UNIVERSITA` DI NAPOLI FEDERICO II STUDIO DELL

UNIVERSITA’ DI NAPOLI FEDERICO II
DOTTORATO DI RICERCA IN BIOCHIMICA
E BIOLOGIA CELLULARE E MOLECOLARE
XXI CICLO
STUDIO DELL’ESPRESSIONE GENICA DELLA
PROTIMOSINA ALFA E DELLA RELASSINA-3
DURANTE LO SVILUPPO EMBRIONALE DEL
TELEOSTEO Danio rerio
Dottorando
ALDO DONIZETTI
Relatore
Prof. Francesco Aniello
Coordinatore
Prof. Giuseppe D’Alessio
Anno Accademico 2007/2008
RINGRAZIAMENTI E DEDICHE
Il presente lavoro di tesi è frutto di un percorso di crescita professionale in
cui diverse persone sono divenute importanti compagni di viaggio. E’
doveroso, quindi, esprimere la mia gratitudine a quanti hanno partecipato
alla realizzazione dei progetti di ricerca del mio dottorato.
Innanzitutto, un ringraziamento particolare al mio docente guida, il prof.
Francesco Aniello, la cui supervisione mi ha permesso di raggiungere la
giusta maturità professionale necessaria alla gestione delle mie ricerche.
Ringrazio la prof.ssa Tina Pietropaolo per la revisione critica della mia
tesi. Ringrazio gli studenti di cui ho avuto il piacere di seguire i progetti
di tesi sperimentale: Enzo, Daniele, Mario Grossi, Daniela, Angelo,
Giovanni, Paolo, Peppe, Riccardo, Giusy, Marcella, Michela, Francesca,
Tilde, Antonella, Giovanna, Mario Giorleo, Umberto, Antonio, Ciro,
Santina, Marianna, Davide, Pietro, Imma, Maria, Salvatore, Carlo, Nicola,
Antonino, Emilia, Silvia, Dario, Giuseppe, Mario, Caterina, Marco,
Emanuele, Valerio, Stella.
Dedico la tesi a mia moglie Giovanna, ai miei genitori Raffaele e Luisa, a
mia sorella Rosa, a mio cognato Franco e ai miei nipoti Selenia e
Domenico.
II
SOMMARIO
I meccanismi di regolazione della trascrizione genica e le funzioni
biologiche della protimosina alfa e della relassina-3 sono studiati
principalmente nei mammiferi. Alla protimosina alfa sono state
accreditate diverse funzioni tra cui un ruolo attivo nella proliferazione e
sopravvivenza
cellulare,
mentre
la
relassina-3,
funziona
come
neurotrasmettitore per un gruppo ristretto di neuroni detto nucleo incerto.
Con l'obiettivo di allargare la conoscenza sul profilo d'espressione genica
della protimosina alfa e della relassina-3 in altre classi di vertebrati, e in
particolare durante lo sviluppo embrionale, abbiamo usato come modello
sperimentale il pesce teleosteo Danio rerio ottenendo i seguenti risultati:
1. Protimosina alfa: abbiamo dimostrato che il gene per la protimosina
alfa risulta duplicato in Danio rerio e che entrambi i geni identificati si
esprimono durante lo sviluppo embrionale. A partire dalla duplicazione, i
due geni hanno diversificato i meccanismi di regolazione trascrizionale
poiché i profili d'espressione sono simili ma non identici. Nel complesso,
i due geni mostrano che l'espressione non è ubiquitaria, ma riguarda
territori specifici. L'espressione osservata in alcuni territori, come
l'abbozzo della coda, fa ipotizzare che la protimosina alfa sia coinvolta
nei meccanismi di proliferazione cellulare, mentre in altri, come le creste
neurali, è presumibilmente coinvolta nella sopravvivenza cellulare,
mostrando che tali funzioni sono conservate nei vertebrati.
2. Relassina-3: anche in questo caso abbiamo dimostrato una duplicazione
genica che ha portato all'esistenza di due paraloghi, rln3a e rln3b.
Studiandone il profilo d'espressione abbiamo raggiunto importanti
risultati nella neuroanatomia dei pesci. Infatti entrambi i geni, nelle prime
fasi dello sviluppo del cervello, sono espressi in tutto il territorio neurale,
III
mentre nelle fasi finali del periodo di faringula restringono drasticamente
la loro espressione a piccoli gruppi di cellule nella regione mesencefalica.
Analisi di sezioni trasversali unite all'uso di opportuni marcatori
territoriali ci hanno fatto concludere che si tratta di cellule del grigio
periacqueduttale, una regione del cervello fino ad ora mai descritta nel
pesce zebra. Mentre rln3b si esprime esclusivamente in questo territorio
anche agli stadi successivi, rln3a, a partire dallo stadio larvale, si esprime
anche in un altro gruppo di cellule situato nella regione rombencefalica
intorno al quarto ventricolo. La relazione neuroanatomica di questo
gruppo di cellule con il rafe dorsale e superiore ed il locus coeruleus
dimostra che appartiene alla regione dei ponti. Queste osservazioni ci
hanno fatto ipotizzare che si tratti di una struttura omologa al nucleo
incerto dei mammiferi. L’ipotesi è stata confermata mediante l'analisi dei
territori d'espressione del gene crhr1, che nel cervello di ratto caratterizza
proprio il nucleo incerto. Tali evidenze sperimentali sono le prime
riguardanti l'esistenza del nucleo incerto nel cervello dei pesci.
L'espressione del gene rln3a nel pesce zebra dimostra che la sua funzione
come neurotrasmettitore è così importante da mantenersi perfettamente
conservata nell'evoluzione dei vertebrati. Inoltre, dati preliminari
sull'espressione genica dei recettori della relassina-3 mostrano che i
circuiti neurali legati alla risposta allo stress, di cui fa parte il nucleo
incerto, sono potenzialmente funzionali già nelle prime fasi di vita
dell'organismo.
IV
SUMMARY
Prothymosin alpha and relaxin-3 have only been studied in mammalian
species, and information on their gene regulation and functions are mainly
restricted to the adult organism. In particular, prothymosin alpha shows
different functions including an active role in proliferation and cell
survival, whereas relaxin-3 acts as a neurotransmitter for a neuron cluster
known as nucleus incertus. The main goal of this work was to expand
current knowledge on the prothymosin alpha and relaxin-3 gene
expression pattern during vertebrate embryonic development, using
zebrafish as the model organism.
1. Prothymosin alpha: we showed that the prothymosin alpha gene is
duplicated in zebrafish, and our analyses indicated that both paralog genes
are expressed during embryonic development; additionally, they have a
similar but not identical expression pattern, which suggests that the two
genes have diversified their transcription regulation mechanisms during
zebrafish evolution. The spatial analyses of the transcript distribution
show that the prothymosin genes' expression is not ubiquitous during
embryonic development but is restricted to specific territories, including
the central nervous system, the pharyngeal arch region and some retinal
cells. Our experimental data led to the hypothesis of a conserved role of
prothymosin alpha in cell proliferation and cell survival during
vertebrates evolution, and that its function in these biological mechanisms
occurs during embryonic development.
2. Relaxin-3: we identified a new member of the relaxin family that we
considered to be a second relaxin-3 on the basis of the sequence
homology. The analysis of the gene expression pattern of two paralogs,
rln3a and rln3b, led to important targets in the fish neuroanatomy. Both
V
genes are diffusely expressed in the developing brain during early stages
of neurogenesis, whereas during the pharyngula period, their expression is
restricted to two small cell clusters in the midbrain region. By examining
the analyses of the transverse sections of hybridized embryos combined
with the use of specific markers, we concluded that these cells are in the
periacqueductal gray matter, a brain region never described until now in
the zebrafish. Later, at 72 hpf, only rln3a is also expressed in a second
posteriormost cell cluster distributed along the fourth ventricle in the
rombencephalic region. The comparison of the neuroanatomical position
among this cell group and superior raphe, dorsal raphe and the locus
coeruleus, shows that the posteriormost rln3a-expression cell cluster is
regionalized in the pons region. On the basis of these observations, we
hypothesized that this cell cluster might correspond to mammalian
nucleus incertus. We corroborated our hypothesis with the analysis of
expression territories of the crhr1 gene, which is a marker for the nucleus
incertus in the rat brain. These are the first evidences of the nucleus
incertus in fish. Our data of such a restricted expression of the rln3 genes
in the developing zebrafish brain are in accordance with phylogenetic
analyses that hypothesized a conserved role during vertebrate evolution
for Rln3 as a neuropeptide. In addition, the gene expression pattern of the
relaxin-3 receptors shows that the neural circuits, associated with stress
response, are potentially functional in the early stage of life.
VI
INDICE
Pag.
1.0 PROTIMOSINA ALFA.....................................................1
1.1 Introduzione...................................................................1
1.2 Scopo della ricerca.........................................................7
1.3 Risultati...........................................................................9
1.3.1 Identificazione e clonaggio dei cDNA......................9
1.3.2 Espressione durante lo sviluppo embrionale...........12
1.3.2a Profilo temporale di espressione genica............12
1.3.2b Profilo spaziale di espressione genica:ptmaa....14
1.3.2c Profilo spaziale di espressione genica:ptmab.....18
1.3.3 Espressione genica nei tessuti adulti.......................20
1.4 Discussione....................................................................22
2.0 RELASSINA-3.................................................................26
2.1 Introduzione.................................................................26
2.2 Scopo della ricerca.......................................................33
2.3 Risultati.........................................................................35
2.3.1 Identificazione e clonaggio dei cDNA....................35
2.3.2 Espressione durante lo sviluppo embrionale...........37
2.3.2a Profilo temporale di espressione genica............37
2.3.2b Profilo spaziale di espressione genica: rln3a.....37
2.3.2c Profilo spaziale di espressione genica: rln3b.....44
2.3.3 Espressione genica nell'adulto................................45
VII
2.3.4 Uno sguardo ai recettori..........................................46
2.3.4a Identificazione e clonaggio dei cDNA...............47
2.3.4b Profilo temporale di espressione genica............50
2.3.4c Profilo spaziale di espressione genica: rxfp1.....52
2.3.4d Profilo spaziale di espressione genica: rxfp3.....52
2.3.4e Espressione genica nei tessuti adulti..................53
2.4 Discussione....................................................................55
3.0 SISTEMA SPERIMENTALE, MATERIALI E
METODI...........................................................................60
3.1 Organismo modello: Danio rerio (pesce zebra).............60
3.2 Embriogenesi.................................................................61
3.3 Allevamento e impiego degli esemplari di Danio rerio.65
3.4 Estrazione dell’RNA totale da embrioni e tessuti
adulti di Danio rerio......................................................65
3.5 RT-PCR..........................................................................67
3.6 Analisi del prodotto di PCR ed estrazione del DNA
dal gel di agarosio..........................................................71
3.7 Clonaggio nel vettore plasmidico pGEM®-T-Easy........71
3.8 Trasformazione di cellule batteriche di E. coli (DH5α).73
3.9 Minipreparazione del DNA plasmidico.........................74
3.10 Maxipreprarazione di DNA plasmidico.......................75
3.11 Sintesi delle sonde ad RNA..........................................76
3.12 Quantificazione delle sonde ad RNA...........................78
VIII
3.13 Ibridazione in situ su embrioni interi...........................79
4.0 BIBLIOGRAFIA..............................................................87
IX
INDICE DELLE FIGURE
Pag.
Figura 1. Protimosina alfa nel rimodellamento della
cromatina……….....................................................4
Figura2. Allineamento delle sequenze amminoacidiche e
struttura genica della protimosina alfa.................... 11
Figura3. Albero filogenetico e profilo temporale di
espressione delle protimosine alfa...........................13
Figura4. Ibridazione in situ per il gene ptmaa........................15
Figura 5. Ibridazione in situ per il gene ptmab.......................19
Figura 6. Struttura del precursore della relassina....................27
Figura 7. Allineamento delle sequenze amminoacidiche e
struttura genica di Rln3a e Rln3b.............................36
Figura 8. Profilo temporale di espressione dei geni rln3a e
rln3b.........................................................................38
Figura 9. Ibridazione in situ per il gene rln3a.........................39
Figura 10. Ibridazione in situ con marcatori genici per
determinati territori neurali....................................42
Figura 11. Ibridazione in situ per il gene rln3b.......................45
Figura 12. Profilo di espressione dei geni rln3a e rln3b
nell’adulto.................................................................................46
Figura 13. Allineamento delle sequenza amminoacidiche e
struttura genica del recettore Rxfp1......................49
X
Figura 14. Allineamento delle sequenze amminoacidiche
del recettore Rxfp3 e profilo di espressione dei
geni rxfp1 e rxfp3...................................................51
Figura 15. Ibridazione in situ per il gene rxfp1 ......................53
Figura 16. Ibridazione in situ per il gene rxfp3 ......................54
XI
Protimosina alfa: introduzione
1.0 PROTIMOSINA ALFA
1.1 INTRODUZIONE
La protimosina alfa è una piccola proteina, di 109-113 amminoacidi
a seconda della specie, tra le più acide del mondo eucariotico grazie ad un
contenuto di acido aspartico e glutammico di poco al di sotto del 50%
(Haritos et al., 1984). La sua estrema acidità non è l’unica caratteristica
che ne fa una delle proteine più discusse dalla sua identificazione. Infatti,
manca di regioni idrofobiche e di residui aromatici e sulfidrilici, per cui
non assorbe a 280 nm; ad oggi sembra che sia l'unica proteina fosforilata
a livello di residui di acido glutammico; non mostra strutture secondarie e
sembra adottare una conformazione a gomitolo statistico, è considerata
infatti un membro della classe delle proteine cosiddette “intrinsecamente
non strutturate” (Segade e Gòmez-Márquez, 1999; Hannappel e Huff,
2003; Gast e al., 2003).
L’acceso dibattito non si ferma solo alle caratteristiche strutturali ma
riguarda anche la localizzazione della proteina. Infatti, la protimosina
alfa, sebbene manchi di un peptide segnale e non sia stato descritto alcun
meccanismo di secrezione, è stata isolata dal siero umano e dal mezzo di
coltura condizionato di timociti di vitello e ratto (Panneerselvam et al.,
1987; Franco et al., 1989). Altri studi, dimostrano la presenza della
proteina nel citoplasma cellulare e l’interazione con molecole che hanno
funzioni completamente diverse. Ad esempio, è stato dimostrato che la
protimosina alfa lega alcuni tRNA di cui probabilmente regola il
metabolismo (Lukashev e al., 1999). Altri lavori dimostrano l’interazione
nel citoplasma tra la protimosina alfa e Keap1 con effetti sulla risposta
allo stress ossidativo; infatti, le cellule rispondono allo stress ossidativo e
1
Protimosina alfa: introduzione
all’attacco elettrofilico mediante l’espressione coordinata di un insieme di
geni regolata dal fattore di trascrizione Nrf2; in cellule non stressate, Nrf2
e’ associata ad un inibitore proteico, Keap1, ed in tal modo è impedita
nella sua azione sulla trascrizione genica; la protimosina alfa è capace di
liberare Nrf2 dal complesso Keap1-Nrf2 competendo con Nrf2 per lo
stesso sito di legame con Keap1 (Karapetian e al., 2005). Infine, la
protimosina alfa si trova anche nel nucleo, dove viene destinata grazie ad
un segnale di localizzazione nucleare bipartito, composto dalla sequenza
KKQK, localizzata nella regione carbossi-terminale, e da una lisina posta
13 amminoacidi a monte, in particolare, in questo comparto cellulare è
presente in quantità paragonabili all’istone H1 con cui è stata ampiamente
dimostrata l’interazione (Gómez-Márquez e Rodriguez, 1998; Karetsou e
al., 1998). Gli esempi precedenti dimostrano non solo che la proteina è
presente in diversi comparti cellulari, ma che può interagire con diverse
molecole. Questa versatilità si concilia con l'assenza di una precisa
struttura tridimensionale, la protimosina alfa, infatti, assumerebbe una
specifica conformazione proprio nell'interazione con altre molecole.
Poiché dalla struttura di una proteina deriva la sua funzione, tutti questi
dati fanno immaginare che la protimosina alfa sia una proteina
multifunzionale coinvolta in diversi meccanismi cellulari, spesso non
correlati, in funzione delle molecole con cui interagisce.
Queste considerazioni spiegano anche come mai dalla sua scoperta la
protimosina alfa ha alimentato diverse linee di ricerca focalizzate sulle
varie funzioni biologiche manifestate. Uno dei filoni di dati più
consistente riguarda il ruolo della protimosina alfa nel nucleo. Diverse
evidenze sperimentali infatti supportano l'ipotesi che la protimosina alfa
sia coinvolta nei cambiamenti dello stato di condensazione della
2
Protimosina alfa: introduzione
cromatina: innanzitutto, l’interazione con l’istone H1 che è il maggior
determinante della strutturazione della fibra nucleosomale in livelli di
struttura più complessi (Karetsou e al., 1998); l’accessibilità della
nucleasi micrococcica aumenta in cellule HL-60 che super-esprimono la
protimosina alfa (Gomez-Marquez e Rodriguez, 1998); l’attivazione
trascrizionale indotta dalla protimosina alfa può essere spiegata dalla
maggiore accessibilità concessa alla RNA Polimerasi II con cui la
protimosina alfa viene ritrovata in regioni di cromatina decondensata
(Karetsou e al., 2002; Subramanian e al., 2002); durante la mitosi la
protimosina alfa viene esclusa dal volume occupato dal DNA,
probabilmente in conseguenza della condensazione dei cromosomi
(Enkmann e al., 2000). In figura 1 è schematizzato il meccanismo di
azione della protimosina alfa nella decondensazione della cromatina così
come ipotizzato in base alle evidenze sperimentali precedentemente
elencate (Gómez-Márquez, 2007). Durante l’interfase l’interazione della
protimosina alfa con l’istone H1 determina la decondensazione della
cromatina dalla fibra di 30 nm alla fibra di 10 nm, permettendo la
trascrizione o la replicazione del DNA. In questo modello viene proposta
anche una funzione per la fosforilazione a carico dell’acido glutammico
della protimosina alfa. La defosforilazione dell’acido glutammico
fornirebbe l'energia sufficiente a liberare l’istone H1 dal DNA
permettendone l’interazione con la protimosina alfa. Durante la mitosi
invece la protimosina alfa viene allontanata dalla cromatina per
permetterne la condensazione (Fig. 1).
L'espressione della protimosina alfa è stata correlata alla proliferazione
cellulare dato che aumenta nelle cellule di mammifero in proliferazione,
al punto da essere considerata un marcatore della progressione tumorale,
3
Protimosina alfa: introduzione
Figura 1. Rappresentazione schematica del ruolo della
protimosina alfa nel rimodellamento della cromatina. Per la
descrizione riferirsi al testo. Ptma: protimosina alfa; H1: istone
H1. Modificata da Gómez-Márquez (2007).
infatti, i livelli della proteina sono più alti nei tessuti malati, ad esempio
nel cancro all'intestino e nell'epatocarcinoma, rispetto ai tessuti circostanti
sani (Tsitsilonis e al., 1993; Wu e al., 1997). Questi dati sono in accordo
con gli studi sulla regolazione trascrizionale del gene per la protimosina
alfa, che ne mostrano l'espressione sotto il controllo dei membri della
famiglia myc, noti protoncogeni con un ruolo chiave nella proliferazione
cellulare. In particolare, è stato dimostrato in cellule di fibroblasti di topo
RAT1A che c-myc, attraverso la formazione di un eterodimero con la
proteina max, è capace di indurre la trascrizione del gene della
4
Protimosina alfa: introduzione
protimosina alfa riconoscendo una E-box presente nel primo introne del
gene stesso (Eilers e al., 1991; Gaubats e al., 1994). Inoltre, in cellule di
neuroblastoma il livello degli mRNA per la protimosina alfa sono
strettamente correlati ai livelli dell'mRNA di N-myc, facendo supporre,
sebbene non vi siano ancora prove dirette, che la protimosina alfa sia un
bersaglio anche di N-myc (Sasaki e al., 2001). Al contrario, l'espressione
della protimosina alfa diminuisce parallelamente alla progressione del
differenziamento cellulare, come dimostrano esperimenti su cellule HL60 e di neuroblastoma (Dosil e al., 1993; Smith e al., 1993; Garnier e al.,
1997).
