Metodi in vitro richiesti per la
classificazione H4 e H8
Laura Turco
Istituto Superiore di Sanità
Dipartimento Ambiente e Prevenzione Primaria
Reparto Meccanismi di Tossicità
Roma
[email protected]
«La classificazione dei rifiuti» Istituto Superiore di Sanità - Roma 17 ottobre 2013
Richiesta regolatoria
In ambito regolatorio quando si rende necessario effettuare nuovi
test tossicologici (valutazione del rischio di sostanze nuove e
preesistenti, registrazione di nuove sostanze, classificazione di
pericolosità) si richiede l’esecuzione di metodi alternativi alla
sperimentazione animale quando disponibili.
Normative vigenti a livello europeo che richiedono metodi alternativi:
Regolamento (CE) n.1107/2009 relativo all’immissione in commercio di prodotti
fitosanitari;
Regolamento (CE) n. 528/2012 relativo alla messa a disposizione sul mercato e all’uso
dei biocidi;
7°emendamento 2003/15/CEE alla Direttiva cosmetici (76/768/CEE);
Regolamento REACH.
Metodi alternativi alla sperimentazione animale
Refinement – Reduction - Replacement
Refinement: migliorano le condizioni
dell’animale
Reduction: si riduce il numero degli
animali senza alterare il
potere statistico del dato
Replacement: il modello animale è sostituito
da modelli in vitro
X
Validazione di un metodo alternativo
Si definisce l’affidabilità, la rilevanza, la riproducibilità e la
valenza predittiva del metodo.
Principi della validazione
1. Base scientifica e necessità del saggio
2. Relazione tra endpoints ed effetto
3. Protocollo dettagliato
4. Riproducibilità (variabilità intra-laboratorio e interlaboratorio)
5. Trasferibilità inter-laboratorio
6. Affidabilità del saggio (sostanze e dati di riferimento)
7. Campo di applicazione
Accettazione regolatoria del metodo
Linee Guida OCSE
Metodi alternativi validati
TGs 420,423,425,436, 429, 442 A e B
Metodi basati sull’uso di animali ma con applicazione di reduction e refinement
TGs 404 and 405
Raccomandazione di una strategia integrata per una valutazione a step a partire
da informazioni esistenti (refinement)
TGs 430,431,432, 435, 437
Metodi in vitro (applicazione del principio di replacement)
La «testing strategy» della TG 404 (2002)
Replacement: solo effetti topici?
I metodi alternativi di completa sostituzione sono prevalentemente
relativi ad effetti topici a causa delle caratteristiche dei modelli stessi.
Semplificazione
Graduale
aumento di
complessità
Replacement: solo effetti topici?
Definizioni di pericolo H4 e H8
H8: «Corrosivo» – Sostanze o preparati che, a contatto con tessuti vivi, possono
esercitare su di essi un’azione distruttiva.
H4: «Irritante» – Sostanze o preparati non corrosivi il cui contatto immediato,
prolungato o ripetuto con la pelle o le mucose può provocare una reazione
infiammatoria.
Corrosione cutanea
Studi di validazione per test in vitro
Transcutaneous electrical
resistance test
(TG 430)
Human skin model test
(TG 431)
Le Linee Guida OCSE definiscono le caratteristiche dei singoli test, le capacità
predittive e il campo di applicazione.
Corrosione cutanea in vitro I
Test di resistenza elettrica transcutanea (TER)
Riferimento: linea guida OCSE TG 430
Metodo ex vivo (Reduction)
«A validation study and other published studies have reported that rat skin
transcoutaneous electrical resistance (TER) assay is able to discriminate between
known corrosives and non-corrosives.»
La sensibilità della pelle del ratto è stata dimostrata nel corso dello studio di
validazione.
L’età (28-30 giorni) e la specie del ratto sono importanti per assicurare le condizioni
ideali della pelle (prima che inizi la crescita del pelo adulto).
Caratteristiche del test
Endpoint:
Perdita dell’integrità dello strato corneo e delle funzioni di barriera: maggiore
permeabilità al passaggio di ioni misurata come riduzione della TER al di sotto di
un valore soglia (cut-off 5kΏ).
Misurazione dell’impedenza cutanea
Compromessa integrità tissutale
Diminuzione di resistenza elettrica
Campo di applicabilità
«A validation study and other published studies
have reported that rat skin transcoutaneous
electrical resistance (TER) assay is able to
discriminate between known corrosives and noncorrosives.»
Procedura
Il disco di pelle separa una «receptor chamber»
da una «donor chamber», entrambe contenenti
solfato di magnesio 154 mM.
