UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI BRESCIA
Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologie
Sezione di Farmacologia
Relazione di Dottorato in Neuroscienze I anno
Coordinatore: Chiar.mo Prof. PierFranco Spano
Anno Accademico 2009/2010
Laura Navarria
Alfa-sinucleina e malattia di Parkinson: nuove implicazioni nei
processi neurodegenerativi e nella disfunzione sinaptica
Introduzione
L’accumulo di proteine “unfolded” nel reticolo endoplasmatico (RE) delle cellule
eucariotiche scatena l’attivazione di un meccanismo di difesa conosciuto come
“unfolded protein response” (UPR) (Yoshida, 2007). Nel processo dell’UPR sono
coinvolte tre vie indipendenti, le quali terminano con l’attivazione della
“degradazione associata al RE” (ERAD) e l’inibizione della trascrizione delle
proteine (Hoyer-Hansen and Jaattela, 2007).
Quando si verifica un accumulo di polipeptidi nel RE, il sensore dello stress
Grp78/BiP si dissocia da tre recettori sensibili allo stress, PERK, IRE1 e ATF6
attivando la UPR.
L’attivazione di PERK dovuta alla dissociazione di Grp78/BiP blocca la sintesi delle
proteine fosforilando “eukaryotic initiation factor 2α” (eIF2α). Quesa fosforilazione
induce una cascata di segnale che termina con la trascrizione dell’attivatore del fattore
di trascrizione 4(ATF4) anche conosciuta come “cAMP responsive element 2”
(CREB-2) che non viene normalmente trascritto in assenza di stress del RE.
ATF4/CREB-2, trasloca nel nucleo e induce la trascrizione di geni richiesti per
ristabilire l’omeostasi del RE e/o indurre i processi apoptotici e autofagici (Zhang and
Kaufman, 2006; Kincaid and Cooper, 2007).
Hoozemans e colleghi (2007) hanno recentemente dimostrato che, in neuroni
dopaminergici della sostanza nigra in pazienti affetti da malattia di Parkinson (MP),
c’è l’attivazione del pathway PERK-dipendente dell’UPR.
La MP è caratterizzata dalla presenza di inclusioni intracellulari, chiamati corpi di
Lewy (CL), la cui componente principale è α-sin.
Alfa-sin è una proteina sinaptica che si trova in associazione con le vescicole
(Cookson 2005) a modulare l’attività neuronale (Forti net al., 2005).
L’aggregazione patologica di α-sin in cellule dopaminergiche induce morte cellulare
(Bellucci et al. 2008) e l’overespressione di α-sin induce meccanismi di apoptosi
(Saha et al. 2000).
Recenti studi indicano che in cellule che over-esprimono la forma mutata A53T di αsin c’è un aumento dei livelli di GRP78/BiP e peIF2α, suggerendo che l’accumulo di
α-sin potrebbe indurre l’attivazione dell’UPR (Smith et al.,2005)
Inoltre è stato dimostrato che l’over-espressione di α-sin può indurre l’attivazione
dell’UPR nel lievito (Cooper et al., 2006) e che la tossicità di α-sin dovuta alla
fosforilazione della Ser129 indice l’UPR (Sugeno et al., 2008).
Studi preliminari nel nostro laboratorio hanno dimostrato che, in cellule SH-SY5Y
differenziate verso un fenotipo dopaminergico SH-SY5Y+ (Bellucci et al., 2008), αsin è stata identificata nel RE in associazione con GRP78/BiP.
Le cellule SH-SY5Y+ sono state sottoposte a deprivazione di glucosio (DG) in modo
da indurre la formazione di aggregati intracitoplasmatici fibrillari di α-sin composti
dalla forma wild-type e tronca (α-sin1-120). La presenza di aggregati insolubili di αsin hanno indotto un aumento dei livelli di GRP78/BiP e ATF4/CREB-2.
