DNA polimerasi I

CERCATE SU YOU TUBE I FILMATI DI BIOLOGIA
CE NE SONO DI TUTTI I TIPI
IL MATERIALE GENETICO
Fino agli anni ‘40 si credeva che le proteine fossero le molecole della informazione
ereditaria.
C’erano comunque diverse indicazioni che il materiale genetico fosse costituito dagli
acidi nucleici.
(Esperimento di Griffith del 1928; esperimento di Avery et al., 1944)
Griffith, 1928
Esperimenti di trasformazione batterica utilizzando Diplococcus pneumoniae, ceppo
IIIS(virulento, capsulato, coltivato su piastra forma colonie con superficie liscia) e ceppo
IIR(non virulento, acapsulato, forma colonie con superficie ruvida)
Esperimento di Hershey e Chase (1952)
fase 1: preparazione dei fagi T2 marcati
fase 2: dimostrazione che il DNA è il materiale genetico del fago T2
Fagi
La radioattività si ritrova nella
progenie fagica all’interno di
E. coli
E. coli
Fagi
La radioattività NON si
ritrova nella progenie fagica
all’interno di E. coli
E. coli
Esperimento di Fraenkel-Conrat e Singer (1957)
In alcuni virus il materiale genetico è l’RNA : Virus del Mosaico del Tabacco
COMPOSIZIONE DEL MATERIALE GENETICO
Gli acidi nucleici sono composti di subunità ripetute chiamati nucleotidi
Ciascun nucleotide è composto
da tre unità: un gruppo fosfato,
uno zucchero e una base
azotata.
Pirimidine
Purine
COMPOSIZIONE DEL MATERIALE GENETICO
I NUCLEOTIDI
Le basi azotate sono legate allo zucchero a livello del carbonio in posizione 1’
Il fosfato si lega al carbonio in posizione 5’ a formare il nucleotide
La base più lo zucchero formano un nucleoside.
STRUTTURA DEL DNA
Esperimento di Chargaff (1950)
Distribuzione delle purine e delle pirimidine nel DNA di diversi organismi
Organismo
virus
fago T2
Herpes simplex
batteri
S. pneumoniae
B. subtilis
E. coli K12
S. marcescens
funghi
N. crassa
S. cerevisiae
eucarioti sup.
frumento
mais
D.melanogaster
uomo
timo
fegato
spermatozoi
A
moli %
T
G
rapporti molari
G/C
(A+T)/(G+C)
C
A/T
32,6
13,8
32,6
12,8
18,1
37,7
18,6
35,6
1,00
1,07
1,09
1,05
1,88
0,36
29,8
28,2
26,0
20,3
31,6
28,3
23,9
20,6
20,5
21,9
24,9
29,4
18,0
21,6
25,2
29,7
0,94
1,00
1,09
0,99
1,13
1,01
0,99
0,99
1,59
1,30
1,00
0,69
23,0
31,3
23,3
32,9
27,1
18,7
26,6
17,1
0,98
0,95
1,01
1,09
0,86
1,79
28,1
25,6
30,7
27,4
25,3
29,4
21,8
24,5
19,6
22,7
24,6
20,2
1,03
1,01
1,04
0,96
0,99
0,97
1,25
1,04
1,51
30,9
30,3
30,5
29,4
30,3
28,9
19,9
19,5
19,5
19,8
19,9
20,6
1,05
1,00
1,05
1,00
0,98
0,97
1,52
1,54
1,47
STRUTTURA DEL DNA
Conferenza Cold Spring Harbor Laboratory (1953)
Dati di Rosalind Franklin e M.Wilkins ottenuti con l’analisi del DNA mediante diffrazione ai raggi X
( Franklin non vinse il premio Nobel perché morì prima )
STRUTTURA DEL DNA
Modello di Watson e Crick, 1953
STRUTTURA DEL DNA
 I nucleotidi sono legati fra loro
mediante un legame
fosfodiesterico fra il fosfato in 5’
e il carbonio in 3’ del nucleotide
successivo
 Il singolo filamento di DNA ha
una polarità:
una estremità 5’ P e una 3’ OH
CARATTERISTICHE DELLA DOPPIA ELICA DEL DNA

La doppia elica del DNA ha una struttura antiparallela, con i due filamenti orientati in direzione opposta.

I filamenti assumono questa struttura per la complementarietà delle basi azotate:

L’ adenina di un filamento è appaiata alla timina sull’altro filamento con la formazione di due legami ad
idrogeno

