14 marzo 2013

Tecnologie
Ricombinanti
Dr. Giulio Piluso
Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale
Tel. 081-5665685
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 E. Boncinelli, A. Simeone
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Di cosa parleremo?
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Le tecnologie ricombinanti sono l’insieme delle
metodiche, sviluppatesi all’incirca negli ultimi 20-25
anni, che consentono l’analisi, lo studio e la
manipolazione di specifiche sequenze all’interno di
una popolazione complessa di molecole di DNA.
Esse trovano applicazione in moltissimi campi della
biologia molecolare:







Identificazione e caratterizzazione di nuovi geni
Diagnostica molecolare
Analisi di espressione
Studi funzionali
Produzione di modelli animali
Terapia genica
Applicazioni industriali
Clonaggio del DNA (1)
Un frammento di DNA d’interesse rappresenta solo
una piccolissima parte di un genoma complesso.
 Il gene della -globina corrisponde al 0.00005%
dell’intero genoma umano
 Il gene della distrofina corrisponde al 0.08%
dell’intero genoma umano.
La tecnologia del clonaggio del DNA consente
l’amplificazione selettiva dei frammenti di DNA
desiderati, producendo un forte aumento
programmato del numero di copie della sequenza di
DNA selezionato.
Clonaggio del DNA (2)
Le metodiche normalmente utilizzate si basano sulla
replicazione ciclica del DNA, catalizzata da DNA
polimerasi specifiche.
Si distinguono:
 Sistemi di clonaggio che utilizzano cellule (in vivo),
in cui molecole di DNA ricombinante sono trasferite
in cellule adatte, di cui si sfruttano i sistemi
biosintetici per amplificare selettivamente il
frammento di DNA d’interesse.
 Sistemi di clonaggio senza cellule (in vitro), in cui la
tecnica di elezione è sicuramente la Polymerase
Chain Reaction (PCR).
Clonaggio del DNA
utilizzando cellule (1)
Le tecniche di clonaggio che utilizzano cellule prevedono
quattro passaggi principali:
1. Costruzione di molecole di DNA ricombinante,
mediante saldatura dei frammenti di DNA
d’interesse ad un replicone (una qualsiasi
sequenza di DNA capace di replicarsi
autonomamente)
2. Trasformazione, con cui le molecole di DNA
ricombinante vengono trasferite in cellule ospiti
(batteri o lieviti) in cui i repliconi siano in grado di
compiere la replicazione del DNA
indipendentemente dal genoma della cellula ospite.
Clonaggio del DNA
utilizzando cellule (2)
3. Propagazione selettiva dei cloni cellulari.
• Le cellule trasformate vengono piastrate
4.
distribuendole su di una superficie di agar per
favorire la crescita di colonie isolate
• Le colonie isolate possono essere recuperate
per essere cresciute in mezzo di coltura
liquido
Isolamento dei cloni cellulari ed estrazione del
DNA ricombinate.
Repliconi extracromosomici
come molecole vettrici
I frammenti di DNA estraneo per potersi replicare
all’interno di una cellula devono contenere un’origine di
replicazione capace di funzionare in quel tipo cellulare.
I vettori di clonaggio sono appunto molecole di DNA
opportunamente ingegnerizzate così da assolvere a
questa funzione in cellule specifiche.
Le cellule batteriche sono le più utilizzate per la loro
velocità di replicazione. I vettori più comuni sono:
 I plasmidi: piccole molecole di DNA circolare a
doppio filamento.
 I batteriofagi: virus che infettano cellule batteriche.
Endonucleasi di Restrizione
L’avvento della tecnologia del DNA ricombinante è
strettamente legato alla scoperta delle nucleasi di
restrizione di tipo II, enzimi che tagliano il DNA in tutti i
punti che contengono specifiche sequenze di
riconoscimento.
Questi enzimi proteggono il batterio dall’infezione da
parte dei virus (batteriofagi) il cui DNA, non
specificamente metilato, è tagliato da queste nucleasi di
restrizione.
 Metilasi del DNA, con specificità di sequenza,
metilano il DNA batterico.
 Endonucleasi di restrizione, con specificità di
sequenza, agiscono sul DNA del virus, non
metilato, ma non sul DNA genomico della cellula
batterica.
Caratteristiche degli enzimi
di restrizione
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
La sequenza riconosciuta dalla maggior parte degli
E.R. è palindromica (uguale su entrambi i filamenti
quando letta in direzione 5’→3’).
In genere i punti di taglio non coincidono con l’asse
di simmetria della palindrome, generando estremità
coesive (sticky ends), sporgenti al 5’ o 3’ (5’ or 3’
overhang)
I punti di taglio possono anche cadere sull’asse di
simmetria della palindrome, generando estremità
tronche (blunt ends).
E.R. diversi che riconoscono la stessa sequenza
bersaglio sono detti isoschizomeri.
Alcuni esempi di Enzimi di
Restrizione
Enzyme
Source
Sequence cut
Average expected fragment
size (kb) in human DNAa
AluI
Arthrobacter luteus
AGCT
0.3
HaeIII
Hemophilus aegyptus
GGCC
0.6
TaqI
Thermus aquaticus
TCGA
1.4
MnlI
Moraxella nonliquefaciens
CCTC/GAGG
0.4
HindIII
Hemophilus influenzae Rd
AAGCTT
3.1
EcoRI
Escherichia coli R factor
GAATTC
3.1
BamHI
Bacillus amyloliquefaciens H
GGATCC
7.0
PstI
Providencia stuartii
CTGCAG
7.0
MstI
Microcoleus species
CCTNAGGc
7.0
SmaI
Serratia marcescens
CCCGGG
78
BssHII
Bacillus stearothermophilus
GCGCGC
390b
NotI
Norcadia otitidis-caviarum
GCGGCCGC
9766b
a
Assuming 40% G + C, and a CpG frequency 20% of that expected.
Observed average sizes are often lower than these estimates.
c N = A, C, G or T.
Note: Names are normally derived from the first letter of the genus and the first two letters of the species name, e.g. PstI is the first restriction nuclease to have been
isolated from Providenciastuartii. MnlI is an example of an enzyme whose recognition sequence is not palindromic. So-called rare-cutters often have recognition
sequences containing one or more CpG dinucleotides and cut vertebrate DNA comparatively infrequently.
b
DNA Ligasi
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
I frammenti di DNA ottenuti per digestione
con un E.R. possono essere riuniti insieme
per azione di una DNA Ligasi che catalizza
la formazione di ponti fosfodiesterici tra i
nucleotidi di due frammenti di DNA.
La reazione richiede ATP come fonte di
energia.
La più comune DNA Ligasi utilizzata è la T4
DNA Ligasi.
Clonaggio di un frammento di
DNA esogeno in un vettore
plasmidico.
Come favorire la formazione
di molecole ricombinati utili
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

