Clonaggio funzionale (Functional cloning) Identificazione e clonazione di un gene attraverso la sua funzione MALATTIA FUNZIONE Clonaggio posizionale (Positional cloning) Identificazione e clonazione di un gene attraverso la sua posizione MALATTIA MAPPATURA (proteina) GENE CLONAZIONE GENE MAPPATURA FUNZIONE GENETICA FISICA Functional cloning L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza della posizione sul genoma: sulla base del prodotto proteico strategia utilizzata per la clonazione del gene del fattore VIII della coagulazione, responsabile dell’emofilia A Functional cloning L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza della posizione sul genoma: sulla base del prodotto proteico oppure mediante l’uso di anticorpi specifici estrazione mRNA totale trascrizione in vitro proteine nascenti anticorpi specifici mRNA immunoprecipitazione del complesso polisomiale purificazione dell’mRNA specifico reverse-transcription per produrre il cDNA specifico utilizzo del cDNA per selezionare cloni specifici da cDNA libraries Functional cloning L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza della posizione sul genoma: sulla base del prodotto proteico oppure mediante l’uso di anticorpi specifici oppure mediante la sua similitudine a un gene umano paralogo o un gene ortologo di altre specie Positional cloning Identificazione e clonazione di un gene attraverso la sua posizione Il primo stadio consiste nel restringere il più possibile (<2Mb) la regione candidata. Raccogliere numerose famiglie affette dalla stessa malattia (possibilità di errore può essere l’eterogeneità genetica) Analizzare molti marcatori informativi ben mappati sul genoma La penetranza della malattia deve essere ben conosciuta. Se la malattia ha penetranza completa sono informative anche le ricombinazioni trovate negli individui sani, altrimenti sono utili solo quelle trovate negli individui affetti 8 6 3 2 1 8 7 5 4 6 6 2 2 6 5 2 2 1 6 2 2 8 6 3 2 1 8 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 2 5 2 5 5 5 1 4 1 3 7 5 2 5 2 5 5 5 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 3 6 5 5 7 8 7 4 4 2 5 4 6 5 2 6 2 2 3 6 5 5 7 8 6 5 2 6 2 2 7 4 4 2 5 4 2 5 2 6 2 2 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 8 6 3 2 1 8 7 5 4 6 6 2 2 6 5 2 2 1 6 2 2 8 6 3 2 1 8 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 2 5 2 5 5 5 6 5 2 6 2 2 2 5 2 5 5 5 2 2 1 9 5 5 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 3 6 5 5 7 8 7 4 4 2 5 4 6 5 2 6 2 2 3 6 5 5 7 8 6 5 2 6 2 2 7 4 4 2 5 4 1 4 1 3 7 5 2 5 2 6 2 2 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 8 6 3 2 1 8 7 5 4 6 6 2 2 6 5 2 2 1 6 2 2 8 6 3 2 1 8 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 2 5 2 5 5 5 6 5 2 6 2 2 2 5 2 5 5 5 2 2 1 9 5 5 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 3 6 5 5 7 8 7 4 4 2 5 4 6 5 2 6 2 2 3 6 5 5 7 8 6 5 2 6 2 2 7 4 4 2 5 4 1 4 1 3 7 5 2 5 2 6 2 2 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 6 5 2 6 2 2 8 6 3 2 1 8 7 5 4 6 6 2 2 6 5 2 2 1 6 2 2 8 6 3 2 1 8 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 2 5 2 5 5 5 1 4 1 3 7 5 2 5 2 5 5 5 2 2 1 9 5 5 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 3 6 5 5 7 8 7 4 4 2 5 4 6 5 2 6 2 2 3 6 5 5 7 8 6 5 2 6 2 2 7 4 4 2 5 4 2 