Le cellule SH-SY5Y+ deprivate di glucosio presentano una riduzione della vitalità
cellulare (Bellucci et al., 2008). In linea con queste osservazioni Vekrellis e colleghi
(2009) hanno recentemente dimostrato che l’over-espressione di α-sin oligomerica
induce l’attivazione delle fasi iniziali del pathway apoptotico con l’insorgenza di
eventi proapoptotici quale il rilascio mitocondriale del cyt c nel citoplasma. Il
processo, però risulta bloccato a valle dei meccanismi mitocondriali.
Scopo del lavoro
Sulla base delle precedenti osservazioni, lo scopo di questo lavoro è stato quello di:
- Valutare se le forme wild type e tronca di α-sin interagiscono direttamente con
GRP78/BiP e come variano i livelli di espressione di GRP78/BiP in cellule
non neuronali che presentano aggregati di α-sin.
- Valutare come variano i livelli di GRP78/BiP in cellule SH-SY5Y+ che
presentano aggregati di α-sin dopo il trattamento con agenti che inducono
l’aggregazione di α-sin quali la 6-idrossi-dopamina (6OH-DOPA).
- Valutatare la specificità dell’attivazione del GRP78/BiP stimolando le cellule
SH-SY5Y+ e sottoposte a DG a trattamenti con agenti che stimolano o
inibiscono l’attivazione dell’UPR quali rispettivamente la tunicamicina (TUN)
e il dantrolene (DTL).
- Valutare se il silenziamento di α-sin con RNAinterference in cellule SHSY5Y+ coincide con una mancata attivazione del GRP78/BiP dopo la DG.
- Valutare se α-sin interagisce direttamente con GRP78/BiP e se la sua
aggregazione ne varia l’espressione in neuroni positivi per la tirosina
idrossilasi (TH) della sostanza nigra di topi transgenici per la forma tronca di
α-sin (SYN120) e topi di controllo.
- Valutare come variano i livelli di ATF4/CREB-2 in neuroni della sostanza
nigra di topi transgenici SYN120 e topi di controllo.
- Valutare la sofferenza (saggio del LDH) ed i cambiamenti pro-apoptotici
(rilascio di cyt c nel citoplasma) in cellule SH-SY5Y+ sottoposte a DG.
Materiale e Metodi
Come modello “in vitro” sono state utilizzate
- Cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y differenziate con trattamento di 3 giorni
con acido retinoico (10μM) e tre giorni con 12-tetradecanoyl-phorbol-13-acetato
(80nM) verso un fenotipo dopaminergico (SH-SY5Y+) sottoposte a deprivazione di
glucosio (DG), un insulto che induce la formazione di aggregati intracitoplasmatici
fibrillari di α-sin composti sia dalla forma “full lenght” che da quella tronca (α-sin1120) (Bellucci et al. 2008).
- Cellule renali embrionali umane HEK293 sono state stabilmente transfettate con un
costrutto di α-sin 140 aa (HEKsin140) e con un costrutto di α-sin 120 aa
(HEKsin120) e sottoposte a DG.
Come modello “in vivo” sono stati utilizzati
- Topi transgenici SYN120 (G-LONG) di 12 mesi che overesprimono la forma tronca
(1-120) di α-sin con deposizione selettiva di aggregati filamentosi e granulari di α-sin
in neuroni dopaminergici.
- Topi di controllo C57BL/6J di 12 mesi
I risultati di questo lavoro sono stati ottenuti con l’utilizzo delle seguenti tecniche:
- L’immunocitochimica è stata effettutata su cellule adese su vetrini collagenati o
polilisinati fissate con paraformaldeide 4% per 15 minuti e poi marcate con i rispettivi
anticorpi. I vetrini sono stati poi osservati al microscopio a fluorescenza (Olimpus
IX50) e con microscopio laser confocale (Carl Zeiss).
- L’immunoistichimica è stata effettuata in “free floating” su sezioni coronali di
animali precedentemente perfusi con paraformaldeide 4% e poi marcate con i
rispettivi anticorpi. Le sezioni sono state poi osservate al microscopio a fluorescenza
(Olimpus IX50) e con microscopio laser confocale (Carl Zeiss).
