IL LABORATORIO
Giuseppe Mameli
Dipartimento di Scienze Biomediche,
Sezione di Microbiologia
Università di Sassari
Influenza
L'influenza è una malattia respiratoria acuta dovuta alla infezione da virus influenzali. È una malattia stagionale che, nell'emisfero occidentale, si verifica durante il periodo invernale. Il primo isolamento di virus influenzale nell'uomo risale al 1933 in Inghilterra (ma in precedenza erano stati isolati virus influenzali sia da polli che da suini). Ci sono tre tipi differenti, costituenti il genere Orthomixovirus: il virus tipo A e il virus tipo B, responsabili della sintomatologia influenzale classica, e il tipo C, di scarsa rilevanza clinica (generalmente asintomatico).
Gli ortomixovirus (virus dell’influenza)
infettano molte specie animali
il serbatoio naturale è costituito dagli uccelli acquatici, che
spesso sono migratori
Come è fatto il virus dell’Influenza
nucleocapside
(segmenti di RNA
ricoperti di proteine)
pericapside
Spicole di emagglutinina
(H) e di neuraminidasi (N)
I virus aviario, umano, suino, ecc. hanno H e N differenti
ad es. H5 e H9 sono aviari, H1, H2, N1, sono umani
100 nm
Distribuzione dei 16 serotipi di HA
in natura
serotipo HA Uccelli
HA1
sì
HA2
sì
HA3
sì
HA4
sì
HA5
sì
HA6
sì
HA7
sì
HA8‐16
sì
Cavalli
Suini
sì
Uomo
sì
sì
sì
sì
sì
sì
sì
sì
sì
Distribuzione dei 9 serotipi di N in natura
Uccelli
Cavalli
Suini
Uomo
N1
sì
sì
sì
N2
sì
sì
sì
N3
sì
N4
sì
N5
sì
N6
sì
N7
sì
sì
N8
sì
sì
N9
sì
sì
World Health Organization (WHO)
Influenza Nomenclature
Influenza type
Geographic source
Hemagglutinin subtype
A/Panama/2007/99 (H3N2)
Year of isolation
Isolate number
Neuraminidase subtype
Influenza type B and C do not occur as subtypes.
influenza del 2007 detta "l'Americana".
Ceppo prevalente: A/Wisconsin/2007 (H3N2)
altri ceppi isolati: Nuova Caledonia e Malaysia
Il virus dell’influenza è un virus fragile
e facilmente fermato dall’immunità.
Per sopravvivere, attua la strategia di
mutare in continuazione
Fattori che sostengono le epidemie
e le epizoozie:
•
•
•
•
Drift antigenico
Riassortimento e shift antigenico
Immunità di breve durata
Salto di specie
Antigenic drift: deriva antigenica minore:
lievi mutazioni (in genere mutazioni puntiformi
Ser Cys Lys Arg
UCG ACA UUU GCG
Mutazione
UCG ACA CUU GCG
Trascrizione
AGC UGU GAA CGC
Traduzione
Ser Cys Glu Arg
• si ha nell’influenza A e B, non in C.
• sostituzioni, delezioni e inserzioni nei
geni dell’emagglutinina e della
neuraminidasi.
• responsabile delle epidemie annuali
HA cleavage and virulence
May ‘94 ‐>
June ‘94
PQ--RETR
low
cleavability
low
virulence
respiratory
infection
Dec ‘94 ‐>
Jan ‘95
PQRKRKTR
high
cleavability
high
virulence
systemic
infecton
?