5 2 6 2 2 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 8 6 3 2 1 8 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 2 6 5 2 2 1 6 2 2 8 6 3 2 1 8 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 2 5 2 5 5 5 1 4 1 3 7 5 2 5 2 5 5 5 2 2 1 9 5 5 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 3 6 5 5 7 8 7 4 4 2 5 4 6 5 2 6 2 2 3 6 5 5 7 8 6 5 2 6 2 2 7 4 4 2 5 4 2 5 2 6 2 2 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 8 6 3 2 1 8 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 2 6 5 2 2 1 6 2 2 8 6 3 2 1 8 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 2 5 2 5 5 5 1 4 1 3 7 5 2 5 2 5 5 5 2 2 1 9 5 5 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 3 6 5 5 7 8 7 4 4 2 5 4 6 5 2 6 2 2 3 6 5 5 7 8 6 5 2 6 2 2 7 4 4 2 5 4 2 5 2 6 2 2 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 8 6 3 2 1 8 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 2 6 5 2 2 1 6 2 2 8 6 3 2 1 8 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 2 5 2 5 5 5 1 4 1 3 7 5 2 5 2 5 5 5 2 2 1 9 5 5 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 3 6 5 5 7 8 7 4 4 2 5 4 6 5 2 6 2 2 3 6 5 5 7 8 6 5 2 6 2 2 7 4 4 2 5 4 2 5 2 6 2 2 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 8 3 8 2 7 9 9 4 6 4 1 6 8 3 8 2 7 9 9 3 2 3 5 8 8 3 8 2 7 9 5 3 5 3 1 7 8 3 8 4 2 3 9 3 2 3 5 8 Raccolte numerose famiglie si stima la verosimiglianza della mappatura mediante il calcolo del LOD SCORE (logaritmo della probabilità relativa di linkage) I II III 1a famiglia 1 2 A1 A1 B1 B1 A2 A2 B2 B2 1 2 3 A1 A2 B1 B2 A1 A2 B1 B2 A2 A2 B2 B2 1 2 3 4 A1 A2 B1 B2 A1 A2 B2 B2 A2 A2 B2 B2 A2 A2 B2 B2 I II III 1a famiglia 1 2 A1 A1 B1 B1 A2 A2 B2 B2 1 2 3 A1 A2 B1 B2 A1 A2 B1 B2 A2 A2 B2 B2 1 2 3 4 A1 A2 B1 B2 A1 A2 B2 B2 A2 A2 B2 B2 A2 A2 B2 B2 cr. parentali 3 cr. ricombinanti 1 I II III 2a famiglia 1 2 A1 A1 B2 B2 A2 A2 B1 B1 1 2 3 4 A1 A2 B2 B1 A1 A2 B2 B1 A1 A2 B2 B1 A1 A1 B2 B2 1 2 3 A1 A1 B2 B2 A1 A1 B2 B2 A2 A1 B1 B2 4 5 A1 A1 A2 A1 B2 B2 B1 B2 cr. parentali 5 cr. ricombinanti 0 I II III 3a famiglia 1 2 A2 A2 B2 B2 A1 A1 B1 B1 1 2 3 A1 A2 B1 B2 A1 A2 B1 B2 A1 A1 B1 B1 1 2 3 4 5 6 A1 A1 B1 B1 A2 A1 B2 B1 A1 A1 B1 B1 A1 A1 B1 B1 A2 A1 B2 B1 A2 A1 B2 B1 cr. parentali 6 cr. ricombinanti 0 I II III 1 4a e 5a famiglia 1 2 A2 A2 B1 B1 A1 A1 B2 B2 1 2 3 4 A2 A1 B1 B2 A1 A1 B2 B2 A2 A1 B1 B2 A2 A2 B1 B1 2 3 4 5 A1 A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A1 A1 B2 B2 B1 B2 B1 B2 B2 B2 B2 B2 6 7 8 9 A1 A2 A2 A2 A2 A2 A1 A2 B2 B1 B1 B1 B1 B1 B2 B1 I II III 1 4a e 5a famiglia 1 2 A2 A2 B1 B1 A1 A1 B2 B2 1 2 3 4 A2 A1 B1 B2 A1 A1 B2 B2 A2 A1 B1 B2 A2 A2 B1 B1 2 3 4 5 A1 A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A1 A1 B2 B2 B1 B2 B1 B2 B2 B2 B2 B2 6 7 8 9 A1 A2 A2 A2 A2 A2 A1 A2 B2 B1 B1 B1 B1 B1 B2 B1 cr. parentali 4+4 = 8 cr. ricombinanti 1+0 = 1 Riassumendo 1a 2a 3a 4a 5a famiglia famiglia famiglia famiglia famiglia 4 5 6 5 4 meiosi meiosi meiosi meiosi meiosi = = = = = 3 5 6 4 4 cr. cr. cr. cr. cr. parentali parentali parentali parentali parentali + + + + + 1 0 0 1 0 cr. cr. cr. cr. cr. ricombinante ricombinanti ricombinanti ricombinante ricombinanti IN TOTALE 5 famiglie - 24 meiosi parentali 22 ricombinanti 2 invece secondo l’ipotesi dell’indipendenza parentali 12 ricombinanti 12