura et al.,1995] (Figura 23). Entrambi questi composti sono derivati dall’acido arachidonico, e sono in grado di legarsi ai recettori per i cannabinoidi, tuttavia, con differenze sia nell’affinità che nell’efficacia dell’attivazione [Howlett,2002]. 123 Durante gli ultimi anni sono stati descritti molti altri mediatori lipidici che sembrano agire, almeno in parte, attraverso i recettori per i cannabinoidi di tipo 1 e/o di tipo 2, e conferiscono specifici effetti farmacologici in vivo [Bradshaw e Walker,2005]. Specificamente, questi composti sono: 2-arachidonoil-gliceril-etere (noladin) [Hanus et al.,2001], la virodamina [Porter et al.,2002] e la N- arachidonoildopamina [Huang et al.,2002] e probabilmente la olammide [Leggett et al.,2004]. Tuttavia la funzione nei processi fisiologici di questi ultimi composti non è stata ancora ben stabilita in dettaglio, e sono necessari ulteriori studi [De Petrocellis et al.,2004]. Inoltre, ci sono molti altri probabili mediatori lipidici che potrebbero svolgere un azione cannabinoidomimetica, ma non è ancora noto in dettaglio quale sia l’esatto meccanismo d’azione di questi composti [Bradshaw cannabinoidomimetici e Walker,2005]. potrebbero I essere molti casi, parzialmente questi attribuiti effetti alle interferenze con gli enzimi che inattivano gli endocanabonoidi [Bradshaw e Walker,2005]. Questi lipidi potrebbero, pertanto, essere capaci di aumentare l’attività dei recettori per i cannabinoidi attraverso ‘aumento della concentrazione degli endocannabinoidi come l’AEA e/o 2-AG. Figura: 22. Struttura del’anandamide (AEA) Figura: 23. Struttura del 2-arachidonoilglicerolo (2-AG) Recettori per i cannabinoidi Fino ad ora sono stati identificati e caratterizzati, a livello molecolare, due tipi di recettori per i cannabinoidi che presentano una struttura con sette domini transmembrana e sono accoppiati alle proteine G, e sono stati chiamati recettore per i cannabinoidi di tipo 1 (CB1 receptor) [Matsuda et al.,1990] e di tipo 2 (CB2 receptor) [Munro et al.,1993]. 124 Figura 24: Struttura dei recettori dei cannabinoidi CB1 e CB2 Il recettore CB1 è stato originariamente descritto come il recettore, tipo del cervello (“brain type”) poiché i suoi livelli di espressione nel cervello erano molto elevati [Herkenham et al.,1990]. Tuttavia studi recenti attribuiscono agli endocannabinoidi nuovi siti di azione, attraverso l’attivazione del recettore CB1, in organi periferici. I recettori di tipo CB2 sono presenti, pressoché esclusivamente, nelle cellule immunitarie e del sangue, dove potrebbero partecipare alla regolazione della risposta immunitaria [Howlett et al.,2002]. Tuttavia, i recettori CB2 esercitano le loro funzioni anche in cellule che non appartengono al sistema immunitario, come i cheratinociti [Ibrahim et al.,2005]. Ci sono delle prove farmacologiche che testimoniano la presenza di altri tipi di recettori per i cannabinoidi, i quali, tuttavia, non sono stati ancora clonati [Begg et al.,2005]. Studi di espressione hanno dimostrato che CB1 è uno dei più abbondanti recettori accoppiati alle proteine G presenti nel cervello dei mammiferi [Herkenham et al.,1990]. CB1 è ampiamente espresso nel cervello, incluso il bulbo olfattivo, le regioni corticali (neocorteccia, corteccia piriforme, ippocampo e amigdala), molte parti dei gangli basali, i nuclei talamici e ipotalamici, la corteccia cerebellare, i nuclei del tronco encefalico. Nelle regioni subcorticali, CB1 è presente a livelli relativamente elevati nella regione del setto (setto laterale e mediano, e nuclei verticali e orizzontali della banda diagonale). Bassi livelli di espressione di CB1 sono presenti nelle regione ipotalamiche, nel nucleo preottico mediale e laterale, nel nucleo preotico magnocellulare e nel nucleo paraventricolare [Marsicano e Lutz,1999]. I primi studi condotti sulla distribuzione di CB1 mostravano una presenza disseminata del recettore in entrambi i lobi dell’ipofisi dei roditori [Herkenam et al.,1991]. Studi più recenti hanno esaminato in maggior dettaglio la 125 distribuzione dell’mRNA di CB1 nel lobo anteriore dell’ipofisi. Nel 1999, l’abbondante presenza del recettore CB1 nell’adenoipofisi di ratto è stata associata con la capacità di questa ghiandola di sintetizzare gli endocannabinoidi [Gonzalez et al.,2000].Inoltre è stato dimostrata la presenza di CB1 nelle cellule dell’ipofisi di ratto che secernono la prolattina e in quelle che secernono l’LH [Wenger et al.,1999]. Nei roditori, l’espressione di CB1 nell’ipofisi è sotto l’influenza degli ormoni sessuali circolanti, infatti, gli androgeni e gli estrogeni hanno la capacità di upregolare e di down-regolare l’espressione di CB1 In accordo con questi risultati è stato trovato che in ratti, affetti da iperplasia ipofisaria indotta dagli estrogeni, si verificava una diminuzione dell’espressione di CB1. Di conseguenza, nei ratti , le ipofisi dei maschi mostrano un più alto livello di espressione dell’mRNA di CB1 rispetto a quella delle femmine [Gonzalez et al.,2000]. Il recettore per i cannabinoidi di tipo 1 è espresso, oltre che nel cervello, anche negli organi periferici. Sono stati trovati elevati livelli di espressione di CB1 nella tiroide di ratti durante le prime fasi embrionali [Buckley et al., 1998], mentre nella tiroide di ratto adulto i livelli di mRNA di CB1 erano veramente bassi ma sufficienti per essere rilevati [Porcella et al.,2002]. Inoltre CB1 è espresso anche negli organi periferici che sono coinvolti nel controllo metabolico. Nel 2003, due gruppi indipendenti trovarono la presenza di CB1 negli adipociti di topo e dell’uomo [Cota et al.,2003; Bensaid et al.,2003; Engeli et al.,2005]. Recentemente CB1 è stato localizzato nel fegato di topo [Osei-Hyiaman et al.,2005]. Inoltre il sistema degli endocannabinoidi è presente anche nel tratto gastrointestinale dove ha la funzione di modulare diverse funzioni incluse la mobilità, l’infiammazione e la secrezione. CB1 è espresso, anche, nelle terminazioni del nervo vago che innervano il tratto gastrointestinale [Pertwee,2001] che sono coinvolte nella segnalazione tra l’intestino e il cervello e nella modulazione dell’assunzione di cibo. Il recettore CB1 è espresso anche negli organi riproduttivi. È noto da tempo che esso è espresso nei testicoli [Galiegue et al.,1995; Gerard et al.,1991], e in particolare sembra essere localizzato nelle cellule di Leyding [Wenger et al.,2001]. CB1 è presente anche nelle ovaie [Galiegue etal.,1995], probabilmente esso è localizzato nelle cellule della granulosa. È stata rilevata la sua presenza anche nell’utero di topo [Das et al.,1995] e nel miometrio nell’uomo [Dennedy et al.,2004]. È importante notare che CB1 è coespresso con i recettori β-adrenergici nella muscolatura dell’ovidotto, dove il sistema 126 degli endocannabinoidi regola la mobilità e il trasporto dell’embrione [Wang et al.,2004]. Sintesi, rilascio, assorbimento, e degradazione degli endocannabinoidi: attivazione su richiesta del sistema degli endocannabinoidi Gli endocannabinoidi sono molto lipofilici, e questa caratteristica non permette loro di essere immagazzinati in delle vescicole, come gli altri neurotrasmettitori. Di conseguenza, la regolazione del segnale degli endocannabinoidi è strettamente controllata dalla loro sintesi, dal loro rilascio, dal loro assorbimento e dalla loro degradazione [Piomelli, 2003]. Molteplici stimoli differenti, incluso depolarizzazione della membrana e l’aumento intracellulare di Ca2+ e/o la stimolazione del recettore può attivare complessi macchinari enzimatici, che conducono alla scissione dei fosfolipidi di membrana ed eventualmente alla sintesi degli endocannabinoidi. Differenti enzimi sono coinvolti nella sintesi di diversi endocannabinoidi in differenti condizioni. Gli endocannabinoidi possono attivare i recettori per i cannabinoidi dopo la sintesi, o dopo un precedente rilascio nello spazio intracellulare o spostandosi direttamente tra endocannabinoidi la è membrana limitato da cellulare. efficaci Il segnale processi di trasmesso degradazione, dagli che interessano un’assunzione facilitata dallo spazio extracellulare nella cellula, e un catabolismo enzimatico mediato da specifici enzimi intracellulari. Gli enzimi in grado di degradare gli endocannabinoidi sono stati caratterizzati molto bene, essi sono ammide idrolasi degli acidi grassi (FAAH) per l’anandamide e per altri composti correlati [Giang e Cravatt,1997] e una monoglicerol lipasi per il 2-AG [Dinh et al.,2002], tuttavia altri enzimi potrebbero essere coinvolti nella degradazione di quest’ultimo composto [Dinh et al.,2004]. Si pensa che il sistema degli endocannabinoidi agisca su richiesta, con una selettività spaziale e temporale rigorosamente regolamentata. Questo sistema esecita le sue azioni modulatorie solo quando e dove è necessario. Questo comporta una importante distinzione tra le funzioni fisiologiche del sistema degli endocannabinoidi (selettive nello spazio e nel tempo) e le azioni farmacologiche degli agonisti esogeni dei recettori per i cannabinoidi, che mancano di selettività. In questo contesto di regolazione endocrina, è interessante citare che la stimolazione ormonale con i glucocorticoidi può condurre alla sintesi degli endocannabinoidi nell’ipotalamo, attraverso un rapido meccanismo non genomico [Di et al,2003]. 127 Segnali inter e intracellulari mediati dagli endocannabinoidi Diversi meccanismi mediati dagli endocannabinoidi vengono riportati di seguito: 1) Nel sistema nervoso centrale (CNS), gli endocannabinoidi, possono gire da neurotrasmettitori trasferendo informazioni da un neurone al successivo. Qui gli endocannabinoidi rilasciati postsinapticamente migrano nei siti presinaptici dove attivano i recettori CB1. Dunque essi mediano un segnale retrogrado [Freund et al.,2003; Wilson e Nicoll,2003; Alger,2002]. 2) Gli endocannabinoidi possono mediare un segnale autocrino che induce un effetto auto inibitore sull’attività neuronale. Questo è stato mostrato per i neuroni GABAergici nella corteccia cerebrale [Bacci et al.,2004]. 3) Gli endocannabinoidi possono agire sia in maniera paracrina che autocrina, senza coinvolgere la trasmissione sinaptica. Questo è presumibilmente applicabile per le cellule gliali [Stella,2004] e nelle cellule non neuronali come gli adipociti e gli epatociti. 4) Dal momento che gli endocannabinoidi e il recettore CB1 sono presenti nella cellula , non può essere escluso che gli endocannabinoidi possono agire come molecole di segnalazione intracellulare. AEA e 2-AG non sembrano mediatori intercambiabili. Per esempio, prove elettrofisiologiche e biochimiche mostrano che il 2-AG è prevalentemente coinvolto nel contrllo retrogrado dell’attività sinaptica nell’area tegumentale ventrale (VTA) [Melis et al.,2004],o dell’ippocampo [Chevaleyre e Castillo,2004], mentre AEA sembra giocare un ruolo importante in altre regioni come nei gangli basali [Gerdeman e Lovinger,2001] e nell’amigdala [Azad et al.,2004]. In sintesi, gli endocannabinoidi sembrano essere dei mediatori di segnali molto versatili, coinvolti in un ampio spettro di processi di regolazione fisiologica. 128 Cannabinoidi esogeni e endogeni e il loro ruolo nella regolazione endocrina È noto da molto tempo che i cannabinoidi esogeni sono in grado di influenzare la secrezione degli ormoni ipofisari, comportando, quindi, degli importanti effetti sulle funzioni degli organi bersaglio periferici. L’ipotalamo è generalmente considerato come il principale sito d’azione dei cannabinoidi sulle funzioni neuroendocrine. Questo punto di vista viene supportato da recenti pubblicazioni che mostrano che i cannabinoidi agiscono come dei messaggeri retrogradi che attivano i recettori CB1, espressi nelle terminazioni presinaptiche glutammatergiche nell’ipotalamo. La conseguente attivazione del recettore CB1 provoca una cascata di segnali che conduce all’inibizione del rilascio dei neurotrasmettitori glutammato eccitatori nelle cellule neuroendocrine del PVN, e del nucleo sopraottico [Di et al.,2003]. Questo conduce ad un generale effetto soppressivo sulle cellule neuroendocrine, e di conseguenza ad un effetto inibitorio sulle funzioni neuroendocrine. Tuttavia, è stato recentemente proposto che il sistema degli endocannabinoidi potrebbe essere in grado di controllare il bilancio ormonale anche attraverso un diretto effetto a livello degli organi bersaglio periferici. Il ruolo dei cannabinoidi nella modulazione dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi e della fertilità Nelle femmine, la somministrazione di cannabinoidi, endogeni o esogeni, sembra non avere effetti sulla secrezione di FSH [Wenger et al.,1995], mentre molte evidenze sperimentali attribuiscono ai cannabinoidi una grande abilità di down-regolare nel i livelli plasmatici di LH [Gonzalez et al.,2000; Murphy et al.,1990; Wenger et al.,1995; Besch et al.,1977]. Questo effetto è dovuto ad una completa soppressione della secrezione pulsatile di LH [Tyrey,1978; Smith et al.,1978]. Nelle scimmie, una cronica somministrazione (per 18 giorni) di ∆9THC (∆9 tetraidrocannabinolo, principio attivo della marijuana (Cannabis sativa)), provoca un blocco dei picchi degli estrogeni e dell’LH e il conseguente aumento della concentrazione di progesterone [Asch et al.,1981]. Tuttavia, gli stessi animali sviluppano una tolleranza agli effetti antiriproduttivi della droga dopo pochi mesi di trattamento [Schith et al.,1983]. Un eccesso di cannabinoidi potrebbe anche compromettere la regolare ovulazione, non solo agendo a 129 livello ipotalamico ma anche colpendo direttamente sullo strato della granulosa ovarica [Treinen et al.,1993]. Si asserisce che l’effetto inibitorio dei cannabinoidi sulla secrezione dell’LH abbia un sito di azione al di sopra dell’ipofisi. Infatti la somministrazione di gonadotropine o GnRH è in grado di indurre l’ovulazione o il rilascio di LH, rispettivamente, anche in presenza di alti livelli di ∆9-THC [Tyrey,1978; Smith et al.,1978]. Tuttavia uno studio mostra che, in vitro, i cannabinoidi non sono capaci di bloccare la secrezione basale di GnRH dall’ipotalamo [Murphy et al.,1990]. Questi risultati suggeriscono che i cannabinoidi modificano, indirettamente, la secrezione del GnRH, attraverso una modulazione negativa dell’attività dei neurotrasmettitori che promuovono la secrezione del GnRH, come la norepinefrina [Murphy et al.,1990] e il glutammato [Shen et al.,1996], e mediante la stimolazione di quei modulatori che down-regolano la secrezione del GnRH, come la dopamina [Rodriguez de Fonseca et al.,1992], GABA [de Miguel et al.,1998], gli oppiodi [Kumar e Simpkins,1983], e l’ormone rilasciante le corticotropine (CRH) [Jackson e Murphy,1997]. L’effetto stimolatorio di cannabinoidi sui neuroni dopaminergici è ben conosciuto [Maldonado,2002], tuttavia, il loro impatto sull’attività dopaminergica del cervello varia in funzione dello stato delle gonadi, come viene dimostrato da diverse prove [Rodriguez de Fonseca et al.,1994]. In particolare è stato dimostrato che i recettori per gli ormoni steroidei mediano gli effetti del ∆9THC, favorendo il comportamento sessuale [Turley e Floody,1981], attraverso l’attivazione del recettore CB1 [Mani et al.,2001]. Inoltre, nello stesso studio di Mani et al. del 2001, viene riportato che è richiesta una interazione tra il progesterone e il recettore per la dopamina, di tipo 1 (D1), per la recettività sessuale nelle femmine di ratto facilitata dal ∆9-THC. Recenti risultati sulla fluttuazione dell’AEA durante il ciclo ovarico, hanno permesso ad alcuni autori di ipotizzare che gli endocannabinoidi potrebbero influenzare la secrezione ormonale e il comportamento sessuale agendo direttamente sul recettore CB1 [Stella,2001]. Tuttavia, nell’ovaio è stata trovata un’importante produzione di endocannabinoidi, in particolare al momento dell’ovulazione, e ciò ha reso possibile formulare l’ipotesi che gli endocannabinoidi potrebbero aiutare a regolare la maturazione follicolare e lo sviluppo dell’ovaio [Schuel et al.,2002]. L’utero contiene la più alta concentrazione di AEA rilevata nei tessuti dei mammiferi, ed è il solo tessuto dove l’AEA è il principale componente (più del 95%) degli N-aciletanolamidi [Schmid et al.,1997]. Questa osservazione, insieme all’espressione di CB1 negli embrioni reimpiantati [Paria et al.,1995], 130 hanno, recentemente, suggerito di concentrare gli sforzi sul ruolo del sistema degli endocannabinoidi durante le prime fasi della gravidanza e nella modulazione delle interazioni tra embrioni e utero. Alti livelli di AEA influenzano negativamente lo sviluppo e l’impianto degli embrioni attraverso l’attivazione di CB1 [Paria et al.,1998], mentre bassi livelli di AEA promuovono la crescita e la differenziazione embrionale [Wang et al.,1999; Paria e Dey,2000;Maccarone e Finazzi-Agro,2004]. È, dunque, evidente che la degradazione enzimatica di AEA da parte di FAAH, è un punto di controllo enzimatico nel controllo della riproduzione. Una serie di studi condotti da Maccarone et al. [Maccarone et al.,2003; Maccarone e Finazzi-Agro,2004] mostrano che l’attività di FAAH è sotto una stretta regolazione da parte di molti ormoni, come il progesterone, la leptina, e l’FSH, ben noti modulatori della fertilità. Utilizzando un blocco farmacologico o genetico del recettore CB1 è stato, recentemente, dimostrato che un deficit dei segnali inviati dagli endocannabinoidi comporta una ritenzione degli embrioni di topo nell’ovidotto, provocando il fallimento della gravidanza. Questo è dovuto al profondo indebolimento della contrazione coordinata della muscolatura liscia del’ovidutto e della sua distensione [Wang et al.,2004]. In sintesi, tutte le tappe, che vanno dalla fertilizzazione fino alla gravidanza, sembrano essere strettamente modulate dagli endocannabinoidi,rafforzando l’idea che il sistema degli endocannabinoidi potrebbe essere considerato, non solo come neuromodulatore centrale, ma anche come un protagonista fisiologico in un più ampio scenario. Nei maschi i cannabinoidi provocano una diminuzione della concentrazione dell’LH [Kolodny et al.,1974; Symons et al.,1976]. Tuttavia, non c’è ancora un generale accordo, ma sembra che la somministrazione cronica di cannabinoidi, in molte specie, sia in grado di ridurre la produzione [Harclerode et al.,1978] e la secrezione [Kolodny et al.,1974; Symons et al.,1976] di testosterone, che provoca la soppressione della spermatogenesi, e la riduzione del peso dei testicoli e degli organi riproduttivi accessori [Dixit et al.,1974]. Gli effetti importanti dei cannabinoidi sul sistema gonadico sono principalmente attribuiti all’attivazione del recettore CB1, come è stato dimostrato usando degli agonisti e degli antagonisti specifici [Martin-Calderon et al.,1998; Wenger et al.,1997]. Una conferma definitiva è stata fornita da recenti studi, che hanno dimostrato che iniezioni intraperitoneali di AEA provocano una diminuzione della concentrazione di LH e di testosterone nei topi wild-type, ma non nei topi che mancano del gene che esprime il recettore CB1 (CB1-/-) [Wenger et al.,2001]. 131 Inoltre, è noto che i testicoli esprimono il recettore CB1 [Gerard et al.,1991], e sintetizzano gli endocannabinoidi [Sugiura et al.,1996]. È stato visto che topi esposti al ∆9-THC presentano un ridotto impulso copulatorio, e ciò potrebbe spiegare il fatto che i cannabinoidi down-regolano i livelli di testosterone circolante [Merari et al.,1973]. Inoltre, è stato visto che il fluido del tratto genitale maschile contiene una significante quantità di endocannabinoidi [Schuel et al.,2002], e questo suggerisce che queste molecole segnale lipidiche potrebbero influenzare importanti processi che controllano le funzioni dello sperma e/o dell’uovo e le interazioni con il gamete. In conclusione, sembra, quindi, che il sistema degli endocannabinoidi ha un importante ruolo nella regolazione dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi sia nelle femmine che nei maschi. Il sistema degli endocannabinoidi nella modulazione del bilancio energetico Ci sono due interessanti aspetti che sottolineano l’importanza del sistema degli endocannabinoidi nella regolazione dell’assunzione di cibo, e del metabolismo energetico. Primo: è stato visto che il ruolo del sistema degli endocannabinoidi, nella regolazione della risposta alla nutrizione,presenta un alto grado di conservazione durante l’evoluzione [De Petrocellis et al.,1999]. Secondo: è stato osservato che sono richiesti alti livelli di endocannabinoidi, nel latte materno, affinché i neonati rispondano all’inizio dell’allattamento [Fride et al.,2001]. Proprietà di soddisfazione La somministrazione dell’attività di endocannabinoide AEA può associata rappresentare con una un amplificazione normale assunzione, episodica, di cibo da parte del ratto [Williams e Kirkham,1999]. Importante, gli effetti di AEA sono completamente bloccati dal pretrattamento degli animali con l’antagonista degli endocannabinoidi per il recettore CB1 SR141716, confermando il ruolo principale nell’attivazione del recettore CB1 negli effetti iperfagici degli endocannabinoidi [Williams e Kirkham, 2002;Kirkham e Williams,2001]. E’ ora chiaro che il sistema endocannabinoide partecipa alla modulazione dei circuiti ricompensa/rafforzamento e la sua manipolazione è in grado di influenzare il comportamento correlato alla ricompensa [Gardner e Vorel, 132 1998]. La grande espressione del recettore CB1 in aree legate alla ricompensa costituisce una forte indicazione che il sistema endocannabinoide sia coinvolto in varie funzioni fisiologiche controllate in queste regioni cerebrali, inclusa la nutrizione [Breivogel e Childes,1998]. La circuitazione ricompensa/rafforzamento del cervello dei mammiferi consiste in una serie di nuclei cerebrali connessi sinapticamente. Questo circuito è implicato nel piacere prodotto dalle ricompense naturali come il cibo, le droghe che danno dipendenza ed il sesso, ed è il substrato neuronale della dipendenza da droghe e del fenomeno di dipendenza (p.es come la ricerca e la disforia indotte da astinenza) [Gardner e Vorel, 1998]. Assunzione di cibo Una complessa e ridondante rete neuronale ipotalamica provvede ad alti livelli di adattabilità della nutrizione a vari stimoli centrali e periferici. La ridondanza di segnali collegati alla regolazione dell’appetito è concepibile in vista dell’importanza vitale della nutrizione ai fini della sopravvivenza [Flier, 2004]. Mentre difetti nelle vie di segnalazione anoressigniche portano quasi sempre all’obesità, perdita di segnali orexigenici raramente risultano in un fenotipo magro. Un esempio di questa ridondanza nel sistema di segnalazione orexigenico ipotalamico è fornito dai topi mancanti del neuropeptide Y (uno dei neuropeptidi appetito-stimolanti più importanti) dove è più probabile che i meccanismi compensatori si attivino. I segnali che vengono da vari organi periferici, come il fegato, il tratto gastrointestinale ed il tessuto adiposo, sono convoluti principalmente a livello ipotalamico per informare costantemente il cervello riguardo lo stato nutritivo [Flier, 2004, Erickson et al, 1996, Wynne et al, 2005]. Un esempio di questo controllo periferico è l’ormone, adipocitaderivato, leptina, che agisce sui recettori localizzati sull’ipotalamo [Flier, 2004]. Una pietra miliare nell’identificazione del sistema degli endocannabinoidi, come un nuovo fattore nella regolazione dell’assunzione di cibo a livello ipotalamico, è stata la scoperta che la leptina è un forte modulatore dei livelli di endocannabinoidi ipotalamici [Di Marzo et al, 2001]. Solo durante gli ultimi anni si è cominciato a chiarire più in dettaglio l’interazione fra gli endocannabinoidi e CB1 nelle vie di regolazione della nutrizione. Il recettore CB1 è espresso in sistemi ipotalamici peptidergici chiave, come quelli che producono CRH nel PVN, i trascritti cocainaanfetamina, correlati, nel nucleo dorsomediale, e l’ormone che concentra melanina, e l’orexina nell’area ipotalamica perifornicale [Cota et al, 2003]. 