Oltre all’effetto sulla proliferazione cellulare la protimosina alfa è
coinvolta anche nei meccanismi di sopravvivenza cellulare. Infatti, grazie
alla capacità di inibire la formazione dell’apoptosoma, previene
l'attivazione delle caspasi e quindi la cascata di eventi apoptotici che ne
conseguirebbe (Jiang e al., 2003). Un'ulteriore prova a favore dell'azione
antiapoptotica della protimosina alfa deriva da studi sull’effetto della
proteina HuR, un noto fattore antiapoptotico, sul trascritto della
protimosina alfa. In particolare, cellule HeLa in risposta a stimoli
apoptotici incrementano il livello di proteina HuR, che si lega alla regione
3’UTR del trascritto della protimosina alfa, regolandone la disponibilità
nel citoplasma e la traduzione ed in definitiva agendo sui livelli della
proteina richiesta per le funzioni antiapoptotiche (Lal e al., 2005).
Quali che siano le diverse funzioni accreditate alla protimosina alfa,
l'essenzialità del suo ruolo biologico è sottolineata anche dalla sua
distribuzione tissutale nell’organismo adulto, al punto che in letteratura si
è affermata l'idea che la protimosina alfa sia ubiquitaria. Infatti, sia il
trascritto che la proteina sono stati ritrovati in tutti i tessuti in cui la sua
5
Protimosina alfa: introduzione
presenza sia stata analizzata, tra essi non solo il timo, dove fu identificata
inizialmente, ma anche, per citarne solo alcuni, l’ovario, il cervello, il
cuore, il muscolo, i reni, l’intestino, il fegato, la milza, il polmone ed il
testicolo (Eschenfeldt e al., 1986; Clinton e al., 1989).
6
Protimosina alfa: scopo della ricerca
1.2 SCOPO DELLA RICERCA
Fino agli inizi del 2000 la protimosina alfa era ritenuta una proteina
esclusiva dei mammiferi, dati i fallimenti di identificazione in altri
organismi dai batteri agli anfibi (Trumbore e al., 1998). Solo nel 2002, il
prof. Francesco Aniello ha identificato per la prima volta in un vertebrato
non mammifero, l’anfibio Rana esculenta, la sequenza nucleotidica delle
protimosina alfa (Aniello e al., 2002). La proteina di questo anfibio
contiene nella sua catena amminoacidica, rispettivamente 28 e 25 unità di
acido aspartico e acido glutammico ed è presente il segnale di
localizzazione nucleare nella regione carbossi-terminale della proteina. La
protimosina alfa della Rana esculenta mostra elevati valori di identità
amminoacidica con la proteina delle varie specie di mammifero a
dimostrazione di un elevato grado di conservazione evolutiva della
proteina. Mediante esperimenti di Northern blotting è stato dimostrato che
il trascritto è presente in tutti i tessuti analizzati, ma se si analizza la
distribuzione cellulare nel testicolo si osserva che l'espressione genica non
è ubiquitaria, infatti, il trascritto è presente solo in alcuni tipi cellulari,
come gli spermatociti primari e secondari e le cellule di Leydig, mentre è
assente in altri, come le cellule del Sertoli (Aniello e al., 2002).
Recentemente l'uso di anticorpi contro la protimosina alfa ha permesso di
localizzare la proteina nel nucleo delle cellule germinali, dove sarebbe
coinvolta nella strutturazione della cromatina, e nel citoplasma delle
cellule interstiziali di Leydig, dove invece è probabile che intervenga nei
meccanismi di sopravvivenza cellulare (Ferrara e al., 2008).
La scoperta della protimosina alfa negli anfibi ha costituito un importante
passo nella comprensione della storia evolutiva di questa proteina, a cui è
seguita, grazie ai progetti di sequenziamento degli ultimi anni,
7
Protimosina alfa: scopo della ricerca
l'identificazione della sequenza nucleotidica in altre specie appartenente
alle varie classi dei vertebrati. Allo scopo di estendere la conoscenza
sull'evoluzione della funzione e dei meccanismi di regolazione genica
della protimosina alfa, il presente lavoro di tesi ha avuto come obiettivo
l'analisi dell'espressione del gene per la protimosina alfa nei pesci, cioè
nei più bassi vertebrati in cui la sua sequenza sia stata identificata. Inoltre,
ad oggi mancano studi estensivi sulla funzione che la protimosina alfa
riveste nello sviluppo embrionale dei vertebrati. A tal proposito il mio
studio è focalizzato sul profilo d'espressione del gene della protimosina
alfa nello sviluppo embrionale del teleosteo Danio rerio, comunemente
noto come pesce zebra, le cui caratteristiche generali e lo sviluppo
embrionale sono riportati nel paragrafo “Sistema sperimentale, materiali e
metodi”.
8
Protimosina alfa: risultati
1.3 RISULTATI
1.3.1 Identificazione e clonaggio dei cDNA
Al fine di identificare la sequenza nucleotidica della protimosina
alfa del pesce zebra, ho effettuato una ricerca nella banca dati nucleotidica
del Sanger Institute (www.sanger.ac.uk). In particolare, ho eseguito la
ricerca avvalendomi della sequenza amminoacidica della proteina umana
e usando il programma bioinformatico tBLASTn, partendo dal
presupposto di un elevato grado di conservazione della sequenza primaria
che la protimosina alfa mostra nei vari vertebrati, come dimostrato dagli
studi sulla Rana esculenta. In tal modo, alla fine della ricerca, ho
identificato due sequenze nucleotidiche EST (Expression Sequence Tag)
che nella banca dati dell'NCBI (National Center for Biotechnology
Information, www.ncbi.nlm.nih.gov) sono denominate prothymosin alpha
(ptma) e prothymosin alpha-like (ptma-like). A tal punto ho disegnato due
coppie di oligonucleotidi per amplificare le regioni codificanti dei due
trascritti, mediante la tecnica dell'RT-PCR (Reverse TranscriptionPolimease Chain Reaction) come riportato nel paragrafo Materiali e
Metodi. In particolare, ho usato, come stampo cDNA (DNA
complementare) ottenuto tramite reazione di retrotrascrizione di RNA
totale estratto da embrioni a 24 ore di sviluppo. I prodotti della reazione
di amplificazione sono stati analizzati su di un gel di agarosio. La
presenza dei prodotti di amplificazione delle dimensioni attese dimostrava
che entrambi i geni sono attivi durante l'embriogenesi (dati non mostrati).
Al fine di verificarne la specificità, i prodotti di amplificazione sono stati
estratti dal gel, clonati nel vettore pGEM®-T-Easy, ed infine sequenziati.
Le due proteine codificate dalle sequenze amplificate mostrano una
9
Protimosina alfa: risultati
percentuale di similarità amminoacidica del 75% e quando comparate alla
protimosina alfa umana dell'80% e del 69% rispettivamente. In accordo
con le regole di nomenclatura internazionale (www.zfin.org) ho
denominato tali proteine “Ptmaa” e “Ptmab”. Ptmaa è lunga 105
amminoacidi e presenta 26 residui di acido aspartico e 23 di acido
glutammico; Ptmab è lunga 106 amminoacidi di cui 30 unità sono di
acido aspartico e 24 di acido glutammico. Inoltre, ambedue le proteine
hanno il segnale di localizzazione nucleare bipartito come la protimosina
alfa degli altri vertebrati (fig. 2A).
Il gene umano della protimosina alfa è sul cromosoma 2 ed è costituito da
5 esoni e 4 introni. Per verificare la struttura dei geni per la protimosina
alfa nel pesce zebra e compararla a quella del gene umano, ho ricercato e
identificato
le
sequenze
genomiche
nella
banca
dati
Ensembl
(www.ensembl.org). Come è possibile osservare dalla figura 2B, ambedue
i geni si presentano organizzati in 5 esoni e 4 introni come per l'omologo
gene umano.
Per ricavare informazioni sulle relazioni filogenetiche delle 2 protimosine
alfa del pesce zebra nella linea evolutiva dei vertebrati, ho effettuato
ricerche nelle diverse banche dati nucleotidiche (NCBI, Sanger, Ensembl)
per identificare la sequenza della protimosina alfa in altre specie. I
mammiferi, gli uccelli e gli anfibi presentano un'unica sequenza per la
protimosina alfa, mentre non è stato possibile identificare alcuna
sequenza nei rettili, probabilmente per la scarsa quantità di sequenze
nucleotidiche disponibili per questa classe. La comparazione tra le
sequenze amminoacidiche della protimosina alfa ritrovate nei mammiferi,
negli uccelli e negli anfibi mostra una percentuale di similarità
amminoacidica con Ptmaa tra il 72 e l'82% e quando comparate con
10
Protimosina alfa: risultati
Figura 2. A. Allineamento delle sequenze amminoacidiche di Ptmaa
e Ptmab del pesce zebra e di PTMA dell'uomo mediante il
programma ClustalW. Gli amminoacidi identici sono indicati
dall'asterisco, le sostituzioni conservative e semiconservative sono
indicate rispettivamente con i due punti e il punto singolo. I trattini
rappresentano gli intervalli introdotti dal programma per ottenere il
miglior allineamento. B. Struttura genica in esoni ed introni del gene
umano (Hs PTMA) e dei geni del pesce zebra (Dr ptmaa, Dr ptmab)
della protimosina alfa.
Ptmab tra il 68 e il 72%. La ricerca ha prodotto un risultato simile a
quello ottenuto in Danio rerio per il teleosteo Ictalurus punctatus (pesce
gatto). Infatti, come per il pesce zebra, sono presenti due sequenze
nucleotidiche codificanti la protimosina alfa.
In base alla percentuale di similarità amminoacidica con le sequenze
omologhe della protimosina alfa del pesce zebra ho denominato le due
11
Protimosina alfa: risultati
sequenze proteiche del pesce gatto “Ptmaa” e “Ptmab”. In particolare,
“Icatalurus punctatus Ptmaa” mostra una percentuale di similarità del 94
% quando comparata a “Danio rerio Ptmaa”, mentre “Ictalurus punctatus
Ptmab” del 90 % con “Danio rerio Ptmab”. Questi dati percentuali,
rappresentati nell'albero filogenetico della figura 3A, permettono di
osservare che le due protimosine alfa di Danio rerio e di Ictalurus
punctatus formano due gruppi distinti, di cui “Ptmaa” risulta essere più
vicino alle protimosine alfa degli altri vertebrati.
1.3.2 Espressione durante lo sviluppo embrionale
1.3.2a Profilo temporale di espressione genica
Come si evince dal paragrafo precedente, la presenza di ampliconi
specifici per ptmaa e ptmab a 24 ore di sviluppo dimostrava già che i due
geni sono trascritti a quello stadio embrionale. Per avere informazioni
sull’espressione dei due geni durante l’embriogenesi del pesce zebra, ho
eseguito esperimenti di RT-PCR a partire da RNA totali estratti a tempi
diversi di sviluppo embrionale. Come si può osservare nella figura 3B, il
trascritto del gene ptmaa è assente nei primi stadi di sviluppo;
l’espressione genica è evidente solo a partire dal periodo di formazione
dei somiti come dimostra la presenza del prodotto di amplificazione a 16
ore di sviluppo. L'intensità del prodotto di PCR aumenta gradualmente
fino a 72 ore di sviluppo quando l'embrione è ormai una giovane larva.
Diversamente, il trascritto del gene ptmab è presente già a 4 ore di
sviluppo con un prodotto di amplificazione che diminuisce a 8 ore e
aumenta nuovamente con il periodo di formazione dei somiti,
mantenendosi costante fino all’ultimo stadio esaminato (fig. 3B).
12
Protimosina alfa: risultati
Figura 3. A. Albero filogenetico della protimosina alfa di diverse specie
ottenuto mediante il programma ClustalW. Dr Ptmaa, Danio rerio Ptmaa
(NM_194376); Dr Ptmab, Danio rerio Ptmab (NM_001098730); Ip
Ptmaa, Ictalurus punctatus Ptmaa (BE470115); Ip Ptmab, Ictalurus
punctatus Ptmab (CB937538); Re Ptma, Rana esculenta Ptma
(CAC39397); Xl Ptma, Xenopus laevis Ptma (BC044709); Xt Ptma,
Xenopus tropicalis Ptma (NM_001016523); Tg Ptma, Taeniopygia
guttata Ptma (EF191884); Gg Ptma, Gallus gallus Ptma (DN830020); Bt
Ptma, Bos taurus Ptma (NM_001039953); Rn Ptma, Rattus norvegicus
Ptma (NM_021740); Mm Ptma, Mus musculus Ptma (BC085171); Hs
Ptma, Homo sapiens Ptma (NM_002823). B. Profilo temporale
d'espressione dei geni ptmaa e ptmab del pesce zebra. In figura è
riportata l’immagine ottenuta con bromuro di etidio della corsa
elettroforetica delle reazioni di RT-PCR a vari stadi di sviluppo
embrionale. In alto sono riportate le ore dopo la fecondazione. Come
controllo sperimentale è stata usata l'amplificazione del cDNA della
proteina ribosomale Rplp0.
13
Protimosina alfa: risultati
1.3.2b Profilo spaziale di espressione genica: ptmaa
Una volta analizzato il profilo temporale d’espressione dei due geni,
ho effettuato lo studio dei territori d’espressione mediante la tecnica
dell'ibridazione in situ su embrioni interi a vari stadi di sviluppo
embrionale. In particolare, ho utilizzato sonde ad RNA antisenso marcate
con digossigenina per rivelare la presenza del trascritto di interesse. Come
controllo della specificità del segnale di ibridazione ho usato
corrispondenti sonde ad RNA senso marcate anch’esse con digossigenina.
In tutti gli esperimenti con le sonde senso non è stato rivelato alcun
segnale (dati non mostrati).
In accordo con il risultato degli esperimenti di RT-PCR, non è stato
osservato alcun segnale di ibridazione per ptmaa agli stadi di 4 e 8 ore di
sviluppo (fig. 4A, B). Durante il periodo di formazione dei somiti, invece,
è possibile osservare una forte espressione di ptmaa nella parte dorsale
dell'embrione, dove risiede il sistema nervoso centrale in sviluppo,
nell'abbozzo della coda e a ridosso del vitello come indicato dalle frecce
(fig. 4C). Quest’ultima regione, come si può osservare meglio nella figura
4D, è bilaterale e si estende in direzione caudale; in quella regione vi è il
mesoderma laterale, da cui si sviluppano sia i precursori delle cellule del
sangue sia i dotti pronefrici. Al fine di valutare quale di questi due tipi
cellulari esprimono il gene ptmaa è stato necessario utilizzare geni che si
esprimono in questi specifici territori. Nel pesce zebra è stato dimostrato
che il gene cdh17, che codifica per un membro della famiglia delle
caderine, si esprime selettivamente nelle cellule dei dotti pronefrici e non
nei precursori ematopoietici durante l’embriogenesi (Horsfield e al.,
2002). Sulla base dei dati della letteratura ho disegnato due
oligonucleotidi d’innesco specifici per cdh17 e dopo opportuna reazione
14
Protimosina alfa: risultati
Figura 4. Ibridazione in situ per il gene ptmaa agli stadi indicati dalle
ore dopo la fecondazione. A-C, H, N: visione laterale dell'embrione. EG, I, J, O, U: visione dorsale dell'embrione. D, M, P: regione della coda.
Gli inserti in D e M raffigurano doppie ibridazioni in situ con ptmaa
(blu) e cdh17 (arancio). F: doppia ibridazione in situ con ptmaa (blu) e
krox20 (arancio). G: ingrandimento della regione della testa. K, L:
dettaglio della regione del tronco a livello del rombencefalo. La linea
nera in P rappresenta il punto della sezione nell'inserto. Q-T: sezioni
trasversali come indicate dalle linee nere in O. V-Y: sezioni come
indicate dalle linee nere in U. La testa bianca della freccia indica il
placode della linea laterale anteriore. La testa della freccia nera indica il
placode olfattivo. Gli asterischi indicano i sacchetti endodermici. ac,
abbozzo della coda; app, abbozzo della pinna pettorale; c, cervelletto;
ca, cellule amacrine; cS, corpuscoli di Stannius; d, diencefalo; dp, dotti
pronefrici; ec, ectoderma; en, endoderma; fc, fessura corioidea; gt,
ganglio trigeminale; i, intestino; l, lente; nc, notocorda; pLLP, precursori
della linea laterale posteriore; r, rombencefalo; rf, regione faringea; ro,
rombomeri; t, telencefalo; ti, timo; To, tetto ottico; vo, vescicola otica;
15
Protimosina alfa: risultati
di amplificazione ho clonato il cDNA d’interesse nel vettore pGEM®-TEasy. Dopo aver determinato, mediante sequenziamento, che l’inserto di
cDNA fosse quello desiderato, ho sintetizzato sonde ad RNA, marcate
con fluoresceina, specifiche per il trascritto del gene cdh17, da usare in
esperimenti di doppia ibridazione in situ. La marcatura con fluoresceina
permette l’utilizzo simultaneo della sonda per cdh17 con la sonda per il
trascritto del gene ptmaa, marcata con digossigenina. In tal modo usando
anticorpi specifici per la digossigenina e per la fluoresceina è possibile
identificare ambedue i trascritti nello stesso embrione e distinguere i due
segnali d’ibridazione mediante reazioni colorimetriche che sviluppano
colori differenti per le due sonde. Gli esperimenti di doppia ibridazione in
situ dimostrano chiaramente la colocalizzazione dei trascritti del gene
ptmaa (blu) e cdh17 (arancio), portando alla conclusione che ptmaa è
espresso esclusivamente nei dotti pronefrici e non nei precursori
ematopoietici (inserto nella figura 4D). A questo stadio, una visione
dorsale dell'embrione permette di osservare che l'espressione di ptmaa
non si rivela solo nel sistema nervoso centrale, ma anche in elementi del
sistema nervoso periferico. In particolare, nella testa, la positività è
visibile nel placode olfattivo (fig. 4G) e posteriormente nel ganglio
trigeminale, nel placode della linea laterale anteriore e nelle vescicole
otiche (fig. 4E). Inoltre, l'espressione nel sistema nervoso centrale non è
uniforme manifestandosi più forte nella regione diencefalica (fig. 4G) e in
due dei sette rombomeri (fig. 4E). Per definire con precisione tali
rombomeri ho effettuato un esperimento di doppia ibridazione in situ con
una sonda antisenso per il gene krox20, che codifica per un fattore di
trascrizione fondamentale per la segmentazione del rombencefalo
(Oxtoby e Jowett, 1993). Infatti tale gene è espresso esclusivamente nei
16
Protimosina alfa: risultati
rombomeri 3 e 5 costituendone un formidabile marcatore territoriale.