La guanina di un filamento alla citosina dell’altro filamento con tre legami ad idrogeno
REPLICAZIONE DEL DNA SECONDO WATSON E CRICK
 Il modello di Watson e Crick del DNA
prevedeva che l’informazione genetica
risiedesse nella sequenza delle basi lungo
la molecola.
 I due filamenti della doppia
elica parentale si aprono e
ciascuno fa da stampo per la
sintesi di due nuovi filamenti
(replicazione semiconservativa)
Z- DNA e B - DNA
Z-DNA:
• elica levogira
• le coppie di basi distano 0,360,38 nm,
•
un giro completo dell’elica
comprende 12 paia di basi;
•
è una struttura favorevole
per sequenze del tipo
….GCGCGCGC
• Un a molecola di DNA può
avere tratti con conformazione
Z tratti con conformazione B
• Sono state isolate proteine che
si legano specificamente alla
forma Z
• Si ritiene che abbia un ruolo
nella regolazione
dell’espressione genica
STRUTTURA DI UNA MOLECOLA DI RNA
• il ribosio sostituisce il deossiribosio
• l’uracile sostituisce la timina.
• Le basi sono legate in 1’ al ribosio, il
gruppo fosfato in 5’ e in 3’ come nel DNA
• La struttura secondaria è variabile
Principali differenze fra DNA e RNA
basi
DNA
A, T, C, G
RNA
A, U, C, G
zucchero
D-2-desossiribosio
D-ribosio
composizione chi-mica
struttura fisica
A = T; G = C
variabile
doppia elica
singolo filamento con
struttura variabile secondo il
tipo di RNA
dimensioni
molto grande (vedi
il cromosoma)
eterogeneo, molto più
piccolo del DNA
localizzazione
nucleo (ma anche mitocondri e cloroplasti)
citoplasma (in parte nel
nucleo)
stabilità metabo-lica
molto stabile (poca
sintesi o degradazione)
diversa a seconda del tipo; continua sintesi o
degradazione
stabilità agli
agenti chimici
stabile in alcali,instabile in acido a
caldo
instabile in acido a caldo, molto instabile in
alcali anche a freddo
funzione
materiale genetico
sintesi proteica (materiale genetico in alcuni
virus
sintesi
“replicazione” su entrambi i filamenti
della doppia elica
“trascrizione” su un
solo filamento della
doppia elica di DNA
Fine
ORGANIZZAZIONE DEL MATERIALE EREDITARIO NEL CROMOSOMA
virus a DNA
virus a RNA
1) cromosoma circolare SF
DF
fago M13 di E. coli
SV40
2) cromosoma lineare DF
fagi T2,T4,T6 di E.coli
1) RNA a singolo filamento
TMV Virus Mosaico Tabacco
2) 2 filamenti di RNA identici
Retrovirus
Procarioti: DNA circolare
Nei batteri le Topoisomerasi I e II permettono il passaggio
da DNA rilassato a DNA superavvolto
IL CROMOSOMA BATTERICO
I CROMOSOMI DEGLI EUCARIOTI
Costituenti del cromosoma eucariotico e loro rapporti quantitativi
DNA 1
cromatina
proteine 1,5-2,5 proteine istoniche 1
proteine acide
0,5-1,5
RNA
0,05
 Proteine istoniche: H1, H2A, H2B, H3, H4 (H5)
sono proteine basiche perché ricche di lisina e arginina
hanno un ruolo fondamentale nel determinare la struttura della
cromatina.
 Proteine acide: classe molto eterogenea;
possono essere diverse in tessuti diversi;
alcune hanno ruolo regolatorio dell’attività genica;
alcune hanno un ruolo strutturale formano lo “scaffold “del cromosoma
altre sono le proteine della replicazione e della trascrizione
LA FIBRA DI CROMATINA A COLLANA DI PERLE
Struttura globulare di 10-11 nm di diametro
IL NUCLEOSOMA
Un ottamero di istoni
intorno a cui si avvolge il
filamento di DNA con una
molecola di Istone H1
all’esterno
DAL NUCLEOSOMA ALLA FIBRA DI CROMATINA DI 30 nm
Modello di avvolgimento del filamento di DNA per
formare la fibra di 30 nm
Modello di ancoraggio della fibra di 30 nm
all’impalcatura di proteine non istoniche
Oggi si ritiene che ogni ansa sia
una unità indipendente di
replicazione e di trascrizione
Rappresentazione schematica dei diversi ordini di impacchettamento della cromatina, che sono
ritenuti alla base del cromosoma metafasico altamente condensato
DNA a doppia
elica
2 nm
cromatina a
“collana di
perle”
10 -11 nm
nucleosomi
impacchettati
nella fibra di
cromatina
30 nm
sezione
distesa di un
cromosoma
300 nm
sezione
condensata di
un
cromosoma
700 nm
cromosoma
metafasico
1400 nm
CROMOSOMA METAFASICO VISTO AL MICROSCOPIO ELETTRONICO
CROMOSOMA METAFASICO VISTO AL MICROSCOPIO ELETTRONICO
Cromosoma metafasico dopo la rimozione degli istoni
Cromosoma metafasico con istoni
CICLO CELLULARE e MITOSI
 Quando le cellule raggiungono determinate dimensioni devono
arrestare l’accrescimento e specializzarsi o dividersi
 La divisione cellulare negli eucarioti coinvolge due processi:
mitosi assicura che ogni nuovo nucleo riceva lo stesso
numero di cromosomi presenti nella cellula madre
citocinesi divisione del citoplasma tra le due cellule figlie
Le diverse fasi del ciclo cellulare
Interfase (G1 + S + G2)
Mitosi
La mitosi rappresenta la fase conclusiva del ciclo cellulare
LE DIVERSE FASI DELLA MITOSI
Durante la mitosi i cromosomi sono visibili al Microscopio Ottico
La metafase è lo stadio di maggior condensazione dei cromosomi
CROMOSOMI METAFASICI
DI Vitis vinifera 2n = 38
CROMOSOMI METAFASICI
DI UOMO 2n = 46
IL CARIOTIPO
 Il numero, la morfologia e le dimensioni dei cromosomi sono costanti e caratteristici per ogni
specie e costituiscono il cariotipo
 Ogni cromosoma presenta: un centromero, posizione variabile
due telomeri, le regioni terminali dei cromosomi
 Alcuni cromosomi presentano una costrizione secondaria e un “satellite”