Antigenic shift: deriva antigenica maggiore:
Un cambio importante nel virus dell’influenza
•Si ha solo nel virus influenzale di Tipo A
•Implica una modifica importante nel genoma virale
•Interessa virus influenzali umani e di altre specie animali
• Profonde modifiche nell’HA o nella NA, per riassortimento genico
• Ne viene fuori un virus con un NUOVO profilo antigenico
• Conseguenze PANDEMICHE
l’influenza è trasmessa dagli
uccelli acquatici (al centro)
direttamente (linee continue)
al pollame e ai maiali,
che
la trasmettono all’uomo
Influenza Antigenic Shift derivante da
riassortimento di segmenti genomici
PB1
PB2
PA
HA
NA
NP
M1 & 2
NS1 & 2
Isolato
aviario
PB1
PB2
PA
HA
NA
NP
M1 & 2
NS1 & 2
PB1
PB2
PA
HA
NA
NP
M1 & 2
NS1 & 2
Virus riassortito
Isolato
umano
256 p
ossibi
li
c o mb
inazio
ni
Nel 900 ci sono state tre superepidemie (pandemie)
di influenza:
1918
1957
1968
H1N1
H2N2
H3N2
la “Spagnola”
la ”Asiatica”
la “Hong Kong”
20-100 milioni di morti
1-2 milioni di morti
700.000 morti
1977
H1N1
Ricomparsa della Spagnola
Nessuna pandemia
2009 H1N1v la “suina/nordamericana” in corso
le pandemie di influenza si hanno quando
•il virus dell’influenza umana scambia geni con un altro virus influenzale
dentro un animale infetto,
oppure
•Un virus influenzale animale salta dagli animali all’uomo
Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian
Influenza A/(H5N1) Reported to WHO
22 January 2007
2003
Country
2004
cases deaths cases deaths
2005
2006
2007
Total
cases deaths cases deaths cases deaths cases deaths
Azerbaijan 0 0
0 0
0 0
8 5
0 0
8 5
Cambodia 0 0
0 0
4 4
2 2
0 0
6 6
China
1 1
0 0
8 5
13 8
0 0
22 14
Djibouti
0 0
0 0
0 0
1 0
0 0
1 0
60,6% mortalità
Egypt
0 0
0 0
0 0
18 10
1 1
19 11
Indonesia
0 0
0 0
19 12
56 46
5 4
80 62
Iraq
0 0
0 0
0 0
3 2
0 0
3 2
(dei casi arrivati
all’osservazione, che è
molto inferiore a quello
dei casi effettivi)
Thailand
0 0
17 12
5 2
3 3
0 0
25 17
Turkey
0 0
0 0
0 0
12 4
0 0
12 4
Viet Nam
3 3
29 20
61 19
0 0
0 0
93 42
Total
4 4
46 32
97 42
116 80
6 5
269 163
Total number of cases includes number of deaths.
WHO reports only laboratory‐confirmed cases. All dates refer to onset of illness.
From Medscape Infectious Diseases
La storia dell’influenza A(H1N1)v 2009
John G. Bartlett, MD :
10/27/2009
February 24 2009: Il paziente zero: bimba di 6 mesi del nord Messico
March 3, 2009: Inizia il riconoscimento di casi a Città del Messico
April 6, 2009: Focolaio a La Gloria, Mexico,(60%.colpiti)
April 15, 2009: Primi casi riconosciuti virologicamente e 1° caso USA: bambino di 10anni in California, positivo
per antigene influenzale H1, ma negativo per H1 e H3 stagionali
Aprile 24 2009: arriva in Italia la notizia di decine di casi in Messico, con mortalità del 25% , con allarme prepandemico, a livello 3. Allerta Influnet Sassari in serata.
April 26, 2009: USA dichiarano emergenza sanitaria.
April 29, 2009: Ministro della Salute Messicano riporta in 1 mese: 2155 casi di polmonite grave e 100 morti.
Aprile 30 2009: 1° campione pervenuto a Influnet Sassari: negativo.
Maggio 2 2009: 1° caso in Italia.
May 9, 2009: Riconoscimento di stato di pandemia, con casi riconducibili a viaggi aerei da Città del Messico.
June 11, 2009: L’Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO/OMS) dichiara che pandemia è a livello 6, la
nuova influenza H1N1 è ”incontenibile"; inoltre la maggior parte dei colpiti ha meno di 25anni, con
1/3 dei casi gravi tra giovani in buona salute.
July 1, 2009: Casi USA: >1 milione di infettati; 87% dei morti ha 5-59 anni.
July 17, 2009: WHO/OMS riporta 94512 casi confermati virologicamente e 429 morti, considerati la “punta
dell’iceberg." Si decide di fermarsi con la conta dei casi
Luglio 17 2009: 1° caso in Sardegna
July 20, 2009: Il Cile riferisce di A(H1N1)v nei tacchini, introducendo la possibilità di scambi con geni aviari
August 25, 2009: Previsione per gli USA: A(H1N1)v può infettare metà della popolazione, con 1.8 milioni di
ospedalizzati, e 30000-90000 morti.
August 31, 2009: WHO/OMS prevede che entro 2 anni si infetterà circa 1/3 della popolazione mondiale.
(l’influenza stagionale solitamente colpisce 5%-20% per stagione, con 200000 ospedalizzati e una
media di 36000 morti.
October 24, 2009: Gli USA dichiarano lo stato di emergenza nazionale per l’influenza A(H1N1).
Metà Novembre 2009: picco dell’epidemia in Italia
2° settimana Dicembre 2009: picco epidemia in Sardegna (?).
