3. nucleosomi - Progetto e

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Ogni cellula con,ene circa 2 metri di DNA Diametro nucleo = 5 – 8 μm Come organizzare il DNA? Il DNA nucleare si distribuisce nei CROMOSOMI 3,2 x 109 coppie di nucleo2di distribuite in 24 cromosomi 1
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Compattamento del DNA nei cromosomi a) 
b) 
c) 
d) 
e) 
Contenimento nel ristretto spazio cellulare (o virale) Protezione da possibili danni Maggiore stabilità per una corretta espressione dell’informazione Efficiente trasmissione alle cellule figlie Organizzazione strutturale di ordine superiore: facilita l’espressione genica e la ricombinazione omologa, che genera la diversità individuale DNA + proteine (> parte istoni) = cromatina DNA viene ≈ 10.000 volte (da cm a μm) Diversi stadi 1) associazione DNA-­‐istoni => nucleosoma 2) associazione fra nucleosomi vicini Le molecole di DNA sono fortemente compattate Vi sono 3 livelli di ripiegamento: 1.  Nucleosomi (11 nm) 2.  Filamenti da 30 nm 3.  Anse radiali. 2
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Nucleosoma: Unità d’impacchettamento della cromatina Il nucleosoma è composto di un core di di otto
proteine istoniche e il DNA è avvolto intorno ad
esse. Il DNA tra ciascun nucleosoma è
chiamato DNA linker
Gli ISTONI sono le proteine più abbondanti associate al DNA eucariotico 5 tipi: H2A, H2B, H3, H4 (core del nucleosoma)
H1 (lega il DNA linker fra 2 nucleosomi)
proteine basiche, cioè cariche positivamente (> 20% di lisina e
arginina) PM 11-15 KDa (H1 è 20 kDa)
formati da un dominio ben conservato, detto histone-fold, formato
da 3 α-eliche separate da 2 loop non strutturati
Coda N terminale
Histone fold
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La parte centrale del nucleosoma contiene un ottamero istonico e un
DNA lungo 146 bp
Cromatina al
microscopio elettronico
Tutto l’istone H1 può essere rimosso senza alterare la struttura del
nucleosoma, il che suggerisce che si trova all’esterno della particella
Digestione DNA
nucleosomico con
Nucleasi micrococcica
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• Ci vogliono 80 paia di basi per fare un giro attorno all’ottamero
– due regioni di DNA che siano separate di 80 paia di basi nella
doppia elica in soluzione si trovano invece una vicina all’altra sulla
superficie del nucleosoma
• conseguenze funzionali
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H32*H42
Nocciolo centrale
1 dimero H2A*H2B
Visibile dall’alto
Tramite le loro cariche + gli istoni si legano alla porzione zucchero-­‐
fosfato del DNA carico -­‐ 6
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Il DNA è avvolto ≅1,7 volte intorno all’ottamero istonico,
Tutti e 4 gli istoni del nucleo stabiliscono contatti con il DNA: RIPIEGAMENTO ISTONICO L’associazione è mediata da un grande numero di legami idrogeno tra le proteine e gli atomi di ossigeno dei legami fosfodiestere, vicino al solco minore del DNA. 7
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14 siti di contatto 140 legami idrogeno Ciascun istone del
core possiede un
estensione
ammino-terminale
chiamata coda
che sporge
all’esterno del
nucleosoma
Posizioni code non ben definite ma sembra comunque che code di H3 e H2B passano tra I giri della superelica di DNA coda di H4 sembra stabilire contatti con un dimero H2A-­‐H2B 8
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La replicazione separa i filamenti di dna, quindi deve distruggere il nucleosoma, ma i nucleosomi si riformano immediatamente La maggior parte dei nucleosomi non sono fissi nella loro posizione, ma possono
venire posizionati in zone particolari (posizionamento dei nucleosomi).
