Biologia Molecolare

Biologia Molecolare
CDLM in CTF 2010-2011 – La trascrizione negli eucarioti
 
I meccanismi della trascrizione
 
Organizzazione generale delle sequenze
regolative
 
Il macchinario generale della trascrizione
 
Si stima che molti eucarioti abbiano un
numero complessivo di geni compreso tra
20k e 25k geni
 
Alcuni geni hanno una espressione
pressoché costante (housekeeping genes)
 
La regolazione genica negli eucarioti
prevede diversi punti di controllo, il più
importante dei quali è la trascrizione
 
La definizione dei dettagli del meccanismo di
traduzione ha richiesto lo studio delle
interazioni proteina/DNA
L’espressione genica è controllata a diversi livelli. Questo permette di ottenere una
modulazione più efficace, specifica nel tempo e nello spazio.
La necessità di esprimere GENI DIVERSI in cellule e tessuti diversi nasce dalla diversità
nella specializzazione funzionale di cellule che hanno comunque lo stesso genoma
L’adattamento a condizioni ambientali in costante mutamento è strettamente correlato
con la regolazione genica.
 
Alcune delle proteine che intervengono nel
processo di trascrizione hanno affinità per il
DNA
 
Il legame al DNA avviene in regioni specifiche
 
Una molecola carica immersa in un campo elettrico si muove verso il polo di
carica opposta.
 
Il DNA, grazie ai numerosi gruppi fosfato, ha una carica netta negativa.
Questa carica è costante per unità di lunghezza.
 
Se inseriamo una molecola di dna in un campo elettrico questa migrerà
verso il polo positivo.
 
Se intrappoliamo il DNA in un gel poroso lo spostamento del DNA sarà
ostacolato dall’attrito.
 
Più grande è la molecola di DNA è maggiore sarà l’attrito: le molecole di
DNA più grandi migreranno più lentamente, quelle più piccole migreranno
più velocemente.
 
Questa è l’elettroforesi su gel.
 
Il DNA da analizzare presenta una estremità marcata.
 
Si eseguono due esperimenti paralleli: in uno il DNA viene
analizzato da solo, nell’altro il DNA viene prima fatto interagire
con una proteina che lega il DNA.
 
I due campioni vengono trattati con DNAsi I, un enzima che
produce dei tagli random in diverse posizioni
 
Viene così prodotta una popolazione di molecole di dna più
piccole, di varia lunghezza sulla base della posizione di taglio.
 
Nel campione con la proteina legata, la zona di legame è
inaccessibile alla DNAsi I. In questa zona non si verificano tagli.
 
Se facciamo correre i due campioni su un gel elettroforetico nel
campione senza proteina avremo una popolazione ben distribuita
di frammenti mentre nel campione trattato con la proteina ci sarà
un intervallo nel quale non si riscontrano frammenti. Le estremità
di questo intervallo determinano la zona coperta dalla proteina che
lega il DNA
 
Il DNA da analizzare presenta una estremità marcata.
 
Si eseguono due o più esperimenti paralleli: in uno il DNA viene
analizzato da solo, nell’altro il DNA viene prima fatto interagire con
una proteina che lega il DNA. E possibile fare altri esperimenti in cui
si utilizzano diverse DNA binding protein contemporaneamente
 
I campioni vengono fatti correre su gel elettroforetico utilizzando
concentrazioni saline particolari che consentano ai complessi DNAproteine di rimanere attivi.
 
Il primo esperimento produrrà una sola banda che corrisponde al
DNA libero.
 
Il secondo esperimento può produrre:
 
Una sola banda all’altezza della precedente significa che la proteina non si è legata al
DNA
 
Una sola banda con migrazione inferiore significa che la proteina si è legata
“ritardando” la migrazione del DNA.
 
La presenza di due bande (una all’altezza del DNA libero ed una ritardata) significa che
alla concentrazione di proteina utilizzata una parte del DNA è stato legato (banda in
ritardo) ed una parte no.
 
Il
macchinario
responsabile
della
trascrizione negli eucarioti è composto
anche da proteine che NON si legano
direttamente al DNA, ma che interagiscono
con altre proteine del macchinario stesso
 
La trascrizione prevede:
  Macchinario generale della trascrizione
  Fattori di trascrizione specifici
 
I meccanismi della trascrizione
 
Organizzazione generale delle sequenze
regolative
 
Il macchinario generale della trascrizione
 
 
Elementi promotori
 
Nucleo del promotore
 
Elementi prossimali
Elementi regolatori a lungo raggio
 
Enhancher
 
 
Silencer
Isolatori
 
LCRs
 
MAR
 
Lettera maiuscola > 50% dei promotori
 
Lettera minuscola < 50% dei promotori
 
 
TATA Box -> 32% potenziali nuclei
 
Lega TFIID (in particolare TBP)
 
Può agire senza Inr, BRE e DPE
DPE -> identificato nei TATAless – richiede Inr
 
 
Inr -> Simile a TATA (sinergico ma autonomo)
 
 
Lega TFIID (TAF9 TAF6)
Lega TFIID (TAF1 e TAF2)
DPE -> lega TFIIB
I TF legati attivano o reprimono
direttamente la trascrizione o
interagiscono con Enhancer/
Silencer
CAAT Box ->CBF
GC Box -> Sp1
•  Gli Enhancer sono specifiche sequenze di DNA
in grado di legare fattori proteici capaci di
aumentare l'efficacia dei promotori nell'attivazione
della trascrizione
• Al contrario, i Silencer sono specifiche sequenze
di DNA che legano inibitori proteici della
trascrizione
Sono entrambi elementi distali e per
interagire con la regione del promotore è
necessario che il DNA si ripieghi a formare
un’ansa.
 
Marcatori di confine della cromatina
(eterocromatina/eucromatina)
 
Attività di blocco di sequenze regolatrici distali