Tecniche per il nervo
periferico
Tecniche di Anatomia Patologica Dott. Giorgio Bettarelli
I nervi periferici sono strutture
composite costituite da fibre
nervose, vasi sanguigni e tessuto
connettivo.
All’esame macroscopico appaiono
come cordoncini biancastri a
superficie esterna liscia.
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COMPOSIZIONE DEL NERVO
una guaina esterna formata da tessuto connettivo
l’epinevrio, composto da tessuto fibroso lasso e
scarso tessuto adiposo nell’ambito del quale si
trovano i fascetti nervosi, arterie vene e vasi
linfatici.
Ogni singolo fascetto è a sua volta delimitato dal
perinevrio, costituito da file concentriche di cellule
perineurali appiattite separate da collagene. Lo
spessore del perinevrio varia a seconda dello
spessore del fascetto.
Dal perinevrio di staccano sottili sepimenti
connettivali che riempiono gli spazi compresi tra le
singole fibre nervose costituendo l’endonevrio.
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In base alla presenza o meno di una guaina prodotta
dalle cellule di Schwann le fibre nervose si dividono
in:
mielinizzate e non mielinizzate.
Le fibre mielinizzate, nell’uomo, hanno un diametro
variabile tra 1μ e 20 μ, mentre quelle non mielinizzate
sono sempre di un diametro inferiore e sono raccolte in
gruppi di 8 – 15 circondate da una catena comune di
cellule satelliti (cellule di Schwann o di Remark ).
Ogni singolo assone mielinizzato è circondato dalla
sua catena di cellule di Schwann e dalla guaina
mielinica costituita dalle membrane plamatiche,
giustapposte e compattate, delle cellule di Schwann.
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La guaina mielinica si interrompe periodicamente in
corrispondenza del nodo del Ranvier che rappresenta quindi un
tratto di assone sprovvisto di guaina. Il tratto di fibra che è
compreso tra due nodi di Ranvier è chiamato segmento
internodale o internodo, la cui lunghezza è direttamente
proporzionale al diametro dell’assone.
La lunghezza degli internodi si mantiene relativamente costante in
una determinata fibra. La presenza di segmenti internodali
eccessivamente corti è generalmente un segnale di un
precedente danno alla cellula di Schwann.
Anche lo spessore della guaina mielinica è proporzionale al
diametro dell’assone.
La relazione tra il diametro dell’assone d e quello della fibra D è
espressa generalmente come valore d/D o g, è relativamente
costante ed ha un valore di circa 0,7.
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Le fibre dei nervi periferici possono anche essere
distinte in:
sensitive ( afferenti ) se conducono impulsi
sensitivi dalla periferia al centro;
motrici- somatiche (efferenti ) se conducono
impulsi motori ai muscoli scheletrici;
motrici – viscerali ( efferenti ) se conducono
impulsi motori alla muscolatura liscia o cardiaca;
eccitosecretrici ( efferenti ) se innervano le
ghiandole endocrine o esocrine
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Le neuropatie periferiche si dividono in:
mononeuropatie, un solo nervo è
colpito o più nervi in modo asimmetrico
polineuropatie in cui più nervi sono
colpiti in modo bilaterale e simmetrico.
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MONONEUROPATIE
Tutti quei processi patologici capaci di
indurre lesioni focali come traumi,
compressioni, malattie vascolari
infiammatorie o degenerative.
POLINEUROPATIE
possono essere genetiche oppure
sostenute da cause diverse, le più
frequenti sono quelle tossiche,
metaboliche o infiammatorie.
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Le biopsie nervose sono particolarmente informative
anche nei casi in cui si sospetti una patologia
infiammatoria come ad esempio casi di vasculite e
polineuropatia demielinizzante infiammatoria cronica
o anche nell’amiloidosi.
Le neuropatie demielinizzante sono facilmente
diagnosticabili specie utilizzando le preparazioni a
fibre singole.
Le mononeuropatie le sezioni trasversali permettono
di ben evidenziare la distribuzione focale delle
lesioni.
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Il coinvolgimento di differenti tipi di fibre è
altamente informativo per alcune neuropatie
genetiche. Ad esempio, la perdita prevalente di
piccole fibre mielinizzate caratterizza le
neuropatie ereditarie sensitive ed autonomiche
( tipo I, II, IV ), mentre le grandi fibre
mielinizzate sono caratteristiche della malattia
di Fiedreich.
La biopsia è anche indicata quando si abbia
una grave neuropatia periferica della quale non
sia possibile ipotizzarne la genesi su base
clinica.