133 Questi dati sono recentemente confermati dalla dimostrazione che l’attivazione di CB1 aumenta fortemente la via A-stimolata dell’orexina intracellulare [Hilairet et al, 2003]. 134 Scopo II Nell’allevamento intensivo del coniglio l’infertilità di “origine alimentare” che si riscontra frequentemente nelle coniglie primipare, contemporaneamente gravide e allattanti, rappresenta una delle cause di ridotta efficienza riproduttiva con conseguente perdita economica. Da anni è noto che esiste un legame tra lo stato nutrizionale e la fertilità [Boland et al.,2000], ma ancora non è noto qual è il meccanismo attraverso il quale il deficit calorico influenza le funzioni riproduttive [Wade e Jones, 2004]. In differenti specie animali, una prolungata restrizione calorica inibisce la secrezione pulsatile del LH, riducendo la secrezione del GnRH da parte dell’ipotalamo [Wade et al.,1986; Cameron, 1996], e ciò induce una condizione di anestro [Diskin et al., 2003]. Da un recente lavoro, condotto nei nostri laboratori, si è appreso che un breve digiuno di 24 ore è in grado di influenzare negativamente sia la fertilità che la recettività sessuale delle coniglie [Brecchia et al.,2006]. Quando si ha scarsa disponibilità di cibo viene inibito il sistema ipotalamoipofisi-gonadi. L’effetto primario del deficit metabolico è l’inibizione degli impulsi ipotalamici di GnRH. Questo provoca una cascata di eventi che portano all’interruzione della secrezione delle gonadotropine ipofisarie, comportando una mancata secrezione degli steroidi, che ha come conseguenza l’inibizione della fase estrale. Lo scopo di questo studio è stato quello di andare a valutare l’espressione genica nell’adenoipofisi del recettore di tipo alfa degli estrogeni (ERα) e del recettore per il GnRH (GnRHR) e dell’ FSH-β, e la secrezione dinamica dell’LH in seguito alla stimolazione dell’ GnRH in coniglie intatte, ovariectomizzate (OVX), trattate con estrogeni (E) alimentate ad libitum (AL) o tenute a digiuno (F) per 48 ore. Inoltre, nello stesso modello sperimentale, si è andato a valutare l’espressione genica do ERα anche nell’ipotalamo. Recentemente, si è posta molta attenzione allo studio del sistema degli endocannabinoidi che rappresenta un nuovo sistema endogeno di trasduzione dei segnali coinvolto in molteplici funzioni fisiologiche [Piomelli,2003; De Petrocellis et al.,2004], tra cui il controllo dell’assunzione di cibo e del bilancio energetico [Pagotto et al.,2006]. Inoltre, molti studiosi asseriscono che i cannabinoidi possono influenzare la secrezione ormonale e il comportamento sessuale [Stella,2001]. Nello stesso modello sperimentale si è andato a valutare la variazione dell’espressione genica del recettore per i cannabinoidi tipo 1 (CB1) sia nell’adenoipofsi che nell’ipotalamo. 135 Materiali e metodi Reagenti I primer random exameres, la deossiribonucleasi I (DNAase I Amp.Grade), La trascrittasi inversa RNAsi-H (SuperScript III Reverse Trascriptase) la RNAsi H di Escherichia coli, i ladder di DNA, e anche i reagenti per l’isolamento e la purificazione dell’RNA totale (TRIzol), la Taq DNA polimerasi (Taq Platinum), il buffer 10X per la PCR, il MgCl2 50 mM, le provette RNAsi free, l’acqua RNAsi free e i deossinucleotidi NTPs sono stati ottenuti dall’ Invitrogen (S.Giuliano Milanese, Milano, Italia). I primers per l’rRNA 18S e i corrispondenti competimeri (QuantumRNA 18S Internal Standard) sono stati acquistati dall’ Applied Biosystem (Monza,MI, Italia). I primers per l’mRNA del GnRH-R e di CB1 sono stati acquistati dall’Invitrogen. Il kit Nucleospin Extract II è stato acquistato dalla Macherey Nagel Inc. (Bethlehem, PA, USA). L’anticorpo primario monoclonale di topo anti-GnRH-R, utilizzato per IHC è stato acquistato da NeoMarkers (CA, USA). L’anticorpo monoclonale di topo anti ERα, è stato acquistato da Zymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA, USA). L’anticorpo primario policlonale di capra anti-CB1 è stato comprato dalla Santa Cruz Biotechnology. L’anticorpo secondario biotinilato di capra anti-topo, utilizzato per l’immunoistochimica di GnRH-R e ERα è stato acquistato dalla Vector Laboratories (Burlingame,CA,USA). L’anticorpo secondario di cavallo anti- capra, utilizzato per CB1 è stato acquistato dalla Vector. Il complesso avidinabiotina (ABC, Vector Elite Kit) e il cromogeno 3,3’-diaminobenzidina tetracloride (DAB) è stato comprato da Vector Laboratories. Il siero normale di capra è stato ottenuto dalla Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). I reagenti per la determinazione dell’LH, LH di coniglio (Lot#AFP7818C) e anti-LH di coniglio (Lot#AFP3120489GP) soono stati gentilmente concessi dal Dott. A.F. Parlow (Harbour UCLA, Medical Centre, CA, USA). Il 17β-estradiolo è stato acquistato dalla Sigma (St. Luis, MO, USA). I tubi SilasticTM (3,35 mm ID x 4,65 mm OD) e il silicone medico adesivo SilasticTM,sono stati gentilmente forniti dalla Dow Corning, corporation (Midland, MI, USA). 136 Protocollo sperimentale I protocolli che coinvolgono il trattamento e l’uso degli animali, per questi esperimenti è stato approvato dal Comitato di Bioetica dell’Università di Perugia Animali e regime ormonale Per questi esperimenti sono state utilizzate coniglie New Zealand White, sessualmente mature, aventi un peso di 3,5-4 kg, sono state allevate in gabbie singole in condizioni controllate di luce (14 ore di luce, 10 ore di oscurità) e di temperatura (20°C). 24 coniglie sono state ovariectomizzate (OVX) per via laparotomica, sotto anestesia generale effettuata con xylazina (3 mg/Kg) e ketamina (35 mg/Kg). Le coniglie sono state tenute a ricovero per 15 giorni prima di essere utilizzate per l’esperimento. Tutte le coniglie sono state alimentate con un mangime commerciale e hanno avuto libero accesso all’acqua per tutta la durata dell’esperimento. Le coniglie sono state pesate sia all’inizio che alla fine dell’esperimento Esperimento 1: le finalità dell’esperimento sono state quelle di verificare: a) la distribuzione cellulare di ERα e del GnRHR nell’adenoipofisi, b) gli effetti del digiuno, dell’ovariectomia (OVX) e del trattamento con estrogeni (E) sull’espressione genica di ERα, del GnRH-R e dell’ FSH. Il giorno prima dell’inizio dell’esperimento, le coniglie, sono state assegnate in maniera casuale ad uno dei seguenti 8 gruppi (3 coniglie per gruppo): § AL: coniglie alimentate ad libitum, coniglie controllo; § AL-E: coniglie alimentate ad libitum; § AL-OVX: coniglie alimentate ad libitum, ovariectomizzate; § AL-OVX-E: coniglie alimentate ad libitum, ovariectomizzate e trattate con 17β-estradiolo; § F (Fasted) : coniglie sottoposte a digiuno; § F-E: coniglie sottoposte a digiuno e trattate con il 17β-estradiolo; § F-OVX: coniglie sottoposte a digiuno e ovariectomizzate; § F-OVX-E: coniglie sottoposte a digiuno, ovariectomizzate e trattate con il 17β-estradiolo. Il trattamento con gli estrogeni è stato effettuato attraverso l’impianto sottocutaneo di tubi silastic di 13 mm, contenenti 20 mg/Kg di peso di 17βestradiolo, e chiusi all’estremità con silicone adesivo. I silastic riempiti con 137 estrogeni sono stati impiantati sottocute nella regione del collo e l’impianto è stato effettuato un giorno prima dell’inizio del digiuno, mentre ai corrispondenti controlli sono stati impiantati dei tubi silastic vuoti. Mentre le coniglie controllo sono state alimentate ad libitum, le coniglie trattate sono state tenute a digiuno per 48 ore. Alla fine del digiuno, le coniglie sono state sacrificate attraverso dislocazione cervicale, per prelevare le ipofisi e l’ipotalamo. Esperimento 2 lo scopo è stato quello di valutare il ruolo degli estrogeni ovarici, nelle coniglie, durante il digiuno, e la risposta dinamica dell’LH e dell’FSH alla somministrazione del GnRH esogeno. 20 coniglie sono state ovariectomizzate come descritto precedentemente. Due settimane dopo l’intervento, sia le coniglie intatte che quelle OVX sono state assegnate agli stessi 8 gruppi (3 coniglie per gruppo) dell’esperimento 1, e sono state trattate come nell’esperimento 1. Alla fine, tutte le coniglie sono state trattate con un’iniezione intramuscolare di 0,8 µg di un analogo del GnRH (Receptal, Hoechst-Russel Vet, Milano, Italia) per indurre l’ovulazione. Il giorno in cui è stato somministrato il GnRH viene designato come giorno 0. Immediatamente dopo la somministrazione del GnRH, le coniglie, che erano state tenute a digiuno, sono state nuovamente alimentate con mangime standard commerciale. Non appena terminato l’esperimento, gli impianti sono stati rimossi. Esperimento 3: l’obiettivo è stato quello di verificare gli effetti del digiuno, dell’ovariectomia e del trattamento con estrogeni sull’espressione genica rispettivamente di: a) CB1 a livello dell’adenoipofisi e dell’ipotalamo, e b) di ERα nell’ipotalamo. Le ipofisi e gli ipotalami sono stati prelevati durante la fase sperimentale 1, quindi, la procedura sperimentale e gli 8 gruppi sperimentali sono gli stessi dell’esperimento 1. Raccolta dei tessuti e dei campioni di sangue Subito dopo il sacrificio, il cervello di ogni coniglia dell’esperimento 1, è stato rimosso, e sono stati isolati l’ipotalamo e l’ adenoipofisi, i quali sono stati divisi in due parti, destinate rispettivamente all’ IHC e alla biologia molecolare. Le porzioni di tessuto destinate all’IHC (analisi del GNRH-R e dell’ ERα a livello adenoipofisario), sono state immediatamente fissate attraverso l’immersione in una soluzione di formaldeide al 4% (w/v) e PBS (0,1 M, pH 7,4) per 24 ore a 138 temperatura ambiente e successivamente processate per la fissazione in paraffina. Le parti di tessuto destinate alla biologia molecolare e quindi all’ analisi dell’ espressione genica, sono state immediatamente congelate a -80°C. Nel secondo giorno di esperimento, alle coniglie, al fine di effettuare prelievi ripetuti di sangue e di lasciarle libere di svolgere le normali attività, è stato inserito un catetere nella vena marginale dell’orecchio. Durante le ultime 3 ore di digiuno, sono stati raccolti campioni di sangue (1 ml) ogni 30 minuti. Terminate le 3 ore di digiuno, le coniglie sono state nuovamente alimentate e, successivamente, sono state sottoposte a prelievi di sangue ogni 30 minuti per 6 ore. Tutti i campioni di sangue sono stati messi in provette contenenti EDTA e, immediatamente centrifugati a 3000 g per 15 minuti. Il plasma, così ottenuto è stato congelato a -20°C, in attesa di essere utilizzato per i successivi dosaggi ormonali. Immunoistochimica per ERα, GnRH-R e CB1 L’analisi immunoistochimica è stata effettuata solo su coniglie tenute a digiuno. Questo esperimento è stato fatto a scopo indicativo, per vedere se erano presenti o meno i recettori per l’Erα, GnRH e per i cannabinoidi nell’ipofisi e dove erano localizzati. Sezioni di ipofisi di coniglie tenute a digiuno, dello spessore di 5µm sono state sottoposte alle procedure per l’identificazione del GnRH-R e dell’ERα, e di CB1 utilizzando anticorpi primari monoclonali di topo anti-GnRH-R e anti-Erα, e policlonale di capra anti-CB1 diluiti, rispettivamente, 1:100, 1:80 e 1:100, seguiti dall’incubazione con un anticorpo secondario, di capra anti-topo biotinilato (1:200) per GnRH-R e per ERα e con un anticorpo di cavallo anti-capra biiotinilato (1:200) per CB1, in accordo con la procedura sperimentale descritta in Dall’Aglio e collaboratori [Dall’Aglio et al.,2006]. Le reazioni positive sono state rilevate come precipitati marrone rossiccio. Mentre per CB1 è stata utilizzata una controcolorazione con ematossilina di Gill. Estrazione dell’RNA e retrotrascrizione L’RNA totale è stato estratto da un pool di tre metà di adenoipofisi e da tre metà di ipotalami [Boiti et al., 2003]. Le contaminazioni di DNA genomico vengono prevenute attraverso il trattamento con seguendo le procedure indicate dalla casa produttrice. deossiribonucleasi I, 139 5 µl di RNA totale sono stati retrotrascritti in cDNA in un volume finale di 20 µl del kit SuperScript III Reverse Trascriptase. Le eventuali contaminazioni di DNA genomico vengono controllate attraverso una PCR effettuata col cDNA ottenuto da una retrotrascrizione nella quale non è stato utilizzato l’enzima trascrittasi inversa (RT-). Amplificazione mediante RT-PCR multiplex Il protocollo per l’amplificazione mediante PCR multiplex è stato illustrato precedentemente da Boiti e collaboratori [Boiti et al.,2004]. Nel protocollo di PCR multiplex è stato utilizzato 1 ml di cDNA dell’adenoipofisi o dell’ipotalamo come stampo per i primers ERα, GnRH-R,FSH e per CB1 e per il 18S (vedi la tabella 2) Tabella 2: Sequenza dei primers per ERα, GnRH-R, FSH, CB1 e per il 18S utilizzato come standard interno Gene ERα GnRH-R FSH CB1 18S senso antisenso senso antisenso senso antisenso senso antisenso senso antisenso Lunghezza Primers Numero bp (5’-3)’ di cicli 147 AGATCCAAGGGAATGAGCTG 35 CTGCGGCGTTGAACTCATA 247 116 148 489 CCTTGCCTGGATCCTCAGTA ATGAAGGACCCGTGTCAGAG TCAAGAACGAAAGTCGGAGGTT GGACATCTAAGGGCATCA CATCCAGTGGGGAGAACT GGAGTGCAGGATGACAGA TCAAGAACGAAAGTCGGAGGTT GGACATCTAAGGGCATCA 30 32 35 140 Le PCR eseguite per amplificare un frammento del cDNA di ERα, GnRH-R, FSH e CB1 consistono in un primo ciclo di denaturazione a 94 °C per 75 secondi, seguito da un profilo di amplificazione di n° (vedi tabella 2) cicli caratterizzati da un primo ciclo di denaturazione a 94 °C per 15 secondi, seguito da un annealing a 60 °C per 30 secondi, e da un estensione a 72 °C per 45 secondi, ed uno step finale di estensione a 72 °C per 10 minuti. All’interno di ogni esperimento e per ogni gene analizzato, l’intero set di campioni è stato analizzato in parallelo in una singola PCR, utilizzando aliquote della stessa mix di PCR I prodotti amplificati generati dalla PCR (18 µl dei 25 µl totali della reazione) sono stati analizzati tramite elettroforesi su gel di agarosio al 2% utilizzando una colorazione al bromuro di etidio (0,5 µg/ml). L’analisi dei prodotti di amplificazione è stata descritta precedentemente da Boiti e collaboratori [Boiti et al.,2004]. Dosaggio ormonale La concentrazione plasmatica di LH è stata determinata attraverso il metodo dei RIA con doppio anticorpo omologo. L’anticorpo utilizzato è stato un anticorpo anti –coniglio per LH diluito 1:75000. Il tracciante è stato ottenuto attraverso la iodurazione dell’LH di coniglio (AFP-7818C) con il metodo iodogeno [Mattioli et al.,1986]. La sensibilità del metodo era di 0,5 ng/ml di plasma. I coefficienti di variazione intra-saggio e iter-saggio, calcolati utilizzando un singolo pool di plasma misurato 10 volte, erano,rispettivamente, di 3,9% e di 4,5%. Tutti i campioni sono stati misurati in duplicato nello stesso momento per ridurre le variazioni inter-saggio. Analisi statistica I dati relativi al peso corporeo son stati analizzati con il test ANOVA per le misurazioni ripetute. I rapporti di ogni prodotto di PCR per i geni target (ERα, GnRH-R, FSH, CB1), normalizzato con il prodotto coamplificato del 18S sono stati analizzati attraverso il test ANOVA a due vie (trattamento e gel possono essere due fonti di variabilità) seguito dal test di Student-Newman-Keuls t-test. I dati relativi alla totalità degli effetti sull’LH, durante il periodo di digiuno sono stati analizzati con il test ANOVA per misurazioni ripetute, in accordo con un modello che include il trattamento del gruppo, la coniglia all’interno del gruppo, 141 il periodo di tempo e le interazioni tra i gruppi e il periodo: la coniglia all’interno del trattamento è stata utilizzata come termine di errore. Il confronto tra gli effetti è stato effettuato con il test di Student-Newman-Keuls t-test. Un valore di P<0,05 è stato considerato significativo. Risultati Alla fine delle 48 ore di digiuno, il peso delle coniglie è stato il 4,9% in meno rispetto alle coniglie alimentate (controllo). Immunolocalizzazione di ERα, di GnRH-R e di CB1 nell’ipofisi Utilizzando un anticorpo monoclonale, l’immunoreattività di Erα è stata evidenziata nel nucleo di molte cellule ipofisarie, anche se nelle coniglie tenute a digiuno si osserva una bassa intensità (Figura 25). La colorazione positiva per il GnRH-R è evidente nei nuclei di molte cellule ipofisarie, inoltre è stato trovato un debole segnale nel citoplasma delle cellule ipofisarie (Figura 26) L’immunoreattività per CB1 si osserva nel citoplasma di alcune cellule dell’adenoipofisi. La positività è identificabile con la colorazione marrone. I nuclei sono stati controcolorati con ematossilina di Gill (Figura 27) 142 Figura: 25. Immunocolorazione per ERα nell’ipofisi di coniglio prelevata dalle coniglie tenute a digiuno (F). I segnali positivi sono rilevati da colorazione marrone. La reazione positiva è visibile nel nucleo delle cellule ipofisarie. Scala a barra: 50 µm Figura: 26. Immunocolorazione per GnRH-R nell’ipofisi di coniglio prelevata dalle coniglie tenute a digiuno (F). I segnali positivi sono rilevati da colorazione marrone. La reazione positiva è visibile nel nucleo delle cellule ipofisarie ed è stato trovato un debole segnale nel citoplasma delle cellule ipofisarie. Scala a barra: 50 µm 143 Figura: 27. Immunocolorazione per CB1 nell’ipofisi di coniglio prelevata dalle coniglie tenute a digiuno (F). I segnali positivi sono rilevati da colorazione marrone. La reazione positiva è visibile nel nucleo delle cellule ipofisarie. . I nuclei sono stati controcolorati con ematossilina di Gill Scala a barra: 20 µm 144 Espressione genica per ERα, GnRH-R , FSH e CB1 nell’ipofisi I corrispondenti prodotti di amplificazione ottenuti utilizzando i primers di ERα, GnRH-R, FSH e CB1 sono stati ottenuti della lunghezza (bp) aspettata (Figura 28b, A,B,C). L’analisi della sequenza ha mostrato che i corrispondenti prodotti di PCR sono omologhi con le sequenze pubblicate di cDNa di ERα, GnRH-R, FSH e CB1 del coniglio. L’espressione dell’mRNA di ERα è significantemente ridotta (P<0,05) dal digiuno nelle coniglie intatte (Figura 28, A). Il trattamento con gli estrogeni riduce (P<0,05) l’espressione di ERα nelle coniglie intatte AL e F. Questo effetto inibitorio dell’estradiolo, tuttavia, non è molto evidente negli animali OVX, in entrambi i gruppi AL (gruppi AL-OVX rispetto ai AL-OVX-E) o negli F (gruppi F-OVX rispetto ai F-OVX-E). Al contrario, l’ovariectomia provoca una diminuzione (P<0,05) dei livelli di mRNA di ERα solo negli animali AL e F. Il digiuno down-regola (P<0,05) l’espressione dell’mRNA di GnRH-R nelle coniglie intatte (Figura 28, B). Il trattamento con gli estrogeni provoca un simile effetto, ma solo negli F. Al contrario, l’ovariectomia down-regola (P<0,05) l’mRNA di GnRH-R solo nel gruppo AL. Il trattamento con gli estrogeni (P<0,05) aumenta l’espressione dell’mRNA di GnRH-R nelle coniglie F-OVX. L’espressione genica dell’mRNA di FSH (Figura 28, C) non è modificata dal digiuno ma è down-regolata dal trattamento con gli estrogeni solo nelle coniglie F (P<0,05). Al contrario, l’ovariectomia up-regola l’espressione dell’mRNA di FSH sia negli AL che nei F (P<0,05), ma il trattamento con gli estrogeni provoca una down-regolazione solo nelle coniglie AL-OVX. L’abbondanza relativa dell’mRNA di CB1 rimane più o meno agli stessi livelli negli animali intatti, sia alimentati che a digiuno,ma diminuisce (P<0,05) notevolmente nelle coniglie tenute a digiuno e trattate con gli estrogeni (gruppo F-E) (Figura 29). Nelle coniglie OVX, indipendentemente dal digiuno e dal trattamento con gli estrogeni i livelli di mRNA di CB1 non variano (Figura 29). 145 1.0 Aa Intact OVX ERα /18 S ratio Arbitrary units 0.8 0.6 b b b b b 0.4 0.2 b c 0.0 GnRH-R/18 S ratio Arbitrary units 1.0 B Intact OVX 0.8 0.6 a a a a 0.4 b b b 0.2 c 0.0 FSH-β /18 S ratio Arbitrary units 1.5 C Intact OVX b 1.0 b b a a a 0.5 a c 0.0 AL AL-E F F-E Figura: 28(a). Abbondanza relativa dell’mRNA di ERα (A), del GnRH-R (B) e di FSH (C) nell’ipofisi di coniglio Per ogni gruppo sperimentale, il valore (media±SD) deriva da analisi densitometrica di ERα, GnRH-R e di FSH, riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del 18S. Per ogni gruppo sperimentale, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente diverso (P<0,05). AL: alimentate ad libitum; AL-E: alimentate e trattate con estrogeni; AL-OVX: alimentate e ovariectomizzate; AL-OVX-E: alimentate, ovariectomizzate e trattate con estrogeni; F: tenute a digiuno per 48 ore; F-E: digiuno e trattate con estrogeni; F-OVX: digiuno e ovariectomizzate; F-OVX-E: digiuno, ovariectomizzate e trattate con estrogeni. 146 A 18S 489 bp ERα 147 bp LD PCR- AL ALE ALOV ALOVE F FE FOV FOVE B 18S 489 bp GnRH-R 247 bp LD PCR- AL ALE ALOV ALOVE F FE FOV FOVE C 18S 489 bp FSH 116 bp LD PCR- AL ALE ALOV ALOVE F FE FOV FOVE Figura: 28(b) Tipiche fotografie di un gel d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per ERα (147 bp) e 18S (489 bp) (pannello A), per GnRH-R (247 bp) e 18S (489 bp) (pannello B), e per FSH (116 bp) e 18S (489 bp) (pannello C). LD: indica il marker per la lunghezza del DNA, PCR-: indica il controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono ai gruppi sperimentali. AL: alimentate ad libitum; ALE:alimentate e trattate con estrogeni; AL-OVX: alimentate e ovariectomizzate; AL-OVX-E : alimentate, ovariectomizzate e trattate con estrogeni; F: tenute a digiuno per 48 ore; F-E: digiuno e trattate con estrogeni; F-OVX: digiuno e ovariectomizzate; F-OVX-E: digiuno, ovariectomizzate e trattate con estrogeni. 147 A 18S 489 bp CB1 148 bp LD PCR- AL ALE ALOV ALOVE F FE FOV FOVE B CB1 mRNA levels in rabbit pituitaries CB1/18 S ratio Arbitrary units 1.0 0.8 a a a a a a 0.6 a b 0.4 0.2 0.0 AL E V E AL LO OV A AL F FE V E FO FOV Figura: 29. Abbondanza relativa dell’mRNA di CB1 nell’ipofisi di coniglio. Il pannello A mostra una tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per CB1 (148 bp) e 18S (489 bp). LD: indica il marker per la lunghezza del DNA, PCR-: indica il controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono ai gruppi sperimentali. Per ogni gruppo sperimentale, il valore (media±SD) deriva da analisi densitometrica di CB1, riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del 18S. Per ogni gruppo sperimentale, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente diverso (P<0,05). AL: alimentate ad libitum; ALE:alimentate e trattate con estrogeni; AL-OVX: alimentate e ovariectomizzate; AL-OVX-E : alimentate, ovariectomizzate e trattate con estrogeni; F: tenute a digiuno per 48 ore; F-E: digiuno e trattate con estrogeni; F-OVX: digiuno e ovariectomizzate; F-OVX-E: digiuno, ovariectomizzate e trattate con estrogeni. 148 Espressione genica ipotalamica di ERα e di CB1 Nelle coniglie intatte, la relativa abbondanza dell’mRNA, ipotalamico, di ERα non è influenzata dal digiuno, ma il trattamento con gli estrogeni down-regola (P<0,05) la sua espressione negli animali alimentati (Figura 30). Nelle coniglie OVX, sia AL che F, i livelli di mRNA di ERα sono più bassi (P<0,05) rispetto agli animali intatti, sia alimentati che a digiuno (Figura 30). La somministrazione di estrogeni ai gruppi AL-OVX-E e F-OVX-E aumenta (P<0,05) l’espressione genica dell’mRNA di ERα. Tuttavia il trattamento con gli estrogeni negli F-OVX ripristina i livelli dei trascritti ipotalamici dell’mRNA dell’ERα rilevati nelle coniglie intatte. Nelle coniglie intatte e a digiuno, il trattamento con gli estrogeni down-regola l’espressione dell’mRNA di ERα nell’ipotalamo (Figura 30). L’ovariectomia riduce i livelli dei trascritti di ERα nelle coniglie a digiuno e OVX, mentre, il trattamento con gli estrogeni provoca,in queste coniglie, un aumento dell’espressione,che,comunque,non ritorna ai livelli riscontrati nelle coniglie intatte tenute a digiuno. Nelle coniglie alimentate intatte l’espressione dei trascritti ipotalamici di CB1 rimangono all’incirca agli stessi livelli,indipendentemente dal trattamento con gli estrogeni (Figura 31). Nelle AL-OVX i trascritti di mRNA di CB1 diminuiscono (P<0,05) visibilmente comparati con i controlli. La quantità dei trascritti ipotalamici di CB1 non subisce modificazioni significative sia negli animali intatti che OVX tenuti a digiuno. Indipendentemente dallo stato nutrizionale e dalla presenza o meno delle ovaie, il trattamento con gli estrogeni non modifica l’espressione dei trascritti di mRNA ipotalamici di CB1. 