Quality control: TER > 10 kΏ
Procedura
Quality control (TER > 10 Ώ)
I dischi di pelle
devono provenire
da un singolo
animale
Controllo positivo (acido cloridrico 10 M)
Controllo negativo (acqua distillata)
Sostanza test
-
Eliminare la tensione superficiale della pelle con etanolo al 70%
Reidratare la pelle con soluzione di MgSO4 154 mM
Volume di liquido da testare è di 150 µl
Incubazione 24 ore a 20-23 °C
La sostanza viene eliminata con un getto d’acqua a 30°C
Misurazione della resistenza in soluzione di MgSO4 154 mM
Una successiva fase di colorazione del tessuto è prevista dalla procedura come test
di conferma per i risultati positivi inclusi quelli con valori vicino al 5kΏ.
Falsi positivi?
Sostanze che riducono la TER
Sostanze corrosive
Falsi positivi
Colorazione con sulforodamina B
Discrimina un semplice aumento di permeabilità agli ioni
dall’azione corrosiva che distrugge gli strati superficiali dell’epidermide
La quantità di colorante estratto dai dischi di pelle viene calcolata spettroscopicamente
mediante il coefficiente di estinzione molare (λ565nm = 8,7 x 104) e una retta di calibrazione.
-
Interpretazione dei risultati
I risultati si accettano solo se i controlli cadono nei rispettivi range.
-
Il valore TER > 5kΏ
-
-
La sostanza si considera NON CORROSIVA se:
Il valore TER ≤ 5kΏ e
Il disco di pelle non mostra danni
evidenti e
- Il contenuto di colorante estratto dal
disco è molto inferiore a quello del
controllo positivo.
La sostanza si considera CORROSIVA se:
Il valore TER ≤ 5kΏ e
Il disco di pelle mostra evidenti danni
-
-
Il valore TER ≤ 5kΏ e
Il disco di pelle non mostra danni
evidenti e
Il contenuto di colorante estratto dal
disco è ≥ a quello del controllo
positivo.
Diagramma di flusso operativo
TER ≥ 5kΏ
TER < 5kΏ
NON
CORROSIVO
Sono
presenti
danni evidenti
nella struttura
della pelle?
si
CORROSIVO
no
Colorazione
con
sulforodamina B
≥C+
CORROSIVO
<C+
NON
CORROSIVO
Come riportare i dati
-
-
I valori di resistenza (kΏ) e del contenuto di colorante (µg/disco) vanno
riportati in tabelle come dati singoli e medie ± SD inclusi i replicati del singolo
test e le ripetizioni dei test.
Informazioni del test report:
-
Caratteristiche delle sostanze utilizzate
Caratteristiche degli animali
Condizioni del test
Risultati
Discussione e conclusioni
Punti critici
-
Età e ceppo del ratto
-
Per ogni studio i dischi di pelle devono provenire da un singolo animale
Sensibilità e correlazione con uomo
dimostrate in fase di validazione del test
Quality control (TER > 10 Ώ)
Controllo positivo (acido cloridrico 10 M)
Controllo negativo (acqua distillata)
Sostanza test
-
Un aumento di TER nei dischi trattati indica la presenza residua
di sostanza test sulla superficie della pelle.
-
Il tipo di apparato e la procedura influenzano i risultati: il valore soglia
di corrosività di 5kΏ è il risultato dello studio di validazione con
l’apparato e la procedura indicati nella linea guida. Calibrazione del
metodo e valori soglia di resistenza.
Corrosione cutanea in vitro II
Test su epidermide umana ricostruita (RhE)
Riferimento: linea guida OCSE TG 431
L’epidermide umana ricostituita a partire da cheratinociti umani in particolari
condizioni di coltura è altamente rappresentativa delle proprietà fisiologiche e
biochimiche del tessuto d’origine.
I modelli di pelle umana sono disponibili in commercio (EpiDermTM e EPISKINTM)
Corrosione cutanea in vitro II
Test su epidermide umana ricostruita (RhE)
Riferimento: linea guida OCSE TG 431
Gli studi di validazione hanno stabilito la capacità di RhE di discriminare tra
corrosivi e non corrosivi noti.
Sensibilità 82%
(23/28)
Specificità 84%
(27/32)
Campo di applicabilità
- Può essere utilizzato con sostanze singole o preparati liquidi, solidi e semi-solidi.
- Permette la discriminazione tra Corrosivi e Non Corrosivi.
Caratteristiche del test
Le sostanze corrosive penetrano nello strato corneo per diffusione o erosione e
sono tossiche per le cellule degli strati sottostanti.