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Indicazioni
La biopsia del nervo periferico è
riconosciuta oggi come una valida
procedura investigativa, ma, in
considerazione che si tratta di un metodo
invasivo che provoca nei pazienti delle
piccole menomazioni, deve essere
effettuata solo se veramente indicata e
naturalmente con il consenso informato del
paziente.
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Il fine dell’esame istopatologico del nervo
è quello di identificare le alterazioni
patognomoniche o caratteristiche per un
determinato gruppo di patologie
(amiloidosi disordini infiammatori,
malattie demielinizzanti ).
Inoltre l’esame bioptico fornisce utili
indicazioni sull’andamento temporale
della malattia (acuto, subacuto, cronico),
sull’entità della neuropatia e
sull’estensione della rigenerazione.
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E’ opportuno ricordare che le fibre nervose possono
facilmente subire alterazioni meccaniche e
chimiche. Gli artefatti si possono verificare sia in
fase di prelievo sia in quella di fissazione e
possono essere talmente gravi da rendere la
biopsia inutilizzabile ai fini diagnostici.
Risulta quindi estremamente importante seguire un
protocollo preciso per tre importanti fasi dell’esame
bioptico:
Selezione del nervo periferico per la biopsia
Tecnica di escissione da utilizzare
Trattamento del campione
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NERVI SENSITIVI
Il nervo più frequentemente usato per scopi
diagnostici è il nervo surale, contiene sia fibre
sensitive che autonomiche. Per questo motivo
esistono valori di controllo relativamente costanti
che permettono di definire con sufficiente precisione
il range di normalità.
Altri nervi sensitivi che possono essere a volte
utilizzati sono: il peroneo superficiale, il safeno, il
radiale superficiale e l’auricolare maggiore. Lo
studio di questi nervi è riservato a casi speciali, ma il
range di normalità è meno costante e i deficit residui
dell’intervento meno tollerati clinicamente.
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NERVI MISTI SENSITIVI E MOTORI
La porzione laterale del nervo peroneo
profondo è stata occasionalmente usata per lo
studio del sistema motorio. Vengono prelevati
alcuni fascetti laterali a livello della caviglia che
provocano un deficit funzionale del muscolo
estensore breve delle dita.
Questo nervo è piuttosto delicato e va incontro
ad alterazioni fisiologiche precoci che lo
rendono poco indicato per la biopsia.
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BIOPSIA COMBINATA NERVO E
MUSCOLO
La biopsia contemporanea del nervo e del
muscolo può essere utile nello studio di
lesioni focali, come le vasculiti. Può essere
ottenuta con una sola incisione per quanto
riguarda il nervo peroneo e il muscolo
peroneo breve, il nervo surale nel polpaccio
e il muscolo gastrocnemio.
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Generalmente un chirurgo esperto riesce a
prelevare un segmento di nervo della lunghezza di
circa tre centimetri con il minimo trauma.
Il campione, una volta escisso, viene inviato
immediatamente al laboratorio di istopatologia, per
evitare danni al tessuto, è opportuno che il nervo
venga avvolto in una garza imbevuta in soluzione
fisiologica a bassa temperatura ( è sufficiente del
ghiaccio attorno al contenitore ).
Nel laboratorio di istopatologia se il nervo è
sufficientemente lungo ( più di tre centimetri ) viene
diviso in due o tre porzioni.
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E’ indispensabile per ogni biopsia avere a
disposizione preparati:
fissati in formalina e inclusi in paraffina
fissati in gluteraldeide che possono essere
processati per la microscopia elettronica e per
le preparazioni a fibre singole.
congelare un frammento che può essere
conservato in azoto liquido per essere poi
utilizzato per studi di tipo immunoistochimico,
biochimico e di biologia molecolare.
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TRATTAMENTO DEL CAMPIONE
La prima tappa fondamentale per ottenere buoni
risultati finali è la fissazione, questa può
indurre una certa retrazione del nervo e quindi
causare degli artefatti. Ciò si può evitare se,
appena giunto in laboratorio, il nervo viene
orientato longitudinalmente e posto su di un
supporto al quale viene tenuto aderente. In
alternativa si possono applicare dei piccoli pesi
all’estremità distale del nervo mentre
l’estremità prossimale viene ancorata ad un
tappo di sughero che viene messo a
galleggiare in un contenitore con il liquido
fissativo.
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Buoni risultati si ottengono facendo aderire su di un
supporto costituito da un piccolo rettangolo ricavato
da una mattonella di sughero le porzioni di nervo
prelevate
l nervo in pochi minuti aderisce bene al supporto e
può essere messo a fissare nei contenitori con
formalina tamponata al 4% e in gluteraldeide
facendo naturalmente attenzione che la superficie
del sughero con adeso il nervo sia rivolta verso il
basso.