E’ utile linearizzare il plasmide (vettore) con E.R. le cui
estremità coesive siano compatibili con quelle del
frammento di DNA da clonare.
E’ utile defosforilare il vettore. Il trattamento con una
fosfatasi (Fosfatasi alcalina) rimuovendo i gruppi
fosfato alle estremità del vettore linearizzato, impedisce
al plasmide di richiudersi su se stesso nella reazione
ligazione.
Il frammento di DNA da clonare ed il vettore sono
utilizzati nella reazione di ligazione in rapporto
equimolare o in leggero eccesso dell’inserto.
Come trasferire il DNA
ricombinante nella cellula
ospite
La membrana cellulare è permeabile in modo selettivo e,
normalmente, non lascia transitare grosse molecole come
frammenti di DNA.
Opportuni trattamenti possono rendere la membrana
plasmatica permeabile consentendo l’ingresso anche di
grosse molecole di DNA ricombinante. La cellula si dice
allora competente.


Trattamenti con Sali ad elevata forza ionica (CaCl)
Brevi shock elettrici (elettroporazione)
L’introduzione di DNA ricombinante in una cellula resa
competente (es. cellula batterica) è detta trasformazione.
Come selezionare le cellule che
contengono le molecole di DNA
ricombinante
Un problema rilevante è selezionare le cellule che, dopo la
trasformazione, contengono la molecola di DNA ricombinante e
che, poste in coltura, consentiranno di ottenere da esse una
notevole quantità del frammento di DNA d’interesse.
Questo avviene comunemente in due modi:
 Geni per la resistenza ad antibiotici (AmpR, KanR, TetR)
Le cellule batteriche contenenti il plasmide sono
selezionate per la loro capacità di crescere su terreni
contenenti uno specifico antibiotico.
 Complementazione del gene per la -galattosidasi.
Consente alle cellule contenenti il vettore di produrre la
-galattosidasi e di convertire una sostanza incolore, Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranoside)
in un composto che colora di blu le colonie.
Come è fatto un vettore
plasmidico
La selezione dei cloni
contenenti l’inserto di DNA
Altri tipi di vettori: il
batteriofago
Il principale limite dei vettori plasmidici è che
non si possono clonare frammenti superiori a
5-10 Kb.
 Vettori virali basati sul batteriofago
consentono in parte di superare questo limite
arrivando a 20 Kb.


In questi vettori parte del genoma virale, non
essenziale per la replicazione del
batteriofago, viene sostituito dall’inserto di
DNA che deve essere clonato.
Modalità di replicazione del
batteriofago in E. Coli
Il genoma del batteriofago
Clonaggio nel batteriofago
Limiti dei diversi vettori di
clonaggio oggi disponibili
Cloning vector
Standard high copy number plasmid vectors
Bacteriophage insertion vectors
Bacteriophage replacement vectors
Cosmid vectors
Bacteriophage P1
PAC (P1 artificial chromosome) vectors
BAC (bacterial artificial chromosome) vectors
YAC (yeast artificial chromosome) vectors
Size of insert
0-10 kb
0-10 kb
9-23 kb
30-44 kb
70-100 kb
130-150 kb
up to 300 kb
0.2-2.0 Mb
Librerie di DNA