Rendere accessibile siti di legame sul DNA a proteine regolatrici (DNA linker)
COMPLESSI DI RIMODELLAMENTO DEI NUCLEOSOMI ATP DIPENDENTI
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POSIZIONAMENTO dei NUCLEOSOMI
Disposizione dei nucleosomi su sequenze definite del DNA,
anzichè in siti casuali rispetto alla sequenza
Competizione tra gli istoni e le proteine sequenze specifiche
Il nucleosoma
richiede almeno 146
bp per formarsi
Alcune proteine
legano il
nucleosoma e ne
condizionano il
posizionamento
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da 1,1 m X 2 nm a circa 16 cm X 11 nm
Nucleosoma ≅ 200 bp (146 DNA core+60 DNA linker) Ogni giro d’elica contiene 10,5 bp ñ
200 bp/10,5 bp = 20 passi d’elica Ogni passo d’elica = 3,4 nm ñ
20 x 3,4 nm = 68 nm 68 nm/ 11 nm = 6 ñ
Fattore d’impaccamento
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Il ruolo dell’istone H1
L’H1 interagisce sia con una porzione centrale del DNA core che con ~20 bp di uno dei due DNA linker, facendo aumentare la lunghezza di DNA arrotolato. 12
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L’H1 induce i nucleosomi a
raggrupparsi in un insieme
ripetitivo ed ordinato
Per formare la fibra di 30 nm
Minore accessibilità per enzime e
proteine al DNA
Il legame di H1 aumenta il
compattamento del DNA sul
nucleosoma, imponendo una
costrizione sugli angoli di entrata e
uscita del DNA dal nucleosoma.
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L’istone H1 media la formazione della fibra da 30 nm L’aggiunta di H1 stabilizza una struttura cromatinica di ordine superione: la fibra da 30 nm Sono stati proposti due modelli alternativi per illustrare la formazione di questa struttura: i) modello a soleneoide Superelica contenente 6 nucleosomi/giro DNA linker parte della superelica e non attraversa mai l’asse del solenoide. ii) modello a zig-­‐zag differisce dal precedente per la diversa posizione del DNA linker, che attraversa l’asse longitudinale della fibra. fibra da 30 nm
• In condizioni di maggiore forza ionica la cromatina appare come una fibra da 30 nm. • Per ottenere questa struttura è necessaria la presenza dell’istone H1. • La fibra si avvolge su se stessa, con una periodicità di 6 nucleosomi per ogni giro, che corrisponde ad un rapporto di condensazione di 40 • La fibra da 30 nm è la struttura di base sia della cromatina interfasica che di quella mitotica. Probabilmente l’orientamento dei nucleosomi All’interno della fibra è quello del solenoide: i nucleosomi sono ruotati di 60° uno rispetto all’altro. L’istone H1 è probabilmente localizzato all’interno. Non conosciamo in dettaglio le strutture di ordine superiore in cui la fibra da 30 nm si organizza nel nucleo interfasico e nel cromosoma mitotico. 14
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Le code istoniche contribuiscono alla formazione della fibra da 30 nm mediando interazioni (legami a idrogeno) tra nucleosomi adiacenti. istoni del core privi di code non sono in grado di formare fibre da 30 nm Le proteine istoniche mostrano un elevatissimo livello di conservazione per tutta la loro lunghezza. 15
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L’impaccamento della cromatina sui nucleosomi: 6 volte: da 1 m a 16 cm nelle fibre da 30 nm: 40 volte: 1 m a 2.5 cm molto lontano dall’impaccamento necessario (10.000-­‐100.000 volte) per contenere il DNA nel nucleo. Strutture di ordine superiore della cromatina Il modello strutturale più accreditato realizza questo compattamento attraverso la formazione di anse (40-­‐90 kbp) bloccate alla base da una struttura proteica denominata scaffold nucleare topoisomerasi II e proteine SMC (Structural Maintenance of Chromosome) sono componenti essenziali dello scaffold nucleare. 16
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I filamenti da 30 nm si associano ad un’impalcatura di proteine non istoniche a formare le anse radiali. 17
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il DNA di un cromosoma è quindi un filamento continuo, in piccola parte aderente allo scaffold proteico, in misura maggiore espanso lateralmente in loops. 5 avvolgimenti della doppia elica
La compressione del DNA avviene a più livelli nucleosoma fibra da 30 nm fibra ad ansa fibra da 700 nm :cromatina si superavvolge (diametro dei singoli cromatidi) fibra da 1400 nm: livello di condensazione massimo (cromosomi mitotici) 18