SVILUPPO DI UN METODO DI ANALISI DELL’IMMAGINE IN
BIOLUMINESCENZA PER IL MONITORAGGIO IN VIVO DI INFEZIONI
BATTERICHE E DELL’AZIONE DI FARMACI
Patrizia Pasini1, Rita Aldini2, Enrico Roda3, Aldo Roda1
Dipartimenti di Scienze Farmaceutiche1, Scienze Chimiche2, Medicina Interna e
Gastroenterologia3, Università di Bologna
L’analisi dell’immagine in luminescenza è una tecnica analitica che permette la localizzazione
e quantificazione di molecole di interesse su una superficie bersaglio. La tecnica può essere
impiegata per studiare la distribuzione spaziale di analiti sia a livello microscopico (sezioni di
tessuto e singole cellule) sia a livello macroscopico (superficie di organi isolati, animali da
esperimento intatti).
Nel presente studio è stato sviluppato un metodo di analisi dell’immagine in bioluminescenza
per il monitoraggio in vivo di infezioni batteriche e dell’azione di farmaci. Come indicatori
bioluminescenti sono stati utilizzati dei batteri di un ceppo enterotossico di Escherichia coli
modificati geneticamente mediante l’inserimento nel cromosoma dell’intera cassetta genica
luxCDABE che codifica per il sistema bioluminescente luciferina/luciferasi derivato da batteri
spontaneamente luminescenti (Photorhabdus luminescens). In questo modo i batteri E. coli
esprimono costitutivamente i geni responsabili della luminescenza e sono stabilmente
luminescenti. Tali batteri sono stati introdotti per gavaggio nell’apparato gastroenterico di
animali da esperimento intatti (ratti e topi) e, a
vari intervalli di tempo, sono state acquisite
immagini del segnale luminescente sulla
CCD
superficie degli animali stessi, mediante un
sistema
di
analisi
dell’immagine
in
luminescenza basato su una videocamera CCD
raffreddata con un doppio Peltier (Night Owl,
EG&G Berthold), come schematizzato in
Figura 1.
Il metodo è stato ottimizzato in termini di
quantità di cellule e volume di sospensione Figura 1. Schema del dispositivo per analisi dell’immagine.
batterica somministrati, pH del mezzo di
coltura e all’interno dell’apparato gastroenterico, tempo di acquisizione delle immagini
digitali. La massima intensità di segnale è stata ottenuta somministrando circa 1010 cellule
batteriche in un volume di 2.5 mL. Il pH ottimale per la reazione bioluminescente, e per la
vitalità batterica, è 7.3-7.4. Studi in vitro ci hanno permesso di dimostrare che l’intensità di
segnale si riduce circa del 50% a pH 6, si mantiene pressochè costante a pH 5 e 4, per poi
ridursi drasticamente a pH 3; al contrario, a valori di pH 8 e 9 l’intensità dell’emissione non
varia significativamente. Di conseguenza, l’introduzione dei batteri nell’animale è stata
preceduta dalla somministrazione di 0.8 mL di bicarbonato di sodio all’8.4% per tamponare
l’ambiente acido dello stomaco. Il tempo di acquisizione ottimale con il miglior rapporto
segnale/fondo è risultato di 5 min.
Il primo risultato significativo è stato la visualizzazione di un segnale analitico intenso,
nonostante i fenomeni di assorbimento e di scattering dei fotoni che si verificano durante il
passaggio della luce attraverso i tessuti animali. In condizioni ottimizzate è stato possibile
monitorare in tempo reale la colonizzazione batterica dell’apparato gastroenterico.
Immediatamente dopo la somministrazione dei batteri il segnale luminoso è stato osservato in
corrispondenza dell’esofago, per essere poi rivelato in tratti successivi in corrispondenza del
procedere dei batteri, come mostrato in Figura 2, ottenuta elaborando con falsi colori le
immagini in b/n del segnale bioluminescente e sovrapponendole a quelle in luce riflessa
dell’animale. La misura del segnale analitico allo stesso tempo dopo la somministrazione dei
batteri in ratti diversi ha dato valori di intensità dello stesso ordine di grandezza (dopo 5 min,
2.3 – 4.9 x 104 fotoni/s/pixel), dimostrando la riproducibilità del modello.
15’
45’
75’
105’
135’
Figura 2. Localizzazione sulla superficie dell’animale intatto del segnale analitico derivante da batteri E. coli ricombinanti, resi
stabilmente bioluminescenti, introdotti nell’apparato gastroenterico.
A nostra conoscenza quello presentato è il primo modello di monitoraggio in vivo di infezioni
batteriche nel tratto gastroenterico di animali intatti effettuato con “probe” bioluminescenti. In
letteratura sono presenti alcuni studi in cui vengono utilizzati probe fluoresecnti, che
presentano l’inconveniente di essere accompagnati da un segnale di fondo molto elevato,
dovuto alla fluorescenza spontanea dei tessuti animali, che riduce notevolmente la rivelabilità
del segnale. Un altro vantaggio della bioluminescenza rispetto alla fluorescenza è la
possibilità di eseguire un’analisi quantitativa più accurata. A questo scopo verrà condotto uno
studio approfondito dei fenomeni di assorbimento e scattering dei fotoni attraverso i tessuti, in
modo da definire la relazione tra intensità del segnale superficiale e numero di cellule
batteriche presenti nel tratto gastroenterico. Le prospettive di questo studio includono la
valutazione dell’effetto della somministrazione di antibiotici o di probiotici in vivo, avendo a
disposizione un modello estremamente rapido e predittivo.
