UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PERUGIA
DOTTORATO DI RICERCA IN “INCREMENTO DELLE PRODUZIONI
ZOOTECNICHE E PATOLOGIA DEGLI ANIMALI DA REDDITO”
“XXII” CICLO
settore scientifico disciplinare “VET 02”
"Nuovi aspetti della fisiologia riproduttiva nella coniglia:
effetti della PGF2α e del GnRH sul corpo luteo e dello stress
metabolico sull’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi."
Lorena Lilli
RELATORE:
Cristiano Boiti
COORDINATORE:
Giovanni Vitellozzi
A. A. 2008/09
1
2
3
Indice
Elenco delle abbreviazioni
Introduzione
Asse ipotalamo-ipofisi-gonadi
Ipotalamo
Principali funzioni svolte dall’ipotalamo
Ormoni secreti dall’ipotalamo e la loro funzione
Regolazione dell’attività endocrina ipotalamica
Ipofisi
Secrezione degli ormoni adenoipofisari
Ormoni secreti dall’ipofisi
Azione biologica delle gonadotropine ipofisarie
Controllo della secrezione di gonadotropine ipofisarie da parte
dell’ipotalamo
Regolazione della riproduzione nella femmina
Fisiologia riproduttiva della coniglia
Gravidanza e pseudogravidanza
L’ormone rilasciante le gonadotropine: GnRH
Recettore per il GnRH: GnRH-R
Estrogeni
Recettore degli estrogeni
Pag.
5
6
6
6
7
9
10
12
13
13
14
15
17
19
20
21
23
32
33
Capitolo I
37
Il corpo luteo
Risultati
Discussione
Conclusioni
37
37
39
41
43
47
56
58
58
59
70
88
95
Capitolo II
96
Bilancio energetico nella riproduzione
96
98
Generali azioni del progesterone
Sviluppo del corpo luteo
Pathway steroidogenico luteinico
Regolazione trofica delle funzioni luteali
Luteolisi
Scopo I
Materiali e metodi
Reagenti
Protocollo sperimentale
Effetti energetici sul sistema ipotalamo-ipofisi-gonadi
Effetti energetici sulla motivazione e sull’esecuzione
dell’alimentazione e dei comportamenti riproduttivi
Un sistema per organizzare i fattori che controllano il bilancio
energetico ela riproduzione
103
103
4
Il sistema degli endocannabinoidi
Endocannabinoidi
Recettori per i cannabinoidi
Sintesi, rilascio, assorbimento e degradazione degli
endocannabinoidi: attivazione su richiesta del sistema degli
endocannabinoidi
Segnali inter e intracellulari mediati dagli endocannabinoidi
Cannabinoidi esogeni e endogeni e il loro ruolo nella regolazione
endocrina
Il sistema degli endocannabinoidi nella modulazione del bilancio
energetico
Scopo II
Materiali e metodi
Reagenti
Protocollo sperimentale
Risultati
Discussione
Conclusioni
122
122
123
126
127
128
131
134
135
135
136
141
153
157
Ringraziamenti
Bibliografia
158
159
5
Elenco delle abbreviazioni
HPG: Hypothalamic-pituitary-gonadal axis, asse ipotalamo-ipofi-gonadi
Arc: nucleo arcuato ipotalamico
NTS: nucleo del tratto solitario, ipotalamo
AP: area posteriore, ipotalamo
PVN: nucleo paraventricolare, ipotalamo
VMH: nucleo ipotalamico ventromediale
RNA: acido ribonucleico
POA: area preottica, ipotalamo
mRNA: RNA messaggero
DNA: acido desossiribunucleico
cDNA:DNA complementare
CL: corpo luteo
OVX: ovariectomizzate
P. progesterone
E: estrogeni
AL: coniglie alimentate ad libutum
AL-E: coniglie alimentate ad libitum e tratatte con il 17β-estradiolo
AL-OVX: coniglie alimentate ad libitum e ovariectomizzate
AL-OVX-E: coniglie alimentate ad libitum,ovariectomizzate e tratatte con il
17β-estradiolo
F: coniglie sottoposte a 48 ore di digiuno
F-E: coniglie sottoposte a 48 ore di digiuno
F-OVX: coniglie sottoposte a 48 ore di digiuno e ovariectomizzate
F-OVX-E: coniglie sottoposte a 48 ore di digiuno ovariectomizzate e tratatte
con il 17β-estradiolo
∆9-THC: ∆9-tetraidrocannabinolo, principio attivo della Cannabis sativa
PCR: reazione a catena della polimerasi
IHC: immunoistochimica
WB: western blotting
6
Introduzione
Asse ipotalamo ipofisi gonadi
L’ipotalamo e l’ipofisi formano un’entità funzionale (sistema ipotalamoipofisario) che regola la maggior parte dei processi endocrini dei vertebrati. In
particolare, l’ipotalamo secerne fattori rilascianti e inibenti attraverso le sinapsi
neuroemali dell’eminenza mediana. I capillari presenti in questa regione si
raccolgono in un sistema portale venoso che ha come unico bersaglio l’ipofisi
anteriore o adenoipofisi, ove le vene si capillarizzano nuovamente. Questo
particolare meccanismo impedisce alle sostanze secrete dall’ipotalamo di
disperdersi nella circolazione generale, di conseguenza, esse possono agire
anche a concentrazioni molto basse.
Gli ormoni ipotalamici agiscono in maniera selettiva sui diversi tipi cellulari
presenti nell’ipofisi stimolando o inibendo la secrezione dei rispettivi ormoni.
Nella maggior parte dei casi gli ormoni ipofisari hanno come bersaglio
ghiandole periferiche (gonadi, surrene, tiroide) che sono stimolate a secernere
i loro ormoni. A livello ipotalamico e ipofisario sono presenti recettori per questi
ormoni;
la
loro
attivazione
determina
il
blocco
della
secrezione,
rispettivamente, degli ormoni ipotalamici e/o di quelli ipofisari. Il risultato è
quello di un controllo a retroazione da parte dell’ipotalamo di (quasi) tutto il
sistema endocrino. D’altra parte i nuclei ipotalamici ricevono importanti
informazioni
sensoriali,
ad
esempio
visive
(attraverso
il
nucleo
soprachiasmatico), olfattive (nucleo preottico mediale e corpi mammillari) e
viscerali (nucleo paraventricolare attraverso il lemnisco viscerale) e quindi
l’attività dei neuroni ipotalamici viene fortemente influenzata anche da
molteplici fattori, e la loro azione di controllo nei confronti dell’ipofisi viene
modulata da tali informazioni.
Ipotalamo
L’ipotalamo è la porzione del diencefalo situata ventralmente al talamo, alla
base dell’encefalo: questa regione svolge importanti funzioni di controllo nei
confronti degli organi interni e di un’ampia gamma di comportamenti finalizzati
alla
sopravvivenza
dell’organismo
e
della
specie
(funzioni
vitali
come
l’acquisizione di cibo ed acqua, il mantenimento della temperatura corporea, la
difesa del territorio, il corteggiamento, la scelta sessuale e le cure parentali).
7
Per le funzioni che svolge, l’ipotalamo è spesso considerato il punto di
contatto tra il sistema nervoso e il sistema endocrino, ovvero tra i due sistemi
che servono, nei vertebrati, a regolare le attività di tutto l’organismo.
I confini di questa regione diencefalica sono segnati anteriormente dalla
lamina terminale, inferiormente dal chiasma dei nervi ottici e dall’ipofisi,
caudalmente
dall’inizio
dell’acquedotto
di
Silvio,
mentre
dorsalmente
l’ipotalamo è compreso tra due commessure (anteriore e posteriore) ed è
sovrastato e circondato lateralmente dalla massa del talamo. La regione
compresa tra la commessura anteriore e la lamina terminale viene definita area
preottica ed ha origine dalla vescicola telencefalica, ma, di norma, viene
considerata legata funzionalmente all’ipotalamo. All’area preottica (POA) segue
l’ipotalamo anteriore e successivamente l’ipotalamo medio basale o tuberale,
ed i corpi mammillari. L’organizzazione dei nuclei ipotalamici è piuttosto
complessa e molto spesso anche controversa in quanto, come in molte altre
regioni del tronco encefalico, mancano chiari elementi di confine tra un nucleo
ed un altro. [Panzica, dizionario di biologia].
Principali funzioni svolte dall’ipotalamo
Regolazione cardiocircolatoria
La stimolazione di differenti aree ipotalamiche è in grado di determinare
qualunque tipo di effetto neurogeno noto sul sistema cardiocircolatorio, come
aumento
o
diminuzione
della
pressione
arteriosa,
tachicardia
oppure
brachicardia. In generale, la stimolazione dell’ipotalamo fa aumentare la
pressione arteriosa e la frequenza cardiaca, mentre la stimolazione dell’area
preottica provoca spesso effetti opposti, ossia diminuzione della frequenza
cardiaca e della pressione arteriosa.
Questi fenomeni si attuano principalmente attraverso la mediazione dei
centri di controllo cardiovascolari situati nella formazione reticolare del bulbo e
del ponte.
Regolazione della temperatura corporea
Nell’ipotalamo anteriore, e specialmente nell’area preottica, vi sono ampie
zone coinvolte nella regolazione della temperatura corporea. Quando la
temperatura del sangue che circola attraverso queste aree aumenta, specifici
neuroni termosensibili rispondono con un incremento di attività, mentre
quando la temperatura diminuisce, anche la loro attività si riduce. Questi
8
neuroni a loro volta, controllano i meccanismi responsabili dell’aumento e della
diminuzione della temperatura corporea.
Regolazione del contenuto idrico dell’organismo
L’ipotalamo
regola
il
contenuto
di
acqua
nel
corpo
attraverso
due
meccanismi: 1) generando la sensazione di sete, che spinge il soggetto ad
introdurre liquidi e, 2) controllando l’eliminazione di acqua con le urine.
Un’area denominata centro della sete è situata nell’ipotalamo laterale.
Quando nei neuroni di questo nucleo (o di nuclei ipotalamici associati) la
concentrazione di elettroliti aumenta, il soggetto avverte un forte desiderio di
bere, che lo spingerà a cercare la sorgente più vicina di acqua ed a bere quanto
basta per riportare ai valori normali la concentrazione elettrolitica nei neuroni
del centro della sete.
Il
controllo
dell’eliminazione
renale
di
acqua
viene
invece
assolto
principalmente dai nuclei sopraottici. Quando i liquidi dell’organismo si fanno
troppo concentrati, i neuroni di questi nuclei divengono più attivi e, utilizzando
le connessioni che attraverso l’infundibulo ipotalamico raggiungono l’ipofisi
posteriore, liberano a questo livello l’ormone antidiuretico (o vasopressina).
Quest’ultimo passa nel sangue e va ad agire sui dotti collettori renali,
promuovendo un riassorbimento massivo di acqua e riducendo l’eliminazione
attraverso le urine.
Regolazione della contrattilità uterina e dell’emissione di latte dalla ghiandola
mammaria
La stimolazione dei nuclei paraventricolari provoca la secrezione dell’ormone
ossitocina da parte della neuroipofisi. L’ossitocina, a sua volta, aumenta la
contrattilità dell’utero e provoca anche contrazione delle cellule mioepiteliali
che circondano gli alveoli mammari, rendendo così possibile la fuoriuscita di
latte attraverso i capezzoli.
Alla fine della gravidanza vengono secrete quantità particolarmente elevate
di ossitocina, che concorrono a promuovere le contrazioni uterine del parto.
Successivamente, la suzione della mammella della madre da parte del neonato
dà origine a segnali nervosi che dal capezzolo raggiungono l’ipotalamo dove
provocano la liberazione di ossitocina. Questa, a sua volta, induce l’espulsione
del latte ,rendendolo disponibile per il neonato.
9
Centri che regolano le funzioni gastrointestinali e l’assunzione di cibo
La stimolazione di diverse aree ipotalamiche provoca nell’animale da
esperimento una fame intensa, un appetito vorace, ed una spinta imperiosa a
procacciarsi
il
cibo.
L’area
ipotalamica
laterale
appare
particolarmente
importante nell’insorgenza della sensazione di fame, ed una sua lesione causa
la perdita del desiderio di cibo, talora fino a provocare un’inanizione mortale.
Esiste anche un’area che inibisce il desiderio di cibo. Essa è chiamata centro
della sazietà, e corrisponde al nucleo ventromediale dell’ipotalamo. Se viene
stimolato, questo nucleo, in un animale che sta assumendo cibo, esso cessa
immediatamente di mangiare e mostra una totale indifferenza al cibo. Dopo
distruzione bilaterale di quest’area, invece, non solo l’animale diventa
insaziabile, ma per un eccesso di attività dei suoi centri ipotalamici della fame,
sviluppa un appetito vorace e va incontro a obesità di grado estremo.
Un’altra area dell’ipotalamo che interviene nel controllo delle funzioni
dell’alimentazione è rappresentata dai corpi mammillari, che controllano molti
riflessi connessi all’assunzione di cibo, tra cui il leccamento delle labbra e la
deglutizione.
Il controllo ipotalamico della secrezione dell’ipofisi anteriore
La stimolazione di specifiche aree ipotalamiche promuove la secrezione da
parte di ormoni da parte dell’ipofisi anteriore.
L’ipofisi anteriore riceve sangue principalmente dai vasi che provengono
dalla parte inferiore dell’ipotalamo e vanno ad alimentare i seni capillari
interposti tra le cellule ghiandolari. Nel sangue che scorre attraverso
l’ipotalamo, prima che esso raggiunga l’ipofisi anteriore, vari nuclei ipotalamici
riversano neuropetidi liberatori o inibitori. Questi ultimi a loro volta vengono
trasportati con il sangue all’ipofisi anteriore, dove agiscono sulle cellule
ghiandolari regolando il rilascio dei vari ormoni.
Ormoni secreti dall’ipotalamo e loro funzione
Speciali
neuroni
dell’ipotalamo
sintetizzano
e
secernono
gli
ormoni
ipotalamici liberatori e inibitori che regolano la secrezione dell’adenoipofisi.
Questi neuroni, che hanno il corpo cellulare in varie zone dell’ipotalamo,
inviano i loro assoni nell’eminenza mediana e nel tuber cinereum, quella parte
dell’ipotalamo, cioè, che si continua nel peduncolo ipofisario. Le terminazioni di
queste fibre si differenziano dalla maggior parte delle terminazioni nel sistema
nervoso centrale; infatti, la loro funzione non è quella di trasmettere segnali da
10
un neurone all’altro, ma semplicemente quella di secernere nei liquidi tessutali
gli
ormoni
ipotalamici
liberatori
o
inibitori.
Questi
ormoni
vengono
immediatamente assorbiti nei capillari del sistema portale ipotalamico-ipofisario
e trasportati direttamente ai sinusoidi dell’ipofisi anteriore.
I principali ormoni ipotalamici liberatori e inibitori sono i seguenti:
§
L’ormone
liberatore
della
tireotropina
(TRH:
thyroid-stimulating
hormone re leasing hormone), che induce la liberazione dell’ormone
tireotropo.
§
L’ormone liberatore della corticotropina (CRH: corticotropin releasing
hormone),
che
promuove
la
liberazione
di
ormone
crescita
(GHRH:
growth
adrenocorticotropo.
§
L’ormone
liberatore
dell’ormone
della
hormone releasing hormone), che provoca la liberazione dell’ormone
della crescita, e l’ormone inibitore dell’ormone della crescita (GHIH:
growth hormone inhibitory hormone), chiamato anche somatostatina
, che, invece, ne inibisce la liberazione.
§
L’ormone
liberatore
delle
gonadotropine
(GnRH:
gonadotropin
releasing hormone), che stimola la liberazione sia dell’ormone
luteinizzante (LH) che dell’ormone follicolo stimolante (FSH).
§
Il fattore inibitore della prolattina (PIF: prolactin inhibitory factor),
che inibisce la secrezione di prolattina.
La maggior parte degli ormoni ipotalamici, se non tutti, viene secreta a livello
delle terminazioni nervose nell’eminenza mediana per poi essere trasportata
all’ipofisi anteriore. La stimolazione elettrica dell’eminenza mediana eccita
queste terminazioni nervose e induce la liberazione di tutti gli ormoni
ipotalamici. Però, i pirenofori dei neuroni da cui si originano le fibre che vanno
a terminare nell’eminenza mediana si trovano in altre aree dell’ipotalamo o in
zone della base del cervello strettamente correlate. [Guyton & Hall: Fisiologia
medica].
Regolazione dell’attività endocrina ipotalamica
Le cellule che secernono gli ormoni ipotalamici sono neuroni a tutti gli effetti
e quindi ricevono numerose afferenze nervose, a carattere eccitatorio e
inibitorio. Inoltre, risentono dell’azione e della concentrazione dei neuropeptidi
11
modulatori presenti nel liquido extracellulare e nel liquor. Essendo fuori o al
limite della barriera ematoencefalica esse sono altresì sottoposte all’azione
degli ormoni circolanti e degli ormoni ipofisari, forse anche per effetto della
diffusione retrograda dal circolo portale. Infine, sempre per la loro posizione ai
limiti
della
barriera
concentrazione
di
ematoencefalica,
metaboliti
(glucosio,
risentono
corpi
direttamente
chetonici,
acidi
della
grassi,
concentrazione di Na2+ e di Ca2+), che ne influenzano l’attività.
Una caratteristica comune è l’autoregolazione a feedback (generalmente
negativo), esercitata dai prodotti della secrezione indotta sull’attività delle
cellule ipotalamiche. Si parla di feedback a circuito lungo quando la secrezione
ipotalamica viene inibita dall’ormone liberato all’ultimo anello della catena
endocrina evocata.
Si parla di feedback a circuito breve quando l’azione è esercitata sull’ipofisi,
e di circuito brevissimo quando un ormone ipofisario influenza la secrezione del
proprio principio di liberazione.
Un’altra
importante
caratteristica
della
secrezione
di
alcuni
ormoni
ipotalamici è la liberazione ad impulsi ritmici. I ritmi di secrezione autonomi,
probabilmente dovuti a feedback, sono influenzati da afferenze nervose
connesse all’attività dei centri regolatori dei bioritmi. Gli esempi più noti
riguardano la regolazione della liberazione di CRH, in relazione all’attività
diurna e notturna; di GHRH, in relazione ai ritmi sonno-veglia; di TRH, in
relazione ai ritmi alimentari; di PRL e, negli animali a riproduzione stagionale,
del GnRH, in relazione a ritmi annuali dipendenti dal fotoperiodo. Nel caso del
GnRH, la secrezione, caratteristicamente pulsatile, presenta frequenza ad
ampiezza diverse in relazione alle variazioni della concentrazione plasmatica
degli steroidi sessuali.
Alle
cellule
neuroendocrine
ipotalamiche
confluiscono
numerosissime
terminazioni provenienti da neuroni situati in altre zone encefaliche o
nell’ipotalamo stesso, i quali, liberando i loro neurotrasmettitori, regolano
l’attività secretoria. La regolazione della secrezione dei neuro ormoni e dei
fattori di liberazione ipotalamici è la risultante della sommazione degli stimoli
attivanti o inibenti, mediati da diversi neurotrasmettitori e neuromodulatori.
Le vie colinergiche hanno scarsa influenza diretta sull’attività endocrina
ipotalamica. Stimoli colinergici provocano la liberazione di ADH e PRL;
stimolano inoltre le attività corticali, determinando attenzione e aumento delle
capacità mentali in genere.
I neuroni delle principali vie catecolaminergiche e serotoninergiche che
proiettano sull’ipotalamo sono localizzati in centri del tronco cerebrale, connessi
12
con la sostanza reticolare attivante. Hanno tutti importante azione di
regolazione
endocrina
ipotalamica
e
importanti
effetti
comportamentali,
determinando essenzialmente modificazioni dell’attenzione, delle motivazioni,
dell’umore. [A. Debenedetti, Endocrinologia]
Ipofisi
La ghiandola pituitaria o ipofisi è posta alla base del cranio, in una nicchia
ossea
detta
sella
turgica,
circondata
dalla
dura
madre.
L’ipofisi
è
strutturalmente e funzionalmente divisa in due porzioni: l’adenoipofisi, o lobo
anteriore, è una vera e propria ghiandola endocrina preposta alla sintesi e
secrezione di ormoni trofici; la neuroipofisi, o lobo posteriore, in diretta
connessione con l’ipotalamo tramite l’infundibolo, è deputata al rilascio dei due
peptidi
prodotti
dai
nuclei
magnocellulari
dell’ipotalamo
(ossitocina
e
vasopressina).
La neuroipofisi viene irrorata direttamente da branche delle arterie ipofisarie
mediane
ed
inferiori.
L’adenoipofisi,
nei
mammiferi,
è
il
tessuto
più
vascolarizzato. Il sangue arterioso è fornito dalle carotidi interne, tramite le
arterie ipofisarie mediane e inferiori, che formano una rete di capillari a livello
dell’eminenza mediana dell’ipotalamo, i quali a loro volta si ricombinano nelle
vene del sistema portale.
Esiste anche un certo flusso ematico retrogrado dall’ipofisi all’ipotalamo, che
provvede al meccanismo di feedback degli ormoni ipofisari nei confronti del loro
controllo neuroendocrino.
La neuroipofisi è costituita da terminazioni assoniche dei neuroni dei nuclei
sopraottico e paraventricolare dell’ipotalamo, disperse nella matrice gliare e
intimamente addossate ai capillari.
La popolazione cellulare dell’adenoipofisi è alquanto eterogenea: sulla base
della affinità alla colorazione le cellule secernenti vengono distinte in basofile,
acidofile e cromofobe, anche se tutte, durante la fase di attività secernente, si
mostrano cromofobe o non assumono il colorante per l’assenza di granuli di
secreto. L’immunocitochimica e la microscopia elettronica permettono di
distinguere le cellule adenoipofisarie in base ai loro specifici prodotti di
secrezione (somatotrofe, lattotrofe, tirotrofe, corticotrofe, gonadotrope).
Tutte le cellule secernenti adenoipofisarie sono caratterizzate da un reticolo
endoplasmatico molto sviluppato, con numerosi ribosomi per la sintesi degli
ormoni,
e
da
un
imponente
apparato
del
Golgi,
che
provvede
all’impacchettamento degli ormoni stessi all’interno dei granuli. I granuli di
13
secrezione sono caratteristici delle cellule endocrine che sintetizzano polipeptidi
e catecolamine, e costituiscono un importante e pronto deposito di ormoni
preformati, in condizioni di non attività, al riparo dalla degradazione ad opera
degli enzimi intracitoplasmatici.
Secrezione degli ormoni adenoipofisari
I fattori di liberazione ipotalamici agiscono sugli specifici recettori posti sulla
membrana delle cellule secernenti ipofisarie, con un meccanismo simile a
quello degli altri ormoni peptidici: il legame dell’ormone con il recettore
determina l’attivazione dell’adenilato ciclasi e l’incremento di AMP ciclico
intracellulare. L’AMP ciclico rende le cellule più permeabili agli ioni Ca2+, che
vengono pertanto concentrati nel citoplasma. Il Ca2+ causa l’attivazione dei
microfilamenti citoplasmatici, che determina lo spostamento dei granuli di
secreto verso la periferia della cellula, la loro membrana si fonde con quella
plasmatica,
il
contenuto
viene
riversato
nell’interstizio
per
esocitosi
e
rapidamente passa nei capillari fenestrati per entrare in circolo. L’ormone
sintetizzato in eccesso può essere degradato prima di venire secreto, mediante
un processo detto crinofagia, caratterizzato dalla fusione della membrana dei
granuli con quella lisosomale. [A. Debenedetti, Endocrinologia]
Ormoni secreti dall’ipofisi
Dai differenti tipi di cellule dell’adenoipofisi vengono secreti sei ormoni
principali, e altri di importanza minore; mentre dalla neuroipofisi sono secreti
solo due ormoni. Gli ormoni secreti dalla adenoipofisi hanno ruoli fondamentali
nel controllo delle funzioni metaboliche e riproduttive dell’organismo e sono:
1) L’ormone della crescita (GH: growth hormone) che promuove la
crescita
corporea
agendo
su
molte
funzioni
metaboliche,
specialmente sulla formazione di proteine.
2) L’adrenocorticotropina
(ACTH:
adrenocorticotropic
hormone)
che
controlla la secrezione di alcuni ormoni della corteccia surrenale, che
a loro volta agiscono sul metabolismo del glucosio, delle proteine e
dei lipidi.
3) L’ormone stimolante la tiroide (tireotropina, TSH: thyroid stimulating
hormone) che regola la secrezione di tiroxina e triiodotironina da
parte della tiroide, e questi a loro volta controllano una gran parte
delle reazioni chimiche che avvengono nell’organismo .
14
4) La prolattina (PRL) che promuove lo sviluppo della ghiandola
mammaria e la produzione di latte.
5) L’ormone follicolo stimolante (FSH: follicle stimulating hormone).
6) L’ormone luteinizzante (LH: luteinizing hormone).
Questi ultimi due ormoni vengono detti ormoni gonadotropi e controllano lo
sviluppo delle gonadi e la loro attività durante la funzione riproduttiva.
I due ormoni che vengono secreti dalla neuroipofisi esercitano tutt’altre
funzioni e sono:
1) L’ormone antidiuretico (ADH: antidiuretic hormone; chiamato
anche vasopressina) che controlla la quantità di acqua escreta con
le urine, e quindi concorre alla regolazione del contenuto in acqua
dei liquidi corporei.
2) L’ossitocina che: a) promuove l’eiezione di latte dalle ghiandole
mammarie
attraverso
i
capezzoli
durante
la
suzione
e
b)
interviene, probabilmente, nel meccanismo del parto alla fine della
gestazione. [Guyton & Hall: Fisiologia medica].
Azione biologica delle gonadotropine ipofisarie
Le gonadotropine ipofisarie sono l’ormone luteinizzante (LH) e l’ormone
follicolo-stimolante (FSH). Si tratta di glicoproteine prodotte dalle cellule
basofile adenoipofisarie, dette gonadotrope. Entrambe sono formate da due
catene polipeptidi che, sub unità α e β, di cui la α è identica per i due ormoni,
ed è comune a quella del TSH. Le catene α presentano minime differenze fra
specie diverse, mentre la subunità β, che conferisce la specificità all’ormone,
può presentare differenze legate alla specie. Le gonadotropine circolano nel
sangue in forma libera: l’emivita è di 30-50 minuti per l’LH e di 3-4 ore per
l’FSH.
Sia nei maschi che nelle femmine le gonadotropine sono essenziali per
promuovere lo sviluppo delle gonadi, la steroidogenesi e la produzione dei
gameti. La subunità β è responsabile dello specifico legame al recettore sulla
membrana delle cellule bersaglio, legame che attiva l’adenilato ciclasi e quindi
la produzione di AMP ciclico. L’AMP ciclico attiva una specifica proteinchinasi,
che a sua volta determina la fosforilazione di altri enzimi, effettori dell’azione
biologica .
L’LH viene anche indicato come ICSH (interstitial cells stimulating hormone)
dal momento che stimola le cellule del Leyding a produrre androgeni. A livello
dell’ovaio l’LH stimola la produzione di progesterone da parte del corpo luteo e
15
la sintesi di androgeni ed estrogeni in combinazione con l’FSH; LH favorisce il
passaggio colesterolo-pregnenolone, tappa precoce della sintesi di steroidi, e
quindi stimola la produzione di testosterone sia da parte delle cellule del
Leyding del testicolo, che delle cellule tecali dell’ovaio. Le cellule della
granulosa
convertono
il
testosterone
in
estradiolo
grazie
all’intervento
dell’enzima aromatasi, sotto lo stimolo dell’FSH.
L’FSH è determinante per la maturazione del follicolo,cioè durante il
processo che dal follicolo primario porta al follicolo maturo, in particolare per la
formazione dell’antro. Causa la formazione del liquido follicolare e, in
sinergismo con gli estrogeni, stimola la moltiplicazione e la maturazione delle
cellule della granulosa, nonché la formazione su di esse di recettori sia per
l’FSH che per l’LH.
Le elevate quantità di estrogeni prodotti dal follicolo maturo provocano la
liberazione di gonadotropine, in particolare di LH, da parte dell’ipofisi: il picco
preovulatorio di LH determina la deiscenza del follicolo e l’ovulazione.
Nel maschio, l’effetto dell’LH sulla spermatogenesi è di tipo indiretto, legato
cioè alla produzione di testosterone da parte delle cellule interstiziali.
L’FSH agisce sulle cellule del Sertoli dei tubuli seminiferi, dove stimola la
secrezione di proteine che trasportano gli androgeni (ABP: androgen binding
protein). Queste proteine legano il testosterone, entrato nelle cellule per
diffusione, e lo mantengono in elevata concentrazione nel lume dl tubulo
seminifero,
dove
risulta
determinante
per
la
maturazione
delle
cellule
germinali.
Controllo della secrezione di gonadotropine ipofisarie da parte
dell’ipotalamo
La secrezione di gonadotropine da parte dell’ipofisi anteriore è controllata da
un unico fattore ipotalamico, il decapeptide GnRH (gonadotropin releasig
hormone). Giunto all’adenoipofisi tramite il sistema portale, il GnRH agisce
stimolando sia la secrezione di gonadotropine che la loro sintesi, sia
aumentando la sensibilità delle cellule gonadotrope al GnRH stesso. Tutti gli
effetti sono mediati dall’aumento del Ca2+ intracellulare (entrata nelle cellule
del LEC e mobilizzazione dai depositi intracellulari).
La secrezione basale o tonica di GnRH, e quindi di gonadotropine, è di tipo
pulsatile, specialmente per quanto riguarda l’LH, con emissioni intermittenti ad
intervalli di circa un’ora, la cui frequenza e l’ampiezza è variabile a seconda
della specie, dell’età, dello stadio del ciclo estrale e di molteplici fattori
16
ambientali
(alimentazione,
stagione,
fotoperiodo,
temperatura,
tipo
di
allevamento, ecc.).
Nelle femmine ad ovulazione spontanea, durante la fase estrale si verifica
una caratteristica scarica di gonadotropine (prevalentemente LH), detta
secrezione fasica o anche «picco preovulatorio dell’LH», che è responsabile
dell’ovulazione.
Tale
aumento
preovulatorio
è
indotto
dalle
elevate
concentrazioni di estrogeni provenienti dal follicolo maturo, che agiscono a
livello dell’asse ipotalamo-ipofisi con un meccanismo di feedback positivo.
Esistono
nell’ipotalamo
due
centri
di
controllo
della
liberazione
di
gonadotropine. Il centro per la secrezione tonica o basale è costituito da
neuroni situati nel nucleo arcuato e nel nucleo ventromediale, con terminazioni
distribuite nell’eminenza mediana. Tale centro è sensibile ad un feedback
negativo esercitato dagli steroidi sessuali circolanti, e probabilmente, dalle
stesse gonadotropine; il feedback negativo degli estrogeni può agire inoltre a
livello ipofisario, sulle cellule gonadotrope. Il centro ipotalamico per la
liberazione preovulatoria di gonadotropine è situato nelle aree ipotalamiche
anteriori (preottiche e soprachiasmatiche) ed è invece regolato a feedback di
tipo positivo da parte degli estrogeni. Durante il periodo di anestro post-partum
delle femmine in lattazione questo feedback positivo può essere inibito da
fattori neuroendocrini connessi allo stimolo della suzione.
In alcune specie (gatto, coniglio, visone, furetto, scoiattolo, dromedario) il
picco preovulatorio di LH e la conseguente deiscenza del follicolo non
avvengono spontaneamente, ma sono provocati soltanto dalla stimolazione di
recettori vaginali durante il coito («ovulazione indotta»). Si instaura infatti un
riflesso
neuroendocrino
in
cui
gli
impulsi
nervosi
afferenti
giungono
all’ipotalamo, sollecitando la liberazione di GnRH, cui segue quella delle
gonadotropine ipofisarie.
Nel maschio è noto da tempo un altro fattore di regolazione, l’inibina, che
svolge azione inibitoria sul rilascio di FSH. L’inibina è una molecola proteica
prodotta probabilmente dalle cellule del Sertoli che, con un meccanismo di
feedback negativo sull’asse ipotalamo-ipofisi, modula la secrezione di FSH,
inviando informazioni in base allo stato ed all’entità dell’attività spermatogenica
dei tubuli seminiferi. L’inibina viene prodotta anche nella femmina, nel follicolo
ovarico; la sua concentrazione è parallela a quella degli estrogeni e,
analogamente al maschio, ha la funzione di inibire la secrezione di FSH senza
modificare quella della LH.
Le gonadotropine ipofisarie e quindi l’attività sessuale degli animali sono
comunque regolate da una complessa e complicata varietà di fattori nervosi,
17
psichici, endocrini, metabolici, ambientali, che interagiscono a vari livelli
dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi. [A. Debenedetti, Endocrinologia].
Regolazione della riproduzione nella femmina
I periodi in cui non si svolgono attività cicliche regolari (anestro)
costituiscono la maggior parte della vita di una femmina fertile normale. Il
periodo giovanile e quelli di anestro gestazionale e di allattamento sono assai
maggiori di quelli relativamente brevi dell’attività ciclica.
I principi generali dell’endocrinologia della riproduzione nelle varie specie
sono i medesimi, ma esistono comunque delle differenze: alcuni animali sono
poliestrali annuali (bovini, suini), altri sono poliestrali stagionali (equini, ovini,
felini). Il cane è monoestrale stagionale. Altre differenze sono riferibili al tipo di
ovulazione. La maggior parte degli animali ha un’ovulazione spontanea mentre
nel gatto, nel coniglio, e nel dromedario l’ovulazione è indotta dalla
stimolazione dei recettori sensoriali della vagina e cervice durante il coito.
Il processo riproduttivo nei mammiferi è regolato da una complessa e solo
parzialmente compresa “cascata “ di processi, regolati dal sistema nervoso
centrale (SNC), da un certo numero di tessuti secretori, tessuti bersaglio e
numerosi ormoni.
Il sistema nervoso centrale riceve informazioni dall’ambiente che circonda
l’animale (segnali esterni: visivi, olfattivi, uditivi, tattili) e li convoglia, quando
importanti ai fini riproduttivi, alle gonadi attraverso l’asse ipotalamo-ipofisigonadi.
L’ipotalamo e l’ipofisi sono strutture strettamente connesse con la parte
ventrale del cervello. Ambedue le strutture sono, non solo, organi produttori di
ormoni ma, anche organi bersaglio che costituiscono un sistema omeostatico a
feedback, grazie al quale la maggior parte degli ormoni regola il proprio livello
di secrezione.
Nell’ipotalamo i neuroni endocrini producono, stimolati dal SNC, il GnRH.
Attraverso il sistema portale ipotalamo-ipofisario, il GnRH raggiunge il lobo
anteriore dell’ipofisi, dove stimola le cellule gonadotrofe a secernere l’FSH e
l’LH. GnRH, FSH, LH vengono secreti ad intervalli, con ritmo pulsatile. L’FSH
stimola lo sviluppo dei follicoli ovarici, nella cui teca interna l’LH induce la
sintesi dell’androstenedione a partire dal colesterolo. L’androstenedione viene
convertito a testosterone che nelle cellule della granulosa del follicolo, sotto
l’influsso del FSH viene trasformato in composto aromatico: il 17 β-estradiolo.
18
L’estradiolo
possiede
un
feedback
positivo
su
ipotalamo
e
ipofisi,
aumentando la frequenza di emissione pulsatile del GnRH.
Al di sopra del livello soglia di estradiolo, l’ipotalamo risponde con la
produzione di GnRH che induce a sua volta la produzione di LH e questo dà
inizio alla ovulazione. Un altro effetto importante dell’estradiolo è l’induzione
dei segni dell’estro. L’estro può essere definito come l’insieme dei sintomi
comportamentali e fisici che segnalano ai soggetti della stessa specie che la
femmine è in fase fertile e che consentirà all’accoppiamento.
Le cellule della granulosa producono anche sostanze inibenti (inibina). Non
sono conosciuti tutti gli effetti di questo ormone, ma il suo nome si deve
all’effetto di feedback negativo sul rilascio del FSH da parte dell’ipofisi, che
controlla in tal modo lo sviluppo follicolare.
Dopo l’ovulazione ciò che resta del follicolo viene trasformato in corpo luteo
sotto l’effetto dell’LH. La cavità follicolare viene riempita da vasi sanguigni e le
cellule della granulosa aumentano il proprio volume. Il corpo luteo è
soprattutto un organo secernente che produce progesterone e ossitocina. Il
progesterone è l’ormone maggiormente responsabile del mantenimento della
gravidanza. Esso fa diminuire il rilascio pulsatile di GnRH e inibisce così nuove
ovulazioni, inoltre prepara l’endometrio all’annidamento dell’embrione in
formazione e inibisce contrazioni incontrollate della parete uterina.
Se l’ovulo che viene rilasciato dal follicolo durante l’ovulazione non viene
fecondato, l’animale non riceverà un segnale di gravidanza dall’embrione e, a
circa 16 giorni
dall’ovulazione, l’endometrio dell’utero non gravido secernerà la prostaglandina
F2α (PGF2α), ormone luteolitico che avvia la regressione del corpo luteo.
Il meccanismo luteolitico delle prostaglandine non è del tutto spiegato, ma
implica
una
riduzione
dell’irrorazione
sanguigna
del
corpo
luteo
per
vasocostrizione e un effetto diretto della PGF2α sulle cellule luteali. Anche
l’ossitocina prodotta nel corpo luteo si pensa possa giocare un ruolo nella
luteolisi. Come risultato della regressione del corpo luteo la concentrazione di
progesterone nel sangue diminuirà e il blocco del progesterone sul rilascio del
GnRH ipotalamico cesserà. Ciò da inizio ad una nuova fase follicolare e infine
allo sviluppo di un follicolo pre-ovulatorio. Il periodo della maturazione del
follicolo, dall’estro e dell’ovulazione, che sono caratterizzati da produzione di
estradiolo, viene chiamata fase follicolare del ciclo. La fase dominata dal
progesterone, che va dall’ovulazione fino alla luteolisi, viene denominata fase
luteale.
19
Fisiologia riproduttiva della coniglia
La fisiologia riproduttiva della coniglia è caratterizzata da un’ovulazione non
spontanea ma indotta dall’accoppiamento. La femmina viene considerata in
estro più o meno permanente, e l’ovulazione si verifica in concomitanza con
l’accoppiamento: si definisce in estro se accetta il maschio; in diestro se lo
rifiuta. Numerose osservazioni hanno evidenziato un’alternanza di periodi di
estro e di diestro, ma è difficile prevederne la durata e individuare tutti quei
fattori ambientali e ormonali che l’influenzano. È stato comunque accertato che
il 90% delle femmine con vulva rossa accettano il maschio e ovulano, mentre
questi eventi si verificano solo nel 10% delle coniglie con vulva bianca. Quindi,
il colore della vulva è un buon indicatore dell’estro ed esprime la recettività
delle femmine, confermata dalla posizione di lordosi che assume in presenza
del maschio.
La coniglia può restare in estro parecchi giorni consecutivi; successivamente
i follicoli che hanno raggiunto lo stadio finale di maturazione regrediscono e
vengono rimpiazzati da nuovi follicoli, che restano qualche giorno allo stadio
preovulatorio
prima
di
regredire
anch’essi.
Le
condizioni
di
estro
e
l’accettazione del maschio possono verificarsi anche durante la gestazione,
soprattutto nella seconda metà; l’accoppiamento non ha conseguenze negative
sui feti e non è mai seguito da una nuova gravidanza, come si verifica nella
lepre (superfetazione).
Normalmente l’ovulazione è indotta dagli stimoli associati al coito. Il riflesso
ovulatorio si esplica attraverso due vie: la via nervosa o afferente che
trasmette lo stimolo al sistema nervoso centrale; la via umorale o efferente che
trasferisce l’ordine all’ovaia. La sede di destinazione delle via afferente è
l’ipotalamo (campo copulocettivo) che integra l’informazione con altri messaggi
interni (livello di steroidi) ed esterni (olfattivi, gustativi, visivi, uditivi); nella
femmina pluripara questo insieme è confrontato con gli elementi contenuti
nella memoria.
L’ipotalamo libera allora picogrammi di ormone rilasciante le gonadotropine
(GnRH) che, attraverso il circolo sanguigno, raggiunge l’ipofisi anteriore
stimolando il rilascio, da parte delle cellule basofile, delle gonadotropine FSH e
LH. L’FSH determina la maturazione finale del follicolo (1,2-1,5 mm), con
formazione di un ovulo aploide; sembra inoltre che influenzi il riflesso
ovulatorio amplificando l’azione dell’LH. L’aumento del livello plasmatico di FSH
è evidente nel 2° minuto dopo il coito, ma il valore massimo viene raggiunto
tra 50 minuti e 2 ore dallo stesso.
20
L’LH
è
responsabile
dell’ovulazione
che
avviene
10-12
ore
dopo
l’accoppiamento per deiscenza del follicolo di Graaf. L’LH stimola, inoltre, la
produzione
di
estradiolo,
progesterone,
20α diidrossiprogesterone
e
prostaglandine.
Il GnRH induce anche la liberazione di ossitocina che favorisce l’ovulazione.
Dopo 4-5 ore dal coito il livello di LH è tornato al valore minimo, mentre tra
le 16 e le 22 ore si riscontra un altro picco di FSH, che induce la formazione di
nuovi follicoli, pronti per le successive ovulazioni. Questi follicoli avranno una
funzione luteotrofa fondamentale, mediata dall’17-β estradiolo, sui corpi lutei
già a partire dalla quinta o sesta giornata dall’ovulazione.
Gravidanza e Pseudogravidanza
Nel coniglio la gestazione ha una durata di 30-33 giorni. La razza ha una
certa incidenza sulla sua variabilità. Il mantenimento della gravidanza, durante
tutto il periodo di gestazione, è garantito dal progesterone. Nel coniglio, l’unica
fonte di progesterone è il corpo luteo (CL). La durata dell’attività steroidogenica
del CL, si mantiene approssimativamente per 30-32 giorni, durante i quali
assicura
la
sintesi
del
progesterone
necessario
al
mantenimento
della
gravidanza.
Se all’ovulazione non è associata la fertilizzazione, nelle coniglie s’instaura
una pseudogravidanza, con un blocco dell’attività riproduttiva per 15-18 giorni,
poiché i CL, che si formano in seguito all’ovulazione, persistono e continuano a
sintetizzare e rilasciare progesterone, e regrediscono solamente verso il 15-18°
giorno.
21
L’ormone rilasciante le gonadotropine: GnRH
Il GnRH è il regolatore centrale della cascata ormonale riproduttiva ed è
stato isolato per la prima volta dall’ipotalamo di mammifero come decapeptide
(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly.NH2) [Schally et al.,1971, Matsuo
et al.,1971, Baba et al.,1971].
Il GnRH è processato enzimaticamente nei neuroni ipotalamici da un
polipeptide precursore ed immagazzinato in granuli di accumulo trasportati
lungo gli assoni alle zone esterne dell’eminenza mediana [Fink et al.,1988,
Seeburg et al.,1987].
Il peptide è rilasciato in impulsi sincronizzati dalle terminazioni nervose di
circa 1000 neuroni nel sistema ipofisario portale ogni 30-120 minuti per
stimolare la biosintesi e la secrezione di LH ed FSH dalle cellule gonadotrofe
ipofisarie [Fink et al., 1988].
Ogni impluso di GnRH stimola un impulso di rilascio di LH, ma gli impulsi di
FSH
sono
meno
distinti.
Nonostante
LH
sia
conservato
ed
altamente
dipendente da GnRH per la secrezione, FSH tende ad essere secreto
costitutivamente ed è più dipendente dalla biosintesi per la sua secrezione. La
frequenza degli impulsi è maggiore nella scarica ovulatoria di LH e minore
durante la fase luteale del ciclo ovario.
Lo schema asincrono del rilascio di LH e FSH risulta da cambiamenti nella
frequenza degli impulsi di GnRH, modulando gli effetti degli steroidi gonadali e
degli ormoni peptidici sulle risposte di LH e FSH a GnRH, e sulle differenze nelle
emivite dei due ormoni.
Basse dosi di GnRH sintetico, somministrato in maniera pulsatile per
simulare i livelli endogeni di GnRH nei vasi portali (pg/mL) ripristinano la
fertilità in donne ed uomini ipogonadici e sono anche effettivi nel trattamento
dei testicoli non discesi e della pubertà ritardata. Al contrario, alte dosi di
GnRH, o di agonisti analoghi, desensibilizzano le cellule gonadotrope con il
risultante calo di LH e FSH e la diminuzione nelle funzioni ovariche e testicolari.
