(Microsoft PowerPoint - DNA e Tecniche di Base [modalit\340

Nozioni di base in
biologia molecolare
Dott.ssa Daniela Fiocco
Il DNA contiene l’informazione genetica
Griffith, 1928
esiste un “principio trasformante”, in grado di convertire ceppi
innocui di Streptococcus pneumoniae in virulenti
Avery, MacLeod & McCarty, 1944:
il principio trasformante è identificato nella molecola di DNA
Hershey & Chase, ’50
Il materiale ereditario, trasferito nei batteri infettati per produrre una
nuova progenie virale fagica, è l’acido nucleico
Watson & Crick, 1953
Proposta di un modello strutturale per il DNA coerente con la
funzione di molecola depositaria dell’ informazione genetica.
il modello molecolare della doppia elica è coerente con la funzione di
deposito dell’informazione genetica
Estremità 5′
P
Estremità 3′
HO
5′
4′
3′
2′
2′
1′
A
T 1′
5′
P
P
C
G
P
P
G
C
P
P
T
OH
Estremità 3′
3′
4′
A
P
Estremità 5′
L’informazione genetica è rappresentata dalla
sequenza di basi che è tradotta in sequenza di
amminoacidi nelle proteine (codice genetico)
La complementarità specifica tra le basi è alla
base dei processi di
•trasmissione (DUPLICAZIONE),
•trasferimento (TRASCRIZIONE-TRADUZIONE)
•ed evoluzione (RICOMBINAZIONE)
dell’informazione genetica
• e costituisce il principio di molti
esperimenti/tecniche di ingegneria genetica
Negli anni ’70, la scoperta degli enzimi di restrizione, della
trasformazione batterica e dell’elettroforesi su gel di agarosio
ha avviato lo sviluppo della biologia molecolare
Tecniche di base per l’analisi dei geni:
• restrizione→ tagli specifici sul DNA e riunione di molecole
diverse
• clonaggio molecolare→ studio di singoli geni isolati
• concetto di trasformazione e metodi di trasformazione
• elettroforesi su gel→ analisi ad alta risoluzione del DNA
• blotting ed applicazioni→ rilevamento di sequenze omologhe
• purificazione del DNA
Anni ’70: scoperta degli enzimi di restrizione
→ diventa possibile tagliare il DNA in siti specifici e riunire
molecole di DNA di diversa origine
Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi
che riconoscono e tagliano il DNA a livello di
una specifica sequenza nucleotidica.
Il sito riconosciuto è generalmente formato
da una sequenza di 4-8 bp.
Enzimi diversi riconoscono sequenze
nucleotidiche diverse: ogni enzima ha perciò
una sua caratteristica specificità
Gli enzimi di restrizione sono isolati dai
batteri, dove costituiscono un sistema di
difesa naturale che distrugge eventuali
molecole di DNA estraneo e quindi protegge
da infezioni virali.
1978, premio Nobel a W. Arber, D. Nathan &
H. O’Smith, per la scoperta degli enzimi di
restrizione
Esistono 3 classi di enzimi di restrizione; gli enzimi di tipo 2 sono i più usati in
ingegneria genetica: riconoscono brevi sequenze palindromiche (es GGTACC;
GGTNACC) producendo estremità coesive (sticky) o piatte (blunt)
TAGLIO
SIMMETRICO
ASIMMETRICO
FREQUENZA DI TAGLIO: La distanza media tra siti di taglio è : 4n , dove n= n°basi del sito
riconosciuto
Es: 4-base cutter: 44 = 256 bp
6-base cutter:
46 = 4096 bp
Applicazioni degli enzimi di restrizione
1) Mappe di restrizione
2) Creazione di molecole di DNA ricombinante e clonaggio
3) Analisi di RFLP
Mappe di restrizione
1) DNA “digerito” con più tipi di
endonucleasi di restrizione,
(digestioni singole e multiple)
2) i frammenti risultanti separati
ed analizzati mediante
elettroforesi.
Dal quadro di frammenti ottenuti
si risale a posizione e ordine
relativo dei siti di restrizione
nella molecola di DNA: “mappa
di restrizione”.
Molecole di DNA ricombinante
Le estremità coesive generate dagli enzimi di restrizione sono molto utili per le
tecniche di manipolazione genetica.