- Le diverse corse proteiche sono state eseguite su gel di poliacrilamide al 4-12% e
poi transferite su membrana di PVDF su cui sono state effettuate le
immunomarcature.
Risultati
Per valutare se α-sin interagisse direttamente con GRP78/BiP e se i livelli di
GRP78/BiP fossero aumentati in presenza di aggregati di α-sin, sono state usate
cellule HEK293 stabilmente transfettate con la forma tronca (HEK 293 SYN120) e
wild type (HEK 293 SYN140) di α-sin.
Precedenti studi hanno dimostrato che la forma tronca 1-120 α-sin aggrega più
velocemente della forma wild type o mutata della proteina (Crowther et al., 1998;
Tofaris et al., 2003). Infatti, l’over-espressione di α-sin di entrambe le forme, ma in
particolare nella forma tronca induceva la formazione di aggregati.
Per stimolare ulteriormente la formazione aggregati di α-sin insolubile abbiamo
sottoposto le cellule a DG. Infatti, nei cloni HEK 293 SYN120 e HEK 293 SYN140
sottoposti a DG (Figura 1 E e K) la marcatura di GRP78/BiP era più intensa di quella
che si osservava nelle cellule non sottoposte a trattamento (Figura 1 B e H).
Esperimenti di western blot (Figura 2 A) hanno dimostrato un aumento dei livelli di
GRP78/BiP in cellule HEK 293 SYN120 e HEK 293 SYN140 come mostra
l’istogramma in Figura 2 B.
Studi di immunoprecipitazione (Figura 2 C) hanno rivelato che α-sin wild type e
tronca interagivano con GRP78/BiP in frazioni di RE nei cloni stabili HEK 293
SYN120 e HEK 293 SYN140.
Figura 1 Doppia marcatura per GRP78/BiP (verde) e α-sin (rosso) in HEK 293, HEK 293 SYN140 e
HEK 293 SYN120. Nel pannello D, E e F le cellule sono state sottoposte a DG.
Figura 2 A Wester Blotting per α-sin e GRP78/BiP in HEK 293 di controllo e sottoposte a DG, HEK
293 SYN140 di controllo e sottoposte a DG e HEK 293 SYN120 di controllo e sottoposte a DG. Gli
asterischi indicano gli oligomeri di α-sin incrementati dal trattamento di DG. B L’istogramma mostra
la quantificazione densitometrica in % delle bande di GRP78/BiP normalizzate con la tubulina. C
Immunoblotting per α-sin (anticorpo SYN-1) in immunoprecipitati per GRP78/BiP in frazioni di RE di
HEK 293, HEK 293 SYN140, HEK 293 SYN120 e sottoposte a DG.
Per confermare se l’attivazione di GRP78/BiP sia dipendente all’aggregazione di αsin e non del trattamento di GD, abbiamo utilizzato SH-SY5Y+ trattate con 6OHDOPA 0,2 mM per 24h. La 6OH-DOPA è una tossina che induce aggregazione di αsin in cellule SY5Y (Alves da Costa et al., 2006). Dopo il trattamento con la 6OHDOPA le cellule SH-SY5Y+ mostravano inclusioni di α-sin (Figura 3 D) e un
incremento dei livelli di GRP78/BiP (Figura 3 E) rispetto alle cellule non trattate
(Figura 3 A-C).
L’analisi densitometrica (Figura 3 G) ha confermato un aumento dei livelli di
espressione di GRP78/BiP e α-sin in cellule SH-SY5Y+ sottoposte a trattamento con
6OH-DOPA rispetto alle cellule non trattate.
Figura 3 Doppia marcatura per GRP78/BiP (verde) e α-sin (rosso) in cellule SH-SY5Y+ e sottoposte a
trattamento con 6OH-DOPA. (A-F). Wester blotting (G) per α-sin e GRP78/BiP in cellule SH-SY5Y+
di controllo e sottoposte a trattamento con 6OH-DOPA.. Alfa-tubulina è riportata come controllo di
un’equo caricamento dei campioni. L’istogramma (H) mostra la quantificazione densitometrica in %
delle bande di α-sin normalizzate con α-tub. L’istogramma (I) mostra la quantificazione densitometrica
in % delle bande di GRP78/BiP normalizzate con α-tub.