Endpoint di
citotossicità
valutato
Endpoint
misurato
Vitalità cellulare
Attività della succinato deidrogenasi
Conversione enzimatica
(deidrogenasi)
MTT
Sale tetrazolio
di bromuro
Sale blu
formazan
Technical proficiency
«Prior to routine use of any RhE test method that adheres to this Test Guideline,
laboratories should demonstrate technical proficiency, using the twelve Proficiency
Chemicals recommended in Table 1.»
-
Uguale numero di corrosivi e non corrosivi
Sostanze facilmente reperibili e che coprono le classi chimiche più importanti
Sono inclusi corrosivi forti e meno forti
Si utilizzano senza l’impiego di sostanze che implichino pericolo maggiore della
corrosività
Procedura pre-test
Prove da effettuare al momento della ricezione dei campioni di RhE:
-
Verifica delle proprietà di barriera tramite l’utilizzo di una sostanza marker:
IC50 o ET50
-
Il valore OD del colorante MTT estratto dal controllo negativo deve essere
almeno 20 volte superiore a quello del solvente di estrazione in assenza di
colorante (bianco).
Procedura
-
Si utilizzano due replicati per ogni condizione (tempi di esposizione) inclusi
i controlli.
Al termine del periodo di esposizione la sostanza viene dilavata con un
tampone salino.
Si procede con il test colorimetrico MTT.
-
I campioni liquidi si distribuiscono uniformemente (minimo
25 µl) sulla superficie del tessuto.
I campioni solidi si applicano uniformemente sulla
superficie del tessuto e vanno inumiditi con acqua distillata
per assicurare un buon contatto.
Per ogni test in parallelo alle sostanze si devono sempre
utilizzare i controlli negativo (0,9% NaCl o acqua ) e positivo
(8N KOH).
-
-
-
Al termine del periodo di esposizione la sostanza viene
dilavata con un tampone salino.
Si procede con il test colorimetrico MTT.
Interpretazione dei risultati
-
Si calcola la percentuale di vitalità relativa al valore di OD di ogni trattato
rispetto al valore OD del controllo negativo posto arbitrariamente come 100%.
-
Il valore cut-off della percentuale di vitalità che permette di discriminare tra
sostanze corrosive e non è stabilito per ogni modello di RhE durante gli studi di
validazione.
-
Esempio: criteri per la predizione di corrosività con il modello EpiDermTM
vitalità:
- 3’ ≥ 50%
- 15’ ≥ 15%
vitalità:
- 3’ < 50%
NON
CORROSIVO
CORROSIVO
vitalità:
- 3’ ≥ 50%
- 15’ < 15%
Punti critici
-
-
Proficiency exercise: verifica della performance del modello sperimentale.
- Quando: al momento del ricevimento dei campioni RhE e, se questi
vengono utilizzati di routine, le prove si effettuano ogni sei mesi un
anno.
-
Verifica delle proprietà di barriera tramite l’utilizzo di una sostanza marker:
IC50 o ET50
Nel test MTT:
- il valore di OD del controllo negativo deve essere almeno 20 volte
superiore di quello del solvente di estrazione tal quale (bianco).
- Verifica di eventuali interazioni tra il reagente MTT e le sostanze da
testare.
Irritazione cutanea
L’irritazione cutanea si manifesta con eritema
ed edema come il risultato di eventi a cascata
innescati in seguito alla penetrazione
dell’agente irritante attraverso lo strato
corneo e alla sua azione citotossica sui
cheratinociti che rilasciano citochine che
danno inizio al processo infiammatorio nel
derma sottostante.
I cheratinociti dei modelli RhE riproducono in
vitro gli eventi iniziali del processo quindi
consentono una quantificazione del processo
stesso.
Irritazione cutanea
EpiSkinTM
Studi di validazione
linea guida OCSE TG 439
EpiDermTM
SkinEthicTM
Stessi modelli della TG 431 ma il protocollo è diverso. I cheratinociti dei modelli
RhE presentano gli stessi meccanismi d’azione e innescano la cascata di reazioni
infiammatorie del processo di irritazione cutanea in vivo.
Campo di applicabilità
- Può essere utilizzato con sostanze singole o preparati liquidi, solidi e semi-solidi.
- Limite fondamentale del metodo: non consente la classificazione degli irritanti
leggeri.
Possibili applicazioni
di questo metodo in
ambito regolatorio:
- Test di «replacement» come «stand-alone» test.
- Parziale «replacement» come parte di una strategia di test
integrati.