In connessione con la rete europea e con WHO/OMS
LABORATORI DELLA RETE NAZIONALE INFLUNET
I laboratori sono stati selezionati sulla base di un controllo di Qualità (QCA) diagnostico e di Proficiency, sulla reperibilità del Responsabile in caso di emergenza, e sulla presenza di strutture di bio‐contenimento.
TORINO
AO "Amedeo di Savoia" Dr.ssa V. Ghisetti
PIEMONTE
NOVARA
AO "Maggiore della Carità " Dr. G. Fortina
LIGURIA
GENOVA
UNIVERSITA' Prof. P. Crovari
MILANO
AO "L. Sacco" Prof.ssa M.R. Gismondo
LOMBARDIA
MILANO
UNIVERSITA' Dr. F. Pregliasco
PAVIA
IRCCS San Matteo Prof. G. Gerna
FRIULI VENEZIA GIULIA
TRIESTE
UNIVERSITA' Prof. C. Campello
VENETO
PADOVA
UNIVERSITA' Prof. G. Palù
PARMA
UNIVERSITA' Prof.ssa M.L. Tanzi
EMILIA ROMAGNA
BOLOGNA
AO "Sant'Orsola" Prof. V. Sambri
PISA
UNIVERSITA' Prof. L. Ceccherini Nelli
TOSCANA
FIRENZE
UNIVERSITA' Prof.ssa A. Azzi
SIENA
UNIVERSITA' Prof. E. Montomoli
MARCHE
ANCONA
AO "Ospedali Riuniti" Dr.ssa P. Bagnarelli
UMBRIA
PERUGIA
UNIVERSITA' PERUGIA Prof.ssa A. Iorio
ROMA
UNIVERSITA' CATTOLICA Prof. G. Fadda
LAZIO
CAMPANIA
ABRUZZO
MOLISE
PUGLIA
CALABRIA
SARDEGNA
SICILIA
ROMA
NAPOLI
NAPOLI
TERAMO
PESCARA
LARINO
BARI
I.R.C.C.S. “Lazzaro Spallanzani”,
Dott.ssa Maria Capobianchi
AO "Cotugno" DR. C. Esposito
AO RN "V. Monaldi" DR. R. Smeraglia
LECCE
Laboratorio Analisi di PO PO "Santo Spirito" AO "G. VIETRI" UOC Policlinico Laboratorio di Igiene del Di.S.Te.B.A. Università del Salento
Dott. G. Sciarra
Dr. P. Fazii
Dr.ssa M. Bucci
Prof.ssa M. Chironna
Dott.ssa Antonella Dedonno
COSENZA
SASSARI
PALERMO
AO "Annunziata" COSENZA
UNIVERSITA' UNIVERSITA' Dr.ssa C. Giraldi
Prof.ssa A. Dolei
Dr. F. Vitale
Laboratory Diagnosis
• Serology • Viral Detection
– Cell culture
– Antigen detection
• DFA
• Immunoassays (“rapid antigen tests”)
– Molecular
Serology
•
•
•
•
Not useful for clinical management
Retrospective diagnosis
Not standardized between labs
Surveillance and research purposes
Specimens for Influenza Virus Detection
• Nasopharyngeal swab (NP)
• Nasopharyngeal aspirate (NPA)
– Infants, young children
• Sputum
• Bronchoscopy specimens
Specimens for Virus Detection
• Swabs into Viral Transport Media
(contains antibiotics to inhibit bacterial growth)
• Store and transport at 4oC
Si lavora sotto cappe a flusso d’aria verticale
I filtri HEPA eliminano 99.97% delle particelle >0.3μM
Timing of Testing
(extrapolated from seasonal influenza)
• Immunocompetent
– Obtain within 5 days after illness onset
– Lower yield after 5 days (false negatives)
• Immunocompromised & infants/young children
– Shed virus for > 1 week
– Can obtain beyond 5 days Rapid Antigen Test (Rapid Influenza Diagnostic Test)
•
•
•
•
Rapid immunoassays
Assay time: 15‐40 min
Specimen Storage: 2‐8oC Differentiates Flu A and B
Rapid Antigen Tests
•
•
•
•
•
•
•
•
Rapid (15‐40 min)
Potential for point of care testing
Unable to assess specimen quality
Least sensitive of all methods (<50‐70%)
A negative result does not exclude influenza
Lower sensitivity in adults Needs higher viral titres in specimen for positive
Specificity of >95%
Cannot subtype virus
Molecular Detection for Influenza
• RT‐PCR (reverse‐transcriptase PCR)
• Detects different gene targets:
– Matrix gene → tells us it’s influenza A
– Seasonal H1, H3 gene → tells us it’s seasonal flu
if negative for these referred to as “untypeable”
– Pandemic H1 → tells us it’s pandemic H1N1
• Most sensitive method (more sensitive than culture and now the “gold standard”)
• Needs specialized instruments/training
• Assay time: 3 hrs
• expensive
RT Real Time PCR
Primers e sonda usati
Curva di calibrazione
con lo standard
plasmidico
Creazione del metodo in Real Time PCR
N°Plasmidi
Media Ct
SD
CV
105
28,1
0,007
0,025
104
31,3
0,247
0,790
103
36,1
0,233
0,645
102
38,4
0,353
0,919
10
41,5
0,431
1,038
1
-
-
-
Specifico
Sensibile
Riproducibile
Ricerca virus influenzale A(H1N1)v
Laboratorio di Riferimento Influnet Sardegna.