La gluteraldeide viene usata ad una
concentrazione del 2,5% diluita in tampone di
Sorensen PH 7,4 ed il nervo viene lasciato fissare
per circa 24 ore a temperatura ambiente.
Successivamente il campione viene posto in
tampone di Sorensen e conservato in frigorifero a
4°C in attesa dei trattamenti successivi
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Post-fissazione
La porzione di nervo fissata in gluteraldeide e
orientata allo studio per la Microscopia
Elettronica e per la preparazione a fibre singole
viene ulteriormente divisa. Due piccole porzioni
agli estremi del nervo vengono sezionate
trasversalmente ( il taglio deve essere preciso e
perpendicolare all’asse del nervo ) e saranno
indirizzate alla processazione per l’inclusione in
resina, la porzione centrale viene liberata di parte
dell’epinevrio con l’utilizzo di pinzette a punta fine
e di uno stereo microscopio, in questo modo si
ottengono gruppi di fibre nervose
grossolanamente separate.
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La post-fissazione in osmio è importante
in quanto ottimo fissatore dei lipidi,
rende più stabili le strutture del nervo
per i trattamenti successivi, inoltre la
colorazione nera che da ai preparati
rende più visibili le fibre per la
preparazione delle fibre singole e
costituisce un primo lieve contrasto alle
sezioni per l’osservazione al
microscopio elettronico
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TAMPONE DI SORENSEN
E’ costituito da due soluzioni madri:
Soluzione A
Na2HPO4 anidro 9.47 gr
H2O distillata fino a 1000 cc.
Soluzione B
KH2PO4 anidro 9.08 gr.
H2O distillata fino a 1000 cc.
Per 100 ml di tampone a pH 7,4 occorrono:
80.4 ml di sol A
19,6 ml di sol B
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Inclusione in resina
Processazione: metodo di routine
•Alcool
•Alcool
•Alcool
•Alcool
•Alcool
•Alcool
•Alcool
•Ossido di propilene
•Ossido di propilene
%
50%
70%
80%
95%
95%
assoluto
assoluto
Tempo
15’
15’
15’
15’
15’
15’
15’
15’
15’
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Inclusione
Ossido di propilene + resina epossidica
1:1
60’ a T° ambiente.
Resina assoluta overnight a 4° C, il
contenitore deve essere aperto coperto da
una garza.
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Il giorno seguente, dopo ulteriore passaggio in
resina pulita, il campione viene incluso in apposite
celle in gomma.
Porre massima attenzione nell’orientamento del
nervo che deve consentire un taglio perfettamente
perpendicolare all’asse, per questo può essere
consigliabile avere dei piccoli frammenti di resina
polimerizzata da inserire come supporto al nervo.
Per facilitare l’orientamento dell’inclusione, non
sempre agevole a causa della resina che
uniforma le superfici del nervo, può essere utile
usare lo strereomicroscopio .
La polimerizzazione avviene in termostato:
60° C 16 – 20 ore.
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Un metodo alternativo di disidratazione e inclusione è
quello più rapido che utilizza come agente disidratante
l’acetone:
• 5 passaggi da 5’ ciascuno con acetone al 60% a T°
ambiente (60 cc. acetone + 40 cc acqua distillata)
• 5 passaggi da 5’ ciascuno con acetone assoluto a T°
ambiente
• 2 passaggi da 15’ con acetone assoluto + resina 1: 1 a
60° C
• 2 passaggi da 15’ con acetone assoluto + resina 1: 3 a
60° C
• 1 passaggio da 20’ con resina pura a 60°
• La polimerizzazione avviene in termostato:
60° C 16 – 20 ore.
• L’inclusione avviene nelle apposite celle in gomma
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RESINA EPOSSIDICA
La quantità minima di resina che è consigliabile
preparare è di 50 cc, la vischiosità dei costituenti
potrebbe comportare errori eccessivi nella
misurazione con risultati non costanti sulla
consistenza finale.
Per 50 cc occorrono:
30 cc di DDSA (induritore)
(dodecenil succinic anhydride )
10 cc di EPON 812
epossidi
10 cc di ARALDITE CY 212
1 cc diDMP30 (catalizzatore)
Tri( dimethylaminomethy)phenol
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Dalle inclusioni così ottenute si tagliano con
l’ausilio
dell’ultramicrotomo,
(LEICA
ULTRACUT UCT rotativo ad avanzamento
meccanico).
Prima del taglio le inclusioni devono essere
sottoposte a “sgrosso” e alla squadratura a
piramide trapezoidale.