Caratteristiche del test
Endpoint di
citotossicità
Endpoint
misurato
Vitalità cellulare
Attività della succinato deidrogenasi
Conversione enzimatica
(deidrogenasi)
MTT
Sale tetrazolio
di bromuro
Sale blu
formazan
Technical proficiency
Le prove di performance e di proprietà di barriera si devono effettuare al momento
della ricezione dei modelli RhE e si ripetono ad intervalli regolari.
Lista dei «Proficiency chemicals»
Procedura pre-test
Valori di riferimento per le prove di funzionalità di barriera
Valori di riferimento per le prove di vitalità (OD)
Requisiti del test
Un singolo set sperimentale di tre replicati è sufficiente per una sostanza da
testare quando la classificazione è inequivocabile.
In caso di risultati borderline (replicati non concordanti e/o vitalità = 50±5%) si
procede con un secondo esperimento. Un terzo esperimento si prevede solo in
caso di discordanza tra i primi due.
La durata di esposizione e la temperatura dipendono da
quale dei tre modelli RhE si utilizza.
L’esposizione varia tra 15 e 60 minuti cui seguono 42 ore di
post incubazione.
La temperatura è compresa tra 20 e 37°C.
Procedura
-
-
-
I campioni liquidi si distribuiscono uniformemente (minimo
25 µl) sulla superficie del tessuto.
I campioni solidi si applicano uniformemente sulla
superficie del tessuto e vanno inumiditi con acqua distillata
per assicurare un buon contatto.
Per ogni test, in parallelo alle sostanze, si devono sempre
utilizzare i controlli negativo (acqua o PBS) e positivo (5%
SDS).
Al termine del periodo di esposizione la sostanza viene
dilavata con un tampone salino.
Si procede con il test colorimetrico MTT.
Interpretazione dei risultati
I valori di OD relativi alle sostanze test si esprimono in % di vitalità normalizzati
rispetto al controllo negativo posto come 100%.
Vitalità ≤ 50%
IRRITANTE
Vitalità > 50%
NON
IRRITANTE
Irritazione oculare
Definizione da Globally Harmonised System for the Classification of
Chemical and Mixtures (GSH):
Qualsiasi cambiamento nell’aspetto dell’occhio a seguito
dell’applicazione di una sostanza sulla superficie anteriore dell’occhio
che sia completamente reversibile entro 21 giorni dall’applicazione.
Il metodo classico si basava sull’applicazione delle sostanze sugli occhi dei conigli
(Test in vivo Draize TG405 aggiornata al 2012).
Studi di validazione
Test BCOP
Bovine Corneal Opacity
and Permeability
TG 437
Test ICE
Isolated Chicken Eye
TG 438
Test BCOP
Bovine Corneal Opacity and Permeability
TG 437
Endpoint considerati: spessore, opacità, livello di idratazione e permeabilità alla
fluoresceina della cornea.
Struttura ed integrità della cornea determinati istologicamente.
Limitazioni: la sensibilità del metodo non permette di discriminare i
leggermente irritanti.
In assenza di istologia si ha una sottostima per le sostanze che agiscono
principalmente su iride e congiuntiva.
Applicabile solo per la classificazione: distinzione tra corrosivi e severi irritanti.
Test ICE
Isolated Chicken Eye
TG 438
Endpoint considerati: danno corneale (opacità, tumefazione, permeabilità).
Struttura ed integrità della cornea determinati istologicamente.
Limitazioni: la sensibilità del metodo non permette di discriminare i
leggermente irritanti. Limitazioni per i solidi.
Applicabile solo per la classificazione: distinzione tra corrosivi e severi irritanti.
Metodo ex vivo
I metodi BCOP e ICE possono essere usati solo all’interno di una
strategia integrata di test
In pre-validazione un test basato su epitelio di cornea umana per
irritazione oculare con buone possibilità di discriminazione tra
irritanti e non irritanti.
Sensibilizzazione cutanea
Metodi alternativi al test in vivo su guinea pig (OECD TG 406):
- LLNA (Mouse Limph Node Assay): Reduction – Refinement
Metodi in vitro per H4 e H8
Un parere dell’Istituto Superiore di Sanità suggerisce un processo
decisionale a tappe per la classificazione «corrosivo» e «irritante».
Rifiuto
Pericoloso
H8 Corrosivo
> valore soglia
Quantificazione
Riserva
acido-alcalina
Test in vitro
Corrosione
cutanea
< valore soglia
Rifiuto
Pericoloso
H8 Corrosivo
N
e
g
a
t
i
v
o
Positivo
NON
CORROSIVO
Rifiuto
Pericoloso
H4 Irritante
NON
IRRITANTE
Positivo
Test in vitro
Irritazione
cutanea
Negativo
Grazie per
l’attenzione
[email protected]