Come si osserva nella figura 4F i due trascritti mostrano una completa
sovrapposizione nel rombomero 3, mentre solo ptmaa si esprime nel
rombomero 4 definendone perfettamente i margini. All'inizio del periodo
di faringula compaiono nuovi territori d’espressione quali l'abbozzo della
pinna pettorale e la retina, in particolare a livello delle cellule che
circondano la fessura corioidea (fig. 4H). La trascrizione permane nel
sistema nervoso centrale sia a livello della corda spinale (fig. 4M) che del
cervello (fig. 4H, I, J), con una maggiore intensità nel telencefalo e nel
diencefalo (fig. 4I). Nel sistema nervoso periferico l'espressione di ptmaa
continua nel placode olfattivo (fig. 4I), nel ganglio trigeminale, nel
placode della linea laterale anteriore e nella vescicola otica (fig. 4L),
mentre nella coda compare un’espressione nei precursori delle cellule
della linea laterale posteriore (fig. 4M). Ai lati del rombencefalo, dove
risiedono le cellule che prenderanno parte alla formazione della faringe, si
osserva una forte espressione nei sacchetti endodermici, che a questo
stadio sono 4 strutture ben definite; inoltre, seppure con minore intensità,
il trascritto è presente anche nelle cellule circostanti, tra le quali vi sono le
creste neurali in migrazione (fig. 4L). L’espressione nella regione faringea
è già visibile a 20 ore di sviluppo quando inizia la formazione dei
sacchetti endodermici (fig. 4K). A 27 ore di sviluppo il livello del
trascritto nei dotti pronefrici si riduce ai soli corpuscoli di Stannius,
piccole strutture simmetriche strettamente correlate ai dotti pronefrici,
come mostrato dalla doppia ibridazione con cdh17 (inserto nella figura
4M).
Alla fine del periodo di faringula (48 ore), il trascritto si distribuisce
uniformemente sia nella retina che nel cervello (fig. 4N, O), come meglio
17
Protimosina alfa: risultati
mostrato nelle sezioni trasversali (fig. 4Q-T). L’espressione genica
diminuisce visibilmente nella corda spinale, mentre manca del tutto nelle
cellule della linea laterale e nei dotti pronefrici (fig. 4P). A questo stadio
compare un nuovo sito di trascrizione nella coda, che la sezione
trasversale dimostra essere ristretto alle cellule dell'intestino (fig. 4P e
inserto). Per quanto riguarda la faringe, alla fine del periodo di faringula,
gli archi sono strutture ben definite, dove il gene ptmaa si esprime
esclusivamente nelle cellule che delimitano l'arco stesso all'esterno
(ectodermiche) e all'interno (endodermiche) (fig. 4T). Allo stadio di larva
(72 ore), l'espressione si concentra in modo particolare nella testa: il
segnale d’ibridazione continua ad essere uniformemente distribuito nel
cervello (fig. 4U), come meglio mostrato nelle sezioni trasversali (fig.
4V); nella retina, invece, l’espressione si restringe alle sole cellule
amacrine (fig. 4V, W), mentre nella faringe, il segnale è ancora evidente
nelle cellule ectodermiche ed endodermiche che circondano l'arco
faringeo (fig. 4V). A questo stadio, inoltre, inizia l’espressione nel timo
come si può osservare nella sezione trasversale (fig. 4Y).
1.3.2c Profilo spaziale di espressione genica: ptmab
A 4 e 8 ore di sviluppo il trascritto del gene ptmab è evidente in
tutte le cellule embrionali (fig 5A, B). Durante il periodo di formazione
dei somiti, il gene ptmab si esprime nell'abbozzo della coda, nel sistema
nervoso centrale e nei dotti pronefrici (fig. 5C) come confermato da
esperimenti di doppia ibridazione in situ con il marcatore genico cdh17
(fig. 5D). Il livello di espressione nel sistema nervoso centrale è uniforme,
ad eccezione di una maggiore intensità del trascritto nella zona
ventricolare (fig. 5C, D, E). ptmab è espresso anche nel sistema nervoso
18
Protimosina alfa: risultati
Figura 5. Ibridazione in situ per il gene ptmab agli stadi indicati dalle
ore dopo la fecondazione. A-C, G, L: visione laterale dell'embrione. E,
H, I, M, U: visione dorsale dell'embrione. D, K, N: regione della coda.
In D e nell'inserto in K sono raffigurate doppie ibridazioni in situ con
ptmab (blu) e cdh17 (arancio). F: ingrandimento della testa. J:
dettaglio della regione del tronco a livello del rombencefalo. P:
ingrandimento dei neuromasti. La linea nera in N rappresenta il punto
della sezione O. Q-T: sezioni trasversali come indicate dalle linee nere
in M. V-Y: sezioni come indicate dalle linee nere in U. La testa bianca
della freccia indica il placode della linea laterale anteriore. La testa
della freccia nera indica il placode olfattivo. ac, abbozzo della coda;
af, archi faringei; app, abbozzo della pinna pettorale; c, cervelletto; ca,
cellule amacrine; co, cellule orizzontali; d, diencefalo; dp, dotti
pronefrici; ec, ectoderma; en, endoderma; i, intestino; l, lente; n,
neuromasti; nc; notocorda; pLLP, precursori della linea laterale
posteriore; r, rombencefalo; rf, regione faringea; t, telencefalo; To,
tetto ottico; vo, vescicola otica; zv; zona ventricolare.
19
Protimosina alfa: risultati
periferico, in particolare nel placode olfattivo (fig. 5F), nella retina, nel
placode della linea laterale anteriore e nella vescicola otica (fig. 5E).
All'inizio del periodo di faringula il trascritto è ancora uniformemente
distribuito nel sistema nervoso centrale sia nel cervello che nella corda
spinale (fig. 5G, H, I, K). Permane la trascrizione nel sistema nervoso
periferico, visibile già nel periodo precedente (fig. 5H, J), mentre inizia
l'espressione anche nei precursori della linea laterale posteriore (fig. 5K) e
nell'abbozzo della pinna pettorale (fig. 5J). A questo stadio, il trascritto
rimane particolarmente evidente nei dotti pronefrici (fig. 5K e inserto). In
figura 5J è possibile apprezzare l’espressione nei precursori della faringe
disposti ai lati del rombencefalo ad esclusione delle cellule dei sacchetti
endodermici. Alla fine del periodo di faringula, l'espressione nel sistema
nervoso centrale si mantiene diffusa ed intensa (fig. 5L, M, N, e sezioni
trasversali Q-T), così come nella retina (fig. 5L, M, R, S) e nella regione
faringea (fig. 5L, S, T). Inoltre è ancora evidente l’espressione
nell'abbozzo della pinna pettorale (fig. 5M) e nei neuromasti che
discendono dai precursori della linea laterale posteriore (fig. 5N, P). Nella
coda, a ridosso del vitello, la trascrizione si concentra alle cellule
dell'intestino (fig. 5N, O). A 72 ore di sviluppo, l’espressione si restringe
alla sola area del tetto ottico nel cervello (fig. 5U) come si apprezza
meglio nelle sezioni trasversali (fig. 5V), alle cellule ectodermiche nella
faringe (fig. 5V, W) e nella retina, esclusivamente alle cellule amacrine e
orizzontali (fig. 5V, Y).
1.3.3 Espressione genica nei tessuti adulti
Al fine di avere indicazioni preliminari sull’espressione dei geni per
la protimosina alfa in individui adulti di pesce zebra, ho effettuato
20
Protimosina alfa: risultati
un’analisi mediante esperimenti di RT-PCR usando come stampo cDNA
relativi a diversi tessuti dell’organismo adulto. Come controllo della
reazione è stato usato il trascritto per la proteina ribosomale Rplp0. ptmaa
è espresso in tutti i tessuti con un'intensità maggiore nel cervello e
nell'intestino, mentre ptmab si esprime in tutti i tessuti analizzati con un
livello del trascritto uniforme (dati non mostrati).
21
Protimosina alfa: discussione
1.4 DISCUSSIONE
Nel genoma di varie specie di mammiferi, uccelli e anfibi è presente
un unico gene per la protimosina alfa. I dati del presente lavoro di tesi
evidenziano che nel genoma del pesce zebra sono presenti due geni per la
protimosina alfa, ptmaa e ptmab, e che ambedue i paraloghi identificati,
comparati al gene umano, hanno un organizzazione esone-introne
conservata. Ambedue le proteine del pesce zebra mostrano un'elevata
percentuale di amminoacidi acidi e il segnale di localizzazione nucleare
bipartito, come la protimosina alfa delle altre specie di vertebrato. La
ricerca nelle banche dati nucleotidiche ha permesso di scoprire che anche
il pesce gatto (Ictalurus punctatus) presenta due geni per la protimosina
alfa, suggerendo un evento di duplicazione genica avvenuto nella linea
evolutiva dei teleostei. L'analisi filogenetica mostra inoltre che le
protimosine alfa dei due pesci non sono ugualmente correlate alle
proteine degli altri vertebrati, dato che Ptmaa presenta un maggior grado
di conservazione della sequenza primaria rispetto a Ptmab.
I risultati degli esperimenti di RT-PCR e di ibridazione in situ mostrano
che entrambi i geni hanno un profilo di espressione complesso che
coinvolge diversi territori dell’embrione durante lo sviluppo embrionale.
Innanzitutto è interessante notare che, contrariamente ai dati della
letteratura riferita all’espressione genica nell’organismo adulto di specie
di mammifero, l’espressione dei geni, durante lo sviluppo embrionale del
pesce zebra, non è ubiquitaria, come dimostra il segnale di ibridazione
ristretto a specifici tipi cellulari, ad esempio, nella retina a 72 ore di
sviluppo o l’assenza del segnale nelle cellule dei muscoli del tronco e
della coda. Se, invece, si analizza l’espressione nell’adulto si osserva che
il trascritto è presente in tutti i tessuti analizzati compresi i muscoli del
22
Protimosina alfa: discussione
tronco. Questi dati sono in accordo con i risultati di Franco del Amo e
Freire (1995) che avevano già dimostrato come nello sviluppo embrionale
del ratto, l’espressione genica della protimosina alfa fosse ristretta a
determinati tessuti, in particolare, di origine ectodermica e mesodermica.
Guardando nel dettaglio l’espressione dei due paraloghi del pesce zebra,
si osserva che il profilo temporale e spaziale è simile ma non identico.
Infatti, entrambi i geni sono espressi principalmente nel sistema nervoso
centrale e nella regione faringea. Solo ptmab presenta un'espressione di
origine materna, come dimostrato dalla presenza del trascritto a 4 ore di
sviluppo, dato che nel pesce zebra la trascrizione zigotica inizia intorno
alle 3-4 ore dopo la fecondazione. Le differenze più evidenti si
manifestano nel sistema nervoso periferico dove solo ptmaa è espresso
nel ganglio trigeminale, mentre solo ptmab nei neuromasti che
compongono la linea laterale del pesce. Durante il periodo di faringula
ptmaa e ptmab sono evidentemente espressi nella retina dove allo stadio
larvale il segnale d’ibridazione si restringe a specifici tipi cellulari: ptmaa
si esprime esclusivamente nelle cellule amacrine, ptmab, invece,
principalmente nelle cellule orizzontali. E’ interessante osservare anche
l’andamento dell’espressione nei dotti pronefrici, dove entrambi i geni
sono espressi durante il periodo di formazione dei somiti ma solo ptmaa
restringe drasticamente l’espressione ai soli corpuscoli di Stannius.
Durante questo periodo, inoltre, i geni ptmaa e ptmab si esprimono ai lati
del rombencefalo nella regione dei precursori cellulari della futura
faringe, alla cui formazione concorrono cellule che originano da tutti e tre
i foglietti embrionali, ectodermico, tra cui le creste neurali in migrazione,
mesodermico ed endodermico. Anche in questo territorio si manifesta una
significativa differenza nel profilo di espressione dei due paraloghi, infatti
23
Protimosina alfa: discussione
solo ptmaa si esprime nei sacchetti endodermici durante tutte le fasi del
loro sviluppo. Allo stadio di larva, infine, il gene ptmaa si esprime nei
primordi del timo, mentre manca in questo territorio l'espressione di
ptmab. In definitiva i due paraloghi mostrano un profilo di espressione
piuttosto complesso, dal quale si evince che i meccanismi di regolazione
trascrizionale dei due paraloghi, a partire dalla duplicazione genica, si
sono evoluti determinando una parziale diversificazione, poiché, mentre
in alcuni territori i due geni sono coespressi, in altri la presenza dei
rispettivi trascritti è mutualmente esclusiva.
Se si confronta il profilo di espressione dei geni ptma del pesce zebra con
il profilo dell'omologo gene del topo durante lo sviluppo embrionale
(Franco del Amo e Freire, 1995) si evince come alcuni aspetti siano
perfettamente conservati. Innanzitutto condividono l'espressione nel
sistema nervoso centrale, che è il principale territorio in cui si rinviene il
trascritto, ed in vari territori dove vi è un'attiva proliferazione cellulare,
che come sottolineato nell'introduzione è una delle funzioni cardine
accreditata alla protimosina alfa. Ad esempio, tra questi territori vi è
l'abbozzo delle pinne pettorali per il pesce zebra, o l'abbozzo degli arti
anteriori per il topo, e l'abbozzo della coda. Come nel topo, anche nel
pesce zebra i geni sono espressi nella regione faringea dove è intrigante
l'espressione nelle creste neurali in migrazione che rivestono un ruolo
fondamentale per la formazione della futura faringe, contribuendo alla
formazione della cartilagine, dell'endotelio dei vasi sanguigni e dei nervi.
E' interessante richiamare all'attenzione che in letteratura sono presenti
studi in topo, che indicano la regolazione trascrizionale del gene della
protimosina alfa sotto il controllo di alcuni membri della famiglia di
oncogeni myc (Eilers e al., 1991; Gaubats e al., 1994; Sasaki e al., 2001).
24
Protimosina alfa: discussione
Questa correlazione è stata osservata anche durante lo sviluppo
embrionale del topo, dove il profilo d'espressione di c-myc e n-myc
coincide con quello della protimosina alfa, facendo ipotizzare che la loro
funzione sia strettamente legata tanto nell'adulto quanto nello sviluppo
embrionale (Moll e al., 1996). Nello sviluppo embrionale del pesce zebra
alcuni geni myc (mych, cmyc e nmyc) sono espressi in diversi territori in
cui sono presenti anche i trascritti per i due paraloghi della protimosina
alfa analizzati nel presente lavoro, tra essi varie regioni del sistema
nervoso centrale, della retina e della regione faringea, dove sarebbero
coinvolti nella proliferazione cellulare o, come è stato direttamente
dimostrato per mych, nella sopravvivenza cellulare delle creste neurali
(Loeb-Hennard e al., 2005; Bessa e al., 2008; Hong e al., 2008). In
assenza di studi funzionali in cui valutare la relazione tra i geni per la
protimosina alfa e i geni myc, le nostre analisi possono solo far
immaginare che anche durante lo sviluppo embrionale del pesce zebra la
protimosina alfa viene ingaggiata per svolgere diversi ruoli che
abbracciano la proliferazione, il differenziamento e la sopravvivenza
cellulare.
I dati appena presentati sono oggetto di una pubblicazione scientifica
sulla rivista Developmental Dynamics (Donizetti e al., 2008a).
25
Relassina-3: introduzione
2.0 RELASSINA-3
2.1 INTRODUZIONE
La relassina-3 (RLN3) è l’ultimo membro della famiglia dei peptidi
relassina ad essere stato identificato (Bathgate e al., 2002). Ad oggi,
nell'uomo, sono noti 7 geni per i membri di questa famiglia di cui tre per
le relassine (relassina-1, relassina-2 e relassina-3) e 4 per i peptidi
insulino-simili (INSL). I geni RLN1 e RLN2 sono ritenuti un prodotto di
duplicazione genica avvenuta esclusivamente nella linea dei primati, a cui
corrisponderebbe nelle altre specie un unico gene denominato Rln1
(Bathgate e al., 2006). Per ragioni storiche, quindi, RLN2 dell'uomo e
delle grandi scimmie equivale a Rln1 degli altri mammiferi, e per evitare
confusioni entrambe le molecole vengono comunemente chiamate
“relassina”. Il nome deriva dall'azione esercitata sull'apparato riproduttivo
femminile durante la gravidanza, infatti, la relassina fu identificata più di
ottanta anni fa, quando Hisaw osservò che l'iniezione di siero, proveniente
da femmine gravide di porcellino della guinea o coniglio in femmine di
porcellino vergini, induceva il rilassamento del legamento pubico e
modifiche all'apparato riproduttivo femminile necessarie per agevolare il
parto (Hisaw, 1926).
La relassina presenta caratteristiche strutturali simili all'insulina e
nonostante la percentuale di similarità amminoacidica sia relativamente
bassa si ipotizza una comune origine a partire da un unico gene
ancestrale: entrambe le molecole vengono sintetizzate come proormoni
composti da un peptide segnale e dai domini B-C-A, di cui C viene
rimosso dopo la maturazione; all'interno dei domini B e A, che
costituiscono l'ormone maturo, vi sono 6 cisteine altamente conservate tra
26
Relassina-3: introduzione
le quali si instaurano 2 ponti disolfuro intercatena e un ponte disolfuro
intracatena nel dominio A (Bathgate e al., 2006), inoltre, la relassina è
caratterizzata da una sequenza consenso necessaria all'interazione con il
recettore (RxxxRxxI/V), presente all'interno del dominio B (Büllesbach e
Schwabe, 2005) (fig. 6).
Figura 6. Rappresentazione schematica della
struttura del precursore della relassina. In figura si
possono osservare il peptide segnale ed il peptide C
rimossi con la maturazione della molecola. A seguito
dei tagli proteolitici la molecola sarà composta dai
domini B e A legati da 2 ponti disolfuro intercatena e
uno intracatena. Nel dominio B è presente il motivo
di interazione con il recettore. C: cisteina, I:
isoleucina, R: arginina, V: valina, x: amminoacido
qualunque.
La maggior parte degli studi sulle relassine, spinti anche da un forte
interesse
della
ricerca
farmacologica,
riguardano
la
relassina
propriamente detta, un ormone peptidico circolante principalmente
27
Relassina-3: introduzione
prodotto dal corpo luteo dell’ovario e dalla placenta e come detto sopra,
già dagli inizi della sua scoperta identificato come ormone della
gravidanza, grazie alla sua azione sul rimodellamento dell'apparto
riproduttivo femminile durante la gravidanza (Sherwood, 2004; Bathgate
e al., 2006).
L'importanza della relassina nella fisiologia della riproduzione è
dimostrata dai topi femmine mutanti per il suo gene che mostrano
un'anormale sviluppo della sinfisi pubica, della ghiandola mammaria, dei
capezzoli ed in generale degli organi riproduttivi con conseguenti
problemi al parto e alla sopravvivenza dei nascituri (Zhao e al., 1999). La
relassina è prodotta anche nel tratto riproduttivo maschile e la sua assenza
in topi mutanti determina anche in tal caso problemi agli organi
riproduttivi con conseguenti effetti sulla fertilità (Gunnersen e al., 1995;
Samuel e al., 2003).
A differenza della relassina, i dati relativi alla relassina-3 sono molto più
esigui poiché l’identificazione risale solo al 2002 ed è avvenuta grazie
alla presenta dei motivi strutturali caratteristici delle relassine, quali i
residui di cisteina necessari per la formazione dei ponti disolfuro, il
motivo conservato RxxxRxxI/V, fondamentale per il legame al recettore e
l'organizzazione strutturale fatta di un peptide segnale, due catene B e A
separate da un peptide C (Bathgate et al., 2002). Già dalla sua
identificazione la relassina-3 si mostrava particolarmente diversa dagli
altri membri della famiglia, infatti, il gene codificante è principalmente
espresso nel cervello, mentre il trascritto è assente nei tessuti riproduttivi
femminili come ovario e placenta, che sono invece i principali siti di
produzione della relassina (Bathgate et al., 2002; Liu et al., 2003). Questa
importante differenza fece immaginare una diversa funzione della
28
Relassina-3: introduzione
relassina-3 rispetto agli altri membri della famiglia il cui ruolo è legato
alla riproduzione. Studi ultrastrutturali, basati sull'uso di anticorpi contro
la relassina-3, hanno dimostrato che nel cervello la molecola è localizzata
all'interno di vescicole nel pericario di alcuni neuroni e nelle terminazioni
sinaptiche degli assoni, suggerendo che venga prodotta nel soma,
convogliata lungo le direttive assoniche ed infine rilasciata nella fessura
sinaptica funzionando come neurotrasmettitore (Tanaka e al., 2005).