DNA di origine diversa sono legati grazie alla complementarità tra le estremità generate
dallo stesso enzima di restrizione, generando una molecola di DNA chimerica
RFLP= Restriction Fragment Length Polymorphism
Il polimorfismo genetico consiste in differenze di sequenza a livello di cromosomi
omologhi: differenze nucleotidiche, anche minime, possono generare o eliminare
specifici siti di restrizione.
La digestione di segmenti corrispondenti di cromosomi omologhi produce
differenti quadri di restrizione chiamati “RFLP”.
Wild-type allele
AGATCT
TCTAGA
Restriction site
Mutant allele
AGAGCT
TCTCGA
Not a restriction
site
Gli RFLP sono marcatori utili per
- rilevare differenze tra genomi (studi filogenetici e di popolazione)
- diagnosi di malattie ereditarie.
Un particolare RFLP può essere associato alla forma “difettosa” di un gene, tanto da
caratterizzare gli individui affetti dalla patologia.
Attualmente, gli RFLP sono usati nella diagnosi di malattie con base genetica (fibrosi
cistica, distrofia muscolare di Duchenne, fenilchetonuria, emofilia, etc.).
Allele I
Allele II
Analisi su gel
w
Taglio
C
C
G
G
G
G
C
C
z
A
C
G
G
T
G
C
C
1
–
Frammenti
più lunghi
z
x
Taglio
y
2
C
C
G
G
G
G
C
C
x
Taglio C G
y
C G
G C
G C
w
DNA prelevato dai cromosomi
Frammenti
più corti
+
y
y
Esempio di esame diagnostico basato su un polimorfismo genetico.
0.2 kb
1.2 kb
introne
Gene per la β-globina
Mst II
(mancante in HbS)
Tipo di
emoglobina
A
S
Sequenza amminoacidica e
nucleotidica nel gene per la
β-globina
-Pro- Glu - Glu
CCT-GAG-GAG
Sito per MstII
-Pro- Val - Glu
CCT-GTG-GAG
Sito non riconosciuto da MstII
Elettroforesi dei prodotti di restrizione
A
S
A/S
1.4 kb
1.2 kb
0.2 kb
Il cambiamento di una sola base (A→
→T), nel gene per la β-globina, determina una sostituzione
amminoacidica nella proteina codificata (Glu→
→Val), che altera le proprietà strutturali dell’emoglobina,
generando l’anemia falciforme.
Il cambiamento nucleotidico, rispetto alla sequenza wild type, comporta la perdita del sito riconosciuto
dall’enzima MstII. Questo polimorfismo ha un’utilità diagnostica e può essere rilevato analizzando il
pattern di restrizione ottenuto trattando la regione genomica, precedentemente amplificata per PCR, con
l’enzima MstII: nel genotipo omozigote wild type, la digestione produrrà due frammenti (A), nel mutato un
unico frammento (S), nell’eterozigote portatore tre frammenti (A/S).
Clonaggio molecolare
Il clonaggio molecolare consente l’amplificazione e lo studio di uno specifico
frammento di DNA.
Il segmento di DNA di interesse viene inserito in una molecola di DNA “vettore” in grado di
replicarsi autonomamente. Il risultante vettore chimerico (“DNA ricombinante”) è
introdotto in un organismo ospite, in genere un batterio, che viene fatto riprodurre in
modo da generare una popolazione numerosa: tutti i membri della popolazione
conterranno molte copie del DNA ricombinante, ottenendo così quantità elevate del DNA
di interesse, inserito inizialmente.
La base del clonaggio
Taglio e riunione del DNA con enzimi di restrizione e DNA ligasi:
Come si fa ad introdurre DNA estraneo in una cellula ospite?
•Il DNA è una molecola carica che attraversa difficilmente parete e
membrane cellulari→ metodi di trasformazione
•affinchè sia mantenuto nell’ospite e trasmesso alle successive
generazioni, il DNA esogeno deve essere integrato in un’unità di
replicazione funzionante→ vettore di clonaggio
•La trasformazione ha un’efficienza <100%: è necessario poter distinguere
le cellule trasformate da quelle non trasformate → marcatori di selezione.
TRASFORMAZIONE
La trasformazione consiste nel trasferimento di DNA esogeno all’interno di una
cellula ospite.