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La forma a trapezio consente un facile
orientamento delle sezioni in particolare per
l’eventuale successiva riduzione per il taglio
delle sezioni “fini”.
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Dalle inclusioni così ottenute si tagliano con
l’ausilio dell’ultramicrotomo, (LEICA ULTRACUT
UCT rotativo ad avanzamento meccanico).
Le lame utilizzate sono di vetro ottenute dal taglio
di una barra di vetro alle quali si applica una
vaschetta per la raccolta delle sezioni.
Le sezioni semifini hanno uno spessore di
0,5 – 1 μ.
Raccolte su di un vetrino portaoggetti le sezioni
devono essere asciugate.
Un metodo valido per ottenere sezioni senza
pieghe, è quello di far asciugare le sezioni in una
capsula di Petri con all’interno un batuffolo di
cotone imbevuto di benzene e posta in termostato
a 60° C (sotto cappa aspirata).
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Blu di Toluidina su sezioni semifini
Soluzione colorante
1 gr di BORACE ( Sodio Tetraborato ) sciolto in 100cc di
H2O distillata, sull’agitatore magnetico scaldando la
soluzione si aggiunge
1 gr di BLU DI TOLUIDINA far sciogliere bene. La
soluzione è pronta per l’uso dopo qualche giorno.
Il colorante si versa dopo filtrazione sulle sezioni semifini
poste su di una piastra calda per 2-5 minuti. Il calore è
importante in quanto la resina essendo fondamentalmente
idrofoba impedirebbe le penetrazione del colorante
acquoso.
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Blu di Toluidina su sezioni semifini
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Sezione trasversale di fascetto nervoso fissato in formalina e incluso in
paraffina. Colorazione Ematosillina Eosina. E’ riconoscibile l’epinevrio
formato da tessuto connettivo lasso con voluminose diramazioni
vascolari ed il perinevrio che circonda i singoli fascetti.
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In alcuni casi selezionati è
opportuno procedere all’
allestimento di sezioni ultrafini per
l’osservazione ultrastrutturale che
consente di ottenere informazioni
dettagliate, ad esempio sulla
struttura della mielina o sulla
presenza di inclusioni e alterazioni
tipiche delle malattie metaboliche.
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Il taglio avviene sempre con
l’utramicrotomo dopo aver
selezionato e ridotto la piramide.
Si utilizza una lama di diamante.
Lo spessore delle sezioni “fini” varia
da 500 a 700 A
50 – 70 nmt (nanometri )
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COLORAZIONE DI SEZIONI ULTRAFINI
Le sezioni ultrafini vengono raccolte sul lato opaco di griglie di
rame da 150 – 200 mesh.
L’indice di misura mesh indica il numero di maglie della griglia.
Le griglie con le sezioni vengono poi colorate o meglio
contrastate con:
•ACETATO DI URANILE ( soluzione sovrasatura in alcool
etilico 95°) per 40’
•Risciacquo in alcool 95°
•CITRATO DI PIOMBO ( 0,1 gr di citrato di piombo in 4 ml di
NaOH 1N portato a 40ml con H2O bidistillata ) per 10’
•Risciacquo in H2O bidistillata
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PREPARAZIONE PER FIBRE SINGOLE
Dopo la post- fissazione in tetrossido di osmio ed i
successivi lavaggi ( Sorensen), i segmenti di nervo
vengono trasferiti in una soluzione composta da
tampone di Sorensen e glicerolo nella proporzione di
1:1 per 24 ore alla temperatura di 4°C successivamente
vengono posti in glicerolo puro. Il glicerolo agevola lo
scorrimento delle fibre nervose e ne facilita la
manipolazione.
La tecnica della preparazione a fibre singole richiede
molto tempo, lavorando con pinzette a punta sottile
osservando attraverso uno stereomicroscopio,
l’operatore elimina l’epinevrio e il perinevrio.
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PREPARAZIONE PER FIBRE SINGOLE
Si procede successivamente alla separazione
delle singole fibre o di gruppi di due o tre fibre
da ciascuno dei fascetti ottenuti. Quando si sono
ottenute fibre singole queste vengono trasferite
sudi un vetrino portaoggetto accostando fibre
provenienti da fascetti diversi per garantire un
campionamento randomizzato.
Vengono poi montate in balsamo.
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Preparazione a fibre singole. E’ visibile la degenerazione
assonale, per confronto, la fibra in alto è normale ed è visibile
un nodo del Ranvier.
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Colorazione immunoistochimica con anticorpo HAM 56 su
sezione longitudinale. Il nervo è sede di degenerazione
assonale l’anticorpo contorna le camere di digestione della
mielina nel citoplasma dei macrofagi.
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