149 A 18S 489 bp ERα 147 bp LD PCR- AL ALE ALOV ALOVE F FE FOV FOVE B ERα mRNA levels in the hypothalamus of rabbits ERα /18 S ratio Arbitrary units 1.0 0.8 0.6 0.4 a a a b 0.2 a b a b 0.0 AL E V E AL LO OV A AL F FE V E FO FOV Figura: 30. Abbondanza relativa dell’mRNA di ERα nell’ipotalamo di coniglio. Il pannello A mostra una tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per ERα (147 bp) e 18S (489 bp). LD: indica il marker per la lunghezza del DNA, PCR-: indica il controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono ai gruppi sperimentali. Per ogni gruppo sperimentale, il valore (media±SD) deriva da analisi densitometrica di ERα, riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del 18S. Per ogni gruppo sperimentale, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente diverso (P<0,05). AL: alimentate ad libitum; ALE:alimentate e trattate con estrogeni; AL-OVX: alimentate e ovariectomizzate; AL-OVX-E : alimentate, ovariectomizzate e trattate con estrogeni; F: tenute a digiuno per 48 ore; F-E: digiuno e trattate con estrogeni; F-OVX: digiuno e ovariectomizzate; F-OVX-E: digiuno, ovariectomizzate e trattate con estrogeni. 150 A 18S 489 bp CB1 148 bp LD PCR- AL ALE ALOV ALOVE F FE FOV FOVE B CB1 mRNA levels in the hypothalamus of rabbits 1.0 CB1/18 S ratio Arbitrary units a 0.8 a a a 0.6 a a a b 0.4 0.2 0.0 AL E V E AL LO OV A AL F FE V E FO FOV Figura: 31. Abbondanza relativa dell’mRNA di CB1 nell’ipotalamo di coniglio. Il pannello A mostra una tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per CB1 (148 bp) e 18S (489 bp). LD: indica il marker per la lunghezza del DNA, PCR-: indica il controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono ai gruppi sperimentali. Per ogni gruppo sperimentale, il valore (media±SD) deriva da analisi densitometrica di CB1, riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del 18S. Per ogni gruppo sperimentale, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente diverso (P<0,05). AL: alimentate ad libitum; ALE:alimentate e trattate con estrogeni; AL-OVX: alimentate e ovariectomizzate; AL-OVX-E : alimentate, ovariectomizzate e trattate con estrogeni; F: tenute a digiuno per 48 ore; F-E: digiuno e trattate con estrogeni; F-OVX: digiuno e ovariectomizzate; F-OVX-E: digiuno, ovariectomizzate e trattate con estrogeni. 151 Profilo ormonale dell’LH Le 48 ore di digiuno non modificano la concentrazione plasmatica di LH prima della somministrazione del GnRH, che rimane bassa e confrontabile con i controlli alimentati sia intatti che ovariectomizzati (Figura 32, A e B). La concentrazione massima del picco di LH è osservata 30 minuti dopo la somministrazione del GnRH, sia nelle coniglie alimentate che a digiuno, e sia negli animali intatti che OVX, indipendentemente dal trattamento con gli estrogeni (Figura 32, A e B). Il più alto rilascio di LH viene osservato nelle coniglie a digiuno trattate con gli estrogeni (Figura 32, A), mentre il più basso rilascio si verifica nelle coniglie a digiuno (Figura 32, A). Nelle coniglie OVX, l’entità del rilascio di LH è praticamente lo stesso nei 4 gruppi sperimentale (Figura 32, B), inoltre né il digiuno e né il trattamento con gli estrogeni modificano la risposta dell’LH alla somministrazione dell’GnRH (Figura 32, B). In tutti i gruppi sperimentali, si registra un declino dei livelli plasmatici di LH 4 ore dopo l’iniezione del GnRH, fino a raggiungere concentrazioni prossime ai valori basali (Figura 32, A e B). 152 50 45 A GnRH AL AL-E F F-E 40 LH (ng/ml) 35 30 25 20 15 10 5 0 -180 -150 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 Minutes from GnRH 50 45 B GnRH AL-OVX AL-OVX-E F-OVX F-OVX-E 40 LH (ng/ml) 35 30 25 20 15 10 5 0 -180 -150 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 Minutes from GnRH Figura: 32. Concentrazione plasmatica di LH in coniglie intatte (pannello A) e ovariectomizzate (OVX, pannello B) alimentate ad libitum (AL), a digiuno per 48 ore (F) e sia in coniglie alimentate (AL-E) e a digiuno (F-E) trattate con il 17β-estradiolo (E,90 mg in un tubicino di silicone, Silastic, impiantati sotto cute il giorno prima dell’esperimento), durante le 3 ore prima e durante 4 ore dopo la somministrazione del GnRH (freccia, tempo 0) e dopo la ripresa dell’alimentazione negli animali che erano stati tenuti a digiuno per 48 ore. Ogni punto rappresenta la media ± SEM (SEM: errore standard della media) di tre valori. 153 Discussione La privazione di cibo conduce all’infertilità in molte femmine di mammifero [Schneider e Wade, 1990; Bronson e Marsteller,1985], e induce cambiamenti fisiologici a vari livelli dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi. I nostri risultati indicano che due giorni di digiuno, oltre che provocare una riduzione del 5% del peso corporeo delle coniglie, determinano specifici effetti sull’espressione genica ipofisaria di ERα, GnRH-R e FSH-β. In un recente studio, condotto nei nostri laboratori, era stato proposto che il 17β-estradiolo svolgesse un ruolo chiave nel mantenimento delle funzionalità dell’asse ipotalamico-ipofisario, rendendolo capace di rispondere appropriatamente alla somministrazione esogena del GnRH [Brecchia et al.,2006]. Questa ipotesi si basava sull’osservazione che coniglie tenute a digiuno per 48 ore, presentavano una bassa concentrazione plasmatica di estrogeni, e una marcata riduzione della secrezione di LH con più basse frequenze di pulsazione, in risposta al GnRH, rispetto alle coniglie controllo alimentate ad libitum. I dati, ottenuti da questo studio, sono in accordo con i precedenti, indicando un maggior ruolo degli estrogeni nell’aumentare il rilascio di LH, indotto dal GnRH. Tuttavia, l’aumento della secrezione di LH, rilevato nelle coniglie F-E, in risposta alla somministrazione del GnRH, non è dovuto all’aumento dell’espressione genica del GnRH-R, poiché la relativa abbondanza dell’mRNA di GnRH-R viene down-regolata dal digiuno in se. Inoltre il trattamento con gli estrogeni non provoca l’aumento del picco ovulatorio nelle coniglie controllo alimentate ad libitum, sebbene il gene per il suo recettore sia down-regolato (AL-E). Mentre, nelle coniglie OVX-E, sia alimentate che a digiuno, non si verifica una modificazione del rilascio del LH, indotto dal GnRH, e l’andamento della secrezione uguaglia, perfettamente, quello che si rileva nelle coniglie controllo (AL). Questi risultati indicano l’esistenza di complicate interazioni a feedback tra lo stato nutrizionale e gli ormoni ovarici, incluso il 17β-estradiolo. Nell’ipofisi, l’abbondanza relativa dell’mRNA di ERα è down-regolata nelle coniglie a digiuno rispetto alle coniglie alimentate, ma questo effetto non è evidenziato nelle coniglie OVX. Questi dati, insieme ai bassi livelli circolanti di 17β-estradiolo descritti, nello stesso modello animale, da Brecchia e collaboratori [Brecchia et al., 2006], potrebbero in parte spiegare la riduzione della recettività sessuale, indotta dal digiuno, ed anche la riduzione del profilo di secrezione di LH, indotto dal GnRH. Gli effetti fisiologici degli estrogeni sul sistema neuroendocrino, includono una diretta azione sui neuroni ipotalamici e 154 sulle cellule dell’ipofisi, e un’azione indiretta attraverso le cellule della glia ed endoteliali [McEwen,1999], e questo provoca un’alterazione di sintesi e della secrezione di quasi tutti gli ormoni ipofisari, compresi quelli che sono correlati con la riproduzione, tra cui LH, l’FSH e la prolattina [Fink,1988; Maurer et al.,1990; Gharib et al.,1990]. Perciò la down-regolazione di ERα nell’ipofisi, dei conigli tenuti a digiuno, potrebbe suggerire un legame fisiologico diretto, mediato dagli estrogeni, tra l’attività delle gonadotropine ipofisarie e l’effettivo stato dei follicoli nell’ovaio. Nei conigli, tuttavia, l’apparato neuronale che genera gli impulsi di LH non è sensibile al feedback positivo degli estrogeni, mentre le specie ad ovulazione spontanea ne sono sensibili [Dufy Barbe et al.,1978; Kauffman e Rissman,2006]. Il recettore ERα è espresso anche nei neuroni GnRH nell’ipotalamo, dove media gli effetti sia positivi che negativi degli estrogeni, sulla sintesi e sul rilascio del GnRH, ed è stato visto che il recettore degli estrogeni di tipo α è il principale recettore che media gli effetti soppressivi sulla funzione neuronale del GnRH [Hu et al.,2008]. I nostri dati rilevano che i livelli di espressione dell’mRNA di ERα nell’ipotalamo sono più bassi rispetto a quelli trovati nell’ipofisi, e si assiste a cambiamenti dinamici in tutti i gruppi sperimentali. Tuttavia, variazioni significative sono presenti, solamente, nei gruppi AL-E, AL-OVX e F-OVX, in cui si ha una down-regolazione di ERα. Questi risultati indicano che, nell’ipotalamo la riduzione della secrezione degli estrogeni, provocata dall’ovariectomia, induce una diminuzione dell’espressione genica di ERα, mentre nell’ipofisi l’OVX sembra non avere effetti sull’espressione del recettore. Il sistema neurosecretorio di GnRH risponde ad una varietà di segnali neuromodulatori correlati agli stimoli interni e ambientali che sono collegati a molti recettori sensoriali e olfattivi [Sawyer et al., 1974]. Tuttavia, il trattamento con gli estrogeni non neutralizza gli effetti negativi del digiuno, ma aumenta la down-regolazione della trascrizione di ERα, nell'ipofisi, provocata dalla privazione di cibo. Questi risultati suggeriscono che lo stato nutrizionale delle coniglie interagisce con gli ormoni steroidei ovarici, attraverso complesse interazioni che vanno oltre a quelle relative al 17β-estradiolo. L’espressione del mRNA di GnRH-R, nell’adenoipofisi, viene regolato in maniera diversa dal digiuno e dalla presenza o dall’assenza degli estrogeni. Le coniglie a digiuno presentano un’abbondanza relativa di mRNA di GnRH-R più bassa rispetto a quella che si riscontra nelle coniglie alimentate. La riduzione della secrezione del LH, dipendente dal GnRH, nelle coniglie tenute a digiuno, potrebbe essere una conseguenza dell’inibizione del rilascio del GnRH 155 endogeno, dovuto all’aumento dell’azione del feedback negativo degli estrogeni in molte regioni cerebrali, come trovato nelle femmine di ratto [Nagatami et al.,1996], e alla diminuzione dell’espressione del GnRH-R nelle cellule gonadotrope dell’ipofisi. Questa ipotesi è indirettamente supportata da Carlson e Perrin [Carlson e Perrin,1979], che osservarono una diminuzione della reattività dell’ipofisi di coniglie ovariectomizzate e trattate con GnRH, e Rodriguez et al.,[Rodriguez et al.,1998] osservarono che l’aumento dei livelli plasmatici di LH dopo la somministrazione del GnRH, era correlato con recettività sessuale e quindi, con i livelli di estrogeni circolanti. Nel nostro modello troviamo una correlazione tra i livelli di espressione genica del GnRH-R e la secrezione di LH, indotta dal GnRH. Infatti, il digiuno down-regola l’espressione del mRNA del GnRH-R nelle coniglie intatte, ma non nelle OVX. Inoltre l’ampiezza del rilascio di LH, indotto dal GnRH, è più bassa nelle coniglie a digiuno rispetto a quelle alimentate, mentre negli animali OVX i profili di secrezione dell’LH sono sovrapponibili. Questi dati suggeriscono che tra i molti segnali che convergono verso l’ipofisi, che è responsabile della secrezione delle gonadotropine, quelli che riguardano il bilancio energetico svolgono un ruolo centrale. Negli ovini, la privazione di cibo provoca una diminuzione della concentrazione di LH e dell’espressione genica del recettore per il GnRH, nell’ipofisi [Beckett et al.,1997]. In questa specie, durante una prolungata perdita di peso, l’azione del feedback negativo del 17β-estradiolo sulla frequenza di pulsazione del LH è notevolmente aumentata [Beckett et al.,1997]. Il digiuno non influenza l’espressione genica di FSH-β nelle coniglie intatte. Indipendentemente dallo stato nutrizionale, l’ovariectomia aumenta l’espressione dei trascritti per FSH-β. Il trattamento con gli estrogeni provoca degli effetti diversi secondo lo stato nutrizionale e la presenza o l’assenza del feedback ovarico. Sono stati trovati bassi livelli di mRNA per FSH-β, ERα e GnRH-R nelle ipofisi delle coniglie a digiuno e trattate con gli estrogeni, mentre nei corrispondenti gruppi OVX, il trattamento con gli estrogeni provoca effetti sull’espressione del GnRH-R, ma nessuno sull’espressione dell’ERα, nell'ipofisi. Molti studi sul sistema degli endocannabinoidi hanno focalizzato la loro attenzione sugli effetti dei cannabinoidi endogeni (2-AG: arachidonoil glicerolo e anandamide) ed esogeni (∆9-THC: ∆9-tetraidrocannabinolo) sulla regolazione neuroendocrina dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi e sull’assunzione di cibo. Tuttavia, la maggior parte di questi esperimenti sono stati effettuati sui ratti. Recenti studi [Gonzàlez et al.,2000], suggeriscono che gli endocannabinoidi 156 possono influenzare la secrezione ormonale e il comportamento sessuale agendo direttamente sul loro recettore CB1 [Stella, 2001]. Tutti o quasi, gli studi presenti in somministrazione letteratura, degli però, hanno endocannabinoidi o analizzato dei gli effetti cannabinoidi della esogeni sull’espressione di CB1, o come questa somministrazione possa influire sulla regolazione neuroendocrina sia a livello ipofisario che ipotalamico. Nel nostro studio, invece noi abbiamo posto la nostra attenzione sugli effetti del digiuno, dell’ovariectomia e del trattamento con gli estrogeni, sull’espressione genica del recettore per i cannabinoidi sia nell’ipofisi e sia nell’ipotalamo. Nel nostro modello sperimentale l’espressione genica di CB1 nell’ipofisi risulta down-regolata soltanto dalla privazione di cibo e dal trattamento con gli estrogeni (coniglie F-E), mentre non subisce significative modificazioni negli altri gruppi sperimentali. Ciò è in accordo con i risultati di precedenti studi, che hanno mostrato come l’espressione genica ipofisaria di CB1 sia influenzata dagli steroidi sessuali [Genazzani et al., 1997], e che nell’adenoipofisi di femmine di ratto, gli estrogeni down-regolano l’espressione genica di CB1 [Gonzàlez et al.,2000]. Nei nuclei ipotalamici c’è una minore densità dei recettori per i cannabinoidi rispetto ad altre regioni del cervello, ma i livelli di CB1 sono comunque alti rispetto a quelli di altri recettori accoppiati alle proteine G, nell’ipotalamo [Harkenham et al., 1991; Breinvogel et al.,1997]. I nostri dati indicano che l’espressione di CB1 nell’ipotalamo è down-regolata dall’ovariectomia ma solo nelle coniglie alimentate. 157 Conclusioni I nostri dati suggeriscono che la privazione di cibo è in grado di alterare la secrezione delle gonadotropine ipofisarie andando ad agire direttamente sull’espressione genica del recettore per il GnRH-R nell’ipofisi. La riduzione dei trascritti per il GnRH-R potrebbe ridurre l’efficienza della risposta dell’adenoiposi agli impulsi ipotalamici del GnRH, riducendo in questo modo la secrezione delle gonadotropine ipofisarie, influendo direttamente sulla funzionalità ovarica. Però il digiuno produce effetti diversi sull’espressione dei geni presi in considerazione in questo studio, anche tra i vari gruppi sperimentali, indicando l’esistenza di complicate vie di segnalazione tra i centri che rispondono ad una variazione dello stato nutrizionale e quelli che regolano la funzionalità ovarica. Tuttavia ulteriori studi sono necessari per comprendere meglio queste complicate interazioni, e anche per comprendere meglio il ruolo degli estrogeni circolanti sulla regolazione ipotalamica dei neuroni GnRH. 158 Ringraziamenti Giunta alla fine del mio dottorato di ricerca colgo l’occasione per ringraziare tutti coloro che mi hanno aiutato e supportato durante questi tre anni. Un ringraziamento speciale va al professore Boiti che mi ha seguito assiduamente e pazientemente nell’attività scientifica. Ringrazio la dottoressa Margherita Maranesi per la sua disponibilità, oltre che a livello personale, anche nel condividere con me le sue conoscenze scientifiche, e la ringrazio soprattutto per il suo contributo a questo lavoro di tesi. Ringrazio il dottore Gabriele Brecchia, il dottor Massimo Zerani e la dottoressa Cecilia dall’Aglio per aver contribuito alla mia formazione scientifica e al lavoro di tesi. Ringrazio la mia famiglia: mamma Rosanna,zio Mario e mia sorella Laura per essermi stati sempre vicini e per avermi supportato (e spesso anche sopportato) in questi anni. Ringrazio Giada, Alessandra e Daniele per essermi stati sempre vicini, e per non essersi ancora stancati di sopportarmi. In fine, un pensiero speciale va al mio “papino”, che è sempre con me. 159 Bibliografia Abdel-Latif AA. 1986 Calcium Mobilization Receptors, Polyphosphoinositides, And The Generation Of Second Messengers. Pharmacol. Rev. 39: 227–272. Abraham IM, Han S-K, Todman MG, Korach KS, Herbison AE. 2003 Estrogen receptor h mediates rapid estrogen actions on gonadotropin-releasing hormone neurons in vivo. J. Neurosci. 23:5771– 7. Abramovitz MY, Boie, Nguyen T, Rushmore TH, Bayne MA, Metters KM, Slipetz TM and Grygorczyk R. 1994 Cloning And Expression Of A Cdna For The Humanoid FP Receptor. J. Biol. Chem. 269: 1356–1360. Adams EC and Hertig AT. 1969 Studies on the corpus luteum. I. Observation on the ultrastructure of development and regression of the luteal cells during the menstrual cycle. J. Cell Biol. 41:696–715. Adashi EY. 1990 The potential relevance of cytokines to ovarian physiology: the emerging role of resident ovarian cells of the white blood cell series. Endocrin. Rev.11(3):454-464. Agudo SPL, Zahler WL and Smith MF. 1984 Effects of prostaglandins F2α on the adenylate cyclase and phosphodiesterase activity of ovine corpora lutea. J. Anim. Sci. 58: 955–962. Ahima RS, Dushay J, Flier SN, Prabakaran D, Flier JS. 1997 Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. J. Clin. Invest. 99:391– 5. Ahima RS, Kelly J, Elmquist JK, Flier JS. 1999 Distinct physiologic and neuronal responses to decreased leptin and mild hyperleptinemia. Endocrinology. 140:4923– 31. Ahima RS, Prabakaran D, Mantzoros C, Qu D, Lowell B, Maratos-Flier E, et al. 1996 Role of leptin in the neuroendocrine response to fasting. Nature. 382:250– 2. Alger BE. 2002 Retrograde Signaling In The Regulation Of Synaptic Transmission: Focus On Endocannabinoids. Prog. Neurobiol. 68:247–286. Alila HW, Corradino RA and Hansel W. 1988 A Comparison Of The Effects Of Cyclooxygenase Prostanoids On Progesterone Production By Small And Large Bovine Luteal Cells. Prostaglandins. 36:259–270. Alila HW., Dowd JP, Corradino RA, Harris WV and Hansel W. 1988 Control Of Progesterone Production In Small And Large Bovine Luteal Cells Separated By Flow Cytometry. J. Reprod. Fertil. 82: 645–655. Ammar AA, Sederholm F, Saito TR, Scheurink AJW, Johnson AE, Sodersten P. 2000 NPY-Leptin: Opposing Effects On Appetitive And Consummatory Ingestive Behavior And Sexual Behavior. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 278:R1627–33. Anderson LL, Neol FC and Melampy RM. 1961. Hysterectomy And Ovarian Function In Beef Heifers. Am. J. Vet. Res. 23: 794–802. 160 Anderson LL, Rathmacher RP and Melampy RM. 1966 The Uterus And Unilateral Regression Of Corpora Lutea In The Pig. Am. J. Physiol. 210: 611–614. Anderson RA, Baird DT. 2002 Male contraception. Endocr. Rev. 23:735–762. Arends MJ, Morris RG and Wyllie AH. 1990 Apoptosis—the role of the endonuclease. Am. J. Pathol. 136:593–608. Arias P, Rodriguez M, Szwarcfarb B, Sinay IR, Moguilevsky JA. 1992 Effect of insulin on LHRH release by perfused hypothalamic fragments. Neuroendocrinology. 56:415–8. Armstrong JD, Britt JH. 1987 Nutritionally-Induced Anestrus In Gilts: Metabolic And Endocrine Changes Associated With Cessation And Resumption Of Estrous Cycles. J. Anim. Sci.65:508–23. Asch RH, Smith CG, Siler-Khodr TM, Pauerstein CJ. 1981 Effects Of ∆9Tetrahydrocannabinol During The Follicular Phase Of The Rhesus Monkey (Macaca mulatta). J. Clin. Endocrinol. Metab. 52:50–55. Astwood EB. 1941.The Regulation Of Corpus Luteum Function By Hypophysial Luteotrophin. Endocrinology. 28: 309–320. Attardi B and Happe HK. 1986 Modulation Of The Estradiol-Induced Luteinizing Hormone Surge By Progesterone Or Antiestrogens: Effects On Pituitary Gonadotropin-Releasing Hormone Receptors. Endocrinology. 119:274–283. Attardi B, Klatt B, Hoffman GE and Smith MS. 1997 Facilitation Or Inhibition Of The Estradiol-Induced Gonadotropin Surge In The Immature Rat By Progesterone: Regulation Of Gnrh And LH Messenger Rnas And Activation Of Gnrh Neurons. J. Neuroendocrinol. 9:589–599. Auletta FJ and Flint APF. 1988. Mechanisms Controlling Corpus Luteum Function In Sheep, Cows, Non-Human Primates, And Women, Especially In Relation To The Time Of Luteolysis. Endocr. Rev. 9: 88–105. Azad SC, Monory K, Marsicano G, Cravatt BF, Lutz B, Zieglgansberger W, Rammes G. 2004 Circuitry For Associative Plasticity In The Amygdala Involves Endocannabinoid Signaling. J. Neurosci. 24: 9953–9961. Azmi TI and O’Shea JD. 1984 Mechanism Of Deletion Of Endothelial Cells During Regression Of The Corpus Luteum. Lab. Invest. 51:206–217. Baba Y, Matsuo H, Schally AV. 1971 Structure of the porcine LH and FSH-releasing hormone. II. Confirmation of the proposed structure by conventional sequential analyses. Biochem. Biophys. Res.Commun. 44:459–463. Bacci A, Huguenard JR, Prince DA. 2004 Long-Lasting Self-Inhibition Of Neocortical Interneurons Mediated By Endocannabinoids. Nature. 431:312–316. Bacci ML, Barazzoni AM, Forni M and Lalatta Costerbosa G. 1996 In situ detection of apoptosis in regressing corpus luteum of pregnant sow: evidence of an early presence of DNA fragmentation. Domest. Anim. Endocrinol. 13:361–372. Baffy G, Miyashita T, Williamson JR and Reed JC. 1993 Apoptosis induced withdrawal of interleukin-1 (IL-3) from an IL-3 dependent hematopoetic cell line 161 is associated with repartitioning of intracellular calcium and is blocked by enforced Bcl-2 oncoprotein production. J. Biol. Chem. 268:6511–6519. Bagavandoss P, Wiggins RC, Kunkel SL, Remick DG, Keyes PL. 1990 Tumor necrosis factor production and accumulation of inflammatory cells in the corpus luteum of pseudopregnancy and pregnancy in rabbits. Biol. Reprod. 42 (2):367376. Bai Y, Zhang S, Kim K-S, Lee J-K, Kim K-H. 1996 Leptin Inhibits Acetyl Coa Carboxylase In 313 Pre-Adipocytes. J. Biol. Chem. 271:13939–42. Ban E, Arias MC, Latouche J, Leblanc P, Heurtier JF, Drieu K, Fillion G, Haour F. 1990 GnRH receptors in rat brain, pituitary and testis: modulation following surgical and gonadotropin-releasing hormone agonist-induced castration. Mol. Cell. Endocrinol. 70:99-107. Bao B and Garverick HA. 1998 Expression Of Steroidogenic Enzyme And Gonadotropin Receptor Genes In Bovine Follicles During Ovarian Follicular Waves: A Review. J. Anim. Sci. 76: 1903–1921. Barash IA, Cheung CC, Weigle DS, Ren H, Kabigting EB, Kuijper JL, et al. 1996 Leptin Is A Metabolic Signal To The Reproductive System. Endocrinology. 137:3144 –7. Barbieri RL. 1992 Clinical applications of GnRH and its analogues. Trends Endocrinol. Metab. 3:30–34. Barkan AL, Regiani SR, Duncan JA, Marshall JC. 1983 Pituitary gonadotropinreleasing hormone receptors during gonadotropin surges in ovariectomizedestradiol-treated rats. Endocrinology. 112:1042-1048. Bartness TJ. 1997 Food Hoarding Is Increased By Pregnancy, Lactation and Food Deprivation In Siberian Hamsters. Am. J. Physiol. 