Sono state sviluppate diverse tecniche che permettono di trasformare cellule
sia batteriche che eucariotiche, incluse di mammifero.
-a)Trattamento con una combinazione di cationi bivalenti e successivo shock termico.
-b) Elettroporazione
-c) Gene gun
-Infezione con virus i cui genomi sono stati modificati in modo da contenere il DNA esogeno
(metodo usato per eucarioti e batteri).
- Microiniezione (cellule di mammifero).
L’ospite per il clonaggio varia secondo le esigenze
E. coli
B. subtilis
S. cerevisiae
Efficienza di trasformazione:
(quantità di trasformanti)/ (quantità di DNA)
Escherichia coli, batterio Gram-negativo, è l’ospite standard di numerosi
esperimenti di clonaggio
Si possono raggiungere efficienze di 107-109 trasformanti/µg DNA
•Facile ed economico da coltivare
•Crescita rapida (Tg=20-30 min)
•Genetica nota
•I ceppi da laboratorio hanno mutazioni che
non consentono la diffusione all’esterno
Colonia di Escherichia coli
Si prepara un terreno di coltura selettivo
in cui solo i batteri/microorganismi
trasformati sono in grado di crescere
Condizioni di sterilità
Incubazione delle piastre alla T ottimale
per la crescita del microorganismo
Come si genera una coltura di cellule animali?
•Si preleva piccolo frammento di tessuto (2mm3)
•Digestione con proteasi per degradare matrice extracellulare e separare le cell.
•Trasferimento in flask con terreno e fattori di crescita (da siero) per stimolare
proliferazione
•Linee cellulari primarie: le cellule ottenute da tessuto non si dividono o lo fanno
per poche volte prima di andare incontro a senescenza e morire
•Linee cellulari secondarie: cellule ottenute da tessuto riescono a dare numerose
generazioni (10-20 divisioni), prima di invecchiare e morire
•Linee cellulari trasformate: in seguito a cambiamenti genetici, spontanei o indotti
(ad es mediante infezione virale), le cellule perdono il normale controllo su
divisione e crescita cellulare→ cellule crescono indefinitamente: linee
immortalizzate (es cell HeLa: cellule tumorali derivanti da paziente morta di cancro
all’utero nel 1951)
Metodi di transfezione
I metodi di trasfezione usati per le cellule animali tendono ad aumentare la
permabilità della membrana plasmatica al DNA e a superare l’ostacolo
all’ingresso del DNA costituito dalla matrice extracellulare (soprattutto nei
tessuti).
TRANSFEZIONE MEDIATA DA PEPTIDI
METODI CHIMICI
INIEZIONE
ELETTROPORAZIONE
TRANSFEZIONE MEDIATA DA LIPOSOMI
TRANSFEZIONE MEDIATA DA VIRUS
TRANSFEZIONE MEDIATA DA LIPOSOMI
LIPIDE CATIONICO
LIPOSOMA CATIONICO
LIPOSOMI
CATIONICI
INTERAGENTI
CON DNA
Non si tratta di liposomi classici
(:vescicole a doppio strato lipidico
che racchiudono una sostanza
idrofilica)
bensì di lipidi cationici che
formano vescicole lungo tutta la
lunghezza del DNA (mediante
legame elettrostatico) favorendo
ingresso attraverso la membrana.
Vantaggi
•i liposomi evitano la
degradazione, mediata da
endosomi, del DNA entrato
•Facile esecuzione
•riproducibile
MICROINIEZIONE DI DNA
Il DNA è iniettato direttamente nel nucleo delle cellule in coltura; metodo
applicabile su cellule di grossa taglia, es ovociti; bassa probabilità di
integrazione
ELETTROFORESI SU GEL
L’elettroforesi su gel consente di separare ed analizzare molecole di DNA di
dimensioni diverse.
Molecole cariche, come acidi nucleici e proteine, possono essere separate mediante
elettroforesi: migrazione in un campo elettrico.
Essendo cariche negativamente, le molecole di DNA migrano verso il polo positivo.
Fasi di preparazione di un gel per elettroforesi
1
2
4
5
7
8
3
6
9
Dopo la “corsa”, il gel è posto su una lampada di luce UV per
visualizzare il pattern di migrazione del DNA
In un gel di elettroforesi, il DNA si può
visualizzare con coloranti fluorescenti,
come il bromuro di etidio, un potente
agente intercalante del DNA.