Per valutare la specificità dell’attivazione di α-sin, abbiamo trattato le cellule SHSY5Y+ con tunicamicina (TUN) 1 μg/ml (una molecola che induce l’attivazione
dell’UPR inibendo il processo di glicosilazione delle proteine) (Oda et al., 2007) e
dantrolene (DTL) 80μM (un inibitore dei recettori della rianodina, che blocca il
rilascio di Ca++ dal RE, e previene l’attivazione dell’UPR) (Nguyen et al., 2002).
In cellule SH-SY5Y+ il trattamento con DTL inibiva l’incremento di GRP78/BiP
indotto dalla DG, mentre il trattamento con TUN incrementava l’espressione di
GRP78/BiP. Questo effetto era inibito dal trattamento con il DTL, infatti nelle cellule
SH-SY5Y+ trattate con DTL e TUN avevamo una riduzione dei livelli di GRP78/BiP
in confronto alle cellule SH-SY5Y+ trattate solo con la TUN. Questi sono stati
confermati con analisi semiquantitativa in western blot (Figura 4 U).
Queste osservazioni hanno confermato che l’attivazione di GRP78/BiP tramite α-sin è
mediata dall’UPR.
Figura 4 Doppia marcatura per GRP78/BiP (verde) e α-sin (rosso) in cellule SH-SY5Y+ e sottoposte a
DG trattate con DTL, TUN e TUN+DTL (A-T). L’istogramma (U) mostra la quantificazione
densitometrica in % delle bande di GRP78/BiP normalizzate con α-tub in cellule SH-SY5Y+ e
sottoposte a DG trattate con DTL, TUN e TUN+DTL.
Per verificare se l’attivazione dell’UPR fosse direttamente correlata alla presenza di
α-sin, abbiamo silenziato α-sin con RNA interference (siRNA).
In cellule SH-SY5Y+ silenziate, dopo la DG (Figura 5 N) non si osservavano
differenze dei livelli di espressione del GRP78/BiP in confronto a cellule di controllo
(Figura 5 J) indicando che l’attivazione dell’UPR dopo la DG è strettamente
dipendente da α-sin. Invece, la formazione di inclusioni di α-sin induceva un
aumento di espressione del GRP78/BiP nelle cellule SH-SY5Y+ sottoposte a DG e
trattate con il vettore di silenziamento (scramble) (Figura 5 V).
Questi dati sono poi stati confermati in western blot (Figuta 5 Y) che hanno rivelato
l’efficienza di silenziamento di α-sin e i rispettivi livelli di GRP78/BiP.
Figura 5 Doppia marcatura per GRP78/BiP (verde) e α-sin (rosso) in cellule SH-SY5Y+ di controllo
(A-D) e sottoposte a DG (E-H), cellule SH-SY5Y+ silenziate per α-sin con siRNA (I-L) e sottoposte a
DG (M-P), cellule SH-SY5Y+ trattate con il vettore di silenziamento SCR (Q-T) e sottoposte a DG (UX). Western blotting (Y) per GRP78/BiP e α-sin in cellule SH-SY5Y+ di controllo, silenziate con
siRNA e con vettore e sottoposte a DG. Alfa-tubulina è riportata come controllo di un’equo
caricamento dei campioni.
Per valutare se l’over-espressione di α-sin possa indurre l’attivazione dell’UPR “in
vivo" abbiamo usato un modello transgenico di MP di 12 mesi che over-esprime la
forma tronca (1-120) di α-sin sotto la guida di un promotore per la TH e presenta
selettivamente aggregati di α-sin in neuroni dopaminergici nigrostriatali.
Gli esperimenti in tripla marcatura hanno dimostrato un aumento
delll’immunoreattività per GRP78/BiP in neuroni α-sin-TH-immunopositivi (Figura 6
D ). In particolare gli aggregati di α-sin erano concentrati nelle strutture GRP78/BiP
positive (Figura 6 F) .
L’analisi in wester blot (Figura 6 Q) ha mostrato un aumento dei livelli di GRP78/BiP
negli estratti di sostanza nigra dei topi transgenici SYN120 rispetto al topo di
controllo.
Studi di immunoprecipitazione hanno mostrato un legame diretto tra α-sin e
GRP78/BiP in estratti proteici totali provenienti da neuroni della SNpC del topo
transgenico SIN120 e del topo di controllo (Figura 6 S).
P
A
B
C
D
E
F
G
H
I
L
M
O
Q
S
Figura 6 Tripla marcatura per α-sin, GRP-78(BiP e TH in SNpC in topo transgenico SYN120 (tg) (AH) e in topo di controllo C57BL6/J (wt) (I-O). Western blotting per GRP78/BiP (P) e α-sin (S) in
estratti di SNpC di topo transgenico SYN120 (tg) e in topo di controllo (wt). Alfa-tubulina è riportata
come controllo di un’equo caricamento dei campioni. L’istogramma (Q) mostra la quantificazione
densitometrica in % delle bande di GRP78/BiP normalizzate con α-tub. Immunoblotting per
GRP78/BiP in immunoprecipitati per α-sin (anticorpo SYN-1) in estratti totali di SNpC di topo
transgenico SYN120 (tg) e in topo di controllo (wt).
Per valutare l’attivazione dell’UPR GRP78/BiP-α-sin dipendente, abbiamo misurato
l’aumento di espressione di ATF4/CREB-2 come ultimo segnale indotto dalla cascata
PERK dipendente. L’immunoreattività per ATF4/CREB-2 era indotta nei nuclei di
neuroni della SNpC dei topi SYN120 (Figura 7 B) immunopositivi per α-sin. Nei
neuroni dei topi di controllo non osserva alcuna positività per ATF4/CREB-2 (Figura
7 F). Analisi di western blot (Figura 7 K) indicavano un aumento statisticamente
significativo dei livelli di ATF4/CREB-2 nel topo transgenico SYN120 rispetto al
controllo.
Figura 7 Doppia marcatura per GRP78/BiP (verde) e α-sin (rosso) in SNpC in topo transgenico
SYN120 (tg) (A-D) e in topo di controllo C57BL6/J (wt) (E-H). Western blotting per GRP78/BiP (I) in
estratti di SNpC di topo transgenico SYN120 (tg) e in topo di controllo (wt). Alfa-tubulina è riportata
come controllo di un’equo caricamento dei campioni. L’istogramma (J) mostra la quantificazione
densitometrica in % delle bande di GRP78/BiP normalizzate con α-tub.
Le cellule SH-SY5Y+ soggette a DG, in presenza di aggregati di α-sin, presentano
una riduzione della vitalità cellulare (Bellucci et al., 2008). In questa fase abbiamo
valutato la soffrenza della delle cellule SH-SY5Y+ di controllo e sottoposte a DG con
il saggio del LDH (lactate dehydrogenase). Il rilascio di LDH dalle cellule nel terreno
di coltura è un indicatore dello stato di sofferenza della cellula dovuto al blocco della
crescita cellulare e all’alterazione dell’integrità e funzionalità della membrana. Le
cellule SH-SY5Y+ deprivate di glucosio dimostravano una sofferenza statisticamente
significativa rispetto alle cellule di controllo (Figura 8).
Recenti studi indicano che l’attivazione della cascata dell’UPR PERK dipendente
induce apoptosi (Lin et al., 2009). Nello stesso tempo è stato dimostrato che l’overespressione di α-sin induce l’attivazione delle fasi iniziali del patway apoptotico che
poi si risolve in una morte cellulare indipendente ai successivi stadi del patway
apoptotico (Vekrellis et al., 2009). Il rilascio di cyt c dai mitocondri è un evento
proapoptotico precoce. Proprio per questo motivo abbiamo valutato i livelli di cyt c
nella frazione mitocondriale e citoplasmatica delle cellule SH-SY5Y+ di controllo e
sottoposte a DG. Il rilascio di cyt c nel citoplasma nelle cellule SH-SY5Y+ sottoposte
al DG era incrementato rispetto alle celleule SH-SY5Y+ di controllo (Figura 9 B).