Questo fenomeno di desensibilizzazione è spesso applicato nella medicina
clinica per la terapia di un’ampia gamma di patologie[Millar et al., 1987;
Casper,1991; Conn e Crowley,1991, Barbieri,1992; Moghissi,1992; Conn e
Crowley,1994; Filicori,1994; Emons e Schally,1994] .
Gli antagonisti del peptide GnRH inibiscono il sistema riproduttivo tramite
competizione con il GnRH endogeno per il legame con i propri recettori [Millar
et al.,2000].
22
In aggiunta alle applicazioni terapeutiche, gli analoghi del GnRH possono
essere utilizzati come un nuova generazione di contraccettivi maschili e
femminili sostituendo gli ormoni steroidei [Nieschlang et al.,1992; Fraser,1993;
Anderson e Baird,2002].
Le varie applicazioni degli analoghi di GnRH hanno attivato molti studi sulla
fisiologia, biologia cellulare, e funzione molecolare di questo ormone. Il
clonaggio dei recettori per il GnRH (GnRH-R) ha accelerato i progressi nella
comprensione delle relazioni attività-struttura del complesso recettori-ligandi
dovute a mutagenesi e nello sviluppo di molecole non peptidiche antagoniste
[Seaflon et al.,1997; Flanagan et al.,1997; Millar,2001; Millar,2002].
Struttura di GnRH
Nonostante si ritenesse che il GnRH di mammifero isolato dall’ipotalamo
fosse una struttura unica con un ruolo primario nella regolazione di LH e FSH, è
diventato sempre più chiaro che nei vertebrati coesistono diverse forme [King e
Millar,1979; King e Millar,1980] Ciò ha portato all’identificazione di strutturale
di 23 differenti forme di GnRH [Millar,2001; Millar,2002;King e Millar,1995;
King
e
Millar,1997;Millar
e
King,1988;
King
e
Millar,1987;Millar
et
al.,1997;Sherwood,1987;Sherwood e Lovejoy,1989; Sherwood et al.,1993;Yoo
et al., 2000;Okubo et al.,2000; Iwakoshi et al.,2002].
Queste molecole sono distribuite in un’ampia gamma di tessuti nei
vertebrati
nei
quali
apparentemente
svolgono
diverse
funzioni
di
tipo
neroendocrino (come per il rilascio di GH in alcune specie di pesce), paracrino
(nella placenta e nelle gonadi), autocrino (nei neuroni GnRH, nelle cellule
immunitarie,
nei
tumori
della
prostata
e
della
mammella),
e
ruoli
neurotrasmettitori/neuromodulatori nel sistema nervoso centrale e periferico
[Millar et al.,2004].
Poiché nessuna di queste comunicazioni tra cellula segnalatrice e cellula
bersaglio è mediata dalla secrezione di GnRH nella circolazione generale, una
singola forma di GnRH è teoricamente capace di servire tutti questi ruoli.
Comunque, è evidente che almeno due, e generalmente tre, forme di GnRH
sono presenti nella maggioranza delle specie di vertebrati fin qui studiate.
La più ubiquitaria è il GnRH II “di pollo” (così denominato perché isolato la
prima volta dal cervello di questo animale). Poiché il GnRH II ha una struttura
conservata dagli osteitti all’uomo, è probabile che sia la forma che si è evoluta
per prima e che sia quella dal ruolo principale. Questa forma è stata definita
23
GnRH II, mentre la forma ipotalamica è definita tipo I. Una terza forma di
GnRH è presente solo negli osteitti ed è definita GnRH III.
Gli amminoacidi N-terminali (pGlu-His-TrP-Ser) e quelli COOH-terminali
(Pro-Gly.NH2) si sono conservati per circa i 600 milioni d’anni d’evoluzione dei
cordati. Il GnRH I mostra una variazione considerevole nelle posizioni 5, 7, ed
8, il che influenza la selettività del ligando [Millar et al.,2004;Iwakoshy et
al.,2002].
La conservazione della lunghezza del peptide e dell’estremità ammino e
carbossi terminale indicano che queste caratteristiche sono molto importanti
per il legame e l’attivazione dei recettori. Viceversa, la considerevole variabilità
nella posizione 8 del GnRH naturale (Arg, Gln, Trp, Ser, Thr, Asn, Leu, Tyr, Lys,
Ala, Trp) suggerisce che, virtualmente, in questa posizione ogni residuo è
tollerato. Tuttavia, non è questo il caso del recettore di tipo I ipofisiario di
mammifero, il quale richide l’arginina in posizione 8 per legami ad alta affinità
[Seaflon et al.,1997;Karten e Rivier,1986].
I peptidi corti, come il GnRH, sono altamente flessibili in soluzione ed
esistono come in equilibrio fra numerose conformazioni in funzione delle
interazioni molecolari, delle influenze locali dei solventi come l’acqua, dei lipidi,
e anche in relazione all’iniziale interazione col recettore stesso [Maliekai et
al.,1997;Chary et al.,1986; Guarnieri e Weinstein,1996]. Comunque, tra
queste conformazioni, ce ne sono di cosiddette bioattive che rappresentano
strutture più favorevoli per l’interazione con il recettore.
I residui ammino-terminali di GnRH sono coinvolti nell’attivazione del
recettore, e modificazioni di questi residui in GnRH portano alla produzione di
analoghi
con
proprietà
antagonistiche
[Seaflon
et
al.,1997;
Karten
e
Rivier,1986].
Recettore per il GnRH: GnRH-R
Diversi aspetti del recettore per il GnRH (GnRH-R) è le sue proprietà di
trasduzione del segnale sono stati descritti [Clayton et al.,1981; Conn et
al,1986; Huckle et al.,1988; Hazum et al.,1988; Naor et al.,1990]. Il ruolo del
Ca2+ come secondo messaggero e del diacilglicerolo (DAG) [Clayton et al,1981]
come potenziale amplificatore della segnalazione di Ca2+ in cellule stimolate da
GnRH sono stati oggetto di numerosi studi [Conn et al.,1986].
Inoltre, la trasduzione del segnale in cellule bersaglio stimolate da GnRH è
un esempio di via fosfolipide-indipendente: è stata descritta un’interazione fra
il Ca2+ citoplasmatico e la proteina chinasi C (PKC) nel controllo della sintesi di
24
gonadotropine e nel loro rilascio, così come la partecipazione della fosfolipasi D
(PLD), l’acido arachidonico (AA) e i suoi metaboliti nella segnalazione indotta
da GnRH. [Naor et al., 1990]
Dall’inizio degli anni ’90 c’è stato un aumento esplosivo nell’informazione
riguardante il GnRH-R e le proprietà di segnalazione. Il DNA complementare
(cDNA) del recettore GnRH umano è stato clonato e isolato per codificare
un'unica variante della struttura a sette domini transmembrana che è
caratteristica dei recettori per gli ormoni peptidici che segnalano attraverso
proteine G eterotrimeriche. Il legame del GnRH ai suoi recettori porta alla
stimolazione di molteplici attività fosfolipasiche nella membrana plasmatica. Gli
agonisti del GnRH, legandosi al GnRH-R, portano all’attivazione di diverse vie di
trasduzione del segnale. Nelle cellule gonadotrofe, GnRH attiva la PLC, via
Gq/11α,
portando all’idrolisi del fosfatidilinositolo 4,5 bifosfato legato alla
membrana, ad inositolo 1,4,5 trifosfato e al diacilglicerolo, che mobilizza il
calcio intracellulare ed attiva le PKC, rispettivamente. Queste a loro volta
stimolano la biosintesi e la secrezione delle gonadotropine, LH e FSH.
Queste vie di segnalazione intracellulare sono ben note. Tuttavia, ci sono
nuove prove sperimentali che indicano come differenti ligandi GnRH (o analoghi
del GnRH) portino ad interazioni preferenziali con diverse proteine intracellulari
attraverso la stabilizzazione del recettore GnRH in varie conformazioni.
[Pawson et al.,2003; Heding et al.,1998]
Lo scambio di comunicazioni attraverso queste vie causa una modulazione
differenziale dell’inositolo 1,4,5 trifosfato e dei segnali del DAG, coerentemente
con le specifiche richieste di questi secondi messaggeri durante la fase iniziale
e sostenuta della risposta del calcio citoplasmatico indotta dal GnRH. In
aggiunta, le cellule gonadotrofe possiedono canali per il calcio sensibili al
voltaggi. L’espressione di numerosi sottotipi di PKC nelle cellule gonadotrope
ipofisarie indica, inoltre, la complessità delle vie di trasduzione del segnale
coinvolte
nei
meccanismi
di
segnalazione
attivati
dai
recettori
GnRH.
Recentemente, è stato dimostrato che l’attivazione dei recettori GnRH induce
l’espressione di diversi geni di risposta primaria (PRG).
Distribuzione
E’ stato possibile determinare la distribuzione tissutale ed i livelli basali di
mRNA che codificano il GnRH-R grazie al cDNA del recettore. I northern blots di
mRNA di ipofisi di topo e in cellule αT3-1 hanno rilevato due specie ibridizzzanti
di 3.5 e 1.6 kb [Tsutsumi et al.,1992; Reinhart et al.,1992; Kaiser et al.,1992].
25
Ipofisi
I recettori di GnRH sono stati caratterizzati nell’ipofisi di diverse specie, cosi
come in cellule αT3 gonadotrofe immortalizzate, [Naor et al.,1980; Wormland
et al.,1985; Pal et al.,1992; Limonta,1986; Weil et al.,1992; Peter et al.,1992,;
Schulz et al.,1993] come siti di legame molto specifici con alta affinità per il
GnRH e i suoi analoghi, agonisti ed antagonisti. Tra i tipi di cellule ipofisarie di
ratto, i siti di legame sono localizzati esclusivamente nelle gonadotrofe (vedi
Figura. 1). [Hyde et al.,1982]
I dati indicano che i GnRH-R nei vertebrati non sono ristretti alla
popolazione di cellule gonadotrope. GnRH si lega sia alle cellule biormonali (che
esprimono LH e FSH) che alle monormonali (che esprimono LH oppure FSH).
[Childs et al.,1984; Naor et al., 1986] I complessi covalenti recettore-ligando
dei recettori di GnRH ipofisari di differenti specie possiedono proprietà simili,
con variazioni minime. [Iwashita e Catt, 1985]
Cervello
La presenza di specifici legami per il GnRH è stata localizzata, mediante
tecniche autoradiografiche, nell’ippocampo, nel nucleo settale laterale, nella
corteccia anteriore. [Millan et al.,1985] GnRH si lega anche con alta affinità a
recettori specifici in cellule ipotalamiche che secernono GnRH (GT1) in maniera
dose-, tempo- e temperatura-dipendente. La specificità di tali recettori è
confermata dalla capacità del GnRH, e degli analoghi agonisti ed antagonisti, di
inibire il legame con i radioligandi fino al 97%.
Gonadi
Nei testicoli, il GnRH-R è espresso nelle cellule di Leydig ma non in quelle di
Sertoli. Nell’ovaio, GnRH-R sono stati identificati in cellule della granulosa e in
cellule luteali [Clayton et al.,1979; Hazum et a.l,1982; Pati et al.,1992]. Nelle
gonadi di ratto, sono stati identificati due differenti e distinte componenti di
GnRH-R di 53 e 43 kDa simili a quelli della ipofisi di ratto. [Iwashita e
Catt,1985]
Placenta
La placenta umana contiene siti di legame a bassa affinità che interagiscono
con analoghi agonisti ed antagonisti di GnRH. [Curie et al.,1981] Questi siti
differiscono dai recettori ipofisari di GnRH in numerosi aspetti. Comunque, la
similarità nei loro siti di legame a quelli delle gonadotrope indica che questi
recettori sono una probabile variante dei recettori GnRH. [Iwashita et al.,1986]
26
Inoltre, il GnRH stimola la sintesi ed il rilascio di gonadotropine bioattive nelle
cellule placentali umane [Curie et al., 1993]
Cellule che esprimono GnRH
I neuroni che producono GnRH sono espressi in tutti i vertebrati. In
contrasto con la struttura relativamente conservata dei peptidi GnRH nei
vertebrati, [Sherwood et al., 1987] ci sono notevoli differenze interspecifiche
nella localizzazione delle cellule nervose GnRH ergiche [Halasz et al.,1989].
La caratteristica distribuzione delle cellule che producono GnRH nel cervello
è probabilmente un riflesso delle loro funzioni specifiche: il GnRH può agire
come un neurormone, un neurotrasmetitore, ed anche come un ormone locale
nel cervello. La scoperta che i neuroni GnRH nell’ipotalamo dell’uomo e delle
scimmie inviano terminazioni, non solo nell’eminenza mediana ma anche ad
altri neuroni GnRH, e che tali cellule nervose esprimano abbondanti recettori
per GnRH, indicano una regolazione autocrina del rilascio di GnRH, che può
avvenire all’interno del cervello [Halasz et al.,1989; Krsmanovich et al., 1993].
Questo schema di regolazione locale tramite neuropeptidi non è unico dei
neuroni GnRH. GnRH è anche presente in cellule di tumore al seno [Seppiala et
al.,1980; Harris et al.,1991; Sarda et al.,1981; Butzow et al.,1987], ed una
proteina GnRH-simile, con un mRNA messaggero di prepro GnRH, è stata
trovata
in
cellule
della
granulosa
[Clayton
et
al.,1992;
Behrman
et
al.,1989;Ireland et al.,1988; Oikawa et al.,1990] ed in tessuti testicolari
[Chieffi et al.,1991, van Minne et al.,1988].
Il GnRH è anche presente nella placenta umana [Tan et al.,1982], nel
sistema immunitario [Blalock et al, 1989] e nella ghiandola ipofisaria
[Kerdelhue et al.,1990; Pagesy et al.;1992] ed è prodotto da cellule del tumore
al pancreas [Szende et al., 1991].
Mentre la presenza di GnRH nei linfociti indica un’interazione tra sistema
neuroendocrino e immunitario, il significato fisiologico della produzione di GnRH
nella ipofisi non è ancora chiaro. Altri studi sono richiesti per identificare le
cellule ipofisarie che
producono
GnRH
e
per
definire
neuropeptidi sintetizzati localmente [Qayum et al.,1990].
la
funzione
dei
27
Figura 1: Il diagramma schematizza l’azione putativa di GnRH nelle cellule gonadotrofe
(microaggregazione e successiva attivazione delle proteine G e mobilizzazione del
calcio). La macroaggregazione dei recettori porta alla loro down-regolazione. I recettori
down-regolati possono tornare alla superficie cellulare.[Stanislaus et al.,1998]
Struttura molecolare
I recettori per il GnRH sono caratterizzati da una struttura composta da sette
domini transmembrana accoppiati alle proteine-G e l’assenza del dominio
carbossiterminale citoplasmatico (vedi Figura 2). Il peso molecolare della
proteina è 37.684. Studi sulla proteina nativa parlano di un peso intorno ai 5060.000 [Clayton et al.,1989], lasciando supporre che la proteina sia glicosilata.
La presenza di tre forme di GnRH nella maggior parte dei vertebrati
suggerisce l’esistenza di tre recettori GnRH affini. Poiché il dominio EC3 è il
determinante maggiore della selettività per le varianti strutturali di GnRH,
oligonucleotidi degenerati al dominio transmembrana di legame sono stati usati
per amplificare DNA genomico da vari vertebrati.
Questa tecnica ha rivelato l’esistenza di un nuovo recettore di tipo II e la
sua sequenza. Queste sequenze sono state quindi usate per identificare il
presunto GnRH II umano e di altre specie. Tali scoperte, assieme al clonaggio
di altri recettori per il GnRH, suggeriscono una evoluzione precoce dei tre
sottotipi di GnRH-R nei vertebrati parallelamente a quella dei ligandi. Non è
28
stato possibile clonare il GnRH-R II umano a causa del frame shift e del codone
di stop, che non permettono di ottenere una forma funzionale del recettore di
tipo II.
Questo apparente silenziamento del GnRH II è accoppiato alla paradossale
conservazione di GnRH II dai pesci all’uomo. Simili siti di stop o delezioni sono
anche presenti nello scimpanzé, nel bovino, e nell’ovino, mentre un recettore di
tipo II del tutto funzionale è presente nelle scimmie del vecchio e nuovo
mondo, nel suino, nei rettili e negli anfibi. Il gene è andato perduto nel topo ed
assente nei pesci. Questa interessante plasticità nell’inattivazione del tipo II è
probabilmente legata alla duttilità nell’uso dei sottotipi dei recettori GnRH per
la segnalazione dei diversi tipi di GnRH. GnRH I, GnRH II e GnRH-R I sono
universalmente conservati; GnRH-R II è sporadicamente assente o silenziato.
Questo potrebbe essere attribuito al fatto che il recettore di tipo I è in grado di
legare GnRH II con grande affinità e quindi assumere il ruolo di GnRH II,
mentre l’inverso non può avvenire (GnRH-R II è molto selettivo per il GnRH II).
Sono state proposte due spiegazioni per il caso dell’uomo:
q
La prima è che il frame shift ed il codone di stop siano aggiustati post-
trascrizionalmente durante la traduzione (meccanismi simili sono stati
descritti, come trascritti che escludono lo stop o stop tradotti con un tRNA
alla selenocisteina; non sono stati dimostrati nel caso specifico, comunque).
q
La seconda è che un recettore di tipo II parziale sia prodotto e sia
funzionale. E’ stato osservato come la sequenza dopo lo stop (con sequenza
consenso di Kozac ) espressa in linee cellulari di rene di scimmia
immortalizzata (COS) downregola l’espressione del recettore di tipo I.
Il codone di stop è sorto indipendentemente nell’evoluzione nella stessa
zona e non in altre. Questo potrebbe suggerire che c’è un vantaggio nel
possedere un codone di stop e nel produrre sequenze parziali di recettore. La
presenza, però, del recettore II con o senza tale codone in specie correlate
suggerisce
che
questo
vantaggio
può
essere
solo
marginale
[Neil
et
al.,2001;Low et al., 1996;Hauser et al.,1998;Faurholm et al., 2001; Morgan et
al.,2003;Millar et al.,2003].
29
Figura 2 - Rappresentazione bidimensionale del recettore GnRH umano che
mostra i domini tranmembrana connessi allo spazio intra ed extracellulare. In
rosso i siti di legame col ligando (putativi) in verde le tasche di legame, in blu i
residui coinvolti nell’attivazione del recettore. I residui nei riquadri sono i soli
conservati nelle rodopsine. In arancio i residui che interagiscono con la
proteina G. Sono indicati i siti dove agiscono le chinasi C ed A. La sequenza di
GnRH-R di Oryctolagus cuniculus non è ancora stata definita completamente
[Millar et al, 2003].
Regolazione di GnRH-R
L’abilità di GnRH di regolare l’espressione dei propri recettori nelle cellule
ipofisarie è dimostrata da differenti evidenze sperimentali riassumibili in questo
modo:
1. Il numero di recettori del GnRH ipofisario cambiano durante l’ontogenesi e
variano durante il ciclo estrale, la gravidanza e l’allattamento [Savoy-Moore
et al.,1980; Clayton et al.,1980; Clayton et al.,1980; Clayton et al.,1981;
Chan et al.,1981; Duncan et al.,1986];
2. La castrazione e le lesioni ipotalamiche inducono cambiamenti nel numero
di recettori GnRH [Clayton et al.,1982; Barman et al.,1983];
3. La somministrazione di agonisti del GnRH e di anticorpi contro GnRH è
anche associata a cambiamenti nel numero di GnRH-R. [Loumaye et
al.,1983];
4. La stimolazione con GnRH in vitro è seguita da due fasi di cambiamenti nel
numero di recettori; inizialmente, l’attivazione di recettori porta ad una
30
down-regulazione, che poi è seguita da una up-regulazione [Loumaye et
al.,1983];
5. L’up-regulazione dei recettori indotta, dal GnRH, è stimolata anche dalla
depolarizzazione e dall’attivazione del PKC [Naor et al.,1987; Huckle et
al.,1988, Clayton et al.1989];
6. Ormoni steroidei ovarici esercitano effetti diretti sulle cellule gonadotrofe e
influenzano l’espressione dei recettori di GnRH in culture di cellule ipofisarie
[Emons et al.,1991];
7. In aggiunta a tali cambiamenti nei recettori ipofisari, la riduzione del
numero di recettori dopo trattamento con GnRH è stato osservato anche nel
testicolo e nell’ippocampo [Ban et al.,1990];
8. In un primo momento, l’esposizione iniziale al GnRH up-regola GnRH-R, che
poi va incontro ad una successiva fase di down-regolazione [Hapgood et
al.,2005].
Studi topografici sulla localizzazione dei recettori GnRH sulla superficie di
cellule ipofisarie dissociate hanno dimostrato una distribuzione uniforme
durante l’incubazione a breve termine con analoghi del GnRH. Dopo periodi di
incubazione più lunghi, il GnRH legato a recettori è internalizzato con cinetiche
determinate dalla potenza degli analoghi e dalla temperatura di incubazione
[Hopkins et al.,1977; Hazum et al.,1980; Naor et al., 1981].
Studi sulla regolazione del mRNA dei GnRH-R, usando il cDNA come prova
delle analisi di ibridazione, hanno mostrato effetti prominenti del GnRH
sull’espressione dei suoi recettori nella ipofisi. Nonostante una stimolazione
continua di cellule di ipofisi coltivate in vitro non abbia causato cambiamenti
rilevabili dell’espressione dell’mRNA dei recettori, la somministrazione a
intervalli di GnRH ne ha aumentati i livelli di diversi ordini [Kaiser et al.,1993].
Questi dati sono coerenti con la nota abilità del GnRH di regolare l’espressione
del suo proprio recettore e dimostra l’importanza della modalità di secrezione
del GnRH [Savoy-Moore et al.,1980; Clayton et al.,1982; Loumaye et
al.,1983].
Coerentemente con precedenti scoperte che mostravano come il numero di
recettori di GnRH cambiasse durante il ciclo estrale [Clayton et al.,1980], i
livelli di mRNA dei recettori di GnRH nella ipofisi di ratto sono 3 volte più
elevati nel pomeriggio del pro-estro che nella mattina del meta-estro. Questo
aumento precede di diverse ore l’inizio della scarica di LH e prosegue anche
dopo per alcune ore, seguita da una marcata riduzione nel metaestro. Un
aumento addizionale, anche se inferiore, si osserva durante il giorno nell’estro
31
[Illing et al.,1993]. Quindi, l’espressione di GnRH-R è altamente regolata
durante il ciclo estrale, con una correlazione generale tra i livelli di mRNA e
cambiamenti della sensibilità alle risposte gonadotrofe del GnRH.
Diversi fattori endocrini potrebbero essere responsabili dei cambiamenti nei
livelli del mRNA dei recettori GnRH durante il ciclo estrale, inclusi gli stessi
ormoni steroidei ovarici. In accordo con ciò, l’mRNA del recettore del GnRH
aumenta rispettivamente di 2 e 5 volte nelle ghiandole ipofisarie di ratti
femmina ovariectomizzate (OVX) e in ratti maschi orchiectomizzati, dopo 21
giorni. Il trattamento delle femmine con estradiolo e dei maschi con
testosterone diminuisce i livelli di mRNA in 7 giorni [Kaise et al.,1993]. Come
osservato nei ratti, il Northern blot del mRNA dell’ipofisi di pecora mostra un
aumento del mRNA di tutti i recettori di GnRH negli animali castrati [Illing et
al.,1993].
La regolazione steroidea di GnRH è stata anche dimostrata in cellule di
ipofisi di pecora coltivate in vitro [Seaflon et al.,1990]. Cellule ipofisarie
trattate con estradiolo aumentano la densità dei recettori del GnRH di 7-8
volte. Il trattamento con progesterone diminuisce i livelli anche del 80%.
Internalizzazione
Come in altre cellule stimolate da ligandi [Suarez-Quian et al.,1986],
l’internalizzazione di agonisti del GnRH nelle cellule gonadotrofe avviene via
endocitosi mediata da recettori. Il complesso internalizzato va incontro a
dissociazione, seguito da degradazione del ligando e dal parziale riciclo dei
recettori. In contrasto con la rapida internalizzazione degli agonisti di GnRH
[Loumaye et al.,1982], gli antagonisti potenti di GnRH rimangono legati alla
superficie per un periodo molto più lungo [Loumaye et al.,1984].
Nonostante
l’endocitosi
dei
complesso
recettore-ligando
sia
correlata
temporalmente con l’esocitosi delle gonadotropine, essa non è richiesta per la
secrezione di gonadotropine. Inoltre, la de-sensibilizzazione delle cellule
gonadotrofe tramite alte concentrazioni di agonista (ma non di antagonista)
può essere dissociata dall’internalizzazione. Quindi, è possibile che il complesso
internalizzato ormone-recettore sia coinvolto in qualche azione intracellulare
non ancora identificata [Conn et al.,1981; Catt et al.,1988; Smith et al., 1981;
Goropse et al.,1987; Clayton et al., 1988].
32
Estrogeni
Gli estrogeni sono potenti regolatori delle funzioni riproduttive. Il classico
modello dell’azione del 17β-estradiolo (vedi figura 3) è stato descritto
tradizionalmente come mediato da proteine recettoriali che si trovano
principalmente nel nucleo e che stimolano la trascrizione genica. Numerosi
studi che mettono in evidenza una rapida azione non genomica degli steroidi
hanno portato a supporre l’esistenza di recettori localizzati sulla superficie della
cellula. Il fatto che esista o no tale recettore degli estrogeni è ancora materia di
controversia, ma diversi studi hanno messo in evidenza la presenza di proteine
presenti
sulla
membrana
plasmatica
in
grado
di
legare
estrogeni.
Indipendentemente da ciò, gli effetti diretti conosciuti di vari steroidi sulla
trascrizione dei geni mitocondriali rinforzano l’idea di un contatto dei recettori
con il genoma mitocondriale.
Nonostante le indagini iniziali abbiano stabilito che la gran parte delle
proteine extranucleari che legano estrogeni siano reperite nei sovranatanti
delle frazioni di centrifugazioni ottenute da omogeneizzazioni di tessuto
uterino, è stato anche presto chiarito come siti di legame specifico con gli
estrogeni siano associati con strutture cromosomiche e microsomiche [Monje et
al.,2001].
Gli estrogeni svolgono un effetto importante sulla crescita, lo sviluppo e il
mantenimento dello scheletro. La significativa perdita di massa ossea in
seguito
a
menopausa
ed
in
seguito
ad
ovariectomia
indica
il
ruolo
fondamentale degli estrogeni in questo processo. Topi privi di ER funzionali,
creati con tecniche di gene knockout, mostrano cambiamenti nel fenotipo con
una minore densità delle ossa in entrambi i sessi.
Gli estrogeni influenzano la crescita, la differenziazione e lo sviluppo di
numerosi tessuti bersaglio. Tra questi includiamo i tessuti del sistema
riproduttivo maschile e femminile come la ghiandola mammaria, l’utero,
l’ovaio, il testicolo, e la prostata. Gli estrogeni giocano anche un ruolo
importante nel mantenimento del sistema cardiovascolare, dove hanno
sicuramente effetti cardioprotettivi.
La concentrazione di estrogeni nel plasma si correla inversamente con
l’assunzione di cibo nelle femmine di molte specie. L’ovariectomia produce un
immediato aumento dell’assunzione di cibo e del peso corporeo. Tale situazione
nei ratti viene normalizzata con successiva somministrazione di estradiolo
[Geari,2001].
33
Gli estrogeni sono principalmente prodotti nell’ovaio, e vengono prodotti
anche nei testicoli. Essi diffondono fuori e dentro le cellule, ma sono trattenute
in cellule specifiche da una proteina di legame intranucleare, definita recettore
degli estrogeni (ER) [Monje e Boland, 2001].
Figura 3 - Struttura chimica del 17-β Estradiolo (E2 ).
Recettori degli estrogeni
Quasi 50 anni fa, Jensen e Jacobsen (1962) giunsero alla conclusione che
(basandosi su specifici legami con l’estradiolo-17β (E2) nell’utero) l’effetto
biologico degli estrogeni fosse mediato da una proteina recettoriale [Jensen et
al.,1962].
Per molti anni questa proteina è stata oggetto di studio in numerosi
laboratori [Chamnes et al.,1974;Gorsky et al.,1984] e nel 1986 due gruppi
riportarono il clonaggio del recettore degli estrogeni (ER) [Greene et al.,1986].
Fino al 1995, si assumeva che esistesse un solo tipo di ER e che questo
fosse responsabile della mediazione di tutti gli effetti fisiologici e farmacologici
degli estrogeni e degli antiestrogeni naturali. Comunque, nel 1995, un secondo
ER, ERβ, è stato clonato dalla libreria genomica della prostata di ratto [Kuiper
et al.,1996].
34
Il primo ER venne quindi chiamato ERα. Sin da allora numerosi gruppi di
ricerca hanno clonato ERβ da numerose specie [Enmark et al.,1997;Mosselman
et al.,1996; Tchoudakova et al., 1999; Todo et al.,1996,Tremblay et al.,1997],
identificandone diverse isoforme.
La scoperta di ERβ ha portato ad una rivalutazione della biologia degli
estrogeni e, a causa dell’abbondanza di ERβ nel tratto urogenitale umano, ha
rifocalizzato l’attenzione del ruolo degli estrogeni negli individui di sesso
maschile [Chu et al.,1997; Maruyama et al.,1998; Moore et al.,1998; Ogawa et
al., 1998].
Domini funzionali
ERα e ERβ appartengono alla superfamiglia dei recettori nucleari per gli
ormoni steroidei/tiroidei con i quali condividono una comune architettura
strutturale [Giguere et al.,1988; Gronemeyer et al.,1995;Katzenellenbogen et
al.,1996].
ERa ed ERß sono composti da tre domini indipendenti ma interagenti fra di
loro: Quello NH2 terminale o A/B, quello C o di legame al DNA, ed il dominio
D/E/F o di legame al ligando (LBD, vedi Figura 4). Il legame del ligando ad ER
innesca cambi conformazionali nel recettore e questo porta attraverso una
serie di
eventi a modificazioni nel tasso di trascrizione dei geni estrogeno-
correlati.
Questi
eventi
non
sono
completamente
chiari,
ma
includono
la
dimerizzazione del recettore, l’interazione di questo col DNA, il reclutamento di
coattivatori e l’interazione con essi e altri fattori di trascrizione, e la formazione
di un complesso di preinizio, che favorisce il legame della RNA polimerasi
[Katzenellenbogen et al.,1996; Beaton et al.,1989; Beekman et al.,1993;
Kraus et al.,1995; Kraus et al.,1998].
Il dominio N-terminale dei recettori nucleari codifica una funzione di
attivazione ligando-indipendente (AF1), una regione del recettore coinvolta
nell’interazione-proteina-proteina, e l’attivazione trascrizionale dell’espressione
di geni bersaglio [Tora et al.,1989; Kraus et al.,1995].
Entrambi i sottotipi di ER condividono molte proprietà funzionali, possono
legare il 17β-estradiolo con un alta affinità e possono iniziare la trascrizione di
un gene sotto il controllo di elementi di risposta simili. Nonostante il significato
biologico dell’esistenza di isoforme di recettori non sia stato stabilito, la
differenza nel dominio di transattivazione mostrata dalle due isoforme di ER
suggerisce uno specifico comportamento a livello cellulare. Mentre un analisi
della distribuzione basata sull’mRNA ha mostrato come l’espressione del ERβ
35
possa sovrapporsi, ma non risultare esattamente uguale all’espressione di ERα,
maggior attenzione è stata data ai pattern di espressione proteica nei vari
tessuti e sotto distinti ambienti ormonali. La distribuzione di proteine ERβ può
differire da quella predetta dalla rispettiva analisi del mRNA. La presenza in
cellule bersaglio di attività di legame degli estrogeni in una serie di frazioni
subcellulari inclusi mitocondri, lisosomi, membrana plasmatica e microsomi,
sono state indicate, ma la localizzazione subcellulare sia della proteina α che
dellla β non è stata oggetto di molti studi. Un indagine recente in questo senso
ha mostrato come una sostanziale proporzione dei siti nativi leganti estradiolo
nell’utero di coniglio, corrispondenti alle proteine α e β, siano differenzialmente
associati a membrane microsomali e mitocondriali.
Finora si è ritenuto che ERα sia l’isoforma di recettore maggiormente
predominante negli organi riproduttivi, ed ERβ sia un recettore la cui
espressione è dimostrata ampiamente in differenti tipi di tessuto. Tuttavia,
studi
recenti
hanno
mostrato
un’ampia
espressione
di
ERβ
nell’utero,
nonostante i siti in cui esso è stato identificato siano differentemente localizzati
in confronto ad ERα. Oltre ciò, proteine collegate a ERβ leganti estrogeno
sembrano essere espresse ampiamente sia nell’utero che nell’ovaio di coniglio
[Monje e Boland, 2001].
36
Figura 4:Struttura del dominio LBD del recettore ER. In rosso, giallo e viola i
domini ad elica, l’hairpin è colorato di verde. La zona occupata dal ligando è
evidenziata con il colore blu.
Distribuzione
ERα è ampiamente distribuito nel cervello, e l’ipotalamo è una regione
particolarmente ricca di questo recettore. All’interno dell’ipotalamo ERα è
concentrato
nella
fascia
di
Broca,
nell’area
preottica,
nel
nucleo
paraventricolare, nell’ipotalamo laterale, nel nucleo ventromediale. Ci sono
differenze sessuali nella distribuzione.
ERα è diffuso nell’ipofisi, nel tessuto osseo e mRNA di ERα è stato reperito in
cellule del sangue periferico [Pinzone et al.,2004].
Regolazione
Ci sono esempi in molti organi di up-regolazione dei livelli di ERα mediati da
estradiolo. La risposta generale all’estradiolo è una degradazione acuta del
recettore seguita da attivazione trascriziolale del mRNA di ERα estradiolodipendente. L’esposizione a lungo termine all’estradiolo mantiene tessuti come
cervello, tessuti nervosi periferici e fegato in condizione estrogeno-responsiva,
up-regolando lo stato di equilibrio di espressione di ERα
Molti studi dimostrano che il progesterone down-regola l’espressione di ERα
[Pinzone et al.,2004].
37
Capitolo I
Il corpo luteo
Il corpo luteo (CL) svolge un ruolo centrale nella regolazione del ciclo estrale
e nel mantenimento della gravidanza. Questa funzione è svolta principalmente
dal progesterone, che è il principale steroide sintetizzato da questa ghiandola
endocrina transitoria. Se l’oocita non viene fertilizzato, il CL regredisce,
permettendo, in questo modo, che inizi un nuovo ciclo estrale. L’impianto,
l’accoppiamento o anche la stimolazione cervicale in alcune specie di
mammiferi, iniziano un complesso meccanismo adattato al mantenimento delle
funzioni
del
CL,
assicurando
una
continua
secrezione
di
progesterone
necessario per la sopravvivenza del feto.
Neri mammiferi sono stati trovati quattro tipi di CL che differiscono tra loro
per la durata e per la produzione steroidogenica: 1) ciclico, 2) pseudogravidico,
3) gravidico e 4) dell’allattamento. Solo il CL della gravidanza è presente in
tutte le specie dei mammiferi, mentre tutti e quattro i tipi possono essere
trovati nei roditori. Il CL del ciclo non esiste nelle specie ad ovulazione indotta,
e il CL della pseudogravidanza non si forma nei primati, mentre il CL
dell’allattamento è stato trovato solo nelle specie che ovulano dopo il
parto.[Stocco et al.,2007].
Generali azioni del progesterone
I principali bersagli del progesterone sono il tratto riproduttivo e l’asse
ipotalamo-ipofisi. In generale, il progesterone agisce nel tratto riproduttivo
preparandolo all’inizio e al mantenimento della gravidanza.
Il
progesterone,
sembra
esercitare
molti
dei
suoi
effetti
regolando
direttamente la trascrizione di geni attraverso specifici recettori nucleari che
agiscono
come
Sekeris,1997].
fattori
Dopo
il
di
trascrizione
legame
del
ligando-inducibile
ligando,
questi
[Moutsatsou
recettori
e
modulano
l’espressione dei geni attraverso legami specifici progesterone-elementi di
risposta nel DNA. È richiesta una precedente esposizione agli estrogeni, che
inducono la produzione dei recettori per il progesterone [Ing e Tornesi,1997;
Kaneko et al.,1993; Kraus e Katzenellenbogen,1993], affinché gli estrogeni
possano agire nel tratto riproduttivo. Al contrario, il progesterone down-regola
i recettori per l’estradiolo [Brenner et al.,1974; Evans e Leavitt,1980; Laws et
38
al.,1990;West et al.,1987] e blocca molte delle azioni svolte dagli estrogeni,
che generalmente agiscono come fattori mitogeni.
Nell’utero,
il
progesterone
agisce
sull’endometrio
come
fattore
di
differenziazione [Cummings e Yochim,1984]. Durante la fase follicolare, gli
estrogeni inducono la proliferazione delle cellule dell’endometrio, ed una
elevata concentrazione di progesterone durante la fase luteale del ciclo
riproduttivo inibisce la mitosi nell’endometrio [Padycula et al.,1989].
Il progesterone induce, anche, la differenziazione stromale, stimola le
secrezioni
ghiandolari
in
associazione
con
l’accumulo
di
vacuoli
basali
nell’epitelio ghiandolare [Maslar et al.,1986], e cambi di pattern di proteine
secrete
dalle
cellule
dell’endometrio
[Maslar
et
al.,1986;
Strinden
e
Shapiro,1983]. Queste proteine uterine provvedono all’ambiente che supporta
lo sviluppo iniziale dell’embrione.
Nell’utero, il progesterone induce la quiescenza del miometrio. Questo
effetto
sembra
dipendere
da
un
aumento
del
potenziale
di
riposo
e
dall’impedimento della propagazione dell’impulso elettrico tra le cellule del
miometrio
[Parkington,1983].
In
aggiunta,
il
progesterone
diminuisce
l’assorbimento di calcio extracellulare, che è richiesto per la contrazione delle
cellule
del
miometrio
[Batra,1986],
attraverso
una
down-regolazione
dell’espressione dei geni che codificano per le subunità dei canali del calcio
voltaggio-dipendenti [Tezuka et al.,1995]. Il progesterone previene anche le
contrazioni uterine bloccando la capacità dell’estradiolo di indurre i recettori αadrenergici, la cui attivazione causa le contrazioni [Bottari et al.,1983].
Infine, anche la lunghezza del ciclo riproduttivo è governata, in parte, dal
progesterone. La concentrazione ematica di progesterone è bassa durante la
fase follicolare. Durante questa fase, aumenta la concentrazione di estradiolo
che va ad agire sull’ipotalamo e sull’ipofisi stimolando gli impulsi a bassa
ampiezza e alta frequenza dell’ormone luteinizzante LH, che conduce allo
sviluppo follicolare fino all’ovulazione [Lucy et al.,1992]. Dopo l’ovulazione,
quando inizia a svilupparsi il corpo luteo (CL), una elevata concentrazione di
progesterone circolante limita la secrezione di LH ad impulsi a bassa frequenza
e alta ampiezza provocando una sostanziale riduzione della concentrazione
dell’LH.
Questo
effetto
è
il
risultato
dell’azione
del
progesterone
sia
sull’ipotalamo che sull’ipofisi. Il progesterone blocca la fonte del GnRH da parte
dell’ipotalamo [Attardi e Happe,1986; Kasa-Vubu et al.,1992]. Nell’ipofisi, il
progesterone riduce il numero dei recettori per il GnRH [Laws et al.,1990]
down-regolando l’mRNA che codifica per i recettori del GnRH [Bauer-Dantoin et
al.,1995]. Inoltre, il progesterone diminuisce la quantità di LH rilasciato in
39
risposta al GnRH [Janovick e Conn,1996], in parte, come risultato del ridotto
numero di recettori per il GnRH nell’ipofisi. Alti livelli di progesterone provocano
una diminuzione dell’espressione del gene che codifica per le subunità β sia
dell’FSH [Brann et al.,1993; Digregorio e Nett,1995] che dell’LH [Brann et
al.,1993] e le comuni α-subunità delle gonadotropine [Attardi et al.,1997;
Brann et al.,1993; Digregorio e Nett,1995]. Questo effetto del progesterone
sulla secrezione delle gonadotropine sembra essere dipendente dall’intero
ambiente endocrino poiché, in qualche caso il progesterone può facilitare la
fonte di gonadotropine indotte dall’estradiolo [Attardi e Happe,1986; BauerDantoin et al.,1995; Brann e Mahesh,1991; Brann et al.,1991; Krey et
al.,1993].
Sviluppo del corpo luteo
La
fonte
preovulatoria
di
gonadotropine
induce
l’ovulazione
e
la
differenziazione delle cellule follicolari residue, che formano il corpo luteo, e
iniziano a produrre progesterone. Prima di questo, l’estradiolo è lo steroide
primario secreto dall’ovaio. Le cellule della granulosa e della teca del follicolo
producono in maniera coordinata estrogeni [Bao e Garverick,1998; Fortune e
Quirk,1988]. Le cellule della teca esprimono gli enzimi necessari per convertire
il colesterolo in androgeni ma mancano degli enzimi necessari per convertire gli
androgeni in estradiolo [Bao e Garverick,1998]. Al contrario, le cellule della
granulosa producono progesterone, ma non sono in grado di convertire
pregnenolone o progesterone in androgeni. Tuttavia, le cellule della granulosa
possono convertire gli androgeni in estradiolo. Quindi gli androgeni prodotti
dalle cellule della teca vengono aromatizzati ad estradiolo dalle cellule della
granulosa. L’estradiolo è un importante mitogeno e stimola la divisione delle
cellule della granulosa [Richards et al.,1987]. La fonte preovulatoria di LH
comporta una luteinizzazione delle cellule della granulosa e della teca e altera il
pathway steroidogenico in modo che il progesterone risulta essere l’ormone
principale prodotto da tutte e due i tipi cellulari dopo la luteinizzazione.
Tuttavia, il corpo luteo di molte specie, inclusi uomo, suini, e ratti, conserva la
capacità di produrre un po’ di estradiolo [Richards e Hedin,1988; Wuttke et
al.,1997; Wuttke et al.,1998].
La sintesi del progesterone è il pathway meno complesso nell’ovaio. La
differenziazione in cellule capaci di produrre progesterone è accompagnata
dall’aumento dell’espressione di enzimi necessari per la conversione del
colesterolo in progesterone, per esempio il complesso del citocromo P-450 che
40
scinde la catena laterale del colesterolo (P-450scc) e il 3β-idrossisteroide
deidrogenasi/∆5,∆4 isomerasi (3β-HSD), e dlla diminuizione dell’espressione
degli enzimi che convertono il progesterone in estrogeni, per esempio il
citocromo P-450 17 α-idrossilasi e il citocromo P 450 aromatasi [Bao e
Garverick,1998].
Le cellule luteiniche derivate dalle cellule della teca e della granulosa danno
origine a due distinti tipi di cellule luteali che differiscono sia morfologicamente
che fisiologicamente. In molti mammiferi non-primati, le cellule che derivano
prevalentemente dalla granulosa vengono chiamate cellule luteiniche grandi
(LLC: large luteal cell), e quelle che derivano dalla teca vengono denominate
cellule luteiniche piccole (SLC: small luteal cell).
Il corpo luteo, oltre alle cellule steroidogeniche, contiene cellule endoteliali,
fibroblasti,
periciti
e
cellule
che
si
originano
dal
circolo
sanguigno
[Channing,1969; Channing,1969 (a)].
Il grado di migrazione e di mescolamento delle cellule derivate dai follicoli,
durante la formazione del corpo luteo, differisce tra le specie. Le cellule
luteiniche derivanti dalle cellule della granulosa rimangono separate dalle
cellule luteiniche derivanti dalle cellule della teca, e alcune membrane basali
follicolari rimangono a formare una barriera tra le cellule granulosa-luteiniche e
le cellule della teca-luteiniche [Guraya,1971]. Al contrario, il tessuto follicolare
è estesamente riorganizzato durante la migrazione delle cellule della teca, dei
fibroblasti, e delle cellule endoteliali durante lo sviluppo del corpo luteo nei
mammiferi non primati [Niswender e Nett,1994]. In queste specie, le cellule
del corpo luteo sono frammiste nella misura in cui LLC, SLC, fibroblasti e cellule
endoteliali siano in prossimità l’una all’altra [Dharmarajan et al.,1985; farin et
al.,1986].