L'espressione nel cervello dei mammiferi è estremamente ristretta ad un
gruppo di neuroni chiamato nucleo incerto (Bathgate et al., 2002; Burazin
e al., 2002; Liu e al., 2003). Nel ratto, tale struttura neurale si trova nella
sostanza grigia rombencefalica in prossimità del quarto ventricolo, situata
all'estremità posteriore del rafe dorsale (Goto e al., 2001). Il nucleo
incerto ha destato particolare interesse da quando è stato riconosciuto
come il principale sito di espressione del gene per il recettore tipo 1 del
fattore di rilascio della corticotropina (CRF-R1) (Potter e al., 1994). Tale
fattore ed i peptidi ad esso correlati hanno un importante ruolo nel sistema
nervoso centrale nel mediare le risposte comportamentali allo stress. La
via classica attribuita alla risposta mediata da CRF riguarda l'asse
ipotalamo-ipofisi-ghiandola adrenale con il conseguente rilascio di
glucocorticoidi. CRF agisce anche tramite una via extraipotalamica, come
neurotrasmettitore/neuromodulatore, dove è implicato nella risposta
autonoma allo stress. La posizione periventricolare dei neuroni del nucleo
incerto ha fatto ipotizzare che questa struttura possa essere influenzata dal
CRF circolante nel liquido cerebrospinale, che proprio tramite la via
extrapituitaria agirebbe sul nucleo incerto per influenzare le risposte
comportamentali allo stress (Tanaka e al., 2005). Inoltre, l'analisi delle
fibre nervose che afferiscono al nucleo incerto ha mostrato che tale
29
Relassina-3: introduzione
struttura è in una posizione strategica per integrare le informazioni
provenienti
da
distretti
fondamentali
per
la
pianificazione
del
comportamento (tra cui la corteccia prefrontale), mentre le fibre efferenti
che si dipartono dal nucleo incerto fanno intendere che tale struttura possa
esercitare un controllo sull'attività prefrontale ed ippocampale, dove
potrebbe influenzare il ritmo tetha, e su altre strutture implicate in altri
processi quali la locomozione, lo stato di attenzione e di apprendimento
(Goto e al., 2001; Olucha-Cordonau e al., 2003). L'uso di anticorpi contro
la relassina-3 e di sonde ad RNA per il suo recettore (Rxfp3), hanno
avallato ulteriormente l'ipotesi che la relassina-3 funzioni come
neurotrasmettitore per il nucleo incerto, infatti, l'analisi della distribuzione
delle fibre nervose positive all'anticorpo è in accordo con la descrizione
delle fibre efferenti che si dipartono dal nucleo incerto e la distribuzione
di queste fibre si sovrappone, quasi completamente, con la distribuzione
del trascritto per il recettore Rxfp3, facendo ipotizzare che il nucleo
incerto utilizzi la relassina-3 come un neurotrasmettitore tramite l'azione
del recettore Rxfp3 (Tanaka e al., 2005; Ma e al., 2007).
Al di là dei dati neuroanatomici, vi sono diverse evidenze sperimentali
che dimostrano il ruolo della relassina-3 nel funzionamento del nucleo
incerto. Infatti, nei topi, iniezioni di relassina-3 intracerebroventricolari o
nell'ipotalamo, uno dei principali siti di espressione di Rxfp3, provocano
un aumento significativo dell’assunzione di cibo anche in animali saziati
(McGowan e al., 2005; 2006). Iniezioni intracerebroventricolari di CRF
nei cervelli dei topi aumentano l'espressione di c-Fos in più della metà
delle cellule del nucleo incerto che esprimono la relassina-3, e, inoltre, a
seguito di stress fisici, quali l'immersione forzata in acqua, aumenta
l'espressione genica di c-Fos e della relassina-3 nel nucleo incerto,
30
Relassina-3: introduzione
facendo ipotizzare una relazione diretta tra CRF e la relassina-3 nella
risposta allo stress (Tanaka e al., 2005). Recentemente la relassina-3 è
stata messa in relazione al sistema della serotonina durante lo sviluppo
embrionale del ratto. In particolare, l'analisi della distribuzione del
trascritto ha dimostrato che l'espressione del gene per la relassina-3 è
circoscritta a due gruppi di cellule bilaterali ai lati del ventricolo
rombencefalico che presumibilmente corrispondono al nucleo incerto di
un cervello adulto. Inoltre, bloccando la sintesi della serotonina mediante
l'uso di un opportuno inibitore, gli autori hanno osservato un aumento dei
livelli del trascritto per la relassina-3 nei neuroni del nucleo incerto
(Miyamoto e al., 2008).
L'azione della relassina-3 si esercita, come già accennato sopra, tramite
l'interazione con il recettore Rxfp3, sebbene diverse evidenze sperimentali
non fanno escludere che la molecola possa agisca anche tramite il
recettore Rxfp1, specifico per la relassina, dal momento che è capace di
interagire con esso e di attivarlo (Sudo e al., 2002). Ambedue i recettori
sono stati identificati a partire dal 2002 e appartengono alla famiglia dei
GPCRs (G protein-coupled receptors). In particolare, Rxfp3 fu
inizialmente identificato come recettore orfano caratterizzato da
un’elevata espressione nel cervello, principalmente nella substantia nigra
e nella ghiandola pituitaria (ipofisi), con bassi livelli di espressione nei
tessuti periferici (Matsumoto et al., 2000). Solo successivamente fu
identificata la relassina-3 come ligando di Rxfp3, grazie alla purificazione
di un estratto di cervello di maiale capace di stimolare cellule che
esprimevano elevati livelli di Rxfp3 (Liu e al., 2003). Dal punto di vista
strutturale i due recettori sono molto diversi. Rxfp1 è un GPCR di classe I
(rodopsina-simile) appartenente alla famiglia degli LGR, ed è
31
Relassina-3: introduzione
caratterizzato da un grosso dominio extracellulare in cui risiedono 10
domini ricchi in leucina (LRR) e un modulo LDLa all’ammino-terminale
(Hsu e al., 2000). Rxfp1 è espresso non solo nei tessuti riproduttivi dove
agisce la relassina, ma anche in altri territori tra cui il cervello, in
particolare, nel bulbo olfattivo, neocorteccia, regione limbica, ipotalamo,
talamo, mesencefalo, regione dei ponti e midollo (Ma e al., 2006). Proprio
l'espressione di Rxfp1 nel cervello, non permette di escludere, in assenza
di evidenze sperimentali, che la relassina-3 possa agire anche tramite tale
recettore nel sistema nervoso centrale.
Rxfp3 è anch'esso un GPCR, ma a differenza di Rxfp1 presenta un
dominio ammino-terminale extracellulare relativamente piccolo. Il gene
Rxfp3 si esprime in un numero ridotto di tessuti, tra cui il cervello, dove,
esperimenti di ibridazioni in situ mostrano il trascritto principalmente
localizzato nell’ipotalamo, nella corteccia sensoriale, nell'amigdala, nel
bulbo olfattivo e in altri territori (Ma e al., 2007).
La presenza di due diversi recettori per la relassina-3 nel cervello
complica l'interpretazione dei risultati ottenuti da esperimenti di iniezioni
intracerebroventricolari e intraipotalamiche della molecola, che come
precedentemente descritto, mostravano l'influenza della relassina-3
sull'assunzione di cibo. Recentemente è stata sintetizzata una molecola
chimerica (R3/I5) formata dal dominio B della relassina-3 e dal dominio
A di INSL5, che è capace di interagire specificamente con il recettore
Rxfp3 e non con Rxfp1; iniezioni intracerebroventricolari di R3/I5 sono
capaci di indurre gli stessi effetti della relassina-3 sull'assunzione di cibo,
dimostrando che, almeno per quanto riguarda tale effetto, l'azione della
molecola è esercitata tramite il recettore Rxfp3 (Kuei e al., 2007).
32
Relassina-3: scopo della ricerca
2.2 SCOPO DELLA RICERCA
La maggior parte dei dati sperimentali riguardanti le relassine si
riferisce ai mammiferi e alla funzione che rivestono nell'organismo
adulto. Infatti, solo nel 2001, il dott. Gianluca De Rienzo del gruppo del
prof. Minucci della Seconda Università di Napoli, in collaborazione con il
prof. Francesco Aniello, ha identificato per la prima volta in un vertebrato
non mammifero, l'anfibio Rana esculenta, il cDNA di un membro della
famiglia delle relassine. Tale molecola denominata RLF (Relaxin Like
Factor) è composta da un peptide segnale, da domini B e A separati da un
peptide C, e presenta le sei cisteine conservate tipiche della famiglia delle
relassine. Il dott. De Rienzo, inoltre, ha dimostrato che l'espressione
genica nel testicolo della Rana esculenta è ristretta alle cellule di Leydig
ed è correlata alla produzione degli androgeni (De Rienzo e al., 2001).
Dopo questo studio, che identificava il gene omologo più ancestrale nei
vertebrati, i progetti di sequenziamento nucleotidico hanno permesso di
identificare le relassine in diversi organismi appartenenti a diverse classi
di vertebrati. Questi avanzamenti hanno permesso di formulare ipotesi
sulla storia evolutiva della famiglia delle relassine, sebbene l'analisi
filogenetica sia stata complicata dall'elevata variabilità delle sequenze
primarie e dalla scarsa lunghezza delle sequenze amminoacidiche utili per
l'analisi filogenetica, dato che si riducono ai soli domini funzionali, B ed
A, che rientrano nella molecola matura. L'ipotesi più accreditata indica
che la famiglia delle relassine si sia evoluta a partire da un unico gene
ancestrale rln3-simile, che a seguito di due eventi di duplicazione
segmentale avrebbe generato 4 geni già presenti nel genoma dei pesci
prima della separazione dai tetrapodi (Hsu, 2003; Wilkinson e al., 2005).
Inoltre, le analisi filogenetiche mettono in luce la forte pressione selettiva
33
Relassina-3: scopo della ricerca
che l'evoluzione ha esercitato sulla relassina-3, mantenendone la sequenza
amminoacidica dei domini B ed A praticamente invariata nelle varie
specie, sottolineandone l'importanza che riveste la sua funzione
conservata nei vertebrati (Bathgate e al., 2003). Queste osservazioni
rendono particolarmente intrigante lo studio dell'espressione genica e
della funzione della relassina-3 nei pesci, al fine di ottenere ulteriori dati
utili a comprendere l'evoluzione di questo gene. A questo proposito, ho
deciso di analizzare, nel presente lavoro di tesi, il profilo d'espressione
genica della relassina-3 nel modello sperimentale Danio rerio, detto
anche pesce zebra. Inoltre l'analisi dei territori in cui la relassina-3 si
esprime in tale organismo potrà fornire la base per lo studio della
funzione della relassina-3 in un modello sperimentale più semplice e
versatile dei modelli sperimentali fino ad oggi usati per lo studio delle
relassine. In aggiunta, tenendo in considerazione la scarsità di dati relativi
all'espressione durante lo sviluppo embrionale, l'indagine sarà compiuta
specificamente nel contesto dell'embriogenesi.
34
Relassina-3: risultati
2.3 RISULTATI
2.3.1 Identificazione e clonaggio dei cDNA
La sequenza nucleotidica del genoma del pesce zebra è ancora in fase di
aggiornamento, per cui ho ritenuto necessario, innanzitutto, procedere ad
una ricerca in banca dati per identificare eventuali sequenze delle
relassine non ancora note alla letteratura. La ricerca condotta a partire
dalle sequenze amminoacidiche delle relassine del pesce zebra già
depositate in banca dati ha prodotto il ritrovamento di una molecola. Sulla
basa della sequenza nucleotidica ho disegnato due oligonucleotidi di
innesco per amplificare la regione codificante la nuova relassina. Come
stampo della reazione di amplificazione ho usato cDNA, preparato a
partire da RNA totali estratti da embrioni a 24 ore di sviluppo.
Successivamente ho clonato il prodotto di amplificazione nel vettore
pGEM®-T-Easy ed infine ne ho determinato la sequenza nucleotidica.
L'allineamento delle sequenze amminoacidiche dei peptidi B ed A delle
relassine del pesce zebra già note e della molecola neoidentificata
(indicata con il punto interrogativo nella figura 7A) mostra come
quest’ultima contenga il motivo di interazione con il recettore e le sei
cisteine dei ponti disolfuro (fig. 7A). Dall'allineamento si evince inoltre
che i domini B e A della nuova relassina sono quasi identici a quelli della
relassina-3, permettendomi di ipotizzare che si tratti del prodotto di un
gene paralogo. L'allineamento dell'intera sequenza amminoacidica delle
due relassine-3, che ho chiamato Rln3a e Rln3b, mediante il programma
bioinformatico ClustalW, mostra una percentuale di similarità del 70%, e
che, a differenza del resto della molecola, i peptidi B ed A sono
estremamente più conservati (fig. 7B). Usando le sequenze nucleotidiche
35
Relassina-3: risultati
Figura 7. A. Allineamento delle sequenze amminoacidiche dei domini
B ed A dei 4 membri della famiglia delle relassine del pesce zebra
(Rln3, Insl5a, Insl5b, Insl3) già noti in letteratura e della nuova
sequenza indicata con il punto interrogativo, mediante il programma
ClustalW. B. Allineamento amminoacidico dell'intera sequenza delle
relassine Rln3a e Rln3b. Gli amminoacidi identici sono indicati
dall'asterisco, le sostituzioni conservative e semiconservative sono
indicate rispettivamente con i due punti e il punto singolo. I trattini
rappresentano gli intervalli introdotti dal programma per ottenere il
miglior allineamento. C. Struttura genica in esoni ed introni del gene
per la relassina-3 nell'uomo (Hs RLN3) e nel pesce zebra (Dr rln3a,
Dr rln3b).
36
Relassina-3: risultati
dei cDNA delle due relassine-3 ho identificato nella banca dati Ensembl
le corrispondenti sequenze genomiche. Come si osserva dalla figura 7C
l’organizzazione esone-introne di entrambi i geni è perfettamente
conservata se paragonata a quella dell’ortologo umano.
2.3.2 Espressione durante l'embriogenesi
2.3.2a Profilo temporale di espressione genica
Il clonaggio della sequenza nucleotidica della relassina-3b (Rln3b) a
24 ore di sviluppo indicava che il trascritto era presente a quello stadio.
Per estendere il profilo d'espressione all'intero sviluppo embrionale per
entrambi i geni, rln3a e rln3b, ho eseguito reazioni di RT-PCR usando
come stampo cDNA preparato da embrioni a vari stadi di sviluppo, da 4 a
72 ore dopo la fecondazione. Come si osserva dalla figura 8 il trascritto
per Rln3a è presente già al primo stadio di sviluppo preso in esame (4
ore), mentre è assente durante il periodo di gastrulazione (8 ore). La
trascrizione riprende con il periodo di formazione dei somiti e continua
fino a 72 ore di sviluppo, mostrando un aumento dei livelli del trascritto
con l'inizio del periodo di faringula (24 ore) che si mantengono costanti
fino all'ultimo stadio di sviluppo analizzato. Il trascritto del gene rln3b
risulta presente in ogni stadio embrionale analizzato con livelli di
intensità del prodotto di amplificazione relativamente bassi, fatta
eccezione per il periodo di formazione dei somiti e la fase finale del
periodo di faringula, quando il trascritto risulta essere più abbondante
(fig. 8).
2.3.2b Profilo spaziale di espressione genica: rln3a
All'inizio dello sviluppo embrionale la distribuzione del trascritto del gene
rln3a è diffusa in tutte le cellule dell'embrione (fig. 9A), mentre durante la
37
Relassina-3: risultati
Figura 8. Profilo temporale d'espressione dei geni
rln3a e rln3b del pesce zebra. In figura è riportata la
corsa elettroforetica delle reazioni di RT-PCR a vari
stadi di sviluppo embrionale. In alto sono riportate
le ore dopo la fecondazione. Come controllo
sperimentale è stata usata l'amplificazione del cDNA
della proteina ribosomale Rplp0.
gastrulazione (fig. 9B) il trascritto è assente come atteso dai risultati di
RT-PCR. Nel periodo della somitogenesi, l'espressione si restringe alla
parte anteriore del sistema nervoso centrale dell'embrione,dove non è
possibile distinguere territori preferenziali di trascrizione (fig. 9C). Nelle
fasi iniziali del periodo di faringula, è più evidente la distribuzione
uniforme del trascritto nel cervello (fig. 9D). Durante il periodo
di
faringula si ha un cambiamento drastico nel profilo d'espressione di
questo gene. Infatti, il trascritto, che è diffuso negli stadi iniziali (fig. 9D),
si circoscrive successivamente a due ristretti gruppi di cellule nella
regione del tegumento mesencefalico, come indicato dalla freccia rossa in
figura 9E. Questa condizione di espressione ristretta permane anche negli
stadi successivi, 48, 72 e 96 ore di sviluppo, quando un crescente numero
38
Relassina-3: risultati
Figura 9. Ibridazione in situ su embrioni interi per il gene rln3a agli
stadi indicati dalle ore dopo la fecondazione. A-F, M: visione laterale
dell'embrione. G, I, N: visione dorsale dell'embrione. J, K: sezioni
trasversali di embrioni ibridati come indicato dalle linee nere in I. L:
ingrandimento di una sezione trasversale all'altezza del segnale
d'ibridazione visibile in K. Ce, cervelletto; gp, grigio
periacqueduttale; i, ipotalamo; M, midollo allungato; R, rafe; T,
tegumento; TeO, tetto ottico; vo, vescicola otica; Vre, ventricolo
rombencefalico.
di cellule esprime il gene (fig. 9F, G, H, I, M, N). Al fine di identificare
con maggiore precisione la posizione anatomica dei gruppi di cellule che
esprimono rln3a, ho effettuato sezioni trasversali degli embrioni ibridati.
Come mostrato in figura 9J i due gruppi di cellule si posizionano nella
regione dorsale e laterale del tegumento a ridosso del ventricolo
mesencefalico. Ad una prima analisi ho ritenuto che la posizione di questo
gruppo
di
cellule
fosse
compatibile
39
con
la
zona
del
grigio
Relassina-3: risultati
periacqueduttale, un'importante struttura del cervello dei vertebrati, sino
ad oggi mai descritta nel pesce zebra.
L'ibridazione in situ mostra, inoltre, che a partire dalle 72 ore di sviluppo
il gene rln3a è espresso anche in un altro ristretto gruppo di cellule,
situato nella regione a cavallo tra il tegumento ed il midollo allungato
(fig. 9H, I, M, N). Nella sezione trasversale queste cellule si mostrano
raggruppate nella regione centrale della zona grigia (fig. 9K) e disposte in
due colonne bilaterali intorno al quarto ventricolo, come meglio mostrato
nell'ingrandimento (fig. 9L).
Al fine di identificare con maggiore dettaglio le cellule neurali che
esprimono il gene rln3a nel cervello del pesce zebra, sono passato ad una
seconda fase dello studio in cui ho ricercato una serie di marcatori genici
da utilizzare per una descrizione anatomica più precisa. Per quanto
riguarda il grigio periacqueduttale, non vi è alcuna descrizione di questo
territorio nel pesce zebra e quindi nessun marcatore genico è stato
descritto in letteratura. In ratto, invece, è noto che il grigio
periacqueduttale è caratterizzato dall'espressione delle proencefaline,
precursori di oppioidi endogeni coinvolti nei meccanismi di controllo del
dolore (Lovick, 2008). Tenuto conto di ciò, ho valutato se i geni per le
proencefaline fossero buoni candidati come marcatori per quel territorio
anche nel pesce zebra, dove sono noti due geni paraloghi, penk e penkl
(Gonzalez Nuñez e al., 2003). Disegnati glioligonucleotidi di innesco
specifici per i due trascritti ho effettuato esperimenti di RT-PCR su RNA
estratti da embrioni a 72 ore di sviluppo, per amplificare le regioni di
cDNA
di
interesse
e
clonarle
nel
vettore
pGEM®-T-Easy.