Il bromuro di etidio emette una luce
rosa-arancio quando è intercalato nel
DNA e sottoposto a radiazione UV
La matrice del gel è un polimero che forma un reticolo di maglie che le molecole
devono attraversare. Dalla concentrazione di matrice nel gel dipende il range di
dimensione dei frammenti separabili con buona risoluzione
•↓concentrazione→ maglie lasse → separazione di molecole grandi;
•↑concentrazioni → maglie strette → separazione di molecole con basso PM.
•Poliacrilammide (PAGE) → pori sottili (conc. 3-30%)
Matrice polimerica
per gel
elettroforesi
•agarosio → pori grossolani e disordinati (conc. 0.8-3%)
All’interno del gel la velocità di migrazione del DNA è influenzata dalla
dimensione e dallo stato strutturale
Schwartz & Cantor, 1984
La gel-elettroforesi in campo pulsato (PFGE) permette di separare
molecole di DNA molto lunghe, fino a 10000Kb (10Mb)
•Consente analisi di cromosomi interi
•Le cellule sono incluse direttamanete in blocchi d’agarosio per ottenere
DNA integro
Sequenziamento del DNA
I didesossiribonucleotidi
interferiscono con la normale
sintesi del DNA e bloccano
l’estensione.
Nel gel si separano frammenti
diversi per lunghezza anche di
una sola base.
Nei sequenziatori moderni:
ddNTP marcati per
fluorescenza
Elettroforesi su gel-capillare
Il sequenziamento del DNA è
applicato ai geni, ma anche a
genomi completi: progetto
genoma umano (Dulbecco)
Southern, 1975
Il Southern Blotting permette di individuare frammenti di DNA con sequenza
specifica all’interno di una popolazione eterogenea di frammenti
Il metodo si basa su:1) la produzione di una replica del gel su membrana;
2) la complementarità tra DNA “sonda”e DNA fissato su membrana
Sonda radioattiva
(DNA)
DNA a filamento singolo
La sonda è un segmento di DNAss marcato
Durante la fase di ibridazione riconosce e lega il
DNA bersaglio presente sulla membrana
Mediante l’appaiamento
delle basi azotate
si individua il gene prescelto
Analoghi al southern blotting, in quanto basati sul trasferimento di molecole da
gel di elettroforesi a membrana sono:
-Northern blotting → trasferim. di RNA; rilevamento per ibridazione con sonde di
DNA
-Western blotting→ trasferim. di proteine separate mediante PAGE; rilevamento
con anticorpi marcati
-South-Western blotting → trasferim. di proteine; rilevamento con sonde di DNA
ds; consente l’identificazione di proteine in grado di legare DNA
Il western blotting differisce dal southern per due aspetti principali:
1. Il trasferimento di proteine avviene per passaggio di corrente elettrica (e non
per capillarità)
2. Il rilevamento si basa sul legame di anticorpi
Applicazioni del Southern blotting
Medicina legale: DNA fingerprint
Gli RFLP di particolari marcatori sono evidenziati e confrontati mediante
southern blotting
Sangue
dell’imputato
Sangue rinvenuto
sui vestiti dell’imputato
Sangue
della vittima
Purificazione del DNA
Purificazione del DNA genomico
Step principali:
1. Lisi cellulare con metodi vari secondo il tipo cellulare
2. Rimozione dei frammenti cellulari mediante centrifugazione
3. La parte solubile è trattata con solventi organici (fenolo e
cloroformio) per denaturare e allontanare le proteine
4. Precipitazione e concentrazione degli acidi nucleici rimasti nella
fase acquosa (etanolo o PEG)
5. Rimozione dell’RNA: trattamento con enzima RNAsi
6. (Centrifugazione in gradiente di densità per separare diversi tipi
di DNA)
Resa di DNA genomico → 0.5-3 µg per mg di tessuto,
5-15 µg da 300 µl di sangue intero.