La proliferazione cellulare nel corpo luteo che si sta sviluppando ha un tasso
mitotico elevato che è uguale alla rapidità di crescita dei tumori [JablonkaShariff et al.,1993].
I fattori che regolano la proliferazione delle SLC e dei fibroblasti non son
stati ancora ben caratterizzati, ma possono coinvolgere il fattore di crescita dei
fibroblasti [Redmer e Reynolds,1996], l’ormone della crescita (GH) [Jungel et
al.,1995] e l’LH [Grazul-Bilska et al.,1995]. Il fattore di crescita endoteliale
vascolare (VEGF), è un fattore mitogeno specifico per le cellule endoteliali
[Ferrara,1993], ed è probabilmente il principale regolatore della proliferazione
delle cellule endoteliali luteiniche all’inizio del ciclo [Behrman et al.,1971]. L’LH
e la gonadotropina corionica umana (hCG) inducono l’espressine di VEGF da
parte dei follicoli preovulatori e dalle cellule della granulosa isolate [Garrido et
41
al.,1993; Koos,1995]; l’immunoneutralizzazione di VEGF abolisce l’attività
mitogena delle cellule endoteliali nei CL in sviluppo [Doraiswamy et al.,1995].
La
proliferazione
delle
cellule
endoteliali
è
necessaria
per
la
neovascolarizzazione durante lo sviluppo luteinico, da cui deriva un’estesa rete
di capillari nel corpo luteo [Redmer e Reynolds,1996; Reynolds et al.,1992]. Il
lume dei capillari rappresenta il 22% del volume totale del corpo luteo
[Dharmarajan et al.,1985], e ciò è in accordo con l’alto tasso del flusso
sanguigno, presente nel corpo luteo, che è maggiore a quello di qualunque
altro
tessuto.
direttamente
strettamente
Inoltre,
adiacenti
vicini
ai
molte
ai
membrane
capillari,
capillari
o
delle
adiacenti
[Dharmarajan
cellule
luteiniche
allo
spazio
et
al.,1985].
sono
interstiziale,
Così
la
giustapposizione delle cellule luteiniche con i capillari provvede all’alta richiesta
metabolica dei corpi lutei, i quali consumano da 2 a 6 volte più ossigeno, per
unità di peso, rispetto al fegato , reni o cuore [Swann e Bruce,1987].
Pathway steroidogenico luteinico
Substrati steroidogenici
Il substrato per la steroidogenesi è il colesterolo. In condizioni normali la
maggior parte del colesterolo è sintetizzata nel fegato [Krisans,1996] e
trasportata ai tessuti steroidogenici, come la corteccia surrenale, il follicolo, il
corpo luteo e i testicoli, sotto forma di lipoproteine. Le lipoproteine a bassa
densità (LDL: low-density lipoprotein) e le lipoproteine ad alta densità (HDL:
hight-density lipoprotein) sono le più comuni fonti di colesterolo per la
produzione di ormoni steroidei da parte del corpo luteo [Hwang e Menon,1983;
Ohashi et al.,1982; Pate e Condon, 1982].
In condizioni normali, la maggior parte del colesterolo, utilizzato per la
steroidogenesi, è ottenuta dalla circolazione sanguigna sotto forma di LLD e
HLD. L’assorbimento di LDL da parte delle cellule luteiniche avviene attraverso
una endocitosi mediata da recettori [Brown
e Goldstein,1986]. Una volta
internalizzato, gli endosomi si combinano con i lisosomi, dove le LDL si
dissociano dal recettore e questa scissione rende disponibile alle cellule il
colesterolo libero. Il recettore delle LDL viene reciclato o degradato [Grummer
e Carroll,1988].
L’assorbimento delle HDL extracellulari avviene attraverso il legame ad una
proteina legata alla membrana plasmatica che lega le HLD, e il colesterolo è
trasportato dentro la cellula da un meccanismo non ancora compreso che però
42
sembra
non
essere
un’endocitosi
mediata
da
recettore
[Lestavel
e
Fruchart,1994].
Una volta che il colesterolo libero è presente all’interno del citoplasma della
cellula, questo può essere utilizzato per la steroidogenesi o per la formazione
delle membrane cellulari, o può essere esterificato con acidi grassi, per formare
esteri del colesterolo ad opera della colesterolo estere sintasi e immagazzinato
[Johnson et al.,1997].
Gli esteri del colesterolo formano spesso delle gocce lipidiche che sono state
spesso utilizzate come caratteristiche morfologiche per riconoscere i tipi di
cellule steroidogeniche. La colesterolo esterasi idrolizza gli esteri del colesterolo
immagazzinati e libera il colesterolo per essere utilizzato dalle cellule. Questo è
uno dei primi step della steroidogenesi che viene estremamente controllato dai
pathways de secondi messaggeri. La colesterolo esterasi è attivata dalla
fosforilazione ad opera della proteinchinasi A (PKA) [Caffrey et al.,1979;
Pittman et al.,1975; Trzeciak e Boyd,1974].
Trasporto del colesterolo
La sintesi di tutti gli steroidi è dipendente dal trasporto del colesterolo ai
mitocondri e poi dalla membrana mitocondriale più esterna a quella più interna
dove il complesso enzimatico che taglia le catene laterali del colesterolo per
formare pregnolone [Stone e Hechter,1954]. Il primo step di questo processo,
cioè il trasporto alla membrana mitocondriale esterna, sembra richiedere un
citoscheletro intatto, dal momento che gli inibitori delle funzioni sia dei
microtuboli che dei microfilamenti [Crivello e Jefcoate,1978] prevengono
l’accumulo mitocondriale del colesterolo. Lo stato di fosforilazione delle
proteine del citoscheletro probabilmente influenza il tasso di trasporto del
colesterolo. Le proteine che legano gli steroli sembrano avere, anche, un ruolo
nel trasporto del colesterolo ai mitocondri [Ikonen,1997; Scallen et al.,1985].
La stimolazione della steroidogenesi da parte degli ormoni trofici che
aumentano il trasporto di colesterolo ai mitocondri, che sembra essere un
processo complicato che non può essere spiegato dalla semplice diffusione del
colesterolo attraverso il citoplasma.
Lo step limitante, nel pathway steroidogenico, sembra essere il trasporto di
colesterolo dalla membrana mitocondriale esterna a quella interna [Stevens et
al.,1993]. Questo step sembra essere il principale punto di regolazione, sia
positivo che negativo, della steroidogenesi attraverso il sistema dei secondi
messaggeri [Simpson e Waterman,1983]. Da tempo è noto che la stimolazione
del pathway steroidogenico da parte degli ormoni trofici , richiede la sintesi di
43
una proteina con un emivita molto breve. La fosforilazione di questa proteina è
associata all’aumento della secrezione degli steroidi [Epstein et al.,1991; Pon
et al.,1986]. Questa proteina, chiamata StAR (steroidogenic acute regulatory
protein), viene tagliata in due forme, una acida e una basica, durante
l’inserzione nella membrana mitocondriale. È stato ipotizzato che è proprio
durante l’inserzione di questa proteina, nella membrana mitocondriale, che il
colesterolo viene trasportato verso il complesso enzimatico, che taglia la
catena laterale del colesterolo, per formare il pregnolone [Waterman,1995].
Conversione del colesterolo a progesterone
Una volta che il colesterolo viene trasportato alla matrice mitocondriale,
l’azione del P-450scc, adrenodossina e l’adrenodossina riduttasi tagliano la
catena laterale del colesterolo per formare pregnolone [Stone e Hechter,1954].
Il pregnolone viene poi trasportato al reticolo endoplasmatico liscio, che è
generalmente associato ai mitocondri, dove la 3β-HSD converte il pregnolone in
progesterone [Hanukoglu,1992].
Regolazione trofica delle funzioni luteali
Gli ormoni luteotrofici sono quelli che supportano la crescita e/o le funzioni
dei corpi lutei. Durante la normale fase luteale, il corpo luteo aumenta le
proprie dimensioni e la capacità di secernere progesterone. Una volta che il
corpo luteo ha ottenuto una dimensione matura, e ha raggiunto il suo massimo
potenziale
di
secrezione
del
progesterone,
le
funzioni
luteali
vengono
mantenute da pochi a molti giorni, a seconda della specie, e poi se l’animale
non diviene gravido, deve avvenire la regressione del corpo luteo per
permettere una nuova ovulazione e quindi un’altra occasione per una
gravidanza.
La concentrazione di progesterone nel plasma dipende dalla quantità di
tessuto steroidogenico, dal flusso sanguigno, e dalla capacità del tessuto
steroidogenico
di
sintetizzare
il
progesterone.
La
quantità
di
tessuto
steroidogenico è dipendente dal numero e dalla dimensione delle cellule
luteiniche steroidogeniche, che aumentano entrambe durante lo sviluppo
luteinico.
Aumenta,
anche,
il
flusso
sanguigno
nel
corpo
luteo,
e
di
conseguenza aumenta la concentrazione di progesterone circolante.
Gli ormoni che supportano la crescita e/o le funzioni del corpo luteo vengono
chiamati luteotropici e includono: l’LH, il GH, la prolattina, fattore di crescita
44
insulina-simile (IGF-I: insulin-like growth factor), l’ossitocina, la prostaglandina
E2 (PGE2) e la prostaglandina I2 (PGI2).
Sviluppo luteinico
L’importanza degli ormoni secreti dall’ipofisi per un normale sviluppo e
funzionamento
del
CL
[Astwood,1941;Denamur
e
è
stata
dimostrata
Martinet,1973;Farin
et
in
molte
specie
al.,1990;Hutchinson
e
Zeleznik,1984;Snook et al.,1969; Spies et al.,1967;Vande Wiele et al.,1970].
Se viene rimossa l’ipofisi al 5° giorno del ciclo estrale, nella pecora, il corpo
luteo smette di accrescere il suo peso, e la concentrazione del progesterone nel
siero rimane o agli stessi livelli osservati al 5° o al di sotto [Farin et
al.,1990;Juengel et al, 1995].
Questa perdita di peso luteinico, se comparata con animali intatti, è
associata con una diminuzione del numero delle SLC e dei fibroblasti e ad una
diminuzione della grandezza delle cellule luteiniche steroidogeniche sia piccole
che grandi [Farin et al.,1990]. La diminuzione della concentrazione di
progesterone nel plasma non sembra essere associata con la diminuzione
dell’assunzione di lipoproteine intesa come concentrazione di mRNA che
codifica sia per i recettori delle LDL che di quello che codifica per le proteine
che legano l’HDL (BP), e presumibilmente le loro proteine non diminuiscono
[Tandeski et al.,1996]. Tuttavia, la rimozione dell’ipofisi è seguita da una
riduzione dei livelli di mRNA che codifica per le proteine steroidogeniche StAR,
P-450ssc e 3β-HSD [Juengel et al.,1995 (a); Juengel et al.,1995]. La
diminuzione del numero e della grandezza delle cellule steroidogeniche e la
diminuzione della capacità di sintetizzare progesterone da parte delle cellule
steroidogeniche, ha come conseguenza che il corpo luteo ha una ridotta
capacità di secernere il progesterone.
L’ipofisectomia rimuove tutti gli ormoni dalla circolazione; tuttavia, negli
ovini, la somministrazione fisiologica di LH e GH è sufficiente a supportare il
normale sviluppo del corpo luteo. Dopo che il corpo luteo si è formato, la
rimozione dell’ipofisi provoca la regressione del CL [Denamur,1966; Denamur
et al.,1973;Haworth,1997].
Ruolo degli estrogeni nelle funzioni luteiniche
In alcune specie come coniglio, ratto, e suini, gli estrogeni sono luteotropi.
Tuttavia, l’entità della dipendenza del corpo luteo dall’estradiolo, come
supporto, varia in queste specie.
45
Nel coniglio, la rimozione dell’estradiolo provoca l’arresto della secrezione
del progesterone, quindi, l’estradiolo viene considerato il principale ormone
luteotropo. In questa specie l’LH svolge un ruolo secondario, ed è quello di
stimolare la sintesi di estradiolo da parte dei follicoli [Holt,1989]. Allo stesso
modo, nei ratti, l’estradiolo sembra essere direttamente coinvolto nella
stimolazione della secrezione del progesterone. Tuttavia, nei ratti, sia LH che la
prolattina sono necessari per mantenere la funzionalità del corpo luteo, ma il
loro ruolo è comunque secondario. La prolattina è essenziale per mantenere
l’espressione dei recettori dell’estradiolo e dell’LH nel corpo luteo [Gibori et
al.,1988]. Sia nei ratti che nel coniglio, gli estrogeni stimolano anche,
direttamente o indirettamente, l’ipertrofia delle cellule luteiniche durante la
gravidanza [Gibori et al.,1988; Holt,1989]. Nei suini il ruolo degli estrogeni è
meno definito. L’impianto di capsule contenenti estradiolo, nei corpi lutei
provoca la crescita dei CL e l’aumento della secrezione del progesterone
[Conley e Ford,1989].
Inoltre, l’estradiolo riduce la secrezione di prostaglandina 2α (PGF2α) da
parte dell’utero, prevenendo, in questo modo la luteolisi [Ford et al.,1982].
Un altro potenziale meccanismo attraverso il quale gli ormoni luteotropi
sono in grado di supportare le funzioni luteiniche è attraverso la diminuizione
l’espressione dei recettori per l’ormone luteolitico PGF2α.
Tuttavia, LH sembra up-regolare l’espressione dell’mRNA che codifica per i
recettori della PGF2α [Juengel et al.,1996; Tsai et al.,1996], e l’ipofisectomia ,
durante la fase luteale intermedia, non ha effetto sulla concentrazione luteinica
di questo mRNA [Haworth,1997]. Perciò, gli ormoni luteotropi non supportano
le funzioni luteiniche attraverso la soppressione dell’espressione dei recettori
per la PGF2α.
Controllo della secrezione di progesterone
Le SLC e le LLC differiscono per la loro capacità di secrezione del
progesterone, e le LLC producono da 2 a 40 volte più progesterone delle SLC
non stimolate. I due tipi cellulari differiscono anche nella loro risposta a
differenti stimoli ormonali e/o dai secondi messaggeri [Niswender e Nett,1994].
Effetto dell’LH sulla secrezione del progesterone
Nelle ovini [Hoyer et al.,1984;Rodgers et al.,1983], nei bovini [Alila et
al.,1988],
nei
suini
[Tekpetey
e
Armstrong,1991],
una
concentrazione
fisiologica di LH aumenta la secrezione di progesterone da parte delle SLC, ma
non da LLC. Tuttavia, è stato dimostrato che negli ovini e nelle bovini, entrambi
46
tipi cellulari esprimono i recettori per l’LH [Chegini et al.,1991;Harrison et
al.,1987]. Nei tessuti o nelle cellule luteiniche negli ovini e nei bovini, il legame
dell’LH ai suoi recettori attiva l’adenilato ciclasi, e ciò conduce all’aumento della
concentrazione dell’AMP ciclico e infine all’attivazione della PKA [Davis et
al.,1996; Hoyer et al.,1984; Marsh,1976]. L’attivazione della PKA nelle SLC
aumenta lievemente il rilascio di colesterolo dagli esteri del colesterolo
[Wiltbank et al.,1993] ma non influenza la concentrazione dell’mRNA o l’attività
del P-450ssc o del 3β-HSD [Belfiore et al., 1994; Wiltbank et al.,1993].
Il modesto incremento dell’attività della colesterolo esterasi non è sufficiente
a provocare l’aumento da 5 a 20 volte della secrezione di progesterone
osservata dopo il trattamento delle SLC con LH [Wiltbank et al.,1993]. Quindi,
l’effetto steroidogenico del’LH non sembra essere modulato dai cambiamenti
dei tre enzimi steroidogenici coinvolti nella biosintesi del progesterone.
Pertanto è stato ipotizato che l’LH aumenta la produzione degli steroidi
facilitando il trasporto del colesterolo attraverso le cellule in prossimità del
complesso enzimatico P-450ssc [Wiltbank et al.,1993].
Effetto stimolatore delle prostaglandine sulla secrezione di progesterone
È stato supposto che le prostaglandine della serie E e I possono essere
importanti per le normali funzioni luteiniche [Hansel et al.,1991; Milvae e
Hansel, 1980; Milvae e Hansel,1983]. Queste prostaglandine sono prodotte in
maggior quantità durante la fase luteale precoce rispetto alla fase luteinica
tardiva, e quindi è stato proposto che queste prostaglandine possano avere un
ruolo nello sviluppo dell CL [Milvae e Hansel,1983]. Forti evidenze supportano
un ruolo per la PGI2 nello sviluppo del corpo luteo [Homeida e El-Eknah,1992].
La somministrazione di PGI2 al tessuto luteinico dei bovini, ovini incrementa la
secrezione del progesterone [Alila et al., 1988; Bennegard et al.,1990; Fitz,
Hoyer et al.,1984; Fitz et al.,1984; Milvae e Hansel,1980].
È stato mostrato che anche la prostaglandina E2 incrementa la produzione di
progesterone nelle cellule luteali dei bovini e degli ovini [Alila et al.,1988; Fitz,
Hoyer et al.,1984; Fitz et al.,1984; Shelton et a.,1990].
Meccanismo
attraverso
il
quale
gli
ormoni
luteotropi
incrementano
la
produzione di progesterone da parte delle cellule luteiniche
Nelle SLC di molte specie, e nelle LLC dei ratti e dei primati non umani, gli
ormoni luteotropi, come l’LH e la PGI2, incrementano, di molto, la sintesi del
progesterone
attraverso
l’attivazione
della
PKA.
L’attivazione
della
PKA
probabilmente stimola il progesterone, attraverso l’aumento del trasporto del
47
colesterolo verso il complesso enzimatico P-450ssc [Wiltbank et al.,1993]. Al
contrario, nelle LLC degli ovini, suini, bovini, l’aumento della sintesi di
progesterone, in risposta alle luteotropine come PGI2,PGE2, GH e IGF-I, non è
provocata dall’attivazione della PKA [Hoyer et al.,1984].
Luteolisi
La luteolisi viene definita come la lisi o la morte strutturale del corpo luteo.
Durante la luteolisi avvengono due eventi correlati: all’inizio c’è una perdita
della capacità di sintetizzare e secernere progesterone [McGuire et al.,1994]
seguita, poi, dalla perdita delle cellule che compongono il corpo luteo
[Knickerbocker et al.,1988; Pate,1994]. In molte specie di mammiferi la
luteolisi è dipendente dalla presenza dell’utero. L’isterectomia nelle giovenche
[Anderson et al.,1961;Malven e Hansel,1964;Wiltbank e Casida,1956], negli
ovini [Wiltbank e Casida,1956], nei suini [Anderson et al.,1961] e in altre
specie di mammiferi provoca una luteolisi ritardata. Tuttavia, l’isterectomia nei
primati non ritarda la luteolisi.
La prostaglandina 2α (PGF2α) è il fattore che, prodotto dall’utero, inizia la
luteolisi [Hansel et al.,1973; McCracken et al.,1970] in molte specie di non
primati.
Per alcune specie è stato ipotizzato che la PGF2α entra nell’arteria ovarica
dalla vena utero-ovarica, attraverso un meccanismo di scambio contro-corrente
[Ginther,1974]. Questo permette alla PGF2α di viaggiare nell’arteria ovarica
senza entrare nella circolazione polmonare, dove verrebbe inattivata dagli
enzimi presenti nei polmoni [Piper et al.,1970].
Durante la regressione luteale, l’iniziale diminuzione della concentrazione
plasmatica di progesterone, sembra non essere dovuta alla perdita delle cellule
luteiniche steroidogeniche. Infatti è stato visto che il numero delle cellule
luteiniche diminuisce in seguito alla riduzione della concentrazione plasmatica
di progesterone [Braden et al.,1988]. La diminuzione della secrezione di
progesterone è, molto probabilmente, dovuta alla diminuzione del flusso di
sangue luteinico e alla diminuzione della capacità steroidogenica delle singole
cellule luteiniche.
È stato proposto che l’estradiolo, proveniente dai follicoli in sviluppo,
provoca il rilascio della ossitocina ipofisaria, che a sua volta stimola il rilascio di
piccole quantità di PGF2α dall’utero [Fairclough et al.,1980]. In seguito la
PGF2α inizia un loop di feebak positivo che coinvolge il rilascio supplementare
48
di ossitocina luteinica e di PGF2α sia di origine luteinica [Tsai et al.,1997] che
uterina [Silvia et al.,1991].
È stato, recentemente, proposto che il rilascio di PGF2α da parte del corpo
luteo amplifica il segnale luteolitico in maniera autocrina e paracrina [Olofsson
et al.,1992, Tsai e Wiltbank,1997; Tsai e Wiltbank,1998].
Flusso sanguigno e cambiamenti vascolari
La PGF2α riduce il flusso sanguigno nel CL e questo può causare la luteolisi
privando la ghiandola dei nutrienti, dei substrati per la steroidogenesi e dei
supporti luteotropi [Phariss et al.,1970]. La somministrazione di PGF2α agli
ovini riduce il flusso sanguigno nel corpo luteo e parallelamente diminuiscela
secrezione di progesterone [Nett et al.,1976; Niswender et al.,1973].
Poiché le cellule endoteliali esprimono i recettori per la PGF2α [Mamluk et
al.,1998], la PGF2α, probabilmente, agisce direttamente su questa popolazione
cellulare. La PGF2α causa la degenerazione delle cellule endoteliali del corpo
luteo [O’Schea et al.,1977; Sawyer et al.,1990], e ciò provoca una marcata
riduzione della densità dei capillari [Azmi e O’Shea,1984; Braden et al.,1988;
Nett et al.,1976], in tal modo riducendo il flusso sanguigno nel parenchima
luteinico. Sembra che anche bassi livelli di PGF2α possono indurre l’apoptosi
nelle cellule endoteliali dei capillari luteinici.
Recentemente l’endotelina-1 è stata indicata come possibile mediatore degli
effetti della PGF2α sul flusso sanguigno nel CL [Girsh,Milvae et al., 1996;
Girsh,Wang et al 1996]. La PGF2α stimola le cellule endoteliali del CL a
produrre endotelina-1 in vitro [Girsh,Wang et al 1996] e in vivo [Ohtani et
al.,1998]. Inoltre, per la sua potente attività vasocostrittrice, l’endotelina-1
inibisce
l’attività
steroidogenica
delle
cellule
steroidogeniche
del
CL
[Girsh,Wang et al 1996]. Inoltre, l’endotelina-1 può ridurre il flusso sanguigno
durante l’inizio della luteolisi, causando una la costrizione delle arteriole
[Ohtani et al.,1988] e provocando così ipossia, che può causare il rilascio
addizionale di endotelina-1 [Rakugi et al.,1990].
Le proprietà antiluteolitiche delle PGE2 possono, in parte, attenuare l’azione
vasocostrittrice dell’endotelina-1 [Silldorff et al.,1995].
Cambiamenti morfologici
La PGF2α stimola una straordinaria serie di cambiamenti morfologici. La
proporzione delle cellule luteiniche steroidogeniche, che compongono il CL,
49
diminuisce, entro le 24 ore, negli ovini trattate con la PGF2α durante la fase
luteale media [Braden et al.,1988]. Il numero delle cellule che può essere
raccolto da Cl dispersi enzimaticamente diminuisce, e questo calo precede la
riduzione del numero delle SLC [Braden et al.,1988]. Allo steso tempo si
verifica anche una riduzione della grandezza delle LLC [Braden et al.,1988;
Gemmell et al.,1976].
I cambiamenti morfologici, sia nelle LLC che nelle SLC, non divengono
evidenti
fino
a
24-36
ore
dopo
l’esposizione
alla
PGF2α [Sawyer et
al.,1990], tuttavia, in questo periodo, la capacità steroidogenica delle cellule è
marcatamente ridotta. È interessante notare che le cellule endoteliali, nei
capillari dei CL degli ovini trattate con la PGF2α, sono la prima popolazione di
cellule che esibiscono drammatici cambi morfologici [Sawyer et al.,1990]
indicativi dell’apoptosi [Kerr et al.,1972]. Si sospetta che la degenerazione
delle cellule endoteliali sia un effetto diretto della PGF2α, ma non è stato
ancora provato.
Segnali intracellulari
La PGF2α agisce attraverso il suo legame a specifici recettori localizzati sulle
LLC [Fitz et al.,1982; Juengel et al.,1996]. Questi recettori appartengono alla
famiglia dei recettori, caratterizzati da sette domini transmembrana, accoppiati
alle proteine G [Abramovitz et al.,1994; Grave set al.,1995; Sakamoto et
al.,1994; Sugimoto et al.,1994]. Dopo il legame al recettore ad alta affinità, la
PGF2α induce l’attivazione delle fosfolipasi C (PLC) legate alla membrana
[Berridge e Irvine,1984], attraverso la stimolazione delle proteine G [Miwa et
al.,1990].
La PLC catalizza l’idrolisi del fosfstidilinositolo-4,5-difosfato a inositolo-1,4,5trifosfato (IP3) [Davis et al.,1988] e a 1,2-diacilglicerolo (DAG) [Berridge e
Irvine,1984].
L’aumento della concentrazione citosolica di IP3, induce il rilascio di Ca2+ dal
reticolo endoplasmatico liscio al compartimento citoplasmatico [Berridge e
Irvine,1984]. L’aumento di Ca2+ libero e di DAG (localizzato nella membrana
plasmatica) stimola l’attività catalitica della protein chinasi Ca2+ dipendente
(PKC, anch’essa localizzata nella membrana plasmatica) [Nishizuka,1987].
Si pensa che la PKC medi molte delle azioni antisteroidogeniche della PGF2α
nelle LLC [McGuire et al.,1994; Wiltbank et al.,1990; Wiltbank et al.,1991].
L’accumulo, di Ca2+ derivato dai microsomi e di origine extracellulare,
indotto dalla PGF2α, aumenta l’attività catalitica della PKC. Si pensa che
50
l’attivazione della PKC nelle LLC provochi una modificazione post-traduzionali
delle proteine cellulari coinvolte nella steroidogenesi [McGuire et al.,1994;
Wiltbank et al.,1990], nella disponibilità di colesterolo [Behrmanet al.,1971], e
nel mantenimento della matrice extracellulare [Wojtowicz-Praga et al.,1997;
Lum e Malik, 1996].
L’attivazione della PKC induce l’espressione e l’attivazione di proteine
coinvolte nell’apoptosi in altri tipi cellulari [Schwartzman e Cidlowski,1993]. È
possibile che l’attivazione della PKC favorisca l’apoptosi nelle LLC.
PGF2α di origine luteinica
La PGF2α può essere sintetizzata dai CL nelle donne [Mitchell et al.,1991],
nelle scrofe [Guthrie et al.,1978], negli ovini [Rexroad e Guthrie,1979;Tsai e
Wiltbank,1997] nei bovini [Pate,1988], e nei roditori [Olofsson et al.,1992].
Durante la fase luteale tardiva del ciclo estrale, la PGF2α, proveniente da fonti
periferiche, può stimolare la sintesi della PGF2α nei corpi lutei degli ovini [Tsai
e Wiltbank,1997].
È stato proposto che la PGF2α, prodotta localmente nel CL, agisca attraverso
un meccanismo che, per via paracrina e/o autocrina, induce l’apoptosi [Auletta
e Flint,1988].La PGF2α e la PGE2 sono sintetizzate utilizzando i fosfolipidi di
membrana come substrato in una serie di reazioni caratterizzate da tre step
chiamati pathways della ciclo ossigenasi. La fosfolipasi A2 e la fosfolipasi C,
localizzate nella membrana plasmatica, idrolizzano i fosfolipidi di membrana,
liberando acido arachidonico che può essere utilizzato come substrato per la
sintesi della PGF2α [Kaneko et al.,1993]. La cicloossigenasi (prostaglandine
G/H
sintasi)
catalizza
lo
step
tasso-limitante
nella
biosintesi
delle
prostaglandine, che è la conversione dell’acido arachidonico in PGH2 [Dewitt e
Smith,1995]. In fine la PGH2 è rapidamente convertita in PGF2α dalla
prostaglandina F sintasi [Watanabe et al.,1985].
Le fosfolipasi A2 e C esibiscono un aumento della loro attività in presenza di
elevate concentrazioni di Ca2+ libero intracellulare [Abdel-Latif,1986; Flower e
Blackwell, 1976].
La PGF2α down-regola l’mRNA che codifica per la cicloossigenasi nei CL di
bovini, durante le prime fasi del ciclo estrale [Tsai e Wiltbank,1998]. Questo
periodo coincide con l’intervallo di tempo in cui la PGF2α non è in grado di
causare la luteolisi, suggerendo che la sintesi locale di PGF2α potrebbe essere
importante in questo processo.
51
Queste osservazioni supportano l’ipotesi che la PGF2α può autoregolare la
propria sintesi mediante stimolazione della liberazione di acido arachidonico
attraverso l’idrolisi dei fosfolipidi di membrana, e ciò provoca: 1) che il
recettore della PGF2α legato alle proteine G, attiva la fosfolipasi C, e la
conseguente conversione dell’acido arachidonico in PGH2, e 2) l’aumento di
Ca2+ citosolico.
La disponibilità di acido arachidonico e l’attività della cicloossigenasi, le quali
determinano la capacità cellulare di sintetizzare le prostaglandine, vengono
entrambe incrementate nel CL, in risposta alla PGF2α.
La PGF2α provoca l’inibizione della sintesi di progesterone
La prostaglandina 2α diminuisce la sintesi di progesterone nel CL nei bovini,
negli ovini, nei suini,nei primati, e nei ratti e conigli pseudogravidi/ gravidi in
vivo [Niswender e Nett,1994].
Se alle cellule luteiniche, dalla fase intermedia alla fase tardiva luteale,
vengono fornite lipoproteine come fonte di colesterolo per aumentare la
secrezione
di
progesterone,
il
trattamento
con
la
PGF2α
provoca
un
diminuzione della sintesi e della secrezione di progesterone [Fitz et al.,1993;
Pate e Condon,1989; Pitzel et al.,1993;Wiltbank et al.,1991;Yuan et al.,1993].
Probabilmente
ci
sono
molteplici
meccanismi
attraverso
i
quali
la
PGF2α riduce la sintesi di progesterone; tuttavia, dal momento che la PGF2α
riduce la secrezione di progesterone nelle LLC provenienti da preparazioni
purificate di corpi lutei sia bovini che ovini [Wiltbank et al.,1991], è chiaro che
la PGF2α influenza direttamente queste cellule.
La prostaglandina 2α può diminuire la sintesi di progesterone attraverso
molti meccanismi intracellulari compresi:
Effetti della PGF2α sui recettori per gli ormoni luteotropi
Dal momento che il tasso di sintesi del progesterone è dipendente dagli
ormoni luteotropi, la PGF2α potrebbe ridurre la capacità del corpo luteo di
rispondere a questi ormoni.
Il trattamento con PGF2α, negli ovini, provoca una rapida diminuzione dei
livelli d mRNA che codificano per i recettori dell’LH [Guy et al.,1995;Smith et
al.,1996]. Questa riduzione dei livelli di mRNA, che codifica per il recettore
dell’LH, sembra essere preceduta da una riduzione del legame dell’LH alle
membrane luteiniche [Diekman et al.,1978].
52
La down-regolazione dei recettori per gli ormoni luteotropi non sembra
essere il meccanismo attraverso il quale la PGF2α provoca la diminuzione della
secrezione di progesterone da parte del CL. La PGF2α potrebbe interferire con
la capacità dell’LH di attivare la PKA, così come l’attività dell’adenilato ciclasi
diminuisce dopo la somministrazione della PGF2α. La PGF2α
può ridurre
l’attività della PKA aumentando la degradazione del cAMP, che causa un
aumento dell’attività della fosfodiesterasi [Agudo et al.,1984;Garverick et
al.,1985]. Inoltre, se la PKA è attivata costitutivamente nelle LLC, come è stato
suggerito, la capacità della PGF2α di sopprimere l’attività della PKA può
condurre alla diminuzione della secrezione di progesterone da parte delle LLC.
Effetti della PGF2α sull’utilizzo delle lipoproteine e sul rilascio di colesterolo
Se
gli
effetti
antisteroidogenici
della
PGF2α vengono
mediati
dalla
regolazione dell’assunzione delle lipoproteine o dallo stoccaggio e dal rilascio di
colesterolo, ci si aspetterebbe una riduzione dei recettori delle lipoproteine e/o
dell’attività della colesterolo esterasi. In vivo, la PGF2α provoca la diminuzione
della concentrazione luteinica dell’mRNA che codifica per il recettore delle LDL
[Rodgers et al.,1987; Tandesski et al.,1996], ma aumenta i livelli dell’mRNA
che codifica per le proteine che legano le HDL [Tandesski et al.,1996].
Sembra
che
la
PGF2α non
regoli
l’utilizzo
del
colesterolo
da
fonti
extracellulari. Tuttavia, l’attività della colesterolo esterasi non viene colpita dal
trattamento con la PGF2α nelle LLC degli ovini [Wiltbank et al.,1993].
Eventi immunomediati
Ci sono notevoli evidenze a sostegno del ruolo critico svolto dal sistema
immunitario nel processo della luteolisi.
I leucociti infiltrano il corpo luteo durante la luteolisi [Brännstrom e
Norman,1993;Murdoch et al.,1988]. Gli eosinofili, come i macrofagi, si
accumulano nel CL in regressione, prima che la concentrazione di progesterone
nel plasma inizi a diminuire in risposta ad un fattore chemiotassico, non ancora
identificato [Murdoch,1987]. Tuttavia, gli eosinofili non sono richiesti per far
progredire
la
regressione
del
CL
indotta
dalla
PGF2α
[Murdoch
e
Steadman,1988].
Il ruolo principale dei macrofagi, durante la regressione del CL, sembra
essere
di
fagocitare
le
cellule
luteiniche
degenerate
[Adams
e
Hertig,1969;Bulmer,1964; Paavola,1979;Pepperell et al.,1992] e degradare la
matrice extracellulare [Parker,1991; Tscheshe et al.,1986].
I macrofagi svolgono tre funzioni durante le prime fasi della luteolisi:
53
1. fagocitano le cellule luteiniche degenerate;
2. inibiscono la steroidogenesi mediata dalle citochine;
3. stimolano la secrezione di PGF2α da parte del CL.
Durante la luteolisi i linfociti T invadono il CL e secernono l’interferone γ
(INF-γ), che stimola la presentazione degli antigeni al complesso maggiore di
istocompatibilità sulla superficie delle cellule luteiniche [Fairchild e Pate,1989].
L’interleuchina-1 (IL-1), prodotta dai macrofagi, dai fibroblasti e dalle cellule
endoteliali [Paavola,1979], stimola la produzione di PGF2α nelle colture di
cellule luteiniche bovine [Nothnick e Pate,1990]. Inoltre, il fattore necrotico
tumorale α (TFN-α), prodotto dai macrofagi, inibisce la secrezione basale di
progesterone, e stimola la secrezione di PGF2α [Fairchild-Benyo e Pate,1992].
L’attrazione e l’infiltrazione dei leucociti nel parenchima luteinico, provoca un
aumento della produzione locale di citochine (in particolare di IL-1,di TNF-α, e
di IFN-γ), che stimolano, in fine , la sintesi di PGF2α da parte del CL e attivano i
macrofagi.
In sintesi, le cellule immunitarie e le citochine, sembrano avere un ruolo
nella luteolisi, regolando la sintesi della PGF2α, la steroidogenesi e la
fagocitosi.
Apoptosi
L’apoptosi [Martin et al.,1994;Schwartzman e Cidlowski,1993] è un processo
attivo attraverso il quale vengono eliminate popolazioni di cellule non essenziali
dagli stessi tessuti [Kerr et al.,1972]. Diversi cambiamenti, sia morfologici che
biochimici,
sono
caratteristici
delle
cellule
apoptotiche,
inclusi:
la
frammentazione nucleare, la comparsa di vescicole legate alla membrana che
contengono citoplasma, la frammentazione del DNA genomico e cambiamenti
nell’espressione genica. L’involuzione di alcune ghiandole endocrine, dopo la
rimozione del supporto o dell’attivazione degli ormoni trofici, attraverso uno
stimolo negativo, è realizzata attraverso l’apoptosi.
Le cellule della granulosa, private dell’FSH, vanno incontro al processo
apoptotico durante l’atresia follicolare [Hurwitz e Adashi,1992; Tilly,1997].
La PGF2α promuove l’apoptosi nelle cellule, compreso il corpo luteo [Sawyer
et al.,1990].
Le prime evidenze morfologiche che la cellula è apoptotica sono la comparsa
di frammenti nucleari che contengono la cromatina degenerata [Sawyer et
al.,1990], la riduzione del volume cellulare e la comparsa di frazioni
54
citoplasmatiche legate alla membrana [Kerr et al.,1972]. Questi frammenti
cellulari, o corpi apoptotici, sono bersagli per le cellule fagocitotiche del sistema
immunitario. I macrofagi aumentano il processo apoptotico nelle popolazioni di
cellule luteiniche attraverso la fagocitosi dei frammenti di queste cellule che
vengono avvolte da vescicole di membrana [Gemmell et al.,1976].
Un altro caratteristico comportamento dell’apoptosi è il taglio nucleosomale
del DNA genomico in frammenti di circa 185 bp (oligonucleosomi) [Arends et
al.,1990].
Le prove per un ruolo della PGF2α nell’apoptosi delle cellule luteiniche, sono
la comparsa degli oligonucleosomi, in risposta al trattamento con la PGF2α, nei
bovini [Juengel et al.,1993;Zheng et al.,1994], negli ovini [McGuire et
al.,1994;Rueda et al.,1995], negli uomini [Shikone et al.,1996], nei ratti
[Matsuyama et al.,1996] e nei suini [Bacci et al.,1996].
Recentemente si è sviluppato un crescente interesse intorno ai geni
(famiglia delle bcl-2) coinvolti nella regolazione dell’apoptosi [Martin e
Green,1995; Reed,1994; Korsmeyer,1995]. La prima proteina identificata che
regola l’apoptosi è bcl-2 (B cell lymphoma 2)[Korsmeyer,1992]. Bcl-2,
associata
alla
membrana,
previene
la
morte
cellulare
regolando
il
mantenimento del meccanismo omeostatico del Ca2+ [Baffy et al.,1993],
attenuando lo stress ossidativo [Hockenberry et al.,1993], e interagendo con
ras [Fernandez e Bischoff,1993] e bax [Kosmeyer,1995].
Bax (bcl-2 associated-gene-x) promuove l’apoptosi legandosi con bcl-2, e
impedendole, così, di svolgere le sue funzioni antiapoptotiche [Oltvai et
al.,1993]
e
promuovendo
direttamente
l’apoptosi
[Kosmeyer,1995].
La
proporzione tra bcl-2 e bax, nella cellula, è relazionata con il potenziale che ha
questa cellula di divenire apoptotica.
La proteina nucleare p53 stimola la morte cellulare attraverso l’apoptosi
incrementando il tasso di trascrizione del gene bax [Miyashita et al.,1994;
Miyashita
e
Reed,1995],
il
quale
reprime
la
trascrizione
di
bcl-2
[Kosmeyer,1995].
Sono stati identificati due omologhi di bcl-2, rispettivamente: bcl-xl e bcl-xs,
prodotte dallo splicing alternativo del gene bcl-x [Boise et al.,1993]. Bcl-xl
funziona come repressore dell’apoptosi (azione simile a bcl-2) mentre bcl-xs
mima l’azione di bax [Boise et al.,1993].
Durante la luteolisi nei bovini, l’mRNA che codifica per bax è elevata, mentre
l’mRNA che codifica per bcl-2rimane invariato [Rueda et al.,1997]; da ciò
risulta un incremento del rapporto tra bax e bcl-2, una situazione che provoca
l’apoptosi mediata da bax. Rimane ancora sconosciuto se l’aumento della
55
trascrizione dell’mRNA di bax sia mediato da p53. I livelli dell’mRNA di p53 non
aumentano durante la luteolisi [Rueda et al.,1997;Trott et al.,1997], tuttavia
l’attività di p53 può essere regolata principalmente a livello post-traduzionale
[Zambetti e Levine,1993].
Stress ossidativo
Le specie reattive dell’ossigeno sono integralmente coinvolte nella luteolisi e
nell’apoptosi
[Carlson
et
al.,1993;Riley
e
Behrman,1991].
Gli
anioni
superossidi, i radicali idrossilici e il perossido d’idrogeno (H2O2) sono le specie
reattive dell’ossigeno prodotte principalmente nelle cellule steroidogeniche
[Hornsby e Crivello,1983 (a); Hornsby e Crivello,1983].
Durante la luteolisi si assiste ad un incremento dello stress ossidativo e
sembra che siano i macrofagi i principali artefici di questo aumento [Simpson
et al.,1987].
56
Scopo I
La
coniglia
è
un
animale
poliestrale
ad
ovulazione
indotta
dall’accoppiamento o da trattamenti ormonali. Se all’ovulazione non si
associano la fecondazione e la fertilizzazione, nella coniglia, si instaura una
fase di pseudogravidanza, che si prolunga per un periodo di 15-18 giorni, al
termine dei quali si ha la regressione del CL.
Il ruolo dei fattori luteolitici nella coniglia è di estrema importanza, poiché,
riducendo la lunghezza della pseudogravidanza, acquisisce una capacità
riproduttiva molto elevata che le consente di riprodursi durante tutto l’arco
dell’anno
senza
periodi
di
anestro.
Ridurre
i
periodi
di
interparto
è
determinante a livello zootecnico e a fini economici. Nel coniglio la regressione
del CL è indotta dalla PGF2α di origine uterina. Da precedenti studi, effettuati
nei nostri laboratori, si è appreso che i CL divengono sensibili all’azione
luteolitica della PGF2α solo dopo alcuni giorni dall’ovulazione. Per quanto
riguarda le coniglie, l’aumento della sensibilità alla PGF2α è direttamente
proporzionale alla maturità dei CL. Si è visto che i corpi lutei sono refrattari (o
quasi) al trattamento con la PGF2α quando si trovano tra il 3° e il 5° giorno di
pseudogravidanza,
mentre
la
sensibilità
al
trattamento
aumenta
proporzionalmente all’età dei CL, fino a divenirne completamente sensibili dal
9° giorno di pseudogravidanza [Boiti et al., 1998]. Tuttavia, come avviene
anche in altre specie [Diaz e Wiltbank, 2005; Tsai e Wiltbank, 1998], il CL delle
coniglie non è completamente refrattario al trattamento con la PGF2α durante
le fasi iniziali del suo sviluppo, ma anche se avvengono molti cambiamenti a
livello molecolare e genetico la capacità steroidogenica dei CL non risulta
compromessa [Boiti et al., 2007; Zerani et al., 2007]. Ancora, però, non si
conoscono quali fattori sono attivati dalla PGF2α per promuovere la regressione
luteinica.
La regressione dei corpi lutei mediante il pathway apoptotico è stata
dimostrata in diverse specie [Sugino e Okuda,2007;Dharmarajan et al.,2004;
Nicosia et al.,1995].
L’obiettivo di questo studio è stato indagare se questa diversa sensibilità alla
PGF2α sia dovuta a meccanismi apoptotici o infiammatori o ad entrambi,
andando a confrontare gli effetti del trattamento della PGFα sull’espressione di
geni target per il processo apoptotico e del processo infiammatorio (IL-1β), in
CL nella fase luteinica precoce (4 giorni) e intermedia (9 giorni), al fine anche
di capire meglio, quali sono i meccanismi che proteggono i CL dalla
regressione, durante la fase iniziale del suo sviluppo. Inoltre, dal momento che
57
molte evidenze sperimentali hanno dimostrato che il 17β- estradiolo esercita
azioni sia luteotrofiche che luteolitiche, a seconda delle specie, attraverso
regolazione genica mediata dal suo recettore ER [Schams e Berisha, 2001],
siamo andati a studiare se il trattamento con la PGF2α sia in grado di
influenzare l’espressione genica di ERα, che è l’isoforma predominante
nell’ovaio di coniglio.
L’ormone rilasciante le gonadotropine (GnRH) è un decapeptide secreto
dall’ipotalamo che svolge un ruolo centrale di regolatore nella fisiologia
riproduttiva dei mammiferi. Il GnRH influenza i processi riproduttivi regolando
la sintesi e il rilascio delle gonadotropine ipofisarie, che a loro volta modulano
la steroidogenesi e la gametogenesi [Conn e Crowley,1994]. Le principali fonti
e i siti di azione del GnRH sono l’ipotalamo e l’ipofisi, ma molti studi hanno
riportato la presenza di un origine extraipotalamica del GnRH e anche la
presenza dei suoi recettori (GnRH-R) in numerosi organi periferici, inclusi gli
organi riproduttivi [Ramakrishnappa et al., 2005].
