Microtubuli - Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

Il citoscheletro Il citoscheletro è più sviluppato in cellule eucario<che animali, che non possiedono una parete cellulare esterna come ba@eri e cellule delle piante. Ruoli del citoscheletro: -‐  Mantenere la forma della cellula (collegata alla sua funzione) e dotarla di resistenza meccanica -‐  Mo<lità cellulare -‐  Organizzazione interna della cellula Riguardo a forma e movimento, è allo stesso tempo ossatura e muscolatura della cellula, molto dinamico e in con<nuo cambiamento per soddisfare i bisogni cellulari. Riguardo a l’organizzazione, è impalcatura per tuJ gli organuli ma anche autostrada per il collegamento fra di loro. Il citoscheletro è formato da tre <pi diversi di proteine che fanno ﬁlamen<: -‐ Filamen( di ac(na -‐ Microtubuli -‐ Filamen( intermedi Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro FILAMENTI INTERMEDI I ﬁlamen< intermedi sono come ‘corde’ molto for< che rendono le cellule resisten< agli stress di <po meccanico (s<ramento). Sono il <po di ﬁlamen< più durevole, resistono cambiamen< osmo<ci e detergen<. Sono faJ da proteine ﬁlamentose di <pi molto diversi (famiglia eterogenea), che formano ﬁbre di 10 nm di diametro, a metà fra i ﬁlamen< di ac<na e i microtubuli. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Formano una rete traverso il citosole e intorno al nucleo, che collega fra di loro i pun< di ancoraggio della cellula con altre cellule (desmosomi). Si trovano pure al interno del nucleo di tu@e le cellule eucario<che, formando un re<colo che raﬀorza l’involucro nucleare dal lato interno: la lamina nucleare. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Monomero con teste globulari e regione allungata a elica alfa. Dimero ad alfa elica superavolta. Tetramero formato da due dimeri inver<< e sfalsa<. Due tetrameri associa< da interazioni non covalen<. O@o tetrameri associa< dagli stremi e lateralmente per formare un ﬁlamento. Regioni globulari: molto variabili. Regioni ﬁlamentose: molto conservate. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Tipi di ﬁlamen< intermedi Ogni <po di ﬁlamento è fa@o di unità proteiche cara@eris<che. Le chera<ne sono di tan< <pi, a seconda del <po di epitelio. Chera(ne Negli epiteli. Anche in peli, unghie, penne Vimen(ne e simili Nel tessuto conne=vo, cellule muscolari e gliali Neuroﬁlamen( Lamine nucleari Nelle cellule nervose In tu@e le cellule eucario(che Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro I ﬁlamen< intermedi interagiscono con altre proteine, sopra@u@o tramite le teste globulari di ogni subunità, che sporgono dal ﬁlamento intrecciato. Ad esempio, sono collega< fra di loro, agli altri ﬁlamen< del citoscheletro e ai pun< di adesione fra le cellule (desmosomi) da molecole come la plec(na. Micrograﬁa di microscopia ele@ronica colorata: blue: ﬁlamen< intermedi; rosso: microtubuli; verde: plec<na; giallo: an<corpi contro la plec<na marca< con par<celle di oro. L’ac<na è stata rimossa per vedere gli altri componen<. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro La presenza di ﬁlamen< intermedi è fondamentale per la resistenza meccanica degli epiteli allo s<ramento. Senza i ﬁlamen< intermedi gli epiteli sono molto fragili e si rompono (malaJa). Senza plec<na, i topi muoiono poco dopo la nascita, con problemi epiteliali, muscolari e nervosi. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro La lamina nucleare è formata da proteine de@e lamine (non laminine!) che formano ﬁlamen< intermedi che si organizzano in rete per rinforzare l’involucro nucleare. Queste lamine si possono modiﬁcare per fosforilazione per farli separare durante la mitosi, quando l’involucro nucleare si rompe per far dividere il materiale gene<co fra le cellule ﬁglie. Successivamente, le lamine si defosforilano e ricos<tuiscono la lamina nucleare. Mutazioni delle lamine causano una grave malaJa del <po delle progerie, dove il paziente invecchia prematuramente, ma le ragioni per questo eﬀe@o non sono chiare. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro MICROTUBULI I microtubuli sono il componente del citoscheletro più coinvolto nelle funzioni di organizzazione degli organuli e nella comunicazione fra di loro (il traﬃco vescicolare), grazie alla interazione con proteine motrici. Il suo diametro è di 20 nm circa. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro I microtubuli della cellula in riposo (interfase) si organizzano in maniera radiale, partendo del centrosoma, verso il centro della cellula. Durante la divisione cellulare (mitosi), i microtubuli si riorganizzano e formano il fuso mito(co, una stru@ura che distribuisce i cromosomi fra le due cellule ﬁglie. I microtubuli sono pure il citoscheletro fondamentale di certe stru@ure come ciglia e ﬂagelli, allungamen< a forma di peli che sporgono da un lato Polo del fuso della cellula (di solito apicale) e mito(co fanno di propulsione per spostare la cellula o il ﬂuido a conta@o. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro I microtubuli sono faJ da due piccole unità di tubulina, una alfa e una beta, che si legano non covalentemente in un eterodimero. Gli eterodimeri si legano alternando per formare protoﬁlamen(, che hanno così due estremi diversi: sono polarizza(, con un estremo alfa e uno beta. Tredici protoﬁlamen< si legano lateralmente, tuJ orienta< nella stessa direzione, formando un tubo vuoto: il microtubulo, che ha un estremo alfa (estremità meno) e uno beta (estremità più). Gli stremi sono funzionalmente diversi, quello più si allunga più velocemente che quello meno, dunque il microtubulo cresce dal lato più (per addizione di eterodimeri). Le conseguenze funzionali sono molto importan<. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro I microtubuli si organizzano radialmente partendo da un centro organizzatore, che nelle cellule animali è il centrosoma, e crescendo verso l’esterno dalle estremità più. Nel centro del centrosoma ci sono due cilindri di microtubuli, i centrioli, di funzione sconosciuta, ma molto simili o iden<ci ai corpuscoli basali che organizzano i microtubuli di ciglia e ﬂagelli. In torno ci sono anelli di tubulina gamma, che funzionano come centri di nucleazione: essenziali per la polimerizzazione Si( di nucleazione della tubulina in Anelli di tubulina gamma microtubuli alle concentrazioni Matrice del citosoliche si centrosoma tubulina. Coppia di centrioli Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Ricostruzione dello scheletro di microtubuli che partono dal centrosoma di una cellula di C. elegans. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Come fanno i microtubuli in realtà? Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Come fanno i microtubuli in realtà? Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro I microtubuli si allungano e si accorciano in maniera repen<na, è la instabilità dinamica. Si basa nel legame di GTP ai dimeri di tubulina: il dimero-‐GTP si lega forte all’estremità più e la fa crescere, formando un cappuccio a GTP. Se il GTP della estremità s’idrolizza a GDP, i legami s’indeboliscono e il microtubulo si disfà: è una catastrofe. Questo processo man<ene i livelli di dimeri di tubulina al< nel citosole, per la nuova polimerizzazione. Microtubulo in allungamento Microtubulo in accorciamento Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro La importanza di ques< fenomeni di polimerizzazione/depolimerizzazione è dimostrata dal fa@o che i farmaci che arrestano la polimerizzazione (come la colchicina) o la depolimerizzazione (come il taxolo) causano l’arresto della mitosi durante la fase del fuso mito<co. Si usano come an<tumorali. La instabilità dinamica fa che i microtubuli siano molto dinamici, si formano e si sfanno in con<nuazione, e così esplorano dove c’e bisogno di nuovi microtubuli. Ma la cellula può regolare la intensità del fenomeno per i propri ﬁni. I microtubuli necessari a stabilizzare una stru@ura o creare un collegamento si agganciano a proteine di ancoraggio dal lato più e rimangono stabili, o delle proteine specializzate si legano al estremo più, o lungo i microtubuli, e li stabilizzano, mentre altre li collegano ad altri componen< del citoscheletro o agli organuli. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Un esempio molto chiaro sono le cellule polarizzate, dove c’e una stre@a organizzazione polare dei componen< (stru@ura) e della aJvità (funzione) cellulare. I microtubuli sono fondamentali per mantenere questa organizzazione di organuli e vescicole. Trasporto centripeto Trasporto centrifugo I componen< del citoplasma si spostano usando il citoscheletro di microtubuli e ac<na come delle strade, grazie a proteine motrici, che usano ATP per generare un movimento di <po saltatorio e direzionato. Diversi motori si associano a diversi <pi di ﬁlamento, si muovono in diverse direzioni e trasportano diversi cariche. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Le proteine motrici che si spostano lungo i microtubuli sono di due <pi: chinesine (verso il lato più) e dineine (verso il meno). Tu@e e due sono dimeri di proteine con una testa globulare e una coda allungata. Le due teste legano il microtubulo in maniera orientata e idrolizzano ATP, generando cambiamen< conformazionali e movimento. Le due code si uniscono in una sola che lega il carico da trasportare. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Diversi <pi di chinesine e dineine si specializzano nel trasporto di diversi carici. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Trasporto di vescicole lungo i microtubuli Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Organizzazione degli organuli: RE-‐chinesina, Golgi-‐dineina Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Due stru@ure cellulari organizzate dai microtubuli: Ciglia: protrusioni piliformi di ˜0.25 µm di diametro, che propulsano il ﬂuido esterno (epitelio respiratorio, ovidu@o) o le cellule in ambiente ﬂuido (protozoi). Flagelli: organi propulsori di organismi unicellulari e spermatozoi, più lunghi e aziona< da un movimento ondulatorio. I microtubuli al loro interno crescono a par<re di un organizzatore che è il corpusculo basale, nel citoplasma. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro La stru@ura interna di tuJ e due è la stessa, molto conservata (protozoi al uomo): una coppia di microtubuli centrali e nove coppie a@orno, legate fra di loro da diverse proteine. Fra queste è importante la dineina ciliare, che si lega a due microtubuli (dalla testa e la coda) e li fa scorrere fra di loro, generando la ﬂessione del ciglio o ﬂagello. Mutazioni di questa proteina: sindrome di Kartagener (infezioni bronchiali e sterilità maschile). Dineina Microt. singolo della coppia centrale Dineina Doppio microtubulo esterno Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro FILAMENTI DI ACTINA I ﬁlamen< di ac<na, in tu@e le cellule eucario<che, sono i principali responsabili della mo<lità cellulare e dei mo< di superﬁcie. Interagiscono con molte proteine che legano ac<na, per tante funzioni diverse. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro I ﬁlamen< di ac<na formano lo scheletro dei microvilli (cellule intes<nali), dei fasci contra=li (i muscoli della cellula) e delle protrusioni superﬁciali molto dinamiche, e formano pure l’anello contra=le che divide una cellula in due alla ﬁne della mitosi. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Sono ﬁlamen< più soJli, ﬂessibili e cor< dei microtubuli, con circa 7 nm di diametro. Si organizzano in fasci e re< per fare stru@ure più robuste. Il ﬁlamento si forma per addizione di monomeri di ac<na, formando una doppia catena con due ﬁlamen< fortemente intreccia<. Gli estremi dei monomeri sono diversi, dunque pure i ﬁlamen< di ac<na hanno una polarità stru@urale, con un estremo meno e uno più. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro TuJ i due estremi possono crescere, ma il estremo più lo fa a maggiore velocità. La crescita avviene per aggiunta di monomeri lega< ad ATP. Una volta uni< al ﬁlamento, l’ATP si idrolizza ad ADP indebolendo il legame agli altri monomeri. Lo scambio di ADP per ATP accade solo nello stato monomerico. Pure i ﬁlamen< di ac<na sono in equilibrio dinamico, fra polimerizzazione e depolimerizzazione, e pure in questo caso ci sono tossine che possono bloccare ogni fenomeno (polim: citocalasine; depolim: falloidina). Ac(na legata ad ADP Ac(na legata ad ATP Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Di solito la metà dell’ac<na è in ﬁlamen< e l’altra metà monomerica, in maniera di essere disponibile se c’e bisogno di fare nuovi ﬁlamen< velocemente. Ci sono tante proteine che legano l’ac<na, per molte funzioni diverse: -‐  Proteine che legano l’ac<na monomerica, per tenere la riserva di monomero pronta (proﬁlina). -‐  Proteine che promuovono la polimerizzazione sul fronte di avanzamento di una cellula in movimento (formine; ARP: ac3n related proteins). -‐  Proteine che organizzano i fasci contraJli. -‐  Proteine che formano re<coli di ﬁlamen< di ac<na nel cortex cellulare. -‐  Proteine che rompono i ﬁlamen< in frammen< cor< (gelsolina). -‐  Proteine motrici che legano i ﬁlamen< per generare movimento (miosina). -‐  Proteine che si muovono lungo i ﬁlamen< legando carico come organelli. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Proteina che frammenta ﬁlamen( Proteina che sequestra i monomeri Proteina di nucleazione Proteina che organiza fasci (ﬁlopodia) Proteina motrice Proteina di collegamento nel cortex Proteina cappuccio Proteina di collegamento laterale Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Il cortex cellulare Abbiamo visto che la membrana plasma<ca è rinforzata da una rete di spectrina dal lato citosolico. La maggior parte delle cellule hanno pure una rete di ﬁlamen< di ac<na so@o la membrana plasma<ca che forma uno strato che da resistenza meccanica alla cellula, coinvolto nel mantenimento della forma cellulare, nel movimento della cellula e nella formazione di protrusioni mobili di membrana. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Molte cellule si spostano strisciando sul substrato: -‐ Arriva un segnale che aJva rece@ori. -‐  La cellula eme@e prolungamen< sul fronte aJvato: lamellipodi e ﬁlopodi. Polimerizzazione di ac<na verso il fronte, estremo più, 1 µm/sec. -‐  I prolungamen< si a@accano al substrato (integrine) e fanno d’ancora, collegandosi all’ac<na. -‐  Il corpo cellulare viene trascinato usando ques< pun< di ancoraggio per generare movimento: ac<na e miosina. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Fronte avanzamento Nuovo ﬁlamento L’ac<na nei lamellipodi Proteina cappuccio Complesso ARP Formina L’ac<na nei ﬁlopodi Monomeri di ac(na Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Le miosine Sono le proteine motrici che interagiscono con l’ac<na, movendosi verso gli stremi più dei ﬁlamen<. Hanno una testa globulare con aJvità ATPasi per generare movimento, e una coda che lega diversi <pi di carico a seconda del <po di miosina. La miosina I si trova in tu@e le cellule, fa spostare carici lungo i ﬁlamen< di ac<na, o pure la membrana plasma<ca rispe@o ai ﬁlamen< di ac<na. La miosina II è la principale miosina del muscolo. Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro L’aJvità delle proteine che legano l’ac<na, e quindi del citoscheletro di ac<na, è modiﬁcata da segnali intra-‐ ed extracellulari: le proteine che legano l’ac<na sono proteine eﬀe@rici. Così la cellula può rispondere a cer< segnali con movimen< e spostamen<. Le molecole segnalatrici intracellulari che collegano i segnali con le proteine che legano ac<na appartengono alla famiglia della proteina Rho, e sono interru@ori dipenden< del legame a GTP (GTP: on; GDP: oﬀ). Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Il citoscheletro Cellula in riposo Rho: fasci contra=li ed spostamento Rac: lamellipodi Cdc 42: ﬁlopodi Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos