Clonaggio funzionale
(Functional cloning)
Identificazione e clonazione di
un gene attraverso la sua
funzione
MALATTIA
FUNZIONE
Clonaggio posizionale
(Positional cloning)
Identificazione e clonazione di
un gene attraverso la sua
posizione
MALATTIA
MAPPATURA
(proteina)
GENE
CLONAZIONE
GENE
MAPPATURA
FUNZIONE
GENETICA
FISICA
Functional cloning
L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza
della posizione sul genoma:
 sulla base del prodotto proteico
strategia utilizzata per la clonazione del gene del fattore VIII della
coagulazione, responsabile dell’emofilia A
Functional cloning
L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza
della posizione sul genoma:
 sulla base del prodotto proteico
oppure
 mediante l’uso di anticorpi specifici
estrazione mRNA totale
trascrizione in vitro
proteine nascenti
anticorpi specifici
mRNA
immunoprecipitazione del complesso polisomiale
purificazione dell’mRNA specifico
reverse-transcription per produrre il cDNA specifico
utilizzo del cDNA per selezionare cloni specifici da
cDNA libraries
Functional cloning
L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza
della posizione sul genoma:
 sulla base del prodotto proteico
oppure
 mediante l’uso di anticorpi specifici
oppure
 mediante la sua similitudine a un gene umano paralogo o
un gene ortologo di altre specie
Positional cloning
Identificazione e clonazione di un gene attraverso
la sua posizione
Il primo stadio consiste nel restringere il più possibile (<2Mb)
la regione candidata.
 Raccogliere numerose famiglie affette dalla stessa malattia
(possibilità di errore può essere l’eterogeneità genetica)
 Analizzare molti marcatori informativi ben mappati sul
genoma
 La penetranza della malattia deve essere ben conosciuta.
Se la malattia ha penetranza completa sono informative
anche le ricombinazioni trovate negli individui sani,
altrimenti sono utili solo quelle trovate negli individui
affetti
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9
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1
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2
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1
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5
5
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4
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5
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2
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3
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7
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2
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2
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4
2
5
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1
4
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6
5
2
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2
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2
2
1
9
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5
2
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2
2
7
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4
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6
2
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5
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2
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2
2
1
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2
6
5
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2
1
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2
2
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2
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1
