131 - Dipartimento di Scienze Chimiche, della Vita e della
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SVILUPPO DI UN METODO DI ANALISI DELL’IMMAGINE IN BIOLUMINESCENZA PER IL MONITORAGGIO IN VIVO DI INFEZIONI BATTERICHE E DELL’AZIONE DI FARMACI Patrizia Pasini1, Rita Aldini2, Enrico Roda3, Aldo Roda1 Dipartimenti di Scienze Farmaceutiche1, Scienze Chimiche2, Medicina Interna e Gastroenterologia3, Università di Bologna L’analisi dell’immagine in luminescenza è una tecnica analitica che permette la localizzazione e quantificazione di molecole di interesse su una superficie bersaglio. La tecnica può essere impiegata per studiare la distribuzione spaziale di analiti sia a livello microscopico (sezioni di tessuto e singole cellule) sia a livello macroscopico (superficie di organi isolati, animali da esperimento intatti). Nel presente studio è stato sviluppato un metodo di analisi dell’immagine in bioluminescenza per il monitoraggio in vivo di infezioni batteriche e dell’azione di farmaci. Come indicatori bioluminescenti sono stati utilizzati dei batteri di un ceppo enterotossico di Escherichia coli modificati geneticamente mediante l’inserimento nel cromosoma dell’intera cassetta genica luxCDABE che codifica per il sistema bioluminescente luciferina/luciferasi derivato da batteri spontaneamente luminescenti (Photorhabdus luminescens). In questo modo i batteri E. coli esprimono costitutivamente i geni responsabili della luminescenza e sono stabilmente luminescenti. Tali batteri sono stati introdotti per gavaggio nell’apparato gastroenterico di animali da esperimento intatti (ratti e topi) e, a vari intervalli di tempo, sono state acquisite immagini del segnale luminescente sulla CCD superficie degli animali stessi, mediante un sistema di analisi dell’immagine in luminescenza basato su una videocamera CCD raffreddata con un doppio Peltier (Night Owl, EG&G Berthold), come schematizzato in Figura 1. Il metodo è stato ottimizzato in termini di quantità di cellule e volume di sospensione Figura 1. Schema del dispositivo per analisi dell’immagine. batterica somministrati, pH del mezzo di coltura e all’interno dell’apparato gastroenterico, tempo di acquisizione delle immagini digitali. La massima intensità di segnale è stata ottenuta somministrando circa 1010 cellule batteriche in un volume di 2.5 mL. Il pH ottimale per la reazione bioluminescente, e per la vitalità batterica, è 7.3-7.4. Studi in vitro ci hanno permesso di dimostrare che l’intensità di segnale si riduce circa del 50% a pH 6, si mantiene pressochè costante a pH 5 e 4, per poi ridursi drasticamente a pH 3; al contrario, a valori di pH 8 e 9 l’intensità dell’emissione non varia significativamente. Di conseguenza, l’introduzione dei batteri nell’animale è stata preceduta dalla somministrazione di 0.8 mL di bicarbonato di sodio all’8.4% per tamponare l’ambiente acido dello stomaco. Il tempo di acquisizione ottimale con il miglior rapporto segnale/fondo è risultato di 5 min. Il primo risultato significativo è stato la visualizzazione di un segnale analitico intenso, nonostante i fenomeni di assorbimento e di scattering dei fotoni che si verificano durante il passaggio della luce attraverso i tessuti animali. In condizioni ottimizzate è stato possibile monitorare in tempo reale la colonizzazione batterica dell’apparato gastroenterico. Immediatamente dopo la somministrazione dei batteri il segnale luminoso è stato osservato in corrispondenza dell’esofago, per essere poi rivelato in tratti successivi in corrispondenza del procedere dei batteri, come mostrato in Figura 2, ottenuta elaborando con falsi colori le immagini in b/n del segnale bioluminescente e sovrapponendole a quelle in luce riflessa dell’animale. La misura del segnale analitico allo stesso tempo dopo la somministrazione dei batteri in ratti diversi ha dato valori di intensità dello stesso ordine di grandezza (dopo 5 min, 2.3 – 4.9 x 104 fotoni/s/pixel), dimostrando la riproducibilità del modello. 15’ 45’ 75’ 105’ 135’ Figura 2. Localizzazione sulla superficie dell’animale intatto del segnale analitico derivante da batteri E. coli ricombinanti, resi stabilmente bioluminescenti, introdotti nell’apparato gastroenterico. A nostra conoscenza quello presentato è il primo modello di monitoraggio in vivo di infezioni batteriche nel tratto gastroenterico di animali intatti effettuato con “probe” bioluminescenti. In letteratura sono presenti alcuni studi in cui vengono utilizzati probe fluoresecnti, che presentano l’inconveniente di essere accompagnati da un segnale di fondo molto elevato, dovuto alla fluorescenza spontanea dei tessuti animali, che riduce notevolmente la rivelabilità del segnale. Un altro vantaggio della bioluminescenza rispetto alla fluorescenza è la possibilità di eseguire un’analisi quantitativa più accurata. A questo scopo verrà condotto uno studio approfondito dei fenomeni di assorbimento e scattering dei fotoni attraverso i tessuti, in modo da definire la relazione tra intensità del segnale superficiale e numero di cellule batteriche presenti nel tratto gastroenterico. Le prospettive di questo studio includono la valutazione dell’effetto della somministrazione di antibiotici o di probiotici in vivo, avendo a disposizione un modello estremamente rapido e predittivo.
