Operatore vedere il DNA

VEDERE IL DNA MANUALE PER OPERATORE
il laboratorio didattico si svolge al polo scientifico di sesto fiorentino (laboratori 76, 78) oppure alla ex
farmitalia di viale Morgagni ed è di tipo teorico pratico.
La lezione comincia con una introduzione teorica che richiama i concetti di cellula e DNA supportata da
una presentazione in power point e prosegue con l'estrazione di DNA plasmidico da cellule batteriche.
OCCORENTE
COMPUTER PORTATILE e VIDEOPROIETTORE
STRUMENTI: Piastra/agitatore magnetico (o forno a microonde)
Centrifuga per tubi tipo eppendorf da 1,5 ml
Micropipette p10 p100 p1000
Cella elettroforetica completa (vasca, slitta, pettini) e alimentatore
Transilluminatore (lampada UV)
VETRERIA: cilindro graduato da 500 ml
becker da 300 ml
2 bottiglie da 500 ml
ALTRO: cellule di E. coli in coltura
estrazioni plasmidiche di controllo
ancoretta magnetica
camici rossi usa e getta
punte blu
punte gialle
REAGENTI: SOLUZIONI
soluzioni P1, P2, P3
isopropanolo
etanolo 70%
TE o acqua sterile
TEA 1X sufficiente per riempire la vasca elettroforetica e per fare il gel
BBF 10X
Bromuro di etidio
POLVERI
terreno di coltura LB (estratto di lievito, triptone, NaCl)
Agar per terreno solido
Agarosio per gel
ALLESTIMENTO LABORATORIO DIDATTICO
Gel di agarosio 0,8% in TEA 1X:
Scaldare fino a completa dissoluzione la soluzione di agarosio in TEA 1X, aggiungere la giusta quantità di
ET-Br e versare nella slitta. Attendere la solidificazione (30 min) prima dell'utilizzo.
allestire un numero di postazioni sufficienti per fare in modo che gli studenti possano lavorare a gruppi di 3
massimo 4 persone.
Per ogni postazione:
3 camici
3 paia di guanti
foglio di carta assorbente
cestino per raccogliere le punte
set di micropipette p10, p100, p1000
scatola punte blu
scatola punte gialle
rack
1,5ml di coltura batterica
P1, P2, P3 (almeno 500 µl in eppendorf)
isopropanolo (almeno 1 ml in eppendorf)
etanolo 70% (almeno 1 ml in eppendorf)
TE o acqua (almeno 500 µl in eppendorf)
1 eppendurf vuota
BBF 10X (almeno 10 µl in eppendorf)
SVOLGIMENTO ATTIVITA' DIDATTICA (2h 10')
Introduzione: la cellula e il DNA (10')
Introduzione al laboratorio e spiegazione del protocollo (15')
Svolgimento del protocollo di ESTRAZIONE DI DNA PLASMIDICO mediante QIAscreen (60')
Il QIAscreen è adatto all'estrazione di plasmidi di dimensioni non superiori alle 4-5 Kb; plasmidi di
dimensioni maggiori possono essere degradati.
l Si inocula il ceppo dal quale si vuole estrarre il DNA in 3 ml di LB in presenza
dell'antibiotico/i a cui il ceppo batterico è resistente e si pone a crescere in agitazione a
37°C fino alla mattina successiva.
La presenza dell'antibiotico si spiega con la resistenza portata dal plasmide e con la volontà di selezionare
solo le cellule che portano il plasmide di interesse.
l La mattina si centrifugano 1,5-3 ml di coltura per 2' a 12000 rpm
La coltura è una sospensione cellulare e la sua torbidità è dovuta alla presenza delle cellule (almeno un
miliardo per ml di coltura). Con la centrifugazione le cellule precipitano a formare il pellet perché il sistema
separa le varie componenti della soluzione a differente densità, nella fattispecie le cellule dal terreno di
coltura.
l Risospendere delicatamente il pellet in 0,3 ml di P1 (50mM Tris-HCl pH8, 10mM EDTA
pH 8.0 + RNasiA 100 g/ml).
Il primo componente della soluzione P1 è un tampone, soluzione in cui il pH non varia in modo
apprezzabile sia aggiungendo un acido sia aggiungendo una base. La sua funzione è quella di creare un
microambiente favorevole al mantenimento del DNA in condizioni ottimali. Il secondo componente è un
chelante degli ioni bipositivi(soprattutto calcio e magnesio) e la sua presenza si spiega per la necessità di
disattivere gli enzimi litici (DNAasi che utilizzano Mg come cofattore essenziale per il loro funzionamento)
che si liberano con la lisi cellulare e che potrebbero degradare il DNA; sottraendo il Ca invece si
destabilizzano le membrane biologiche le cui cariche superficiali negative sono in parte schermate da questo
ione e inoltre si riescono a produrre delle piccole aperture nella parete batterica. Il terzo componente è
un'enzima che determina la lisi dell'RNA (l'altro acido nucleico la cui quantità nella cellula è molto maggiore
a causa delle sue numerose funzioni: mRNA, tRNA, rRNA) necessaria per poter osservare bene solo il
segnale dovuto al DNA, che altrimenti potrebbe risultare “mascherato”.
l Aggiungere 0,3 ml di P2 (200mM NaOH, 1% SDS), agitare delicatamente per inversione
e incubare a temperatura ambiente per max 5'.