272:118– 25. Baskin DG, Figlewicz DP,Woods SC, Porte Jr D, Dorsa DM. 1987 Insulin In The Brain. Annu. Rev. Physiol. 49:335–47. Batra S. 1986 Effect Of Estrogen And Progesterone Treatment On Calcium Uptake By The Myometrium And Smooth Muscle Of The Lower Urinary Tract. Eur. J. Pharmacol. 127:37–42. Bauer-Dantoin AC, Hollenberg AN, Jameson JL. 1993 Dynamic regulation of gonadotropin-releasing hormone receptor mRNA levels in the anterior pituitary gland during the rat estrous cycle. Endocrinology. 133:1911-1914. Bauer-Dantoin AC, Weiss J and Jameson JL. 1995 Roles Of Estrogen, Progesterone, And Gonadotropin-Releasing Hormone (Gnrh) In The Control Of Pituitary Gnrh Receptor Gene Expression At The Time Of The Preovulatory Gonadotropin Surges. Endocrinology. 136: 1014–1019. Beak SA, Heath MM, Small CJ, Morgan DG, Ghateim MA, TaylorAD, et al. 1998 Glucagon-Like Peptide-1 Stimulates Luteinizing Hormonereleasing Hormone Secretion In A Rodent Hypothalamic Neuronal Cell Line. J. Clin. Invest. 101:1334– 41. Beato M, Chalepakis G, Schauer M, Slater EP. 1989 DNA regulatory elements for steroid hormones. J. Steroid. Biochem. 32(5):737-47. 162 Beckett JL, Sakurai H, Adams BM, Adams TE. 1997 Negative feedback potency of estradiol is increased in orchidectomized sheep during chronic nutrient deficiency. Biol. Reprod. 57:408-14. Beekman JM, Allan GF, Tsai SY, Tsai MJ, O'Malley BW. 1993 Transcriptional activation by the estrogen receptor requires a conformational change in the ligand binding domain. Mol. Endocrinol. (10):1266-74. Begg M, Pacher P, Batkai S, Osei-Hyiaman D, Offertaler L, Mo FM, Liu J, Kunos G. 2005 Evidence For Novel Cannabinoid Receptors. Pharmacol. Ther. 106:133– 145. Behrman HR, Aften RF, Ireland JJ, Milvae RA. 1989 Characteristics of an antigonadotrophic GnRH-like protein in the ovaries of diverse mammals. J. Reprod. Fertil. Suppl. 37:189-194. Behrman HR, MacDonald GJ and Greep RO. 1971 Regulation Of Ovarian Cholesterol Esters: Evidence For Enzymatic Sites Of Prostaglandin- Induced Loss Of Corpus Luteum Function. Lipids. 6:791. Belfiore CJ, Hawkins DE, Wiltbank MC and Niswender GD. 1994. Regulation Of Cytochrome P-450scc Synthesis And Activity In The Ovine Corpus Luteum. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 51: 283–290. Bennegard B, Hahlin M and Hamberger L. 1990 Luteotropic Effects Of Prostaglandins I2 And D2 On Isolated Human Corpora Luteum. Fertil. Steril. 54: 459–464. Bensaid M, Gary-Bobo M, Esclangon A, Maffrand JP, Le Fur G, Oury-Donat F, Soubrie´ P. 2003 The Cannabinoid CB1 Receptor Antagonist SR141716 Increases Acrp30 Mrna Expression In Adipose Tissue Of Obese Fa/Fa Rats And In Cultured Adipocyte Cells. Mol. Pharmacol. 63:908–914. Berridge MJ and Irvine RF. 1984 Inositol Triphosphate: A Novel Second Messenger In Cellular Signal Transduction. Nature. 312: 315–321. Berry RJ, Peters J. 1975 Macquarie Island House Mice: A Genetical Isolate On A SubAntarctic Island. J. Zool. (Lond.). 176:375–89. Besch NF, Smith CG, Besch PK, Kaufman RH. 1977 The Effect Of Marihuana (∆9Tetrahydrocannabinol) On The Secretion Of Luteinizing Hormone In The Ovariectomized Rhesus Monkey. Am. J. Obstet. Gynecol. 128:635–642. Bifulco M, Di Marzo V. 2002 Targeting The Endocannabinoid System In Cancer Therapy: A Call For Further Research. Nat.Med. 8:547–550. Blalock JE, Costa 0. 1989 Immune neuroendocrine interactions: implications for reproductive physiology. Ann. NY Acad. Sci. 564:261-266. Blum RM, Schneider JE. 2000 Fasting-Induced Anestrus Is Associated Withlow, While Insulin-Induced Anestrus Is Associated With High Plasma Leptin Concentrations. Abstr. – Soc. Neurosci. Boise LH, Gonzalez-Garcia M, Postema CE, Ding L, Lingsten T, Turka LA, Mao X, Nunez G and Thompson CB. 1993 Bcl-x, a bcl-2 related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74: 597–608. 163 Boiti C, Canali C, Zerani M, Gobbetti A. 1998 Changes in refractoriness of rabbit Corpora lutea to a Prostaglandin F2α analogue, alfaprostol, during pseudopregnancy. Prostaglandins. 56(4):255-264. Boiti C, Guelfi G, Zampini D, Brecchia G, Gobbetti A, Zerani M. 2003 Regulation of nitric-oxide synthase isoforms and role of nitric oxide during prostaglandin F2alpha-induced luteolysis in rabbits. Reproduction. 125:807–816. Boiti C, Guelfi G, Zerani M, Zampini D, Brecchia G, Gobbetti A. 2004 Expression patterns of cytokines, p53, and nitric oxide synthase isoenzymes in corpora lutea of pseudopregnant rabbits during spontaneous luteolysis. Reproduction. 127(2):229-238. Boiti C, Maranesi M, Dall'Aglio C, Pascucci L, Brecchia G, Gobbetti A, Zerani M. 2007 Vasoactive peptides in the luteolytic process activated by PGF2alpha in pseudopregnant rabbits at different luteal stages. Biol. Reprod. 77(1):156-164. Boiti C, Zampini D, Zerani M, Guelfi G, Gobbetti A. 2001 Prostaglandin receptors and role of G protein-activated pathways on corpora lutea of pseudopregnant rabbit in vitro. J. Endocrinol. 168:141–151. Boiti C, Zerani M, Zampini D, Gobbetti A. 2000 Nitric oxide synthase activity and progesterone release by isolated corpora lutea of rabbits in early- and mid-luteal phase of pseudopregnancy are differently modulated by prostaglandin E-2 and prostaglandin F-2α via adenylate cyclase and phospholipase. C. J. Endocrinol. 164(2):179-186. Boland MP, Lonergan P, O'Callaghan D. 2001 Effect of nutrition on endocrine parameters, ovarian physiology, and oocyte and embryo development. Theriogenology.55(6):1323-40. Bottari SP, Vokaer A, Kaivez E, Lescrainer JP and Vauquelin GP. 1983 Differential Regulation Of Alpha-Adrenergic Receptor Subclasses By Gonadal Steroids In Human Myometrium. J. Clin. Endocrinol. Metab. 57:937–941. Braden TD, Gamboni F and Niswender GD. 1988 Effects Of Prostaglandin F2aInduced Luteolysis On The Populations Of Cells In The Ovine Corpus Luteum. Biol. Reprod. 39: 245–253. Bradshaw HB, Walker JM. 2005 The Expanding Field Of Cannabimimetic And Related Lipid Mediators. Br. J. Pharmacol. 144:459–465. Brann DW and Mahesh VB. 1991 Detailed Examination Of The Mechanism And Site Of Action Of Progesterone And Corticosteroids In The Regulation Of Gonadotropin Secretion: Hypothalamic Gonadotropin- Releasing Hormone And Catecholamine Involvement. Biol. Reprod. 44:1005–1015. Brann DW, McDonald JK, Putnam CD and Mahesh VB. 1991 Regulation Of Hypothalamic Gonadotropin-Releasing Concentrations By Progesterone And Hormone And Corticosteroids In Neuropeptide Immature Y Rats: Correlation With Luteinizing Hormone And Follicle-Stimulating Hormone Release. Neuroendocrinology. 54:425–432. 164 Brann DW, O’Conner JL, Wade MF, Zamorano PL and Mahesh VB. 1993 Regulation Of Anterior Pituitary Gonadotropin Subunit Mrna Levels During The Preovulatory Gonadotropin Surge: A Physiological Role Of Progesterone In Regulating LH-Beta And FSH-Beta Mrna Levels. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 46:427–437. Brännstrom M and Norman RJ. 1993 Involvement of leukocytes and cytokines in the ovulatory process and corpus luteum function. Hum. Reprod. 8:1762–1775. Bréard E, Delarue B, Benhaïm A, Féral C, Leymarie P. 1998 Inhibition by gonadotropins of interleukin-1 production by rabbit granulosa and theca cells: effects on gonadotropin-induced progesterone production. Eur. J. Endocrinol. (3);138:328-336. Brecchia G, Bonanno A, Galeati G, Federici C, Maranesi M, Gobbetti A, Zerani M, Boiti C. 2006 Hormonal and metabolic adaptation to fasting: effects on the hypothalamic-pituitary-ovarian axis and reproductive performance of rabbit does. Domest. Anim. Endocrinol. 31: 105-122. Breinvogel CS, Sim LJ and Childers SR. 1997 Regional differences in cannabinoid receptors/G-protein coupling in rat brain. J. Pharmacol. Expe. Ther. 282:16321642. Breivogel CS, Childers SR. 1998 The Functional Neuroanatomy Of Brain Cannabinoid Receptors. Neurobiol. Dis. 5:417–431. Brenner RM,. Resko JA, and West NB. 1974 Cyclic Changes In Oviductal Morphology And Residual Cytoplasmic Estradiol Binding Capacity Induced By Sequential Estradiol-Progesterone Treatment Of Spayed Rhesus Monkeys. Endocrinology. 95: 1094–1104. Bronson FH, Heideman PD. 1990 Short-Term Hormonal Responses To Food Intake In Peripubertal Female Rats. Am. J. Physiol. 259: R25– 31. Bronson FH, Marsteller FA. 1985 Effect of short-term food deprivation on reproduction in female mice. Biol. Reprod. 33:660–667. Bronson FH. 1986 Food-Restricted, Prepubertal Female Rats: Rapid Recovery Of Luteinizing Hormone Pulsing With Excess Food, And Full Recovery Of Pubertal Development With Gonadotropin-Releasing Hormone. Endocrinology. 118:2483– 7. Bronson FH. 1988 Effect Of Food Manipulation On The Gnrh–LH–Estradiol Axis Of Young Female Rats. Am. J. Physiol. 254:R616–21. Bronson FH. 1989 Mammalian Reproductive Biology. The University of Chicago Press. Chicago, London. Bronson FH. 2000 Puberty And Energy Reserves: A Walk On The Wild Side.In: Wallen K, Schneider JE, Editors. Reproduction In Context: Social And Environmental Influences On Reproduction. MIT Press Cambridge. P. 15– 34. Brown J. 1962 Effects Of 2-Deoxy-D-Glucose On Carbohydrate Metabolism: Review Of The Literature And Studies In The Rat. Metabolism. 11: 1098– 112. Browning JY, Keyes PL, Wolf RC. 1980 Comparison of serum progesterone, 20 alpha-dihydroprogesterone, and estradiol-17 beta in pregnant and 165 pseudopregnant rabbits: evidence for postimplantation recognition of pregnancy. Biol Reprod. 23(5):1014-9. Brunner L, Whitebread S, Leconte I, Stricker-Kongrad A, Cumin F, Chiesi M, et al. 1999 A Peptide Antagonist Reduces Food Intake In Rodents. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 23:43– 469. Bucholtz DC, Vidwans NM, Herbosa CG, Schillo KK, Foster DL. 1996 Metabolic Interfaces Between Growth And Reproduction: V Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion Is Dependent On Glucose Availability. Endocrinology. 137:601–7. Buckley NE, Hansson S, Harta G, Mezey E. 1998 Expression Of The CB1 And CB2 Receptor Messenger Rnas During Embryonic Development In The Rat. Neuroscience. 82:1131–1149. Bulmer D. 1964 The histochemistry of ovarian macrophages in the rat. J. Anat. 98: 313–319. Bussenot I, Azoulay-Barjonet C, Parinaud J. 1993 Modulation of the steroidogenesis of cultured human granulosa–lutein cells by gonadotropinreleasing hormone analogs. J. Clin. Endocrinol. Metab. 76:1376–1379. Butzow R, Huhtainemi I, Clayton R, Wahlstrom T, Andersson LC, Seppala M. 1987 Cultured mammary carcinoma cells contain gonadotropin releasing hormone-like immunoreactivity, GnRH binding sites and chorionic gonadotropin. Int. J. Cancer. 39:498-501. Caffrey JL, Fletcher PW, Diekman MA, O’Callaghan PL and Niswender GD. 1979 The Activity Of Ovine Luteal Cholesterol Esterase During Several Experimental Conditions. Biol. Reprod. 21:601–608. Cagampang FRA, Maeda K-I, Yokoyama A, Ota K. 1990 Effect Of Food Deprivation On The Pulsatile LH Release In The Cycling And Ovariectomized Female Rat. Horm. Metab. Res. 22:269– 72. Calingasan NY, Ritter S. 1993 Lateral Parabrachial Subnucleus Lesions Abolish Feeding Induced By Mercaptoacetate But Not By 2-Deoxy-Dglucose. Am. J. Physiol. 265:R1168– 78. Cameron JL, Nosbisch C. 1991 Suppression Of Pulsatile Luteinizing Hormone And Testosterone Secretion During Short Term Food Restriction In The Adult Male Rhesus Monkey (Macaca Mulatta). Endocrinology. 128:1532– 40. Cameron JL. 1996 Regulation Of Reproductive Function In Primates By Short-Term Changes In Nutrition. Rev. Reprod. 1:117–26. Cameron JL. 1996 Regulation of reproductive hormone secretion in primates by shortterm changes in nutrition. Rev. Reprod. 1:117-126. Carlson JC, Perrin DG. 1979 The effect of LH-RH administration on LH release in the female rabbit. J. Reprod. Fertil. 56:175-80. Carlson JC, Wu XM and Sawanda M. 1993 Oxygen radicals and the control of ovarian corpus luteum function. Free Radical Biol. Med. 14: 78–84. Casper RF, Erickson GF, Yen SS 1984 Studies of the effect of GnRH and its agonist on human luteal steroidogenesis in vitro. Fertil. Steril. 42:39–43. 166 Casper RF. 1991 Clinical uses of gonadotropin-releasing hormone analogues. Can. Med. Assoc. J. 144:153–158. Catt KJ, Chang JP, Stojilkovic SS, Morgan RO, Wynn PC, Tasaka K, Iwashita M. 1988 GnRH receptors and activation of gonadotropin secretion. In: Iizuka R, Semm K (eds) Human Reproduction: Current Status/Future Prospect. Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, pp 37-55. Ceddia RB, William Jr WN, Curi R. 2001 The Response Of Skeletal Muscleto Leptin. Front Biosci. 6:D90– 7. Chamness GC, Jennings AW, McGuire WL. 1974 Estrogen receptor binding to isolated nuclei. A nonsaturable process. Biochemistry. 15;13(2):327-31. Chan V, Clayton RN, Knox G, Catt KJ. 1981 Ontogeny of pituitary GnRH receptors in the rat. Endocrinology. 108:2086-2092. Channing CP. 1969 Steroidogenesis And Morphology Of Human Ovarian Cell Types In Tissue Culture. J. Endocrinol. 45:297–308. Channing CP. 1969 Tissue Culture Of Equine Ovarian Cell Types: Culture Methods And Morphology. J. Endocrinol. 43: 381–390. (A) Chary KV, Srivastava S, Hosur RV, Roy KB, Govil G. 1986 Molecular conformation of gonadoliberin using two-dimensional NMR spectroscopy. Eur. J Biochem. 158:323–332. Chegini N, Lei ZM, Rao CV and Hansel W. 1991 Cellular Distribution And Cycle Phase Dependence Of Gonadotropin And Eicosanoid Binding Sites In Bovine Corpora Lutea. Biol. Reprod. 45:506–513. Chehab F, Lim M, Lu R. 1996 Correction Of The Sterility Defect In Homozygous Obese Female Mice By Treatment With The Human Recombinant Leptin. Nat. Genet. 12:318– 20. Chehab FF, Mounzih K, Lu R, Lim ME. 1997 Early Onset Of Reproductive Function In Normal Female Mice Treated With Leptin. Science. 275:88–90. Cheung CC, Thornton JE, Kuijper JL, Weigle DS, Clifton DK, Steiner RA. 1997 Leptin Is A Metabolic Gate For The Onset Of Puberty In The Female Rat. Endocrinology. 138:855– 8. Chevaleyre V, Castillo PE. 2004 Endocannabinoid-Mediated Metaplasticity In The Hippocampus. Neuron. 43:871–881. Chieffi G, Pierantoni R, Fasano S. 1991 Immunoreactive GnRH in hypothalamic and extrahypothalamic areas. Int. Rev. Cytol. 127:1-55. Child GV.1984 Application of dual pre-embedding stains for gonadotropins to pituitary cell monolayers with avidin-biotin (ABC) and peroxidase-antiperoxidase (PAP) complexes: light rncroscopic studies. Stain. Technol. 58:281-289. Chu S, Fuller PJ. 1997 Identification of a splice variant of the rat estrogen receptor beta gene. Mol. Cell. Endocrinol. 132(1-2):195-9. Clarke IJ, Cummins JT. 1982 The Temporal Relationship Between Gonadotropin Releasing Hormone (Gnrh) And Luteinizing Hormone (LH) Secretion Ovariectomized Ewes. Endocrinology. 111:1737– 9. Clarke IJ, Henry BA. 1999 Leptin And Reproduction. Rev. Reprod. 4:48– 55. In 167 Clarke IJ, Horton RJE, Doughton BW. 1990 Investigation Of The Mechanism By Which Insulin-Induced Hypoglycemia Decreases Luteinizing Hormone Secretion In Ovariectomized Ewes. Endocrinology. 127:1470–6. Clayton RN, Catt KJ. 1981 Gonadotropin-releasing hormone receptors: characterization, physiological regulation, and relationship to reproductive function. Endocr. Rev. 2:186-209. Clayton RN, Catt KJ. 1981 Regulation of pituitary gonadotropin-releasing hormone receptors by gonadal hormones. Endocrinology. 108:887-895. Clayton RN, Catt KJ. 1981 Regulation of pituitary gonadotropinreleasing hormone receptors by gonadal hormones. Endocrinology. 108:887-895. Clayton RN, Channabasavaiah K, Steward JM, Catt KJ. 1982 Hypothalamic regulation of gonadotropin-releasing hormone receptors: effects of hypothalamic lesions and a gonadotrophin-releasing hormone antagonist. Endocrinology. 110:1108-1115. Clayton RN, Eccleston L, Gossard F, Thalbard JC, Morel G. 1992 Rat granulosa cells express the gonadotrophin-releasing hormone gene: evidence from in-situ hybridization histochemistry. J. Mol. Endocrinol. 9:189-195. Clayton RN, Harwood JP, Catt KJ. 1979 Gonadotropin-releasing hormone analogue binds to luteal cells and inhibits progesterone production. Nature. 282:90-92. Clayton RN, Solano AR, Gracia-Vela A, Dufau ML, Catt KT. 1980 Regulation of pituitary receptors for gonadotropin-releasing hormone during the rat estrous cycle. Endocrinology. 107:699-706. Clayton RN. 1988 Mechanism of GnRH action in gonadotrophs. Hum. Reprod. 3:479483. Clayton RN. 1989 Gonadotrophin-releasing hormone: its actions and receptors. J. Endocrinol. 120:11-19. Conklin DC, RixonMW,Kuestner RE, Maurer MF, Whitmore TE, Millar RP. 2000 Cloning and gene expression of a novel human ribonucleoprotein. Biochem. Biophys. Acta 1492:465–469. Conley AJ and Ford SP. 1989 Direct Luteotrophic Effect Of Oestradiol-17 Beta On Pig Corpora Lutea. J. Reprod. Fertil. 87:125–131. Conn PM, Crowley Jr WF. 1991 Gonadotropin-releasing hormone and its analogues. N. Engl. J.Med. 324:93–103. Conn PM, Crowley Jr WF. 1994 Gonadotropin-releasing hormone and its analogs. Annu. Rev. Med 45:391–405. Conn PM, Crowley WFJr. 1994 Gonadotropin-releasing hormone and its analogues. Annu. Rev. Med. 45:391–405. Conn PM, Smith R, Rogers DC. 1981 Stimulation of pituitary gonadotropin release does not require internalization of gonadotropin- releasing hormone. J. Biol. Chem. 256:1098-1100. Conn PM. 1986 The molecular basis of gonadotropin-releasing hormone action. Endocr. Rev. 7:3-10. 168 Cota D, Marsicano G, Tschoep M, Gruebler Y, Flachskamm C, Schubert M, Auer D, Yassouridis A, Thone-Reineke C, Ortmann S, Tomassoni F, Cervino C, Nisoli E, Linthorst AC, Pasquali R, Lutz B, Stalla GK, Pagotto U. 2003 The Endogenous Cannabinoid System Affects Energy Balance Via Central Orexigenic Drive And Peripheral Lipogenesis. J. Clin. Invest. 112:423–431. Cota D, Marsicano G, Tschoep M, Gruebler Y, Flachskamm C, Schubert M, Auer D, Yassouridis A, Thone-Reineke C, Ortmann S, Tomassoni F, Cervino C, Nisoli E, Linthorst AC, Pasquali R, Lutz B, Stalla GK, Pagotto U. 2003 The Endogenous Cannabinoid System Affects Energy Balance Via Central Orexigenic Drive And Peripheral Lipogenesis. J. Clin. Invest. 112:423–431. Cravatt BF, Lichtman AH. 2004 The Endogenous Cannabinoid System And Its Role In Nociceptive Behavior. J. Neurobio.L. 61:149–160. Crews D. 2000 Sexuality: The Environmental Organization Of Phehotypic Plasticity. In: Wallen K, Schneider JE, Editors. Reproduction In Context: Social And Environmental Influences On Reproduction. MIT Press; Cambridge (MA). P. 473– 500. Crivello JF and Jefcoate CR. 1978 Mechanisms Of Corticotrophin Action In Rat Adrenal Cells. I. The Effects Of Inhibitors Of Protein Synthesis And Of Microfilament Formation On Corticosterone Synthesis. Biochim. Biophys. Acta. 542:315–329. Crump AD, Lomax MA, Rodway RG. 1982 Oestradiol-Induced Luteinizing Hormone (LH) Release Is Inhibited By 2-Deoxyglucse Infusion In Sheep. J. Physiol. 330:93P– 4P. Cummings AM, and Yochim JM. 1984 Differentiation Of The Uterus In Preparation For Gestation: A Model For The Action Of Progesterone. J. Theor. Biol. 106:353– 374. Cunningham MJ, Clifton DK, Steiner RA. 1999 Leptin’s Actions On The Reproductive Axis: Perspectives And Mechanisms. Biol. Reprod. 60:216– 22. Currie AJ, Fraser HM, Sharpe RM. 1981 Human placental receptors for luteinizing hormone releasing hormone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 99:332-338. Currie WD, Setoyama T, Lee PS, Bairnbridge KG, Church J, Yuen BH, Leung PCK. 1993 Cytosolic free Ca2+ in human syncytiotrophoblast cells increased by gonadotropin-releasing hormone. Endocrinology. 133:2220-2226. D’Occhio MJ, Aspden WJ. 1999 Endocrine and reproductive responses of male and female cattle to agonists of gonadotropin-releasing hormone. J. Reprod. Fertil. Suppl. 54:101–114. Dall’Aglio C, Ceccarelli P, Pascucci L, Brecchia G, Boiti C. 2006 Receptors for leptin and estrogen in the subcommissural organ of rabbits are differentially modulated by fasting. Brain. Res.1124(1):62-69. Das SK, Paria BC, Chakraborty I, Dey SK. 1995 Cannabinoid Ligand-Receptor Signaling In The Mouse Uterus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:4332–4336. 169 Davis JS, Alila HW, West LA, Corradino RA and Hansel W. 1988 Acute Effects Of Prostaglandin F2α On Inositol Phospholipid Hydrolysis In The Large And Small Cells Of The Bovine Corpus Luteum. Mol. Cell. Endocrinol. 58:43–50. Davis JS, May JV and Keel BA. 1996 .Mechanisms Of Hormone And Growth Factor Action In The Bovine Corpus Luteum. Theriogenology. 45:1351–1380. Day ML, Imakawa K, Zalesky DD, Kittok RJ, Kinder JE. 1986 Effects Of Restriction Of Dietary Energy Intake During The Prepubertal Period On Secretion Of Luteinizing Hormone And Responsiveness Of The Pituitary To Luteinizing Hormone-Releasing Hormone In Heifers. J. Anim. Sci. 62:1641–7. de Miguel R, Romero J, Munoz RM, Garcia-Gil L, Gonzalez S, Villanua MA, Makriyannis A, Ramos JA, Fernandez-Ruiz JJ. 1998 Effects Of Cannabinoids On Prolactin And Gonadotrophin Secretion: Involvement Of Changes In Hypothalamic γ-Aminobutyric Acid (GABA) Inputs. Biochem. Pharmacol. 56:1331–1338. De Petrocellis L, Cascio MG, Di Marzo V. 2004 The Endocannabinoid System: A General View And Latest Additions. Br. J. Pharmacol. 141:765–774. De Petrocellis L, Melck D, Bisogno T, Milone A, Di Marzo V. 1999 Finding Of The Endocannabinoid Signalling System In Hydra, A Very Primitive Organism: Possible Role In The Feeding Response. Neuroscience. 92:377–387. De Petrocellis L,Cascio MG, Di MarzoV. 2004 The endocannabinoid system: a general view and latest additions. Br.J. Pharmacol. 141:765-774. Debenedetti A. Endocrinologia. In Aguggini G, Beghelli V, Gulio LF.: Fisiologia degli animali domestici. ed UTET; 1992. pp 652-654, pp 669-670. Denamur R, Martinet J and Short RV. 1973. Pituitary Control Of The Ovine Corpus Luteum. J. Reprod. Fertil. 32:207–220. Denamur R. 1966 Secretion Of Progesterone By Sheep Corpora Lutea Following Hypophysectomy, Pituitary Stalk Section And Hysterectomy.Acta Endocrinol. 52:72–90. Dennedy MC, Friel AM, Houlihan DD, Broderick VM, Smith T, Morrison JJ. 2004 Cannabinoids And The Human Uterus During Pregnancy. Am. J. Obstet. Gynecol. 190:2–9. Devane WA, Hanus L, Breuer A, Pertwee RG, Stevenson LA, Griffin G, Gibson D, Mandelbaum A, Etinger A, Mechoulam R. 1992 Isolation And Structure Of A Brain Constituent That Binds To The Cannabinoid Receptor. Science. 258:1946– 1949. Dewitt D and Smith WL. 1995 Yes, But They Still Get Headaches? Cell. 83:345–348. Dharmarajan AM, Bruce NW and Meyer GT. 1985 Quantitative Ultrastructural Characteristics Relating To Transport Between Luteal Cell Cytoplasm And Blood In The Corpus Luteum Of The Pregnant Rat. Am. J. Anat. 172:87–99. Dharmarajan AM, Goodman SB, Atiya N, Parkinson SP, Lareu RR, Tilly KI, Tilly JL. 2004 Role of apoptosis in functional luteolysis in the pregnant rabbit corpus 170 luteum: evidence of a role for placental-derived factors in promoting luteal cell survival. Apoptosis. 9(6):807-814. Di Marzo V, Goparaju SK, Wang L, Liu J, Batkai S, Jarai Z, Fezza F, Miura GI, Palmiter RD, Sugiura T, Kunos G. 2001 Leptinregulated Endocannabinoids Are Involved In Maintaining Food Intake. Nature. 410:822–825. Di Marzo V, Melck D, Bisogno Endocannabinoids:Endogenous T, Cannabinoid De Petrocellis Receptor L. 1998 Ligands With Neuromodulatory Action. Trends. Neurosci.21:521–528. Di S, Malcher-Lopes R, Halmos KC, Tasker JG. 2003 Nongenomic Glucocorticoid Inhibition Via Endocannabinoid Release In The Hypothalamus: A Fast Feedback Mechanism. J. Neurosci. 23:4850–4857. Diaz FJ, Wiltbank MC. 2005 Acquisition of luteolytic capacity involves differential regulation by prostaglandin F2α of genes involved in progesterone biosynthesis in the porcine corpus luteum. Domest Anim Endocrinol. 28(2):172-189. Dickerman RW, Li H-Y, Wade GN. 1993 Decreased Availability Of Metabolic Fuels Suppresses Estrous Behavior In Syrian Hamsters. Am. J. Physiol. 