Successivamente, sfruttando questi plasmidi ricombinanti, ho sintetizzato
sonde ad RNA marcate con fluoresceina da usare in esperimenti di
40
Relassina-3: risultati
ibridazione in situ, per individuare i territori di espressione dei geni penk
e penkl. In particolare, ho eseguito l’ibridazione in situ su embrioni allo
stadio di larva (72 ore), cioè quando l'espressione di rln3a è ben evidente.
Il gene penk presenta un'espressione ristretta a specifici gruppi di cellule
particolarmente evidenti solo nella regione rombencefalica, mentre nella
regione mesencefalica il segnale di ibridazione è così debole da farmi
escludere l'utilizzo di questa sonda in esperimenti di doppie ibridazioni in
situ con rln3a (dati non mostrati). Il gene penkl, invece, mostra diversi
territori di espressione tra cui la regione mesencefalica, dove sono molto
evidenti due gruppi di cellule che probabilmente rappresentano il grigio
periacqueduttale (fig. 10A). Esperimenti di doppia ibridazione in situ
effettuati su embrioni a 72 ore di sviluppo, con le sonde per i geni rln3a e
penkl, dimostrano chiaramente la colocalizzazione dei due trascritti
dimostrando che il gene rln3a si esprime nel grigio periacqueduttale (fig.
10B).
Per quanto riguarda il gruppo di cellule che esprimono il gene rln3a nella
regione rombencefalica, ho innanzitutto cercato di definire con maggiore
precisione il territorio di appartenenza mediante la comparazione
anatomica con gruppi di neuroni ben precisi. Allo scopo, ho utilizzato il
gene per l'enzima triptofano-idrossilasi (tphR) come marcatore del rafe
dorsale nel mesencefalo, il gene per l'ormone di rilascio della
corticotropina (crh) e per la sua proteina di legame (crh-bp) per marcare
rispettivamente il locus coeruleus ed il rafe superiore nella cosiddetta
“regione dei ponti”. Gli esperimenti di doppia ibridazione in situ
mostrano che il gruppo di cellule marcate dall’espressione di rln3a è
situato posteriormente al rafe dorsale (fig. 10C, D) e confinato nella parte
rostrale della regione dei ponti, come evidenziato dalla relazione spaziale
41
Relassina-3: risultati
Figura 10. Ibridazione in situ su embrioni interi con marcatori genici
di specifici territori neurali. A. espressione del gene penkl nel cervello
di embrioni a 96 ore di sviluppo. B. doppia ibridazione in situ per
rln3a (blu) e penkl (arancio). C-H: doppia ibridazione in situ su
embrioni a 72 ore di sviluppo. rln3a (blu), tphR (arancio, C, D), crh
(arancio, E, F), crh-bp (arancio, G, H). I: comparazione di singole
ibridazioni in situ per crhr1 e rln3a. J, K: sezioni trasversali di
embrioni ibridati con la sonda antisenso per crhr1 come indicate dalla
linea nera in I e ingrandimento come indicato in J. L: ingrandimento
della sezione trasversale di embrioni ibridati con la sonda antisenso per
rln3a effettuata a livello del nucleo incerto, come indicato dalla linea
nera in I. A, B, D, F, H, I: visione dorsale del cervello. C, E, G: visione
laterale del cervello. La testa della freccia blu indica i neuroni del
nucleo incerto. La testa della freccia blu/arancio indica la
colocalizzazione dei trascritti dei geni rln3a e penkl nel grigio
periacqueduttale. La testa della freccia arancio indica il rafe dorsale
(C, D), il locus coeruleus (E, F) ed il rafe superiore (G, H). Ce,
cervelletto; gp, grigio periacqueduttale; M, midollo allungato; R, rafe;
T, tegumento; vo, vescicola otica.
con il locus coeruleus (fig. 10E, F) ed il rafe superiore (fig. 10G, H). La
42
Relassina-3: risultati
localizzazione nella regione dei ponti e la distribuzione delle cellule
intorno al quarto ventricolo, messa in evidenza precedentemente, somiglia
alla descrizione dell’espressione della relassina-3 durante lo sviluppo
embrionale del cervello di ratto (Miyamoto e al., 2008). Queste
indicazioni mi hanno portato ad ipotizzare che il gruppo di cellule
rombencefaliche che esprimono il gene rln3a, rappresentino una struttura
omologa al nucleo incerto dei mammiferi. Questi neuroni, fino ad oggi,
sono stati identificati e descritti solo nei mammiferi, per cui non sono noti
nel pesce zebra marcatori genici utili a sostenere la mia ipotesi. Facendo
riferimento al ratto, dove il nucleo incerto è ben caratterizzato, è noto che
in tale struttura è particolarmente espresso il recettore tipo 1 del fattore di
rilascio della corticotropina (Crhr1). Sulla base di questo dato ho deciso
di rintracciare la sequenza del gene ortologo nel pesce zebra. In
particolare, ho utilizzato la sequenza amminoacidica del recettore di
Oncorhynchus keta (salmone) per analizzare la banca dati nucleotidica
dell'NCBI mediante il programma bioinformatico tBLASTn. La ricerca si
è conclusa con il ritrovamento di una putativa sequenza amminoacidica
del recettore tipo 1 di Crh, depositata in banca dati come predizione del
programma GNOMON. Sulla base della sequenza nucleotidica ho
disegnato gli inneschi per effettuare esperimenti di RT-PCR su RNA totali
estratti da embrioni a 72 ore di sviluppo. Il prodotto di amplificazione è
stato poi clonato nel vettore pGEM®-T-Easy e sequenziato per confermare
che l'inserto fosse la regione di cDNA d'interesse. Come per gli altri geni,
partendo da questo costrutto ho sintetizzato le sonde necessarie agli
esperimenti di ibridazione in situ, con i quali ho analizzato la
distribuzione spaziale del trascritto d'interesse. In particolare, gli
esperimenti di ibridazione condotti su embrioni a 96 ore di sviluppo
43
Relassina-3: risultati
hanno mostrato che l'espressione genica di crhr1 è piuttosto debole e
distribuita in diverse regione del cervello, tra cui si distingue un segnale
più forte nella regione rombencefalica (fig. 10I). Nonostante il segnale sia
troppo debole per ottenere buoni risultati in un esperimento di doppia
ibridazione in situ, la comparazione dei risultati delle singole ibridazioni
in situ per il gene crhr1 e per rln3a mostra chiaramente la corrispondenza
dei due gruppi di cellule nella regione rombencefalica (fig. 10I). Tale
corrispondenza si può osservare meglio comparando le sezioni trasversali
di embrioni ibridati con la sonda per il gene crhr1 (fig. 10J, K) e per il
gene rln3a (fig. 10L), supportando l'ipotesi che il gruppo di cellule da me
identificato costituisca una struttura omologa al nucleo incerto dei
mammiferi.
2.3.2c Profilo spaziale di espressione genica: rln3b
A 4 e 8 ore di sviluppo l'espressione di rln3b è evidentemente
diffusa in tutto l’embrione (fig. 11A, B). A partire dal periodo della
somitogenesi il trascritto si concentra nella parte anteriore del sistema
nervoso centrale (fig. 11C). Negli stadi iniziali del periodo di faringula
l'espressione continua a manifestarsi nel cervello ed in modo uniforme
(fig. 11D). Solo alla fine di questo periodo, intorno alle 48 ore di sviluppo
l'espressione si restringe drasticamente a due gruppi di cellule nella
regione mesencefalica (fig. 11E), dove permane anche negli stadi
successivi (fig. 11F, G, H). La doppia ibridazione in situ con la sonda per
rln3a dimostra che le cellule che esprimono rln3b nella regione
mesencefalica sono circoscritte al grigio periacqueduttale (fig. 11I, J).
Nessun altro segnale è stato rivelato per rln3b nel cervello del pesce zebra
anche spingendo i tempi di rivelazione a diversi giorni.
44
Relassina-3: risultati
Figura 11. Ibridazione in situ su embrioni interi per il gene rln3b
agli stadi indicati dalle ore dopo la fecondazione. A-F, I: visione
laterale dell'embrione. G, H, J: visione dorsale dell'embrione. A-H:
singola ibridazione in situ con la sonda antisenso per rln3b. I, J:
doppia ibridazione in situ per rln3a (blu) e rln3b (arancio). La
freccia rossa indica l'espressione nel grigio periacqueduttale. La
testa della freccia blu/arancio indica la colocalizzazione dei trascritti
per rln3a e rln3b nel grigio periacqueduttale.
2.3.3 Profilo temporale di espressione nell’adulto
Per analizzare il profilo di espressione dei due geni paraloghi della
relassina-3 nell'adulto, ho effettuato esperimenti di RT-PCR a partire da
RNA estratti da vari organi di individui adulti di pesce zebra dissezionati.
In particolare, ho utilizzato territori associati all'espressione delle
relassine nei mammiferi, quali il testicolo, l'ovario, il muscolo, il cervello,
e l'intestino. Come si osserva dalla figura 12, il gene rln3a si esprime
45
Relassina-3: risultati
esclusivamente nel cervello, mentre rln3b mostra un profilo più
complesso, dato che il prodotto di amplificazione si rinviene in tutti gli
organi analizzati ma con intensità maggiore nel testicolo e nel cervello
(fig. 12).
Figura 12. Profilo d'espressione dei geni rln3a e rln3b del
pesce zebra nei tessuti adulti. In figura è riportata la corsa
elettroforetica delle reazioni di RT-PCR nei vari tessuti.
Come controllo sperimentale è stata usata l'amplificazione
del cDNA della proteina ribosomale Rplp0.
2.3.4 Uno sguardo ai recettori
Allo scopo di avere un quadro completo non solo dei meccanismi di
regolazione trascrizionale, ma anche della funzione biologica che Rln3a e
Rln3b hanno nello sviluppo embrionale del pesce zebra, ho ritenuto
doveroso iniziare lo studio del profilo d'espressione genica dei recettori
46
Relassina-3: risultati
della relassina-3, Rxfp1 e Rxfp3.
2.3.4a Identificazione e clonaggio dei cDNA
Per identificare la sequenza nucleotidica del recettore Rxfp1 del
pesce zebra ho utilizzato la sequenza amminoacidica della proteina
umana, scandagliando la banca dati nucleotidica dell'NCBI mediante il
programma bioinformatico tBLASTn. In particolare, ho utilizzato la
sequenza amminoacidica del dominio extracellulare, dove risiedono le
principali caratteristiche distintive che permettono di classificare questo
recettore, così che la ricerca potesse restituire risultati particolarmente
significativi; il resto della molecola infatti è costituita principalmente dai
domini transmembrana la cui sequenza amminoacidica è condivisa da più
recettori di questo tipo. La ricerca mi ha permesso di identificare una
sequenza nucleotidica catalogata già in banca dati come predizione del
programma bioinformatico GNOMON, ma sulla quale non vi sono ancora
dati sperimentali. Allineando questa sequenza con quella del recettore
umano, era chiaro che mancava la regione amminoacidica che compone il
dominio LDLa che si trova all'estremità ammino-terminale della proteina.
Allo scopo di identificare tale sequenza ho affinato la ricerca
bioinformatica utilizzando esclusivamente la sequenza amminoacidica del
dominio LDLa e della regione fiancheggiante della proteina umana e ho
effettuato la ricerca nella banca dati Ensembl. Grazie a tale approccio
sono riuscito ad identificare una sequenza amminoacidica con un'elevata
percentuale d'identità con la corrispondente sequenza umana. Sulla base
delle sequenze nucleotidiche rintracciate con la mia ricerca, ho disegnato
una serie di oligonucleotidi d'innesco che mi permettessero di ottenere
l'intera sequenza codificante il recettore Rxfp1 del pesce zebra, mediante
47
Relassina-3: risultati
reazioni di amplificazione (PCR) su campioni di cDNA di embrioni a 48
ore di sviluppo. Una volta assemblate le sequenze dei cDNA clonati ho
proceduto alla traduzione bioinformatica della regione codificante e ho
effettuato un allineamento della sequenza amminoacidica così ottenuta
con la corrispondente proteina umana. La sequenza proteica da me
identificata ha un elevato valore percentuale di identità amminoacidica
con quella umana (74%) e possiede tutti i requisiti strutturali per essere
l'omologo del recettore Rxfp1 umano, come si osserva dall'allineamento
della figura 13A. In particolare, sono presenti il modulo LDLa e i dieci
domini ricchi in leucina che caratterizzano questi recettori, inoltre sono
conservati tutti gli amminoacidi che costituiscono il sito di legame al
ligando (in rosso nella figura 13A), ad eccezione di una sostituzione
semiconservativa in posizione 202. Poiché la struttura esone-introne del
gene RXFP1 umano è nota ed è costituito da 18 esoni, ho proceduto allo
studio della corrispondente struttura dell'ortologo gene del pesce zebra. In
particolare, partendo dalle sequenze nucleotidiche dei cDNA clonati e
sequenziati, ho identificato le corrispondenti sequenze genomiche
mediante analisi bioinformatiche nella banca dati nucleotidica Ensembl,
risalendo alla struttura genica come rappresentata nella figura 13B. Nel
genoma umano il primo esone è distante circa 50,6 kb e contiene solo 50
nucleotidi della regione codificante, mentre nel secondo esone risiede la
regione codificante il dominio LDLa (Muda e al., 2005), il gene rxfp1 del
pesce zebra, invece, è composto da 17 esoni, dove il primo contiene sia la
sequenza codificante il peptide segnale che il modulo LDLa; al di là di
questa differenza per tutti gli altri esoni vi è perfetta corrispondenza tra
uomo e pesce zebra, avvalorando l'ipotesi che la sequenza ritrovata sia del
recettore Rxfp1 (fig. 13B).
48
Relassina-3: risultati
Figura 13. A. Allineamento delle sequenze amminoacidiche del
recettore Rxfp1 del pesce zebra e dell'uomo mediante il programma
ClustalW. Gli amminoacidi identici sono indicati dall'asterisco, le
sostituzioni conservative e semiconservative sono indicate
rispettivamente con i due punti e il punto singolo. I trattini
rappresentano gli intervalli introdotti dal programma per ottenere il
miglior allineamento. B. Comparazione della struttura genica in esoni
ed introni del gene umano (Hs RXFP1) e del pesce zebra (Dr rxfp1).
49
Relassina-3: risultati
Con la stessa strategia ho effettuato la ricerca della sequenza
amminoacidica e nucleotidica di rxfp3 nel pesce zebra, usando la
sequenza proteica del recettore umano. In tal modo ha identificato più
sequenze nucleotidiche di cui 2 erano particolarmente interessanti sulla
base del valore di similarità amminoacidica delle corrispondenti proteine,
che in banca dati erano già riportate come simili al recettore Rxfp3. Dopo
aver dimostrato che ambedue i geni corrispondenti erano espressi a 48 ore
di sviluppo (dati non mostrati), ho concentrato la mia attenzione solo sul
gene codificante la proteina con la maggiore percentuale di identità
amminoacidica
con
il
recettore
umano.
Disegnando
ulteriori
oligonucleotidi d'innesco ho clonato la restante regione del cDNA che
mancava per avere la completa sequenza codificante. La sequenza
amminoacidica ricavata dalla traduzione bioinformatica dell'intera
sequenza
codificante
presenta
una
percentuale
di
similarità
amminoacidica pari al 56% quando allineata con la proteina umana (fig.
14A).
2.3.4b Profilo temporale di espressione genica
Utilizzando specifiche coppie di oligonucleotidi e cDNA preparati
da RNA di embrioni a vari stadi di sviluppo, ho eseguito reazioni di PCR
per risalire all'espressione temporale durante lo sviluppo embrionale del
pesce zebra dei geni rxfp1 e rxfp3. Dai risultati si evince che il trascritto
del gene rxfp1 è presente in ogni stadio embrionale analizzato, con
un'intensità della banda di amplificazione leggermente maggiore a 4 e 48
ore di sviluppo (fig. 14B). Anche lo specifico amplicone di rxfp3 è
presente in tutti i campioni analizzati con un'intensità costante nei vari
stadi ad eccezione delle 16 ore di sviluppo dove risulta leggermente
50
Relassina-3: risultati
Figura 14. A. Allineamento delle sequenze amminoacidiche del
recettore Rxfp3 del pesce zebra e dell'uomo mediante il programma
ClustalW. Gli amminoacidi identici sono indicati dall'asterisco, le
sostituzioni conservative e semiconservative sono indicate
rispettivamente con i due punti e il punto singolo. I trattini
rappresentano gli intervalli introdotti dal programma per ottenere il
miglior allineamento. B. Profilo temporale d'espressione dei geni rxfp1
e rxfp3 del pesce zebra. In figura è riportato il risultato delle reazioni
di RT-PCR a vari stadi di sviluppo embrionale. In alto sono riportate le
ore dopo la fecondazione. Come controllo sperimentale è stata usata
l'amplificazione del cDNA della proteina ribosomale Rplp0.
51
Relassina-3: risultati
inferiore (fig. 14B).
2.3.4c Profilo spaziale di espressione genica: rxfp1
Per una preliminare analisi dei territori di espressione genica,
effettuata mediante esperimenti di ibridazione in situ, ho focalizzato la
mia attenzione sul cervello durante l'embriogenesi, in considerazione
dell'espressione ristretta dei geni rln3a e rln3b dimostrata in precedenza.
A 24 ore di sviluppo, l'unico territorio d'espressione è confinato in un
gruppo di cellule tra il bulbo e il placode olfattivo, probabilmente cellule
del nervo terminale (fig. 15A, B). L'espressione in queste cellule permane
anche negli stadi successivi, 48 e 72 ore di sviluppo (fig. 15C-G). Alla
fine del periodo di faringula (48 ore) compaiono nuovi territori di
espressione nella regione diencefalica e nell'ipotalamo (fig. 15C, D). A 72
ore di sviluppo, l'espressione è allargata a diversi gruppi di cellule nella
regione diencefalica, nell'ipotalamo, nel tetto ottico, nel tegumento e nel
rombencefalo (fig. 15E, H).
2.3.4d Profilo spaziale di espressione genica: rxfp3
Anche in questo caso la mia attenzione è ricaduta sull'espressione
del gene nel cervello del pesce zebra durante lo sviluppo embrionale. Al
momento, gli unici stadi a cui è stato possibile ottenere segnali
d'ibridazione specifici sono a 48 e a 72 ore di sviluppo, cioè,
rispettivamente la fase finale del periodo di faringula e lo stadio larvale. A
48 ore si possono osservare tre gruppi di cellule che esprimono rxfp3,
distinguibili anche allo stadio successivo (fig. 16A-D, F). Uno di essi si
trova inequivocabilmente nel grigio periacqueduttale, come dimostra la
doppia ibridazione in situ con rln3a (fig. 16G). Gli altri due gruppi, ad
52
Relassina-3: risultati
Figura 15. Ibridazione in situ su embrioni interi per il gene rxfp1
agli stadi indicati dalle ore dopo la fecondazione. A, C, E: visione
laterale del cervello dell'embrione. B, D, F: visione ventrale della
regione del bulbo olfattivo. H: visione dorsale del cervello
dell'embrione. La testa della freccia nera indica l'espressione nel
nervo terminale. bo, bulbo olfattivo; d, diencefalo; i, ipotalamo; o,
placode olfattivo; T, tegumento; To, tetto ottico; r, rombencefalo.
una prima analisi, sembrano rappresentare i territori del rafe e del locus
coeruleus (fig. 16A, B, D, F). Infine, è interessante osservare come a 72
ore di sviluppo si evidenzia un altro territorio di espressione, dorsale al
rafe, che potrebbe essere il gruppo di neuroni del nucleo incerto (fig.