Tutti i recettori per il GnRH sono proteine transmembrana legate alle
proteine G che agiscono attivando la trasduzione del segnale mediante i
pathways delle fosfolipasi (PL): C (PLC), A2 (PLA2), D (PLD) o dell’adenilato
ciclasi (AC) [Millar,2005]. L’attivazione delle fosfolipasi potrebbe generare
acido arachidonico, che è convertito in prostaglandine dall’azione delle
cicloossigenasi 1 e 2, così come da altri enzimi prostaglandine sintasi
[Naor,2009]. Molti studi hanno evidenziato un effetto diretto del GnRH sui CL
nei conigli, ma hanno prodotto risultati contraddittori. L’obiettivo di questo
studio è stato quello di esaminare in vitro gli effetti modulatori del GnRH nei CL
di coniglie durante tre stadi luteali della pseudogravidanza: la fase precoce (4
giorni), la fase intermedia (9 giorni) e la fase tardiva (13 giorni).
58
Materiali e Metodi
Reagenti
I primer random esameri, la deossiribonucleasi I (DNAase I Amp.Grade), La
trascrittasi inversa RNAsi-H (SuperScript III Reverse Trascriptase), la RNAsi H
di Escherichia coli, i ladder di DNA, e anche i reagenti per l’isolamento e la
purificazione dell’RNA totale (TRIzol), la Taq DNA polimerasi (Taq Platinum), il
buffer PCR 10X, il MgCl2 50 mM, le provette RNAsi free, l’acqua RNAsi free e i
deossinucleotiditrifosfato (dNTPs), così come i primer disegnati sull’mRNA di IL1β , di ERα, di p53, di Bcl-x e di Bax sono stati ottenuti dall’ Invitrogen
(S.Giuliano Milanese, Milano, Italia).I primers costruiti su parte dell’RNA
ribosomiale
(rRNA)
della
subunità
18S
e
i
corrispondenti
competimeri
(QuantumRNA 18S Internal Standard) sono stati acquistati dall’ Applied
Biosystem (Monza,MI, Italia). Il kit Nucleospin Extract II, è stato acquistato
dalla Macherey Nagel Inc. (Bethlehem, PA, USA).
La [2,3-3H]L-arginina triziata, che ha un‘attività di 30-40 Ci/mmol, è stata
acquistata dall’Amersham Biosciences (Amersham Biosciences Ltd, Little
Chalfont, Bucks, UK).
Il NOS detectTM Assay Kit è stato comprato da Alexis Corp. (Läufelfingen,
Svizzera).
L’anticorpo
primario
monoclonale
di
topo
anti-ERα ,
utilizzato
per
l’immunoistichimica (IHC) è stato acquistato dalla Zymed (San Francisco, Ca,
USA). Dalla Santa Cruz Byotechnology (Santa Cruz, CA, USA) sono stati
comperati: gli anticorpi monoclonali di topo anti-p53, anti-Bcl-x e anti-Bax
utilizzati per l’ IHC e per il western blotting (WB), così come il reagente
Luminol per il WB, utilizzato per la rivelazione delle bande. L’anticorpo
secondario biotinilato di capra anti-topo, utilizzato per l’IHC è stato acquistato
dalla Vector Laboratories (Burlingame,CA,USA). Il complesso avidina-biotina
(ABC, Vector Elite Kit) e il cromogeno 3,3’-diaminobenzidina tetracloride (DAB)
è stato comprato dalla Vector Laboratories.
Il kit per il dosaggio delle proteine è stato acquistato da Bio-Rad
Laboratories (Hercules, CA, USA). Il ladder per il WB PageRulerTM è stato
ottenuto da Fermentas (Burlington, Ontario, Canada). L’anticorpo secondario
anti-topo, coniugato con la perossidasi di rafano, utilizzato per il WB e le
pellicole per la chemioluminescenza sono stati acquistati dalla Thermo Fisher
Scientific (Rockford, IL, USA).
59
L’anticorpo primario monoclonale diretto contro il recettore del GnRH
(GnRHR) è stato acquistato dalla BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA).
Il progesterone triziato, la PGF2α e la PGE2 sono stati comperati da
Amersham Biosciences (Amersham Biosciences Ltd, Little Chalfont, Bucks, UK),
mentre gli ormoni non radioattivi e gli antisieri specifici provengono dalla
Sigma (St. Luis, MO, USA).
Le piastre per l’incubazione dei tessuti luteali, provengono dalla Becton
Dickinson Co. (Clifton, NJ, USA), mentre, il medium 199 e la soluzione salina
bilanciata di Earle sono state acquistate dalla GIBCO (Grand Island, NY, USA).
L’HEPES (acido 4-2-idrossietil-1-piperazinil-etansolfonico) e l’albumina sierica
bovina (BSA) sono state comperati dalla Sigma. I seguenti preparati ormonali
sono stati iniettati per via intramuscolare: l’analogo dell’ormone che rilascia le
gonadotropine (GnRH) (Receptal, Hoechst-Russel Vet, Milano, Italia), e la
PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin; Folligon Intervet, Milano, Italia).
L’antagonista per il GnRH, antide, è stato acquistato dalla Sigma.
Gli altri reagenti sono stati ottenuti a livello locale
Protocollo sperimentale
I protocolli che coinvolgono il trattamento e l’uso degli animali, per questi
esperimenti, sono stati approvati dal Comitato di Bioetica dell’Università di
Perugia.
Valutazione degli effetti della PGF2α
Animali e regime ormonale
Sono state selezionate delle coniglie di razza New Zeland White, nullipare, di
circa 5 mesi di età e dal peso compreso tra 3,5 e 3,8 Kg. Le coniglie, sono
state allevate in gabbie singole, in condizioni controllate di luce (14 ore di luce,
10 ore di oscurità) e di temperatura (18°C). Gli animali sono stati alimentati ad
libitum con mangime commerciale.
Tutte le coniglie, al fine di indurre la pseudogravidanza, sono state trattate
per via intramuscolare, dapprima con 20 UI di PMSG, seguite, due giorni dopo,
da 0.8 µg di un analogo del GnRH (buserelin). Precedenti esperimenti,
effettuati nei nostri laboratori, hanno dimostrato che questo trattamento
60
ormonale induce effettivamente l’ovulazione nelle coniglie [Stradaioli et
al.,1997].
Il giorno in cui è stato somministrato il GnRH viene o indicato come giorno
0.
Trattamento con la PGF2α e raccolta dei tessuti luteali
Al 4° o al 9° giorno di pseudogravidanza, alle coniglie (18 animali per
gruppo), sono stati somministrati per via intramuscolare 200 µg di alfaprostolo
(un analogo della PGF2α).
Per ogni stadio luteinico, sono state sacrificate tre coniglie, mediante
dislocazione cervicale, subito prima (tempo 0) e ad 1.5, 3, 6, 12 e 24 ore dopo
la somministrazione della PGF2α. Subito dopo il sacrificio, da ogni animale, è
stato rimosso il tratto riproduttivo e lavato con soluzione salina. Entro pochi
minuti, i corpi lutei (CL) sono stati estratti dalle ovaie e, grazie ad un
ingrandimento stereoscopico, sono stati separati attentamente dal tessuto non
luteale. Per la successiva valutazione dell’espressione genica e proteica, i CL,
sono stati lavati con PBS privo di Rnasi e immediatamente congelati a -80°C.
Per il rilevamento immunistochimico di ERα, p53, Bcl-xL e Bax, sono state
sacrificate altre due coniglie, prima della somministrazione della PGF2α e dopo
6 ore dall’iniezione, sia a 4 giorni che a 9 giorni di pseudogravidanza.
Le ovaie, immediatamente dopo il sacrificio, sono state rimosse e fissate in
PBS (pH 7,4) contenente di formaldeide al 4% (w/v) per 24 ore a temperatura
ambiente, e successivamente trattate per l’inclusione in paraffina e seguite
dalle procedure di routine per la preparazione dei tessuti.
Da ogni coniglia sono stati prelevati tre campioni di sangue attraverso
prelievo a livello della vena marginale dell’orecchio, il primo dei quali, prima del
trattamento con il GnRH, il secondo prima della somministrazione della PGF2α
e il terzo immediatamente prima del sacrificio. I campioni di sangue sono stati
raccolti
in
provette
vacutainer
contenenti
EDTA
(acido
etilendiamminotetraacetico.) e centrifugati a 3000 giri per 15 minuti, al fine di
separare il plasma dalla parte corpuscolata. Il plasma, così ottenuto, è stato
immediatamente congelato e, successivamente, utilizzato per la valutazione
dello stato funzionale del CL tramite dosaggio della concentrazione del
progesterone. Ai fini di questa tesi di dottorato, si definiscono a) luteolisi
funzionale, quando vi sia il riscontro di una diminuzione del 50% della
concentrazione plasmatica di progesterone rispetto ai valori osservati prima del
trattamento (cioè prima della somministrazione della PGF2α) e b) luteolisi
61
completa, quando si apprezza una diminuzione dei livelli plasmatici di
progesterone al di sotto di 1,0 ng/ml (corrispondenti ai valori riscontrati nelle
coniglie in estro), cioè vi sia una incapacità del CL di secernere il progesterone
[Browning et al.,1980].
Immunoistochimica di ERα, p53, Bcl-x e Bax
Gli esperimenti di IHC sono stati effettuati su sezioni seriali di CL spesse 5
µm, con lo scopo di identificare la localizzazione cellulare di ERα, p53, Bcl-xL e
Bax, utilizzando i corrispondenti anticorpi primari monoclonali di topo diluiti
1:80, 1:100, 1:100, e 1:100, rispettivamente, e poi è stato aggiunto
l’anticorpo secondario biotinilato diluito 1:200 [Dall’Aglio et al.,2006].
Le sezioni, in cui non è stato aggiunto l’anticorpo primario, o è stato
sostituito da una pre-immunizzazione con le immunoglobuline gamma di topo,
sono state utilizzate come controllo negativo (colorazione aspecifica).
L’intensità
della
colorazione
è
convenzionalmente
considerata
come:
assente, debole, moderata e forte, quando la percentuale di positività delle
cellule di CL nelle sezioni per campo ottico del microscopio a fluorescenza è
rispettivamente di: <1, 1-10, 10-50, 50-100.
Estrazione dell’RNA e trascrizione inversa
L’RNA totale è stato estratto dai CL di tre coniglie per ogni stadio luteinico
[Boiti et al., 2004]. Le contaminazioni da DNA genomico sono state evitate
attraverso il trattamento con l’enzima deossiribonucleasi I, utilizzato secondo le
istruzioni date dalla casa produttrice.
5 µg di RNA totale (1 µg/µl) sono stati retro-trascritti in cDNA, in un volume
finale di 20 µl della mix di sintesi SuperScript III Reverse Trascriptase,
utilizzando
esameri
casuali,
seguendo
il
protocollo
fornito
dalla
casa
produttrice. Le eventuali contaminazioni di DNA genomico vengono controllate
attraverso una PCR effettuata col cDNA ottenuto da una retrotrascrizione nella
quale non è stato utilizzato l’enzima trascrittasi inversa (RT-).
Amplificazione mediante RT-PCR multiplex
Il protocollo per l’amplificazione mediante PCR multiplex è stato illustrato in
Boiti et al.,2004. Per la PCR è stato utilizzato, come stampo per i primer ERα,
IL-1β, p53, Bcl-x, Bax, e per il 18S (vedi tabella 1), 1 µl di cDNA luteinico
62
Le PCR eseguite per amplificare un frammento del cDNA di ERα, IL-1β, p53,
Bcl-x, Bax, consistono in un primo ciclo di denaturazione a 94 °C per 75
secondi, seguito da un numero variabile di cicli di amplificazione (vedi tabella
1) caratterizzati da un primo ciclo di denaturazione a 94 °C per 15 secondi,
seguito da uno di annealing a 60 °C per 30 secondi, e da uno di estensione a
72 °C per 45 secondi, ed uno step finale di estensione a 72 °C per 10 minuti.
All’interno di ogni esperimento e per ogni gene analizzato, l’intero set di
campioni è stato analizzato in parallelo in una singola PCR, utilizzando aliquote
della stessa mix di PCR.
Ogni set di determinazioni è stato eseguito in triplicato. L’rRNA 18S è un
controllo interno ideale per l’analisi quantitativa dell’ RNA poiché la sua
concentrazione rimane invariata a prescindere dai tessuti e dai trattamenti,
anche se la sua quantità relativamente elevata, lo rende difficile da usare in
esperimenti di RT-PCR poiché gli mRNA bersaglio sono di gran lunga meno
abbondanti. Comunque, per ovviare a questo problema e diminuire l’efficienza
della PCR a favore dell’amplificazione del cDNA per il 18S rendendola
comparabile a quella del gene studiato, viene mescolata l’appropriata quantità
di Primer 18S con il rispettivo competimero, che non è altro che un primer
modificato all’ estremità 3’ e che blocca l’estensione della DNA polimerasi.
63
Tabella 1: Sequenza dei primers per ERα, IL-1β, p53, Bcl-x, Bax, e per 18S
utilizzato come standard interno.
Lunghezza
Gene
ERα
bande bp
147
35
TGAGGCCGATGGTCCCAATTA
183
antisenso
35
AAGGCCTGTGGGCAGGGAAC
senso
GCTGCTCCGACAGCGATGGT
300
antisenso
30
CCCTCCCAGGACAGGCACAC
senso
ACAGCAGTGAAGCAGGCTCT
228
Bcl-x
antisenso
30
CATCTCCTTGTCCACGCTTT
CCTTTTGCTTCAGGGTTTCA
senso
165
Bax
cicli
CTGCGGCGTTGAACTCATA
senso
P53
Numero di
AGATCCAAGGGAATGAGCTG
senso
antisenso
IL-1β
Primers (5’-3’)
32
ATCCTCTGCAGCTCCATGTT
antisenso
TCAAGAACGAAAGTCGGAGGTT
Senso
489
18S
antisenso
GGACATCTAAGGGCATCA
Analisi dei prodotti di amplificazione
I prodotti amplificati, generati dalla PCR, sono stati analizzati (18 µl dei 25 µl
totali della reazione), tramite elettroforesi su gel di agarosio al 2% utilizzando
una colorazione al bromuro di etidio (0,5 µg/ml). Ogni gruppo di campioni su
gel è stato caricato assieme ad un controllo negativo privo di RNA e di ladder.
Le immagini dei gel sono state acquisite usando una fotocamera digitale Kodak
DC290. Per ogni prodotto di PCR, l’intensità della banda, corretta rispetto
all’intensità del background (OD assoluto sottratto dai livelli di background
dalle linee corrispondenti), è stata quantificata utilizzando il software Quantity
One (Bio-Rad).
Per quantificare l’mRNA relativo al gene d’interesse, l’intensità della banda
ottenuta da ciascun prodotto di PCR, è stata normalizzata con quella del gene
housekeeping 18S, coamplificata nella stessa aliquota, e il valore espresso in
unità arbitrarie.
64
Sequenziamento
Gli amplificati di tutte e tre le reazioni di PCR sono stati purificati con il Kit
Nucleospin Extract II. Il sequenziamento è stato eseguito con il metodo di
Sanger, che ha confermato la reale amplificazione della sequenza prefissata.
Western Blotting per p53, Bcl-xL e Bax
Per ogni coniglia, le proteine luteali totali, sono state estratte da un pool di 8
CL come descrito da Zerani e collaboratori [Zerani et al.,2004]. I CL sono stati
omogeneizzati in 1 ml di RIPA buffer freddo (PBS contenente 1% Igepal CA630, 0,5% sodio desossicolato, 0,1% SDS). Dopo incubazione a 4°C per 20
minuti, l’omogenato è stato centrifugato a 12.000 giri per 60 minuti a 4°C. La
concentrazione proteica del sopranatante è stata quantificata utilizzando un kit
per il saggio proteico e la BSA come standard. Un quantitativo di proteine pari
a 20 µg, sono state separate mediante elettroforesi su SDS-PAGE, in un gel di
poliacrilammide al 10% e con staking gel al 4%, per 40 minuti a 200V e
500mA. In seguito, le proteine, sono state trasferite su membrane di
nitrocellulosa, per 1 ora a 100 V e 350 mA. Le membrane sono state poi
bloccate con TBS contenente 0,05% di Tween 20 e il 5% di latte scremato in
polvere. In seguito, le membrane sono state incubate, sequenzialmente, con gli
anticorpi monoclonali anti-p53, anti-Bcl-xL e anti-Bax, tutti diluiti 1:500,
overnight a 4°C. Poi le membrane sono state incubate per 60 minuti a
temperatura ambiente, sotto lieve agitazione,con l’anticorpo secondario antitopo (1:20.000), coniugato con la perossidasi di rafano (HRP). Tutti gli
anticorpi son stati diluiti in TBS contenente il 5% latte scremato in polvere, e i
lavaggi, dopo ogni incubazione, sono stati fatti con PBS contenente lo 0.05% di
Tween-20.
Le
bande
sono
state
rilevate
usando
il
kit
per
ECL
(Enhanced
chemiluminescent) ed esposte su pellicole per raggi-X. La densità delle bande è
stata esaminata con il software Quantity One della Bio-Rad. Dopo ogni
incubazione con l’anticorpo secondario, le membrane sono state immerse nella
strip solution e poi incubate con l’anticorpo primario monoclonale di topo anti
β-tubulina (0.5 µg/ml), overnight a 4°C. La densità di ciascuna banda è stata
normalizzata con quella della β-tubulina corrispondente, utilizzata come
controllo interno, e i valori espressi in unità arbitrarie.
65
Determinazione dell’attività enzimatica della NOS
L’attività della NOS è stata determinata attraverso il monitoraggio della
reazione di conversione dell’ [3H]L-arginina a [3H]L-citrullina con un kit
commerciale di rilevazione della NOS, in accordo con le procedure sperimentali
descritte da Boiti e collaboratori nel 2004 [Boiti et al.,2004].
Dosaggio della concentrazione plasmatica del progesterone
La concentrazione del progesterone è stata determinata attraverso dosaggio
radioimmunologico (RIA), utilizzando specifici anticorpi in accordo con il
protocollo riportato nel lavoro di Boiti e collaboratori del 2000 [Boiti et
al.,2000]. Il progesterone viene estratto da 0,1 ml di plasma con etere etilico e
ogni campione viene saggiato in duplicato. La sensibilità del saggio è di 0,08
ng/ml, per il progesterone mentre i coefficienti di variazione intra e intersaggio sono, rispettivamente, di 5,3% e 10,2%.
Analisi statistica
I dati dell’espressione genica e proteica, dei livelli plasmatici di progesterone
e dell’attività enzimatica della NOS, sono stati analizzati con il test ANOVA
seguito
dal
test
di
Student-Newman-Keuls
t-test.
Le
differenze
sono
considerate significative per valori di P<0.01.
Valutazione della regolazione luteinica da parte del GnRH
Animali e regime ormonale
Le coniglie, di razza New Zeland White, dal peso compreso tra 3,5 e 4 Kg,
sono state selezionate e allevate in gabbie singole,in condizioni controllate di
luce (14 ore di luce, 10 ore di oscurità) e di temperatura (18°-24°C). Gli
animali sono stati alimentati ad libitum con mangime commerciale e hanno
avuto libero accesso all’acqua.
Tutte le coniglie sono state trattate, al fine di indurre la pseudogravidanza,
con 20 UI di PMSG, seguite, tre giorni dopo, da una iniezione intramuscolare di
0.8 µg di un analogo del GnRH (buserelin). Il giorno della somministrazione del
buserelin è stato indicato come giorno 0.
66
Prelievo dei tessuti
Dopo il sacrificio è stato rimosso, da ogni coniglia, il tratto riproduttivo, e
lavato con soluzione salina. Pochi minuti dopo il sacrificio, dalle ovaie sono stati
prelevati i CL, e ubito processati per le incubazioni in vitro. Per la rilevazione
immunoistochimica di GnRH-R, le ovaie prelevate (da due coniglie per stadio
luteinico) sono state fissate mediante immersione in una soluzione di PBS (pH
7,4) contenete formaldeide al 4% (w/v) per 24 ore, a temperatura ambiente, e
successivamente sono state incluse in paraffina e trattate con le procedure di
routine per la preparazione dei tessuti.
Incubazione in vitro
Per lo studio in vitro i CL appartenenti ai tre stadi luteinici: 4, 9 e 13 giorni
di pseudogravidanza, sono stati distribuiti (n=1/pozzetto) nelle piastre. In ogni
pozzetto è stato aggiunto 1 ml di medium 199 e soluzione salina bilanciata di
Earle (2,2 mg/ml di bicarbonato di sodio, 2,3 mg di HEPES) con BSA al 3%.
Prima del trattamento ogni CL è stato tagliato in 4 parti con delle forbicine. Ad
ogni gruppo sperimentale (totale 12 gruppi) e per ogni stadio luteinico, sono
stati assegnati 5 CL. I 12 gruppi sperimentali sono stati così suddivisi:
(I)
Medium come controllo;
(II)
Agonista del GnRH (Buserelin 200 nM);
(III)
Buserelin+antagonista del GnRH (antide, 100 nM);
(IV)
Buserelin+ inibitore della fosfolipasi A2 (PLA2) (4-bromofenacil
bromide, 2 µM);
(V)
Buserelin+ inibitore della fosfolipasi C (PLC) (composto48/80, 2
µM);
(VI)
Buserelin+ inibitore della fosfolipasi D (PLD) (propanololo, 10
µM);
(VII)
Buserelin+ inibitore dell’adenilato ciclasi (2-O-metiladenosina, 2
µM);
(VIII)
Buserelin+antagonista
dell’inositolo-1,4,5-trifosfato
(IP3)
(2-
aminoetil difenilborinato, 100 µM);
(IX)
Buserelin+ antagonista del diacilglicerolo (DAG) (1-esadecil-2-
acetil glicerolo, 100 µM);
(X) Buserelin+ inibitore della PKC (starosporine, 20 µM);
(XI)
Buserelin+ inibitore della COX (acido acetilsalicilico, 100 µM);
67
(XII)
Buserelin+ inibitore della NOS (N-nitro-L-arginina metil estere,
100 µM).
Ogni piastra di coltura è stata incubata a 37°C in atmosfera d’aria
contenente il 5% di CO2 per 4 ore, come descritto da Boiti e collaboratori [Boiti
et al.,2001]. Dopo 4 ore, da ogni pozzetto, è stato prelevato il medium di
coltura e questo è stato immediatamente congelato a -20°C per la successiva
rilevazione della concentrazione di progesterone.
Dosaggio radioimmunologico degli ormoni
La concentrazione di progesterone, di PGF2α e di PGE2 sono state
determinate mediante RIA [Boiti et al.,2000].
La concentrazione del progesterone è stata saggiata nel medium di coltura
dei 12 gruppi sperimentali, mentre la concentrazione della PGF2α e della PGE2
è stata saggiata solamente nel medium dei gruppi controllo e dei gruppi trattati
con il GnRH.
I coefficienti di variazione intra e inter-saggio e la dose minima rilevabile
sono rispettivamente per la PGF2α: 8%, 12% e 19 pg, per la PGE2: 7%, 13%,
18 pg e per il progesterone: 5%, 9%, 10 pg.
Determinazione dell’attività enzimatica
L’attività enzimatica delle COX 1 e 2, è stata determinata attraverso la
misurazione della scomparsa del substrato marcato radioattivamente [H3]AA
[Zerani et al.,2007]. Sono stati impiegati l’inibitore selettivo della COX-2 (NS398, 1 µM) e l’inibitore non selettivo della COX (acido acetilsalicilico, ASA, 1
mM). Per ogni campione, l’attività della COX-1 è stata determinata calcolando
la velocità di scomparsa del [H3]AA incubato con inibitore selettivo della COX-2.
Al contrario, l’attività enzimatica della COX-2 è stata determinata calcolando la
velocità di scomparsa del [H3]AA incubato senza l’inibitore selettivo della COX2, e al valore ottenuto è stato sottratto quello della COX-1. I valori ottenuti per
COX-1 e per la COX-2 sono stati corretti mediante sottrazione dei valori della
scomparsa del substrato [H3]AA, ottenuti da altre reazioni enzimatiche e non
enzimatiche.
L’attività di NOS è stata determinata attraverso il monitoraggio della
reazione
di
conversione
dell’[3H]L-arginina
a
[3H]L-citrullina
commerciale di rilevazione della NOS [Boiti et al.,2000].
con
kit
68
Immunoistochimica: recettore del GnRH di tipo I (GnRH-RI)
Le sezioni di tessuto sono state deparaffinate in xylene, reidratate con
etanolo e risciacquate in acqua distillata. Le stesse sezioni sono state,
sottoposte al recupero dell’antigene in una soluzione di citrato (10mM, pH6), e
messe nel forno a microonde per 10 minuti a 700 W. Le sezioni sono state fatte
raffreddare a temperatura ambiente e sottoposte a lavaggio con TBS buffer. I
campioni sono stati immersi in metanolo contenente H2O2 al 3% per 1 ora, per
attenuare l’attività endogena della per ossidasi, e successivamente sciacquati
sottoposti a lavaggio con TBS. La colorazione di fondo è stata prevenuta
incubando le sezioni con un siero normale di coniglio, diluito 1:10, per 30
minuti a temperatura ambiente. Poi i vetrini sono state incubate con l’anticorpo
primario monoclonale di capra anti-GnRH-R I (diluito 1:200 in TBS contenente
0,1 % di BSA), per 1 ora a 37°C e poi overnight a 4°C in una camera umida. Il
giorno dopo le sezioni sono state sottoposte a 3 lavaggi con TBS (5 minuti
ciascuno). Alla fine dei lavaggi sono state trattate di nuovo con un siero
normale di coniglio e poi incubate per 30 minuti, a temperatura ambiente, con
l’anticorpo secondario biotinilato anti-capra di coniglio, diluito 1:200 in TBS.
Dopo i lavaggi in TBS, le sezioni son state esposte al complesso ABC per 30
minuti, e di nuovo sciacquate con TBS. I siti di attività della perossidasi sono
stati visualizzati utilizzando come cromogeno il DAB kit, e successivamente i
campioni sono stati sciacquati 2 volte con acqua distillata per 5 minuti ,poi
colorati con ematossilina, lavati con acqua e in fine disidratati attraverso
passaggi in soluzioni di etanolo al 70, 95 e 100%, schiariti con xilene e
assemblati con un medium per microscopio a fluorescenza. Come controlli
negativi sono state utilizzate le sezioni di tessuto, non trattate con l’articorpo
primario, ma con TBS.
Retrotrascrizione del GnRH-R nei CL
Questo esperimento è stato effettuato per verificare la presenza del GnRH-R
nel CL di coniglio. Precedentemente le normali tecniche di retrotrascrizione e
PCR, fin qui utilizzate, non avevano mostrato una sensibilità tale da rilevare la
presenza del trascritto per il GnRH-R nei CL. Per ovviare a questo problema ed
aumentare la sensibilità dell’amplificazione, abbiamo sostituito, durante la
retrotrascrizione, i random esameri con una coppia di primers specifica per
GnRH-R. Il cDNA ottenuto con questa retrotrascrizione è stato utilizzato per
69
una PCR con i primers specifici per il GnRH-R (Tabella 2), che riconoscevano
una sequenza interna a quella amplificata con la prima coppia di primers. Come
ulteriore prova è stata effettuata una retrotrascrizione utilizzando gli oligo(dT)
al posto dei random esameri. Come stampo per la prima retrotrascrizione è
stato utilizzato RNA totale estratto da CL di 4 giorni di pseudogravidanza a 0,
6, 12 ore di trattamento con la PGF2α (Figura 17).
Analisi statistica
I dati relativi agli effetti dei trattamenti in vitro sui livelli ormonali, e sulle
attività enzimatiche sono stati analizzati con il test ANOVA seguito dal t-test di
Student-Newman-Keuls. Le differenze sono state considerate significative a
P<0,01.
70
Risultati
Valutazione degli effetti della PGF2α
Induzione in vivo della luteolisi
La concentrazione plasmatica di progesterone, utilizzata come marker
dell’attività funzionale del CL, era bassa (0,6±0.3 ng/ml) in tutte le coniglie
prima
dell’induzione
dell’ovulazione.
La
concentrazione
plasmatica
di
progesterone diminuisce dopo 12 ore (P< 0,01) dal trattamento con la PGF2α
nelle coniglie a 9 giorni di pseudogravidanza, e la completa regressione
funzionale viene raggiunta 24 ore (P<0,01) più tardi quando i livelli di
progesterone diminuiscono fino ai valori basali trovati durante l’estro (Figura:
5). Come ci si aspettava, la PGF2α non è in grado di indurre la regressione
funzionale quando viene somministrata a 4 giorni di pseudogravidanza.
Plasma progesterone after
PGF2α analogue injection
14
Progesterone (ng/mL)
Day 9
Day 4
12
10
8
6
4
2
0
0
1.5
3
6
*
*
12
24
Hours post-treatment
Figura:5. Concentrazione plasmatica di progesterone in campioni sangue
raccolti a 0, 1.5, 3, 6, 12 e 24 ore dopo la somministrazione dell’analogo
sintetico della PGF2α, a 4 e 9 giorni di pseudogravidanza. Oltre al punto 0,
ciascun dato rappresenta la media±SD del valore derivato da tre coniglie
diverse. Gli asterischi indicano valori di concentrazione, del progesterone,
significatamene differenti (P<0,01) rispetto al tempo 0
71
CL a 4 giorni
ERα
CL a 9 giorni
ERα
50 µm
ERα
ERα
ERα
50 µm
50 µm
50 µm
A
B
C
D
p53
3
p53
50 µm
50 µm
E
Bax
Bax
L
0
50 µm
H
Bax
50 µm
50 µm
I
50 µm
G
F
p53
x
p53
Bax
50 µm
50 µm
M
N
6
0
Ore dopo il trattamento con la PGF2α
6
Figura:6.
Dettagli
di
microfotografie
di
CL
derivati
dall’analisi
immunoistochimica di ERα, p53 e Bax in ovaie di coniglio prelevate a 4 e 9
giorni di pseudogravidanza prima (ora 0) e 6 ore dopo la somministrazione di
PGF2α. Le reazioni positive sono mostrate colorate di marrone. ERα, p53 e Bax
mostrano reazioni positive nucleari di diverse intensità all’interno delle cellule
luteiniche. Scala a barra: 50 µm.
Immunolocalizzazione di ERα, p53, Bcl-xl e Bax
Utilizzando anticorpi monoclonali, le reazioni positive per ERα e p53 sono
state osservate nel nucleo delle cellule luteiniche sia nei CL di 4 che in quelli di
9 giorni (Figura:6). Inoltre, sia ERα che p53 sono visibili sia prima che dopo la
somministrazione della PGF2α. Nei CL di 4 giorni di pseudogravidanza
(Figura:6, pannelli A e B) la reazione immunitaria è più intensa e il numero
delle cellule immunoreattive (IR) per ERα è molto maggiore che in quelle nei
CL di 9 giorni di pseudogravidanza (Figura:6 pannelli C e D) dopo 6 ore dal
trattamento con la PGF2α. Prima del trattamento, il numero delle cellule IR per
72
p53 è simile sia nei CL di 4 e di 9 giorni, ma diminuisce dopo 6 ore, mentre
l’intensità delle IR rimane invariata (Figura:6 pannelli E-F).
La colorazione positiva per Bax è stata osservata nel citoplasma delle cellule
luteiniche sia nei CL di 4 che di 9 giorni. Prima della somministrazione della
PGF2α. la reazione immunoreattiva è più evidente, nei CL di 4 rispetto a quelli
di 9 giorni, così come il numero delle cellule IR per Bax è molto maggiore nei
CL di 4 giorni (Figura:6, pannelli I-N). Ad entrambi gli stadi luteali, dopo 6 ore
dall’iniezione diminuisce sia il numero che l’intensità delle cellule IR per Bax
(Figura:6, pannelli L e N).
Indipendentemente
dalla
fase
luteinica,
non
è
stata
osservata
una
colorazione per Bcl-xL, sia prima che dopo la somministrazione della PGF2α.
Nelle sezioni in cui al posto dell’anticorpo primario è stato aggiunto un siero
normale, non si è verificata nessuna colorazione.
50 µm
Figura: 7. Immunocolorazione per Bcl-xL nell’ovaio di coniglio prelevato a 4
giorni di pseudogravidanza. I segnali positivi sono rilevati da colorazione
marrone. La reazione positiva è visibile nel citoplasma dell’ovocita, all’interno
del follicolo primario.
Scala a barra: 50 µm
73
ERα mRNA levels in rabbit
CL after PGF2α injection
1.2
Day-4
Day-9
ERα/18S Ratio
Arbitrary units
1.0
0.8
a
*
a
a
a
a
0.6
a
aa
a
0.4
c
0.2
c
b
0.0
0
1.5
3
6
12
24
Hours post-treatment
Giorno 4
18S 489 bp
ERα 147 bp
Giorno 9
18S 489 bp
ERα 147 bp
LD
PCR-
0
1.5
3
6
12
24
Figura: 8. Abbondanza relativa dell’mRNA di ERα nei CL prelevati subito prima
e a differenti intervalli di tempo dopo l’iniezione di PGF2α a 4 e 9 giorni di
pseudogravidanza. Il pannello in basso mostra una tipica fotografia di un gel
d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle
bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers
specifici per Erα (147 bp) e 18S (489 bp). LD: indica il marker per la lunghezza
del DNA, PCR-:indica il controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono
alle ore dopo la somministrazione della PGF2α. Per ogni stadio luteale, il valore
(media±SD) deriva da analisi densitometrica di ERα, riportata in unità
arbitrarie relative all’espressione del 18S, combinate con i risultati provenienti
da tre diverse coniglie, per ogni ora di trattamento. Per ogni stadio luteinico,
differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente
diverso (P<0,01). L’asterisco indica una significativa differenza (P<0,01) dei
valori prima del trattamento (ora 0) tra gli stadi luteinici.
74
IL-1β mRNA levels in rabbit
CL after PGF2α injection
2.0
Day-4
Day-9
d
IL-1β/18S Ratio
Arbitrary units
1.6
c
c
1.2
bb
b
b
a
b
a
0.8
a
a
0.4
0.0
0
1.5
3
6
12
24
Hours post-treatment
Giorno 4
18S 489 bp
IL-1β 183 bp
Giorno 9
18S 489 bp
IL-1β 183 bp
LD
PCR-
0
1.5
3
6
12
24
Figura:9. Abbondanza relativa dell’mRNA di IL-1β nei CL prelevati subito prima
e a differenti intervalli di tempo dopo l’iniezione di PGF2α a 4 e 9 giorni di
pseudogravidanza. Il pannello in basso mostra una tipica fotografia di un gel
d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle
bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers
specifici per IL-1β (183 bp) e 18S (489 bp). LD: indica il marker per la
lunghezza del DNA, PCR-: indica il controllo negativo, mentre le altre corsie
corrispondono alle ore dopo la somministrazione della PGF2α. Per ogni stadio
luteale, il valore (media±SD) deriva da analisi densitometrica di IL-1β, riportata
in unità arbitrarie relative all’espressione del 18S, combinate con i risultati
provenienti da tre diverse coniglie, per ogni ora di trattamento. Per ogni stadio
luteinico, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore
significativamente diverso (P<0,01).
Espressione genica di ERα e IL-1β
Prima del trattamento i livelli di mRNA di ERα son più bassi (p<0,01) nei CL
di 4 giorni rispetto a quelli di 9 giorni di pseudogravidanza (Figura: 8).
Nei
CL
di
4
giorni
la
concentrazione
dell’mRNA
di
ERα
rimane
approssimativamente costante durante le 24 ore dal trattamento. Invece, a 9
75
giorni di pseudogravidanza i livelli dell’mRNA diminuiscono gradualmente fino a
valori prossimi allo zero (P<0,01) entro le 6 ore dalla somministrazione della
PGF2α, e nelle ore successive rimangono, comunque, a livelli bassi (Figura: 8).
Prima della somministrazione di PGF2α la quantità relativa dell’mRNA dell’IL1β, è simile nei CL di entrambe le fasi luteiniche (Figura:9). In seguito al
trattamento i livelli di mRNA dell’Il-1β aumentano gradualmente durante le
prime 3 ore dal trattamento, sia nei CL di 4 che in quelli di 9 giorni (Figura:9).
A 4 giorni di pseudogravidanza, l’abbondanza relativa dell’mRNA dell’IL-1β
aumenta di 2 volte (P<0,01), rispetto ai livelli basali, dopo 3 ore dalla
somministrazione della PGF2α, e poi diminuisce durante le ore successive fino a
tornare ai livelli prima del trattamento. Mentre nei CL di 9 giorni il picco si
registra a 6 ore dall’iniezione della PGF2α, e nelle ore successive i livelli di
mRNA diminuiscono gradualmente fino a tornare ai livelli prima della
somministrazione della PGF2α.
Espressione genica di p53, Bcl-xL e Bax.
Prima della somministrazione della PGF2α i livelli di mRNA di p53 sono
comparabili sia nei CL di 4 che in quelli di 9 giorni (Figura:10, A e B). A 4 giorni
di pseudogravidanza l’abbondanza relativa di mRNA di p53 diminuisce
gradualmente durante le 24 ore dopo il trattamento. Nei CL di 9 giorni i livelli
di mRNA di p53 aumentano (P<0,01) fino a 3 ore dopo la somministrazione
della PGF2α, e nelle ore successive diminuiscono gradualmente fino a valori
inferiori a quelli prima del trattamento (Figura:10, A e B).
I livelli basali di mRNA di Bcl-x sono più alti (P<0,01) nei CL di 4 giorni che
in quelli di 9 giorni (Figura:11 C e D). A 4 giorni di pseudogravidanza,
l’abbondanza relativa di mRNA di Bcl-x rimane pressoché costante durante le
24 ore successive alla somministrazione della PGF2α. Mentre nei Cl nella fase
tardiva luteinica, i livelli dei trascritti di Bcl-x iniziano a diminuire (P<0,01) 6
ore dopo il trattamento fino a raggiungere valori molto bassi (P<0,01) 24 ore
dopo la somministrazione di PGF2α (Figura: 11 C e D).
L’abbondanza relativa dei trascritti di Bax, prima del trattamento, è simile in
entrambe le fasi luteiniche. A 4 giorni di pseudogravidanza, i livelli di mRNA di
Bax non sono colpiti dal trattamento (Figura: 11, A e B). Nei CL di 9 giorni,
l’espressione dell’mRNA di Bax rimane agli stessi livelli per le prime 3 ore dal
trattamento, nelle ore successive diminuisce (P<0,01) fino a dimezzare la
propria espressione (Figura:11, A e B).
76
A
18S 489
bp
Giorno 4
p53 300 bp
18S 489 bp
Giorno 9
p53 300 bp
LD
PCR-
1.6
0
1.5
B
p53/18S Ratio
Arbitrary units
1.2
1.0
6
12
24
Day-4
Day-9
c
c
1.4
3
a
a
a
a
b
0.8
b
b
b
0.6
b
b
12
24
0.4
0.2
0.0
0
1.5
3
6
Hours post-treatment
C
0.6
D
Day-4
Day-9
c
Giorno 4
p53
(53 kDa)
Giorno 9
p53/β-tubulin
Arbitrary units
0.5
c
c
c
0.4
0.3
b
b
0.2
b
d
Giorno 4
β-tubulina
Giorno 9
0.1
a
0.0
0
1.5
3
6
12
24
a
a
d
0
1.5
3
6
12
24
Hours post-treatment
Figura:10. Abbondanza relativa dell’mRNA dell’espressione proteica di p53, in
CL prelevati subito prima e a differenti intervalli di tempo dopo l’iniezione di
PGF2α a 4 e 9 giorni di pseudogravidanza. Il pannello A mostra una tipica
fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra
la presenza delle bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR
utilizzando primers specifici per p53 (300 bp) e 18S (489 bp). LD: indica il
marker per la lunghezza del DNA, PCR-:indica il controllo negativo, mentre le
altre corsie corrispondono alle ore dopo la somministrazione della PGF2α. Per
ogni stadio luteale, il valore (media±SD) deriva da analisi densitometrica di
p53, in B, riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del 18S. In C è
rappresentato l’immunoblot di p53 e della β-tubolina; in D, è rappresentata
l’analisi densitometrica riportata in unità relative, normalizzata con la βtubolina. Per ogni stadio luteinico, i valori sono conbinati con i risultati
provenienti da tre diverse coniglie, per ogni ora di trattamento. Per ogni stadio
luteinico, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore
significativamente diverso (P<0,01).
77
A
Giorno 4
1.0
18S 489 bp
Bax 165 bp
0.8
Bax/18S Ratio
Arbitrary units
Giorno 9
18S 489 bp
Bax 165 bp
LD
PCR-
0
1.5
3
6
12
B
24
a
Day-4
Day-9
a
a
a
a
a
a
a
0.6
a
b
b
b
0.4
0.2
0.0
Giorno 4
LD
PCR-
0
1.5
3
6
12
0
1.5
3
6
12
24
Hours post-treatment
24
18S 489 bp
C
Bcl-x 228 bp
Giorno 9
18S 489 bp
Bcl-x 228 bp
0
2.0
1.5
3
6
D
12
Bcl-x/18S Ratio
Arbitrary units
*a
a
a
a
3
a
a
0.8
a
a
a
b
0.4
0.0
PCR-
Day-4
Day-9
1.6
1.2
24
0
1.5
3
6
b
b
12
24
Hours post-treatment
Bax/Bcl-x mRNA ratio
LD
E
Day 4
Day 9
b
2
a
a
1
0
a
a
a
a
*a
a
0
1.5
a
3
a
a
6
12
24
Hours post-treatment
Figura:11. Abbondanza relativa dell’mRNA di Bax e Bcl-xL nei CL prelevati
subito prima e a differenti intervalli di tempo dopo l’iniezione di PGF2α a 4 e 9
giorni di pseudogravidanza. A e C mostrano una tipica fotografia di un gel
d’agarosio al 2%, colorato con bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle
bande di lunghezza aspettate, ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers
specifici per Bax (165 bp), e per Bcl-xL (228 bp) e per 18S (489 bp). LD: indica
il marker per la lunghezza del DNA, PCR-:indica il controllo negativo, mentre le
altre corsie corrispondono alle ore dopo la somministrazione della PGF2α. B e D
mostrano i dati dell’analisi densitometrica di Bax e Bcl-xL, riportati in unità
arbitrarie relative all’espressione del 18S. Il pannello E, mostra i cambiamenti
quantitativi dell’espressione dell’mRNA di Bax e BCl-xL, espressi dal rapporto
Bax/Bcl-xL. Per ogni stadio lutenico, il valore dell’espressione genica
(media±SD) combina i risultati provenienti da tre diverse coniglie, per ogni ora
di trattamento. Per ogni stadio luteinico, differenti lettere, sopra le colonne,
indicano un valore significativamente diverso (P<0,01). L’asterisco indica una
significativa differenza (P<0,01) dei valori prima del trattamento (ora 0) tra gli
stadi luteinici.