264:R568– 72. Diekman MA, O’Callaghan P, Nett TM and Niswender GD. 1978 Effect of prostaglandin F2α on the number of LH receptors in ovine corpora lutea. Biol. Reprod. 19:1010–1013. Digregorio GB and Nett TM. 1995 Estradiol And Progesterone Influence The Synthesis Of Gonadotropins In The Absence Of Gonadotropin-Releasing Hormone In The Ewe. Biol. Reprod. 53: 166–172. Dinh TP, Carpenter D, Leslie FM, Freund TF, Katona I, Sensi SL, Kathuria S, Piomelli D. 2002 Brain Monoglyceride Lipase Participating In Endocannabinoid Inactivation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:10819–10824. Dinh TP, Kathuria S, Piomelli D. 2004 RNA Interference Suggests A Primary Role For Monoacylglycerol Lipase In The Degradation Of The Endocannabinoid 2Arachidonoylglycerol. Mol. Pharmacol. 66:1260– 1264. Diskin MG, Mackey DR, Roche JF, Sreenan JM. 2003 Effects of nutrition and metabolic status on circulating hormones and ovarian follicle development in cattle. Anim. Reprod. Sci.78:345-370. Dixit VP, Sharma VN, Lohiya NK. 1974 The Effect Of Chronically Administered Cannabis Extract On The Testicular Function Of Mice. Eur. J. Pharmacol. 26:111–114. Dong Q, Lazarus RM, Wong LS, Vellios M, Handelsman DJ. 1991 Pulsatile LH Secretion In Streptozotocin-Induced Diabetes In The Rat. J. Endocrinol. 131:49– 55. Doraiswamy V, Grazul-Bilska AT, Ricke WA, Redmer DA and Reynolds LP. 1995 Immunoneutralization Of Angiogenic Activity From Ovine Corpora Lutea (CL) With Antibodiesagainst Fibroblast Growth Factor (FGF)-2 And Endothelial Cell Growth Factor (VEGF). Biol. Reprod. 52, Suppl. 1:112. Vascular 171 Dufy-Barbe L, Dufy B, Vincent JD. 1978 Serum gonadotropin levels in the ovariectomized rabbit: Effect of acute and chronic administration of estradiol. Biol. Reprod.18:118-24. Duncan JA, Barkan A, Herbon L, Marshall JC. 1986 Regulation of pituitary gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptors by pulsatile GnRH in female rats: effects of estradiol and prolactin. Endocrinology. 118:320-327 Emons G, Nil1 J, Sturm R, Ortmann 0. 1991 Effects of progesterone on gonadotropin-releasing hormone receptor concentration in cultured estrogenprimed female rat pituitary cells. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 42:831-839. Emons G, Schally AV. 1994 The use of luteinizing hormone releasing hormone agonists and antagonists in gynaecological cancers. Hum. Reprod 9:1364–1379. Engeli S, Bohnke J, Feldpausch M, Gorzelniak K, Janke J, Batkai S, Pacher P, Harvey-White J, Luft FC, Sharma AM, Jordan J. 2005 Activation Of The Peripheral Endocannabinoid System In Human Obesity. Diabetes. 54:2838– 2843. Enmark E, Pelto-Huikko M, Grandien K, Lagercrantz S, Lagercrantz J, Fried G, Nordenskjöld M, Gustafsson JA. 1997 Human estrogen receptor beta-gene structure, chromosomal localization, and expression pattern. J. Clin. Endocrinol. Metab.82(12):4258-65. Epstein LR, and Orme-Johnson NR. 1991 Regulation Of Steroid Hormone Biosynthesis. Identification Of Precursors Of A Phosphoprotein Targeted To The Mitochondria In Stimulated Rat Adrenal Cortex Cells. J. Biol. Chem. 266: 19739–19745. Erickson JC, Clegg KE, Palmiter RD. 1996 Sensitivity To Leptin And Susceptibility To Seizures Of Mice Lacking Neuropeptide Y. Nature. 381:415–421. Estacio MA, Yamada S, Tsukamura H, Hirunagi K, Maeda K. 1996 Effect Of Fasting And Immobilization Stress On Estrogen Receptor Immunoreactivity In The Brain In Ovariectomized Female Rats. Brain Res. 717(1–2):55 –61. Estacio MAC, Tsukamura H, Yamada S, Tsukahara S, Hirunagi K, Maeda K. 1996 Vagus Nerve Mediates The Increase In Estrogen Receptors In The Hypothalamic Paraventricular Nucleus And Nucleus Of The Solitary Tract During Fasting In Ovariectomized Rats. Neurosci. Lett. 208:25– 8. Estevez A, Tognetti T, Rearte B, Sander V, Motta AB. 2002 Interleukin1-beta in the functional luteolysis. Relationship with the nitric oxide system. Prostaglandins Leukot. Essent Fatty Acids. 67(6):411-417. Evans RW, and Leavitt WW. 1980 Progesterone Inhibition Of Uterine Nuclear Estrogen Receptor: Dependence On RNA And Protein Synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 5856–5860. Fairchild DL and Pate JL. 1989 Interferon induction of major histocompatibility complex antigens on cultured bovine luteal cells. Biol. Reprod. 40:453–457. Fairchild-Benyo DL and Pate JL. 1992 Tumor necrosis factor a alters bovine luteal cell synthetic capacity and viability. Endocrinology. 130: 854–860. 172 Fairclough RJ, Moore LG, Mcgowan LT, Peterson AJ, Smith JF, Tervit HR and Watkins WB. 1980 Temporal Relationship Between Plasma Concentrations Of 13,14-Dihydro-15-Keto-Prostaglandin F And Neurophysin I/II Around Luteolysis In Sheep. Prostaglandins. 20:199–208. Farin CE, Moeller CL, Sawyer HR, Gamboni F and Niswender GD. 1986 Morphometric Analysis Of Cell Types In The Ovine Corpus Luteum Throughout The Estrous Cycle. Biol. Reprod. 35:1299–1308. Farin CE, Nett TM and Niswender GD. 1990 Effects Of Luteinizing Hormone On Luteal Cell Populations In Hypophysectomised Ewes. J. Reprod. Fertil. 88: 61– 70. Faurholm B, Millar RP, KatzAA. 2001 The genes encoding the type II gonadotropinreleasing hormone receptor and the ribonucleoprotein RBM8A in humans overlap in two genomic loci. Genomics. 78:15–18. Fernandez MJ and Bischoff JR. 1993 Bcl-2 associates with the Ras-relates protein Rras p53. Nature. 366:274–275. Ferrara N. 1993 Vascular Endothelial Growth Factor. Trends Cardiovasc. Med. 3:244– 250. Filicori M. 1994 Gonadotrophin-releasing hormone agonists. A guide to use and selection. Drugs. 48:41–58. Fink G. 1988 Gonadotropin secretion and its control. In: Knobil E, Neill J, eds. The physiology of reproduction. New York: Raven. Press. 1349–1377. Fink G. 1988 Oestrogen and progesterone interaction in the control of gonadotrophin and prolactin secretion. J. Steroid Biochem. 30:169-178. Finn PD, Cunningham MJ, Pau KY, Spies HG, Clifton DK, Steiner RA. 1998 The Stimulatory Effect Of Leptin On The Neuroendocrine Reproductive Axis Of The Monkey. Endocrinology. 139: 4652–62. Fitz TA, Hoyer PB and Niswender GD. 1984 Interactions Of Prostaglandins With Subpopulations Of Ovine Luteal Cells. I. Stimulatory Effects Of Prostaglandins E1, E2 And I2. Prostaglandins. 28: 119–126. Fitz TA, Marr MM, Contois DF, Rexroad CE Jr and Fritz MA. 1993 Effects of individual and combined treatment with prostaglandins E2 and F2α on progesterone secretion by ovine luteal cells supplemented with homologous serum lipoproteins in vitro. Biol. Reprod. 48:662–668. Fitz TA, Mayan MH, Sawyer HR and Niswender GD. 1982 Characterization Of Two Steroidogenic Cell Types In The Ovine Corpus Luteum. Biol. Reprod. 27:703– 711. Fitz TA, Mock EJ, Mayan MH and Niswender GD. 1984 Interactions Of Prostaglandins With Subpopulations Of Ovine Luteal Cells. II. Inhibitory Effects Of PGF2α And Protection By PGE2. Prostaglandins. 28:127–138. Flanagan CA, Millar RP, Illing N. 1997 Advances in understanding gonadotrophinreleasing hormone receptor structure and ligand interactions. Rev. Reprod. 2:113–120. 173 Flier JS. 2004 Obesity Wars: Molecular Progress Confronts An Expanding Epidemic. Cell. 116:337–350. Flower RJ and Blackwell GJ. 1976 The Importance Of Phospholipase A2 In Prostaglandin Synthesis. Biochem. Pharmacol. 25:285–291. Ford SP, Magness RR, Farley DB and Van Orden DE. 1982 Local And Systemic Effects Of Intrauterine Estradiol-17 Beta On Luteal Function Of Nonpregnant Sows. J. Anim. Sci. 55:657–664. Fortune JE and Quirk SM. 1988 Regulation Of Steroidogenesis In Bovine Preovulatory Follicles. J. Anim. Sci. 66, Suppl. 2: 1–8. 305. Foster DL, Bucholtz DC. 1995 Glucose As A Possible Metabolic Cue Timing Puberty. In: Bergada C, Moguilevsky JA, Editors. Serono International Symposium On Puberty: Basic And Clinical Aspects. Rome, Italy: Ares-Serono Symposia. P. 319– 32. Foster DL, Olster DH. 1985 Effect Of Restricted Nutrition On Puberty In The Lamb: Patterns Of Tonic Luteinizing Hormone (LH) Secretion And Competency Of The LH Surge System. Endocrinology. 16(1): 375– 81. Fraser HM. 1993 GnRH analogues for contraception. Br. Med. Bull. 49:62–72. Freund TF, Katona I, Piomelli D. 2003 Role Of Endogenous Cannabinoids In Synaptic Signaling. Physiol. Rev. 83:1017–1066. Fride E, Ginzburg Y, Breuer A, Bisogno T, Di Marzo V, Mechoulam R. 2001 Critical Role Of The Endogenous Cannabinoid System In Mouse Pup Suckling And Growth. Eur. J. Pharmacol. 419:207–214. Friedman MI, Rawson NE. 1995 Fuel Metabolism And Appetite Control. Appetite And Body Weight Regulation: Sugar Fat And Macronutrient Subtrates. Boca Raton (FL): CRC Press. P. 63– 76. Friedman MI, Tordoff MG. 1986 Fatty Acid Oxidation And Glucose Utilization Interact To Control Food Intake In Rats. Am. J. Physiol. 251: R840– 5. Friedman MI. 1990 Making Sense Out Of Calories. In: Stricker EM, Editor. Handbook Of Behavioral Neurobiology: Neurobiology Of Food And Fluid Intake, Vol 10. New York: Plenum. P. 513– 29. Friedman MI. 1991 Metabolic Control Of Calorie Intake. In: Friedman MI, Tordoff MG, Kare MR, Editors. Chemical Senses: Appetite And Nutrition, Vol 4. New York: Marcel Dekker. P. 19– 38. Friedman MI. 1995 Control Of Energy Intake By Energy Metabolism. Am. J. Clin. Nutr. 62:1096S–100S [Suppl]. Friedman MI. 1997 An Energy Sensor For Control Of Energy Intake. Proc. Nutr. Soc. 56:41– 50. Friedman MI. 1998 Fuel Partitioning And Food Intake. Am. J. Clin. Nutr. 67:S513–8. Furuta M, Funabashi T, Kimura F. 2001 Intracerebroventricular Administration Of Ghrelin Rapidly Suppresses Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion Ovariectomized Rats. Biochem. Biophys. Res. Commun. 288(4):780–5. In 174 Furuta M, Funabashi T, Kimura F. 2002 Suppressive Action Of Orexin A On Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion Is Potentiated By A Low Dose Of Estrogen In Ovariectomized Rats. Neuroendocrinology. 75(3):151– 7. Galiegue S, Mary S, Marchand J, Dussossoy D, Carriere D, Carayon P, Bouaboula M, Shire D, Le Fur G, Casellas P. 1995 Expression Of Central And Peripheral Cannabinoid Receptors In Human Immune Tissues And Leukocyte Subpopulations. Eur. J. Biochem. 232: 54–61. Gardner EL, Vorel SR. 1998 Cannabinoid Transmission And Reward-Related Events. Neurobiol. Dis. 5:502–533. Garrido C, Simon S and Gospodarowicz D. 1993 Transcriptional Regulation Of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Expression In Ovarian Granulosa Cells. Growth Factors. 8:109–117. Garverick HA, Smith MF, Elmore RG, Morehouse GL, Agudo SPL and Zahler WL. 1985 Changes and interrelationships among luteal LH receptors, adenylate cyclase activity and phosphodiesterase activity during the bovine estrous cycle. J. Anim. Sci. 61:216–223. Geary N. 1999 Effects Of Glucagon, Insulin, Amylin And CGRP On Feeding. Neuropeptides. 33:400– 5. Geary N. 2001 Estradiol, CCK and satiation. Peptides. 22(8):1251-6. Gemmell RT, Stacy BD and Thornburn GD. 1976 Morphology Of The Regressing Corpus Luteum In The Ewe. Biol. Reprod. 14:270–279. Genazzani AR, Lucchesi A, Stomati M, Catarsi S, Genazani AD, Criscuolo M and Petraglia F. 1997 Effects of sex steroid hormone on the neuroendocrine system. EUR. J. Cotracept. Reprod. Health Care. 2(1):63-69. Gerard CM, Mollereau C, Vassart G, Parmentier M. 1991 Molecular Cloning Of A Human Cannabinoid Receptor Which Is Also Expressed In Testis. Biochem. J. 279:129–134. Gérard N, Caillaud M, Martoriati A, Goudet G, Lalmanach AC. 2004 The interleukin-1 system and female reproduction. J. Endocrinol. 180 (2):203-212. Gerardo-Gettens T, Moore BJ, Stern JS, Horwitz BA. 1989 Prolactin Stimulates Food Intake In A Dose-Dependent Manner. Am. J. Physiol. 256:R276 – 80. Gerardo-Gettens T, Moore BJ, Stern JS, Horwitz BA. 1989 Prolactin Stimulates Food Intake In The Absence Of Ovarian Progesterone. Am. J. Physiol. 256:R701– 6. Gerdeman G, Lovinger DM. 2001 CB1 Cannabinoid Receptor Inhibits Synaptic Release Of Glutamate In Rat Dorsolateral Striatum. J. Neurophysiol. 85:468–471 Gharib SD, Wierman ME, Shupnik MA, Chin WW. 1990 Molecular biology of the pituitary gonadotrophins. Endocrine Rev. 11:177-199. Giang DK, Cravatt BF. 1997 Molecular Characterization Of Human And Mouse Fatty Acid Amide Hydrolases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:2238–2242. Gibori G, Khan I, Warshaw ML, Mclean MP, Puryear TK, Nelson S, Durkee TJ, Azhar S, Steinschneider A and Rao MC. 1988 Placental-Derived Regulators 175 And The Complex Control Of Luteal Cell Function. Recent Prog. Horm. Res. 44:377–425. Giguère V, Yang N, Segui P, Evans RM. 1988 Identification of a new class of steroid hormone receptors.Nature. 331(6151):91-4. Ginther OJ. 1974 Internal Regulation Of Physiological Processes Through Venoarterial Pathways: A Review. J. Anim. Sci. 39:550–564. Girsh E, Milvae RA, Wang W, Milvae RA and Meidan R. 1996 Effect Of Endothelin-1 On Bovine Luteal Cell Function: Role Of PGF2α-Induced Antisteroidogenic Action. Endocrinology. 137: 1306– 1312. Girsh E, Wang W, Mamluk R, Arditi F, Friedman A, Milvae RA and Meidan R. 1996 Regulation Of Endothelin-1 In The Bovine Corpus Luteum: Elevation By Prostaglandin F2 Alpha. Endocrinology. 137: 5191–5196. Gonzalez S, Bisogno T, Wenger T, Manzanares J, Milone A, Berrendero F, Di Marzo V, Ramos JA, Fernandez-Ruiz JJ. 2000 Sex Steroid Influence On Cannabinoid CB1 Receptor Mrna And Endocannabinoidi Levels In The Anterior Pituitary Gland. Biochem. Biophys. Res. Commun. 270:260–266. Gonzàlez S, Bisogno T, Wenger T, Manzanares J, Milone A, Berrendero F, Di Marzo V, Ramos JA, Fernandez-Ruiz JJ. 2000 Sex steroid influence on cannabinoid CB1 receptor mRNA and endocannabinoid levels in the anterior pituitary gland. Biochem. Biophys.Res. Commun. 270:260-266. Gorospe W, Conn PM. 1987 Agents that decrease gonadotrouin-releasing hormone (GnRH) receptor intenalization do not inhibit GnRH-mediated gonadotrope desensitization. Endocrinology. 129:222-229. Gorski J, Welshons W, Sakai D. 1984 Remodeling the estrogen receptor model. Mol. Cell. Endocrinol. 36:11-5. Goyeneche AA, Martinez IL, Deis RP, Gibori G, Telleria CM. 2003 In vivo hormonal environment leads to differential susceptibility of the corpus luteum to apoptosis in vitro. Biol. Reprod. 68(6):2322-2330. Graves PE, Pierce KL, Bailey TJ, Rueda BR, Gil DW, Woodward DF, Yool AJ, Hoyer PB and Regan JW. 1995 Cloning Of A Receptor For Prostaglandin F2α From Ovine Corpus Luteum. Endocrinology. 136: 3430–3436. Grazul-Bilska AT, Redmer DA, Jablonka A, Shariff M, Biondini E and Reynolds LP. 1995 Proliferation And Progesterone Production Of Ovine Luteal Cells From Several Stages Of The Estrous Cycle: Effects Of Fibroblast Growth Factors And Luteinizing Hormone. Can. J. Physiol. Pharmacol. 73:491–500. Greene GL, Gilna P,Waterfield M, Baker A, Hort Y, Shine J. 1986 Sequence and expression of human estrogen receptor complementary DNA. Science. 231:1150-4. Gronemeyer H, Moras D. 1995 Nuclear receptors. How to finger DNA. Nature. 375(6528):190-1. Gruaz-Gumowski NM, Lalaoui M, Pierroz DD, Englaro P, Sizonenko PC, Blum WF, et al. 1998 Chronic Administration Of Leptin Into The Lateral Ventricle 176 Induces Sexual Maturation In Severely Food-Restricted Female Rats. J. Neuroendocrinol. 10:627–33. Grummer RR and Carroll DJ. 1988 A Review Of Lipoprotein Cholesterol Metabolism: Importance To Ovarian Function. J. Anim. Sci. 66:3160–3173. Gu GB, Simerly RB. 1997 Projections Of The Sexually Dimorphic Anteroventral Periventricular Nucleus In The Female Rat. J. Comp. Neurol. 384:142–64. Guarnieri F, Weinstein H. 1996 Conformational memories and the exploration of biologically relevant peptide conformations: an illustration for the gonadotropinreleasing hormone. J. Am. Chem. Soc. 118:5580–5589. Guraya, S. S. 1971 Morphology, Histochemistry, And Biochemistry Of Human Ovarian Compartments And Steroid Hormone Synthesis. Physiol. Rev. 51: 785–807, Gürsoy E, Ergin K, Basaloglu H, Koca Y, Seyrek K. 2008 Expression and localisation of Bcl-2 and Bax proteins in developing rat ovary. Res. Vet. Sci. 84(1):56-61. Guthrie HD, Rexroad CE Jr. and Bolt DJ. 1978 In Vitro Synthesis Of Progesterone And Prostaglandin F By Luteal Tissue And Prostaglandin F By Endometrial Tissue From The Pig. Prostaglandins. 16: 433–440. Guy MK, Juengel JL, Tandeski TR and Niswender GD. 1995 Steady-state concentrations of mRNA encoding the receptor for luteinizing hormone during the estrous cycle and following prostaglandin F2α treatment of ewes. Endocrine. 3:585–589. Guyton A., Hall JE. Fisiologia medica. ed EdiSES; 2007. pp 700-702, pp 866-868. Halasz B, Kiss J, Molnar J. 1989 Regulation of the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neuronal system: morphological aspects. J. Steroid. Biochem. 33:663668. Hansel W, Alila HW, Dowd JP and Milvae RA. 1991 Differential Origin And Control Mechanisms In Small And Large Bovine Luteal Cells. J. Reprod. Fertil. 43, Suppl.: 77–89. Hansel W, Concannon PW and Lukaszewska JH. 1973 Corpora Lutea Of The Large Domestic Ruminants. Biol. Reprod. 8: 222–245. Hanukoglu I. 1992 Steroidogenic Enzymes: Structure, Function, And Role In Regulation Of Steroid Hormone Biosynthesis. J. Steroid Biochem. 43:779–804. Hanus L, Abu-Lafi S, Fride E, Breuer A, Vogel Z, Shalev DE, Kustanovich I, Mechoulam R. 2001 2-Arachidonyl Glyceryl Ether, An Endogenous Agonist Of The Cannabinoid CB1 Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:3662–3665. Hapgood JP, Sadie H, van Biljon W, Ronacher K. 2005 Regulation of expression of mammalian gonadotrophin-releasing hormone receptor genes. J. Neuroendocrinol. 17(10): 619-38. Harclerode J, Nyquist SE, Nazar B, Lowe D. 1978 Effects Of Cannabis On Sex Hormones And Testicular Enzymes Of The Rodent. Adv. Biosci. 22- 23:395–405. Harris N, Dutlow C, Eidne K, Dong KW, Roberts J, Millar R. 1991 Gonadotropinreleasing hormone gene expression in MDA-MB- 231 and ZR-75-1 breast carcinoma cell lines. Cancer Res. 51:2577-2581. 177 Harrison LM, Kenny N and Niswender GD. 1987 Progesterone Production, LHReceptors, And Oxytocin Secretion By Ovine Luteal Cell Types On Days 6, 10, And 15 Of The Oestrous Cycle And Day 25 Of Pregnancy. J. Reprod. Fertil. 79: 539–548. Hashimoto R, Kimura F. 1986 Inhibition Of Gonadotropin Secretion Induced By Cholecystokinin Implants In The Medial Preoptic Area By The Dopamine Receptor Blocker, Pimozide, In The Rat. Neuroendocrinology. 42:32– 7. Haworth JD. 1997 Roles of the Pituitary Gland and Immune System in Maintenance and Regression of the Ovine Corpus Luteum (Phd Thesis). Fort Collins: Colorado State University. Hazum E, Conn PM. 1988 Molecular mechanism of gonadotropin releasing hormone (GnRH) action. I. The GnRH receptor. Endocr Rev 9:379-386 Hazum E, Cuatrecasas P, Marian J, Conn PM. 1980 Receptor-mediated internalization of gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:6692-6696. Hazum E, Nimrod A. 1982 Photoaffinity labeling and fluorescence distribution studies of gonadotropin-releasing hormone receptors in ovarian granulosa cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79:1747-1750. He D, Funabashi T, Sano A, Uemura T, Minaguchi H, Kimura F. 1999 Effects Of Glucose And Related Substrates On The Recovery Of The Electrical Activity Of Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator Which Is Decreased By Insulin-Induced Hypoglycemia In The Estrogenprimed Ovariectomized Rat. Brain Res. 820:71– 6. Henry BA, Godong JW, Alexander WS, Tilbrook AJ, Canny BJ, Dunshea F, et al. 1999 Central Administration Of Leptin To Ovariectomized Ewes Inhibits Food Intake Without Affecting The Secretion Of Hormones From The Pituitary Gland: Evidence For A Dissociation Of Effects On Appetite And Neuroendocrine Function. Endocrinology. 140: 1175– 82. Herbison AE, Pape JR. 2001 New Evidence For Estrogen Receptors In GonadotropinReleasing Hormone Neurons. Front Neuroendocrinol. 22:292–308. Herbison AE. 1998 Multimodal Influences Of Estrogen Upon Gonadotropinreleasing Hormone Neurons. Endocr. Rev. 19:302–30. Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvil LS, de Costa BR and Rice KC. 1991 Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: a quantitative in vitro autoradiography study. J. Neurosci. 11:563-583. Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvin LS, De Costa BR, Rice KC. 1991 Characterization And Localization Of Cannabinoid Receptors In Rat Brain: A Quantitative In Vitro Autoradiographicstudy. J. Neurosci. 11:563–583. Herkenham M, Lynn AB, Little MD, Johnson MR, Melvin LS, De Costa BR, Rice KC. 1990 Cannabinoid Receptor Localization In Brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:1932–1936. Hilairet S, Bouaboula M, Carriere D, Le Fur G, Casellas P. 2003 Hypersensitization Of The Orexin 1 Receptor By The CB1 Receptor: Evidence For Cross-Talk 178 Blocked By The Specific CB1 Antagonist, SR141716. J. Biol. Chem. 278:23731– 23737. Hohmann JG, Teal TH, Clifton DK, Davis J, Hruby VJ, Han G, et al. 2000 Differential Role Of Melanocortins In Mediating Leptin’s Central Effects On Feeding And Reproduction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 278:R50 – 9. Holmberg BJ, Morrison CD, Keisler DH. 2001 Endocrine Responses Of Ovariectomized Ewes To Icv Infusion Of Urocortin. J. Endocrinol. 171(3):517– 24. Holt JA. 1989 Regulation Of Progesterone Production In The Rabbit Corpus Luteum. Biol. Reprod. 40: 201–208. Homeida AM and El-Eknah MM. 1992 Inhibition Of Luteal Function By Oxytocin Antagonist In Goats (Capra hircus). J. Reprod. Fertil. 94: 279–285. Hopkins CR, Gregory H. 1977 Topographical localization of the receptors for luteinizing hormone-releasing hormone on the surface of dissociated pituitary cells. J. Cell. Biol. 75:528-540. Hornsby PJ and Crivello JF. 1983 The role of lipid peroxidation and biological antioxidants in the function of the adrenal cortex. I. A background review. Mol. Cell. Endocrinol. 30: 1. (a) Hornsby PJ and Crivello JF. 1983 The role of lipid peroxidation and biological antioxidants in the function of the adrenal cortex. II. Mol. Cell. Endocrinol. 30: 123. Howland BE. 1980 Effect Of Glucoprivation Induced By 2-Deoxy-D-Glucose On Serum Gonadotropin Levels, Pituitary Response To Gnrh And Progesterone- Induced Release Of Luteinizing Hormone In Rats. Horm. Metab. Res. 12:520– 3. Howlett AC, Barth F, Bonner TI, Cabral G, Casellas P, Devane WA, Felder CC, Herkenham M, Mackie K, Martin BR, Mechoulam R, Pertwee RG. 2002 International Union Of Pharmacology. XXVII. Classification Of Cannabinoid Receptors. Pharmacol. Rev. 54: 161–202. Howlett AC. 2002 The Cannabinoid Receptors. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 6869:619–631. Hoyer PB, Fitz TA and Niswender GD. 1984 Hormoneindependent Activation Of Adenylate Cyclase In Large Steroidogenic Ovine Luteal Cells Does Not Result In Increased Progesterone Secretion. Endocrinology. 114: 604–608. Hrabovszky E, Shughrue PJ, Merchenthaler I, Hajszan T, Carpenter CD, Liposits Z, et al. 2000 Detection Of Estrogen Receptor-H Messenger Ribonucleic Acid And 125I-Estrogen Binding Sites In Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Neurons Of The Rat Brain. Endocrinology. 141:3506– 9. Hrabovszky E, Steinhauser A, Barabas K, Shughrue PJ, Peterson SL, Merchenthaler I, et al. 2001 Estrogen Receptor-H Immunoreactivity In Luteinizing Hormone Releasing Endocrinology. 142:3261– 4. Hormone Neurons Of The Rat Brain. 179 Hu L, Gustofson RL, Feng H, Leung PK, Mores N, Krsmanovic LZ, Catt KJ. 2008 Converse regulatory functions of estrogen receptor-alpha and -beta subtypes expressed in hypothalamic gonadotropin-releasing hormone neurons. Mol. Endocrinol. 