16E).
2.3.4e Espressione genica nei tessuti adulti
Esperimenti di RT-PCR effettuati su cDNA relativi a tessuti adulti
mostrano che il gene rxfp1 è espresso in tutti gli organi testati con un
livello d'espressione leggermente superiore nel cervello. Ugualmente
rxfp3 si esprime in tutti gli organi presi in esame mostrando un maggiore
livello del trascritto nel cervello e nell'intestino (dati non mostrati).
53
Relassina-3: risultati
Figura 16. Ibridazione in situ su embrioni interi per il gene rxfp3
agli stadi indicati dalle ore dopo la fecondazione. A, C: visione
laterale del cervello dell'embrione. B, D-G: visione dorsale del
cervello dell'embrione. D-F: foto a diversi piani focali come
indicato in C. G: doppia ibridazione in situ per rxfp3 (blu) e rln3a
(arancio). gp, grigio periacqueduttale; lc, locus coeruleus; ni,
nucleo incerto; R, rafe.
54
Relassina-3: discussione
2.4 DISCUSSIONE
I dati fino ad oggi disponibili sulle relassine si concentrano
principalmente sulla relassina propriamente detta, poiché la sua
identificazione risale a più di ottanta anni fa e le sue funzioni nella
fisiologia della riproduzione hanno attratto l'attenzione della ricerca
farmacologica. Poco si conosce invece sulla funzione della relassina-3 di
più recente identificazione. La maggior parte degli studi sono stati
compiuti sui mammiferi ed in particolar modo sugli organismi adulti,
mentre solo nel 2008 è possibile trovare i primi dati sull'espressione del
gene rln3 nello sviluppo embrionale del ratto (Miyamoto e al., 2008). Il
presente lavoro di tesi ha permesso di estendere la conoscenza sulla
relassina-3 ad un'altra classe vertebrati e cioè i pesci ossei. In particolare,
nel corso della mia indagine abbiamo dimostrato che nel genoma del
pesce zebra il gene rln3 risulta essere duplicato in due paraloghi che ho
denominato rln3a e rln3b. Poiché in tutte le altre classi di vertebrati è
presente un unico gene, si può ipotizzare che la duplicazione in questione
sia specifica della linea dei pesci. Se si osserva l'allineamento dell'intera
sequenza amminoacidica delle due relassine-3 del pesce zebra si può
osservare che i domini che prendono parte alla molecola matura sono
praticamente identici, ad eccezioni di pochi amminoacidi, mentre il resto
della molecola mostra una variabilità significativamente superiore. Tale
osservazione fa ipotizzare che entrambe le molecole siano funzionali, al
punto che durante l'evoluzione la pressione selettiva ne ha mantenuto
invariati i domini B ed A. L'analisi dell'espressione del gene rln3a mi ha
permesso di fare importanti scoperte nello sviluppo neurale del pesce
zebra. Infatti, rln3a si esprime in tutto il cervello durante le prime fasi del
suo sviluppo, mentre a partire dalle 40 ore dopo la fecondazione,
55
Relassina-3: discussione
l'espressione si restringe drasticamente a due gruppi di cellule
mesencefaliche. L'analisi delle sezioni trasversali e l'utilizzo di marcatori
genici opportunamente scelti, mi ha permesso di ipotizzare e confermare
che tali cellule sono confinate nel grigio periacqueduttale. Nei mammiferi
tale regione è legata all'azione analgesica degli oppioidi ed è coinvolta nei
meccanismi di modulazione del dolore (Lovick., 2008; Keay e Bandler;
1998), delle risposte comportamentali all'aggressione (Summers e
Winberg, 2006), ed inoltre è un elemento chiave di alcuni aspetti legati
alla comunicazione vocale di varie specie (Esposito e al., 1999) tra cui
anche il teleosteo Porichthys notatus (pesce cadetto) (Bass e McKibben,
2003; Kittelberger e al., 2006). Tale struttura non è mai stata descritta
nella neuroanatomia del pesce zebra, né durante lo sviluppo embrionale
né nell'adulto. La caratterizzazione di un marcatore quale rln3a, così
specificamente espresso in questa regione durante lo sviluppo embrionale,
costituisce un ottimo punto di partenza per studiare la formazione e la
funzione di tale struttura nelle prime fasi dell'embriogenesi.
A 72 ore di sviluppo il gene rln3a inizia ad esprimersi in un gruppo di
cellule
nella regione rombencefalica. La comparazione con il rafe
dorsale, il rafe superiore e il locus coeruleus mi hanno fatto concludere
che tali cellule si trovano nella regione dei ponti. Questa osservazione
unita alla distribuzione delle cellule intorno al quarto ventricolo, mi hanno
fatto ipotizzare di aver identificato una struttura omologa al nucleo
incerto dei mammiferi. La conferma alla mia ipotesi è venuta da
esperimenti di ibridazione in situ per il recettore tipo 1 del fattore di
rilascio della corticotropina, che nel ratto è particolarmente espresso nei
neuroni del nucleo incerto. Le evidenze sperimentali riportate nel presente
lavoro di tesi sono le prime riguardanti l'esistenza del nucleo incerto nei
56
Relassina-3: discussione
pesci, poiché tale struttura era nota esclusivamente nel cervello dei
mammiferi. L'espressione di rln3a nel cervello del pesce zebra è in
accordo con le ipotesi filogenetiche sulla funzione conservata nei
vertebrati della relassina-3 come neurotrasmettitore (Wilkinson e
Bathgate, 2007). Nel cervello di ratto durante lo sviluppo embrionale il
nucleo incerto costituisce il sito principale di produzione della relassina-3,
mentre solo poche cellule disperse esprimono il gene in altri territori tra
cui il grigio periacqueduttale (Myiamoto e al., 2008). Nel cervello del
pesce zebra invece l'espressione di rln3a è considerevole tanto nel grigio
periacqueduttale quanto nel nucleo incerto, facendo ipotizzare che la
funzione esercitata nel nucleo incerto dalla relassina-3 si sia conservata
durante l'evoluzione, mentre solo i pesci, o almeno il pesce zebra, hanno
mantenuto un elevato livello d'espressione del gene nel grigio
periacqueduttale.
Il confronto dell'espressione dei due paraloghi, rln3a e rln3b, mostra
similitudini e differenze rimarchevoli. Innanzitutto, già il profilo
temporale d'espressione fornisce la prova di una differenziazione dei
meccanismi di regolazione trascrizionale e/o di stabilità del trascritto.
Infatti entrambi gli mRNA sono di origine materna come dimostra la
presenza della banda di amplificazione a 4 ore di sviluppo, ma solo il
trascritto di ptmab è presente durante il periodo della gastrulazione (8 ore
di sviluppo).
L'analisi spaziale dell'espressione genica mostra una
notevole differenza nell'espressione neurale dei due geni. Infatti, mentre
entrambi i geni si esprimono nel grigio periacqueduttale, solo rln3a si
esprime nel nucleo incerto. Nei tessuti dell'organismo adulto, infine, i due
geni mostrano differenze ancora più evidenti, dal momento che rln3a si
esprime esclusivamente nel cervello, mentre rln3b si esprime in tutti i
57
Relassina-3: discussione
tessuti presi in esame ed in particolare, ad un livello superiore nel cervello
e nel testicolo. Nel complesso questi dati fanno ipotizzare che durante lo
sviluppo embrionale ad essere essenziale sia solo la funzione di Rln3a,
mentre la pressione selettiva dell'evoluzione, che ha mantenuto conservati
i domini B ed A di Rln3b, si giustificherebbe con la funzione che tale
molecola svolgerebbe nei territori dell'organismo adulto in cui non è
presente Rln3a. Ovviamente si tratta solo di pure speculazioni in assenza
di dati funzionali e di un profilo spaziale d'espressione nei tessuti adulti in
cui si identifichino i tipi cellulari che esprimono i due geni.
Poiché le molecole di cui si è discusso esercitano la loro funzione solo
tramite l'interazione con i recettori, ho ritenuto fondamentale iniziare
un'indagine sul profilo d'espressione dei geni per i recettori stessi durante
lo sviluppo embrionale del pesce zebra. Nonostante i dati sul profilo
spaziale d'espressione siano da completare e validare, l'analisi preliminare
dà comunque interessanti spunti di discussione. Infatti, entrambi i geni,
rxfp1 e rxfp3, sono espressi nel cervello durante l'embriogenesi ed in
particolare in discreti gruppi di cellule in diverse aree neurali, facendo
supporre che il sistema di neurotrasmissione della relassina-3 sia già
attivo nelle prime fasi dello sviluppo dell'organismo. Se si osservano con
attenzione i territori d'espressione di rxfp3 si può notare che oltre al grigio
periacqueduttale, in cui sono espressi anche rln3a e rln3b, il segnale
d'ibridazione è visibile nel rafe, nel locus coeruleus e nel nucleo incerto,
sebbene in questi casi la precisa natura delle cellule debba essere validata
da esperimenti di doppia ibridazione in situ con marcatori specifici.
Questi dati fanno immaginare che il nucleo incerto del pesce zebra possa
influenzare l'attività di quei gruppi cellulari attraverso il sistema di
neurotrasmissione Rln3a/Rxfp3, ipotesi che ben si coniuga con i dati della
58
Relassina-3: discussione
letteratura che vedono il nucleo incerto come parte importante di un
circuito neurale che influenza le risposte comportamentali allo stress. I
risultati del presente lavoro di tesi gettano le basi per lo studio di strutture
del cervello quali il grigio periacqueduttale ed il nucleo incerto nel pesce
zebra, un emergente modello sperimentale in diversi campi della biologia
tra cui la neurobiologia del comportamento, non solo, ma costituiscono un
ottimo punto di partenza per studiare i meccanismi di riposta allo stress
nelle prime fasi di vita dell'organismo.
Parte dei dati appena presentati sono stati oggetto di una pubblicazione
scientifica sulla rivista Developmental Dynamics (Donizetti e al., 2008b).
59
Sistema sperimentale, materiali e metodi
3.0
SISTEMA
SPERIMENTALE,
MATERIALI
E
METODI
3.1 Organismo modello: Danio rerio (pesce zebra)
L’uso di specie modello si basa sull’assunto che molte delle loro
caratteristiche biologiche sono condivise e conservate in molte altre
specie del regno. La ricerca biologica si concentra su organismi
selezionati definiti “sistemi modello” che presentano caratteristiche adatte
al tipo di studi che si vogliono affrontare. Il teleosteo Danio rerio,
comunemente detto pesce zebra, rappresenta oggi una specie di grande
interesse per la ricerca biologica grazie ad un insieme di caratteristiche
che ne fanno uno dei modelli più importanti della biologia dello sviluppo
come riconosciuto dal National Institute of Health (NIH) americano.
Innanzitutto le ridotte dimensioni dell'animale adulto, circa 3 cm di
lunghezza, rendono semplice ed economico l'allevamento di un gran
numero di individui. La maturità sessuale è raggiunta in poco tempo, 3
mesi, e si possono ottenere uova fecondate in tutte le stagioni mantenendo
costante foto- e termo-periodo (14 h di luce a 10 h di buio, a 28,5 °C). La
fecondazione è esterna permettendo di seguire agevolmente lo sviluppo
embrionale. La rapidità dello sviluppo embrionale, la trasparenza degli
embrioni, le dimensioni e la facile manipolazione delle uova fecondate,
permettono di applicare numerose tecniche sperimentali che rendono
interessante l'uso del pesce zebra in diversi ambiti della biologia dalla
biochimica alla biologia comportamentale. La possibilità di ottenere
mutazioni puntiformi su singoli geni mediante l'agente etilnitrosourea
(ENU) e di inserzioni (Amsterdam e al., 2004) ha permesso di identificare
mutanti con difetti dello sviluppo in diversi organi e sistemi. Tali mutanti
60
Sistema sperimentale, materiali e metodi
hanno un ruolo fondamentale non solo nel chiarire la funzione di vari geni
nello sviluppo embrionale, ma, in diversi casi, costituiscono ottimi
modelli di malattie umane tra cui ad esempio malattie neurodegenerative
(Tomasiewicz et al., 2002). Inoltre il pesce zebra si sta affermando un
ottimo modello anche per studi comportamentali, volti a comprendere la
relazione tra funzione dei geni e comportamento. Ad esempio una recente
analisi genetica ha permesso di identificare un insieme di mutazione che
influenzano il controllo neurale delle risposte optocinetiche (Muto e al.,
2005) e il coinvolgimento del sistema dopaminergico in specifici
fenomeni di apprendimento in seguito a trattamento con cocaina (Darland
e Dowling, 2001). Non ultime le applicazioni in ambito farmacologico,
dove i limiti di modelli animali mammiferi vengono superati dall'uso di
altri sistemi modello, tra cui il pesce zebra, ormai largamente utilizzato
per lo sviluppo di nuovi farmaci (Kari e al., 2007).
3.2 Embriogenesi
Kimmel (1995) suddivide lo sviluppo embrionale del pesce zebra in
8 periodi, suddivisi ulteriormente in stadi, nei quali è possibile
identificare i principali processi embriogenetici.
Zigote (0-3/4 h)
L'uovo di pesce zebra misura circa 0,7 mm di diametro con nucleo e
citoplasma che giacciono sopra un'abbondante massa di deuteroplasma.
La fecondazione attiva i movimenti citoplasmatici visibili già entro 10
minuti. Il citoplasma privo di vitello si sposta verso il polo animale in
modo da segregare il blastodisco, privo di tuorlo, dal citoplasma più
chiaro, ricco di tuorlo, localizzato al polo vegetativo.
Segmentazione (3/4-2 h)
61
Sistema sperimentale, materiali e metodi
La segmentazione è di tipo discoidale, poiché avviene solo nel blastodisco
ed i piani di segmentazione non si estendono al citoplasma ricco di tuorlo.
Dopo la prima divisione di segmentazione dello zigote, i blastomeri si
dividono ad intervalli di 15 min. Le divisioni citoplasmatiche,
meroblastiche, tagliano il blastodisco in modo incompleto ed i blastomeri
rimangono uniti da ponti citoplasmatici. Le prime divisioni sono tutte
longitudinali; la prima divisione orizzontale dà origine ad un embrione di
64 cellule a circa 2 h dalla fecondazione.
Blastula (2-5 h)
Durante questo periodo avviene la "midblastula transition" (MBT),
caratterizzata dal rallentamento del ciclo cellulare e dall'inizio della
trascrizione dei geni zigotici. Si forma lo strato di vitello sinciziale (YSL)
ed inizia l’epibolia. Quest'ultima continua per tutto il periodo della
gastrulazione. L'orientamento dei piani di segmentazione diviene
indeterminato. Con l'inizio della stadio mid-blastula, la durata dei cicli
cellulari comincia ad allungarsi e le divisione cellulari non sono più
sincrone. Alcune cellule sono in interfase mentre altre sono in mitosi.
L’asincronia è evidente dalla morfologia. I blastomeri che formano la
corona marginale, poggiano sul tuorlo e sono connessi tramite ponti
citoplasmatici per tutta la segmentazione. Con l'inizio del decimo ciclo, le
cellule marginali sprofondano, liberando il loro citoplasma e i nuclei nel
citoplasma della vicina cellula ricca di vitello. Si forma così uno strato
sinciziale del vitello (YSL). L’YSL, organo unico dei teleostei, può essere
extra-embrionale, non contribuendo al corpo dell'embrione. Esso si
estende al di sotto del blastodisco, formando un completo sincizio interno
che persiste per tutta l'embriogenesi, ed ha funzione nutritiva. L’epibolia
consiste nell'ispessimento e nell'estensione dello YSL e del blastodisco sul
62
Sistema sperimentale, materiali e metodi
tuorlo. Alla fine di questo stadio, le cellule marginali (EVL) sono più
numerose delle cellule profonde. Esse si estendono e si appiattiscono
formando un monostrato epiteliale.
Gastrula (5-10h)
L’inizio della involuzione definisce il sorgere della gastrulazione. Una
regione marginale ispessita, detta "anello marginativo", appare lungo il
bordo del blastoderma. Come non vi era un blastocele nella blastula, così
non vi è un archenteron nella gastrula. L'involuzione comporta il
ripiegamento del blastoderma su se stesso, formando due strati: uno strato
superiore, epiblasto, ed uno strato inferiore, ipoblasto. Le cellule
dell'epiblasto daranno origine all'epidermide, al sistema nervoso centrale,
alle creste neurali e ai placodi sensoriali. L'ipoblasto, invece, darà origine
ai derivati classicamente ascritti sia al mesoderma che all’endoderma.
Anteriormente l'ipoblasto parassiale genererà i muscoli per i movimenti
degli occhi, delle mascelle e delle branchie. Più posteriormente il
mesoderma parassiale è presente come una piastra segmentale che
formerà i somiti. L'epiblasto dorsale incomincia ad ispessirsi dando
origine alla piastra neurale: è il primo segno morfologico dell'abbozzo del
sistema nervoso centrale. La gastrulazione termina quando l’epibolia è
completa e si è formato il bottone caudale.
Formazione dei somiti (10-24 h)
Una serie di movimenti morfogenetici porta allo sviluppo dei somiti; i
rudimenti degli organi primari diventano visibili, il bottone caudale
diventa più prominente e l'embrione si allunga e compaiono i primi
movimenti del corpo. Questo periodo è chiamato "periodo del bottone
caudale" per la presenza di una struttura a bottone all'estremità caudale. I
somiti compaiono sequenzialmente nel tronco e nella coda. La maggior
63
Sistema sperimentale, materiali e metodi
parte delle cellule interne di ciascun somite si sviluppa in miotomo, o
segmento muscolare. I miotomi mantengono l'organizzazione metamerica
dei somiti e miotomi adiacenti divengono definitivamente separati da un
miosetto trasverso consistente di tessuto connettivo. Dai somiti deriva
anche lo sclerotomo, che da origine alla cartilagine vertebrale. I reni
pronefrici si sviluppano bilateralmente, in profondità, in corrispondenza
del terzo paio di somiti. Alla fine della gastrulazione, il primordio del
sistema nervoso centrale, la piastra neurale, risulta particolarmente spessa
nella sua regione anteriore, dove si formerà il cervello. La formazione del
tubo neurale nei teleostei è particolare: il lumen del tubo neurale, il
neurocele, si forma solo secondariamente, con un processo di cavitazione.
Si forma, cioè, prima del tubo neurale pieno, la "carena neurale", che
successivamente subisce cavitazione. Gli archi faringei ed i rombomeri
sono gli elementi visibili dei segmenti della testa, così come i somiti sono
i componenti del tronco e segmenti della coda.
Faringula (24-48 h)
Da una regione primordiale, in posizione ventrale e anteriore alla
vescicola ottica, si sviluppano sette archi faringei. I primi due anteriori
(arco mandibolare ed ioide), formano le mascelle e l'opercolo; gli altri
archi, detti branchiali, formano le branchie. Si cominciano, intanto, a
formare le pinne, le cellule mesenchimali si uniscono a formare gli
abbozzi delle pinne. Man mano che gli abbozzi si sviluppano, una cresta
di ectoderma apicale diviene prominente alle loro estremità. I rudimenti
delle due pinne pettorali appaiate cominciano la loro morfogenesi. Si
forma il sistema circolatorio ed il cuore comincia a pulsare appena
all'inizio del periodo.