Purificazione di DNA plasmidico
Da cellule di E. coli: metodo della lisi alcalina
Il metodo si basa sul fatto che dopo trattamento alcalino il DNA circolare
plasmidico ma non quello lineare, rinatura più facilmente in seguito a
neutralizzazione
•
Trattamento con detergente SDS e NaOH (pH 12)
•
Neutralizzazione (pH 5.2)
•
Eliminazione del precipitato (proteine e lipidi di
membrana associati a DNA genomico) mediante
centrifugazione
•
Purificazione del DNA in soluzione grazie a
cromatografie a scambio ionico o di gelfiltrazione
•
Resa standard: 1-3 µg per mL di coltura batterica
iniziale
Vettori
I vettori assicurano la propagazione e replicazione del DNA esogeno
nell’ospite. I vettori sono molecole di DNA costruite combinando e
modificando sequenze naturali.
1)Vettori di clonaggio→ amplificazione del DNA inserito
2) Vettori di espressione → traduzione in proteina del DNA inserito
Esistono vari vettori di origine diversa; la scelta del vettore dipende
dall’applicazione e dalla dimensione del frammento da clonare
VETTORE
OSPITE
TIPO DI CLONAGGIO,
applicazioni
Dimensione MAX
dell’inserto
Plasmide
batteri,
lieviti
genomico, cDNA
Manipolazione generale
10-20 kb
Batteriofago λ
e M13
batteri
genomico, cDNA
Librerie, mutagenesi e
sequenziamento
20 kb
Cosmidi
batteri
Genomico librerie
45 kb
BAC
batteri
genomico librerie
100-300 kb
YAC
Lieviti
genomico librerie
100-2000kb
I plasmidi sono molecole di DNA circolari extra-cromosomali.
TEM 2000×
•Naturalmente diffusi in procarioti e alcuni eucarioti (lievito).
•Dimensione standard→1-20kb
Esempio di vettore plasmidico
regione di inserimento
del DNA di interesse
Gene marker per selezionare trasformanti:
resistenza ad antibiotico (ampicillina)
origine di
replicazione
Vettore plasmidico che permette la selezione immediata dei ricombinanti.
Il marker codifica per un fenotipo facilmente rilevabile: con l’inserimento
del DNA esogeno la colonia risulta bianca!
La PCR (Polymerase Chain Reaction) ha rivoluzionato la biologia
molecolare; ideata e messa a punto da Kary Mullis nel 1983 (Nobel per la
chimica nel 1993).
È un metodo attraverso cui una
sequenza di DNA può essere
amplificata esponenzialmente in
vitro in modo specifico.
Molecola
iniziale
di DNA
1
2
4
Numero di molecole di DNA
8
“Ingredienti” e condizioni di PCR
- oligonucleotidi innesco (~20 bp) complementari alle
regioni fiancheggianti la zona da amplificare: primer per
la polimerasi
-Enzima DNA-polimerasi (termostabile)
-dNTP
-DNA stampo.
sia puro che sottoforma di campioni biologici (fettine istologiche, capelli, colonie
batteriche, ecc). La quantità iniziale di DNA richiesta per la PCR è minima, in
teoria, anche una singola molecola è sufficiente
- Condizioni saline (MgCl2) e di pH adeguate
-Alternanza di fasi a diversa temperatura
1) denaturazione del DNA stampo
2) appaiamento dei primer
3) estensione dei primer da parte della polimerasi
20-40 cicli di amplificazione
Accumulo esponenziale dei frammenti di
amplificazione→
Legge esponenziale→ x(2n)
x= n°molecole DNA stampo iniziale; n= n°di cicli
= 1 ciclo di PCR
ad ogni ciclo il DNA bersaglio
raddoppia
•Enzyme
•primers
•Template DNA
•dNTP
•Buffer
Il profilo termico è impostato
in un thermal cycler
Pcr.exe
Il prodotto di reazione è
controllato per elettroforesi
Enzimi usati in PCR
La PCR è stata rivoluzionata dall’uso di DNA polimerasi termostabili derivate da
batteri termofili
Vantaggi
resistenza passaggi di denaturazione
specificità sintesi↑
1) Taq polimerasi estratta da Thermus aquaticus
Attività polimerasi (ed esonucleasi) 5’→3’
Freq di errore 1/104-1/105 bp
Attività adenosin trasferasi
2) Pfu polimerasi (da Pyrococcus furiosus)
Polimerasi-esonucleasi 5’→3’
Esonucleasi 3’→5’: correzione bozze→freq. errore inferiore
3) Enzimi ricombinanti (con caratteristiche modificate/migliorate)
Partenze “hot start”: un ingrediente essenziale è attivato/aggiunto solo dopo che mix ha
raggiunto 95°C→ ↑ resa e specificità PCR (es polimerasi bloccata da anticorpo)
Dimensione max amplicone ~2-10 kb
Primer per PCR
•Oligonucleotidi 20-30 bp
•Complementari all’elica senso ed antisenso (polarità opposte)
•GC ~ 50%
•Evitare sequenze ripetute e complementari tra i due primer
•T annealing ~45-60°C
•Programmi specifici per design di primer
5’-gagtggaccatcgaagataac-3’
3’-ggcgatgactggggcaggacta- 5’
Uso di primer mismatch
volutamente non perfettamente complementari al DNA bersaglio per:
•Introdurre siti di restrizione per clonaggio
•Mutagenesi
•Ricerca di sequenze omologhe e famiglie geniche (uso di primer degenerati)
Applicazioni della PCR
Le applicazioni sono molteplici in campi diversi: genetica molecolare, medicina,
archeologia, medicina forense, analisi di popolazioni, etc.