22(10):2250-9. Huang SM, Bisogno T, Trevisani M, Al-Hayani A, De Petrocellis L, Fezza F, Tognetto M, Petros TJ, Krey JF, Chu CJ, Miller JD, Davies SN, Geppetti P, Walker JM, Di Marzo V. 2002 An Endogenous Capsaicin-Like Substance With High Potency At Recombinant And Native Vanilloid VR1 Receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 8400–8405. Huckle WR, Conn PM. 1988 Molecular mechanism of gonadotropin releasing hormone action. II. The effector system. Endocr. Rev. 9:387-395. Huckle WR, McArdle CA, Conn PM. 1988 Differential sensitivity of agonist- and antagonist-occupied gonadotropin-releasing hormone receptors to protein kinase C activators. J. Biol. Chem. 263:3296-3302. Hurwitz A and Adashi EY. 1992 Ovarian follicular atresia as an apoptotic process: a paradigm for programmed cell death in endocrine tissues. Mol. Cell. Endocrinol. 84:C19—C23. Hutchison JS and Zeleznik AJ. 1984 The Rhesus Monkey Corpus Luteum Is Dependent On Pituitary Gonadotropin Secretion Throughout The Luteal Phase Of The Menstrual Cycle. Endocrinology. 115:1780–1786. Hwang J and Menon KM. 1983 Characterization Of Low Density And High Density Lipoprotein Receptors In The Rat Corpus Luteum And Regulation By Gonadotropin. J. Biol. Chem. 258:8020–8027. Hyde CL, Childs G, Wahl LM, Naor Z, Catt KJ. 1982 Preparation of gonadotrophenriched cell populations from adult rat anterior pituitary cells by centrifugal elutriation. Endocrinology. 111(4):1421-3. Ibrahim MM, Porreca F, Lai J, Albrecht PJ, Rice FL, Khodorova A, Davar G, Makriyannis A, Vanderah TW, Mata HP, Malan Jr TP. 2005 CB2 Cannabinoid Receptor Activation Produces Antinociception By Stimulating Peripheral Release Of Endogenous Opioids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102:3093–3098. Ikonen E. 1997 Molecular Mechanisms Of Intracellular Cholesterol Transport. Curr. Opin. Lipidol. 8: 60–64. Illing N, Jacobs GFM, Becker II, Flanagan CA, Davidson JS, Eales A, Zhou W, Sealfon SC, Millar RP. 1993 Comparative sequence analysis and functional characterization of the cloned sheep gonadotropin-releasing hormone receptor reveal differences in primary structure and ligand specificity among mammalian receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:745-751. Illing N, Sealfon SC, Hapgood J. 1999 A novel human GnRH receptor homolog gene: abundant and wide tissue distribution of the antisense transcript. J. Endocrinol. 162:117–126. 180 Ing NH, and Tornesi MB. 1997 Estradiol Upregulates Estrogen Receptor And Progesterone Receptor Gene Expression In Specific Ovine Uterine Cells. Biol. Reprod. 56: 1205–1215. Ireland JJ, Aten RF, Behrman HR. 1988 GnRH-like proteins in cows: concentiations during corpora lutea development and selective localization in granulosa cells. Biol. Reprod. 38:544-550. Iwakoshi E, Takuwa-Kuroda K, Fujisawa Y, Hisada M, Ukena K, Tsutsui K, Minakata H. 2002 Isolation and characterization of a GnRH-like peptide from Octopus vulgaris. Biochem. Biophys. Res. Commun 291:1187–1193. Iwakoshi E, Takuwa-Kuroda K, Fujisawa Y, Hisada M, Ukena K, Tsutsui K, Minakata H. 2002 Isolation and characterization of a GnRH-like peptide from Octopus vulgaris. Biochem. Biophys. Res. Commun. 291:1187–1193. Iwashita M, Catt KJ. 1985 Photoaffinity labeling of pituitary and gonadal receptors for gonadotropin-releasing hormone. Endocrinology. 117:738-746 Iwashita M, Evans MI, Catt KJ. 1986 Characterization of a gonadotropin-releasing hormone receptor site in term placenta and chorionic villi. J. Clin. Endocrinol. Metab. 62:127-133. Jablonka-Shariff A, Grazul-Bilska AT, Redmer DA and Reynolds LP. 1993 Growth And Cellular Proliferation Of Ovine Corpora Lutea Throughout The Estrous Cycle. Endocrinology. 133:1871–1879. Jackson AL, Murphy LL. 1997 Role Of The Hypothalamic-Pituitary Pituitaryadrenal Axis In The Suppression Of Luteinizing Hormone Release By ∆9- Tetrahydrocannabinol. Neuroendocrinology. 65:446–452. Janovick JA and Conn PM. 1996 Progesterone Diminishes The Sensitivity Of Gonadotropin-Releasing Hormone-Stimulated Luteinizing Hormone (LH) Release And Protects An LH Pool From Desensitization: Actions Opposed By Cholera Toxin. Endocrinology. 137: 1823–1827. Jensen EV, Jacobsen HI. 1962 Basic guides to the mechanism of estrogen Original Paper action. Rec Prog Horm Res;18:387-414. Johnson WJ, Phillips MC and Rothblat GH. 1997 Lipoproteins And Cellular Cholesterol Homeostasis. Subcell. Biochem. 28:235–276. Juengel JL, Garverick HA, Johnson AL, Youngquist RS and Smith MF. 1993 Apoptosis during luteal regression in cattle. Endocrinology. 132:249–254. Juengel JL, Meberg BM, Turzillo AM, Nett TM and Niswender GD. 1995 Hormonal Regulation Of mRNA Encoding Steroidogenic Acute Regulatory Protein In Ovine Corpora Lutea. Endocrinology. 136: 5423–5429. (a) Juengel JL, Nett TM, Tandeski TM, Eckery DC, Sawyer HR and Niswender GD. 1995 Effect Of Luteinizing Hormone And Growth Hormone On Luteal Development In Hypophysectomised Ewes. Endocrine. 3:323–326. Juengel JL, Wiltbank MC, Meberg BM and Niswender GD. 1996 Regulation Of Steady-State Concentrations Of Messenger Ribonucleic Acid Encoding 181 Prostaglandin F2α Receptor In Ovine Corpus Luteum. Biol. Reprod. 54: 1096– 1102. Kaiser UB, Jakubowiak A, Steinberger A, Chin WW. 1993 Regulation of rat pituitary gonadotropin-releasing hormone receptor mRNA levels in vim and in vitro. Endocrinology. 133:931-934 131. Kaiser UB, Zhao D, Gardona GR, Chin WW. 1992 Isolation and characterization of cDNA encoding the rat pituitary gonadotropinreleasing hormone receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 189:1645-1652. Kallo I, Butler JA, Barkovics-Kallo M, Goubillon ML, Coen CW. 2001 Oestrogen Receptor H-Immunoreactivity In Gonadotropin Releasing Hormone-Expressing Neurones: Regulation By Oestrogen. J. Neuroendocrinol. 13:741– 8. Kalra SP, Dube MG, Sahu A, Phelps CP, Kalra PS. 1991 Neuropeptide Y Secretion Increases In The Paraventricular Nucleus In Association With Increased Appetite For Food. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 88: 10931– 5. Kalra SP, Horvath T, Naftolin F, Xu B, Pu S, Kalra PS. 1997 The Interactive Language Of The Hypothalamus For The Gonadotropin Releasing Hormone (GNRH) System. J. Neuroendocrinol. 9:569–76. Kamohara S, Burcelin R, Halaas JL, Friedman JM, Charron MJ. 1997 Acute Stimulation Of Glucose Metabolism In Mice By Leptin Treatment. Nature. 389:374– 7. Kaneko KJ, Gelinas C, and Gorski J. 1993 Activation Of The Silent Progesterone Receptor Gene By Ectopic Expression Of Estrogen Receptors In A Rat Fibroblast Cell Line. Biochemistry. 32:8348–8359. Karten MJ, Rivier JE. 1986 Gonadotropin-releasing hormone analog design. Structurefunction studies toward the development of agonists and antagonists: rationale and perspective. Endocr. Rev. 7:44–66. Kasa-Vubu JZ, Dahl GE, Evans NP, Thrun LA, Moenter SM, Padmanabhan V and Karsch FJ. 1992 Progesterone Blocks The Estradiol-Induced Gonadotropin Discharge In The Ewe By Inhibiting The Surge Of Gonadotropin-Releasing Hormone. Endocrinology. 131: 208–212. Katzenellenbogen BS. 1996 Estrogen receptors: bioactivities and interactions with cell signaling pathways. Biol.Reprod. 54(2):287-93. Kauffman AS, Rissman EF. 2006 Neuroendocrine control of mating-induced ovulation. In: Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. JD Neill, editor. Elsevier: San Diego. pp 2283-2326. Kerdelhue B, Lenior V, Toner J, Millar RP, Dutlow CM, Williams RF, Jones GS, Hodgen GD. 1990 GnRH precursor is present in the anterior pituitary and a marked increase in its content preceeds the estradiol-17β-induced plasma LH surge in the female primate. C. R .Acad. Sci. III 311:479-485. Kerr JFR, Wyllie AH and Currie AR. 1972 Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon With Wide-Ranging Implications In Tissue Kinetics. Br. J. Cancer 26:239–257. 182 Kile JP, Alexander BM, Moss GE, Hallford DM, Nett TM. 1991 GonadotropinReleasing Hormone Overrides The Negative Effect Of Reduced Dietary Energy On Gonadotropin Synthesis And Secretion In Ewes. Endocrinology. 128(2):843– 9. Kimura F, Hashimoto R, Kawakami M. 1983 The Stimulatory Effect Of Cholecystokinin Implanted In The Medial Preoptic Area On Luteinizing Hormone Secretion In The Ovariectomized Estrogen-Primed Rat. Endocrinol. Jpn. 30:305– 9. King JA, Millar RP. 1979 Heterogeneity of vertebrate luteinizing hormone-releasing hormone. Science .206:67–69. King JA, Millar RP. 1980 Comparative aspects of luteinizing hormone- releasing hormone structure and function in vertebrate phylogeny. Endocrinology. 106:707–717. King JA, Millar RP. 1992 Evolution of gonadotropin-releasing hormone. Trends Endocrinol. Metab 3:339–346. King JA, Millar RP. 1995 Evolutionary aspects of gonadotropinreleasing hormone and its receptor. Cell. Mol. Neurobiol .15:5–23. King JA, Millar RP. 1997 Coordinated evolution of GnRHs and their receptors. In: Parhar IS, Sakuma Y, eds. GnRH neurones: gene to behavior. Tokyo: Brain Shuppan; 51–77. Kirkham TC, Williams CM. 2001 Endogenous Cannabinoids And Appetite. Nutr Res Reviews 14:65–86 Klein TW, Newton C, Larsen K, Lu L, Perkins I, Nong L, Friedman H. 2003 The Cannabinoid System And Immune Modulation. J. Leukoc. Biol. 74:486–496. Knickerbocker JJ, Wiltbank MC and Niswender GD. 1988 Mechanisms Of Luteolysis In Domestic Livestock. Domest. Anim. Endocrinol. 5: 91–107. Koering MJ. 1974 Luteolysis in normal and prostaglandin F2α-treated pseudopregnant rabbits. J. Reprod. Fertil. 40(2):259–267. Kojima M, Hosoda H, Date Y, Nakazato M, Matsuo H, Kangawa K. 1999 Ghrelin Is A Growth Hormone-Releasing Acylated Peptide From Stomach. Nature. 402:656– 60. Kolodny RC, Masters WH, Kolodner RM, Toro G. 1974 Depression Of Plasma Testosterone Levels After Chronic Intensive Marihuana Use. N. Engl. J. Med. 290:872–874. Koos RD, LeMaire WJ. 1985 The effects of a gonadotropin-releasing hormone agonist on ovulation and steroidogenesis during perfusion of rabbit and rat ovaries in vitro. Endocrinology. 116:628-632. Koos RD. 1995 Increased Expression Of Vascular Endothelial Growth/Permeability Factor In The Rat Ovary Following An Ovulatory Gonadotropin Stimulus: Potential Roles In Follicle Rupture. Biol. Reprod. 52: 1426–1435. Korsmeyer SJ. 1992 Bcl-2 initiates a new category of oncogenes: regulators of cell death. Blood 80:879–886. 183 Korsmeyer SJ. 1995 Regulators of cell death. Trends Genet. 11:101–105. Kraus WL, and Katzenellenbogen BS. 1993 Regulation Of Progesterone Receptor Gene Expression And Growth In The Rat Uterus: Modulation Of Estrogen Actions By Progesterone And Sex Steroid Hormone Antagonists. Endocrinology. 132: 2371–2379. Kraus WL, Kadonaga JT. 1998 p300 and estrogen receptor cooperatively activate transcription via differential enhancement of initiation and reinitiation. Genes Dev. Feb 1;12(3):331-42. Kraus WL, McInerney EM, Katzenellenbogen BS. 1995 Ligand-dependent, transcriptionally productive association of the amino- and carboxyl-terminal regions of a steroid hormone nuclear receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92(26):12314-8 Krey LC, Padmanabhan V and Beitins IZ. 1993 Progesterone Modulation Of Gonadotropin Secretion By Dispersed Rat Pituitary Cells In Culture. IV. FollicleStimulating Hormone Synthesis And Release. Mol. Cell. Endocrinol. 91: 13–20. Krisans SK. 1996 Cell Compartmentalization Of Cholesterol Biosynthesis. Ann. NY Acad. Sci. 804: 142–164. Krsmanovic LZ, Stojilkovic SS, Mertz LM, Tomic M, Catt KJ. 1993 Expression of gonadotropin-releasing hormone receptors and autocrine reqlation of neuropeptide release in immortalized hypothalamic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:3908-3912. Krusche CA, Vloet TD, Herrier A, Black S, Beier HM. 2002 Functional and structural regression of the rabbit corpus luteum is associated with altered luteal immune cell phenotypes and cytokine expression patterns. Histochem Cell. Biol. 118(6):479-489. Kuiper GG, Enmark E, Pelto-Huikko M, Nilsson S, Gustafsson J-Å. 1996 Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:5925-30. Kumar MS, Simpkins JW. 1983 Naloxone Blocks The Effects Of ∆9 - Tetrahydrocannabinol On Serum Luteinizing Hormone And Prolactin In Rats. Subst. Alcohol Actions Misuse. 4:347–353. Langhans W, Scharrer E. 1987 Evidence For Vagally Mediated Satiety Signal Derived From Hepatic Fatty Acid Oxidation. J. Auton. Nerv. Syst. 18:13–8. Laws SC, Beggs MJ, Webster JC and Miller WL. 1990 Inhibin Increases And Progesterone Decreases Receptors For Gonadotropin-Releasing Hormone In Ovine Pituitary Culture. Endocrinology. 127: 373–380. Laws SC, Beggs MJ, Webster JC, and Miller WL. 1990 Inhibin Increases And Progesterone Decreases Receptors For Gonadotropin-Releasing Hormone In Ovine Pituitary Culture. Endocrinology. 127:373–380. Lazzarini SJ, Schneider JE, Wade GN. 1988 Inhibition Of Fatty Acid Oxidation And Glucose Metabolism Does Not Affect Food Intake Or Hunger Motivation In Syrian Hamsters. Physiol. Behav. 44(2):209– 13. 184 Leggett JD, Aspley S, Beckett SR, D’Antona AM, Kendall DA, Kendall DA. 2004 Oleamide Is A Selective Endogenous Agonist Of Rat And Human CB1 Cannabinoid Receptors. Br. J. Pharmacol. 141:253–262. Lestavel S and Fruchart JC. 1994 Lipoprotein Receptors. Cell. Mol. Biol. 40: 4461– 4481. Levy JR, Gyarmati J, Lesko JM, Adler R, Stevens W. 2000 Dual Regulation Of Leptin Secretion: Intracellular Energy And Calcium Dependence Of Regulated Pathway. Am J Physiol: Endocrinol. Metab. 278: R892– 901. Lewis DE, Shellard L, Koeslag DG, Boer DE, McCarthy HD, McKibbin PE, et al. 1993 Intense Exercise And Food Restriction Cause Similar Hypothalamic Neuropeptide Y Increases In Rats. Am. J. Physiol. 264:E279– 84. Li H-Y, Wade GN, Blaustein JD. 1994 Manipulations Of Metabolic Fuel Availability Alter Estrous Behavior And Neural Estrogen-Receptor Immunoreactivity In Syrian Hamsters. Endocrinology. 135:240– 7. Liebermann DA, Hoffman B, Vesely D. 2007 p53 induced growth arrest versus apoptosis and its modulation by survival cytokines. Cell. Cycle. 6(2):166–170. Limonta P, Ladizhenskaya A, Gunsalus GL, Bardin CW, Thau RB. 1986 Regulation of pituitary gonadotropin-releasing hormone receptors by androgens in the male rabbit. Endocrinology. 118:340- 347. Liu Y., Hu ZY, Feng Q, Zou RJ. 1991 Paradoxical effect of a GnRH agonist on steroidogenesis in cultured monkey granulosa cells. Sci. Chin. 34:1452–1460. Loumaye E, Catt KJ. 1982 Homologous regulation of gonadotropin- releasing hormone receptors in cultured pituitary cells. Science. 215:983-985. Loumaye E, Catt KJ. 1983 Agonist-induced regulation of pituitary receptors for gonadotropin-releasing hormone. J. Biol. Chem. 258:12002-12009. Loumaye E, Wynn PC, Coy D, Catt KJ. 1984 Receptor-binding properties of gonadotropin-releasing hormone derivatives. J. Biol. Chem. 259:12663-12671. Lubkin M, Stricker-Krongrad A. 1998 Independent Feeding And Metabolic Actions Of Orexins In Mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 253:241– 5. Lucy MC., Savio JD, Badinga L, De La Sota RL and Thatcher WW. 1992 Factors That Affect Ovarian Follicular Dynamics In Cattle. J. Anim. Sci. 70:3615–3626. Lum H and Malik AB. 1996 Mechanisms Of Increased Endothelial Permeability. Can. J. Physiol. Pharmacol. 74: 787–800. Maccarrone M, Cecconi S, Rossi G, Battista N, Pauselli R, Finazzi-Agro A. 2003 Anandamide Activity And Degradation Are Regulated By Early Postnatal Aging And Follicle-Stimulating Hormone In Mouse Sertoli Cells. Endocrinology. 144:20–28. Maccarrone M, Finazzi-Agro A. 2004 Anandamide Hydrolase: A Guardian Angel Of Human Reproduction? Trends Pharmacol. Sci. 25:353–357. MacLusky NJ, Naftolin F, Leranth C. 1988 Immunocytochemical Evidence For Direct Synaptic Connections Between Corticotroppin-Releasing Factor (CRF) Gonadotropin-Releasing Hormone (Gnrh)-Containing Neurons In The Preoptic Area Of The Rat. Brain Res. 439:391– 5. 185 Maeda K-I, Cagampang FRA, Coen CW, Tsukamura H. 1994 Involvement Of The Catecholaminergic Input To The Paraventricular Nucleus And Of CorticotropinReleasing Hormone In The Fasting-Induced Suppression Of Luteinizing Hormone Release In Female Rats. Endocrinology. 134: 1718–22. Maldonado R. 2002 Study Of Cannabinoid Dependence In Animals. Pharmacol. Ther. 95:153–164. Maliekal JC, Jackson GE, Flanagan CA, Millar RP. 1997 Solution conformations of gonadotropin releasing hormone (GnRH) and [Gln(8)]GnRH. S. Afr. J. Chem. 50:217–219. Malven PV and Hansel W. 1964 Ovarian Function In Dairy Heifers Following Hysterectomy. J. Dairy Sci. 47: 1388–1393. Mamluk R, Chen D, Greber Y, Davis JS and Meidan R. 1998 Characterization Of Messenger Ribonucleic Acid Expression For Prostaglandin F2α And Luteinizing Hormone Receptors In Various Bovine Luteal Cell Types. Biol. Reprod. 58: 849– 856. Mani SK, Mitchell A, O’Malley BW. 2001 Progesterone Receptor And Dopamine Receptors Are Required In ∆9-Tetrahydrocannabinol Modulation Of Sexual Receptivity In Female Rats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:1249–1254. Manning JM, Bronson FH. 1991 Suppression Of Puberty In Rats By Exercise: Effects On Hormone Levels And Reversal With Gnrh Infusion. Am. J. Physiol. 260:R717– 23. Marin-Bivens CL, Olster DH. 1999 Opiod Receptor Blockade Promotes Weight Loss And Improves The Display Of Sexual Behaviors In Obese Zucker Femal Rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 63:515–20. Marsh JM. 1976 The Role Of Cyclic AMP In Gonadal Steroidogenesis. Biol. Reprod. 14: 30–53. Marsicano G, Goodenough S, Monory K, Hermann H, Eder M, Cannich A, Azad SC, Cascio MG, Gutierrez SO, van der Stelt M., Lopez-Rodriguez ML, Casanova E, Schutz G, Zieglgansberger W, Di Marzo V, Behl C, Lutz B. 2003 CB1 Cannabinoid Receptors And On-Demand Defense Against Excitotoxicity. Science.302:84–88. Marsicano G, Lutz B. 1999 Expression Of The Cannabinoid Receptor CB1 In Distinct Neuronal Subpopulations In The Adult Mouse Forebrain. Eur. J. Neurosci. 11:4213–4225. Marsicano G, Wotjak CT, Azad SC, Bisogno T, Rammes G, CascioMG, Hermann H, Tang J, Hofmann C, Zieglgansberger W, Di Marzo V, Lutz B. 2002 The Endogenous Cannabinoid System Controls Extinction Of Aversive Memories. Nature. 418:530–534. Martin SJ and Green DR.1995 Protease activation during apoptosis: death by a thousand cuts? Cell. 82:349–352. Martin SJ, Green DR and Cotter TG. 1994 Dicing with death: dissecting the components of the apoptosis machinery. Trends Biochem. Sci. 19: 26–30. 186 Martin-Calderon JL, Munoz RM, Villanua MA, Del Arco I, Moreno JL, Rodriguez de Fonseca F, Navarro M. 1998 Characterization Of The Acute Endocrine Actions Of (-)-11-Hydroxy-∆8-Tetrahydrocannabinol-Dimethylheptyl (HU-210), A Potent Synthetic Cannabinoid In Rats. Eur. J. Pharmacol. 344:77–86. Maruyama K, Endoh H, Sasaki-Iwaoka H, Kanou H, Shimaya E, Hashimoto S, Kato S, Kawashima H. 1998 A novel isoform of rat estrogen receptor beta with 18 amino acid insertion in the ligand binding domain as a putative dominant negative regular of estrogen action. Biochem. Biophys. Res.Commun. 246(1):142-7. Maslar IA, Powers-Craddock P and Ansbacher R. 1986 Decidual Prolactin Production By Organ Cultures Of Human Endometrium: Effects Of Continuous And Intermittent Progesterone Treatment. Biol. Reprod. 34:741–750. Massa F, Marsicano G, Hermann H, Cannich A, Monory K, Cravatt BF, Ferri GL, Sibaev A, Storr M, Lutz B. 2004 The Endogenous Cannabinoid System Protects Against Colonic Inflammation. J. Clin. Invest. 113:1202–1209. Matsuda LA, Lolait SJ, Brownstein MJ, Young AC, Bonner TI. 1990 Structure Of A Cannabinoid Receptor And Functional Expression Of The Cloned Cdna. Nature. 346:561–564. Matsuo H, Baba Y, Nair RM, Arimura A, Schally AV. 1971 Structure of the porcine LH- and FSH-releasing hormone I. The proposed amino acid sequence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 43:1334–1339. Matsuyama S, Chang KT, Kanuka H, Ohnishi M, Ikeda A, Nishihara M and Takahashi M. 1996 Occurrence of deoxyribonucleic acid fragmentation during prolactin-induced structural luteolysis in cycling rats. Biol. Reprod. 54: 1245– 1251. Mattioli M, Conte F, Galeati G, Seren E. 1986 Effect of naloxone on plasma concentrations of prolactin and LH in lactating sows. J. Reprod. Fert. 76:167-73. Maurer RA, Kim KE, Day RN, Notides AC. 1990 Regulation of prolactin gene expression by estradiol. Prog. Clin. Biol. Res. 322:159-169. McCracken JA, Glew ME and Scaramuzzi RJ. 1970 Corpus Luteum Regression Induced By Prostaglandin F2α. J. Clin. Endocrinol. Metab. 30: 544–547. McDonald JK, Lumpkin MD, De Paolo LV. 1989 Neuropeptide Y Suppresses Pulsatile Secretion Of Luteinizing Hormone In Ovariectomized Rats: Possible Site Of Action. Endocrinology. 125:186– 91. McEwen BS, Alves SE. 1999 Estrogen action in the nervous system. Endocrine Rev. 20:297-307. McGuire WJ, Juengel JL and Niswender GD. 1994 Protein Kinase C Second Messenger System Mediates The Antisteroidogenic Effects Of Prostaglandin F2α In The Ovine Corpus Luteum In Vivo. Biol. Reprod. 51: 800–806. Mechoulam R, Ben-Shabat S, Hanus L, Ligumsky M, Kaminski NE, Schatz AR, Gopher A, Almog S, Martin BR, Compton DR,Pertwee RG, Griffin G, Bayewitch M, Barg J, Vogel Z. 1995 Identification Of An Endogenous 2- 187 Monoglyceride, Present In Canine Gut, That Binds To Cannabinoid Receptors. Biochem. Pharmacol. 50:83–90. Medina CL, Nagatani S, Darling TA, Bucholtz DC, Tsukamura H, Maeda K, et al. 1998 Glucose Availability Modulates The Timing Of The Luteinizing Hormone Surge In The Ewe. J. Neuroendocrinol. 10:785– 92. Melis M, Perra S, Muntoni AL, Pillolla G, Lutz B, Marsicano G, Di Marzo V, Gessa GL, Pistis M. 2004 Prefrontal Cortex Stimulation Induces 2-ArachidonoylGlycerol-Mediated Suppression Of Excitation In Dopamine Neurons. J. Neurosci. 24:10707–10715. Melis MR, Mascia MS, Succu S, Torsello A, Muller EE, Deghenghi R, et al. 2002 Ghrelin Injected Into The Paraventricular Nucleus Of The Hypothalamus Of Male Rats Induces Feeding But Not Penile Erection. Neurosci. Lett. 329:339– 43. Mendizabal VE, Adler-Graschinsky E. 2003 Cannabinoid System As A Potential Target For Drug Development In The Treatment Of Cardiovascular Disease. Curr Vasc. Pharmaco.L. 1:301–313. Merari A, Barak A, Plaves M. 1973 Effects Of 1(2)-Tetrahydrocannabinol On Copulation In The Male Rat. Psychopharmacologia. 28:243–246. Mercer JG, Beck B, Burlet A, Moar KM, Hoggard N, Atkinson T, et al. 1998 Leptin (Ob) Mrna And Hypothalamic NPY In Food-Deprived/ Refed Syrian Hamsters. Physiol. Behav. 64:191– 5. Millan M, Aguilera G, Wynn PC, Mendelsohn FAO, Catt KJ. 1985 Autoradiographic localization of brain receptors for peptide hormones: angiotensin II, corticotropin-releasing factor, and gonadotropin-releasing hormone. Methods Enzymol. 124:590-607 Millar RP 2003 GnRH II and type II GnRH receptors. Trends Endocrinol. Metabol. 14:35–43. Millar RP, King JA, Davidson JS, Milton RC. 1987 Gonadotropinreleasing hormone— diversity of functions and clinical applications. S. Afr. Med. J. 72:748–755. Millar RP, King JA. 1987 Structural and functional evolution of gonadotropin-releasing hormone. Int. Rev. Cytol. 106:149–182. Millar RP, King JA. 1988 Evolution of gonadotropin-releasing hormone: multiple usage of a peptide. News Physiol. Sci. 3:49–53. Millar RP, Lu ZL, Pawson AJ, Flanagan CA, Morgan K, Maudsley SR. 2004 Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr. Rev. 25(2):235-75 Millar RP, Troskie B, Sun Y-M, Ott T, Wakefield I, Myburgh D, Pawson A, Davidson JS, Katz A, Hapgood J, Illing N, Weinstein H, Sealfon SC, Peter RE, Terasawa E, King JA. Plasticity in the structural and functional evolution of GnRH: a peptide for all seasons. Advances in comparative endocrinology. Proc XIII International Congress of Comparative Endocrinology, Yokohama, Japan, 1997, pp 15–27. Millar RP, Zhu Y-F, Chen C, Struthers RS. 2000 Progress towards the development of non-peptide orally-active gonadotropin-releasing hormone antagonists: therapeutic implications. Br. Med. Bull. 56:761–772. (GnRH) 188 Millar RP. 2001 GnRHs and GnRH receptors. In: De Groot LJ, Jameson JL, eds. Endocrinology. 