Con le tecniche di “bandeggio cromosomico” è possibile riconoscere i cromosomi omologhi di
una specie e ricostruire il cariogramma
Cariogramma umano
FINE
FUNZIONI DEL DNA E FLUSSO DELLA INFORMAZIONE
GENETICA
REPLICAZIONE DEL DNA
ESPERIMENTO DI MESELSON E STHAL 1958
PROCARIOTI
La microfotografia di Cairns
1963 conferma la replicazione
semiconservativa nei
Procarioti
La Replicazione del
cromosoma batterico ha un
solo punto di origine ed è
bidirezionale
SINTESI DEL DNA
I costituenti fondamentali sono: il DNA stampo
un primer (innesco)
i 4 deossinucleotiditrifosfati dATP, dGTP, dCTP, dTTP
l’enzima DNA polimerasi
L’ ENZIMA DELLA REPLICAZIONE
 L’ enzima DNA polimerasi
catalizza la formazione del
legame fosfodiesterico 3’OH-5’P
 Non può iniziare la sintesi di DNA
può solo aggiungere un nucleotide
ad filamento già iniziato
PROPRIETA’ DELLE DNA POLIMERASI DI E. COLI
La DNA polimerasi I è il primo enzima scoperto (da Kornberg nel 1957)
non è l’enzima principale della replicazione del DNA
L’enzima principale della replicazione è la DNA pol III
LE TRE ATTIVITÀ DELLA DNA POLIMERASI I E III
a
b
c
ATTIVITÀ DI “CORREZIONE DI BOZZE” DELLE DNA POLIMERASI I, II e III
I FRAMMENTI DI OKAZAKI
La Replicazione è continua
su un filamento e
discontinua sull’altro
Questo è il filamento lento
LE FASI DELLA REPLICAZIONE DEL DNA
La DNA primasi catalizza la sintesi di
corti filamenti di RNA (10-60 nucleotidi)
complementari ai filamenti-stampo
La DNA polimerasi III
utilizza come innesco i filamenti di RNA
e catalizza la sintesi del nuovo
filamento di DNA
La DNA polimerasi I
rimuove gli inneschi con la sua attività
esonucleasica 5’ 3’ e sintetizza DNA
DNA LIGASI
La DNA ligasi catalizza la chiusura covalente delle interruzioni nel DNA
Le DNA TOPOISOMERASI
rimuovono i superavvolgimenti
DNA TOPOISOMERASI: meccanismo di azione
SCHEMA DI UNA FORCA DI REPLICAZIONE IN E. COLI
• La topoisomerasi catalizza il
rilassamento del DNA
• Elicasi svolge la doppia elica
• Le proteine SSB stabilizzano la
forca replicativa
Frammenti
di Okazaki
EUCARIOTI
Esp. di Taylor e coll 1957
in Allium cepa dimostra
che la replicazione è
semiconservativa
EUCARIOTI
Repliconi multipli nei cromosomi eucariotici
Più siti di replicazione nel DNA di D. melanogaster:
PROPRIETÀ DELLE DNA POLIMERASI NUCLEARI DEGLI EUCARIOTI
DNA pol α
Sintesi
DNA pol δ
DNA pol ε
5’3’
5’3’
5’3’
Primasi associata
Si
No
No
Sintesi da primer
a RNA
a DNA
Si
No
Si
Si
Si
No
Correzione di bozze 3’5’
No
Si
Si
La DNA pol α è costituita da 4 subunità, due di esse hanno attività PRIMASICA
La sua funzione principale è la sintesi degli inneschi
Si ritiene che gli inneschi vengano rimossi da una RNAsiH e gli spazi riempiti dalla
DNA pol δ che è capace di partire da un innesco a DNA
Le DNA pol δ ed ε formano un complesso δ / ε che costituisce l’enzima principale di
sintesi del DNA
FORCA DI REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI
REPLICAZIONE DEI TELOMERI e l’ ENZIMA TELOMERASI
REPLICAZIONE DEI TELOMERI e l’ ENZIMA TELOMERASI
U !!!
è un
filamento di
RNA!!!
ASSEMBLAGGIO DEI NUCLEOSOMI
A mano a mano che la forca replicativa avanza vengono smontati i nucleosomi vecchi
L’assemblaggio dei nucleosomi nuovi avviene appena il nuovo filamento di DNA viene
sintetizzato
FINE