Il primo componente ha una funzione duplice, eleva il pH a valori tali da determinare un notevole stress
osmotico che contribuisce a destabilizzare la parete cellulare ed è inoltre un agente denaturante sulle
strutture cellulari e sul DNA cromosomico ad elevato peso molecolare. Il secondo componente è un
detergente, un sapone, che può infiltrarsi attraverso le regioni di parete destabilizzate ed andare a sciogliere
la membrana plasmatica. Quando la cellula subisce la lisi l'energia che si libera è tale da far deflagrare tutte
le strutture cellulari ad eccezione del DNA plasmidico che è protetto dal superavvolgimento. Il DNA
cromosomico ad alto peso molecolare subisce il processo nonostante il superavvolgimento a causa delle
sue grandi dimensioni, si spezza e va incontro a denaturazione (cosa che invece non interessa i plasmidi se il
tempo di incubazione è inferiore ai 5 minuti).
l Aggiungere 0,3 ml di P3 (2,55 M K-acetato pH 4,8), mescolare ancora per inversione e
centrifugare a 13000 rpm per 10'.
Questa soluzione riporta il pH a valori leggermente basici (intorno a 8) e determina la rinaturazione
talmente rapida delle strutture cellulari da risultare non perfetta. Le strutture curiosamente subiscono un
cambiamento delle proprietà ottiche che risultano nella formazione di flocculi biancastri. Il DNA plasmidico
invece non subisce alcun cambiamento. Con la centrifugazione le strutture cellulari macroscopiche (pareti,
membrane e DNA ad alto peso molecolare) finiscono nel pellet, mentre i plasmidi e le proteine restano in
soluzione.
l Recuperare il sopranatante con una micropipetta e trasferirlo in una nuova eppendorf.
l Precipitare il DNA con 0,7 volumi di isopropanolo mediante centrifugazione per 5’a
temperatura ambiente ed eliminare il sopranatante.
Gli alcoli possono essere usati per purificare o concentrare gli acidi nucleici. In soluzioni alcoliche gli
acidi nucleici precipitano, insieme a parte dei sali, e possono essere efficacemente separati da altri
componenti cellulari più solubili. In isopropanolo viene minimizzata la co-precipitazione delle proteine.
l Aggiungere 0,7 ml di etanolo 70%, centrifugare a 13000 rpm per 2' ed eliminare il sopranatante.
Si tratta di una ulteriore precipitazione in alcool che costituisce una fase di lavaggio del pellet di DNA.
l Lasciare essiccare per qualche minuto e risospendere in 18 µl TE (tris-Hcl pH 8, 1mM EDTA).
Questo reagente permette di risospendere il DNA in una soluzione nella quale può essere conservato. Da
notare la presenza di EDTA (chelante di ioni bipositivi) per mantenere inattive eventuali proteine litiche nei
confronti del DNA che fossero sfuggite alla rimozione.
l Conservare il DNA a 4°C per brevi periodi, oppure a -20°C per tempi più lunghi.
Caricamento dei campioni su gel di agarosio (15'). N.B. Ricordarsi di caricare un controllo
Far aggiungere 2 µl di BBF 10X al campione di DNA estratto e precedentemente risospeso in TE. Il blu di
bromofenolo è un colorante che serve per visualizzare la corsa elettroforetica su gel senza controllarla ogni
volta al transilluminatore. La soluzione contiene anche glicerolo che permette di appesantire il DNA e far si
che risulti più denso della soluzione tampone in cui è contenuto il gel. In questo modo il DNA può essere
depositato sul fondo dei pozzetti per elettroforesi.
Ripresa teorica: DNA plasmidico, elettroforesi e colorazione del DNA (20' durante la corsa
elettroforetica)
Osservazione dei risultati al transilluminatore(10')
Spiegare che le bande che si possono osservare sono le seguenti dall'alto (corrono di meno e quindi sono
più grandi) verso il basso (corrono di più e quindi sono più piccole):
1. DNA plasmidico circolare (forma open circle) non presente nella cellula, ma derivante da taglio su
una singola elica, dovuta al processo di estrazione, che determina la perdita del superavvolgimento.
2. DNA plasmidico superavvolto, la forma comunemente presente nelle cellule, che occupa meno
spazio e si muove più velocemente tra le maglie del gel
3. RNA e proteine sotto forma di una banda ampia (talvolta uno smear che occupa tutta la corsa
elettroforetica) dovuta al fatto che non abbiamo usato la RNAasi nel P1.