E S TE R NI S AS S AR I C AG LIAR I NUOR O OLBIA LANUS E I OZ IE R I OR IS TANO C AR BONIA IG LE S IAS ALG HE R O G HILAR Z A TE MP IO TOTALE
1
382
73
45
26
2
17
41
14
11
4
1
350
MAGGIO
Casi pervenuti
300
GIUGNO
250
LUGLIO
200
AGOSTO
150
SETTEMBRE
OTTOBRE
100
NOVEMBRE
50
DICEMBRE
0
CAMPIONI
ANALIZZATI
POSITIVI PER A
GEN. UMANO
POSITIVI PER
A/H1N1
13
630
Ricerca virus influenzale A(H1N1)v
Laboratorio di Riferimento Influnet Sardegna
Casi pervenuti
140
120
100
80
TOTALE
60
POSITIVI
40
20
45
°S
E
TT
IM
46
A
°S
N
A
E
TT
IM
47
A
N
°S
A
E
TT
IM
48
A
°S
N
A
E
TT
IM
49
A
°S
N
A
E
TT
IM
A
N
A
0
F L U S W INE 2009 T O T AL E
P O S IT IVI
%
45°S E T T IMANA
23
7 30,4
46°S E T T IMANA
50
22
44
47°S E T T IMANA
94
43
45
48°S E T T IMANA
126
76
60
49°S E T T IMANA
120
48
40
SARDEGNA: Settimana 2009 - 50 dal 7 al 13 dicembre 2009 Numero globale di
casi e tassi d’incidenza di influenza. L'incidenza è espressa come numero
di sindromi influenzali (casi) /1000 assistiti/settimana.
Incidenza Totale
10,81
0-4
Casi Inc
29
14,62
5 - 14
Casi Inc
67
15 - 64
Casi Inc
21,31
ITALIA
35
6,11
>65 anni
Casi Inc
5
2,9
Influenza AH1N1v: Totale dei casi accertati in Italia
4000000
Casi totali It
Decessi
3500000
casi/wk
3000000
% decessi
vaccinati
Influenza solita in Italia: 2‐3 milioni di casi
1000‐5000 morti
Tasso di mortalità: 0,03‐0,2%
incid/wk %
(Æ 20‐30 milioni casi attesi in pandemia)
Assist respirat
2500000
Ospedaliz
2000000
1500000
1000000
500000
0
24/4
8/5
22/5
5/6
19/6
3/7
17/7
31/7
14/8
28/8
11/9
25/9
9/10 23/10 6/11 20/11 4/12 18/12
ITALIA: incidenza dell’influenza per classi di età
Stagione 2006 - 2007
Stagione 2007 - 2008
Stagione 2007 - 2008
Stagione 2008 - 2009
A(H1N1)v 2009
CONCLUSIONI
Informazioni sanitarie chiave devono includere aspetti clinici e del laboratorio:
– piani sanitari
– disponibilità di assistenza sanitaria; – Coordinamento tra il laboratorio e i diversi reparti sanitari.
– Individuazione di casi da ospedalizzare, a cui eseguire il test.
– comunicazione e grado di avanzamento nel livello di pianificazione
– caratteristiche epidemiologiche, cliniche e virologiche
Non è facile produrre singole misure può essere meglio affermare quali interventi/contromisure sono utili e giustificabili (e quali non lo sono).
http://www.who.int/csr/disease/swineflu/assess/disease_swineflu_assess_20090511/en/index.html and
http://www.who.int/wer/2009/wer8422.pdf
40
GRUPPO INFLUNET- SARDEGNA
UNIVERSITA’ DI SASSARI
AZIENDA OSPEDALIERA UNIVERSITARIA
Antonina Dolei
Caterina Serra
Luciana Poddighe
Elena Uleri
Alessandra Mei
Dept Biomed. Sciences,
Center of Excellence for Biotech. Dev. Biodiv.Res.,
Univ. of Sassari, Italy