I moderni metodi di clonaggio consentono di
creare vaste collezioni di cloni di DNA (DNA
libraries), rappresentative di una complessa
popolazione di DNA. Principalmente si
distinguono:
 Librerie di DNA genomico, rappresentative
dell’intero genoma di una determinata
specie.
 Librerie di cDNA, rappresentative dei geni
espressi da un tessuto o in un particolare
momento funzionale.
Librerie di DNA genomico
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
Il materiale di partenza è il DNA genomico estratto dai nuclei di
cellule facilmente accessibili (es. cellule del sangue).
Il DNA è frammentato in genere per digestione con un E.R.
 Per limitare la frammentazione del DNA si ricorre spesso a
digestioni parziali (riducendo la quantità di enzima o i tempi
di digestione).
 Questo tipo di trattamento rende la frammentazione casuale
e i frammenti possono sovrapporsi rendendo possibile il
riordino dei cloni.
Il numero di cloni indipendenti è definito in termini di genomaequivalenti (GE).
 Un GE è il num. dei cloni indipendenti pari al rapporto tra
dimensione del genoma e dimensione media dei cloni.
 Per una libreria genomica umana con cloni di circa 40 Kb
GE=3000Mb/40Kb= 75.000 cloni
Esistono anche librerie sub-genomiche, ottenute da specifici
cromosomi od anche porzioni di essi.
Preparazione di una libreria
genomica
Librerie di cDNA
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Il materiale di partenza è l’RNA totale estratto da
uno specifico tessuto o stadio di sviluppo di cui la
libreria deve essere rappresentativa.
E’ possibile selezionare gli mRNA poli (A) mediante
cromatografia su colonne che legano oligo(dT)
L’RNA è retrotrascritto (RNA→DNA) utilizzando
specifiche DNA-polimerasi RNA dipendendenti. Si
ottiene così il cDNA (una molecola di DNA
complementare ad un RNA).
Per facilitare il clonaggio del cDNA vengono
aggiunti degli specifici linkers, contenenti siti di
restrizione che favoriscono il clonaggio.
Preparazione di una libreria
di cDNA
Saggi d’ibridazione con gli
acidi nucleici
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
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L’ibridazione degli acidi nucleici è una tecnica
largamente utilizzata in biologia molecolare per
il riconoscimento di specifiche sequenze in una
miscela complessa di frammenti di DNA o RNA,
sfruttando la specifica complementarietà delle
basi.
Le sonde utilizzate sono molecole di DNA o
RNA che devono essere opportunamente
marcate.
Le sonde più comunemente utilizzate possono
essere a singolo/doppio filamento e di DNA o
RNA.
Modalità di marcatura delle
sonde
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

Per la marcatura delle sonde si utilizzano
prevalentemente tecniche di polimerizzazione in vitro,
durante le quali le molecole di DNA/RNA neosintetizzato
incorporano nucleotidi opportunamente marcati
(normalmente mediante radioisotopi).
Per la marcatura di sonde a DNA a doppio filamento le
tecniche prevalentemente utilizzate sono:
 Nick- translation
 Random priming
Per la marcatura di sonde a RNA si utilizzano tecniche
di trascrizione in vitro.
Per la marcatura di sonde oligonucleotidiche si
utilizzano tecniche di marcatura terminale.
Marcatura di una sonda a
RNA (ribosonda)




La preparazione di una sonda a RNA si ottiene per
trascrizione in vitro a partire da un frammento di DNA
clonato in un vettore plasmidico.
Il vettore deve contenere, in genere a monte del MCS la
sequenza di un promotore fagico. Quelle più utilizzate
sono:
 SP6
 T3
 T7
L’RNA polimerasi dello specifico batteriofago (es. SP6
RNA polimerasi) è utilizzata in presenza di nucleotidi di
cui almeno uno opportunamente marcato.
E’ possibile ottenere sonde senso e antisenso
Schema per sonde a RNA
Isotopi radioattivi utilizzati


Nella marcatura di sonde a DNA/RNA si possono
utilizzare diversi isotopi radioattivi.
L’intensità del segnale autoradiografico dipende da:


Intensità della radiazione emessa dal radioisotopo.
Dal tempo di esposizione (ore, giorni, settimane).
R ad ioisotop e H alf-life D ecay typ e E n ergy of em ission
3
H
12.4 years
-
0.019 M eV
32
P
14.3 d ays
-
1.710 M eV
33
P
25.5 d ays
-
0.248 M eV
35
S
87.4 d ays
-
0.167 M eV
Marcatura non isotopica


Esistono tecniche di marcatura delle sonde che non
prevedono l’utilizzo di radioisotopi.
Questi sistemi di marcatura possono essere:
 Diretti – In cui sono incorporati nucleotidi
opportunamente modificati (es. contenenti fluorofori).
 Indiretti – In cui nucleotidi modificati incorporano
indicatori che hanno elevata affinità con molecole
complessate a marcatori evidenziabili con uno
specifico saggio.
• Sistema Biotina-streptavidina, in cui la sonda
biotinilata lega ad elevata affinità la streptavidina
marcata con un saggio colorimetrico
• Sistema della digossigenina, che sfrutta un
anticorpo specifico per questa molecola