•Diagnosi di malattie genetiche (mutazioni per delezioni/inserzioni o puntiformi)
•Analisi di medicina forense (es DNA finger-print)
•Clonaggio dei prodotti di PCR
•Rilevare infezioni batteriche o virali
•Analisi dell’espressione genica (RT-PCR)
•Studi di evoluzione molecolare (filogenesi)
Sequenziamento del DNA
Alla fine degli anni ’70 sono stati elaborati due metodi
alternativi per il sequenziamento manuale del DNA
• Maxam e Gilbert, 1977: metodo chimico
Il DNA è tagliato chimicamente in corrispondenza di basi
specifiche: i prodotti di taglio sono analizzati su gel
elettroforesi
• Sanger, 1977: metodo terminazione di sintesi enzimatica
Il Dna da sequenziare è replicato a partire da un primer
innesco con una polimerasi; il filamento neosintetizzato è
radiomarcato e la reazione è interrotta per incorporazione di
dideosii -nucleotidi (ciascuno aggiunto alle 4 diverse mix di
reazione)→analisi di elettroforesi→autoradiografia
(1980: Nobel per la chimica a Gilbert e Sanger)
Metodo di Sanger
La mix di reazione è divisa in 4
provette, ciascuna contenente
un diverso ddNTP.
I ddNTP o “terminatori”
(nucleotidi che al 3’ non
posseggono il gruppo ossidrile)
interferiscono con la normale
sintesi del DNA e bloccano
l’estensione.
Separazione dei frammenti
generati mediante elettroforesi
in gel di poliacrilammide.
Ha più vantaggi pratici rispetto a
metodo chimico (condizioni
meno drastiche, anche DNA ds,
+ fedele, etc.)
Enzimi usati: T7 sequenase, ma
anche e sempre più enzimi
termostabili tipo PCR
Sequenziamento automatico
Il metodo di Sanger è rimasto alla base dei protocolli di sequenziamento
automatico
•Enzima
reazione
•DNA stampo
•dNTP
•ddNTP marcati con 4
diversi fluorofori
Analisi computerizzata
dell’elettroferogramma
Con un primer si sequenzia regione
di 500-1000bp
Processo automatizzato
Separazione dei frammenti su
singolo capillare di gel
abbinato ad un rilevatore di
fluorescenza
Il sequenziamento automatico è usato per sequenziare interi
genomi
1) Frammentazione del genoma e clonaggio in vettori
2) Sequenziamento mediante uno dei seguenti approcci:
a) chromosome walking: identificazione di nuovi cloni sovrapposti per
ibridazione di cloni già sequenziati
b) Shot-gun totale: genoma ricostruito assemblando sequenze
sovrapposte di piccoli frammenti casuali
c) Shot-gun gerarchico: il genoma è tagliato in grossi frammenti
sovrapposti, che vengono ulteriormente tagliati e sequenziati
(+ adatto a genomi di grossa taglia)
Oltre a quello umano, sono stati sequenziati o in via di sequenziamneto
anche genomi di altre specie, soprattutto procarioti.
Ogni singolo genoma è interessante di per sé, ma è utile in particolare
ai fini dell’analisi comparativa con il genoma umano.