78
A
2.0
1.8
Giorno 4
Giorno 9
Giorno 4
β-tubulina
Giorno 9
Day-4
Day-9
*a
1.6
Bax/β-tubulin
Arbitrary units
Bax
(21 kDa)
B
1.4
1.0
0.8
0.6
a
0.4
0.0
1.5
3
6
12
b a
b
b
0
24
1.5
b
a
a
0.2
0
c
c
1.2
3
6
a
12
24
Hours post-treatment
C
0.8
β-tubulina
Giorno 4
0
1.5
3
6
12
24
Day-4
b
Bcl-xL/β-tubulin
Arbitrary units
Bcl-xL
(30 kDa)
Giorno 4
D
0.7
0.6
0.5
0.4
a
0.3
a
0.2
0.1
0.0
0
1.5
3
6
12
24
Hours post-treatment
Figura:12. Abbondanza relativa delle proteine di Bax e Bcl-xL nei CL prelevati
subito prima e a differenti intervalli di tempo dopo l’iniezione di PGF2α a 4 e 9
giorni di pseudogravidanza. A e C rappresentano, rispettivamente,
l’immunoblot di Bax e Bcl-xL, e della β-tubolina; B e C mostrano l’analisi
densitometrica , rispettivamente di Bax e di Bcl-xL, riportata in unità arbitrarie
relative alla β-tubulina. Per ogni stadio lutenico, il valore dell’espressione
proteica (media±SD) combina i risultati provenienti da tre diverse coniglie, per
ogni ora di trattamento. Per ogni stadio luteinico, differenti lettere, sopra le
colonne, indicano un valore significativamente diverso (P<0,01). L’asterisco
indica una significativa differenza (P<0,01) dei valori prima del trattamento
(ora 0) tra gli stadi luteinici
Espressione proteica di p53, Bcl-x e Bax
Le variazioni dell’espressione delle proteine di p53,di Bcl-x e di Bax sono
state analizzate mediante western blotting dopo il trattamento con la PGF2α,
nei CL di entrambe le fasi luteiniche (Figura:10, 12). Prima del trattamento le
proteine p53 sono poco espresse sia nei CL di 4 che di 9 giorni. Dopo la
somministrazione della PGF2α si registra un aumento (P<0,01) dell’espressione
proteica in entrambe le fasi luteiniche (Figura:10, C e D). A 4 giorni
l’espressione della proteina p53 aumenta (P<0,01) di circa 30 volte 3 ore dopo
il trattamento, e nelle ore successive, diminuisce fino a valori 8 volte maggiori
79
(P<0,01) rispetto a quelli prima del trattamento (Figura:10 C e D). Nei Cl della
tarda fase luteale, i livelli dell’espressione proteica di p53 aumentano
gradualmente
(P<0,01)
dopo
la
somministrazione
della
PGF2α,
fino
a
raggiungere livelli 12 volte maggiori dopo 12 ore rispetto a quelli prima del
trattamento, e poi diminuiscono fino a 24 ore dopo l’iniezione della PGF2α
raggiungendo valori 3 volte maggiori rispetto a quelli osservati prima della
somministrazione (Figura:10, C e D).
Prima del trattamento l’espressione della proteina Bax è 5 volte maggiore
(P<0,01) nei CL di 4 giorni rispetto a quelli di 9 (Figura:12, A e B). A 4 giorni di
pseudogravidanza, l’espressione proteica di Bax diminuisce di 4 volte (P<0,01)
1,5 ore dopo la somministrazione di PGF2α e nelle ore successive rimane più o
meno agli stessi bassi livelli, ma a 12 ore dopo il trattamento si registra un
picco (Figura:12, A e B). Nei CL di 9 giorni, i livelli di espressione proteica di
Bax rimangono relativamente simili a quelli osservati prima del trattamento,
ma dopo 24 ore dall’iniezione della PGF2α si osserva un aumento di 5 volte
(P<0,01) rispetto ai valori precedenti (Figura:12,A e B).
Prima del trattamento non sono state rilevate bande per BCL-xL, sia nei CL
di 4 che di 9 giorni (Figura:12, C e D). Nei CL a 4 giorni di pseudogravidanza è
stata rilevata una debole espressione proteica di Bcl-xL solo dopo 6, 12 e 24
ore dopo il trattamento, e a 12 ore c’è un incremento dell’espressione proteica
di PGF2α. A 9 giorni di pseudogravidanza non è stata rilevata nessuna
reattività verso questa proteina (Figura:12, C e D).
Attività enzimatica della NOS
L’attività enzimatica totale della NOS luteinica, prima del trattamento, è
comparabile in entrambe le fasi luteiniche (Figura:13).Durante le prime 3 ore
dalla somministrazione della PGF2α, l’attività enzimatica di NOS aumenta di
circa 2 volte (P<0,01) sia nei CL di 4 che di 9 giorni (Figura:13). Nelle ore
successive, l’attività enzimatica diminuisce (P<0,01) fino a raggiungere i valori
osservati prima del trattamento nei Cl di 4 giorni, mentre nei CL di 9 giorni
continua ad aumentare(P<0,01) fino a 6 ore dopo la somministrazione della
PGF2α, e poi diminuisce (P<0,01) raggiungendo i valori basali (Figura:13).
80
Total NOS activity in rabbit
CL after PGF2α injection
40000
dpm mg/protein
Day-4
Day-9
c
b
30000
b
b
b
20000
a
a
10000
0
a
a
0
a
a
12
24
c
1.5
3
6
Hours post-treatment
Figura:13. Attività totale di NOS nei CL prelevati subito prima e a differenti
intervalli di tempo dopo l’iniezione di PGF2α a 4 e 9 giorni di pseudogravidanza.
Per ogni stadio lutenico, i valori (media±SD) combinano i risultati provenienti
da tre diverse coniglie, per ogni ora di trattamento. Per ogni stadio luteinico,
differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore significativamente
diverso (P<0,01).
Valutazione della regolazione luteinica da parte del GnRH
Esperimenti in vitro
La secrezione basale di progesterone, in vitro, è più alta nei CL di 9 giorni
(P<0,01) rispetto a quelli di 4 e 13 giorni, ma la secrezione nei CL di 13 giorni
è più alta (P<0,01) rispetto a quella dei CL di 4 giorni (Figura 14, A).
Il buserelin riduce (P<0,01) la secrezione di progesterone in vitro sia nei CL
di 9 e di 13 giorni, ma non ha effetto sui CL di 4 giorni (Figura 14, A). La coincubazione del buserelin con l’antide, con il composto 48/80, con il 2-aminoetil
difenilborinato,
con
1-esadecil-2-acetil-sn-glicerolo
o
con
staurosporine
neutralizza (P<0,01) gli effetti del solo buserelin sui CL di 9 e 13 giorni
(Figura__). Il co-trattamento con buserelin e acido salicilico o con l’inibitore
della metil estere N-nitro-L-arginina aumenta la secrezione di progesterone
(P<0,01) sia nei CL di 9 e di 13 giorni (Figura 14, A). La co-incubazione del
81
buserelin
con
il
4-bromofenacil
bromide,
con
propanololo o
con
2-O-
metiladenosina non neutralizza gli effetti del solo buserelin sui CL di 9 e di 13
giorni.
La secrezione basale di PGF2α, in vitro, è più alta (P<0,01) nei CL di 13
giorni rispetto a quelli di 4 e di 9 giorni, ma la secrezione della PGF2α è più
elevata (P<0,01) nei CL di 9 giorni rispetto a quelli di 4 giorni (Figura 14, C). Il
trattamento con il buserelin aumenta (P<0,01) la secrezione della PGF2α, in
vitro, sia a 9 che a 13 giorni di pseudogravidanza (Figura 14, C). Il cotrattamento del buserelin con antide, con l’inibitore della PLC, con l’antagonista
di IP3, con l’antagonista del DAG o con l’inibitore della PKA non contrasta
(P<0,01) gli effetti del solo buserelin nei CL di 9 e 13 giorni (Figura 14, C). Il
co-trattaemento con buserelin e l’inibitore della COX diminuisce (P<0,01) la
secrezione di PGF2α nei CL di tutte e tre le fasi luteali, mentre la coincubazione con l’inibitore della NOS non provoca effetti sulla secrezione,
indotta dal buserelin, della PGF2α (Figura 14, C).
La secrezione basale della PGE2, in vitro, è più elevata (P<0,01) nei CL di 4
giorni rispetto a quelli di 9 e di 13 giorni (Figura 14, B). Il trattamento con il
buserelin riduce (P<0,01) la secrezione, in vitro, della PGE2 nei CL di 13 giorni
(Figura 14, B). Il co-trattamento del buserelin con antide, con l’inibitore della
PLC , con l’antagonista di IP3, con l’antagonista del DAG o con l’inibitore della
PKA contrasta (P<0,01) gli effetti del buserelin da solo sui CL di 13 giorni
(Figura 14, B). Il co-trattamento con l’inibitore della COX diminuisce (P<0,01)
la secrezione della PGE2 nei CL di tutte e tre le fasi luteali, mentre il cotrattaemnto con l’inibitore della NOS non provoca nessun effetto sulla
secrezione, indotta dal buserelin, della PGE2 (Figura 14, B).
Attività enzimatica
L’attività enzimatica basale della COX-1 è più alta (P<0,01) nei CL di 13
giorni rispetto a quella dei CL di 4 e 9 giorni (Figura 15, A). Tutti i trattamenti
non provocano alcun effetto sull’attività enzimatica della COX-1 in tutti e tre i
tipi di CL, ad eccezione dell’inibitore della COX-1 che, invece, provoca la
diminuzione (P<0,01) dell’attività enzimatica (Figura 15, A).
L’attività enzimatica basale della COX-2, dei CL di 13 giorni, è più alta
(P<0,01) rispetto a quella dei CL di 4 e 9 giorni; tuttavia l’attività enzimatica
della COX-2 è comunque più alta (P<0,01) nei CL di 9 giorni rispetto a quella
dei CL a 4 giorni di pseudogravidanza (Figura 15, B).Il buserelin aumenta
(P<0,01) l’attività enzimatica della COX-2 in tutti gli stadi luteinici (Figura 15,
82
B). Il co-trattamento del buserelin con antide, con l’inibitore della PLC , con
l’antagonista di IP3, con l’antagonista del DAG o con l’inibitore della PKA
contrasta (P<0,01) gli effetti del buserelin da solo (Figura 15, B). Il cotrattaemento
con
l’inibitore
della
COX
diminuisce
(P<0,01)
l’attività
enzimaticain tutti e tre i tipi di CL; mentre la co-incubazione del buserelin con
l’inibitore della NOS non ha effetti sull’aumento, indotto dal buserelin,
dell’attività enzimatica di COX-2 (Figura 15, B).
L’attività enzimatica basale di NOS è più elevata (P<0,01) nei CL di 4 giorni
rispetto a quelli di 9 giorni (Figura 15, C). Il trattamento con il buserelin
aumenta (P<0,01) l’attività enzimatica della NOS sia nei CL di 9 che di 13
giorni (Figura 15, C). Il co-trattamento del buserelin con antide, con l’inibitore
della PLC , con l’antagonista di IP3, con l’antagonista del DAG o con l’inibitore
della PKA contrasta (P<0,01) gli effetti del buserelin da solo sia nei CL di 9 che
in quelli di 13 giorni (Figura 15, C).Il co-trattamento con l’inibitore della NOS
diminuisce (P<0,01) l’attività enzimatica della NOS in tutte e tre gli stadi
luteinici, mentre il co-trattamento con buserelin e l’inibitore della COX ne
provoca la diminuzione (P<0,01) sia nei CL di 9 che in quelli di 13 giorni
(Figura 15, C).
Immunolocalizzazione di GnRH-R tipo I
L’immunopositività per GnRH-R I è stata rilevata nel citoplasma delle cellule
luteiniche e endoteliali (Figura 16, 1a);inoltre è stata trovata nel citoplasma
degli ovociti e nel citoplasma delle cellule follicolari e della teca presenti sia nei
follicoli antrali che nei follicoli pre-antrali (Figura 16, 1b). L’immunopositività è
stata evidenziata anche nel citoplasma degli ovociti delle cellule follicolari allo
stadio di follicoli primordiali (Figura 16), nell’epitelio ovario (Figura 16), e nelle
cellule endocrine interstiziali (Figura 16). Le cellule dei fibroblasi intermedi
entro i CL non hanno mai mostrato segnali di positività. Durante le tre fasi
luteiniche,
non
sono
state
osservate
differenze
nella
localizzazione
e
nell’intensità. Le procedure di colorazione controllo non hanno rilevato un
segnale positivo apprezzabile in nessuno dei siti descritti per il GnRH-R (inserto
Figura 16).
Espressione genica del GnRH-R nel CL
Attraverso questa modifica del protocollo standard per la retrotascrizione
siamo riusciti a rilevare con elevata specificità la presenza del GnRH-R nei CL di
83
coniglio e aumentare la sensibilità della PCR. Il trascritto non è stato rilevato
nel campione di CL retrotrascritto con random esameri mentre è ben visibile sia
nei campioni retrotrascritti con gli oligo(dT) che in quelli rettrotrascritti con la
coppia di primers specifica per il GnRH-R (Figura 17).
84
A
Progesterone (pg/mg of protein)
10000
Day 4
Day 9
Day 13
8000
6000
a
α
a
PGE2 (pg/mg of protein)
1000
a
a
PGF2α (pg/mg of protein)
a
a
a
a
a
a
a
Day 4
Day 9 a
Day 13
α
a
a
a
a
a
500
β
βa
a
a
a
a
a
ab
0
6000
C
a
a
a
aa
a
a
b
a b a
2000
0
1500
B
a
γ
a
c
c
β
a
4000
c
c
3000
a
a
β
a
a
a
a
α
a
a
a
b
bb
b
b
a
a
a
2000
1000
a
b
γ
a
4000
a
Day 4
Day 9
Day 13
b
5000
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
bcc
0
l
i
i
i
i
i
i
1
ntro H tide LC IP3 AG KC OX OS
Co GnR1+an H1+PRH1+ H1+D H1+PH1+C 1+N
H
RH GnR Gn GnR GnR GnR GnR
Gn
Figura: 14. Effetti in vitro del trattamento con l’agonista del GnRH-1
(buserelin, GnRH-1), da solo e co-incubato con l’antagonista del GnRH-1
(antide), del IP3 (2-aminoetil difenilborinato,IP3a) e del DAG (1-esadecil-2acetil glicerolo,DAGa), e con gli inibitori per la PLC (composto 48/80, PLCi), per
la PKC (stautosporine, PKCi), della COX (acido acetilsalicilico, COXi),e della
NOS (N-nitro-L-arginina metil estere, NOSi) sul rilascio del progesterone
(pannello A), della PGE2 (pannello B), e della PGF2α (pannello C), da parte di
CL di coniglio a 4, 9 e 13 giorni di pseudogravidanza. I valori ottenuti
rappresentano la media±SD dei dati ottenuti da cinque replicati. Le differenti
lettere, presenti sopra le colonne, rappresentano valori significativamente
diversi (P<0,01). Le lettere greche indicano valori significativi per i controlli,
mentre le lettere latine indicano valori significativi per i gruppi sperimentali.
(I dati relativi alle co-incubazioni con gli inibitori della PLA2, della PLD e
dell’AC, non sono stati inseriti perché non provocavano nessuna variazione
rispetto agli effetti del buserelin da solo)
85
COX-1 (dpm/mg of protein)
30000
A
25000
Day 4
Day 9
Day 13
β
a
a
20000
a
a
a
a
a
a
15000
10000
αα
aa
a
a
a
a
aa
aa
aa
a
aa
a
5000
bb b
COX-2 (dpm/mg of protein)
B
0
60000
bb
50000
40000
Day 4
Day 9
Day 13
γ
a
a
a
30000
b
b
a
a
a
20000
10000
β
a
α
a
b
a
a
a
a
a
a
a
a
0
50000
NOS (dpm/mg of protein)
C
b
a
a
cc c
Day 4
Day 9
Day 13
bb
40000
30000
20000
10000
α
a αβ a
βa
a
a a
a a a
a
a
a a
aaa
a a
a a
cc
ddd
0
l
i
i
i
i
i
i
1
ntro H tide LC IP3 AG KC OX OS
Co GnR1+an H1+PRH1+ H1+D H1+PH1+C H1+N
H
R
n
R
R Gn
G GnR Gn GnR GnR
Gn
Figura: 15. Effetti in vitro del trattamento con l’agonista del GnRH-1
(buserelin, GnRH-1), da solo e co-incubato con l’antagonista del GnRH-1
(antide), del IP3 (2-aminoetil difenilborinato,IP3a) e del DAG (1-esadecil-2acetil glicerolo,DAGa), e con gli inibitori per la PLC (composto 48/80, PLCi), per
la PKC (stautosporine, PKCi), della COX (acido acetilsalicilico, COXi),e della
NOS (N-nitro-L-arginina metil estere, NOSi) sull’attività enzimatica della COX-1
(pannello A), della COX-2 (pannello B), e della NOS (pannello C), da parte di
CL di coniglio a 4, 9 e 13 giorni di pseudogravidanza. I valori ottenuti
rappresentano la media±SD dei dati ottenuti da cinque replicati. Le differenti
lettere, presenti sopra le colonne, rappresentano valori significativamente
diversi (P<0,01). Le lettere greche indicano valori significativi per i controlli,
mentre le lettere latine indicano valori significativi per i gruppi sperimentali.
(I dati relativi alle co-incubazioni con gli inibitori della PLA2, della PLD e
dell’AC, non sono stati inseriti perché non provocavano nessuna variazione
rispetto agli effetti del buserelin da solo)
86
20µm
20µm
20µm
20µm
20µm
20µm
20µm
Figura:16. Immunoistochimica delle ovaie di coniglio durante la fase intermedioa di
pseudogravidanza. 1a) L’immunopositività è evidente nel citoplasma delle cellule
luteiniche (L) e nelle cellule endoteliali (freccie), (inserto: controllo della sezione in
assenza dell’antoicorpo primario); 1b) il segnale per GnRH è rilevato nel citoplasma
dell’ovocita (O) e nel citolasma delle cellule follicolari (F), delle cellule della teca (T) e
nelle cellule endocrine interstiziali presenti (I) nel follicoli antrale (inserto: controllo
sezione); 1c) la colorazione è localizzata nel citoplasma dell’ovocita O) e nel citolasma
delle cellule follicolari (F), delle cellule della teca (T) presenti nei follicoli pre-antrali 1d)
la colorazione è evidente nel citoplasma dell’ovocita e nel citoplasma dei follicoli presenti
nel follicolo primario (freccie) e nell’epitelio ovarico (testa della freccia), (inserto:
controllo). Scala: 20 µm
87
GnRH-R 121 bp
LD
PCR-
0
6
RT GnRH-R
12
0
6
12
RT oligo(dT)
0
Ipf
RT random
esameri
Figura:17. Tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con bromuro
d’etidio, che mostra la presenza delle bande di lunghezza attese, ottenute dopo
RT-PCR utilizzando primers specifici per il GnRH-R (121 bp), nei CL di coniglie.
LD: indica il marker per la lunghezza del DNA; PCR-: indica il controllo
negativo; 0, 6, 12 RT GnRH-R indicano l’utilizzo per la PCR di cDNA di CL di 4
giorni a 0, 6, 12 ore di trattamento con la PGF2α retrotrascritti con i primers
specifici per il GnRH-R; 0, 6, 12 RT oligo(dT) indicano l’utilizzo per la PCR di
cDNA di CL di 4 giorni a 0, 6, 12 ore di trattamento con la PGF2α retrotrascritti
con oligo(dT); 0 e Ipf RT random esameri indicano l’utilizzo per la PCR di cDNA
di CL a 4 giorni a 0 ore e cDNA di adenoipofisi retrotrascritti con random
esameri.
88
Discussione
Molte evidenze sperimentali suggeriscono che il 17β-estradiolo esercita
azioni sia luteotrofiche che luteolitiche, a seconda delle specie, attraverso
regolazione genica mediata dal suo recettore ER [Schams e Berisha,2002].
Nell’ovaio di coniglio la forma predominante, del recettore degli estrogeni, è
α,
l’isoforma
che
è
associata
al
compartimento
citosolico
[Monje
e
Boland,2001].
Nel
nostro
studio
si
evidenza
una
chiara
differenza,
nei
livelli
dell’espressione basale, dei trascritti di ERα, tra lo stadio luteinico precoce e
quello
intermedio,
e
l’espressione
è
minore
nei
CL
a
4
giorni
di
pseudogravidanza. Tuttavia, mentre a 4 giorni l’abbondanza relativa dell’mRNA
non viene influenzata dal trattamento con la PGF2α, a 9 giorni l’mRNA di ERα è
ampiamente dawn-regolata già 6 ore dopo la somministrazione della PGF2α. La
diminuzione
dei
trascritti
di
ERα
coincide
con
la
diminuzione
della
concentrazione plasmatica del progesterone, che si riscontra 6 ore dopo
l’iniezione della PGF2α nel tessuto luteinico della fase luteinica intermedia, e 8
ore dopo nella circolazione sanguigna periferica [Boiti et al.,2004]. Studi
precedenti indicano che la perdita della capacità steroidogenica dei CL è
associata con la contemporanea diminuzione dei recettori luteinici per gli
estrogeni, e che c’è una relazione tra il contenuto dei recettori per gli estrogeni
luteinici
e
la
sintesi
di
progesterone
stimolata
dall’estradiolo
[Yuh
e
Keyes,1982]. In base al loro aspetto morfologico, molte delle cellule ERα
immunoreattive sono steroidogeniche, caratterizzate da nuclei rotondi e
citoplasma vacuolizzato. Tuttavia, alcune cellule positive per ERα presentano
nuclei allungati, suggerendo che, anche, altre cellule luteiniche possono
esprimere il recettore ERα.
Dati recenti suggeriscono che la luteolisi potrebbe essere un evento mediato
dalle cellule immunitarie, e le cellule del sistema immunitario che normalmente
risiedono nel CL vengono ora identificate come mediatori chiave della durata
del CL, agendo nelle vicinanze delle cellule luteiniche, endoteliali, stromali e
immunitarie attraverso un’ampia schiera di citochine comprese: TNFα, MCP-1 e
IL-2 [Boiti et a.,2004; Adashi,1990; Bagavandoss et al.,1990]. Tra queste, l’IL1 è stata identificata nell’ovaio di molte specie incluso il coniglio [Takehara et
al.,1994], dove svolge un ruolo nello sviluppo follicolare, nell’ovulazione, e
nella steroidogenesi [Bréard et al.,1998]. Nel nostro studio, in seguito alla
somministrazione della PGF2α, l’mRNA dell’IL-1β aumenta entro le 3 ore dal
trattamento sia a 4 che a 9 giorni di pseudogravidanza, ma in seguito il profilo
89
di espressione cambia a seconda della fase luteinica. Questa differenza
potrebbe dipendere dal cambiamento nella composizione cellulare dei CL e
dalla variazione dell’ambiente endocrino all’interno dei CL. Tuttavia, il sistema
monociti/macrofagi, normale componente del CL del coniglio durante il suo
sviluppo [Koering,1974; Bagavandoss et al.,1990],è la fonte primaria di IL-1β .
Questa citochina è rilasciata anche dall'ovaio, dai fibroblasti , dalle cellule
endoteliali e luteiniche [Estevez et al.,2002] e anche dalle cellule della teca e
della granulosa [Bréard et al.,1998]. Durante la spontanea regressione dei CL è
stato rilevato un aumento del numero delle cellule immunitarie [Takehara et
al.,1994; Krusche et al.,2002]. Quindi, l’aumento dell’espressione genica
dell’IL-1β, dopo la somministrazione della PGF2α, osservato nei CL di 9 giorni di
pseudogravidanza, potrebbe essere correlato all’influsso dei macrofagi, a
questo stadio, come riscontrato nei bovini [Townson et al.,2002].
L’interleuchina-1β svolge molteplici funzioni nell’ovaio [Gérard et al.,2004]:
diminuisce
la
secrezione
di
progesterone,
aumenta
la
sintesi
delle
prostaglandine, induce l’espressione dei recettori per la PGF2α, inibisce la
degradazione
dell’mRNA
di
COX-2
[Narko
et
al.,1997],
e
aumenta
la
produzione di ossido nitrico (NO), attivando l’ossido nitrico sintasi (NOS)
costitutivo e/o inducibile [Estevez et al.,2002]. Recentemente, abbiamo
osservato che la somministrazione di PGF2α provoca una marcata upregolazione dell’espressione e dell’attività di COX-2 e un aumento del rilascio di
PGF2α solo nei CL che hanno acquisito una capacità luteolitica a 9 giorni di
pseudogravidanza
[Zerani
et
al.,2007].
Ciò
suggerisce,
anche
se
indirettamente, che questa citochina potrebbe essere coinvolta nell’attivazione
del pathway della sintesi intra-luteinica della PGF2α, up-regolando l’attività
della NOS e della COX-2. Quindi, questi risultati indicano che l’IL-1β svolge un
ruolo centrale nel promuovere la regressione funzionale dei corpi lutei che
hanno acquisito una capacità luteolitica.
Dopo 1,5 ore dal trattamento con la PGF2α si osserva un marcato aumento
dell’attività luteinica della NOS sia a 4 che a 9 giorni di pseudogravidanza.
Tuttavia si hanno differenze nell’attività enzimatica di NOS tra la fase luteinica
precoce e quella intermedia. Infatti nei CL di 4 giorni l’attività enzimatica di
NOS diminuisce, mentre nei CL di 9 giorni aumenta 6 ore dopo il trattamento, e
poi diminuisce nelle ore successive. L’NO è ora noto per svolgere molteplici
funzioni,
infatti
esso
è
coinvolto
nella
risposta
immunitaria,
nella
differenziazione cellulare e nell’apoptosi in numerosi sistemi dove modula
funzioni chiave in molti processi fisiologici e patologici [Ignarro,1996]. Studi sia
in vitro che in vivo hanno mostrato che l’NO, nell’ovaio, controlla l’ovulazione e
90
regola la steroidogenesi luteinica così come la regressione dei CL, attraverso la
nitrazione e l’ossidazione di specifiche proteine [Motta et al.,2001].
L’attività totale della NOS in vitro dopo la somministrazione della PGF2α è
maggiore nei CL di 9 che in quelli di 4 giorni di pseudogravidanza [Boiti et
al.,2000].È stato osservato che, nelle cellule luteiniche bovine, le specie
reattive dell’ossigeno (ROS) modulano l’attivazione dei segnali che promuovono
l’apoptosi up-regolando l’espressione dell’mRNA della COX-2, di p53 e di Bax
[Nakamura e Sakamoto,2001].
Il fattore di trascrizione p53, tra le sue molteplici funzioni agisce come
soppressore dei tumori causando l’arresto della crescita o l’apoptosi in risposta
ad una varietà stress cellulari [Liebermann et al.,2007]. La proteina p53
interagisce con almeno 6 membri della famiglia delle Bcl-2. La trascrizione del
gene Bcl-x, appartenente alla famiglia delle Bcl-2, produce, per splicing
alternativo, due proteine, di lunghezza e funzioni diverse, la forma lunga ha
funzioni anti-apoptotiche (Bcl-xL, isoforma lunga) mentre la forma breve (Bclxs, isoforma breve) promuove il processo apoptotico. La proteina p53
interagisce con i membri della famiglia Bcl-2 inibendo l’attività antiapoptotica di
Bcl-xL e attivando l’attività pro-apoptotica di Bax [Sot et al.,2007]. Nel nostro
studio si osserva che i livelli di espressione, prima del trattamento, dell’mRNA
di p53 e di Bax sono confrontabili sia a 4 che a 9 giorni di pseudogravidanza,
mentre i trascritti per il gene anti-apoptotico Bcl-xL sono più elevati nei CL di 4
giorni rispetto a quelli di 9 giorni. Il rapporto tra i livelli dell’mRNA di Bax/Bcl-x
, è un indice utilizzato per indicare la suscettibilità di un sistema cellulare verso
i segnali apoptotici, se questo rapporto è basso ci sono meno possibilità che
venga attivato il pathway apoptotico. I nostri dati indicano che questo rapporto
è basso per i CL di 4 giorni, mentre è più elevato in quelli di 9 giorni di
pseudogravidanza. Tuttavia, analizzando l’espressione proteica osserviamo che
i livelli proteici di p53 sono molto bassi in entrambe le fasi luteiniche, mentre la
quantità relativa della proteina di Bax è più elevata a 4 giorni che a 9 giorni di
pseudogravidanza, e che l’espressione proteica di Bcl-xL non è rilevabile in
entrambe le fasi luteiniche. Mediante la tecnica dell’immunoistochimica, sono
state trovate reazioni positive per p53 e Bax, anche se a differenti livelli di
intensità, nelle cellule dei CL di 4 e 9 giorni prima del trattamento con la
PGF2α. Al contrario, nei CL non sono state trovate reazioni positive per Bcl-xL,
mentre son state rilevate colorazioni positive solo negli ovociti dei follicoli
primari, suggerendo che questa proteina protegge queste cellule dagli stimoli
apoptotici. I nostri dati confermano che le proteine p53 e Bax sono
costitutivamente espresse nel CL di coniglio indipendentemente dallo stadio di
91
sviluppo, e questo è in accordo con quanto è stato osservato in altre specie
[Rueda et al.,1997; Yadav et al.,2005; Gürsoy et al.,2008].
Tuttavia il ruolo di p53, Bax e Bcl-xL, nella regolazione della cascata
luteolitica è ancora controverso, questi risultati suggeriscono che i CL sia di 4
che di 9 giorni sono intrinsecamente suscettibili all’apoptosi. Il progesterone è
anche conosciuto per esercitare un’azione protettiva sulla sopravvivenza delle
cellule luteiniche e contrasta la regressione funzionale del CL [Goyeneche et
al.,2003]. Tuttavia dei fattori luteinici che agiscono localmente, con modalità
paracrina
e/o
autocrina,
potrebbero
essere
coinvolti
nella
modulazione
dell’espressione dei geni pro e anti-apoptotici.
Nei CL di 4 giorni di pseudogravidanza si verifica una diminuzione dei livelli
dell’mRNA di p53 dopo la somministrazione della PGF2α, mentre gli mRNA di
Bax e Bcl-xL rimangono pressoché costanti e il loro rapporto rimane
costantemente basso. Tuttavia l’espressione proteica dei p53 aumenta, mentre
quella di Bax diminuisce 1,5 ore dopo il trattamento. Un simile comportamento
si osserva anche durante le ore successive alla somministrazione della PGF2α,
anche se a differenti livelli. È interessante notare che Bcl-xL, che prima del
trattamento non era rilevabile, viene espressa dopo 6 ore dal trattamento.
Inoltre si evidenziano chiaramente delle bande per Bcl-XL a 12 e a 24 ore dalla
somministrazione di PGF2α, che sono correlate con la resistenza all’azione
luteolitica della PGF2α dei CL nella fase precoce di sviluppo. Al contrario nei CL
di 9 giorni di pseudogravidanza, l’espressione genica di p53 è inizialmente upregolata fino a 3 ore dopo l’iniezione della PGF2α, ma poi, durante il corso della
luteolisi funzionale, diminuisce ritornando ai valori prima del trattamento.
L’espressione dei trascritti di Bax è marcatamente down-regolta 6 ore dopo il
trattamento, e un simile profilo è stato osservato per Bcl-xL. Nei CL dei bovini,
durante la regressione, non si osservano variazioni dell’espressione genica di
Bcl-xL e di p53 durante la luteolisi funzionale rispetto ai CL regrediti [Rueda et
al.,1997]. Anche nei CL di ratto, durante la regressione spontanea, questi due
geni apoptotici non variano la loro espressione [Trott et al.,1997].
Nel presente studio, sia le proteine di p53 che di Bax aumentano durante la
fase luteinica intermedia in seguito al trattamento con la PGF2α, ai differenti
intervalli di tempo e a differenti livelli, ma il prodotto proteico di p53 diviene
non rilevabile 24 ore dopo il trattamento. Invece, non si rileva un segnale
apprezzabile per Bcl-xL né mediante western blotting, durante la luteolisi
indotta dalla PGF2α e neanche mediante la tecnica immunoistichimica negli
intervalli di tempo analizzati. Durante la regressione luteale nei CL di ratto, si
rileva una graduale riduzione dell’espressione proteica di p53 [Trott et
92
al.,1997]. Negli uomini la proteina Bax viene espressa costantemente durante
la fase lutale [Vaskivuo et al.,2002]. La somministrazione della PGF2α provoca
un aumento del rapporto di Bax e Bcl-2 nei Cl dei bufali e dei bovini, sia prima
che 4 ore dopo il trattamento, che rimane elevato fino a dopo18 ore [Yadav et
al.,2005]. I nostri dati suggeriscono che l’apoptosi viene controllata da questi
geni e che son attivamente coinvolti in maniera opposta,essi inibiscono o
promuovono questo processo in dipendenza dllo stadio di sviluppo luteinico.
Questi risultati contrastanti, presi insieme, suggeriscono che il meccanismo che
conduce all’apoptosi nei CL dei mammiferi può differire tra le specie.
La presenza del recettore per il GnRH è stata evidenziata nel citoplasma
delle cellule luteali durante tutte le fasi della pseudogravidanza. La presenza
del GnRH-R, così come in altre specie, supporta un ruolo diretto del GnRH nella
regolazione delle funzioni luteiniche nei conigli. Inoltre reazioni positive sono
state osservate in altre cellule dell’ovaio di coniglio, come negli ovociti, nelle
cellule della teca e follicolari, sottolineando così un potenziale ruolo del sistema
GnRH/GnRH-R nella modulazione delle funzioni ovariche nei mammiferi
[Ramakrishnappa et al.,2005].
È stato dimostrato che il GnRH esercita sia effetti inibitori che stimolatori
nelle gonadi, causando sia effetti inibitori che stimolatori sulla produzione di
steroidi da parte delle cellule ovariche [Ramakrishnappa et al.,2005]. Nei
bovini, il trattamento con due antagonisti del GnRH, buserelin e deslorelin,
provoca sia, in vivo che in vitro, effetti inibitori sul rilascio di progesterone
[Milvae et al.,1984; D’Occhio e Aspden,1999]. Mentre, è stato dimostrato che il
GnRH ha effetti stimolatori sulla produzione di progesterone nelle scimmie e
nelle cellule della granulosa nell’uomo [Liu et al.,1991; Bussenot et al., 1993;
Casper et al.,1984]. Nei conigli, l’antagonista del GnRH influenza direttamente
l’ovaio inducendo l’ovulazione, sia negli animali ipofisectomizzati che in vitro
[Koos
e
LeMarie,
1985].
All’11°
giorno
di
pseudogravidanza,
la
somministrazione del GnRH induce la luteinizzazione dei follicoli ovarici e la
regressione funzionale dei CL e ciò è provato dalla diminuzione dei livelli di
progesterone in 3 giorni [Rippel et al.,1976].
I nostri dati supportano l’idea che il GnRH abbia un ruolo diretto nella downregolazione della produzione di progesterone da parte del CL. Gli esperimenti in
vitro mostrano che il buserelin riduce la produzione di progesterone in colture
di CL a 9 e 13 giorni di pseudogravidanza. Questo ruolo del GnRH è supportato,
anche, dai dati provenienti dalla co-incubazione con un antagonista del GnRH,
l’antide, che neutralizza la diminuzione del progesterone indotta dal buserelin.
93
Recentemente, abbiamo dimostrato, attraverso studi in vitro di CL di
coniglie pseudogravide, che la PGF2α e la PGE2 influenzano, in maniera
differente, il rilascio di progesterone, a seconda dello fase luteinica [Boiti e
al.,2001]. La PGE2 deprime l’attività enzimatica di NOS e aumenta la
produzione di progesterone nei CL di 4 giorni, ma non ha effetti nei CL di 9
giorni; al contrario, la PGF2α up-regola l’attività enzimatica di NOS e induce la
luteolisi funzionale nei CL di 9 giorni, ma non ha alcun effetto nei CL nella fase
precoce luteinica. Questo meccanismo fisiologico protegge la crescita dei CL
dalla luteolisi funzionale durante la fase luteinica intermedia, fino a 6 giorni di
pseudogravidanza,
quando
il
CL
,
da
refrattario
diventa
parzialmente
suscettibile alla PGF2α esogena, e acquisisce una competenza luteolitica [Boiti
et al.,2001; Boiti et al.,2003; Boiti et al.,1998]. I dati sulla inefficacia del
buserelin durante la fase precoce luteinica, suggerisce che il meccanismo che
protegge dalla luteolisi, include anche il sistema GnRH/GnRH-R I, almeno in
vitro.
Molti studi indicano che il GnRH, complessato con il suo recettore, attiva
principalmente la PLC via Gq/11, appartiente alla famiglia delle proteine G. la
PLC catalizza l’idrolisi del IP3 e DAG [Millar,2005]. I nostri dati confermano che
questo meccanismo, post-recettoriale, è presente anche nei CL di coniglio.
Infatti, gli effetti del buserelin sulla diminuzione del rilascio del progesterone,
da parte dei CL di 9 e 13 giorni, vengono neutralizzati dalla co-incubazione con
gli inibitori della PLCe della PKC e con gli antagonisti dell’IP3 e DAG, mentre gli
inibitori di AC, PLA2 e PLD non hanno alcuna influenza.
Uno studio recente mostra che nelle cellule gonadotrofe della linea LβT2, il
GnRH produce una induzione, tempo-dipendente, dell’espressione della COX-2
e aumenta la produzione di PGE2 e PGF2α [Naor et al.,2007]. Questi autori
ipotizzano un nuovo pathway di segnalazione mediato dalla PGF2α, che agisce
attraverso una modalità autocrina/paracrina. Il nostro lavoro suggerisce che gli
effetti del GnRH sulla produzione di progesterone da parte del CL di coniglio
sono mediati dall’attivazione del pathway COX-2/PGF2α/NOS. Infatti, il
buserelin aumenta, in vitro, l’attività della COX-2, la produzione della PGF2α e
l’attività della NOS nei CL sia a 9 che a 13 giorni di pseudogravidanza, e ciò
coincide con la diminuzione del rilascio di progesterone. Inoltre, il cotrattamento con antide, con l’inibitore della PLC e della PLK o con gli
antagonisti dell’IP3 e del DAG, neutralizza le azioni del buserelin sulla COX-2,
sulla PGF2α, sulla NOS e sul progesterone, mentre l’inibitore della COX
neutralizza gli effetti del buserelin sulla NOS e sul progesterone, e a sua volta
l’inibitore della NOS ha effetti solo sul progesterone. La diminuzione della
94
PGE2, indotta dal buserelin nei CL di 13 giorni, è probabilmente dovuta
all’aumento della conversione, di questa prostaglandina, in PGF2α attraverso
l’attivazione dell’enzima PGE2-9-chetoriduttasi, e/o l’attivazione della PGE2
sintasi. Un simile meccanismo intracellulare è stato riportato per il loop auto
amplificante della PGF2α, utilizzato dal CL durante il processo luteolico [Zerani
et al.,2007]. I nostri risultati indicano, anche, che i CL nella fase precoce,
refrattari ai fattori luteolici lo sono anche agli effetti del GnRH, dal momento
che gli effetti del buserelin sulla produzione ormonale e sull’attività enzimatica
si verifica solo nei CL di 9 e 13 giorni di pseudogravidanza.
95
Conclusioni
I nostri dati indicano che nei CL di conigli, durante la luteolisi indotta dalla
PGF2α, si verifica un cambiamento dinamico dell’espressione genica e proteica
di geni direttamente coinvolti nel controllo del processo apoptotico. Questo
avviene nei CL che hanno acquisito una capacità luteolitica, (CL a 9 giorni di
pseudogravidanza). Inoltre, a questo stadio luteinico, si assiste ad una
simultanea up-regolazione dei trascritti dei geni p53 e IL-1 e l’aumento
dell’attività enzimatica della NOS precede la down-regolazione dei geni che
codificano per ERα e per Bcl-xL. Quindi la regressione, indotta dal trattamento
con la PGF2α, sembra esere dovuta a distinti processi che coinvolgono sia il
pathway
steroidogenico,
come
viene
dimostrato
dalla
down-regolazione
dell’espressione genica del recettore per gli estrogeni (ERα), che i segnali
apoptotici, poiché si verifica un dinamico cambiamento dell’espressione genica
e proteica di p53 e Bcl-xL. Inoltre l’aumento dell’attività enzimatica della NOS,
provoca un aumento della formazione di ossido nitrico (NO), che è coinvolto
nella risposta immunitaria, nella differenziazione cellulare e nell’apoptosi, e che
è anche una specie reattiva dell’ossigeno (ROS). Ciò ci fa ipotizzare che le ROS,
provocate dall’azione della PGF2α, possano avere un ruolo di regolazione
durante le distinte fasi dell’attivazione/modulazione dei singoli geni coinvolti nel
processo apoptotico.
Per quanto riguarda lo studio sugli effetti, in vitro, del GnRH sulla
regolazione delle funzioni del CL, i nostri dati indicano che il GnRH downregola, direttamente, la produzione del progesterone da parte dei CL che
hanno acquisito una capacità luteolitica. Questo effetto sembra essere dovuto
ad un meccanismo recettoriale o post recettoriale. In base ai nostri risultati è
stato ipotizzato un meccanismo d’azione per il GnRH: il GnRH si lega al suo
recettore attivando la PLC, con conseguente rilascio di IP3 e di DAG. Questi
due messaggeri intracellulari, attivando la PKC, determinano l’attivazione della
COX-2, con conseguente aumento della produzione di PGF2α.
Questa prostaglandina induce un aumento dell’attività enzimatica di NOS
[Boiti et al.,2003], e avviene la sintesi di ossido nitrico che down regola la
produzione di progesterone [Boiti et al.,2000].
96
Capitolo II
Bilancio energetico nella riproduzione
Il legame tra il bilancio energetico e la riproduzione deriva direttamente
dalla teoria dell’evoluzione. In accordo con questa teoria, i meccanismi
fisiologici che si osservano nelle popolazioni ancora esistenti sono il risultato di
una selezione naturale che si è attuata grazie a variazioni genetiche casuali in
popolazioni ancestrali. Quindi, i meccanismi che controllano l’assunzione,
l’immagazzinamento
e
il
consumo
di
energia,
esistono
perché
questi
meccanismi sono in certa misura ereditari e permettono agli animali di
sopravvivere
alla
maturità
riproduttiva,
conferendo
loro
un
vantaggio
riproduttivo.
Le cellule viventi hanno bisogno di un continuo apporto di nutrienti per la
biosintesi e per il metabolismo, ma la disponibilità di cibo e la richiesta
energetica fluttuano in molti habitat, e molti animali smettono di mangiare
quando si dedicano a comportamenti per la perpetuazione della specie. Quando
il tratto digestivo è vuoto, l’organismo dipende da riserve energetiche sia
interne che esterne (rispettivamente grasso corporeo e cibo accumulato).
Durante l’evoluzione degli animali, l’abilità di depositare grandi quantità di
energia all’intero dell’organismo e i meccanismi che inibiscono comportamenti
d’ingestione devono aver permesso agli animali di impegnarsi in altre attività
che hanno migliorato il successo riproduttivo. È stato ipotizzato che i
meccanismi
che
controbilanciano
attività
energeticamente
dispendiose
associate alle cure parentali, abbiano conferito un vantaggio riproduttivo. Per
esempio, molte specie incrementano l’assunzione di cibo durante il periodo di
intense cure parentali, mentre altre incrementano sia l’assunzione che
l’accumulo energetico in previsione della nascita della prole.
Prima della nascita dei figli, le femmine di alcune specie di mammiferi
mangiano molto e depositano grandi quantità di nutrienti sotto forma di lipidi
nel tessuto adiposo, e queste riserve energetiche verranno utilizzate durante
l’allattamento. In altre specie di mammifero, l’assunzione di cibo rimane bassa
per tutto il tempo della gravidanza, mentre aumenta l’accumulo di provviste di
cibo che verranno consumate durante il periodo dell’ allattamento.
Quindi i meccanismi che controllano il bilancio energetico sono integrati con i
meccanismi che controllano la riproduzione [Bronson,1989; Bronson,2000;
Schneider et al.,2002; Wade et al.,1992; Wade et al.,1996]; di conseguenza
non si può comprendere la fisiologia del bilancio energetico e l’inclinazione di
97
ogni specie ad accumulare riserve energetiche se non le si mette in relazione
con il successo riproduttivo.
L’abilità di monitorare la disponibilità energetica sia interna che esterna deve
essere centrale per il legame tra la riproduzione e il bilancio energetico. Questa
abilità permette agli animali di dare priorità a quei comportamenti che si
accordano alle fluttuazioni energetiche e alle condizioni riproduttive. Per
esempio, quando c’è abbondanza di cibo e le richieste energetiche sono basse,
l’energia
è
disponibile
per
tutti
i
processi
necessari
a
un’immediata
sopravvivenza, incluso biosintesi delle proteine, mantenimento del gradiente
ionico, rimozione delle sostanze di rifiuto, termogenesi, locomozione, ricerca
del cibo, ingestione e digestione. Le priorità energetiche includono investimenti
a lungo termine, come la crescita, funzioni immunitarie, e la riproduzione.
Comportamenti legati alla difesa del territorio, corteggiamento, accoppiamento
e cure parentali ricevono un’elevata priorità, e la disponibilità energetica in
eccesso viene immagazzinata come lipidi nel tessuto adiposo o conservata
come provviste nella tana, nel nido o nel cunicolo.
I segnali metabolici, i mediatori ormonali, i modulatori e i neuropeptidi
danno espressione a queste priorità in almeno due vie collegate. Primo: sono
permissivi per gli eventi neuroendocrini che controllano la spermatogenesi, i
cicli ovulatori e la fertilità. Secondo: in molte specie gli stessi segnali metabolici
e
i
messaggeri
chimici
che
aumentano
la
motivazione
ad
assumere
comportamenti riproduttivi attenuano anche la spinta ad impegnarsi nella
ricerca di cibo, nell’ accumulare cibo e nel mangiare [Schneider et al., 2002;
Wade et al., 1996].