4th ed. Philadelphia: W. B. Saunders; 1885. Millar RP. 2002 Gonadotropin-releasing hormones and their receptors. In: Fauser BCJM, ed. Reproductive medicine: molecular cellular and genetic fundamentals. Lancaster, UK: Parthenon Publishing; 199–224. Millar RP. 2005 GnRHs and GnRH receptors. Anim. Reprod. Sci. 88:5–28. Miller DW, Blache D, Martin GB. 1995 The Role Of Intracerebral Insulin In The Effect Of Nutrition On Gonadotropin Secretion In Mature Male Sheep. J. Endocrinol.147:321– 9. Milvae RA and Hansel W. 1980 The Effects Of Prostacyclin (PGI2) And 6-Keto-PGF1a On Bovine Plasma Progesterone And LH Concentrations. Prostaglandins. 20:641–647. Milvae RA and Hansel W. 1983 Prostacyclin, Prostaglandin F2α And Progesterone Production By Bovine Luteal Cells During The Estrous Cycle. Biol. Reprod. 29:1063–1068. Milvae RA, Murphy BD, Hansel W. 1984 Prolongation of the bovine estrous cycle with a gonadotropin-releasing hormone analog. Biol. Reprod. 31:664–670. Minokoshi Y, Haque MS, Shimazu T. 1999 Microinjection Of Leptin Into The Ventromedial Hypothalamus Increases Glucose Uptake In Peripheral Tissues In Rats. Diabetes. 48:287–91. Mitchell DE, Lei ZM and Rao CV. 1991 The Enzymes In Cyclooxygenase And Lipoxygenase Pathways Of Arachidonic Acid Metabolism In Human Corpora Lutea: Dependence Of Luteal Phase, Cellular And Subcellular Distribution. Prostaglandins Leukotrienes Essent. Fatty Acids. 43: 1–12. Miwa M, Tokuda H, Tsushita K, Kotoyori J, Takahashi Y, Ozaki N, Kozawa O and Oiso Y. 1990 Involvement Of Pertussis Toxin-Sensitive GTP-Binding Protein In Prostaglandin F2α−Induced Phosphoinositide Hydrolysis In Osteoblast-Like Cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 171:1229–1235. Miyashita T and Reed JC. 1995 Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell. 80: 293–299. Miyashita T, Krajewski S, Krajewski M, Wang HG, Lin HK, Lieberman DA, Hoffman B and Reed JC. 1994 Tumor suppressor p53 is a regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo. Oncogene. 9: 1799–1805. Moghissi KS. 1992 Clinical applications of gonadotropin-releasing hormones in reproductive disorders. Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 21:125–140 Monje P, Boland R. 2001 Subcellular distribution of native estrogen receptor alpha and beta isoforms in rabbit uterus and ovary. J. Cell. Biochem. 82(3):467-79 Moore JT, McKee DD, Slentz-Kesler K, Moore LB, Jones SA, Horne EL, Su JL, Kliewer SA, Lehmann JM, Willson TM. 1998 Cloning and characterization of human estrogen receptor beta isoforms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 247(1):75-8. 189 Morgan K, Conklin D, Pawson AJ, Sellar R, Ott TR, Millar RP. 2003 A transcriptionally active human type II gonadotropin-releasing hormone receptor gene homolog overlaps two genes in the antisense orientation on chromosome 1q. 12. Endocrinology. 144: 423–436. Morris YA, Crews D. 1990 The Effects Of Exogenous Neuropeptide Y On Feeding And Sexual Behavior In The Red-Sided Garter Snake (Thamnoophis Sirtalis Parietalis). Brain Res. 530:339– 41. Mosselman S, Polman J, Dijkema R. 1996 ER beta: identification and characterization of a novel human estrogen receptor. FEBS Lett. 392(1):49-53. Motta AB, Estevez A, Franchi A, Perez-Martinez S, Farina M, Ribeiro ML, Lasserre A, Gimeno MF. 2001 Regulation of lipid peroxidation by nitric oxide and PGF2α during luteal regression in rats. Reproduction. 121(4):631-637. Moutsatsou P, and Sekeris CE.1997 Estrogen And Progesterone Receptors In The Endometrium. Ann. NY Acad. Sci. 816:99–115. Munro S, Thomas KL, Abu-Shaar M. 1993 Molecular Characterization Of A Peripheral Receptor For Cannabinoids. Nature. 365:61–65. Murahashi K, Bucholtz DC, Nagatani S, Tsukahara S, Tsukamura H, Foster DL, et al. 1996 Suppression Of Luteinizing Hormone Pulses By Restriction Of Glucose Availability Is Mediated By Sensors In The Brainstem. Endocrinology. 137:1171–6. Murdoch WJ and Steadman LE. 1991 Investigations concerning the relationship of ovarian eosinophilia to ovulation and luteal function in the sheep. Am. J. Reprod. Immunol. 25: 81–87. Murdoch WJ, Steadman LE and Belden EL. 1988 Immunoregulation of luteolysis. Med. Hypoth. 27:197–199. Murdoch WJ. 1987 Treatment of sheep with prostaglandin F2α enhances production of a luteal chemoattractant for eosinophils. Am. J. Reprod. Immunol. 15: 52–56. Murphy LL, Steger RW, Smith MS, Bartke A. 1990 Effects Of ∆9 - Tetrahydrocannabinol, Cannabinol And Cannabidiol, Alone And In Combinations, On Luteinizing Hormone And Prolactin Release And On Hypothalamic Neurotransmitters In The Male Rat. Neuroendocrinology. 52:316–321. Nagatani S, Bucholtz DC, Murahashi K, Estacio MAC, Tsukamura H, Foster DL, et al. 1996 Reduction Of Glucose Availability Suppresses Pulsatile LH Release In Female And Male Rats. Endocrinology. 137:1166– 70. Nagatani S, Thompson RC, Foster DL. 2001 Prevention Of Glucoprivic Stimulation Of Corticosterone Secretion By Leptin Does Not Restore High Frequency Luteinizing Hormone Pulses In Rats. J. Neuroendocrinol. 13:371– 7. Nagatani S, Tshukamura H, Murahashi K, Maeda KI. 1996 A rapid suppressive effect of estrogen in the paraventricular nucleus on pulsatile LH release in fasting-ovariectomized rats. J. Neuroendocrino. 8:267-73. 190 Nagatani S, Tsukamura H, Maeda K-I. 1994 Estrogen Feedback Needed At The Paraventricular Nucleus Or A2 To Suppress Pulsatile Luteinizing Hormone Release In Fasting Female Rats. Endocrinology.135: 870– 5. Nagatani S, Tsukamura H, Murahashi K, Maeda KI. 1996 A Rapid Suppressive Effect Of Estrogen In The Paraventricular Nucleus On Pulsatile LH Release In Fasting-Ovariectomized Rats. J. Neuroendocrinol. 8:267– 73. Nakamura T, Sakamoto K. 2001 Reactive oxygen species up-regulates cyclooxygenase-2, p53, and Bax mRNA expression in bovine luteal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 284(1):203-201. Nakazato M, Murakami N, Date Y, Kojima M, Matsuo H, Kangawa K, et al. 2001 A Role For Ghrelin In The Central Regulation Of Feeding. Nature. 409:194– 8. Naor Z, Atlas D, Clayton RN, Forman DS, Amsterdam A, Catt KJ. 1981 Interaction of fluorescent gonadotropin-releasing hormone with receptors in cultured pituitary cells. J. Biol. Chem. 256:3049-3052. Naor Z, Childs GV. 1986 Binding and activation of gonadotropin releasing hormone receptors in pituitary and gonadal cells. Int. Rev. Cytol. 103:147-156. Naor Z, Clayton RN, Catt KJ 1980 Characterization of gonadotropin-releasing hormone receptors in cultured rat pituitary cells.Endocrinology. 107:1144-1152. Naor Z, Jabbour HN, Naidich M, Pawson AJ, Morgan K, Battersby S, Millar MR, Brown P, Millar RP. 2007 Reciprocal cross talk between gonadotropinreleasing hormone (GnRH) and prostaglandin receptors regulates GnRH receptor expression and differential gonadotropin secretion. Mol. Endocrinol. 2:524–537. Naor Z, Schvartz I, Hazum E, Azard A. 1987 Effect of phorbol ester on stimulussecretion coupling mechanisms in gonadotropin-releasing hormone-stimulated pituitary gonadotrophs. Biochem. Biophys. Res. Commun. 148:1312-1322. Naor Z. 1990 Signal transduction mechanisms of Ca2+ mobilizing hormones: the case of gonadotropin-releasing hormone. Endocr. Rev. 11:326-353. Naor Z. 2009 Signaling by G-protein-coupled receptor (GPCR): Studies on the GnRH receptor. Front. Neuroendocrinol. 30:10–29. Narko K, Ritvos O, Ristmaki A. 1997 Induction of cyclooxygenase-2 and prostaglandin F2α receptor expression by interleukin-1β in cultured human granulosa–luteal cells. Endocrinology. 138(11):3638–3644. Narnaware YK, Peter RE. 2001 Neuropeptide Y Stimulates Food Consumption Through Multiple Receptors In Goldfish. Physiol. Behav. 74:185–90. Neill JD, Duck LW, Sellers JC, Musgrove LC. 2001 A gonadotropin- releasing hormone (GnRH) receptor specific for GnRH II in primates. Biochem. Biophys. Res.Commun. 282:1012–1018. Nett TM, Mcclellan MC and Niswender GD. 1976 Effects Of Prostaglandins On The Ovine Corpus Luteum: Blood Flow, Secretion Of Progesterone And Morphology. Biol. Reprod. 15:66–78. 191 Nicosia SV, Diaz J, Nicosia RF, Saunders BO and Muro-Cacho C. 1995 Cell proliferation and apoptosis during development and aging of the rabbit corpus luteum. Ann. Clin. Lab. Sci.. 25(2):143-157. Nieschlag E, Behre HM, Weinbauer GF. 1992 Hormonal male contraception: a real chance? In: Nieschlag E, Habenicht U-F, eds. Spermatogenesis-fertilizationcontraception. Molecular, cellular and endocrine events in male reproduction. Berlin: Springer-Verlag. 477–501. Nillius SJ. 1975 Proceedings: Promotion Of Fertility In Women: Induction Of Ovulation. J. Endocrinol. 66:14P– 5P. Nishizuka Y. 1986 Studies And Perspectives Of Protein Kinase C. Science. 233: 305– 312. Niswender GD and Nett TM. 1994 Corpus Luteum And Its Control In Infraprimate Species. In: The Physiology of Reproduction, Edited By E. Knobil And J. D. Neill. New York: Raven, Vol. 1, P. 781–816. Nothnick WB and Pate JL. 1990 Interleukin-1 is a potent stimulator of prostaglandin synthesis in bovine luteal cells. Biol. Reprod. 43:169–173. Novin D, VanderWeele DA, Rezek M. 1973 Infusion Of 2-Deoxy-D-Glucose Into The Hepatic–Portal System Causes Eating: Evidence For Peripheral Glucoreceptors. Science. 181:858– 60. O’shea JD, Nightingale MG and Chamley WA. 1977 Changes In Small Blood Vessels During Cyclical Regression In Sheep. Biol. Reprod. 17:162–177. Ogawa S, Inoue S, Watanabe T, Hiroi H, Orimo A, Hosoi T, Ouchi Y, Muramatsu M. 1998 The complete primary structure of human estrogen receptor beta (hER beta) and its heterodimerization with ER alpha in vivo and in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 243(1):122-6 Ohashi M, Carr BR and Simpson ER. 1982 Lipoprotein-Binding Sites In Human Corpus Luteum Membrane Fractions. Endocrinology. 110:1477–1482. Ohtani M, Kobayshi S, Miyamoto A, Hayashi K and Fukui Y. 1998 Real-Time Relationships Between Intraluteal And Plasma Concentrations Of Endothelin, Oxytocin, And Progesterone During Prostaglandin F2α-Induced Luteolysis In The Cow. Biol. Reprod. 58:103–108. Oikawa M, Dargan C, Ny T, Hsueh AJW. 1990 Expression of gonadotropin-releasing hormone and prothymosin-α-messenger ribonucleic acid in the ovary. Endocrinology. 127:2350-2356. Okubo K, Amano M, Yoshiura Y, Suetake H, Aida K. 2000 A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 16:298–303. Olofsson J, Norjavaara E and Selstam G. 1992 Synthesis Of Prostaglandin F2α, E2 And Prostacyclin In Isolated Corpora Lutea Of Adult Pseudopregnant Rats Throughout The Luteal Life-Span. Prostaglandins Leukotrienes Essent. Fatty Acids. 46:151–161. 192 Oltvai ZN, Milliman CL and Korsmeyer SJ. 1993 Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerated programmed cell death. Cell. 74:609–619,. Osei-Hyiaman D, DePetrillo M, Pacher P, Liu J, Radaeva S, Batkai S, HarveyWhite J, Mackie K, Offertaler L, Wang L, Kunos G. 2005 Endocannabinoid Activation At Hepatic CB1 Receptors Stimulates Fatty Acid Synthesis And Contributes To Diet-Induced Obesity. J. Clin. Invest. 115:1298–1305. Paavola LG. 1979 The corpus luteum of the guinea pig. IV. Fine structure of macrophages during pregnancy and postpartum luteolysis and the phagocytosis of luteal cells. Am. J. Anat. 154: 337–364. Pagesy P, Li JY, Berthet M, Peillon F. 1992 Evidence of gonadotropin-releasing hormone mRNA in the rat anterior pituitary. Mol. Endocrinol. 6:523-528. Pagotto U, Marsicano G, Cota D, Lutz B, Pasquali R. 2006 The emerging role of the endocannabinoid system in endocrine regulation and energy balance. Endocrine Reviews. 27(1):73-100. Pal D, Miller BT, Parkening TA. 1992 Topographical mapping of GnRH receptors on dispersed mouse pituitary cells bv backscattered electron imaging. Anat. Rec. 233:89-96. Panicker AK, Mangels RA, Powers JB, Wade GN, Schneider JE. 1998 AP Lesions Block Suppression Of Estrous Behavior, But Not Estrous Cyclicity, In FoodDeprived Syrian Hamsters. Am. J. Physiol. 275: R158– 64. Panicker AK, Wade GN. 1998 Insulin-Induced Repartitioning Of Metabolic Fuels Inhibits Hamster Estrous Behavior: Role Of Area Postrema. Am. J. Physiol. 274:R1094–8. Panikashvili D, Mechoulam R, Beni SM, Alexandrovich A, Shohami E. 2005 CB1 Cannabinoid Receptors Are Involved In Neuroprotection Via NF-_B Inhibition. J. Cereb. Blood Flow Metab. 25:477–484. Panikashvili D, Simeonidou C, Ben-Shabat S, Hanus L, Breuer A, Mechoulam R, Shohami E. 2001 An Endogenous Cannabinoid (2-AG) Is Neuroprotective After Brain Injury. Nature.413:527–531 Panzica G. Ipotalamo. in: Fasolo A. Dizionario di biologia ed. UTET; 2004. pp 536-538. Paria BC, Dey SK. 2000 Ligand-Receptor Signaling With Endocannabinoids In Preimplantation Embryo Development And Implantation. Chem. Phys. Lipids. 108:211–220. Paria BC, Ma W, Andrenyak DM, Schmid PC, Schmid HH, Moody DE, Deng H, Makriyannis A, Dey SK. 1998 Effects Of Cannabinoids On Preimplantation Mouse Embryo Development And Implantation Are Mediated By Brain-Type Cannabinoid Receptors. Biol. Reprod. 58:1490–1495. Parker CW. 1991 Neutrophil mechanisms. Am. Rev. Respir. Dis. 143:559–560. Parkington HC. 1983 Electrical Properties Of The Costo-Uterine Muscle Of The GuineaPig. J. Physiol. (Lond.). 335:15–27. Pate JL and Condon WA. 1982 Effects Of Serum And Lipoproteins On Steroidogenesis In Cultured Bovine Luteal Cells. Mol. Cell. Endocrinol. 28:551–562. 193 Pate JL and Condon WA. 1989 Regulation of steroidogenesis and cholesterol synthesis by prostaglandin F2α and lipoproteins in bovine luteal cells. J. Reprod. Fertil. 87:439–446. Pate JL. 1988 Regulation Of Prostaglandin Synthesis By Progesterone In The Bovine Corpus Luteum. Prostaglandins. 36:303–315. Pate JL. 1994 Cellular Components Involved In Luteolysis. J. Anim. Sci. 72:1884–1890. Pati D, Habibi HR. 1992 Characterization of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptors in the ovary of common carp (Cyprinus cuprio). Can. J. Physiol. Pharmacol. 70:268-274 Pepperell JR, Wolcott C and Behrman HR. 1992 Effects of neutrophils in rat luteal cells. Endocrinology. 130:1001–1008. Perera AD, Veralis JG, Mikuma N, Majumdar SS, Plant TM. 1993 Cholecystokinin Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release In The Monkey (Macaca Mulatta). Endocrinology. 132:1723 –8. Perrin MH, Bilezikjian LM, Hoeger C, Donaldson CJ, Rivier J, Haas Y, Vale WW. 1993 Molecular and functional characterization of GnRH receptors cloned from rat pituitary and a mouse pituitary tumor cell line. Biochem. Biophys. Res. Commun. 191:1139-1144. Pertwee RG. 2001 Cannabinoids And The Gastrointestinal Tract. Gut. 48:859–867. Peter RE, Habibi HR, Chang JP, Nakorniak CS, Yu KL, Huang YP, Marchant TA. 1992 Actions of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) in the goldfish. Prog. Clin. Biol. Res. 89:6373-6377. Phariss BB, Cornette JC and Gutnecht GD. 1970 Vascular Control Of Luteal Steroidogenesis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 10:97–103. Pinzone JJ, Stevenson H, Strobl JS, Berg PE. 2004 Molecular and cellular determinants of estrogen receptor alpha expression. Mol. Cell. Biol. 24(11):4605-12. Piomelli D. 2003 The molecular logic of endocannabinoid signaling. Nat. Rev. Neurosci. 4:873-884. Piomelli D. 2003 The Molecular Logic Of Endocannabinoid Signalling. Nat. Rev. Neurosci. 4:873–884. Piper PJ, Vane JR and Wyllie JH. 1970 Inactivation Of Prostaglandins By The Lungs. Nature. 225:600–604. Pittman RC, Khoo JC and Steinberg D. 1975 Cholesterol Esterase In Rat Adipose Tissue And Its Activation By Cyclic Adenosine 39:59-Monophosphate-Dependent Protein Kinase. J. Biol. Chem. 250:4505–4511. Pon LA, Epstein LF and Orme-Johnson NR. 1986 Acute Camp Stimulation In Leydig Cells: Rapid Accumulation Of A Protein Similar To That Detected In Adrenal Cortex And Corpus Luteum. Endocr. Rev. 12: 429–446. Porcella A, Marchese G, Casu MA, Rocchitta A, Lai ML, Gessa GL, Pani L. 2002 Evidence For Functional CB1 Cannabinoid Receptor Expressed In The Rat Thyroid. Eur. J. Endocrinol. 147:255–261. 194 Porter AC, Sauer JM, Knierman MD, Becker GW, Berna MJ, Bao J, Nomikos GG, Carter P, Bymaster FP, Leese AB, Felder CC. 2002 Characterization Of A Novel Endocannabinoid, Virodhamine, With Antagonist Activity At The CB1 Receptor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 301: 1020–1024. Pu S, Jain MR, Kalra PS, Kalra SP. 1998 Orexins, A Novel Family Of Hypothalamic Neuropeptides, Modulate Pituitary Luteinizing Hormone Secretion In An Ovarian Steroid-Dependent Manner. Regul. Pept. 78:133– 6. Rakugi H, Tabuchi Y, Nakamura M, Nagano M, Higashimori K, Makami H, Ogihara T and Suzuki N. 1990 Evidence For Endothelin-1 Release From Resistance Vessels Of Rats In Response To Hypoxia. Biochem. Biophys. Res. Commun. 169:973–977. Ramakrishnappa N, Rajamahendran R, Lin YM, Leung PCK. 2005 GnRH in nonhypothalamic reproductive tissues. Anim. Reprod. Sci. 88:95–113. Redmer DA, and Reynolds LP. 1995 Angiogenesis In The Ovary. Rev. Reprod. 1: 182–192, 1996. Reed JC. 1994 Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J. Cell Biol. 124:1– 6. Reinhart J, Mertz LM, Catt KJ. 1992 Molecular cloning and expression of cDNA encoding the murine gonadotropin-releasing hormone receptors. J.Biol. Chem. 267:21281-21284. Rexroad CE Jr. and Guthrie HD. 1979 Prostaglandin F2α And Progesterone Release In Vitro By Ovine Luteal Tissue During Induced Luteolysis. Adv. Exp. Med. Biol. 112:639–644. Reynolds LP, Killilea S and Redmer DA. 1992 Angiogenesis In The Female Reproductive System. FASEB J. 6: 886–892. Richards JS, and Hedin L. Molecular Aspects Of Hormone Action In Ovarian Follicular Development, Ovulation, And Luteinization. Annu. Rev. Physiol. 50: 441–463. Richards JS, Jahnsen T, Hedin L, Lifka J, Ratoosh S, Durica JM and Goldring NB. 1987 Ovarian Follicular Development: From Physiology To Molecular Biology. Recent Prog. Horm. Res. 43: 231–276. Riley JCM and Behrman HR. 1991 Oxygen radicals and reactive oxygen species in reproduction. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 198: 781–791. Rippel RH, Johnson ES, Kimura ET. 1976 Regression of corpora lutea in the rabbit after injection of a gonadotropin-releasing peptide. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 152:29-32. Ritter RC, Slusser P. 1980 5-Thio-D-Glucose Causes Increased Feeding And Hyperglycemia In The Rat. Am. J. Physiol. 238(2):E141– 4. Rodgers RJ, O’shea JD and Findlay JK. 1983 Progesterone Production In Vitro By Small And Large Ovine Luteal Cells. J. Reprod. Fertil. 69:113–124. Rodgers RJ, Waterman MR and Simpson ER. 1987 Levels of messenger ribonucleic acid encoding cholesterol side-chain cleavage cytochrome P-450, 17a- hydroxylase cytochrome P-450, adrenodoxin, and low density lipoprotein 195 receptor in bovine follicles and corpora lutea throughout the ovarian cycle. Mol. Endocrinol. 1:274–279. Rodriguez de Fonseca F, Cebeira M, Ramos JA, Martin M, Fernandez-Ruiz JJ. 1994 Cannabinoid Receptors In Rat Brain Areas:Sexual Differences, Fluctuations During Estrous Cycle And Changes After Gonadectomy And Sex Steroid Replacement. Life Sci. 54:159–170. Rodriguez de Fonseca F, Fernandez-Ruiz JJ, Murphy LL, Cebeira M, Steger RW, Bartke A, Ramos JA. 1992 Acute Effects Of ∆9- Tetrahydrocannabinol On Dopaminergic Activity In Several Rat Brain Areas. Pharmacol. Biochem. Behav. 42:269–275. Rodriguez JM, Agrasal A, Esquifino A. 1998 Influence of sexual receptivity on LH, FSH and prolactin release after GnRH administration in female rabbits. Anim. Reprod. Sci. 20:57-65. Rodriguez M, Arias P, Refojo D, Feleder C, Moguilevsky J. 1999 Arrest Of Pulsatile Luteinizing Hormone (LH) Secretion During Insulin-Induced Hypoglycemia (IIH): Improvement By Intrahypothalamic Perfusion With Glucose. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 107:257–61. Roemmich JN, Li X, Rogol AD, Rissman EF. 1997 Food Availability Affects Neural Estrogen Receptor Immunoreactivity In Prepubertal Mice. Endocrinology. 138(12):5366– 73. Rossetti L, Massillon D, Barzilai N, Vuguin P, Chen W, Hawkins M, et al. 1997 Short Term Effects Of Leptin On Hepatic Gluconeogenesis And In Vivo Insulin Action. J. Biol. Chem. 272:27758–63. Rueda BR, Tilly KI, Botros IW, Jolly PD, Hansen TR, Hoyer PB and Tilly JL. 1997 Increased bax and interleukin-1b-converting enzyme messenger ribonucleic acid levels coincide with apoptosis in the bovine corpus luteum during structural regression. Biol. Reprod. 56: 186–193. Rueda BR, Tilly KI, Botros IW, Jolly PD, Hansen TR, Hoyer PB, Tilly JL. 1997 Increased bax and interleukin-1β-converting enzyme messenger ribonucleic acid levels coincide with apoptosis in the bovine corpus luteum during structural regression. Biol. Reprod. 56(1):186–193. Rueda BR, Wegner JA, Marion SL, Wahlen DD and Hoyer PB. 1995 Internucleosomal DNA fragmentation in ovine luteal tissue associated with luteolysis: in vivo and in vitro analyses. Biol. Reprod. 52:305–312. Sakamoto K, Ezashi T, Miwa K, Okuda-Ashitaka E, Houtani T, Sugimoto T, Ito S and Hayaishi O. 1994 Molecular Cloning And Expression Of A Cdna Of The Bovine Prostaglandin F2α Receptor. J. Biol. Chem. 269:3881–3886. Sarda AK, Nair RMG. 1981 Elevated levels of LRH in human milk. J. Clin. Endocrinol. Metab. 52:826-828. Savoy-Moore RT, Schwartz NB, Duncan J, Marshall JC. 1980 Pituitary gonadotropin-releasing hormone receptors during the rat estrous cycle. Science. 209:942-944. 196 Sawchenko PE, Swanson LW, Grzanna R, Howe PR, Bloom SR, Polak JM. 1985 Colocalization Of Neuropeptide Y Immunoreactivity In Brain Stem Catecholaminergic Neurons That Project To The Paraventricular Nucleus Of The Hypothalamus. J. Comp. Neurol. 241:138– 53. Sawyer CH, Hilliard J, Kanematsu S, Scaramuzzi R, Blake CA. 1974 Effect of intraventricular infusions of norepinephrine and dopamine on LH release and ovulation in the rabbit. Neuroendocrinology. 15:328-37. Sawyer HR, Niswender KD, Braden TD and Niswender GD. 1990 Nuclear Changes In Ovine Luteal Cells In Response To PGF2α. Domest. Anim. Endocrinol. 7:229– 238. Scallen, T. J., A. Pastuszyn, B. J. Noland, R. Chanderbhan, A. Kharroubi and G. V. Vahouny. 1985. Sterol Carrier And Lipid Transfer Proteins. Chem. Phys. Lipids. 38: 239–261, Schally AV, Arimura A, Baba Y, Nair RM, Matsuo H, Redding TW, Debeljuk L. 1971 Isolation and properties of the FSH and LH-releasing hormone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 43:393–399. Schams D, Berisha B. 2002 Steroids as local regulators of ovarian activity in domestic animals. Domest Anim Endocrinol. 23(1-2):53-65. Scharrer E. 1999 Control Of Food Intake By Fatty Acid Oxidation And Ketogenesis. Nutrition. 9:704– 14. Schmid PC, Paria BC, Krebsbach RJ, Schmid HH, Dey SK. 1997 Changes In Anandamide Levels In Mouse Uterus Are Associated With Uterine Receptivity For Embryo Implantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:4188–4192. Schneider JE, Blum RM, Wade GN. 2000 Metabolic Control Of Food Intake And Estrous Cycles In Syrian Hamsters: I Plasma Insulin And Leptin. Am. J. Physiol. 278:R476– 85. Schneider JE, Buckley CA, Blum RM, Zhou D, Szymanski L, Day DE, et al. 2002 Metabolic Signals, Hormones And Neuropeptides Involved In Control Of Energy Balance And Reproductive Success In Hamsters. Eur. J. Neurosci. 16(3):377–9. Schneider JE, Friedenson DG, Hall A, Wade GN. 1993 Glucoprivation Induces Anestrus And Lipoprivation May Induce Hibernation In Syrian Hamsters. Am. J. Physiol. 264:R573– 7. Schneider JE, Goldman MD, Tang S, Bean B, Ji H, Friedman MI. 1998 Leptin Indirectly Affects Estrous Cycles By Increasing Metabolic Fuel Oxidation. Horm. Behav. 33:217– 28. Schneider JE, Wade GN. 1987 Body Composition, Food Intake, And Brown Fat Thremogenesis In Pregnant Djungarian Hamsters. Am. J. Physiol. 253:R314– 20. Schneider JE, Wade GN. 1989 Availability Of Metabolic Fuels Controls Estrous Cyclicity Of Syrian Hamsters. Science. 244:1326 –8. Schneider JE, Wade GN. 1990 Decreased Availability Of Metabolic Fuelsinduces Anestrus In Golden Hamsters. Am. J. Physiol. 258: R750– 5. 197 Schneider JE, Wade GN. 1990 Decreased availability of metabolic fuels induces anestrus in golden hamsters. Am. J. Physiol. 