Schiusa (48-72 h)
64
Sistema sperimentale, materiali e metodi
La morfogenesi dei principali organi è ormai completa. I cambiamenti
avvengono soprattutto nella regione faringea. All'inizio di questo stadio la
piccola apertura boccale è localizzata in posizione medio-ventrale fra gli
occhi, una posizione che sorprende poiché posteriore alla testa. Durante le
ultime 12 h dell’embriogenesi la bocca subisce un drammatico
cambiamento di posizione. La morfogenesi della mascella sposta la
posizione della bocca anteriormente in modo che, alla fine di questo
periodo, la bocca protrude fra gli occhi. E’ alla fine di questo stadio che si
verifica la fuoriuscita dal corion, vescicola con membrana glicoproteica,
in cui Danio rerio è stato chiuso per tutta la durata del suo sviluppo
embrionale.
3.3 Allevamento e impiego degli esemplari di Danio rerio
Gli individui di Danio rerio sono stati cresciuti in laboratorio, e
allevati e nutriti secondo Westelfied (1995).
3.4 Estrazione dell’RNA totale da embrioni e tessuti adulti di Danio
rerio
Gli RNA sono stati estratti impiegando il metodo della guanidina
tiocianato, in particolare mediante l'uso del reagente TRIzol® della
Invitrogen™, con la strumentazione e i materiali come riportato di
seguito:
Gli embrioni agli stadi di sviluppo desiderati o i tessuti prelevati a seguito
di sezionamento sono portati in tubi sterili. Viene aggiunto ai tubi 1 ml di
TRIzol® ogni 50-100 mg di tessuti o ogni 100-200 embrioni circa, prima
di passare alla fase di omogeneizzazione.
Omogeneizzazione
65
Sistema sperimentale, materiali e metodi
I campioni di materiale biologico vengono omogenizzati direttamente nel
reagente TRIzol® con un Dounce Tissue Gritter di vetro, precedentemente
sterilizzato e trattato con NaOH 0,2 M. Alla fine l’omogenato viene
recuperato e portare in un tubo sterile.
Separazione di Fase
I campioni vengono incubati per 5-10 minuti a temperatura ambiente, per
consentire la dissociazione dei complessi nucleoproteici. Successivamente
si aggiungono 200 μl di cloroformio per ogni ml di TRIzol® impiegato e
si agita vigorosamente per 15 secondi. Infine si centrifugano i campioni a
12.000 g per 10’ in centrifuga da banco refrigerata, per separare la fase
organica da quella acquosa contenente l'RNA.
Precipitazione dell’RNA
La fase acquosa (superiore) viene recuperata facendo attenzione a non
prelevare l’interfaccia o la fase inferiore e si aggiungono ad essa 500 μl di
isopropanolo per ogni ml di TRIzol® utilizzato. Dopo un'incubazione di
10’ a temperatura ambiente, il campione viene centrifugato a 12.000 g per
10’ in centrifuga da banco refrigerata.
Lavaggio dell’RNA
Rimuovere il surnatante e lavare l'RNA precipitato e depositato sul fondo
del tubo con 1ml di etanolo al 70% in H2O DEPC per ogni ml di TRIzol®
utilizzato. Si agita vigorosamente e si centrifuga a 7.500 g per 5’ in
centrifuga da banco refrigerata.
Risospensione dell’RNA
Asciugare il precipitato per pochi minuti all’aria, sotto cappa o a vuoto ed
infine risospendere l’RNA con 50 μl di H2O DEPC, incubare per 10’ a 5560°C per rendere agevole la solubilizzazione dell'RNA.
66
Sistema sperimentale, materiali e metodi
3.5 RT-PCR
La metodica dell'RT-PCR consiste in due fasi, la retrotrascrizione
degli RNA (RT) e la reazione a catena della polimerasi (PCR). Mediante
tale metodo si è proceduto all'analisi delle sequenze dei trascritti di
interesse, e alla determinazione semi-quantitativa dei livelli dei trascritti
stessi nelle varie fasi dello sviluppo embrionale e nei tessuti adulti.

RT (Reverse Transcription)
Il cDNA (DNA complementare) è stato ottenuto a partire dagli RNA totali
di embrioni agli stadi di sviluppo scelti per l'analisi, o a partire da RNA di
tessuti di esemplari adulti. Per la retrotrascrizione sono stati usati
oligonucleotidi statistici lunghi 8 nucleotidi (pdn8), necessari come
inneschi per l'enzima trascrittasi inversa. In particolare sono stati utilizzati
tubi sterili, cui si sono aggiunte le seguenti componenti:
RNA
5μg
pdn8 (25 pmol/μl)
2 μl
dNTP (10 mM)
1μl
H2O DEPC fino ad arrivare ad un volume di 14 μl
La miscela è stata incubata a 65°C per 5’ e poi posta in ghiaccio per 1’;
Dopo centrifugazione, alla reazione sono stati aggiunti i seguenti
componenti:
Tampone di sintesi (5x)
4 μl
DTT (100 mM)
1 μl
Trascrittasi inversa (SS III Invitrogen™) (200 U/μl) 1 μl
La miscela è stata lasciata a temperatura ambiente per 10’ e poi posta in
un bagnetto termostatato a 50°C per 1h. Infine la reazione viene bloccata
mediante inattivazione dell'enzima a 70°C per 15’. Il volume finale dei
67
Sistema sperimentale, materiali e metodi
campioni di cDNA è stato infine portato a 50 μl mediante l'aggiunta di 30
μl di H2O sterile.
 PCR (Polimerase Chain Reaction)
La PCR è una tecnica che permette l'amplificazione di una regione di
DNA compresa tra due oligonucleotidi d'innesco. Il DNA stampo viene
denaturato per far sì che ai singoli filamenti prodotti possano associarsi i
due inneschi complementari alle sequenze che delimitano la regione che
si desidera amplificare. Una DNA polimerasi termoresistente utilizza
questi inneschi per polimerizzare il secondo filamento e le doppie eliche
così ottenute vengono nuovamente denaturate per essere riutilizzate come
stampi per la reazione successiva. La reazione si ripete per il numero di
volte desiderato, producendo grande quantità della regione di DNA
compresa tra i due inneschi.
Il cDNA, ottenuto mediante il protocollo precedentemente descritto, è
stato utilizzato come stampo in reazioni di PCR per clonare specifiche
regioni di cDNA e per effettuare i profili temporali d'espressione dei geni
d'interesse. Ogni reazione di amplificazione è stata condotta in un volume
totale di 25 μl con i seguenti componenti :
cDNA
4 μl
Tampone (10x)
MgCl2
(50 mM)
2,5 μl
0,75 μl
dNTP (10 mM )
2,5 μl
DMSO
1,75 μl
Oligonucleotide 1 (5 pmol/μl)
2 μl
Oligonucleotide 2 (5 pmol/μl)
2 μl
Taq DNA Polimerasi (5U/μl)
0,3 μl
H2O sterile fino ad un volume finale di 25 μl
68
Sistema sperimentale, materiali e metodi
Le condizioni impiegate per l’amplificazione di tutti i cDNA di interesse
sono state:
1 ciclo
38 cicli
1 ciclo
denaturazione
94 °C
4 minuti
denaturazione
94 °C
30 secondi
appaiamento
58 °C
40 secondi
allungamento
72 °C
1 minuto
allungamento
72 °C
7 minuti
Di seguito è riportata la tabella contenente le sequenze degli
oligonucleotidi d'innesco e i numeri di accesso per tutti i geni interessati
dal presente lavoro di tesi.
Gene
n. di accesso
ptmaa
NM_194376
Sequenza oligonucleotide d'innesco
1: 5'-CATTTAGGAAAAATGGCTGACACA-3'
2: 5'-TGAGAACATTTCCAGCAGTGAAGC-3'
ptmab
NM_00109873 1: 5'-TACACAACATTAATTAT GGCAGAT-3'
0
cdh17
NM_194422
2: 5-GCTCAGCAATATGAAACAATCCTT-3'
1: 5'-ATTGATGCCCGTAATCCCGAGC
2: 5'-ATGCCAAGCCCAGCGTTGTCTAAG-3'
krox20
NM_130997
1: 5'-ATCCGAGCGAGTGCTTCTTA-3'
2: 5'-CAGCTGAGAGTGCTGGAGAA-3'
rln3a
AM161137
1: 5'-AAAGCACAGGTAGACCATCAGG-3'
69
Sistema sperimentale, materiali e metodi
2: 5'-TGCAGCCCCATTTGCAGCAGG-3'
rln3b
NW_00187807 1: 5'-CGTCTCGTCGTCCTGATGT-3'
5
penk
NM_182883
2: 5'-GCTCTCTGGATTCGCAGGATTCTC-3'
1: 5’-CACCGGACAGACTGCAGTAAC-3’
2: 5’-CCCTGATCAACATCCTCTGG-3’
penkl
NM_200083
1: 5’-CAGTGGACATTGCCAGAGAA-3’
2: 5’-GCCTTCTTCATAAAGCCTCCA-3’
crh
NM_00100737 1: 5’-CGAGACATCCCAGTATCCAA-3’
9
crhbp
tphr
2: 5’-GATGACAGTGTTGCGCTTCT-3’
NM_00100345 1: 5’-GCTGTGCTTCCTCCTGTTG-3’
9
2: 5’-CCTGATTGGTGGAGCCGTA-3’
AB125219
1: 5'-GGAGAGTGTCAGGTACTGT-3
2: 5'-CAGAAAGCCAACTTCATTCT-3'
crhr1
XM_691254
1: 5'- CAGCTCACCATGAATCCAGA -3
2: 5'- AGAGGCAGCAGAACCAGTGT -3'
rxfp1
XP_693665
1: 5'-ATGCCTAATTTCTTTCTCCCG-3'
2: 5'-GAAGACCCGAGAAGGTCA-3'
3: 5'-TTTGACCTTCTCGGGTCTTC-3'
4: 5'-GTGAGGTACGTGAGCAGC-3'
5: 5'-ACGTACCTCACGCTGGAG-3'
6: 5'-TCACGTGCCGTTGACGC-3'
70
Sistema sperimentale, materiali e metodi
1: 5'-ATGCAAGTCCTCCACAGACC-3'
rxfp3
rplp0
NW_00187856 2: 5'-GCAGAGTCAGGACGAACTGG-3'
4
3: 5'-CTTATACCGCGTGCGATCC-3'
NM_131580
1: 5'-ATCTCCAGAGGAACCATTGAAA-3'
2: 5'-AAGCCCATGTCTTCATCAGACT-3'
3.6 Analisi del prodotto di PCR ed estrazione del DNA dal gel di
agarosio
I 25 μl della reazione di PCR sono stati analizzati su un gel di
agarosio all'1,5 % in tampone TAE 1x (Tris-acetato 40 mM; EDTA 1 mM
pH 8) per verificare se il prodotto di amplificazione fosse delle
dimensioni attese. Al termine della corsa elettroforetica gli ampliconi
sono stati estratti dal gel mediante il sistema “QIAquick Gel Extraction
Kit” della QIAGEN seguendo le istruzioni della casa produttrice.
Al tassello di gel contenente l'amplicone di interesse sono stati aggiunti 3
volumi di tampone QG. Il campione è stato incubato a 50°C per 10 minuti
e sottoposto ad agitazione ogni 2 minuti. Al termine dell’incubazione è
stato aggiunto al campione un volume di isopropanolo pari a quello del
tassello di gel. Il campione è stato poi caricato sulle colonne
cromatografiche del sistema ed è stato centrifugato per 1 minuto a 13000
rpm in centrifuga Eppendorf. Il campione è stato lavato due volte con
tampone PE per rimuovere eventuali sali presenti. Infine il DNA è stato
eluito dalla resina mediante aggiunta di 60 μl di H2O sterile e successiva
centrifugazione a 13.000 rpm per 1 minuto.
3.7 Clonaggio nel vettore plasmidico pGEM®-T-Easy
71
Sistema sperimentale, materiali e metodi
Le regioni di DNA amplificate mediante PCR, sono state clonate
nel vettore plasmidico pGEM®-T-Easy. Tale vettore costituisce un valido
strumento per clonare molecole di DNA provenienti da reazioni di
amplificazione della polimerasi. Infatti il vettore è fornito linearizzato e
con alle estremità 3' un nucleotide T protundente. Tale estremità risulta
utile all'atto della reazione di ligazione in quanto si appaierà con la A
protundente del prodotto della reazione di PCR rendendo più frequente, e
quindi efficiente, la reazione di ligazione stessa. Inoltre tale vettore
presenta ai lati del sito multiplo di clonaggio, le sequenze del promotore
di due RNA polimerasi fagiche, T7 ed Sp6. Tali sequenze sono sfruttate
per la preparazione di sonde ad RNA, necessarie per gli esperimenti di
ibridazione in situ, mediante reazioni di trascrizione in vitro. Inoltre il
vettore presenta il sito multiplo di clonaggio all'interno della regione
codificante l'enzima β-galattosidasi (lacZ). In tal modo l'inserimento della
molecola di DNA di interesse interromperà la sequenza codificante la βgalattosidasi determinando la produzione di un enzima inefficace. A
seguito di un test di α-complementazione sarà possibile discriminare le
colonie batteriche trasformate con il vettore senza inserto da quelle
contenenti il costrutto d'interesse formato dal vettore più l'inserto.
Per la reazione di ligazione è stata allestita la seguente miscela:
Vettore
DNA inserto
50 ng
100 ng
Tampone ligasi (2x)
5 μl
T4 DNA Ligasi
3U
H2O sterile fino ad un volume finale di 10 μl.
La reazione viene fatta procedere a 4°C per tutta la notte, o a temperatura
ambiente per 2 ore. Successivamente la reazione è bloccata mediante
72
Sistema sperimentale, materiali e metodi
denaturazione dell'enzima a 65 °C per 15 minuti. Al termine la miscela
viene utilizzata per trasformare cellule batteriche competenti.
3.8 Trasformazione di cellule batteriche di E. coli (DH5α)
Per la trasformazione si è impiegato un ceppo di E.coli reso
competente per mezzo di un trattamento chimico a base di fosfato di
calcio presso il Servizio di Biologia Molecolare della Stazione Zoologica
di Napoli Anton Dohrn.
La reazione di trasformazione si basa su uno shock termico che permette
l'apertura di pori nella membrana plasmatica dei batteri e quindi l'entrata
delle molecole di DNA. In particolare, un'aliquota di cellule (40 μl)
conservata a -80 °C è fatta scongelare lentamente in ghiaccio; dopodiché
è
stato
aggiunto
alle
cellule
l’intera
reazione
di
ligazione
(precedentemente concentrata a circa 10 μl); le cellule sono incubate per
30’ in ghiaccio, poi, per 1,5’ a 42°C ed infine di nuovo in ghiaccio per
1,5’. Al termine dello shock sono stati aggiunti alle cellule 200 μl di LB
(NaCl 192 mM; estratto di lievito 0,5%; Bacto-triptone 1%; NaOH
5mM). Le cellule sono state poste in agitazione a 37°C per 1h (per
consentire l’espressione della β-lattamasi necessaria alla resistenza
all’antibiotico ampicillina). Infine circa 40 μl di coltura batterica sono
stati piastrati su terreno solido LB + agar in presenza dell'antibiotico
ampicillina ad una concentrazione finale di 100 μg/ml per selezionare le
cellule trasformate dal plasmide, e con l'aggiunta di 10 μl IPTG (1 M) e
40 μl di X-GAL (20 mg/ml). L'IPTG è un analogo del lattosio per cui
funge da induttore dell'espressione del gene LacZ, invece X-GAL è il
substrato per la β-galattosidasi, che a seguito della reazione enzimatica
determina la formazione di un precipitato di colore blu, in tal modo è
73
Sistema sperimentale, materiali e metodi
possibile selezionare le colonie positive (bianche), da quelle negative
(blu). Dopo una notte di crescita a 37 °C le colonie positive sono
prelevate ed incubate in 5ml di terreno di coltura liquido costituito da LB
e ampicillina al fine di ottenere maggiori quantitativo del costrutto
plasmidico d'interesse.
3.9 Minipreparazione del DNA plasmidico
Per poter isolare il DNA plasmidico dalle cellule batteriche il
protocollo che è stato utilizzato è basato sul metodo della lisi alcalina. Dai
5 ml di ciascuna coltura batterica sono state prelevate aliquote di 500 μl,
cui è stato aggiunto un eguale volume di una soluzione sterile di glicerolo
al 40%; dopo accurata agitazione, le aliquote sono state conservate a 20°C, al fine di ottenere una riserva di batteri trasformati. Il restante
volume è stato centrifugato a 3000 rpm per 5 minuti in centrifuga
Beckman GS-6R con rotore GH 3.7, è stato eliminato il sopranatante ed il
"pellet" batterico è stato risospeso in 100 µl di soluzione GTE fredda
(Glucosio 50 mM; Tris-HCl 25 mM, pH 8; EDTA 10 mM pH 8). Sono
stati aggiunti 200 µl di soluzione 2 (NaOH 0,2 M; SDS 1 %) preparata al
momento, e, dopo aver mescolato delicatamente per inversione, i
campioni sono stati posti in ghiaccio. Trascorsi 5 minuti, sono stati
aggiunti 150 µl di soluzione 3 (Potassio Acetato 3 M pH 5,5) e sono stati
lasciati i campioni in ghiaccio per altri 5 minuti.
Dopo centrifugazione di 5 minuti a 14000 rpm in microcentrifuga
Eppendorf, il supernatante è stato estratto con un eguale volume di fenolo
(preequilibrato con Tris-HCl 0,1M pH 8,0):cloroformio:alcol isoamilico
(25:24:1), agitando con cura e centrifugando per 5 minuti come sopra
descritto. Per precipitare il DNA plasmidico sono stati aggiunti 2,5
74
Sistema sperimentale, materiali e metodi
volumi di etanolo assoluto al supernatante ed il tutto è stato lasciato alla
temperatura di -20°C per 30 minuti; il DNA plasmidico è stato recuperato
con una centrifugazione di 20 minuti. Il precipitato è stato lavato con
etanolo 70% e risospeso in 40 µl di TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1
mM pH 8,0).
Si è effettuata una lettura dell'assorbanza allo spettrofotometro alla
lunghezza d'onda di 260 nm, utilizzando uno spettrofotometro VARIAN
DMS 90 e la concentrazione del plasmide è stata determinata utilizzando
la relazione:
1 O.D. = 260 nm= 50 g/ml di DNA plasmidico.
Per valutare il grado di purezza del DNA plasmidico estratto ed escludere
la presenza di RNA, aliquote di 1µg sono state analizzate su gel di
agarosio 1% in TAE 1x (Tris-acetato 40 mM; EDTA 1 mM pH 8)
contenente 0,5 µg/µl di bromuro di etidio.
3.10 Maxipreparazione di DNA plasmidico
Per ottenere preparazioni di maggiori quantitativi di DNA
plasmidico sufficientemente purificato, necessario per le successive fasi
sperimentali, è stato effettuato un inoculo di 100 µl dalla riserva di batteri
trasformati in 200 ml di Super Brodo (NaCl 86 mM; estratto di lievito
2%; Bacto-triptone 3,5%; NaOH 5mM); la coltura batterica è stata messa
a 37°C con agitazione costante (270 rpm) per tutta la notte.
Il giorno successivo, i batteri sono stati raccolti centrifugando a 3000 rpm
per 10 minuti in centrifuga Beckman con rotore GH 3.7. Il precipitato è
stato risospeso in 10 ml di tampone P1 (Tris-HCl 50 mM pH 8; EDTA 10
mM; Ribonucleasi A 100 μg/ml) e lasciato 5 minuti a temperatura
ambiente. Dopo aver aggiunto 10 ml di tampone P2 (NaOH 0,2 mM; SDS
75
Sistema sperimentale, materiali e metodi
1 %) ed aver mescolato per inversione ripetutamente, è stato incubato a
temperatura ambiente altri 5 minuti. Dopo aver aggiunto 10 ml di
tampone P3 (Potassio Acetato 2,55 pH 4,8 M), aver mescolato
delicatamente e incubato in ghiaccio per 20 minuti, i campioni sono stati
centrifugati a 10000 rpm per 30 minuti a 4°C, in centrifuga Sorvall RC2B con rotore SS34.