Al contrario quando le risorse energetiche sono scarse, i meccanismi
fisiologici che ripartiscono l’utilizzazione energetica tenderanno a favorire quei
processi che assicurano la sopravvivenza dell’individuo, soprattutto quei
processi che favoriscono la crescita, la longevità e la riproduzione. Tuttavia, i
processi fisiologici che promuovono la ricerca, l’accumulo e l’ingestione di cibo
ricevono priorità rispetto alla riproduzione, poiché i processi riproduttivi sono
energeticamente dispendiosi e possono essere ritardati quando è in pericolo la
sopravvivenza dell’individuo [Bronson, 1986; Bronson, 1988; Bronson, 1989;
Bronson, 2000].
Per esempio, durante le stagioni in cui la disponibilità di cibo è bassa e le
esigenze di termoregolazione sono alte, i membri di alcune specie di mammiferi
subiscono una regressione delle gonadi e diventano sessualmente inattivi.
Anche nelle specie che si riproducono durante tutto l’anno, quando c’è scarsa
disponibilità di cibo o quando si è in presenza di un’aumentata richiesta
98
energetica che non può essere soddisfatta dall’apporto di sostanze nutrienti, i
processi
riproduttivi
vengono
inibiti
[Bronson,
1989].
Durante
questi
cambiamenti energetici, gli animali sono predisposti al mangiare, alla ricerca e
alla raccolta di cibo, da una varietà di stimoli sensoriali metabolici (per
esempio: diminuita disponibilità di glucosio e dei suoi metaboliti), dagli ormoni
periferici (bassa concentrazione plasmatica di insulina e di leptina) e dai circuiti
centrali che stimolano l’alimentazione (es.: circuiti che coinvolgono il neuro
peptide Y).
Il significato adattativo dei circuiti che stimolano l’alimentazione è relativo
alla sopravvivenza (apportare energia metabolica, nutrienti, acqua, sale e altri
minerali nell’organismo per mantenere la struttura e la funzione cellulare) in
quanto la sopravvivenza è un prerequisito per il successo riproduttivo. I
neuropeptidi che stimolano l’animale a mangiare e a ricercare il cibo,
aumentano
anche
la
spinta
alla
sopravvivenza
durante
le
fluttuazioni
energetiche, inibendo il sistema ipotalamo-ipofisi-gonadi, e questo è molto
importante in prospettiva evoluzionistica. Al contrario, quando c’è abbondanza
di cibo e la richiesta energetica è bassa, gli stessi circuiti centrali che inibiscono
lo stimolo a mangiare tendono a facilitare gli aspetti della riproduzione. La
selezione naturale favorisce quegli animali che riducono la ricerca del cibo e
l’alimentazione
aumentando
il
loro
successo
riproduttivo
[Schneider
et
al.,2002].
L’alternanza tra i periodi riproduttivi e quelli quiescenti differisce a seconda
delle specie animali, ma in generale la maggior parte degli organismi è più
predisposta alla riproduzione quando c’è abbondanza di cibo piuttosto che
quando questo scarseggia.
Effetti energetici sul sistema ipotalamico-ipofisario-gonadico
Una vasta schiera di messaggeri chimici e di processi metabolici sono
coinvolti nel mantenimento del bilancio energetico. In accordo con l’idea che i
meccanismi che controllano l’omeostasi energetica sono correlati con il
successo riproduttivo, molti di questi fattori influenzano anche i processi
riproduttivi,
come
il
sistema
ipotalamico-ipofisario-gonadico
(HPG:
Hypothalamic-Pituitary-Gonadal axis)- Le funzioni del sistema HPG, quando le
femmine non sono sottoposte a stress metabolico, sono illustrate nella Figura
18.
99
Figura: 18. Quando c’è un’abbondanza di riserve metaboliche, i cicli ovulatori
sono caratterizzati da secrezione pulsatile di GnRH rilasciato dai terminali di
cellule secretorie ipotalamiche. Ogni impulso di GnRH è rilasciato da nella
circolazione portale ipofisaria e stimola la secrezione di un impulso di ormone
luteinizzante (LH) dall’ipofisi anteriore alla circolazione generale. Lo sviluppo del
follicolo è stimolato da impulsi di LH e FSH che legano i loro rispettivi recettori nel
follicolo ovario. Durante lo sviluppo follicolare (la fase follicolare del ciclo
ovulatorio) le concentrazioni relativamente basse di
E hanno un feedback
negativo sulla secrezione di GnRH ipotalamico e di gonadotropine ipofisarie. Gli E
hanno anche effetti stimolatori sulla propria sintesi e secrezione, e quindi, la
concentrazione di E continua a salire nella circolazione sistemica. A concentrazioni
più alte, E ha un feedback positivo sul GnRH ipotalamico e sulla secrezione di
gonadotropine ipofisarie. Einduce scariche di LH, che a sua volta induce
l’ovulazione.
100
Figura:19. Gli effetti primari del deficit metabolico di disponibilità di risorse è
l’inibizione degli impulsi ipotalamici di GnRH. (1) Questo porta ad una cascata
di eventi, come l’inibizione della secrezione di gonadotropine ipofisarie (2),
inibizione dello sviluppo del follicolo e la secrezione di E e P (3). Gli effetti della
secrezione inibita di steroidi sono l’inibizione del comportamento estrale (4a) e
l’inibizione del rilascio di LH (4b). Nelle donne, quando gli steroidi ovarici
rimangono cronicamente bassi, si verifica perdita di massa ossea ed anche
problemi alle funzioni cognitive. Si sa che il generatore di impulsi di GnRH è i
luogo primario di effetto in quanto il trattamento esogeno con impulsi specie
specifici di GnRH ripristina la secrezione ipofisaria normale di gonadotropine
101
Figura: 20. Il deficit di sostanze ossidabili ha effetti diretti sul sistema
riproduttivo oltre che sul generatore di impulsi. Questi effetti sono stati
dimostrati provvedendo a GnRh esogeno, o E e P ad animali privati del cibo
temporaneamente o cronicamente. Per esempio, criceti ovariectomizzati
privatio del cibo trattati con E e P mostrano un comportamento estrale con lo
stesso corto tempo di ritardo, ma rimangono in posizione di lordosi per un
durata significativamente più corta di tempo rispetto a criceti nutriti ad libitum.
[Da Schneider et al, 2004]
102
Ogni impulso di GnRH conduce al rilascio pulsatile di LH da parte dell’ipofisi
anteriore [Clarke et al., 1982]. Viene rilasciato anche l’FSH. Gli impulsi di FSH
e LH sono critici per lo sviluppo follicolare e per la secrezione degli steroidi.
L’aumento dei livelli di estrogeni provoca un feedback positivo sul GnRH e
sull’LH, e questa azione degli estrogeni è richiesta per la secrezione di LH, che
scatena l’ovulazione (Figura 18).
I cambiamenti metabolici, così come la privazione di cibo, inibiscono il
sistema HPG a vari livelli (Figure 19 e 20). Il locus principale, tuttavia, è il
generatore d’impulsi del GnRH, e questi effetti sono simili nei maschi e nelle
femmine (Figura 19) [Bronson, 2000]. In condizioni di privazione o di
restrizione di cibo, la secrezione pulsatile di LH, lo sviluppo dei follicoli e
l’ovulazione possono essere reintegrate dal trattamento pulsatile con GnRH in
ratti, ovini, suini, bovini, primati e umani [Armstrong and Britt, 1987; Bronson,
1986; Cameron,1996; Cameron and Nosbisch, 1991;Day et al., 1986;Foster et
al.,1985; Kile et a.,1991;Manning et al.,1991;Nillius, 1975].
I cambiamenti metabolici inibiscono il sistema HPG, in parte aumentando la
sensibilità agli effetti feedback negativi degli estrogeni, e in parte attraverso gli
effetti steroidi-indipendenti. In più, i cambiamenti metabolici alterano la fonte
di GnRH, LH e FSH, indipendentemente dai loro effetti sulla secrezione pulsatile
di LH [Crump et al.,1982;Howland, 1980;Medina et al.,1998]. L’inibizione della
secrezione di GnRH conduce ad una cascata di eventi inibitori che incluono una
diminuzione della secrezione delle gonadotropine, ritardato sviluppo follicolare,
inibizione della sintesi di steroidi gonadici e, nei roditori e primati, una
diminuzione del comportamento riproduttivo indotto dagli steroidi. Tuttavia, i
deficit in molti di questi aspetti del sistema HPG possono essere attribuiti
all’inibizione metabolica della secrezione del GnRH.
Ci si potrebbe aspettare che la trascrizione e la traduzione del GnRH sia un
importante punto di regolazione nei mammiferi che hanno un ovulazione
indotta.
Questi
risultati
sottolineano
gli
effetti
diretti
dei
cambiamenti
metabolici sui neuroni GnRH.
I meccanismi neurali che controllano il comportamento sessuale sono
condizionati da cambiamenti metabolici in animali che non hanno cicli ovulatori
spontanei [Schneider et al.,2004].
103
Effetti energetici sulla motivazione e sull’esecuzione dell’alimentazione
e dei comportamenti riproduttivi
I meccanismi del cervello che controllano il comportamento sessuale e la
spinta ad alimentarsi agiscono alterando gli aspetti motivazionali. Per esempio,
in molte specie i segnali metabolici, gli ormoni periferici e i neuropeptidi
centrali influenzano la spinta alla ricerca di cibo senza necessariamente
influenzare la quantità di cibo che viene ingerita [Schneider et al.,2002]. È
verosimile che gli ormoni, i neuropeptidi e i segnali metabolici non influenzano
universalmente
l’ingestione
di
cibo
o
l’attività
sessuale,
ma
piuttosto
influenzano la motivazione ad assumere comportamenti specie-specifici che
assicurano la sopravvivenza e il successo riproduttivo.
Ci sono prove che i cambiamenti metabolici inibiscono la riproduzione a
diversi livelli, incluso il generatore di impulsi del GnRH (Figura. 19), le
fluttuazioni di GnRH, di LH, di FSH (Figura. 20), e in fine , mediante effetti
diretti dalla disponibilità di nutrienti sui meccanismi del cervello che danno
priorità al corteggiamento, all’accoppiamento e all’ingestione di cibo. (Figura
20)
I segnali neurali periferici provenienti dal nervo vago vengono trasmessi al
nucleo del tratto solitario (NTS), e i segnali metabolici vengono riconosciuti
nell’area posteriore (AP) o NTS mediale e trasmessa all’area ipotalamica, così
come al nucleo paraventricolare (PVN), o all’area preottica (POA) attraverso il
nucleo parabrachiale. È stato ipotizzato che le proiezioni neurali che partono
dal nucleo paraventricolare influenzino la secrezione del GnRH attraverso il
contatto con gli assoni GnRH nel nucleo arcuato. I neuroni GnRH, inoltre,
ricevono impulsi dal nucleo anteroventrale [Gu and Simerly,1997]. Altri ormoni
e neuropeptidi possono agire più direttamente nell’ipotalamo per influenzare i
neuroni GnRH nell’arco o nell’area preottica.
Un sistema per organizzare i fattori che controllano il bilancio
energetico e la riproduzione
I sistemi extrasensoriali sono quelli associati con il gusto, l’olfatto e la
composizione del cibo, così come i segnali sociali, temporali e spaziali associati
con l’alimentazione con i membri della stessa specie del sesso opposto. I
sistemi intrasensoriali sono correlati agli stimoli, come quelli rilevati dai
meccanorecettori, dai recettori nello stomaco, da recettori osmotici e di
nutrienti nell’intestino e nel fegato, e agli stimoli che avvengono dopo
104
l’assimilazione, e che sono generati dai cambiamenti nell’ossidazione delle
sostanze metaboliche. Esempi degli stimoli metabolici primari sono quelli che
provengono dai cambiamenti della disponibilità e dell’ossidazione del glucosio e
degli acidi grassi o dal rapporto tra l’adenosina trifosfato (ATP) e gli altri
nucleotidi adeninici con i fosfati inorganici [Friedman,1990; Friedman,1991;
Friedman,1997; Friedman, 1998; Friedman,1995].
Gli ormoni informano il cervello sullo stato energetico e riproduttivo
dell’animale;
in
tal
modo
stimolano
il
verificarsi
di
aggiustamenti
comportamentali e metabolici per le condizioni ambientali, riproduttive e
energetiche. Per esempio, la secrezione di leptina è correlata con il numero di
adipociti e con il flusso di metaboliti ossidabili negli adipociti [Levy et
al.,2000;Wang et al.,1998]. In molti casi, l’animale ha la possibilità di ignorare
le informazioni ormonali se c’è un’urgente necessità energetica connessa alla
sopravvivenza e alla riproduzione.
Stimoli sensoriali metabolici primari
Gli stimoli metabolici primari sono generati dai cambiamenti nello stato di
ossidazione
dei
nutrienti
metabolici
[Friedman,1990;
Friedman,1991;
Friedman,1997; Friedman,1998; Friedman,1995]. Inoltre, gli stimoli sensoriali
primari derivano dalla distensione meccanica del lume, contrazione intestinale
e variazioni chimiche tra il lume e l’intestino [Schwartz,2000]. È utile
distinguere questi eventi sensoriali da quelli endocrini. Un esempio di un
evento endocrino è il legame di un ormone, come la leptina, al suo recettore
funzionale (Ob-Rb).
In contrasto agli eventi endocrini, gli stimoli sensoriali metabolici primari
derivano dall’ossidazione di substrati metabolici, come il glucosio, gli acidi
grassi liberi e i corpi chetonici o da una sequela di ossidazioni metaboliche. Per
esempio, gli stimoli sensoriali primari possono derivare dagli intermediari del
ciclo di Krebs, dal trasporto di elettroni dell’energia libera che conduce alla
formazione di ATP, da cambiamenti del contenuto di ATP, o variazioni nel
potenziale di fosforilazione (il rapporto tra ATP e gli altri nucleotidi adeninici
con i fosfati inorganici) [Friedman,1998].
Un sistema sensoriale metabolico, che monitora la disponibilità energetica e
invia segnali al generatore di impulsi del GnRH, induce una risposta del sistema
HPG alla disponibilità di risorse metaboliche durante la privazione di cibo e la
rialimentazione.
105
Gli effetti dei cambiamenti metabolici sul rilascio pulsatile dell’LH avvengono
molto più rapidamente dei cambiamenti nel contenuto di grassi corporei in una
grande varietà di specie [Armstrong and Britt, 1987;Bronson, 1986; Bronson,
1988; Bronson, 1990; Cameron,1996; Cameron and Nosbisch, 1991; Clarke et
al., 1990; Schreihofer et al., 1993; Szymanski et al., 2003]. Cambiamenti nel
contenuto di grasso corporeo nella secrezione ormonale non possono tenere
conto dell’aumento della secrezione pulsatile dell’LH, che avviene entro 60
minuti dalla rialimentazione [Szymanski et al., 2003].
Molti studi dimostrano che il generatore di impulsi del GnRH e il
comportamento
sessuale
sono
influenzati
dalla
disponibilità
di
risorse
metaboliche ossidabili minuto dopo minuto [Berry and Peters, 1975;Schneider
et al., 2000].
In accordo con l’ipotesi metabolica, il contenuto corporeo di grassi, l’apporto
e la spesa energetica controllano le funzioni riproduttive agendo attraverso uno
stimolo
sensoriale
comune
che
proviene
dalla
disponibilità
di
risorse
metaboliche ossidabili.
La riserva corporea di grasso, in accordo con l’ipotesi metabolica, invece di
provvedere ai segnali a lungo termine, serve a tamponare i cambiamenti
energetici, in virtù delle scorte energetiche sotto forma di tessuto adiposo.
Quando queste scorte sono terminate, una limitata disponibilità di cibo genera
dei segnali che inibiscono il sistema HPG.
Il sistema HPG viene riattivato dalla disponibilità di sostanze ossidabili prima
che vengano ripristinate le scorte energetiche sotto forma di tessuto adiposo.
Poco è conosciuto riguardo alla natura dei rilevatori sensoriali della disponibilità
di cibo. Tuttavia, l’esistenza di questi sistemi sensoriali è rilevata dall’inibizione
della riproduzione e dall’incremento dell’ assunzione di cibo quando vengono
inibiti specifici pathways metabolici.
Ricerche sul controllo metabolico del sistema sensoriale che controlla
l’assunzione di cibo conducono ad alcuni importanti principi che possono essere
applicati al sistema sensoriale che controlla la riproduzione [Friedman,1991;
Friedman,1991(a); Friedman, 1997; Friedman, 1995; Friedman, 1995(a)].
Primo, lo stimolo sensoriale è generato dai cambiamenti delle risorse
metaboliche ossidabili o dalle variazioni della sequenza delle ossidazione
metaboliche, e non da un particolare tipo di substrato. Secondo, lo stimolo
sensoriale
interagisce
con
il
sistema
di
rilevazione
che
percepisce
la
concentrazione nel circolo dei substrati metabolizzabili, piuttosto che con un
recettore di membrana. Terzo, lo stimolo può essere rilevato sia centralmente
che perifericamente. Infine, gli effetti degli ormoni come l’insulina e la leptina
106
possono intervenire influenzando indirettamente l’ossidazione metabolica a
livello periferico.
L’assunzione di cibo può essere aumentata e i processi riproduttivi inibiti dal
trattamento con agenti che bloccano specifici pathways metabolici, come
l’ossidazione del glucosio e degli acidi grassi liberi. Il trattamento sistematico
con il 2-deossi-D-glucosio (2DG)o con il 5-tioglucosio (5TG) induce un grande
aumento nell’assunzione di cibo nei ratti e in altri mammiferi (con pochissime
eccezioni, una delle quali è rappresentata dal criceto siriano) [Friedman e
Todoff, 1986; Lazzarini et al.,1988; Novin et al., 1973; Ritter e Slusser, 1980].
Trattamenti con alte dosi di insulina incrementano l’assunzione di cibo
inducendo ipoglicemia nei ratti, nei criceti e in altri mammiferi [Geary, 1999]. È
importante notare che l’insulina sistemica e il 2DG stimolano l’assunzione di
cibo ma hanno effetti opposti sulla concentrazione plasmatica di glucosio,
dimostrando
che
l’assunzione
di
cibo
è
sensibile
alla
diminuzione
dell’ossidazione del glucosio o alla sequenza di reazioni metaboliche, e non alla
concentrazione plasmatica di glucosio in sè.
Il controllo metabolico sensoriale della riproduzione è notevolmente simile al
controllo sensoriale metabolico dell’assunzione di cibo.
Il trattamento sistematico con 2DG aumenta l’immissione di cibo nei ratti,
inibisce i cicli estrali nei criceti e inibisce la secrezione pulsatile dell’LH nei ratti
e negli ovini, nonostante il fatto che questi trattamenti hanno effetti trascurabili
sul contenuto corporeo di grassi [Bucholtz et al.,1996; Foster e Bocholtz,1995;
Friedman,1998; Friedman, 1986; Howland,1980; Murahashi et al.,1996;
Nagatani et al.,1996; Schneider et al.,1993; Schneider e Wade, 1989;
Schneider e Wade, 1990].
I rilevatori sensoriali metabolici sono sensibili ad altri stimoli metabolici oltre
a quelli generati dai cambiamenti dell’ossidazione di glucosio. Per esempio,
l’assunzione di cibo che aumenta l’attività riproduttiva, è inibita da trattamenti
con molecole che riducono l’ossidazione degli acidi grassi liberi, come ad
esempio il metil palmoxirato (MP) o il mercaptoacetato (MA) [Calingasan et al,
1993, Langhans et al, 1997].
Questi studi illustrano che l’informazione correlata alla disponibilità di
substrati metabolici specifici è probabilmente integrata a livello intra-cellulare
e/o intra-mitocondriale. E’ stato suggerito che i sensori recettoriali responsabili
dell’ossidazione degli acidi grassi liberi influenzano l’assunzione di cibo poiché
diminuiscono
la
disponibilità
generale
formazione di ATP [Scharrer et al, 1999].
delle
riserve
metaboliche
per
la
107
I processi riproduttivi, come l’assunzione di cibo, sono anche sensibili ai
cambiamenti nell’ossidazione degli acidi grassi liberi, specialmente quando gli
animali sono predisposti all’utilizzazione dei grassi di riserva. I criceti “grassi”
non mostrano anestro indotto da digiuno; viceversa, il trattamento con MP
inibisce la ciclicità estrale, ma non induce iperfagia [Friedman et al., 1995,
1998].
Questi risultati sono illustrati dall’ipotesi metabolica. Durante il digiuno,
l’omeostasi calorica è mantenuta dall’idrolisi dei trigliceridi in acidi grassi liberi
e glicerolo. Gli acidi grassi liberi vengono trasportati ai vari tessuti periferici
dove
sono
principalmente
ossidati,
risparmiando
perciò
glucosio
per
l’ossidazione nel sistema nervoso centrale (SNC).
In accordo con l’ipotesi metabolica, i cicli estrali continuano nei criceti
“grassi” anche a digiuno poiché i loro depositi nel tessuto adiposo danno
origine agli acidi grassi liberi per l’ossidazione cellulare durante il digiuno. Nei
criceti “grassi” trattati con MP, tale sostanza blocca l’ossidazione degli acidi
grassi liberi, neutralizzando quindi il vantaggio di un alto contenuto corporeo di
grassi. Similmente, in criceti trattati con MP nutriti ad libitum, il normale ciclo
estrale continua poiché i carboidrati possono essere usati come una risorsa
alternativa per mantenere la ciclicità estrale. Quando l’utilizzazione di entrambe
le riserve è bloccata da simultaneo trattamento di MP e 2DG, il ciclo estrale è
inibito.
Il segnale metabolico può essere correlato a diversi eventi metabolici, o ad
un evento finale metabolico, come la formazione di ATP [Friedman et al, 1997].
Il
ruolo
dell’ossidazione
di
glucosio
e
acidi
grassi
liberi
differisce
dipendentemente dalle specie e dal loro ciclo vitale. Per esempio, i toporagni
muschiati hanno un tasso metabolico eccezionalmente alto. Essi mangiano
quasi costantemente durante la loro fase attiva, e conservano meno grasso
corporeo di topi, ratti e criceti. In questa specie, il comportamento sessuale è
inibito dalla restrizione calorica alimentare, ed è ripristinato dopo solo tre ore di
alimentazione ad libitum [Temple JL et al, 2002].
Riassumendo, i segnali metabolici periferici e centrali influenzano attitudini
alimentari e riproduttive. Quando gli ormoni influenzano la disponibilità di
risorse metaboliche e l’ossidazione che ha effetti sul comportamento, gli
ormoni agiscono come mediatori dello stimolo metabolico. Come discusso di
seguito,
diversi
ormoni
e
neuropeptidi
centrali
che
influenzano
il
comportamento alimentare hanno un notevole effetto sull’impiego dell’energia
e sulla sua distribuzione (termogenesi, resa cardiaca, tasso metabolico,
ossidazione di glucosio e degli acidi grassi liberi, sintesi dei trigliceridi). Quindi,
108
è spesso difficile discernere tra gli effetti diretti degli ormoni e dei neuropeptidi
sui circuiti centrali che controllano il comportamento e gli effetti indiretti sulla
disponibilità di cibo e sull’ossidazione.
Mediatori ormonali
Si è stabilito che gli ormoni servono come mediatori tra gli eventi stimolatori
metabolici e i meccanismi del cervello che controllano il bilancio energetico e la
riproduzione, quando la loro concentrazione nel sangue, e il legame con i propri
recettori, riflettono la quantità dell’energia immagazzinata e la disponibilità di
sostanze metaboliche ossidabili. È stato ipotizzato che gli ormoni attraversano
il cervello e si legano ai propri recettori, in tal modo informano il cervello sulla
disponibilità interna di energia. La concentrazione degli ormoni circolanti è
anche associata con particolari stagioni e con lo stato riproduttivo, e così,
possono modulare la disposizione delle risorse e dare priorità a quei
comportamenti che ottimizzano il successo riproduttivo.
Agli ormoni si possono applicare dei principi generali sulla relazione ormonecomportamento. Primo, non vengono innescati dal comportamento. Loro
provvedono ad un milieu o ad un contesto che cambia la probabilità che un
particolare comportamento si verifichi attraverso la modulazione degli stimoli
metaboliche, alterando la percezione degli stimoli sensoriali, o agendo a vari
livelli di integrazione nel sistema nervoso centrale. Secondo, la motivazione o
la spinta ad un comportamento possono avvenire anche in assenza degli
ormoni. Terzo, gli ormoni possono coadattarsi, durante l’evoluzione nel
controllo di svariate funzioni e di processi fisiologici che sono importanti per
sopravvivere alla maturità sessuale e per il successo riproduttivo. Quarto,
differenti ormoni servono alla stessa funzione in differenti specie, mentre lo
stesso ormone può avere ruoli diversi in specie diverse.
Ormoni sessuali
Gli ormoni sessuali bene illustrano il contrasto fra modulatori ormonali ed
attivatori ormonali. Nei roditori da laboratorio, il desiderio del maschio di
accoppiarsi è inibita dalla castrazione, ma può essere ripristinato attraverso il
trattamento con testosterone, ed inibito di nuovo da antagonisti dei recettori
degli androgeni impiantati nell’ipotalamo nell’area mediale preottica. La
concentrazione plasmatica di testosterone, tipica nel maschio, non innesca un
impulso copulatorio. In seguito la concentrazione plasmatica di testosterone
aumenta la probabilità che un maschio inizi il corteggiamento, e che abbia un
109
impulso all’accoppiamento in presenza di una femmina sessualmente motivata,
necessità
metaboliche
ed
altri
fattori
ambientali
che
minaccino
la
sopravvivenza. Tuttavia l’impulso sessuale può esistere e può essere espresso
senza stimoli ormonali. Per esempio in individui, di diverse specie, con
esperienza sessuale l’impulso all’accoppiamento continua anche dopo la
rimozione
degli
organi
genitali,
e
gli
ormoni
gonadici
sono
dissociati
dall’impulso sessuale in altre specie.
Inoltre, gli ormoni sessuali sono utili per illustrare l’idea che gli ormoni
possano coordinarsi, durante l’evoluzione, per controllare una varietà di
processi
fisiologici
e
comportamentali
che
sono
importanti
per
la
sopravvivenza, per la maturità sessuale e per il successo riproduttivo. Per
esempio nei roditori e in altre specie, la secrezione ovarica di estrogeni è
necessaria per l’aumento improvviso dell’LH e per l’ovulazione.
Gli estrogeni ovarici il progesterone si sono coordinati durante l’evoluzione
per aumentare le probabilità che avvenga l’accoppiamento durante il periodo in
cui c’è una più alta probabilità che la fertilizzazione dell’ovulo abbia successo.
Gli ormoni sessuali servono anche ad illustrare il concetto correlato che le
specie hanno ormoni differenti che controllano i comportamenti. In alcune
specie, infatti, gli estrogeni e il progesterone sono critici per indurre l’impulso
sessuale tipico femminile, mentre in altre gli androgeni e i glucocorticoidi sono
critici per loa sincronizzazione dell’impulso sessuale e dell’ovulazione,così come
avviene nel topo muschiato.
Analogamente, il tipico impulso sessuale maschile è influenzato dagli
estrogeni, dagli androgeni o dal progesterone o da nessuno di questi steroidi,
ciò dipende dalle specie. Durante l’evoluzione, il progesterone si è adattato nel
facilitare il comportamento tipico maschile in certe specie che mancano di
testosterone. Il progesterone ha il potenziale di influenzare il comportamento
sessuale maschile in tutti i mammiferi compreso l’uomo [Crews, 2000].
In modo simile, gli ormoni riproduttivi si sono adattati nel modulare
l’ingestione di cibo, lo stoccaggio energetico e la spesa energetica in relazione
alla sopravvivenza e al successo riproduttivo. La spinta a mangiare può essere
ottenuta direttamente dai cambiamenti nella disponibilità di cibo senza che ci
siano delle variazioni nella concentrazione degli ormoni sessuali.
In alcune specie gli ormoni per la gravidanza e per l’allattamento si sono
adattati nel facilitare l’aumento dell’assunzione di cibo. Per esempio in molte
specie,
la
concentrazione
sanguigna
di
progesterone
aumenta
drammaticamente durante la gravidanza mentre i livelli degli estrogeni
aumentano ma meno rapidamente. Nelle femmine di ratto ovariectomizzate, il
110
trattamento con moderate quantità di estrogeni diminuisce l’assunzione di cibo,
mentre il trattamento con elevate quantità di progesterone lo aumenta [Wade
and Schneider,1992]. In queste specie sembra che gli ormoni della gravidanza
possono incrementare l’assunzione e lo stoccaggio energetico in preparazione
alla richiesta energetica della lattazione. La lattazione , al contrario, è
caratterizzata da alti livelli di prolattina, un ormone secreto dalla ipofisi
anteriore. Non a sorpresa il trattamento di femmine di ratto ovariectomizzate
preparate con gli estrogeni il trattamento con la prolattina induce un
incremento dose-dipendente nell’assunzione di cibo [Gerardo-Gettens et al,
1989(a); Gerardo-Gettens et al, 1989(b)].
Tuttavia, cambiamenti nei livelli di questi ormoni non spiegano pienamente i
cambiamenti nell’assunzione di cibo. L’incremento nel consumo di cibo durante
l’allattamento è di gran lunga maggiore di quello indotto dal trattamento con
ormoni esogeni. Loro informano il cervello sullo stato riproduttivo dell’animale,
e
favoriscono
una
regolazione
comportamentale
e
metabolica
che
sia
appropriata per quella fase della riproduzione in quella particolare specie.
Durante l’allattamento, quando grandi quantità di energia vengono spese per la
produzione di latte, si ha la produzione di forti segnali sensoriali, derivanti,
probabilmente, direttamente dai cambiamenti nello stato energetico nel
sistema nervoso centrale o periferico della madre, e questi potrebbero spiegare
il drammatico incremento nel consumo di cibo. Gli ormoni della gravidanza
agiscono in concerto o accentuano i segnali sensoriali metabolici primari che
derivano dalla domanda energetica della riproduzione. In più, i segnali
sensoriali metabolici e i mediatori ormonali influiscono non solo nel consumo di
cibo,ma anche l’utilizzazione e la ripartizione dell’energia conservata, e ci sono
differenze tra le specie nel modo in cui questi ormoni modulano il consumo, il
deposito e l’utilizzo del cibo [Wade and Schneider,1992].
Durante la gravidanza, le femmine di ratto e di topo aumentano l’immissione
di energia, in eccesso rispetto alla domanda energetica del feto che sta
crescendo, rinforzando, in tal modo, le scorte energetiche materne, in
previsione della richiesta energetica della lattazione. Al contrario le femmine di
altre specie, come il criceto siriano, non aumentano le proprie scorte
energetiche durante la gravidanza. Piuttosto continuano a mangiare la stessa
quantità di cibo di prima della gravidanza, e impegnano le proprie scorte di
grasso nella crescita del feto [Wade et al., 1986].
Invece il criceto siberiano, durante la gravidanza non aumenta l’assunzione
di cibo, e come conseguenza perde le proprie riserve energetiche (grasso
corporeo)
[Schneider
and
Wade,1987],ma
allo
stesso
tempo
aumenta
111
l’accaparramento di cibo, un comportamento che spinge all’accumulo di scorte
energetiche esterne [Bartness,1997].
Questi esempi indicano che specie differenti utilizzano una varietà di
strategie energetiche, impiegando diversi segnali ormonali, con diversi metodi
di assunzione, stoccaggio e consumo, per soddisfare le loro richieste
energetiche al fine di assicurarsi il successo riproduttivo.
Gli effetti dei cambiamenti energetici sulla fisiologia e sul comportamento
non sono sempre mediati da variazioni nella secrezione degli ormoni sessuali,
ma piuttosto, da modificazioni della sensibilità agli ormoni, probabilmente
attraverso la modulazione dell’espressione genica dei recettori di quegli
ormoni.
I cambiamenti metabolici inibiscono i cicli ovulatori e il sistema HPG
aumentando, in parte, la sensibilità dell’ipotalamo al feedback negativo degli
estrogeni. La privazione di cibo inibisce la secrezione di LH nei ratti
ovariectomizzati trattati con gli estrogeni [Cagampang et al., 1990;Nagatani et
al., 1996; Nagatani et al., 1994].
Molte prove suggeriscono che il feedback negativo degli estrogeni sul GnRH
avviene trans-sinapticamente attraverso i neuroni che si proiettano dal GnRH,
o tramite le cellule gliali, non avviene attraverso il recettore degli estrogeni di
tipo alfa (ERα) localizzati sui neuroni GnRH [Herbison,1998]. Il feedback
negativo degli estrogeni, durante i cambiamenti energetici,potrebbe avvenire
nel PVN dell’ipotalamo, poiché microinfusioni di estrogeni in questa zona
accentuano la soppressione, indotta dal digiuno, della secrezione pilsatile di LH
nei ratti ovariectomizzati [Nagatani et al.,1994], e aumentano le ER-IR nel PVN
nei ratti a digiuno [Estacio et l., 1996]. Queste aree del cervello contengono i
neuroni GnRH (mPOA), o contengono i nuclei che si proiettano verso gli assoni
del GnRH nell’arco della eminenza mediana.
Dati recenti indicano che gli estrogeni possono esercitare alcuni effetti sui
neuroni GnRH direttamente attraverso il recettore per gli estrogeni di tipo beta
(ERβ) [Abraham et al.,2003;Herbison and Pape,2001;Hrabovszky et al., 2001].
I neuroni GnRH esprimono bassi livelli di ERβ e di proteine, ed molti studiosi
hanno utilizzato questi dati per discutere a favore o contro un ruolo funzionale
dell’ERβ [Herbison and Pape, 2001;Hrabovszky et al., 2000; Hrabovszky et al.,
2001; Kallo et al., 2001;Skynner et al., 1999].
Il trattamento con gli estrogeni provoca una rapida fosforilazione delle
proteine che legano gli elementi di risposta al cAMP (CREB) nei neuroni GnRH
dei topi wild-type, nei topi KO per ERα, ma non nei topi KO per ERβ.
112
La fosforilazione di CREB è un indice dei cambiamenti dei segnali
intracellulari. Quindi, questi risultati suggeriscono che ERβ può mediare il
rapido effetto degli estrogeni sul GnRH [Abraham et al.,2003].
I meccanismi neurali che controllano il comportamento sessuale sono anche
influenzati dai cambiamenti metabolici e questi effetti sono indipendenti dagli
effetti
provocati
dai
cambiamenti
metabolici
sul
sistema
HPG
e
sulla
concentrazione degli steroidi gonadici. I criceti siriani ovariectomizzati, indotti
all’estro attraverso il trattamento con gli estrogeni e con il progesterone,
mostrano una diminuzione della durata della lordosi in risposta alla privazione
di cibo, al trattamento con inibitori metabolici o con insulina e all’alloggiamento
in ambienti con basse temperature [Dickerman et al.,1993;Panicker and Wade,
1998].
Variazioni nella durata della lordosi in risposta a questi cambiamenti
metabolici sono strettamente associati ad una significativa diminuzione
del’espressione di ERα nel nucleo ipotalamico ventromediale (VMH) [Estacio et
al., 1996(a); Estacio et al., 1996;Li et al., 1994;Panicker and Wade,
1998;Roemmich et al.,1997].
La Leptina
Il trattamento con leptina diminuisce l’appetito, aumenta il dispendio
energetico, la disponibilità di risorse e facilita i processi riproduttivi [Bai et
al,1996,Clarke et al,1999, Cunningham et al,1999,Finn et al, 1998,Henry et
al,1999, Schneider et al, 2000].
E’ stato più volte ipotizzato che la concentrazione di leptina nel plasma
informa il cervello riguardo il livello di lipidi nel sangue ed il livello di risorse
metaboliche disponibili. Tuttavia, la prova del ruolo funzionale della leptina è
ampiamente circostanziale. La leptina non ha superato il test critico come
segnale di sazietà e difatti, gli effetti di sazietà della leptina non sono invertiti
da un antagonista che sia specifico per un suo recettore [Brunner et al, 1999].
I topi che sono omozigoti per una mutazione del gene della leptina, il gene
ob, sono sia obesi che non fertili, ma entrambe queste condizioni sono invertite
dal trattamento con leptina. La somministrazione di leptina previene gli effetti
della sottoalimentazione su diversi aspetti della riproduzione in roditori da
laboratorio sia obesi che magri [Ahima et al, 1996, 1997, 1999, Barash et al,
1999, Chehab et al, 1997, Gruaz-Gumowsky et al, 1998, Schneider et al, 1998,
Wade et al, 1997].
A tale riguardo, è stato ipotizzato che gli effetti della leptina, sul generatore
di impulsi di GnRH o sulle scariche di GnRH e LH avvengano attraverso neuroni
113
intermediari che si proiettano da neuroni contenenti Ob-Rb [Mercer et al, 1998]
ad altri neuroni che a loro volta si proiettano verso i neuroni GnRH [Herbison et
al, 1998].
Ormoni pancreatici
L’importanza degli ormoni pancreatici, insulina e glucagone, nel controllo
del sistema HPG è ancora oggetto di controversie. Alte dosi di insulina
influenzano indirettamente i processi riproduttivi, indirizzando le risorse
metaboliche nelle riserve. Il trattamento con insulina, a dosi sufficienti da
causare ipoglicemia inibisce la secrezione di LH e la ciclicità estrale, mentre allo
stesso tempo aumenta l’appetito, il contenuto dei grassi nel sangue e la
concentrazione di leptina [Blum and Schneider, 2000, Wade et al, 1991]. Allo
stesso modo, un trattamento con basse dosi di insulina, direttamente nei
ventricoli cerebrali, tende a diminuire lo stimolo dell’appetito e a facilitare la
secrezione pulsatile di LH [Arias et al, 1992, Baskin et al, 1987, Dong et al,
1991, Miller et al, 1995].
Ghrelina e Colecistochinina (CKK)
I peptidi orexigenici rilasciati dal tratto gastroenterico tendono ad inibire la
secrezione di GnRH e, conseguentemente, di LH. La secrezione di ghrelina, un
peptide di 28 amminoacidi sintetizzato dallo stomaco, [Kojima et al, 1999] è
inibita dai pasti e aumenta gradualmente durante gli intervalli tra i pasti. Il
trattamento sistemico con ghrelina induce iperfagia e obesità. [Tschop et al,
2000, Wren et al, 2001] La ghrelina potrebbe agire sui meccanismi del cervello
che controllano il comportamento alimentare e la riproduzione poiché la
ghrelina, somministrata intracerebroventricolarmente o per microiniezione nel
PVN ipotalamico, stimola l’assunzione di cibo in ratti intatti ed inibisce la
secrezione pulsatile di LH in ratti OVX. [Furuta e al, 2001, Melis et al, 2002,
Nakazato et al, 2001]. L’iniezione intravenosa di CCK inibisce l’appetito e
stimola il rilascio di GnRH nelle scimmie maschio, [Perera et al, 1993] mentre il
peptide intestinale, motilina, diminuisce anche la secrezione di LH pulsatile nei
ratti [Tsukamura et al, 2000].
Ormoni Corticosurrenalici
I glucocorticoidi, cortisolo e corticosterone, così come le catecolamine
surrenaliche,
sono
secreti
in
risposta
alla
privazione
di
cibo,
stress
generalizzato ed emergenza metabolica cerebrale. Questi ormoni hanno effetti
inibitori sui processi riproduttivi. Si potrebbe ipotizzare, quindi, che gli ormoni
114
corticosurrenalici medino gli effetti delle richieste metaboliche del sistema HPG
anche se la maggior parte delle prove non riesce ad evidenziare un ruolo
specifico dei glucocorticoidi [Nagatani et al, 2001].
Modulatori ormonali
Gli ormoni come la leptina e l’insulina possono influenzare la riproduzione in
virtù dell’abilità di questi ormoni a modulare la disponibilità intracellulare e
l’ossidazione del glucosio e degli acidi grassi liberi.
La leptina come modulatore
È stato più volte assunto che la leptina agisce direttamente sul meccanismo
ipotalamico che controlla i sistema HPG. Tuttavia è importante notare che la
leptina
se
somministrata
perifericamente
o
centralmente,
up-
regola
drammaticamente la spesa energetica, la termogenesi, l’ossidazione dei
substrati e quindi, ha la capacità di influenzare indirettamente l’assunzione di
cibo e la riproduzione provocando una maggiore disponibilità di substrati per
l’ossidazione, che determina un cambiamento degli stimoli metabolici primari
[Bai
et
al.,1996;Ceddia
et
al.,2001;Kamuhara
et
al.,1997;Rossetti
et
al.,1997;Unger et al.,1999;William et al.,2002;Zhou et al.,1997].
Trattamenti esogeni con la leptina prevengono gli effetti della privazione di
cibo in una grande varietà di specie. È possibile che alcuni o tutti gli effetti dei
trattamenti esogeni di leptina avvengono attraverso gli effetti che la leptina ha
sull’ossidazione dei substrati.
A supporto di tale ipotesi, l’anestro indotto dal digiuno nel criceto siriano non
è
significatamene
attenuato
dal
trattamento
sia
intraperitoneale
che
intracerebroventricolare con la leptina, se ogni iniezione di leptina è preceduta
da un’iniezione degli inibitori metabolici 2DG o MP, tuttavia queste dosi di 2DG
o di MP non inducono anesto nei criceti siriani alimentati ad libitum [Schneider
et al.,1998; Tritos e Maratos-Flier, 1999].
Questi risultati possono riflettere un’interazione tra la leptina e gli inibitori
metabolici a livello dell’ossidazione intracellulare dei substrati metabolici,
tuttavia sono possibili interazioni ad altri livelli. Pochi studi suggeriscono che la
leptina aumenta la disponibilità e l’ossidazione del glucosio [Kamohara et al.,
1997; Minokoshi et al., 1999], mentre il trattamento con il 2DG ha effetti
opposti [Brown, 1962].
Ci sono ora una grande quantità di evidenze in accordo con l’ipotesi che la
leptina aumenta la disponibilità e l’ossidazione intracellulare degli acidi grassi
115
liberi. Gli acidi grassi liberi possono essere resi disponibili per l’ossidazione
attraverso: (1) diminuzione della sintesi de novo degli acidi grassi liberi, (2)
diminuzione
dell’esterificazione
intracellulare
degli
acidi
grassi
liberi
a
trigliceridi, (3) aumento della ripartizione dell’ossidazione e i trigliceridi e degli
acidi grassi liberi e (4) esportazione degli acidi grassi liberi ai tessuti non
adiposi.
Il trattamento degli adipociti con leptina diminuisce la sintesi di nuovi acidi
grassi liberi, aumenta l’esterificazione intracellulare degli acidi grassi liberi a
trigliceridi, aumenta la ripartizione dei trigliceridi e l’ossidazione degli acidi
grassi, incrementa l’esportazione degli acidi grassi liberi alle cellule non
adipose. Il risultato netto è un aumento del 30% dell’efflusso degli acidi grassi
liberi dagli adipociti, e si pensa che questo prevenga l’ossidazione all’interno
degli adipociti e che invece la promuova nelle cellule non adipose [William et
al., 2002].
Se la leptina migliora le funzioni riproduttive, in virtù della sua capacità di
promuovere l’ossidazione dei substrati, si potrebbe sostenere che la leptina
potrebbe non riuscire a migliorare le funzioni riproduttive se i substrati non
sono a lungo disponibili. A supporto di questa ipotesi, trattamenti con la leptina
possono completamente invertire gli effetti del digiuno nella pubertà nei ratti
che vengono limitati nell’80% nel loro apporto di cibo ad libitum [Cheung et al.,
1997].
La privazione di cibo potrebbe limitare l’abilità della leptina di facilitare il
comportamento sessuale attraverso l’aumento della disponibilità energetica e
dell’ossidazione. Inoltre, il trattamento con la leptina può abbreviare la durata
del diestro dovuto all’allattamento nei ratti esposti a una prolungata e cronica
restrizione calorica [Woodside et al.,1998; Woodside et al.,2000], e ciò è in
accordo con l’idea che la leptina non può facilitare la riproduzione se c’è un
deficit nella disponibilità di cibo. Allo stesso modo il trattamento con la letina
può attenuare ma non completamente superare gli effetti della privazione di
cibo sulla secrezione indotta dagli estrogeni dell’LH e della prolattina nei ratti
[Watanobe et al., 1999].
Trattamento con insulina come modulatore
L'idea che l’infertilità derivi da un eccesso nello stoccaggio di energia (come
avviene in alcuni tipi di obesità), e il relativo deficit nella disponibilità e
nell’ossidazione
di
substrati
metabolici
è
illustrato
da
esperimenti
che
impiegano trattamenti con alte dosi di insulina come uno strumento per lo
smistamento dei combustibili metabolici endogeni fuori dalla circolazione nei
116
tessuti in cui sono
stati stoccati. Il trattamento sistematico con alte dosi di
insulina incrementa l’ingestione di cibo e promuove lo stoccaggio dei grassi
nelle specie dei mammiferi.
Il trattamento con insulina inibisce i cicli estrali nel criceto siriano a cui viene
limitato l’assunzione di cibo e
nei criceti controllo trattati solo con soluzione
salina, ma la stessa dose di insulina non è in grado di inibire i cicli estrali
quando i criceti possono mangiare a volontà per compensare la conservazione
energetica [Wade et al., 1991].
Quindi, l’insulina promuove l’obesità e inibisce la ciclicità estrale. Gli effetti
inibitori dell’insulina non sono effetti diretti sulla riproduzione, poiché i criceti
trattati con insulina e alimentati ad libitum mostrano cicli estrali regolari.
L’insulina inibisce la riproduzione, solamente, nei criceti a cui non viene
permesso di mangiare in modo esagerato in risposta al trattamento con
insulina.
L’idea che la riproduzione è controllata da cambiamenti di alcuni mediatori
ormonali del contenuto corporeo di grassi, indica che i criceti trattati con
insulina sia alimentati ad libitum che sottoposti a limitazioni nel cibo, mostrano
una ciclicità estrale regolare, perché entrambi i gruppi guadagnano grasso
corporeo e entrambi hanno elevate concentrazioni plasmatiche di leptina.
Al contrario , l’insulina inibisce la ciclicità estrale solo nei criceti sottoposti a
limitazioni di cibo, pur determinando in entrambi i gruppi il guadagno di grasso
corporeo e elevate concentrazioni di leptina [Blum e Schneider,2000]. Questo
fenomeno non è limitato solo ai criceti siriani, poiché nei ratti e negli ovini la
secrezione pulsatile di LH viene inibita da infusioni di insulina, ma non quando
gli
effetti
metabolici
dell’insulina
vengono
controbilanciati
dall’infusione
simultanea di glucosio [Clarke et al., 1990; He et al., 1999; Rodriguez et al.,
1999].
È interessante notare che i criceti trattati con insulina sono non fertili
nonostante
il
loro
elevato
contenuto
corporeo
di
grassi
e
l’elevata
concentrazione plasmatica di leptina. Questo modello sperimentale illustra
come l’infertilità può accompagnare certi tipi di obesità. Se l’obesità e
l’iperfagia derivano da una predisposizione per l’immagazzinamento di energia
che impedisce di disporre di una sufficiente quantità di substrato per le
ossidazioni intracellulari, ci si aspetterebbe che si crei un deficit nella
disponibilità di substrati metabolici che potrebbero generare stimoli di natura
inibitoria per il sistema HPG [Wade e Schneider, 1992; Wade e Schneider,
1996].
117
I risultati degli esperimenti che hanno esaminato la leptina e l’insulina
enfatizzano l’idea che gli ormoni possono influenzare indirettamente la
riproduzione e il bilancio energetico, attraverso gli effetti sugli stimoli sensoriali
metabolici. In questo senso, questi sono dei modulatori degli stimoli metabolici,
piuttosto che mediatori tra i livelli dell’energia interna e gli effettori centrali.
Effettori centrali
Gli ormoni e gli stimoli sensoriali influenzano il bilancio energetico e la
riproduzione agendo sul sistema degli effettori nel tronco cerebrale e
nell’ipotalamo. L’effettore centrale per il controllo dell’asse HPG e della ciclicità
estrale è il circuito dei neuroni GnRH localizzati nell’ipotalamo medio basale
(incluso il nucleo arcuato), nell’ipotalamo anteriore e nel POA. Gli effettori per il
comportamento sessuale femminile sono meno definiti ma probabilmente
includono il VMH, PVN e il mPOA.
Gli effettori per l’assunzione di cibo son ancora più diffusi e includono le aree
menzionate
nel
controllo
del
comportamento
sessuale
femminile,
più
l’ipotalamo laterale, l’ipotalamo dorsomediale e altre aree. L’informazione
sensoriale metabolica raggiunge queste aree ipotalamiche coinvolte nel sistema
HPG, nell’impulso ad ingerire cibo e nel comportamento sessuale attraverso il
tronco encefalico caudale.
Gli
ormoni
possono
influenzare
gli
effettori
centrali
attraverso
la
modulazione dello stimolo metabolico, o mediante un’azione diretta sui neuroni
nelle aree ipotalamiche [Schneider e Watts,2002].
Catecolamine
Ricerche sul controllo dell’assunzione del cibo hanno portato ad una scoperta
di un circuito attraverso il quale cambiamenti nella disponibilità di glucosio e
nell’ossidazione sono rilevati nel AP (area postrema) e nel NTS (nucleo del
tratto solitario) e viaggiano tramite segnale noradrenergico dalle aree anteriori
del cervello coinvolte nel meccanismo della fame ed il sistema HPG. L’AP ha
connessioni
reciproche
con
l’NTS.
Dal
NTS,
nell’area
A2
i
neuroni
catecolaminergici si proiettano interamente in direzione rostrale, e molti di loro
si proiettano verso PVN [Sawchenko et al, 1985].
118
Neuropetide Y
La secrezione di NPY aumenta in risposta a richieste metaboliche, come
privazione del cibo ed aumento dell’impiego energetico [Kalra et al, 1991,
Lewis et al, 1993].
La secrezione di NPY è elevata durante le richieste metaboliche che
inibiscono la secrezione pulsatile di LH [Kalra et al, 1991, Lewis et al, 1993] ed
i livelli di NPY diminuiscono con i trattamenti che migliorano i deficit metabolici
e reinseriscono la funzione HPG [Kalra et al, 1997].
Per esempio, in animali nutriti, NPY è essenziale per la secrezione di LH, che
normalmente avviene in risposta a prolungate ed elevate concentrazioni di E.
Comunque, NPY è inibitorio del modo pulsatile di secrezione del LH [McDonald
et al, 1989].
Il ruolo di NPY nell’inibizione del sistema HPG, del comportamento sessuale
e e della stimolazione dell’assunzione del cibo è osservato in specie diverse
come i roditori, i pesci e i serpenti. Insieme questi dati portano ad un idea che i
neurotrasmettitori permettano agli animali di stabilire priorità influenzando la
motivazione a intraprendere un determinato comportamento. Questi dati
suggeriscono come potremmo fare maggiormente progressi nel comprendere
questi sistemi centrali di effettori studiando gli aspetti motivazionali del
comportamento sessuale e ingestivo [Ammar et al, 2000, Morris et al, 1990,
Narnaware et al, 2001].
Colecistochinina
Il peptide del sistema digerente, CCK, è secreto come neuropeptide nelle
regioni del CNS contenenti recettori steroidei gonadali e neuroni GnRH, come
l’mPOA. [Simerly et al, 1986] Si ritiene che i neuroni contenenti GnRH nel
mPOA ricevano proiezioni da fibre CCK, [Simerly et al, 1986] e CCK immessa in
quest’area ha sia influenze stimolatorie che inibitorie sulla secrezione di LH e
GnRH [Hashimoto et al, 1986, Kimura et al, 1983, Perera et al, 1993].
Peptide Glucagone-simile
Il trattamento con un altro peptide dell’apparato digerente, GLP-1, aumenta
la secrezione di LH entro i primi 5 minuti di iniezione nei ratti maschi adulti
[Beak et al, 1998]. GLP-1, come CCK, diminuisce l’assunzione di cibo ed è
anche secreta nel CNS [Van Dijk et al, 1999].
Inoltre, un digiuno di 48 h diminuisce il contenuto ipotalamico di GLP-1 in
confronto a quello di ratti nutriti. Neuroni CCK nel AP e neuroni GLP-1 nel NTS
caudale si proiettano al PVN, un area dove si ritiene che la privazione del cibo
119
aumenti la sensibilità al feedback steroide-negativo sul generatore di impulsi
GnRH [Yamamoto et al, 2003].
Ormone rilasciante le Corticotropine
Si ritiene che gli effetti del legame di steroidi al PVN aumentino la
secrezione di CRH in
neuroni che proiettano in vicinanza di neuroni GnRH.
[MacLusky et al, 1988, Maeda et al, 1994, Tsukamura et al, 1999] Il
trattamento centrale con CRH ha influenze inibitorie sulla secrezione di LH, ed il
trattamento con antagonisti al CRH previene gli effetti del digiuno sugli impulsi
di LH in ratti OVX trattati con steroidi [Maeda et al, 1994]. Il trattamento con
CRH inibisce la generazione di impulsi di GnRH da azione diretta sui neuroni
GnRH [MacLusky et al, 1988].
E’ difficile inserire il peptide correlato urocortina in questo quadro;
contrariamente ad un trattamento con CRH, il trattamento con urocortina
aumenta la secrezione di LH mentre alle stesse dosi diminuisce l’assunzione di
cibo negli ovini [Holmberg et al, 2001]. Sarebbe forse più utile possedere dati
riguardo il ruolo dell’urocortina nel controllo del sistema HPG in una varietà di
specie più ampia [Wingfield et al, 2000] .
β-Endorfine
Il rilascio di oppiacei endogeni, in particolare della β-endorfina, è un altro
aspetto della risposta a stress che inibisce il comportamento sessuale. In
femmine obese del ratto di Zucker, il trattamento con antagonisti degli oppioidi
ha attenuato l’obesità e migliorato la performance sessuale [Marin-Bivens et al,
1999].
Orexine
Le orexine, conosciute anche come ipocretine, aumentano sia l’assunzione
di cibo sia l’impiego energetico aumentando il periodo di veglia e prevenendo il
normale periodo di sonno [Lubkin et al, 1998,Willie et al, 2001]. In aggiunta,
l’orexina stimola la secrezione di LH in ratti OVX trattai con steroidi, ed inibisce
la secrezione di LH in ratti trattati con soluzione o con basse dosi di E [Furuta
et al, 2002, Pu et al, 1998, Tamura et al, 1999].
Melanocortine
Un punto di divergenza fra i meccanismi che controllano l’assunzione di cibo
e quelli che controllano la riproduzione è che la leptina influenza l’assunzione di
cibo attraverso la via melanocortinergica , laddove gli effetti della leptina sugli
120
impulsi di LH e sulla ciclicità estrale sembrano essere indipendenti dal sistema
della melanocortina [Hohmann et al, 2000, Schneider et al, 1999]
Ormone inducente il rilascio di Gonadotropine (GnRH)
La maggior parte delle evidenze sperimentali indica che i segnali sensoriali
metabolici e gli ormoni influenzano i neuroni GnRH-ergici indirettamente
attraverso vie centrali e periferiche. Nei criceti, lesioni AP/mTNS prevengono gli
effetti inibitori da glucoprivazione sistemica (trattamento 2DG) o da ipoglicemia
(trattamento con insulina) sul ciclo estrale [Panicker e Wade, 1998; Panicker et
al.,1998; Schneider et al, 1994].
Il deficit sistemico nella disponibilità di glucosio ossidabile non è, quindi,
rilevato direttamente da neuroni GnRH-ergici, ma piuttosto in zone periferiche
o nel nucleo caudale e ridiretti alla parte anteriore. Nei ratti e nei criceti, la
maggior parte dei neuroni GnRH-ergici è localizzata nell’AH, POA, ed Arc, aree
del cervello anteriori rispetto a quelle ricche in recettori della leptina (Ob-Rb) e
dell’insulina. E’ improbabile, quindi, che la secrezione di GnRH sia direttamente
modulata dalla leptina o dall’insulina. I recettori per ER-α, NPY, Ob-Rb ed
insulina non sono stati segnalati nei corpi cellulari dei neuroni GnRH-ergici.
Quindi, è più probabile che le aree ipotalamiche ed extraipotalamiche ricche di
recettori come ER-α ed Ob-Rb indirizzano il segnale verso aree che contengono
i neuroni GnRH [Herbison et al, 1998].
121
Figura 21. Schema riassuntivo Il controllo metabolico della riproduzione e dell’
appetito coinvolgono il sistema nervoso centrale e periferico ed i tessuti periferici. I
riquadri con il contorno più spesso rappresentano aree conosciute per essere importanti
per il controllo metabolico della riproduzione. Lo stimolo sensoriale primario è la
disponibilità di riserve metaboliche ossidabili come il glucosio e gli acidi grassi liberi.
Questi sono rilevati nel nucleo caudale. In aggiunta, è possibile che la disponibilità si
rilevata anche nei tessuti periferici, come il fegato ed il tubo digerente, e che il segnale
si rediretto al cervello tramite il motore dorsale del vago. La secrezione degli ormoni,
come l’insulina e la leptina, è stimolata dall’influsso delle riserve metaboliche nei tessuti,
come il pancreas ed il tessuto adiposo, rispettivamente. (I triangoli indicano presenza di
recettori per steroidi gonadali, i trapezi recettori di leptina ed insulina). [Schneider et al,
2004]
122
Il sistema degli endocannabinoidi
Negli ultimi anni il sistema degli endocannabinoidi è emerso essere un
argomento molto importante nella comunità scientifica. A questo sistema sono
state attribuite differenti azioni di regolazione e il suo coinvolgimento in
molteplici situazioni pato-fisiologiche viene costantemente monitorato.
Il
sistema
degli
endocannabinoidi
comprende:gli
endocannabinoidi,
i
recettori per i cannabinoidi e l’apparato per la loro sintesi e degradazione, e
rappresenta un nuovo sistema di segnalazione endogeno [Piomelli,2003; De
Petrocellis et al.,2004].
In generale, il sistema degli endocannabinoidi è coinvolto in molte differenti
funzioni fisiologiche molte delle quali correlate con i sistemi di recupero dallo
stress
e
con
il
mantenimento
del
bilancio
omeostatico
[Di
Marzo
et
al.,1998].Tra le altre funzioni, è coinvolto nella neuroprotezione [Panikashvili et
al.,2001;Marsicano et al.,2003; Panikashvili et al.,2005], nella nocicezione
[Cravatte e Lichtman,2004], nella regolazione dell’attività motoria (Van der
Stelt e Di Marzo,2003), e nel controllo di certe fasi della memorizzazione
[Wotjak,2005; Marscano et al.,2002;Varvel e Lichtman,2002]. Inoltre, il
sistema degli endocannabinoidi è coinvolto nella modulazione della risposta
immunitaria e infiammatoria [Walter et al.,2003;lei net al.,2003;Massa et
al.,2004], è
in grado di influenzare i sistemi cardiocircolatorio e respiratorio
attraverso il controllo della frequenza cardiaca, della pressione sanguigna e
delle funzioni bronchiali [Mendizabal e Adler-Graschinsky,2003].
In fine, gli endocannabinoidi sono conosciuti per esercitare un’importante
azione antiproliferativa nelle cellule tumorali [Bifulco e Di Marzo,2002].
Endocannabinoidi
Gli endocannabinoidi rappresentano una nuova classe di mediatori lipidici,
eicosanoidi, isolati dal cervello e dai tessuti periferici nel corso dell'ultimo
decennio. Il primo cannabinoide endogeno è stato identificato nel 1992 e si
tratta dell’anandamide (arachidonoiletanolammide, AEA) [Devane et al.,1992]
(Figura 22). Successivamente, è stato scoperto un secondo endocannabinoide:
il 2-arachidonoilglicerolo (2-AG) [Mechoulam et al.,1995; Sugiura et al.,1995]
(Figura 23). Entrambi questi composti sono derivati dall’acido arachidonico, e
sono in grado di legarsi ai recettori per i cannabinoidi, tuttavia, con differenze
sia nell’affinità che nell’efficacia dell’attivazione [Howlett,2002].
123
Durante gli ultimi anni sono stati descritti molti altri mediatori lipidici che
sembrano agire, almeno in parte, attraverso i recettori per i cannabinoidi di
tipo 1 e/o di tipo 2, e conferiscono specifici effetti farmacologici in vivo
[Bradshaw e Walker,2005].
Specificamente, questi composti sono: 2-arachidonoil-gliceril-etere (noladin)
[Hanus
et
al.,2001],
la
virodamina
[Porter
et
al.,2002]
e
la
N-
arachidonoildopamina [Huang et al.,2002] e probabilmente la olammide
[Leggett et al.,2004]. Tuttavia la funzione nei processi fisiologici di questi ultimi
composti non è stata ancora ben stabilita in dettaglio, e sono necessari ulteriori
studi [De Petrocellis et al.,2004]. Inoltre, ci sono molti altri probabili mediatori
lipidici che potrebbero svolgere un azione cannabinoidomimetica, ma non è
ancora noto in dettaglio quale sia l’esatto meccanismo d’azione di questi
composti
[Bradshaw
cannabinoidomimetici
e
Walker,2005].
potrebbero
I
essere
molti
casi,
parzialmente
questi
attribuiti
effetti
alle
interferenze con gli enzimi che inattivano gli endocanabonoidi [Bradshaw e
Walker,2005]. Questi lipidi potrebbero, pertanto, essere capaci di aumentare
l’attività
dei
recettori
per
i
cannabinoidi
attraverso
‘aumento
della
concentrazione degli endocannabinoidi come l’AEA e/o 2-AG.
Figura: 22. Struttura del’anandamide (AEA)
Figura: 23. Struttura del 2-arachidonoilglicerolo (2-AG)
Recettori per i cannabinoidi
Fino ad ora sono stati identificati e caratterizzati, a livello molecolare, due
tipi di recettori per i cannabinoidi che presentano una struttura con sette
domini transmembrana e sono accoppiati alle proteine G, e sono stati chiamati
recettore per i cannabinoidi di tipo 1 (CB1 receptor) [Matsuda et al.,1990] e di
tipo 2 (CB2 receptor) [Munro et al.,1993].
124
Figura 24: Struttura dei recettori dei cannabinoidi CB1 e CB2
Il recettore CB1 è stato originariamente descritto come il recettore, tipo del
cervello (“brain type”) poiché i suoi livelli di espressione nel cervello erano
molto elevati [Herkenham et al.,1990]. Tuttavia studi recenti attribuiscono agli
endocannabinoidi nuovi siti di azione, attraverso l’attivazione del recettore CB1,
in organi periferici.
I recettori di tipo CB2 sono presenti, pressoché esclusivamente, nelle cellule
immunitarie e del sangue, dove potrebbero partecipare alla regolazione della
risposta immunitaria [Howlett et al.,2002]. Tuttavia, i recettori CB2 esercitano
le loro funzioni anche in cellule che non appartengono al sistema immunitario,
come i cheratinociti [Ibrahim et al.,2005]. Ci sono delle prove farmacologiche
che testimoniano la presenza di altri tipi di recettori per i cannabinoidi, i quali,
tuttavia, non sono stati ancora clonati [Begg et al.,2005].
Studi di espressione hanno dimostrato che CB1 è uno dei più abbondanti
recettori accoppiati alle proteine G presenti nel cervello dei mammiferi
[Herkenham et al.,1990]. CB1 è ampiamente espresso nel cervello, incluso il
bulbo olfattivo, le regioni corticali (neocorteccia, corteccia piriforme, ippocampo
e amigdala), molte parti dei gangli basali, i nuclei talamici e ipotalamici, la
corteccia cerebellare, i nuclei del tronco encefalico. Nelle regioni subcorticali,
CB1 è presente a livelli relativamente elevati nella regione del setto (setto
laterale e mediano, e nuclei verticali e orizzontali della banda diagonale). Bassi
livelli di espressione di CB1 sono presenti nelle regione ipotalamiche, nel nucleo
preottico mediale e laterale, nel nucleo preotico magnocellulare e nel nucleo
paraventricolare [Marsicano e Lutz,1999].
I primi studi condotti sulla distribuzione di CB1 mostravano una presenza
disseminata del recettore in entrambi i lobi dell’ipofisi dei roditori [Herkenam et
al.,1991].
Studi
più
recenti
hanno
esaminato
in
maggior
dettaglio
la
125
distribuzione dell’mRNA di CB1 nel lobo anteriore dell’ipofisi. Nel 1999,
l’abbondante presenza del recettore CB1 nell’adenoipofisi di ratto è stata
associata
con
la
capacità
di
questa
ghiandola
di
sintetizzare
gli
endocannabinoidi [Gonzalez et al.,2000].Inoltre è stato dimostrata la presenza
di CB1 nelle cellule dell’ipofisi di ratto che secernono la prolattina e in quelle
che secernono l’LH [Wenger et al.,1999].
Nei roditori, l’espressione di CB1 nell’ipofisi è sotto l’influenza degli ormoni
sessuali circolanti, infatti, gli androgeni e gli estrogeni hanno la capacità di upregolare e di down-regolare l’espressione di CB1 In accordo con questi risultati
è stato trovato che in ratti, affetti da iperplasia ipofisaria indotta dagli
estrogeni,
si
verificava
una
diminuzione
dell’espressione
di
CB1.
Di
conseguenza, nei ratti , le ipofisi dei maschi mostrano un più alto livello di
espressione dell’mRNA di CB1 rispetto a quella delle femmine [Gonzalez et
al.,2000].
Il recettore per i cannabinoidi di tipo 1 è espresso, oltre che nel cervello,
anche negli organi periferici. Sono stati trovati elevati livelli di espressione di
CB1 nella tiroide di ratti durante le prime fasi embrionali [Buckley et al., 1998],
mentre nella tiroide di ratto adulto i livelli di mRNA di CB1 erano veramente
bassi ma sufficienti per essere rilevati [Porcella et al.,2002]. Inoltre CB1 è
espresso anche negli organi periferici che sono coinvolti nel controllo
metabolico. Nel 2003, due gruppi indipendenti trovarono la presenza di CB1
negli adipociti di topo e dell’uomo [Cota et al.,2003; Bensaid et al.,2003;
Engeli et al.,2005]. Recentemente CB1 è stato localizzato nel fegato di topo
[Osei-Hyiaman et al.,2005]. Inoltre il sistema degli endocannabinoidi è
presente anche nel tratto gastrointestinale dove ha la funzione di modulare
diverse funzioni incluse la mobilità, l’infiammazione e la secrezione. CB1 è
espresso, anche, nelle terminazioni del nervo vago che innervano il tratto
gastrointestinale [Pertwee,2001] che sono coinvolte nella segnalazione tra
l’intestino e il cervello e nella modulazione dell’assunzione di cibo. Il recettore
CB1 è espresso anche negli organi riproduttivi. È noto da tempo che esso è
espresso nei testicoli [Galiegue et al.,1995; Gerard et al.,1991], e in
particolare sembra essere localizzato nelle cellule di Leyding [Wenger et
al.,2001].
CB1
è
presente
anche
nelle
ovaie
[Galiegue
etal.,1995],
probabilmente esso è localizzato nelle cellule della granulosa. È stata rilevata la
sua presenza anche nell’utero di topo [Das et al.,1995] e nel miometrio
nell’uomo [Dennedy et al.,2004]. È importante notare che CB1 è coespresso
con i recettori β-adrenergici nella muscolatura dell’ovidotto, dove il sistema
126
degli endocannabinoidi regola la mobilità e il trasporto dell’embrione [Wang et
al.,2004].
Sintesi, rilascio, assorbimento, e degradazione degli endocannabinoidi:
attivazione su richiesta del sistema degli endocannabinoidi
Gli endocannabinoidi sono molto lipofilici, e questa caratteristica non
permette loro di essere immagazzinati in delle vescicole, come gli altri
neurotrasmettitori.
Di
conseguenza,
la
regolazione
del
segnale
degli
endocannabinoidi è strettamente controllata dalla loro sintesi, dal loro rilascio,
dal loro assorbimento e dalla loro degradazione [Piomelli, 2003].
Molteplici stimoli differenti, incluso depolarizzazione della membrana e
l’aumento intracellulare di Ca2+ e/o la stimolazione del recettore può attivare
complessi macchinari enzimatici, che conducono alla scissione dei fosfolipidi di
membrana ed eventualmente alla sintesi degli endocannabinoidi. Differenti
enzimi sono coinvolti nella sintesi di diversi endocannabinoidi in differenti
condizioni.
Gli endocannabinoidi possono attivare i recettori per i cannabinoidi dopo la
sintesi, o dopo un precedente rilascio nello spazio intracellulare o spostandosi
direttamente
tra
endocannabinoidi
la
è
membrana
limitato
da
cellulare.
efficaci
Il
segnale
processi
di
trasmesso
degradazione,
dagli
che
interessano un’assunzione facilitata dallo spazio extracellulare nella cellula, e
un catabolismo enzimatico mediato da specifici enzimi intracellulari. Gli enzimi
in grado di degradare gli endocannabinoidi sono stati caratterizzati molto bene,
essi sono ammide idrolasi degli acidi grassi (FAAH) per l’anandamide e per altri
composti correlati [Giang e Cravatt,1997] e una monoglicerol lipasi per il 2-AG
[Dinh et al.,2002], tuttavia altri enzimi potrebbero essere coinvolti nella
degradazione di quest’ultimo composto [Dinh et al.,2004].
Si pensa che il sistema degli endocannabinoidi agisca su richiesta, con una
selettività spaziale e temporale rigorosamente regolamentata. Questo sistema
esecita le sue azioni modulatorie solo quando e dove è necessario. Questo
comporta una importante distinzione tra le funzioni fisiologiche del sistema
degli endocannabinoidi (selettive nello spazio e nel tempo) e le azioni
farmacologiche degli agonisti esogeni dei recettori per i cannabinoidi, che
mancano di selettività. In questo contesto di regolazione endocrina, è
interessante citare che la stimolazione ormonale con i glucocorticoidi può
condurre alla sintesi degli endocannabinoidi nell’ipotalamo, attraverso un
rapido meccanismo non genomico [Di et al,2003].
127
Segnali inter e intracellulari mediati dagli endocannabinoidi
Diversi meccanismi mediati dagli endocannabinoidi vengono riportati di
seguito:
1) Nel sistema nervoso centrale (CNS), gli endocannabinoidi, possono
gire da neurotrasmettitori trasferendo informazioni da un neurone al
successivo. Qui gli endocannabinoidi rilasciati postsinapticamente
migrano nei siti presinaptici dove attivano i recettori CB1. Dunque
essi mediano un segnale retrogrado [Freund et al.,2003; Wilson e
Nicoll,2003; Alger,2002].
2) Gli endocannabinoidi possono mediare un segnale autocrino che
induce un effetto auto inibitore sull’attività neuronale. Questo è stato
mostrato per i neuroni GABAergici nella corteccia cerebrale [Bacci et
al.,2004].
3) Gli endocannabinoidi possono agire sia in maniera paracrina che
autocrina, senza coinvolgere la trasmissione sinaptica. Questo è
presumibilmente applicabile per le cellule gliali [Stella,2004] e nelle
cellule non neuronali come gli adipociti e gli epatociti.
4) Dal momento che gli endocannabinoidi e il recettore CB1 sono
presenti
nella
cellula
,
non
può
essere
escluso
che
gli
endocannabinoidi possono agire come molecole di segnalazione
intracellulare. AEA e 2-AG non sembrano mediatori intercambiabili.
Per esempio, prove elettrofisiologiche e biochimiche mostrano che il
2-AG è prevalentemente coinvolto nel contrllo retrogrado dell’attività
sinaptica nell’area tegumentale ventrale (VTA) [Melis et al.,2004],o
dell’ippocampo [Chevaleyre e Castillo,2004], mentre AEA sembra
giocare un ruolo importante in altre regioni come nei gangli basali
[Gerdeman e Lovinger,2001] e nell’amigdala [Azad et al.,2004].
In sintesi, gli endocannabinoidi sembrano essere dei mediatori di segnali
molto versatili, coinvolti in un ampio spettro di processi di regolazione
fisiologica.
128
Cannabinoidi esogeni e endogeni e il loro ruolo nella regolazione
endocrina
È noto da molto tempo che i cannabinoidi esogeni sono in grado di
influenzare la secrezione degli ormoni ipofisari, comportando, quindi, degli
importanti effetti sulle funzioni degli organi bersaglio periferici.
L’ipotalamo è generalmente considerato come il principale sito d’azione dei
cannabinoidi sulle funzioni neuroendocrine. Questo punto di vista viene
supportato da recenti pubblicazioni che mostrano che i cannabinoidi agiscono
come dei messaggeri retrogradi che attivano i recettori CB1, espressi nelle
terminazioni presinaptiche glutammatergiche nell’ipotalamo. La conseguente
attivazione del recettore CB1 provoca una cascata di segnali che conduce
all’inibizione del rilascio dei neurotrasmettitori glutammato eccitatori nelle
cellule neuroendocrine del PVN, e del nucleo sopraottico [Di et al.,2003].
Questo
conduce
ad
un
generale
effetto
soppressivo
sulle
cellule
neuroendocrine, e di conseguenza ad un effetto inibitorio sulle funzioni
neuroendocrine.
Tuttavia,
è
stato
recentemente
proposto
che
il
sistema
degli
endocannabinoidi potrebbe essere in grado di controllare il bilancio ormonale
anche attraverso un diretto effetto a livello degli organi bersaglio periferici.
Il ruolo dei cannabinoidi nella modulazione dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi e
della fertilità
Nelle femmine, la somministrazione di cannabinoidi, endogeni o esogeni,
sembra non avere effetti sulla secrezione di FSH [Wenger et al.,1995], mentre
molte evidenze sperimentali attribuiscono ai cannabinoidi una grande abilità di
down-regolare nel i livelli plasmatici di LH [Gonzalez et al.,2000; Murphy et
al.,1990; Wenger et al.,1995; Besch et al.,1977]. Questo effetto è dovuto ad
una completa soppressione della secrezione pulsatile di LH [Tyrey,1978; Smith
et al.,1978]. Nelle scimmie, una cronica somministrazione (per 18 giorni) di ∆9THC (∆9 tetraidrocannabinolo, principio attivo della marijuana (Cannabis
sativa)), provoca un blocco dei picchi degli estrogeni e dell’LH e il conseguente
aumento della concentrazione di progesterone [Asch et al.,1981]. Tuttavia, gli
stessi animali sviluppano una tolleranza agli effetti antiriproduttivi della droga
dopo pochi mesi di trattamento [Schith et al.,1983]. Un eccesso di cannabinoidi
potrebbe anche compromettere la regolare ovulazione, non solo agendo a
129
livello ipotalamico ma anche colpendo direttamente sullo strato della granulosa
ovarica [Treinen et al.,1993].
Si asserisce che l’effetto inibitorio dei cannabinoidi sulla secrezione dell’LH
abbia un sito di azione al di sopra dell’ipofisi. Infatti la somministrazione di
gonadotropine o GnRH è in grado di indurre l’ovulazione o il rilascio di LH,
rispettivamente, anche in presenza di alti livelli di ∆9-THC [Tyrey,1978; Smith
et al.,1978]. Tuttavia uno studio mostra che, in vitro, i cannabinoidi non sono
capaci di bloccare la secrezione basale di GnRH dall’ipotalamo [Murphy et
al.,1990].
Questi
risultati
suggeriscono
che
i
cannabinoidi
modificano,
indirettamente, la secrezione del GnRH, attraverso una modulazione negativa
dell’attività dei neurotrasmettitori che promuovono la secrezione del GnRH,
come la norepinefrina [Murphy et al.,1990] e il glutammato [Shen et al.,1996],
e mediante la stimolazione di quei modulatori che down-regolano la secrezione
del GnRH, come la dopamina [Rodriguez de Fonseca et al.,1992], GABA [de
Miguel et al.,1998], gli oppiodi [Kumar e Simpkins,1983], e l’ormone
rilasciante
le
corticotropine
(CRH)
[Jackson
e
Murphy,1997].
L’effetto
stimolatorio di cannabinoidi sui neuroni dopaminergici è ben conosciuto
[Maldonado,2002], tuttavia, il loro impatto sull’attività dopaminergica del
cervello varia in funzione dello stato delle gonadi, come viene dimostrato da
diverse prove [Rodriguez de Fonseca et al.,1994]. In particolare è stato
dimostrato che i recettori per gli ormoni steroidei mediano gli effetti del ∆9THC, favorendo il comportamento sessuale [Turley e Floody,1981], attraverso
l’attivazione del recettore CB1 [Mani et al.,2001]. Inoltre, nello stesso studio di
Mani et al. del 2001, viene riportato che è richiesta una interazione tra il
progesterone e il recettore per la dopamina, di tipo 1 (D1), per la recettività
sessuale nelle femmine di ratto facilitata dal ∆9-THC.
Recenti risultati sulla fluttuazione dell’AEA durante il ciclo ovarico, hanno
permesso ad alcuni autori di ipotizzare che gli endocannabinoidi potrebbero
influenzare la secrezione ormonale e il comportamento sessuale agendo
direttamente sul recettore CB1 [Stella,2001]. Tuttavia, nell’ovaio è stata
trovata un’importante produzione di endocannabinoidi, in particolare al
momento dell’ovulazione, e ciò ha reso possibile formulare l’ipotesi che gli
endocannabinoidi potrebbero aiutare a regolare la maturazione follicolare e lo
sviluppo dell’ovaio [Schuel et al.,2002].
L’utero contiene la più alta concentrazione di AEA rilevata nei tessuti dei
mammiferi, ed è il solo tessuto dove l’AEA è il principale componente (più del
95%) degli N-aciletanolamidi [Schmid et al.,1997]. Questa osservazione,
insieme all’espressione di CB1 negli embrioni reimpiantati [Paria et al.,1995],
130
hanno, recentemente, suggerito di concentrare gli sforzi sul ruolo del sistema
degli endocannabinoidi durante le prime fasi della gravidanza e nella
modulazione delle interazioni tra embrioni e utero. Alti livelli di AEA influenzano
negativamente lo sviluppo e l’impianto degli embrioni attraverso l’attivazione di
CB1 [Paria et al.,1998], mentre bassi livelli di AEA promuovono la crescita e la
differenziazione embrionale [Wang et al.,1999; Paria e Dey,2000;Maccarone e
Finazzi-Agro,2004]. È, dunque, evidente che la degradazione enzimatica di AEA
da parte di FAAH, è un punto di controllo enzimatico nel controllo della
riproduzione.
Una serie di studi condotti da Maccarone et al. [Maccarone et al.,2003;
Maccarone e Finazzi-Agro,2004] mostrano che l’attività di FAAH è sotto una
stretta regolazione da parte di molti ormoni, come il progesterone, la leptina, e
l’FSH, ben noti modulatori della fertilità. Utilizzando un blocco farmacologico o
genetico del recettore CB1 è stato, recentemente, dimostrato che un deficit dei
segnali inviati dagli endocannabinoidi comporta una ritenzione degli embrioni di
topo nell’ovidotto, provocando il fallimento della gravidanza. Questo è dovuto
al profondo indebolimento della contrazione coordinata della muscolatura liscia
del’ovidutto e della sua distensione [Wang et al.,2004].
In sintesi, tutte le tappe, che vanno dalla fertilizzazione fino alla gravidanza,
sembrano essere strettamente modulate dagli endocannabinoidi,rafforzando
l’idea che il sistema degli endocannabinoidi potrebbe essere considerato, non
solo come neuromodulatore centrale, ma anche come un protagonista
fisiologico in un più ampio scenario.
Nei maschi i cannabinoidi provocano una diminuzione della concentrazione
dell’LH [Kolodny et al.,1974; Symons et al.,1976]. Tuttavia, non c’è ancora un
generale accordo, ma sembra che la somministrazione cronica di cannabinoidi,
in molte specie, sia in grado di ridurre la produzione [Harclerode et al.,1978] e
la secrezione [Kolodny et al.,1974; Symons et al.,1976] di testosterone, che
provoca la soppressione della spermatogenesi, e la riduzione del peso dei
testicoli e degli organi riproduttivi accessori [Dixit et al.,1974]. Gli effetti
importanti dei cannabinoidi sul sistema gonadico sono principalmente attribuiti
all’attivazione del recettore CB1, come è stato dimostrato usando degli agonisti
e degli antagonisti specifici [Martin-Calderon et al.,1998; Wenger et al.,1997].
Una conferma definitiva è stata fornita da recenti studi, che hanno dimostrato
che
iniezioni
intraperitoneali
di
AEA
provocano
una
diminuzione
della
concentrazione di LH e di testosterone nei topi wild-type, ma non nei topi che
mancano del gene che esprime il recettore CB1 (CB1-/-) [Wenger et al.,2001].
131
Inoltre, è noto che i testicoli esprimono il recettore CB1 [Gerard et
al.,1991], e sintetizzano gli endocannabinoidi [Sugiura et al.,1996]. È stato
visto che topi esposti al ∆9-THC presentano un ridotto impulso copulatorio, e
ciò potrebbe spiegare il fatto che i cannabinoidi down-regolano i livelli di
testosterone circolante [Merari et al.,1973]. Inoltre, è stato visto che il fluido
del
tratto
genitale
maschile
contiene
una
significante
quantità
di
endocannabinoidi [Schuel et al.,2002], e questo suggerisce che queste
molecole segnale lipidiche potrebbero influenzare importanti processi che
controllano le funzioni dello sperma e/o dell’uovo e le interazioni con il gamete.
In conclusione, sembra, quindi, che il sistema degli endocannabinoidi ha un
importante ruolo nella regolazione dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi sia nelle
femmine che nei maschi.
Il sistema degli endocannabinoidi nella modulazione del bilancio
energetico
Ci sono due interessanti aspetti che sottolineano l’importanza del sistema
degli
endocannabinoidi
nella
regolazione
dell’assunzione
di
cibo,
e
del
metabolismo energetico. Primo: è stato visto che il ruolo del sistema degli
endocannabinoidi, nella regolazione della risposta alla nutrizione,presenta un
alto grado di conservazione durante l’evoluzione [De Petrocellis et al.,1999].
Secondo: è stato osservato che sono richiesti alti livelli di endocannabinoidi, nel
latte materno, affinché i neonati rispondano all’inizio dell’allattamento [Fride et
al.,2001].
Proprietà di soddisfazione
La
somministrazione
dell’attività
di
endocannabinoide
AEA
può
associata
rappresentare
con
una
un
amplificazione
normale
assunzione,
episodica, di cibo da parte del ratto [Williams e Kirkham,1999]. Importante, gli
effetti di AEA sono completamente bloccati dal pretrattamento degli animali
con l’antagonista degli endocannabinoidi per il recettore CB1 SR141716,
confermando il ruolo principale nell’attivazione del recettore CB1 negli effetti
iperfagici
degli
endocannabinoidi
[Williams
e
Kirkham,
2002;Kirkham
e
Williams,2001].
E’ ora chiaro che il sistema endocannabinoide partecipa alla modulazione
dei circuiti ricompensa/rafforzamento e la sua manipolazione è in grado di
influenzare il comportamento correlato alla ricompensa [Gardner e Vorel,
132
1998]. La grande espressione del recettore CB1 in aree legate alla ricompensa
costituisce una forte indicazione che il sistema endocannabinoide sia coinvolto
in varie funzioni fisiologiche controllate in queste regioni cerebrali, inclusa la
nutrizione [Breivogel e Childes,1998].
La circuitazione ricompensa/rafforzamento del cervello dei mammiferi
consiste in una serie di nuclei cerebrali connessi sinapticamente. Questo
circuito è implicato nel piacere prodotto dalle ricompense naturali come il cibo,
le droghe che danno dipendenza ed il sesso, ed è il substrato neuronale della
dipendenza da droghe e del fenomeno di dipendenza (p.es come la ricerca e la
disforia indotte da astinenza) [Gardner e Vorel, 1998].
Assunzione di cibo
Una complessa e ridondante rete neuronale ipotalamica provvede ad alti
livelli di adattabilità della nutrizione a vari stimoli centrali e periferici. La
ridondanza di segnali collegati alla regolazione dell’appetito è concepibile in
vista dell’importanza vitale della nutrizione ai fini della sopravvivenza [Flier,
2004]. Mentre difetti nelle vie di segnalazione anoressigniche portano quasi
sempre all’obesità, perdita di segnali orexigenici raramente risultano in un
fenotipo magro. Un esempio di questa ridondanza nel sistema di segnalazione
orexigenico ipotalamico è fornito dai topi mancanti del neuropeptide Y (uno dei
neuropeptidi appetito-stimolanti più importanti) dove è più probabile che i
meccanismi compensatori si attivino. I segnali che vengono da vari organi
periferici, come il fegato, il tratto gastrointestinale ed il tessuto adiposo, sono
convoluti principalmente a livello ipotalamico per informare costantemente il
cervello riguardo lo stato nutritivo [Flier, 2004, Erickson et al, 1996, Wynne et
al, 2005]. Un esempio di questo controllo periferico è l’ormone, adipocitaderivato, leptina, che agisce sui recettori localizzati sull’ipotalamo [Flier, 2004].
Una pietra miliare nell’identificazione del sistema degli endocannabinoidi, come
un nuovo fattore nella regolazione dell’assunzione di cibo a livello ipotalamico,
è stata la scoperta che la leptina è un forte modulatore dei livelli di
endocannabinoidi ipotalamici [Di Marzo et al, 2001].
Solo durante gli ultimi anni si è cominciato a chiarire più in dettaglio
l’interazione fra gli endocannabinoidi e CB1 nelle vie di regolazione della
nutrizione. Il recettore CB1 è espresso in sistemi ipotalamici peptidergici
chiave, come quelli che producono CRH nel PVN, i trascritti cocainaanfetamina, correlati, nel nucleo dorsomediale, e l’ormone che concentra
melanina, e l’orexina nell’area ipotalamica perifornicale [Cota et al, 2003].
133
Questi
dati
sono
recentemente
confermati
dalla
dimostrazione
che
l’attivazione di CB1 aumenta fortemente la via A-stimolata dell’orexina
intracellulare [Hilairet et al, 2003].
134
Scopo II
Nell’allevamento intensivo del coniglio l’infertilità di “origine alimentare” che
si riscontra frequentemente nelle coniglie primipare, contemporaneamente
gravide
e
allattanti,
rappresenta
una
delle
cause
di
ridotta
efficienza
riproduttiva con conseguente perdita economica.
Da anni è noto che esiste un legame tra lo stato nutrizionale e la fertilità
[Boland et al.,2000], ma ancora non è noto qual è il meccanismo attraverso il
quale il deficit calorico influenza le funzioni riproduttive [Wade e Jones, 2004].
In differenti specie animali, una prolungata restrizione calorica inibisce la
secrezione pulsatile del LH, riducendo la secrezione del GnRH da parte
dell’ipotalamo [Wade et al.,1986; Cameron, 1996], e ciò induce una condizione
di anestro [Diskin et al., 2003].
Da un recente lavoro, condotto nei nostri laboratori, si è appreso che un
breve digiuno di 24 ore è in grado di influenzare negativamente sia la fertilità
che la recettività sessuale delle coniglie [Brecchia et al.,2006].
Quando si ha scarsa disponibilità di cibo viene inibito il sistema ipotalamoipofisi-gonadi. L’effetto primario del deficit metabolico è l’inibizione degli
impulsi ipotalamici di GnRH. Questo provoca una cascata di eventi che portano
all’interruzione della secrezione delle gonadotropine ipofisarie, comportando
una mancata secrezione degli steroidi, che ha come conseguenza l’inibizione
della fase estrale. Lo scopo di questo studio è stato quello di andare a valutare
l’espressione genica nell’adenoipofisi del recettore di tipo alfa degli estrogeni
(ERα) e del recettore per il GnRH (GnRHR) e dell’ FSH-β, e la secrezione
dinamica dell’LH in seguito alla stimolazione dell’ GnRH in coniglie intatte,
ovariectomizzate (OVX), trattate con estrogeni (E) alimentate ad libitum (AL) o
tenute a digiuno (F) per 48 ore. Inoltre, nello stesso modello sperimentale, si è
andato a valutare l’espressione genica do ERα anche nell’ipotalamo.
Recentemente, si è posta molta attenzione allo studio del sistema degli
endocannabinoidi che rappresenta un nuovo sistema endogeno di trasduzione
dei segnali coinvolto in molteplici funzioni fisiologiche [Piomelli,2003; De
Petrocellis et al.,2004], tra cui il controllo dell’assunzione di cibo e del bilancio
energetico [Pagotto et al.,2006]. Inoltre, molti studiosi asseriscono che i
cannabinoidi possono influenzare la secrezione ormonale e il comportamento
sessuale [Stella,2001]. Nello stesso modello sperimentale si è andato a
valutare la variazione dell’espressione genica del recettore per i cannabinoidi
tipo 1 (CB1) sia nell’adenoipofsi che nell’ipotalamo.