258:R750–R755. Schneider JE, Watts AG. 2002 Energy Balance, Ingestive Behavior Andreproductive Success. In: Pfaff D, Etgen A, Fahrbach SE, Rubin RT, Editors. Hormones, Brain And Behavior. San Diego (CA): Elsevier. p. 435– 23. Schneider JE, Zhou D, Blum RM. 2000 Leptin And Metabolic Control Of Reproduction. Horm. Behav. 37:306– 26. Schneider JE, Zhou D. 1999 Treatment With SHU9119 Increases Food Intake But Does Not Induce Anestrus In Syrian Hamsters Fed Ad Libitum. Abstr - Soc Neurosci. 415. Schneider JE, Zhu Y. 1994 Caudal Brain Stem Plays A Role In Metabolic Control Of Estrous Cycles In Syrian Hamsters. Brain Res. 661: 70– 4. Schreihofer DA, Amico JKA, Cameron JL. 1993 Reversal Of Fasting-Induced Suppression Of Luteinizing Hormone (LH) Secretion In Male Rhesus Monkeys By Intragastric Nutrient Infusion: Evidence For Rapid Stimulation Of LH By Nutritional Signals. Endocrinology. 132: 1890– 7. Schuel H, Burkman LJ, Lippes J, Crickard K, Forester E, Piomelli D, Giuffrida A. 2002 N-Acylethanolamines In Human Reproductive Fluids. Chem. Phys. Lipids. 121:211–227. Schulz RW, Bosma PT, Zandbergen MA, Van Der Sanden MCA, Van Dijk W, Peute J, Bogerd J, Goos HJT. 1993 Two gonadotropin- releasing hormones in the African catfish, Clarias gariepinus: localization, pituitary receptor binding, and gonadotropin release activity. Endocrinology. 133:1569-1577. Schwartz GJ. 2000 The Role Of Gastrointestinal Vagal Afferents In The Control Of Food Intake. Curr. Prospects Nutr. 16:866–73. Schwartzman RA and Cidlowski JA. 1993 Apoptosis: The Biochemistry And Molecular Biology Of Programmed Cell Death. Endocr. Rev. 14:133–151. Sealfon SC, Laws SC, Wu JC, Gillo B, Miller WL. 1990 Hormonal regulation of gonadotropin-releasing hormone receptors and messenger RNA activity in ovine pituitary culture. Mol. Endocrinol. 4:1980-1987. Sealfon SC, Weinstein H, Millar RP. 1997 Molecular mechanisms of ligand interaction with the gonadotropin-releasing hormone receptor. Endocr. Rev. 18:180–205. Seeburg PH, Mason AJ, Stewart TA, Nikolics K. 1987 The mammalianGnRH gene and its pivotal role in reproduction. Recent. Prog. Horm. Res. 43:69–98. Seppala M, Wahlstrom T. 1980 Identification of luteinizing hormone- releasing factor and alpha subunit of glycoprotein hormones in ductal carcinoma of the mammary gland. Int. J. Cancer. 26:267- 268. Shelton K, Parkinson TJ, Hunter MB, Kelly RW and Lamming GE. 1990 Prostaglandin E-2 As A Potential Luteotropic Agent During Early Pregnancy In Cattle. J. Reprod. Fertil. 90:11–17. Shen M, Piser TM, Seybold VS, Thayer SA. 1996 Cannabinoid Receptor Agonists Inhibit Glutamatergic Synaptic Transmission In Rat Hippocampal Cultures. J. Neurosci. 16:4322–4334. 198 Sherwood N. 1987 The GnRH family of peptides. Trends Neurosci. 10:129–132. Sherwood NM, Lovejoy DA, Coe IR. 1993 origin of mammalian gonadotropinreleasing hormones. Endocr Rev 14:241-254. Sherwood NM, Lovejoy DA, Coe IR. 1993 Origin of mammalian gonadotropinreleasing hormones. Endocr. Rev. 14:241–254. Sherwood NM, Lovejoy DA. 1989 The origin of the mammalian form of GnRH in primitive fishes. Fish Physiol. Biochem. 7:85–93. Shikone T, Yamoto M, Kokawa K, Yamashita K, Nishimori K and Nakano R. 1996 Apoptosis of human corpora lutea during cyclic luteal regression and early pregnancy. J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:2376–2380. Silldorff EP, Yang S and Pallone TL. 1995 Prostaglandin E2 Abrogates EndothelinInduced Vasoconstriction In Renal Outer Medullary Descending Vasa Recta Of The Rat. J. Clin. Invest. 95:2734–2740. Silvia WJ, Lewis GS, Mccracken JA, Thatcher WW and Wilson L Jr. 1991 Hormonal Regulation Of Uterine Secretion Of Prostaglandin F2α During Luteolysis In Ruminants. Biol. Reprod. 45:655–663. Simerly RB, Gorski RA, Swanson LW. 1986 Neurotransmitter Specificity Of Cells And Fibers In The Medial Preoptic Nucleus: An Innumohistochemical Study In The Rat. J. Comp. Neurol. 246:343– 63. Simpson ER and Waterman MR. 1983 Regulation By ACTH Of Steroid Hormone Biosynthesis In The Adrenal Cortex. Can. J. Biochem. Cell. Biol. 61:692–707. Simpson PJ, Fantone JC and Lucchessi BR. 1987. Myocardial ischemia and reperfusion injury: oxygen radicals and the role of the neutrophil. In: Oxygen Radicals and Tissue Injury, edited by B. Halliwell. Bethesda, MD: FASEB, p. 63. Smith CG, Almirez RG, Berenberg J, Asch RH. 1983 Tolerance Develops To The Disruptive Effects Of ∆9-Tetrahydrocannabinol On Primate Menstrual Cycle. Science. 219:1453–1455. Smith CG, Smith MT, Besch NF, Smith RG, Asch RH. 1978 Effect Of ∆9Tetrahydrocannabinol (THC) On Female Reproductive Function. Adv. Biosci. 2223:449–467. Smith GW, Gentry PC, Roberts RM and Smith MF. 1996 Ontogeny and regulation of luteinizing hormone receptor messenger ribonucleic acid within the ovine corpus luteum. Biol. Reprod. 54:76–83. Smith MA, Vale WW. 1981 Desensitization to gonadotropinreleasing hormone observed in superfused pituitary cells on cytodex beads. Endocrinology. 108:752-759. Snook RB, Brunner MA, Saatman RR and Hansel W. 1969 The Effect Of Antisera To Bovine LH In Hysterectomized And Intact Heifers. Biol. Reprod. 1:49–58. Sot B, Freund SM, Fersht AR. 2007 Comparative biophysical characterization of p53 with the pro-apoptotic BAK and the anti-apoptotic BCL-xL. J. Biol. Chem. 282(40):29193-29200. 199 Spies HG, Slyter AL and Quadri SK. 1967 Regression Of Corpora Lutea In Pregnant Gilts Administered Antiovine LH Rabbit Serum. J. Anim. Sci. 26:768–771. Stanislaus D, Pinter JH, Janovick JA, Conn PM. 1998 Mechanisms mediating multiple physiological responses to gonadotropin-releasing hormone. Mol. Cell. Endocrinol. 144(1-2):1-10. Stella N. 2001 How Might Cannabinoids Influence Sexual Behavior? Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:793–795. Stella N. 2001 How might cannabinoids influence sexual behaviour? Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 98:1249-1254. Stella N. 2004 Cannabinoid Signaling In Glial Cells. Glia. 48:267–277. Stevens VL, Xu T and Lambeth JD. 1993 Cholesterol Trafficking In Steroidogenic Cells: Reversible Cycloheximide-Dependent Accumulation Of Cholesterol In A Presteroidogenic Pool. Eur. J. Biochem. 216:557–563. Stocco C, Telleria C, Gibori G. 2007 The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocr. Rev. 28(1):117-49. Stone D and Hechter O. 1954 Studies On ACTH Action In Perfused Bovine Adrenals: Site Of Action Of ACTH On Corticosteroidogenesis. Arch. Biochem. Biophys. 51:457–469. Stradaioli G, Verini-Supplizi A, Monaci M, Canali C, Boiti C. 1997 Effects of different doses of PMSG on ovarian response and in vitro embryo development in rabbit. World Rabbit Sci. 3:143-148. Strinden ST and Shapiro SS. 1983 Progesterone-Altered Secretory Proteins From Cultured Human Endometrium. Endocrinology. 112:862–870. Suarez-Quian CA, Wynn PC, Catt KJ. 1986 Receptor-mediated endocytosis of GnRH analogs: differential processing of goldlabeled agonist and antagonist derivatives. J. Steroid. Biochem. 24:183-192. Sugimoto Y, Hasumoto K, Namba T, Irie A, Katsuyama M, Negishi M, Kakizuku A, Narumiya S and Ichikawa A. 1994 Cloning And Expression Of A Cdna For Mouse Prostaglandin F Receptor. J. Biol. Chem. 269:1356–1360. Sugino N, Okuda K. 2007 Species-related differences in the mechanism of apoptosis during structural luteolysis. J. Reprod. Dev. 53(5):977-986. Sugiura T, Kondo S, Sukagawa A, Nakane S, Shinoda A, Itoh K, Yamashita A, Waku K. 1995 2-Arachidonoylglycerol: A Possible Endogenous Cannabinoid Receptor Ligand In Brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 215:89–97. Sugiura T, Kondo S, Sukagawa A, Tonegawa T, Nakane S, Yamashita A, Waku K. 1996 Enzymatic Synthesis Of Anandamide, An Endogenous Cannabinoid Receptor Ligand, Through N-Acylphosphatidylethanolamine Pathway In Testis: Involvement Of Ca(2+)-Dependent Transacylase And Phosphodiesterase Activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 218:113–117. Swann RT and Bruce NW. 1987 Oxygen Consumption, Carbon Dioxide Production And Progestagen Secretion In The Intact Rat Ovary Of The Day-16 Pregnant Rat. J. Reprod. Fertil. 80:599–605. 200 Symons AM, Teale JD, Marks V. 1976 Proceedings: Effect Of ∆9 - Tetrahydrocannabinol On The Hypothalamic-Pituitary-Gonadal System In The Maturing Male Rat. J. Endocrinol. 68:43P–44P. Szende B, Srkalovic G, Timar J, Mulchahey JJ, Neil1 JD, Lapis K, Csikos A, Szepashazi K, Schally AV. 1991 Localization of receptors for luteinizing hormone-releasing hormone in pancreatic and mammary cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:4153-4156. Szymanski LA, Schneider JE, Rao A, Clarke IJ. 2003 Rapid Restoration Of Luteinizing Hormone Pulses In Refed Chronically Undernourished Ewes Occurs Without Alterations In Plasma Leptin Concentrations. Abstr. – Soc. Neurosci. Takehara Y, Dharmarajan AM, Kaufman G, Wallach EE. 1994 Effect of interleukin 1β on ovulation in the in vitro perfused rabbit ovary. Endocrinology. 134(4):1788-1793. Tamura T, Irahara M, Tezuka M, Kiyokawa M, Aono T. 1999 Orexins, Orexigenic Hypothalamic Neuropeptides, Suppress The Pulsatile Secretion Of Luteinizing Hormone In Ovariectomized Female Rats. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264:759–62. Tan L, Rousseau P. 1982 The chemical identity of the immunoreactive LHRH-like peptide biosynthesized in the human placenta. Biochem. Biophys. Res. Commun. 109:1061-1071. Tandeski TR, Juengel JL, Nett TM and Niswender GD. 1996 Regulation Of Messenger RNA Encoding Low Density Lipoprotein Receptor And High Density Lipoprotein Binding Protein In Ovine Corpora Lutea. Reprod. Fertil. Dev. 8:1107–1114. Tchoudakova A, Pathak S, Callard GV. 1999 Molecular cloning of an estrogen receptor beta subtype from the goldfish, Carassius auratus. Gen. Comp. Endocrinol. 113(3):388-400. Tekpetey FR and Armstrong DT. 1991 Steroidogenic Response Of Rat And Pig Luteal Cells To Estradiol-17b And Catecholestrogens In Vitro. Biol. Reprod. 45:498– 505. Temple JL, Schneider JE, Scott DK, Korutz A, Rissman EF. 2002 Mating Behavior Is Controlled By Acute Changes In Metabolic Fuels. Am. J. Physiol., Regul. Integr. Comp. Physiol. 282(3):782–90. Tezuka N, Ali M, Chwalisz K and Garfield RE. 1995 Changes In The Transcripts Encoding Calcium Channel Subunits Of Rat Myometrium During Pregnancy. Am. J. Physiol. 269 (Cell Physiol. 38):C1008—C1017. Tilly JL. 1997 Apoptosis and the ovary: a fashionable trend or food for thought. Fertil. Steril. 67:226–228. Todo T, Adachi S, Yamauchi K. 1996 Molecular cloning and characterization of Japanese eel estrogen receptor cDNA. Mol. Cell. Endocrinol. 119(1):37-45. 201 Tora L, White J, Brou C, Tasset D, Webster N, Scheer E, Chambon P. 1989 The human estrogen receptor has two independent nonacidic transcriptional activation functions. Cell. 59(3):477-87. Townson DH, O'Connor CL, Pru JK. 2002 Expression of monocyte chemoattractant protein-1 and distribution of immune cell populations in the bovine corpus luteum throughout the estrous cycle. Biol. Reprod.66(2):361-366. Tremblay GB, Tremblay A, Copeland NG, Gilbert DJ, Jenkins NA, Labrie F, Giguère V. 1997 Cloning, chromosomal localization, and functional analysis of the murine estrogen receptor beta. Mol. Endocrinol. 11(3):353-65. Tritos NA, Maratos-Flier E. 1999 Two Important Systems In Energy Homeostasis: Melanocortins And Melanin-Concentrating Hormone. Neuropeptides. 33:339–49. Troskie B, Illing N, Rumbak E, Sun Y-M, Hapgood J, Sealfon S, Conklin D, Millar R. 1998 Identification of three putative GnRH receptor sub-types in vertebrates. Gen. Comp. Endocrinol. 112:296–302. Trott EA, Plouffe L Jr, Hansen K, McDonough PG, George P, Khan I. 1997 The role of p53 tumor suppressor gene and bcl-2 protooncogene in rat corpus luteum death. Am. J. Obstet. Gynecol. 177(2):327-331. Trott EA, Plouffe L, Hansen K, Mcdonough PG, George P and Khan I. 1997 The role of p53 tumor suppressor gene and bcl-2 protooncogene in rat corpus luteum death. Am. J. Obstet. Gynecol. 177: 327–331. Trzeciak WH and Boyd GS. 1974 Activation Of Cholesterol Esterase In Bovine Adrenal Cortex. Eur. J. Biochem. 46:201–207. Tsai SJ and Wiltbank MC. 1997 Prostaglandin F2α Induces Expression Of Prostaglandin G/H Synthase-2 In The Ovine Corpus Luteum: A Potential Positive Feedback Loop During Luteolysis. Biol. Reprod. 57:1016–1022. Tsai SJ and Wiltbank MC. 1998 Prostaglandin F2α Regulates Distinct Physiological Changes In Early And Mid-Cycle Bovine Corpora Lutea. Biol. Reprod. 58:346– 352. Tsai SJ, Wiltbank MC and Bodensteiner KJ. 1996 Distinct Mechanisms Regulate Induction Of Messenger Ribonucleic Acid For Prostaglandin (PG) G/H Synthase2, PGE (EP3) Receptor, And PGF2α Receptor In Bovine Preovulatory Follicles. Endocrinology. 137:3348–3355. Tsai SJ, Wiltbank MC. 1998 Prostaglandin F2α regulates distinct physiological changes in early and mid-cycle bovine corpora lutea. Biol. Reprod. 58(2):346-352. Tscheshe H, Fedrowitz J, Michaelis J and Macartney HW. 1986 Matrix degrading proteinases from human granulocytes: type I, II, III collagenase, gelatinase and type IV collagenase. Folia Histochem. Cytobiol. 61:269–273. Tschop M, Smiley DL, Heiman ML. 2000 Ghrelin Induces Adiposity In Rodents. Nature. 407:908– 13. Tsukamura H, Tsukamura S, Maekawa F, Moriyama R, Reyes BA,Sakai T, et al. 2000 Peripheral Or Central Administration Of Motilin Suppresses LH Release In Female Rats: A Novel Role For Motilin. J. Neuroendocrinol. 12:403–8. 202 Tsukamura S, Tsukamura H, Foster DL, Maeda K-I. 1999 Effect Of CorticotropinReleasing Hormone Suppression Of Antagonist Luteinizing On Oestrogen-Dependent Hormone Secretion In Glucoprivic Female Rats. J. Neuroendocrinol. 11:101– 5. Tsutsumi M, Zhou W, Millar RP, Mellon PL, Roberts JL, Flanagan CA, Dong K, Gillo K, Sealfon SC. 1992 Cloning nad functional expression of a mouse gonadotropin-releasing hormone receptor. Mol. Endocrinol. 6:1163-1169. Turley Jr WA, Floody OR. 1981 ∆9-Tetrahydrocannabinol Stimulates Receptive And Proceptive Sexual Behaviors In Female Hamsters. Pharmacol. Biochem. Behav. 14:745–747. Tyrey L. 1978 ∆9-Tetrahydrocannabinol Suppression Of Episodic Luteinizing Hormone Secretion In The Ovariectomized Rat. Endocrinology. 102:1808–1814. Unger RH, Zhou YT, Orei L. 1999 Regulation Of Fatty Acid Homeostasis In Cells: Novel Role Of Leptin. Proc. Natl. Acad. Sciusa. 96:2327– 32. van der Stelt M, Di Marzo V. 2003 The Endocannabinoid System In The Basal Ganglia And In The Mesolimbic Reward System: Implications For Neurological And Psychiatric Disorders. Eur. J. Pharmacol. 480:133–150. Van Dijk TE, Thiele G. 1999 Glucagon-Like Peptide-1 (7–36) Amide: A Central Regulator Of Satiety And Interoceptive Stress. Neuropeptides. 33:406–14. van Minne J.1988 Production and exocrine secretion of LHRH-like material by the male rat reproductive tract. Peptides. 9:515-518. Vande Wiele RL, Bogumil J, Dyrenfurth I, Ferin M, Jewelewicz R, Warren M, Rizkallah T and Mikhail G. 1970Mechanisms Regulating The Menstrual Cycle In Women. Recent Prog. Horm. Res. 26:63–103. Varvel SA, Lichtman AH. 2002 Evaluation Of CB1 Receptor Knockout Mice In The Morris Water Maze. J. Pharmacol. Exp. Ther. 301: 915–924. Vaskivuo TE, Ottander U, Oduwole O, Isomaa V, Vihko P, Olofsson JI, Tapanainen JS. 2002 Role of apoptosis, apoptosis-related factors and 17betahydroxysteroid dehydrogenases in human corpus luteum regression. Mol. Cell. Endocrinol. 194(1-2):191-200. Wade GN, Jennings G, Trayhurn P. 1986 Energy Balance And Brown Adipose Tissue Thermogenesis During Pregnancy In Syrian Hamsters. Am. J. Physiol. 250:R845–50. Wade GN, Jones JE. 2004 Neuroendocrinology of nutritional infertility. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 287(6):R1277-96. Wade GN, Lempicki RL, Panicker AK, Frisbee RM, Blaustein JD. 1997 Leptin Facilitates And Inhibits Sexual Behavior In Female Hamsters. Am. J. Physiol. 272:R1354– 8. Wade GN, Schneider JE, Friedman MI. 1991 Insulin-Induced Anestrus In Syrian Hamsters. Am. J. Physiol. 260:R148– 52. Wade GN, Schneider JE, Li H-Y. 1996 Control Of Fertility By Metabolic Cues. Am. J. Physiol. 270:E1 –19. 203 Wade GN, Schneider JE. 1992 Metabolic Fuels And Reproduction In Female Mammals. Neurosci. Biobehav. Rev. 16:235– 72. Walter L, Franklin A, Witting A, Wade C, Xie Y, Kunos G, Mackie K, Stella N. 2003 Nonpsychotropic Cannabinoid Receptors Regulate Microglial Cell Migration. J. Neurosc.I. 23:1398–1405. Wang H, Guo Y, Wang D, Kingsley PJ, Marnett LJ, Das SK, DuBois RN, Dey SK. 2004 Aberrant Cannabinoid Signaling Impairs Oviductal Transport Of Embryos. Nat. Med. 10:1074–1080. Wang H, Guo Y, Wang D, Kingsley PJ, Marnett LJ, Das SK, DuBois RN, Dey SK. 2004 Aberrant Cannabinoid Signaling Impairs Oviductal Transport Of Embryos. Nat. Med. 10:1074–1080. Wang J, Liu R, Hawkins M, Barzilai N, Rossetti L. 1998 A Nutrient Sensing Pathway Regulates Leptin Gene Expression In Muscle And Fat. Nature. 393:684–8. Wang J, Paria BC, Dey SK, Armant DR. 1999 Stage-Specific Excitation Of Cannabinoid Receptor Exhibits Differential Effects On Mouse Embryonic Development. Biol. Reprod. 60:839–844. Watanabe K, Yoshida R, Shimizu T and Hayaishi O. 1985 Enzymatic Formation Of Prostaglandin F2α From Prostaglandin H2 And D2. Purification And Properties Of Prostaglandin F Synthetase From Bovine Lung. J. Biol. Chem. 260: 7035–7041. Watanobe H, Suda T, Wikberg JES, Schioth HB. 1999 Evidence That Physiological Levels Of Circulating Leptin Exert A Stimulatory Effect On Luteinizing Hormone And Prolactin Surges In Rats. Biochem. Biophys. Res. Commun. 263:162– 5. Waterman MR. 1995 A Rising Star: An Essential Role In Cholesterol Transport. Science. 267:1780–1781. Weil C, Crin LW, Wilson CE, Cauty C. 1992 Evidence of GnRH receptors in cultured pituitary cells of the winter flounder (Pseudopleuronectes americanus W). Gen. Comp. Endocrinol. 85:156-164 Wenger T, Fernandez-Ruiz JJ, Ramos JA. 1999 Immunocytochemical Demonstration Of CB1 Cannabinoid Receptors In The Anterior Lobe Of The Pituitary Gland. J. Neuroendocrinol. 11:873–878. Wenger T, Fragkakis G, Giannikou P, Probonas K, Yiannikakis N. 1997 Effects Of Anandamide On Gestation In Pregnant Rats. Life Sci. 60:2361–2371. Wenger T, Ledent C, Csernus V, Gerendai I. 2001 The Central Cannabinoid Receptor Inactivation Suppresses Endocrine Reproductive Functions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 284:363–368. Wenger T, Toth BE, Martin BR. 1995 Effects Of Anandamide (Endogen Cannabinoid) On Anterior Pituitary Hormone Secretion In Adult Ovariectomized Rats. Life Sci. 56:2057–2063. West NB, McClellan MC, Sternfeld MD, and Brenner RM. 1987 Immunocytochemistry Versus Binding Assays Of The Estrogen Receptor In The Reproductive Tract Of Spayed And Hormonetreated Macaques. Endocrinology. 121:1789–1800. 204 White RB, Eisen JA, Kasten TL, Fernald RD. 1998 Second gene for gonadotropinreleasing hormone in humans. Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:305–309. William Jr WN, Ceddia RB, Curi R. 2002 Leptin Controls The Fate Of Fatty Acids In Isolated Rat White Adipocytes. J. Endocrinol. 175: 735– 44. Williams CM, Kirkham TC. 1999 Anandamide Induces Overeating: Mediation By Central Cannabinoid (CB1) Receptors. Psychopharmacology (Berl.). 143:315– 317. Williams CM, Kirkham TC. 2002 Reversal Of ∆9-THC Hyperphagia By SR141716 And Naloxone But Not Dexfenfluramine. Pharmacol. Biochem. Behav. 71:333–340. Willie JT, Chemelli RM, Sinton CM, Yanagisawa M. 2001 To Eat Or Sleep? The Role Of Orexin In Coordination Of Feeding And Arousal. Annu. Rev. Neurosci. 24:429– 58. Wilson RI, Nicoll RA. 2002 Endocannabinoid Signaling In The Brain.Science. 296:678– 682 107. Wiltbank JN and Casida LE. 1956 Alteration Of Ovarian Activity By Hysterectomy. J. Anim. Sci. 15:134–140. Wiltbank MC, Belfiore CJ and Niswender GD. 1993 Steroidogenic Enzyme Activity After Acute Activation Of Protein Kinase (PK) A And PKC In Ovine Small And Large Luteal Cells. Mol. Cell. Endocrinol. 97:1–7. Wiltbank MC, Diskin MG and Niswender GD. 1991 Differential Actions Of Second Messenger Systems In The Corpus Luteum. J. Reprod. Fertil. 43, Suppl.: 65–75. Wiltbank MC, Diskin MG, Flores JA and Niswender GD. 1990 Regulation Of The Corpus Luteum By Protein Kinase C. II. Inhibition Of Lipoprotein-Stimulated Steroidogenesis By Prostaglandin F2α. Biol. Reprod. 42:239–245. Wingfield JC, Jacobs JD, Tramontin AD, Perfito N, Meddle S, Maney DL, et al. 2000 Toward An Ecological Basis Of Hormone–Behaviour Interactions In Reproduction Of Birds. In: Wallen K, Schneider JE, Editors. Reproduction In Context: Social And Environmental Influences On Reproduction. Cambridge (MA): MIT Press. Wojtowicz-Praga SM, Dickson RB and Hawkins MJ. 1997 Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Invest. New Drugs. 15: 61–75. Woodside B, Abizaid A, Jafferali S. 1998 Acute Food Deprivation Lengthens Lactational Infertility In Rats And This Effect Is Reduced By Systemic Leptin Administration. Am. J. Physiol. 274:R16553 –8. Woodside B, Abizaid A, Walker C. 2000 Changes In Leptin Levels During Lactation: Implications For Lactational Hyperphagia And Anovulation. Horm. Behav. 37:353–65. Wormald PJ, Eidne KA, Millar RP. 1985 Gonadotropin-releasing hormone receptors in human pituitary: ligand structural requirements, molecular size, and cationic effects. J. Clin. Endocrinol. Metab. 61:1190-1194. Wotjak CT. 2005 Role Of Endogenous Cannabinoids In Cognition And Emotionality. Mini Rev. Med. Chem. 5:659–670. 205 Wren AM, Small CJ, Abbot CR, Dhillo WS, Seal LJ, Cohen MA, et al. 2001 Ghrelin Causes Hyperphagia And Obesity In Rats. Diabetes. 50:2540–7. Wuttke W, Pitzel L, Knoke I, Theiling K and Jarry H. 1997 Immune-Endocrine Interactions Affecting Luteal Function In Pigs. J. Reprod. Fertil. 52, Suppl.: 19– 29. Wuttke W, Theiling K, Hinney B and Pitzel L. 1998 Regulation Of Steroid Production And Its Function Within The Corpus Luteum. Steroids. 63:299–305. Wynne K, Stanley S, McGowan B, Bloom S. 2005 Appetite Control. J. Endocrinol. 184:291–318. Yadav VK, Lakshmi G, Medhamurthy R. 2005 Prostaglandin F2alpha-mediated activation of apoptotic signaling cascades in the corpus luteum during apoptosis: involvement of caspase-activated DNase. J. Biol. Chem.. 18280(11):1035710367. Yamamoto H, Kishi T, Lee CE, Choi BJ, Fang H, Hollenberg AN, et al. 2003 Glucagon-Like Peptide-1-Responsive Catecholamine Neurons In The Area Postrema Link Peripheral Glucagon-Like Peptide-1 With Central Autonomic Control Sites. J. Neurosci. 23:2939– 46. Yoo MS, Kang HM, Choi HS, Kim JW, Troskie BE, Millar RP, Kwon HB. 2000 Molecular cloning, distribution and pharmacological characterization of a novel gonadotropin-releasing hormone ([Trp8]GnRH) in frog brain. Mol. Cell. Endocrinol. 164:197–204. Yuan W, Connor ML and Buhr MM. 1993 Responsiveness of porcine large and small luteal cells to luteotropic or luteolytic hormones and cell morphologic changes during the estrous cycle and pregnancy. J. Anim. Sci. 71:481–491. Yuh KC, Keyes PL. 1982 Relationships between estrogen receptor and estradiolstimulated progesterone synthesis in the rabbit corpus luteum. Bio.l Reprod. 27(5):1049-1054. Zambetti GP and Levine AJ. 1993 A comparison of the biological activities of wildtype and mutant p53. FASEB J. 7: 855– 865. Zerani M, Boiti C, Zampini D, Brecchia G, Dall'Aglio C, Ceccarelli P, Gobbetti A. 2004 Ob receptor in rabbit ovary and leptin in vitro regulation of corpora lutea. J. Endocrinol. 183(2):279-288. Zerani M, Dall'Aglio C, Maranesi M, Gobbetti A, Brecchia G, Mercati F, Boiti C 2007 Intraluteal regulation of prostaglandin F2 alpha-induced prostaglandin biosynthesis in pseudopregnant rabbits. Reproduction. 133(5):1005-1016. Zheng J, Fricke PM, Reynolds LP and Redmer DA. 1994 Evaluation of the growth, cell proliferation, and cell death in bovine corpora lutea throughout the estrous cycle. Biol. Reprod. 51:623–632. Zhou YT, Shimabukuro M, Koyama K, Lee Y, Wang MY, Trieu F, et al. 1997 Induction By Leptin Of Uncoupling Protein-2 And Enzymes Of Fatty Acid Oxidation. Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6386– 90.