9
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5
3
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5
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4
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2
2
3
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7
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2
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1
4
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7
5
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5
2
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2
2
2
2
1
9
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6
5
2
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2
2
7
5
4
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6
2
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3
2
1
8
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5
2
6
2
2
2
2
1
9
5
5
2
6
5
2
2
1
6
2
2
8
6
3
2
1
8
6
5
2
6
2
2
7
5
4
6
6
2
2
5
2
5
5
5
1
4
1
3
7
5
2
5
2
5
5
5
2
2
1
9
5
5
1
4
1
3
7
5
6
5
2
6
2
2
2
2
1
9
5
5
3
6
5
5
7
8
7
4
4
2
5
4
6
5
2
6
2
2
3
6
5
5
7
8
6
5
2
6
2
2
7
4
4
2
5
4
2
5
2
6
2
2
1
4
1
3
7
5
6
5
2
6
2
2
2
2
1
9
5
5
6
5
2
6
2
2
7
5
4
6
6
2
8
6
3
2
1
8
6
5
2
6
2
2
2
2
1
9
5
5
2
6
5
2
2
1
6
2
2
8
6
3
2
1
8
6
5
2
6
2
2
7
5
4
6
6
2
2
5
2
5
5
5
1
4
1
3
7
5
2
5
2
5
5
5
2
2
1
9
5
5
1
4
1
3
7
5
6
5
2
6
2
2
2
2
1
9
5
5
3
6
5
5
7
8
7
4
4
2
5
4
6
5
2
6
2
2
3
6
5
5
7
8
6
5
2
6
2
2
7
4
4
2
5
4
2
5
2
6
2
2
1
4
1
3
7
5
6
5
2
6
2
2
2
2
1
9
5
5
8
3
8
2
7
9
9
4
6
4
1
6
8
3
8
2
7
9
9
3
2
3
5
8
8
3
8
2
7
9
5
3
5
3
1
7
8
3
8
4
2
3
9
3
2
3
5
8
Raccolte numerose famiglie si stima la verosimiglianza
della mappatura mediante il calcolo del LOD SCORE
(logaritmo della probabilità relativa di linkage)
I
II
III
1a famiglia
1
2
A1 A1
B1 B1
A2 A2
B2 B2
1
2
3
A1 A2
B1 B2
A1 A2
B1 B2
A2 A2
B2 B2
1
2
3
4
A1 A2
B1 B2
A1 A2
B2 B2
A2 A2
B2 B2
A2 A2
B2 B2
I
II
III
1a famiglia
1
2
A1 A1
B1 B1
A2 A2
B2 B2
1
2
3
A1 A2
B1 B2
A1 A2
B1 B2
A2 A2
B2 B2
1
2
3
4
A1 A2
B1 B2
A1 A2
B2 B2
A2 A2
B2 B2
A2 A2
B2 B2
cr. parentali
 3
cr. ricombinanti  1
I
II
III
2a famiglia
1
2
A1 A1
B2 B2
A2 A2
B1 B1
1
2
3
4
A1 A2
B2 B1
A1 A2
B2 B1
A1 A2
B2 B1
A1 A1
B2 B2
1
2
3
A1 A1
B2 B2
A1 A1
B2 B2
A2 A1
B1 B2
4
5
A1 A1 A2 A1
B2 B2 B1 B2
cr. parentali
 5
cr. ricombinanti  0
I
II
III
3a famiglia
1
2
A2 A2
B2 B2
A1 A1
B1 B1
1
2
3
A1 A2
B1 B2
A1 A2
B1 B2
A1 A1
B1 B1
1
2
3
4
5
6
A1 A1
B1 B1
A2 A1
B2 B1
A1 A1
B1 B1
A1 A1
B1 B1
A2 A1
B2 B1
A2 A1
B2 B1
cr. parentali
 6
cr. ricombinanti  0
I
II
III
1
4a e 5a famiglia
1
2
A2 A2
B1 B1
A1 A1
B2 B2
1
2
3
4
A2 A1
B1 B2
A1 A1
B2 B2
A2 A1
B1 B2
A2 A2
B1 B1
2
3
4
5
A1 A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A1 A1
B2 B2 B1 B2 B1 B2 B2 B2 B2 B2
6
7
8
9
A1 A2 A2 A2 A2 A2 A1 A2
B2 B1 B1 B1 B1 B1 B2 B1
I
II
III
1
4a e 5a famiglia
1
2
A2 A2
B1 B1
A1 A1
B2 B2
1
2
3
4
A2 A1
B1 B2
A1 A1
B2 B2
A2 A1
B1 B2
A2 A2
B1 B1
2
3
4
5
A1 A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A1 A1
B2 B2 B1 B2 B1 B2 B2 B2 B2 B2
6
7
8
9
A1 A2 A2 A2 A2 A2 A1 A2
B2 B1 B1 B1 B1 B1 B2 B1
cr. parentali
 4+4 = 8
cr. ricombinanti  1+0 = 1
Riassumendo
1a
2a
3a
4a
5a
famiglia
famiglia
famiglia
famiglia
famiglia





4
5
6
5
4
meiosi
meiosi
meiosi
meiosi
meiosi
=
=
=
=
=
3
5
6
4
4
cr.
cr.
cr.
cr.
cr.
parentali
parentali
parentali
parentali
parentali
+
+
+
+
+
1
0
0
1
0
cr.
cr.
cr.
cr.
cr.
ricombinante
ricombinanti
ricombinanti
ricombinante
ricombinanti
IN TOTALE
5 famiglie - 24 meiosi
parentali
22
ricombinanti 2
invece
secondo l’ipotesi
dell’indipendenza
parentali
12
ricombinanti 12