135
Materiali e metodi
Reagenti
I primer random exameres, la deossiribonucleasi I (DNAase I Amp.Grade),
La trascrittasi inversa RNAsi-H (SuperScript III Reverse Trascriptase) la RNAsi
H di Escherichia coli, i ladder di DNA, e anche i reagenti per l’isolamento e la
purificazione dell’RNA totale (TRIzol), la Taq DNA polimerasi (Taq Platinum), il
buffer 10X per la PCR, il MgCl2 50 mM, le provette RNAsi free, l’acqua RNAsi
free e i deossinucleotidi NTPs sono stati ottenuti dall’ Invitrogen (S.Giuliano
Milanese, Milano, Italia).
I primers per l’rRNA 18S e i corrispondenti competimeri (QuantumRNA 18S
Internal Standard) sono stati acquistati dall’ Applied Biosystem (Monza,MI,
Italia). I primers per l’mRNA del GnRH-R e di CB1 sono stati acquistati
dall’Invitrogen.
Il kit Nucleospin Extract II è stato acquistato dalla Macherey Nagel Inc.
(Bethlehem, PA, USA).
L’anticorpo primario monoclonale di topo anti-GnRH-R, utilizzato per IHC è
stato acquistato da NeoMarkers (CA, USA). L’anticorpo monoclonale di topo
anti ERα, è stato acquistato da Zymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA,
USA).
L’anticorpo primario policlonale di capra anti-CB1 è stato comprato dalla
Santa Cruz Biotechnology.
L’anticorpo
secondario
biotinilato
di
capra
anti-topo,
utilizzato
per
l’immunoistochimica di GnRH-R e ERα è stato acquistato dalla Vector
Laboratories (Burlingame,CA,USA).
L’anticorpo secondario di cavallo anti-
capra, utilizzato per CB1 è stato acquistato dalla Vector. Il complesso avidinabiotina
(ABC,
Vector
Elite
Kit)
e
il
cromogeno
3,3’-diaminobenzidina
tetracloride (DAB) è stato comprato da Vector Laboratories. Il siero normale di
capra è stato ottenuto dalla Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).
I reagenti per la determinazione dell’LH, LH di coniglio (Lot#AFP7818C) e
anti-LH di coniglio (Lot#AFP3120489GP) soono stati gentilmente concessi dal
Dott. A.F. Parlow (Harbour UCLA, Medical Centre, CA, USA). Il 17β-estradiolo è
stato acquistato dalla Sigma (St. Luis, MO, USA). I tubi SilasticTM (3,35 mm ID
x 4,65 mm OD) e il silicone medico adesivo SilasticTM,sono stati gentilmente
forniti dalla Dow Corning, corporation (Midland, MI, USA).
136
Protocollo sperimentale
I protocolli che coinvolgono il trattamento e l’uso degli animali, per questi
esperimenti è stato approvato dal Comitato di Bioetica dell’Università di Perugia
Animali e regime ormonale
Per questi esperimenti sono state utilizzate coniglie New Zealand White,
sessualmente mature, aventi un peso di 3,5-4 kg, sono state allevate in gabbie
singole in condizioni controllate di luce (14 ore di luce, 10 ore di oscurità) e di
temperatura (20°C). 24 coniglie sono state ovariectomizzate (OVX) per via
laparotomica, sotto anestesia generale effettuata con xylazina (3 mg/Kg) e
ketamina (35 mg/Kg). Le coniglie sono state tenute a ricovero per 15 giorni
prima di essere utilizzate per l’esperimento. Tutte le coniglie sono state
alimentate con un mangime commerciale e hanno avuto libero accesso
all’acqua per tutta la durata dell’esperimento. Le coniglie sono state pesate sia
all’inizio che alla fine dell’esperimento
Esperimento 1: le finalità dell’esperimento sono state quelle di verificare: a)
la distribuzione cellulare di ERα e del GnRHR nell’adenoipofisi, b) gli effetti del
digiuno,
dell’ovariectomia
(OVX)
e
del
trattamento
con
estrogeni
(E)
sull’espressione genica di ERα, del GnRH-R e dell’ FSH.
Il giorno prima dell’inizio dell’esperimento, le coniglie, sono state assegnate
in maniera casuale ad uno dei seguenti 8 gruppi (3 coniglie per gruppo):
§
AL: coniglie alimentate ad libitum, coniglie controllo;
§
AL-E: coniglie alimentate ad libitum;
§
AL-OVX: coniglie alimentate ad libitum, ovariectomizzate;
§
AL-OVX-E: coniglie alimentate ad libitum, ovariectomizzate e trattate
con 17β-estradiolo;
§
F (Fasted) : coniglie sottoposte a digiuno;
§
F-E: coniglie sottoposte a digiuno e trattate con il 17β-estradiolo;
§
F-OVX: coniglie sottoposte a digiuno e ovariectomizzate;
§
F-OVX-E: coniglie sottoposte a digiuno, ovariectomizzate e trattate
con il 17β-estradiolo.
Il trattamento con gli estrogeni è stato effettuato attraverso l’impianto
sottocutaneo di tubi silastic di 13 mm, contenenti 20 mg/Kg di peso di 17βestradiolo, e chiusi all’estremità con silicone adesivo. I silastic riempiti con
137
estrogeni sono stati impiantati sottocute nella regione del collo e l’impianto è
stato effettuato un giorno prima dell’inizio del digiuno, mentre ai corrispondenti
controlli sono stati impiantati dei tubi silastic vuoti.
Mentre le coniglie controllo sono state alimentate ad libitum, le coniglie
trattate sono state tenute a digiuno per 48 ore. Alla fine del digiuno, le coniglie
sono state sacrificate attraverso dislocazione cervicale, per prelevare le ipofisi e
l’ipotalamo.
Esperimento 2 lo scopo è stato quello di valutare il ruolo degli estrogeni
ovarici, nelle coniglie, durante il digiuno, e la risposta dinamica dell’LH e
dell’FSH alla somministrazione del GnRH esogeno. 20 coniglie sono state
ovariectomizzate
come
descritto
precedentemente.
Due
settimane
dopo
l’intervento, sia le coniglie intatte che quelle OVX sono state assegnate agli
stessi 8 gruppi (3 coniglie per gruppo) dell’esperimento 1, e sono state trattate
come nell’esperimento 1. Alla fine, tutte le coniglie sono state trattate con
un’iniezione intramuscolare di 0,8 µg di un analogo del GnRH (Receptal,
Hoechst-Russel Vet, Milano, Italia) per indurre l’ovulazione. Il giorno in cui è
stato somministrato il GnRH viene designato come giorno 0. Immediatamente
dopo la somministrazione del GnRH, le coniglie, che erano state tenute a
digiuno,
sono
state
nuovamente
alimentate
con
mangime
standard
commerciale. Non appena terminato l’esperimento, gli impianti sono stati
rimossi.
Esperimento 3: l’obiettivo è stato quello di verificare gli effetti del digiuno,
dell’ovariectomia e del trattamento con estrogeni sull’espressione genica
rispettivamente di: a) CB1 a livello dell’adenoipofisi e dell’ipotalamo, e b) di
ERα nell’ipotalamo. Le ipofisi e gli ipotalami sono stati prelevati durante la fase
sperimentale 1, quindi, la procedura sperimentale e gli 8 gruppi sperimentali
sono gli stessi dell’esperimento 1.
Raccolta dei tessuti e dei campioni di sangue
Subito dopo il sacrificio, il cervello di ogni coniglia dell’esperimento 1, è
stato rimosso, e sono stati isolati l’ipotalamo e l’ adenoipofisi, i quali sono stati
divisi in due parti, destinate rispettivamente all’ IHC e alla biologia molecolare.
Le porzioni di tessuto destinate all’IHC (analisi del GNRH-R e dell’ ERα a livello
adenoipofisario), sono state immediatamente fissate attraverso l’immersione in
una soluzione di formaldeide al 4% (w/v) e PBS (0,1 M, pH 7,4) per 24 ore a
138
temperatura ambiente e successivamente processate per la fissazione in
paraffina. Le parti di tessuto destinate alla biologia molecolare e quindi all’
analisi dell’ espressione genica, sono state immediatamente congelate a -80°C.
Nel secondo giorno di esperimento, alle coniglie, al fine di effettuare prelievi
ripetuti di sangue e di lasciarle libere di svolgere le normali attività, è stato
inserito un catetere nella vena marginale dell’orecchio. Durante le ultime 3 ore
di digiuno, sono stati raccolti campioni di sangue (1 ml) ogni 30 minuti.
Terminate le 3 ore di digiuno, le coniglie sono state nuovamente alimentate e,
successivamente, sono state sottoposte a prelievi di sangue ogni 30 minuti per
6 ore. Tutti i campioni di sangue sono stati messi in provette contenenti EDTA
e, immediatamente centrifugati a 3000 g per 15 minuti. Il plasma, così
ottenuto è stato congelato a -20°C, in attesa di essere utilizzato per i
successivi dosaggi ormonali.
Immunoistochimica per ERα, GnRH-R e CB1
L’analisi immunoistochimica è stata effettuata solo su coniglie tenute a
digiuno. Questo esperimento è stato fatto a scopo indicativo, per vedere se
erano presenti o meno i recettori per l’Erα, GnRH e per i cannabinoidi
nell’ipofisi e dove erano localizzati. Sezioni di ipofisi di coniglie tenute a
digiuno, dello spessore di 5µm sono state sottoposte alle procedure per
l’identificazione del GnRH-R e dell’ERα, e di CB1 utilizzando anticorpi primari
monoclonali di topo anti-GnRH-R e anti-Erα, e policlonale di capra anti-CB1
diluiti, rispettivamente, 1:100, 1:80 e 1:100, seguiti dall’incubazione con un
anticorpo secondario, di capra anti-topo biotinilato (1:200) per GnRH-R e per
ERα e con un anticorpo di cavallo anti-capra biiotinilato (1:200) per CB1, in
accordo con la procedura sperimentale descritta in Dall’Aglio e collaboratori
[Dall’Aglio et al.,2006]. Le reazioni positive sono state rilevate come precipitati
marrone rossiccio. Mentre per CB1 è stata utilizzata una controcolorazione con
ematossilina di Gill.
Estrazione dell’RNA e retrotrascrizione
L’RNA totale è stato estratto da un pool di tre metà di adenoipofisi e da tre
metà di ipotalami [Boiti et al., 2003]. Le contaminazioni di DNA genomico
vengono
prevenute
attraverso
il
trattamento
con
seguendo le procedure indicate dalla casa produttrice.
deossiribonucleasi
I,
139
5 µl di RNA totale sono stati retrotrascritti in cDNA in un volume finale di 20
µl del kit SuperScript III Reverse Trascriptase. Le eventuali contaminazioni di
DNA genomico vengono controllate attraverso una PCR effettuata col cDNA
ottenuto da una retrotrascrizione nella quale non è stato utilizzato l’enzima
trascrittasi inversa (RT-).
Amplificazione mediante RT-PCR multiplex
Il protocollo per l’amplificazione mediante PCR multiplex è stato illustrato
precedentemente da Boiti e collaboratori [Boiti et al.,2004]. Nel protocollo di
PCR multiplex è stato utilizzato 1 ml di cDNA dell’adenoipofisi o dell’ipotalamo
come stampo per i primers ERα, GnRH-R,FSH e per CB1 e per il 18S (vedi la
tabella 2)
Tabella 2: Sequenza dei primers per ERα, GnRH-R, FSH, CB1 e per il 18S
utilizzato come standard interno
Gene
ERα
GnRH-R
FSH
CB1
18S
senso
antisenso
senso
antisenso
senso
antisenso
senso
antisenso
senso
antisenso
Lunghezza
Primers
Numero
bp
(5’-3)’
di cicli
147
AGATCCAAGGGAATGAGCTG
35
CTGCGGCGTTGAACTCATA
247
116
148
489
CCTTGCCTGGATCCTCAGTA
ATGAAGGACCCGTGTCAGAG
TCAAGAACGAAAGTCGGAGGTT
GGACATCTAAGGGCATCA
CATCCAGTGGGGAGAACT
GGAGTGCAGGATGACAGA
TCAAGAACGAAAGTCGGAGGTT
GGACATCTAAGGGCATCA
30
32
35
140
Le PCR eseguite per amplificare un frammento del cDNA di ERα, GnRH-R,
FSH e CB1 consistono in un primo ciclo di denaturazione a 94 °C per 75
secondi, seguito da un profilo di amplificazione di n° (vedi tabella 2) cicli
caratterizzati da un primo ciclo di denaturazione a 94 °C per 15 secondi,
seguito da un annealing a 60 °C per 30 secondi, e da un estensione a 72 °C
per 45 secondi, ed uno step finale di estensione a 72 °C per 10 minuti.
All’interno di ogni esperimento e per ogni gene analizzato, l’intero set di
campioni è stato analizzato in parallelo in una singola PCR, utilizzando aliquote
della stessa mix di PCR
I prodotti amplificati generati dalla PCR (18 µl dei 25 µl totali della reazione)
sono stati analizzati tramite elettroforesi su gel di agarosio al 2% utilizzando
una colorazione al bromuro di etidio (0,5 µg/ml). L’analisi dei prodotti di
amplificazione è stata descritta precedentemente da Boiti e collaboratori [Boiti
et al.,2004].
Dosaggio ormonale
La concentrazione plasmatica di LH è stata determinata attraverso il metodo
dei RIA con doppio anticorpo omologo. L’anticorpo utilizzato è stato un
anticorpo anti –coniglio per LH diluito 1:75000. Il tracciante è stato ottenuto
attraverso la iodurazione dell’LH di coniglio (AFP-7818C) con il metodo
iodogeno [Mattioli et al.,1986]. La sensibilità del metodo era di 0,5 ng/ml di
plasma.
I
coefficienti
di
variazione
intra-saggio
e
iter-saggio,
calcolati
utilizzando un singolo pool di plasma misurato 10 volte, erano,rispettivamente,
di 3,9% e di 4,5%. Tutti i campioni sono stati misurati in duplicato nello stesso
momento per ridurre le variazioni inter-saggio.
Analisi statistica
I dati relativi al peso corporeo son stati analizzati con il test ANOVA per le
misurazioni ripetute. I rapporti di ogni prodotto di PCR per i geni target (ERα,
GnRH-R, FSH, CB1), normalizzato con il prodotto coamplificato del 18S sono
stati analizzati attraverso il test ANOVA a due vie (trattamento e gel possono
essere due fonti di variabilità) seguito dal test di Student-Newman-Keuls t-test.
I dati relativi alla totalità degli effetti sull’LH, durante il periodo di digiuno sono
stati analizzati con il test ANOVA per misurazioni ripetute, in accordo con un
modello che include il trattamento del gruppo, la coniglia all’interno del gruppo,
141
il periodo di tempo e le interazioni tra i gruppi e il periodo: la coniglia
all’interno del trattamento è stata utilizzata come termine di errore. Il
confronto tra gli effetti è stato effettuato con il test di Student-Newman-Keuls
t-test. Un valore di P<0,05 è stato considerato significativo.
Risultati
Alla fine delle 48 ore di digiuno, il peso delle coniglie è stato il 4,9% in meno
rispetto alle coniglie alimentate (controllo).
Immunolocalizzazione di ERα, di GnRH-R e di CB1 nell’ipofisi
Utilizzando un anticorpo monoclonale, l’immunoreattività di Erα è stata
evidenziata nel nucleo di molte cellule ipofisarie, anche se nelle coniglie tenute
a digiuno si osserva una bassa intensità (Figura 25).
La colorazione positiva per il GnRH-R è evidente nei nuclei di molte cellule
ipofisarie, inoltre è stato trovato un debole segnale nel citoplasma delle cellule
ipofisarie (Figura 26)
L’immunoreattività per CB1 si osserva nel citoplasma di alcune cellule
dell’adenoipofisi. La positività è identificabile con la colorazione marrone. I
nuclei sono stati controcolorati con ematossilina di Gill (Figura 27)
142
Figura: 25. Immunocolorazione per ERα nell’ipofisi di coniglio prelevata dalle
coniglie tenute a digiuno (F). I segnali positivi sono rilevati da colorazione
marrone. La reazione positiva è visibile nel nucleo delle cellule ipofisarie.
Scala a barra: 50 µm
Figura: 26. Immunocolorazione per GnRH-R nell’ipofisi di coniglio prelevata
dalle coniglie tenute a digiuno (F). I segnali positivi sono rilevati da colorazione
marrone. La reazione positiva è visibile nel nucleo delle cellule ipofisarie ed è
stato trovato un debole segnale nel citoplasma delle cellule ipofisarie.
Scala a barra: 50 µm
143
Figura: 27. Immunocolorazione per CB1 nell’ipofisi di coniglio prelevata dalle
coniglie tenute a digiuno (F). I segnali positivi sono rilevati da colorazione
marrone. La reazione positiva è visibile nel nucleo delle cellule ipofisarie. . I
nuclei sono stati controcolorati con ematossilina di Gill
Scala a barra: 20 µm
144
Espressione genica per ERα, GnRH-R , FSH e CB1 nell’ipofisi
I corrispondenti prodotti di amplificazione ottenuti utilizzando i primers di
ERα, GnRH-R, FSH e CB1 sono stati ottenuti della lunghezza (bp) aspettata
(Figura 28b, A,B,C). L’analisi della sequenza ha mostrato che i corrispondenti
prodotti di PCR sono omologhi con le sequenze pubblicate di cDNa di ERα,
GnRH-R, FSH e CB1 del coniglio.
L’espressione dell’mRNA di ERα è significantemente ridotta (P<0,05) dal
digiuno nelle coniglie intatte (Figura 28, A). Il trattamento con gli estrogeni
riduce (P<0,05) l’espressione di ERα nelle coniglie intatte AL e F. Questo
effetto inibitorio dell’estradiolo, tuttavia, non è molto evidente negli animali
OVX, in entrambi i gruppi AL (gruppi AL-OVX rispetto ai AL-OVX-E) o negli F
(gruppi F-OVX rispetto ai F-OVX-E). Al contrario, l’ovariectomia provoca una
diminuzione (P<0,05) dei livelli di mRNA di ERα solo negli animali AL e F.
Il digiuno down-regola (P<0,05) l’espressione dell’mRNA di GnRH-R nelle
coniglie intatte (Figura 28, B). Il trattamento con gli estrogeni provoca un
simile effetto, ma solo negli F. Al contrario, l’ovariectomia down-regola
(P<0,05) l’mRNA di GnRH-R solo nel gruppo AL. Il trattamento con gli
estrogeni (P<0,05) aumenta l’espressione dell’mRNA di GnRH-R nelle coniglie
F-OVX.
L’espressione genica dell’mRNA di FSH (Figura 28, C) non è modificata dal
digiuno ma è down-regolata dal trattamento con gli estrogeni solo nelle
coniglie F (P<0,05). Al contrario, l’ovariectomia up-regola l’espressione
dell’mRNA di FSH sia negli AL che nei F (P<0,05), ma il trattamento con gli
estrogeni provoca una down-regolazione solo nelle coniglie AL-OVX.
L’abbondanza relativa dell’mRNA di CB1 rimane più o meno agli stessi livelli
negli animali intatti, sia alimentati che a digiuno,ma diminuisce (P<0,05)
notevolmente nelle coniglie tenute a digiuno e trattate con gli estrogeni
(gruppo F-E) (Figura 29). Nelle coniglie OVX, indipendentemente dal digiuno e
dal trattamento con gli estrogeni i livelli di mRNA di CB1 non variano (Figura
29).
145
1.0
Aa
Intact
OVX
ERα /18 S ratio
Arbitrary units
0.8
0.6
b
b
b
b b
0.4
0.2
b
c
0.0
GnRH-R/18 S ratio
Arbitrary units
1.0
B
Intact
OVX
0.8
0.6
a
a
a
a
0.4
b
b
b
0.2
c
0.0
FSH-β /18 S ratio
Arbitrary units
1.5
C
Intact
OVX
b
1.0
b
b
a
a a
0.5
a
c
0.0
AL
AL-E
F
F-E
Figura: 28(a). Abbondanza relativa dell’mRNA di ERα (A), del GnRH-R (B) e di
FSH (C) nell’ipofisi di coniglio Per ogni gruppo sperimentale, il valore
(media±SD) deriva da analisi densitometrica di ERα, GnRH-R e di FSH,
riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del 18S. Per ogni gruppo
sperimentale, differenti lettere, sopra le colonne, indicano un valore
significativamente diverso (P<0,05). AL: alimentate ad libitum; AL-E:
alimentate e trattate con estrogeni; AL-OVX: alimentate e ovariectomizzate;
AL-OVX-E: alimentate, ovariectomizzate e trattate con estrogeni; F: tenute a
digiuno per 48 ore; F-E: digiuno e trattate con estrogeni; F-OVX: digiuno e
ovariectomizzate; F-OVX-E: digiuno, ovariectomizzate e trattate con estrogeni.
146
A
18S 489 bp
ERα 147 bp
LD
PCR-
AL
ALE
ALOV
ALOVE
F
FE
FOV
FOVE
B
18S 489 bp
GnRH-R 247 bp
LD
PCR-
AL
ALE
ALOV
ALOVE
F
FE
FOV
FOVE
C
18S 489 bp
FSH 116 bp
LD
PCR-
AL
ALE
ALOV
ALOVE
F
FE
FOV
FOVE
Figura: 28(b) Tipiche fotografie di un gel d’agarosio al 2%, colorato con
bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate,
ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per ERα (147 bp) e 18S
(489 bp) (pannello A), per GnRH-R (247 bp) e 18S (489 bp) (pannello B), e
per FSH (116 bp) e 18S (489 bp) (pannello C). LD: indica il marker per la
lunghezza del DNA, PCR-: indica il controllo negativo, mentre le altre corsie
corrispondono ai gruppi sperimentali. AL: alimentate ad libitum; ALE:alimentate e trattate con estrogeni; AL-OVX: alimentate e ovariectomizzate;
AL-OVX-E : alimentate, ovariectomizzate e trattate con estrogeni; F: tenute a
digiuno per 48 ore; F-E: digiuno e trattate con estrogeni; F-OVX: digiuno e
ovariectomizzate; F-OVX-E: digiuno, ovariectomizzate e trattate con estrogeni.
147
A
18S 489 bp
CB1 148 bp
LD
PCR-
AL
ALE
ALOV ALOVE
F
FE
FOV
FOVE
B
CB1 mRNA levels in rabbit pituitaries
CB1/18 S ratio
Arbitrary units
1.0
0.8
a
a
a
a
a
a
0.6
a
b
0.4
0.2
0.0
AL
E
V
E
AL LO OV
A AL
F
FE
V
E
FO FOV
Figura: 29. Abbondanza relativa dell’mRNA di CB1 nell’ipofisi di coniglio. Il
pannello A mostra una tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con
bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate,
ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per CB1 (148 bp) e 18S
(489 bp). LD: indica il marker per la lunghezza del DNA, PCR-: indica il
controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono ai gruppi sperimentali.
Per ogni gruppo sperimentale, il valore (media±SD) deriva da analisi
densitometrica di CB1, riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del
18S. Per ogni gruppo sperimentale, differenti lettere, sopra le colonne, indicano
un valore significativamente diverso (P<0,05). AL: alimentate ad libitum; ALE:alimentate e trattate con estrogeni; AL-OVX: alimentate e ovariectomizzate;
AL-OVX-E : alimentate, ovariectomizzate e trattate con estrogeni; F: tenute a
digiuno per 48 ore; F-E: digiuno e trattate con estrogeni; F-OVX: digiuno e
ovariectomizzate; F-OVX-E: digiuno, ovariectomizzate e trattate con estrogeni.
148
Espressione genica ipotalamica di ERα e di CB1
Nelle coniglie intatte, la relativa abbondanza dell’mRNA, ipotalamico, di ERα
non è influenzata dal digiuno, ma il trattamento con gli estrogeni down-regola
(P<0,05) la sua espressione negli animali alimentati (Figura 30). Nelle coniglie
OVX, sia AL che F, i livelli di mRNA di ERα sono più bassi (P<0,05) rispetto agli
animali intatti, sia alimentati che a digiuno (Figura 30). La somministrazione di
estrogeni ai gruppi AL-OVX-E e F-OVX-E aumenta (P<0,05) l’espressione
genica dell’mRNA di ERα. Tuttavia il trattamento con gli estrogeni negli F-OVX
ripristina i livelli dei trascritti ipotalamici dell’mRNA dell’ERα rilevati nelle
coniglie intatte. Nelle coniglie intatte e a digiuno, il trattamento con gli
estrogeni down-regola l’espressione dell’mRNA di ERα nell’ipotalamo (Figura
30). L’ovariectomia riduce i livelli dei trascritti di ERα nelle coniglie a digiuno e
OVX, mentre, il trattamento con gli estrogeni provoca,in queste coniglie, un
aumento dell’espressione,che,comunque,non ritorna ai livelli riscontrati nelle
coniglie intatte tenute a digiuno.
Nelle coniglie alimentate intatte l’espressione dei trascritti ipotalamici di CB1
rimangono all’incirca agli stessi livelli,indipendentemente dal trattamento con
gli estrogeni (Figura 31). Nelle AL-OVX i trascritti di mRNA di CB1 diminuiscono
(P<0,05) visibilmente comparati con i controlli. La quantità dei trascritti
ipotalamici di CB1 non subisce modificazioni significative sia negli animali
intatti che OVX tenuti a digiuno. Indipendentemente dallo stato nutrizionale e
dalla presenza o meno delle ovaie, il trattamento con gli estrogeni non modifica
l’espressione dei trascritti di mRNA ipotalamici di CB1.
149
A
18S 489 bp
ERα 147 bp
LD
PCR-
AL
ALE
ALOV
ALOVE
F
FE
FOV
FOVE
B
ERα mRNA levels in the hypothalamus of rabbits
ERα /18 S ratio
Arbitrary units
1.0
0.8
0.6
0.4
a
a
a
b
0.2
a
b
a
b
0.0
AL
E
V
E
AL LO OV
A AL
F
FE
V
E
FO FOV
Figura: 30. Abbondanza relativa dell’mRNA di ERα nell’ipotalamo di coniglio. Il
pannello A mostra una tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con
bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate,
ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per ERα (147 bp) e 18S
(489 bp). LD: indica il marker per la lunghezza del DNA, PCR-: indica il
controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono ai gruppi sperimentali.
Per ogni gruppo sperimentale, il valore (media±SD) deriva da analisi
densitometrica di ERα, riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del
18S. Per ogni gruppo sperimentale, differenti lettere, sopra le colonne, indicano
un valore significativamente diverso (P<0,05). AL: alimentate ad libitum; ALE:alimentate e trattate con estrogeni; AL-OVX: alimentate e ovariectomizzate;
AL-OVX-E : alimentate, ovariectomizzate e trattate con estrogeni; F: tenute a
digiuno per 48 ore; F-E: digiuno e trattate con estrogeni; F-OVX: digiuno e
ovariectomizzate; F-OVX-E: digiuno, ovariectomizzate e trattate con estrogeni.
150
A
18S 489 bp
CB1 148 bp
LD
PCR-
AL
ALE ALOV ALOVE
F
FE
FOV
FOVE
B
CB1 mRNA levels in the hypothalamus of rabbits
1.0
CB1/18 S ratio
Arbitrary units
a
0.8
a
a
a
0.6
a
a
a
b
0.4
0.2
0.0
AL
E
V
E
AL LO OV
A AL
F
FE
V
E
FO FOV
Figura: 31. Abbondanza relativa dell’mRNA di CB1 nell’ipotalamo di coniglio. Il
pannello A mostra una tipica fotografia di un gel d’agarosio al 2%, colorato con
bromuro d’etidio, e mostra la presenza delle bande di lunghezza aspettate,
ottenute dopo RT-PCR utilizzando primers specifici per CB1 (148 bp) e 18S
(489 bp). LD: indica il marker per la lunghezza del DNA, PCR-: indica il
controllo negativo, mentre le altre corsie corrispondono ai gruppi sperimentali.
Per ogni gruppo sperimentale, il valore (media±SD) deriva da analisi
densitometrica di CB1, riportata in unità arbitrarie relative all’espressione del
18S. Per ogni gruppo sperimentale, differenti lettere, sopra le colonne, indicano
un valore significativamente diverso (P<0,05). AL: alimentate ad libitum; ALE:alimentate e trattate con estrogeni; AL-OVX: alimentate e ovariectomizzate;
AL-OVX-E : alimentate, ovariectomizzate e trattate con estrogeni; F: tenute a
digiuno per 48 ore; F-E: digiuno e trattate con estrogeni; F-OVX: digiuno e
ovariectomizzate; F-OVX-E: digiuno, ovariectomizzate e trattate con estrogeni.
151
Profilo ormonale dell’LH
Le 48 ore di digiuno non modificano la concentrazione plasmatica di LH
prima della somministrazione del GnRH, che rimane bassa e confrontabile con i
controlli alimentati sia intatti che ovariectomizzati (Figura 32, A e B). La
concentrazione massima del picco di LH è osservata 30 minuti dopo la
somministrazione del GnRH, sia nelle coniglie alimentate che a digiuno, e sia
negli animali intatti che OVX, indipendentemente dal trattamento con gli
estrogeni (Figura 32, A e B). Il più alto rilascio di LH viene osservato nelle
coniglie a digiuno trattate con gli estrogeni (Figura 32, A), mentre il più basso
rilascio si verifica nelle coniglie a digiuno (Figura 32, A). Nelle coniglie OVX,
l’entità del rilascio di LH è praticamente lo stesso nei 4 gruppi sperimentale
(Figura 32, B), inoltre né il digiuno e né il trattamento con gli estrogeni
modificano la risposta dell’LH alla somministrazione dell’GnRH (Figura 32, B).
In tutti i gruppi sperimentali, si registra un declino dei livelli plasmatici di LH 4
ore dopo l’iniezione del GnRH, fino a raggiungere concentrazioni prossime ai
valori basali (Figura 32, A e B).
152
50
45
A
GnRH
AL
AL-E
F
F-E
40
LH (ng/ml)
35
30
25
20
15
10
5
0
-180 -150 -120
-90
-60
-30
0
30
60
90 120 150 180 210 240
Minutes from GnRH
50
45
B
GnRH
AL-OVX
AL-OVX-E
F-OVX
F-OVX-E
40
LH (ng/ml)
35
30
25
20
15
10
5
0
-180 -150 -120
-90
-60
-30
0
30
60
90 120 150 180 210 240
Minutes from GnRH
Figura: 32. Concentrazione plasmatica di LH in coniglie intatte (pannello A) e
ovariectomizzate (OVX, pannello B) alimentate ad libitum (AL), a digiuno per
48 ore (F) e sia in coniglie alimentate (AL-E) e a digiuno (F-E) trattate con il
17β-estradiolo (E,90 mg in un tubicino di silicone, Silastic, impiantati sotto cute
il giorno prima dell’esperimento), durante le 3 ore prima e durante 4 ore dopo
la somministrazione del GnRH (freccia, tempo 0) e dopo la ripresa
dell’alimentazione negli animali che erano stati tenuti a digiuno per 48 ore.
Ogni punto rappresenta la media ± SEM (SEM: errore standard della media) di
tre valori.
153
Discussione
La privazione di cibo conduce all’infertilità in molte femmine di mammifero
[Schneider e Wade, 1990; Bronson e Marsteller,1985], e induce cambiamenti
fisiologici a vari livelli dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi.
I nostri risultati indicano che due giorni di digiuno, oltre che provocare una
riduzione del 5% del peso corporeo delle coniglie, determinano specifici effetti
sull’espressione genica ipofisaria di ERα, GnRH-R e FSH-β.
In un recente studio, condotto nei nostri laboratori, era stato proposto che il
17β-estradiolo svolgesse un ruolo chiave nel mantenimento delle funzionalità
dell’asse
ipotalamico-ipofisario,
rendendolo
capace
di
rispondere
appropriatamente alla somministrazione esogena del GnRH [Brecchia et
al.,2006]. Questa ipotesi si basava sull’osservazione che coniglie tenute a
digiuno per 48 ore, presentavano una bassa concentrazione plasmatica di
estrogeni, e una marcata riduzione della secrezione di LH con più basse
frequenze di pulsazione, in risposta al GnRH, rispetto alle coniglie controllo
alimentate ad libitum. I dati, ottenuti da questo studio, sono in accordo con i
precedenti, indicando un maggior ruolo degli estrogeni nell’aumentare il rilascio
di LH, indotto dal GnRH. Tuttavia, l’aumento della secrezione di LH, rilevato
nelle coniglie F-E, in risposta alla somministrazione del GnRH, non è dovuto
all’aumento dell’espressione genica del GnRH-R, poiché la relativa abbondanza
dell’mRNA di GnRH-R viene down-regolata dal digiuno in se. Inoltre il
trattamento con gli estrogeni non provoca l’aumento del picco ovulatorio nelle
coniglie controllo alimentate ad libitum, sebbene il gene per il suo recettore sia
down-regolato (AL-E). Mentre, nelle coniglie OVX-E, sia alimentate che a
digiuno, non si verifica una modificazione del rilascio del LH, indotto dal GnRH,
e l’andamento della secrezione uguaglia, perfettamente, quello che si rileva
nelle coniglie controllo (AL). Questi risultati indicano l’esistenza di complicate
interazioni a feedback tra lo stato nutrizionale e gli ormoni ovarici, incluso il
17β-estradiolo.
Nell’ipofisi, l’abbondanza relativa dell’mRNA di ERα è down-regolata nelle
coniglie a digiuno rispetto alle coniglie alimentate, ma questo effetto non è
evidenziato nelle coniglie OVX. Questi dati, insieme ai bassi livelli circolanti di
17β-estradiolo
descritti,
nello
stesso
modello
animale,
da
Brecchia
e
collaboratori [Brecchia et al., 2006], potrebbero in parte spiegare la riduzione
della recettività sessuale, indotta dal digiuno, ed anche la riduzione del profilo
di secrezione di LH, indotto dal GnRH. Gli effetti fisiologici degli estrogeni sul
sistema neuroendocrino, includono una diretta azione sui neuroni ipotalamici e
154
sulle cellule dell’ipofisi, e un’azione indiretta attraverso le cellule della glia ed
endoteliali [McEwen,1999], e questo provoca un’alterazione di sintesi e della
secrezione di quasi tutti gli ormoni ipofisari, compresi quelli che sono correlati
con la riproduzione, tra cui LH, l’FSH e la prolattina [Fink,1988; Maurer et
al.,1990; Gharib et al.,1990]. Perciò la down-regolazione di ERα nell’ipofisi, dei
conigli tenuti a digiuno, potrebbe suggerire un legame fisiologico diretto,
mediato dagli estrogeni, tra l’attività delle gonadotropine ipofisarie e l’effettivo
stato dei follicoli nell’ovaio. Nei conigli, tuttavia, l’apparato neuronale che
genera gli impulsi di LH non è sensibile al feedback positivo degli estrogeni,
mentre le specie ad ovulazione spontanea ne sono sensibili [Dufy Barbe et
al.,1978; Kauffman e Rissman,2006].
Il recettore ERα è espresso anche nei neuroni GnRH nell’ipotalamo, dove
media gli effetti sia positivi che negativi degli estrogeni, sulla sintesi e sul
rilascio del GnRH, ed è stato visto che il recettore degli estrogeni di tipo α è il
principale recettore che media gli effetti soppressivi sulla funzione neuronale
del GnRH [Hu et al.,2008].
I nostri dati rilevano che i livelli di espressione dell’mRNA di ERα
nell’ipotalamo sono più bassi rispetto a quelli trovati nell’ipofisi, e si assiste a
cambiamenti dinamici in tutti i gruppi sperimentali. Tuttavia, variazioni
significative sono presenti, solamente, nei gruppi AL-E, AL-OVX e F-OVX, in cui
si ha una down-regolazione di ERα. Questi risultati indicano che, nell’ipotalamo
la riduzione della secrezione degli estrogeni, provocata dall’ovariectomia,
induce una diminuzione dell’espressione genica di ERα, mentre nell’ipofisi l’OVX
sembra non avere effetti sull’espressione del recettore.
Il sistema neurosecretorio di GnRH risponde ad una varietà di segnali
neuromodulatori correlati agli stimoli interni e ambientali che sono collegati a
molti recettori sensoriali e olfattivi [Sawyer et al., 1974]. Tuttavia, il
trattamento con gli estrogeni non neutralizza gli effetti negativi del digiuno, ma
aumenta la down-regolazione della trascrizione di ERα, nell'ipofisi, provocata
dalla privazione di cibo. Questi risultati suggeriscono che lo stato nutrizionale
delle coniglie interagisce con gli ormoni steroidei ovarici, attraverso complesse
interazioni che vanno oltre a quelle relative al 17β-estradiolo.
L’espressione del mRNA di GnRH-R, nell’adenoipofisi, viene regolato in
maniera diversa dal digiuno e dalla presenza o dall’assenza degli estrogeni. Le
coniglie a digiuno presentano un’abbondanza relativa di mRNA di GnRH-R più
bassa rispetto a quella che si riscontra nelle coniglie alimentate. La riduzione
della secrezione del LH, dipendente dal GnRH, nelle coniglie tenute a digiuno,
potrebbe
essere
una
conseguenza
dell’inibizione
del
rilascio
del
GnRH
155
endogeno, dovuto all’aumento dell’azione del feedback negativo degli estrogeni
in molte regioni cerebrali, come trovato nelle femmine di ratto [Nagatami et
al.,1996], e alla diminuzione dell’espressione del GnRH-R nelle cellule
gonadotrope dell’ipofisi. Questa ipotesi è indirettamente supportata da Carlson
e Perrin [Carlson e Perrin,1979], che osservarono una diminuzione della
reattività dell’ipofisi di coniglie ovariectomizzate e trattate con GnRH, e
Rodriguez et al.,[Rodriguez et al.,1998] osservarono che l’aumento dei livelli
plasmatici di LH dopo la somministrazione del GnRH, era correlato con
recettività sessuale e quindi, con i livelli di estrogeni circolanti.
Nel nostro modello troviamo una correlazione tra i livelli di espressione
genica del GnRH-R e la secrezione di LH, indotta dal GnRH. Infatti, il digiuno
down-regola l’espressione del mRNA del GnRH-R nelle coniglie intatte, ma non
nelle OVX. Inoltre l’ampiezza del rilascio di LH, indotto dal GnRH, è più bassa
nelle coniglie a digiuno rispetto a quelle alimentate, mentre negli animali OVX i
profili di secrezione dell’LH sono sovrapponibili. Questi dati suggeriscono che
tra i molti segnali che convergono verso l’ipofisi, che è responsabile della
secrezione delle gonadotropine, quelli che riguardano il bilancio energetico
svolgono un ruolo centrale. Negli ovini, la privazione di cibo provoca una
diminuzione della concentrazione di LH e dell’espressione genica del recettore
per il GnRH, nell’ipofisi [Beckett et al.,1997]. In questa specie, durante una
prolungata perdita di peso, l’azione del feedback negativo del 17β-estradiolo
sulla frequenza di pulsazione del LH è notevolmente aumentata [Beckett et
al.,1997].
Il digiuno non influenza l’espressione genica di FSH-β nelle coniglie intatte.
Indipendentemente
dallo
stato
nutrizionale,
l’ovariectomia
aumenta
l’espressione dei trascritti per FSH-β. Il trattamento con gli estrogeni provoca
degli effetti diversi secondo lo stato nutrizionale e la presenza o l’assenza del
feedback ovarico. Sono stati trovati bassi livelli di mRNA per FSH-β, ERα e
GnRH-R nelle ipofisi delle coniglie a digiuno e trattate con gli estrogeni, mentre
nei corrispondenti gruppi OVX, il trattamento con gli estrogeni provoca effetti
sull’espressione del GnRH-R, ma nessuno sull’espressione dell’ERα, nell'ipofisi.
Molti studi sul sistema degli endocannabinoidi hanno focalizzato la loro
attenzione sugli effetti dei cannabinoidi endogeni (2-AG: arachidonoil glicerolo
e anandamide) ed esogeni (∆9-THC: ∆9-tetraidrocannabinolo) sulla regolazione
neuroendocrina dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi e sull’assunzione di cibo.
Tuttavia, la maggior parte di questi esperimenti sono stati effettuati sui ratti.
Recenti studi [Gonzàlez et al.,2000], suggeriscono che gli endocannabinoidi
156
possono influenzare la secrezione ormonale e il comportamento sessuale
agendo direttamente sul loro recettore CB1 [Stella, 2001]. Tutti o quasi, gli
studi
presenti
in
somministrazione
letteratura,
degli
però,
hanno
endocannabinoidi
o
analizzato
dei
gli
effetti
cannabinoidi
della
esogeni
sull’espressione di CB1, o come questa somministrazione possa influire sulla
regolazione neuroendocrina sia a livello ipofisario che ipotalamico. Nel nostro
studio, invece noi abbiamo posto la nostra attenzione sugli effetti del digiuno,
dell’ovariectomia e del trattamento con gli estrogeni, sull’espressione genica
del recettore per i cannabinoidi sia nell’ipofisi e sia nell’ipotalamo.
Nel nostro modello sperimentale l’espressione genica di CB1 nell’ipofisi
risulta down-regolata soltanto dalla privazione di cibo e dal trattamento con gli
estrogeni (coniglie F-E), mentre non subisce significative modificazioni negli
altri gruppi sperimentali. Ciò è in accordo con i risultati di precedenti studi, che
hanno mostrato come l’espressione genica ipofisaria di CB1 sia influenzata
dagli steroidi sessuali [Genazzani et al., 1997], e che nell’adenoipofisi di
femmine di ratto, gli estrogeni down-regolano l’espressione genica di CB1
[Gonzàlez et al.,2000].
Nei nuclei ipotalamici c’è una minore densità dei recettori per i cannabinoidi
rispetto ad altre regioni del cervello, ma i livelli di CB1 sono comunque alti
rispetto a quelli di altri recettori accoppiati alle proteine G, nell’ipotalamo
[Harkenham et al., 1991; Breinvogel et al.,1997]. I nostri dati indicano che
l’espressione di CB1 nell’ipotalamo è down-regolata dall’ovariectomia ma solo
nelle coniglie alimentate.
157
Conclusioni
I nostri dati suggeriscono che la privazione di cibo è in grado di alterare la
secrezione delle gonadotropine ipofisarie andando ad agire direttamente
sull’espressione genica del recettore per il GnRH-R nell’ipofisi. La riduzione dei
trascritti
per
il
GnRH-R
potrebbe
ridurre
l’efficienza
della
risposta
dell’adenoiposi agli impulsi ipotalamici del GnRH, riducendo in questo modo la
secrezione
delle
gonadotropine
ipofisarie,
influendo
direttamente
sulla
funzionalità ovarica. Però il digiuno produce effetti diversi sull’espressione dei
geni presi in considerazione in questo studio, anche tra i vari gruppi
sperimentali, indicando l’esistenza di complicate vie di segnalazione tra i centri
che rispondono ad una variazione dello stato nutrizionale e quelli che regolano
la funzionalità ovarica. Tuttavia ulteriori studi sono necessari per comprendere
meglio queste complicate interazioni, e anche per comprendere meglio il ruolo
degli estrogeni circolanti sulla regolazione ipotalamica dei neuroni GnRH.
158
Ringraziamenti
Giunta alla fine del mio dottorato di ricerca colgo l’occasione per ringraziare
tutti coloro che mi hanno aiutato e supportato durante questi tre anni.
Un ringraziamento speciale va al professore Boiti che mi ha seguito
assiduamente e pazientemente nell’attività scientifica. Ringrazio la dottoressa
Margherita Maranesi per la sua disponibilità, oltre che a livello personale, anche
nel condividere con me le sue conoscenze scientifiche, e la ringrazio
soprattutto per il suo contributo a questo lavoro di tesi.
Ringrazio il dottore Gabriele Brecchia, il dottor Massimo Zerani e la
dottoressa Cecilia dall’Aglio per aver contribuito alla mia formazione scientifica
e al lavoro di tesi.
Ringrazio la mia famiglia: mamma Rosanna,zio Mario e mia sorella Laura per
essermi stati sempre vicini e per avermi supportato (e spesso anche
sopportato) in questi anni.
Ringrazio Giada, Alessandra e Daniele per essermi stati sempre vicini, e per
non essersi ancora stancati di sopportarmi.
In fine, un pensiero speciale va al mio “papino”, che è sempre con me.
159
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