Questi dati indicano che il trattamento con la DG ha indotto cambiamenti proapoptotici che promuovono la morte cellulare.
Figura 8 L’istogramma mostra la quantificazione del rilascio di LDH dalle cellule SH-SY5Y di
controllo e sottoposte a DG. Il trattamento ha indotto tossicità alle cellule.
Figura 9 Western blotting per cyt c nella frazione mitocondriale (P2) e citoplasmatica (S2) di SHSY5Y+ di controllo e sottoposte a DG. La rilevazione di COX-IV e α-tubulina sono state usate come
controllo per un equo caricamento della frazione mitocondriale e citoplasmatica. Gli istogrammi
mostrano la quantificazione densitometrica in % delle bande di cyt c nella frazione mitocondriale
normalizzate con la COX-IV (B) e la quantificazione densitometrica in % delle bande di cyt c rilascita
nel citoplasma normalizzate con α-tubulina (C).
Conclusioni
I risultati indicano che l’accumulo di α-sin nel RE induce l’attivazione della cascata
di segnali PERK dipendente dell’UPR.
Nei modelli “in vivo” ed “in vitro” di aggregazione di α-sin si riscontrano un
attivazione della cascata dell’UPR dovuta all’aumento dell’espressione della proteina
sensoria GRP78/BiP α-sin-dipendente. Infatti GRP78/BiP co-immunoprecipita con la
forma wild type e tronca di α-sin.
La presenza di proteine “unfolded” è l’evento centrale che induce l’attivazione
dell’UPR il quale guida la morte cellulare in molte malattie neurodegenerative quali
la MP (Toddle et al., 2009).
Alfa-sin in forma aggregata nelle cellule SH-SY5Y+ lega GRP78/BiP nel RE
attivando la cascata PERK dell’UPR. La cascata si conclude con l’induzione di
ATF4/CREB-2 che promuove la trascrizione di diversi geni coinvolti nell’omostasi
del RE e nel processo apoptotico (Xu et al., 2005). In cellule SH-SY5Y+ sottoposte a
DG, il legame α-sin-GRP78/BiP attiva l’UPR e induce tossicità e cambiamenti
apoptotici che portano alla morte cellulare.
Nei nostri modelli si può direttamente correlare l’attivazione dell’UPR con la
presenza di α-sin in quanto non sono stati valutati alterazioni dei livelli di GRP78/BiP
in assenza si α-sin anche se sottoposti a DG.
Pertanto, l’over-espressione e l’aggregazione di α-sin potrebbe essere un evento di
risposta usato dalla cellula neuronale per contrastare lo stress del RE. Infatti α-sin in
forma aggregata attiva l’UPR solo in una situazione di stress del RE. Alfa-sin
potrebbe essere considerata una sentinella che risponde allo stimolo di stress
cambiando la sua conformazione da wilde type a tronca. L’accumulo e l’aggregazione
nel RE attiverebbe poi l’UPR. La presenza di α-sin nella conformazione monometrica
piuttosto che nella forma aggregata potrebbe sbilanciare la vitalità cellulare nei
confronti della morte cellulare.
Questi risultati indicano che α-sin potrebbe agire come sensore neuronale e mediatore
delle modificazioni cellulari dovute a presenza di proteine “unfolded”, accumulate e
aggregate in relazione allo stress del RE.
L’attivazione dell’UPR α-sin dipendente potrebbe ricoprire un ruolo molto
importante nella regolazione della morte cellulare dovuta a fattori di stress
fisiologicamente presenti nel cervello degli anziani (Bowling and Beal., 1995).
I meccanismi descritti con questi esperimenti possono essere considerati come una
nuova chiave di lettura per delineare nuovi aspetti coinvolti nei meccanismi
patofisiologici della MP.