Il supernatante è stato fatto passare su di una colonna Qiagen-tip-500,
preequilibrata con 10 ml di tampone QBT (NaCl 0,75 M; MOPS 50 mM
pH 7; Etanolo 15 %; Triton X-100 0,15 %). Dopo aver lavato la resina tre
volte con 10 ml di tampone QC (NaCl 1 M; MOPS 50 mM pH 7; Etanolo
15 %) il DNA è stato eluito con 15 ml di tampone QF (NaCl 1,25 M;
MOPS 50 mM pH 8,2; Etanolo 15%), precipitato a temperatura ambiente
con 0,7 volumi di isopropanolo, e centrifugato 30 minuti a 4°C come
sopra descritto. Eliminato il supernatante, il precipitato di DNA
plasmidico è stato lavato con etanolo 70%, e risospeso in 200-500 µl di
TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM pH 8,0). Da questo protocollo
si sono ottenuti generalmente 0,2-1 mg di DNA plasmidico.
3.11 Sintesi delle sonde ad RNA
Linearizzazione del plasmide
Un passaggio preliminare alla trascrizione in vitro consiste nel
linearizzare il costrutto plasmidico in modo da interrompere la
trascrizione effettuata dalle polimerasi fagiche in un punto preciso del
costrutto. 30 μg di DNA plasmidico, ottenuto mediante la proceduta
illustrata in precedenza, e contenente le sequenze dei trascritti d'interesse,
sono stati digeriti con l’enzima di restrizione ApaI, quando era necessaria
la trascrizione con Sp6, oppure con PstI, quando si usava per la
76
Sistema sperimentale, materiali e metodi
trascrizione la polimerasi T7. In particolare sono state usate 5U di enzima
per μg di DNA in un volume finale di 100 µl, nei tamponi consigliati dalle
casa produttrice. Dopo un’incubazione a 37°C per 2 ore, un’aliquota della
reazione è stata analizzata su gel di agarosio allo 0,8% in TAE 1x (Trisacetato 40 mM; EDTA 1 mM pH 8) per verificare l’avvenuta
linearizzazione. I campioni sono stati poi estratti secondo il metodo
fenolo-cloroformio
illustrato
in
precedenza
nel
paragrafo
“minipreparazione del DNA plasmidico”.
Trascrizione in vitro
Mediante tale metodo sono state ottenute le sonde ad RNA marcate
con digossigenina o con fluoresceina utilizzate negli esperimenti di
ibridazione in situ. La trascrizione in vitro è stata effettuata utilizzando il
sistema “DIG RNA labeling kit” della Roche. Con questo sistema è
possibile marcare l’RNA prodotto in vitro con la digossigenina (o
fluoresceina) che funziona come aptene legato covalentemente, attraverso
un braccio spaziatore alla posizione C5 di uno dei precursori della sintesi
di RNA: l’UTP. Il precursore DIG-UTP viene incorporato nella molecola
di RNA neosintetizzata in quanto verrà riconosciuto come un comune
nucleotide dalle RNA polimerasi utilizzate, producendo così sonde di
RNA marcate.
Miscela di reazione:
DNA plasmidico linearizzato 1 μg
miscela di NTP 10x (con DIG-UTP o Fluo-UTP) 2 μl
tampone di trascrizione 10x 2 μl
inibitore delle RNAsi 20U/μl 0,5 μl
T7/SP6 RNA polimerasi 20U/μl 1,5 μl
77
Sistema sperimentale, materiali e metodi
H2O DEPC fino a 20μl di volume finale.
La reazione di sintesi è stata effettuata alla temperatura di 37°C per 2 ore;
successivamente sono stati aggiunti 2μl di DNAsiI (10U/μl), priva di
attività RNAsica ed il tutto è stato incubato a 37°C per 20 minuti, allo
scopo di rimuovere il DNA stampo. La reazione è stata, infine, bloccata
mediante aggiunta di 2 μl di EDTA 0,2M (pH 8,0), di 1/10 del volume
della reazione di LiCl 4M e di 2,5 volumi di etanolo assoluto. L’RNA è
stato lasciato precipitare per la notte a –20°C. Il giorno seguente si è
proceduto ad una centrifugazione, in centrifuga Eppendorf, a 13.000 rpm,
per 30 minuti a 4°C. Il precipitato è stato lavato con etanolo al 70% in
H2O DEPC e ricentrifugato per 15 minuti con le stesse modalità usate per
il passaggio precedente. Infine l’RNA è stato risospeso in 50μl di H2O
DEPC.
3.12 Quantificazione delle sonde ad RNA
Per
quantificare
le
sonde
è
stato
adoperato
un
saggio
immunoenzimatico, ricorrendo all’utilizzo di anticorpi anti-digossigenina
(anti-fluoresceina) coniugati con l’enzima fosfatasi alcalina. La reazione
immunoenzimatica viene condotta su di un filtro di nylon (Hybond-N,
Amersham) sul quale viene posto 1μl di diluizioni crescenti dell’RNA da
quantificare e di RNA controllo marcato anch'esso con digossigenina
(fluoresceina) alla concentrazione di 100 ng/μl, utilizzando il tampone 1
(SSC 10x: Na3C6H5O7 0,15 M + NaCl 1,5 M; Formaldeide 20 %). Per
consentire all’RNA di legarsi stabilmente al filtro, questo è stato posto in
stufa, sotto vuota, a 80°C per 2 ore. Dopo aver fissato gli RNA sul filtro,
questo è stato posto per 2 minuti in SSC 2x (Na3C6H5O7 0,03 M + NaCl
0,3 M) in leggera agitazione, quindi per 30 minuti nel tampone 2 (Acido
78
Sistema sperimentale, materiali e metodi
Maleico 0,1 M; NaCl 0,15 M; portare a pH 7,5 con NaOH)con 2% p/v di
Boehringer blocking powder della Roche. Successivamente la soluzione
viene sostituita con il tampone 2 a cui è aggiunto l’anticorpo anti-DIG-AP
(anti-FLUO-AP) diluito 1:5000 per 1 ora a temperatura ambiente, in
leggera agitazione. Per rimuovere l’anticorpo non legato, sono stati
effettuati due lavaggi da 15 minuti in tampone 1 (SSC 10x: Na3C6H5O7
0,15 M + NaCl 1,5 M; Formaldeide 20 %). Una volta avvenuta
l’interazione tra l’anticorpo ed il corrispondente aptene, la visualizzazione
della sonda viene realizzata attraverso una reazione colorimetrica
catalizzata dalla fosfatasi alcalina coniugata all'anticorpo. Tale enzima, in
presenza di due substrati, il 5-bromo,4-cloro,3-indolifosfato (BCIP 50
mg/ml in DMF 100 %) ed il sale Nitroblu di tetrazolio (NBT 75 mg/ml in
DMF 70 %), produce un substrato insolubile di colore blu. In particolare,
il filtro è stato equilibrato per 5 minuti nel tampone 3 (Tris-HCl 0,1 M pH
7,5; NaCl 0,1 M; MgCl2 50 mM; portare a pH 9,5 con NaOH) di
rivelazione e, successivamente, incubato al buio in una soluzione di
rivelazione così composta dallo stesso tampone 3 (10 ml) con 15 μl di
BCIP e 15 μl di NBT. Il precipitato colorato comincia a formarsi dopo
pochi minuti e la reazione viene bloccata lavando il filtro con H2O. Dal
confronto dell’intensità dei precipitati colorati prodotti dalle diverse
diluizioni di un RNA controllo con quelli prodotti dalle diluizioni degli
RNA da quantificare, si risale alla concentrazione della sonda ad RNA
sintetizzata.
3.13 Ibridazione in situ su embrioni interi
Protocollo adottato per i geni ptma
79
Sistema sperimentale, materiali e metodi
Gli embrioni di Danio rerio giunti allo stadio di sviluppo desiderato
sono fissati in paraformaldeide al 4% e disidratati in metanolo per essere
conservati a –20°C (per diversi mesi). Prima dell’uso, gli embrioni sono
reidratati attraverso una serie di lavaggi a temperatura ambiente ed in
leggera agitazione, in soluzioni a concentrazioni decrescenti di metanolo
e crescenti di PBT (NaCl 200 mM; KCl 3 mM; Na2PO4 10 mM; KH2PO4
2 mM; Tween-20 0,1 %):
2 lavaggi da 5 minuti in 75% metanolo in PBT.
2 lavaggi da 5 minuti in 50% metanolo in PBT.
2 lavaggi da 5 minuti in 25% metanolo in PBT.
3 lavaggi da 5 minuti in PBT.
Una volta reidratati gli embrioni sono stati sottoposti ad un processo di
permeabilizzazione basato sull'azione dell'enzima proteasi K (10 µg/ml)
in PBT seguendo tempi diversi a seconda dello stadio di sviluppo coem
indicato dalla seguente tabella.
Stadio
Tempo d'incubazione
4 ore
30''
8 ore
1'
16 ore
5'
24 ore
10'
48 ore
20'
72 ore
25'
96 ore
30'
80
Sistema sperimentale, materiali e metodi
Dopo il trattamento con proteasi si effettua una fissazione in
paraformaldeide al 4% per 20 min e successivamente 5 lavaggi da 5
minuti in PBT a temperatura ambiente e in agitazione. I campioni sono
poi incubati a 60°C, per 3 ore in 500 µl di miscela di preibridazione così
composta:
Formammide 50 %
SSC
5x
Boehringer blocking powder (Roche) 2 %
Tween-20
0,1 %
Eparina
50 μg/ml
tRNA
1 mg/ml
EDTA
1 mM
CHAPS
0,1 %
Successivamente, si sostituisce questa miscela con una identica
contenente 1 µg/ml di sonda marcata con digossigenina e si lascia a 60°C
in agitazione costante per la notte (prima dell’utilizzo, la sonda viene
denaturata portando la soluzione a 85° per 5 minuti).
Il giorno seguente si effettuano una serie di lavaggi per allontanare la
sonda in eccesso:
2 lavaggi da 5 minuti, a 60°C in agitazione, in SSC 2x + CHAPS 0,1%.
3 lavaggi da 20 minuti, a 60°C in agitazione, in SSC 2x + CHAPS 0,1%.
3 lavaggi da 20 minuti, a 60°C in agitazione, in SSC 0,2x + CHAPS
0,1%.
3 lavaggi da 5 minuti a temperatura ambiente e sotto agitazione in KTBT
(Tris HCl 50 mM pH 7,5; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; Triton X-100 0,3
%). Gli embrioni sono stati successivamente equilibrati in una soluzione
composta da siero inattivato di pecora (15%), Boehringer blocking
81
Sistema sperimentale, materiali e metodi
powder (0,7% peso/volume), Triton X-100 (0,1%) in KTBT, per 2 ore a
4°C in agitazione. Gli embrioni sono stati poi incubati per una notte nella
stessa miscela sopra descritta con l’aggiunta di anticorpo antidigossigenina (Roche) 1:1000, a 4°C per la notte in agitazione.
Il giorno seguente vengono effettuati 10 lavaggi da 30 minuti in KTBT a
temperatura ambiente, in costante agitazione ed infine lasciati per una
notte in KTBT a 4°C in agitazione.
Il giorno seguente gli embrioni sono equilibrati in NTMT (Tris HCl 100
mM pH9,5; MgCl2 50 mM; NaCl 100 mM; Tween-20 0,1 %; Levamisole
1 mM) per fornire le condizioni ottimali di funzionamento per l'enzima
fosfatasi alcalina coniugato all'anticorpo, mediante 3 lavaggi da 15 minuti
a temperatura ambiente in agitazione. Gli embrioni, infine, sono incubati
al buio in NTMT in presenza del substrato della fosfatasi alcalina BCIP
(2,3 µl/ml) e NBT (2,25 µl/ml). La reazione enzimatica determina la
formazione di un precipitato di colore blu/viola e viene seguita ad uno
stereoscopio. Al termine della reazione colorimetrica, si effettuano 3
lavaggi da 5’ con KTBT per bloccare la reazione ed allontanare i substrati.
Infine gli embrioni vengono osservati e fotografati in una soluzione di
glicerolo al 75%.
Doppia ibridazione in situ
In caso di doppia ibridazione in situ, necessaria per rivelare la
presenza di due trascritti diversi simultaneamente nello stesso embrione,
nella miscela di ibridazione viene aggiunta anche la sonda marcata con
fluoresceina ad una concentrazione di 1 µg/ml. Al termine della reazione
colorimetrica della prima ibridazione in situ, una volta effettuati i lavaggi
in KTBT, si procede all'inattivazione dell'enzima coniugato all'anticorpo
anti-digossigenina mediante un trattamento con 500 µl di glicina 0,1M pH
82
Sistema sperimentale, materiali e metodi
2,2.
Dopo con 4 lavaggi in KTBT da 5' a temperatura ambiente in agitazione,
gli embrioni vengono nuovamente equilibrati in una soluzione a base di
siero inattivato di pecora (15%), Boehringer blocking powder (0,7%
peso/volume), Triton X-100 (0,1%) in KTBT, per 30’ a temperatura
ambiente ed infine incubati per una notte nella stessa miscela con
l’aggiunta di anticorpo anti-fluoresceina (Roche) 1:2000, a 4°C in
agitazione per la notte.
Il giorno seguente vengono effettuati 6 lavaggi da 20 minuti in KTBT a
temperatura ambiente, in agitazione ed in seguito 3 lavaggi da 15’ in
NTMT. Infine, i campioni sono incubati al buio in NTMT contenente 7,5
µl/ml del substrato cromogenico INT/BCIP della Roche. In tal caso la
reazione colorimetrica determina la formazione di un precipitato di colore
arancio.
Protocollo adottato per i geni rln3
Per i geni rln3a e rln3b è stato utilizzato il protocollo descritto da
Thisse (2004) così come segue.
Fino al trattamento di permeabilizzazione con proteasi K i passaggi sono
identici al precedente protocollo. In seguito gli embrioni vengono posti in
300 μl di una miscela di preibridazione così composta:
Formammide
SSC
50%
5x
Tween20
0,1%
Acido Citrico pH 6,0
460 μl di 1M per 50 ml
Eparina
50 μg/ml
tRNA
500 μg/ml
83
Sistema sperimentale, materiali e metodi
H2O DEPC
a volume
Dopo 3 ore di preibridazione a 60 °C, la soluzione viene rimossa e
sostituita con la miscela d'ibridazione, identica alla precedente ma
contenente 1 μg/ml di sonda marcata con digossigenina. L'ibridazione
viene condotta per la notte e per l'intero giorno seguente a 60 °C.
Successivamente si effettuano una serie di lavaggi in una soluzione,
HMw, uguale a quella di ibridazione ma priva di eparina e tRNA nel
modo seguente:
1 lavaggio veloce con 500 μl di HMw a 60°C;
1 lavaggio da 15' con 1 ml di 75% HMw/25% SSC 2x a 60°C;
1 lavaggio da 15' con 1 ml di 50% HMw/50% SSC 2x a 60°C;
1 lavaggio da 15' con 1 ml di 25% HMw/75% SSC 2x a 60°C;
1 lavaggio da 15' con 1 ml di SSC 2x 60°C;
2 lavaggi da 30' con 1 ml di SSC 0,2x a 60°C;
1 lavaggio da 10' con 1 ml di 75% SSC 0,2x/25% PBT a T ambiente;
1 lavaggio da 10' con 1 ml di 50% SSC 0,2x/50% PBT a T ambiente;
1 lavaggio da 10' con 1 ml di 25% SSC 0,2x/75% PBT a T ambiente;
1 lavaggio da 10' con 1 ml di PBT a T ambiente;
Gli embrioni vengono equilibrati in 400 μl di una soluzione a base di
siero di pecora inattivato
(2%), BSA (2mg/ml) in PBT per 3 ore a
temperatura ambiente. Dopo la preibridazione la soluzione viene sostituita
con 300 μl di una medesima a cui si è aggiunto l'anticorpo antidigossigenina (Roche) 1:1000. Dopo una notte a 4 °C si procede ad una
serie di lavaggi come di seguito riportato:
1 lavaggio veloce in 1 ml di PBT;
6 lavaggi da 15' con 1 ml di PBT.
84
Sistema sperimentale, materiali e metodi
Infine la reazione di rivelazione colorimetrica del segnale viene effettuata
come per i geni ptma.
Doppia ibridazione in situ
Per le doppie ibridazioni in situ è stata usata la stessa logica del
protocollo adottato per ptma, cioè l'utilizzo nelle miscela di ibridazione di
entrambe le sonde complementari ai trascritti di interesse, una marcata
con digossigenina e l'altra con fluoresceina; dopo la rivelazione del
segnale relativo ad un trascritto si è proceduto a bloccare dell'attività della
fosfatasi alcalina coniugata all'anticorpo anti-digossigenina mediante
trattamento con glicina 0,1M pH 2,2; gli embrioni sono stati di nuovo
equilibrati in una soluzione a base di siero di pecora inattivato (2%), BSA
(2mg/ml) in PBT per 30 minuti a temperatura ambiente; la soluzione è
stata poi sostituita con una identica a cui era stato aggiunto l'anticorpo
anti-fluoresceina (Roche) 1:2000, lasciata agire per la notte a 4°C; il
giorno seguente dopo una serie di lavaggi in PBT si è proceduto alla
rivelazione della seconda sonda come già descritto per i geni ptma.
Variante per i recettori Rxfp1 e Rxfp3
Il protocollo usato per i recettori delle relassine si basa su quello
descritto in precedenza per i geni rln3. Al protocollo sono state aggiunte
delle variazioni che hanno consentito di migliorare la rivelazione dei
trascritti per rxfp1 e rxfp3, che rispetto agli altri analizzati nel presente
lavoro di tesi si sono mostrati significativamente meno intensi. In
particolare il protocollo è identico a quello adottato per i geni rln3 fino a
giorno dell'ibridazione, i successivi lavaggi vengono eseguiti come segue:
85
Sistema sperimentale, materiali e metodi
1 lavaggio veloce con 500 μl di HMw a 60°C;
1 lavaggio da 15' con 1 ml di 75% HMw/25% SSC 2x a 60°C;
1 lavaggio da 15' con 1 ml di 50% HMw/50% SSC 2x a 60°C;
1 lavaggio da 15' con 1 ml di 25% HMw/75% SSC 2x a 60°C;
1 lavaggio da 15' con 1 ml di SSC 2x 60°C;
2 lavaggi da 30' con 1 ml di SSC 0,2x a 60°C;
1 lavaggio da 10' con 1 ml di 75% SSC 0,2x/25% MBT pH 7,5 (acido
maleinico 0,5 M; NaCl 0,75 M; Tween-20 0,1%) a T ambiente;
1 lavaggio da 10' con 1 ml di 50% SSC 0,2x/50% MBT a T ambiente;
1 lavaggio da 10' con 1 ml di 25% SSC 0,2x/75% MBT a T ambiente;
Gli embrioni vengono equilibrati in 400 μl di una soluzione a base di
MBT e Boehringer blocking powder (Roche) al 2 % per 1 ora a
temperatura ambiente. Si sostituisce questa soluzione con 400 μl di una
soluzione a base di MBT, Boehringer blocking powder (Roche) al 2 % e
siero di pecora inattivato (10%) per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo
la preibridazione la soluzione viene sostituita con 300 μl di una medesima
soluzione a cui si è aggiunto l'anticorpo anti-digossigenina (Roche)
1:1000. Dopo una notte a 4 °C si procede ad una serie di 6 lavaggi da 30'
in MBT e alla rivelazione del segnale come riportato per i geni rln3.
86
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