Metodi in vitro richiesti per la classificazione H4 e H8 Laura Turco Istituto Superiore di Sanità Dipartimento Ambiente e Prevenzione Primaria Reparto Meccanismi di Tossicità Roma [email protected] «La classificazione dei rifiuti» Istituto Superiore di Sanità - Roma 17 ottobre 2013 Richiesta regolatoria In ambito regolatorio quando si rende necessario effettuare nuovi test tossicologici (valutazione del rischio di sostanze nuove e preesistenti, registrazione di nuove sostanze, classificazione di pericolosità) si richiede l’esecuzione di metodi alternativi alla sperimentazione animale quando disponibili. Normative vigenti a livello europeo che richiedono metodi alternativi: Regolamento (CE) n.1107/2009 relativo all’immissione in commercio di prodotti fitosanitari; Regolamento (CE) n. 528/2012 relativo alla messa a disposizione sul mercato e all’uso dei biocidi; 7°emendamento 2003/15/CEE alla Direttiva cosmetici (76/768/CEE); Regolamento REACH. Metodi alternativi alla sperimentazione animale Refinement – Reduction - Replacement Refinement: migliorano le condizioni dell’animale Reduction: si riduce il numero degli animali senza alterare il potere statistico del dato Replacement: il modello animale è sostituito da modelli in vitro X Validazione di un metodo alternativo Si definisce l’affidabilità, la rilevanza, la riproducibilità e la valenza predittiva del metodo. Principi della validazione 1. Base scientifica e necessità del saggio 2. Relazione tra endpoints ed effetto 3. Protocollo dettagliato 4. Riproducibilità (variabilità intra-laboratorio e interlaboratorio) 5. Trasferibilità inter-laboratorio 6. Affidabilità del saggio (sostanze e dati di riferimento) 7. Campo di applicazione Accettazione regolatoria del metodo Linee Guida OCSE Metodi alternativi validati TGs 420,423,425,436, 429, 442 A e B Metodi basati sull’uso di animali ma con applicazione di reduction e refinement TGs 404 and 405 Raccomandazione di una strategia integrata per una valutazione a step a partire da informazioni esistenti (refinement) TGs 430,431,432, 435, 437 Metodi in vitro (applicazione del principio di replacement) La «testing strategy» della TG 404 (2002) Replacement: solo effetti topici? I metodi alternativi di completa sostituzione sono prevalentemente relativi ad effetti topici a causa delle caratteristiche dei modelli stessi. Semplificazione Graduale aumento di complessità Replacement: solo effetti topici? Definizioni di pericolo H4 e H8 H8: «Corrosivo» – Sostanze o preparati che, a contatto con tessuti vivi, possono esercitare su di essi un’azione distruttiva. H4: «Irritante» – Sostanze o preparati non corrosivi il cui contatto immediato, prolungato o ripetuto con la pelle o le mucose può provocare una reazione infiammatoria. Corrosione cutanea Studi di validazione per test in vitro Transcutaneous electrical resistance test (TG 430) Human skin model test (TG 431) Le Linee Guida OCSE definiscono le caratteristiche dei singoli test, le capacità predittive e il campo di applicazione. Corrosione cutanea in vitro I Test di resistenza elettrica transcutanea (TER) Riferimento: linea guida OCSE TG 430 Metodo ex vivo (Reduction) «A validation study and other published studies have reported that rat skin transcoutaneous electrical resistance (TER) assay is able to discriminate between known corrosives and non-corrosives.» La sensibilità della pelle del ratto è stata dimostrata nel corso dello studio di validazione. L’età (28-30 giorni) e la specie del ratto sono importanti per assicurare le condizioni ideali della pelle (prima che inizi la crescita del pelo adulto). Caratteristiche del test Endpoint: Perdita dell’integrità dello strato corneo e delle funzioni di barriera: maggiore permeabilità al passaggio di ioni misurata come riduzione della TER al di sotto di un valore soglia (cut-off 5kΏ). Misurazione dell’impedenza cutanea Compromessa integrità tissutale Diminuzione di resistenza elettrica Campo di applicabilità «A validation study and other published studies have reported that rat skin transcoutaneous electrical resistance (TER) assay is able to discriminate between known corrosives and noncorrosives.» Procedura Il disco di pelle separa una «receptor chamber» da una «donor chamber», entrambe contenenti solfato di magnesio 154 mM. Quality control: TER > 10 kΏ Procedura Quality control (TER > 10 Ώ) I dischi di pelle devono provenire da un singolo animale Controllo positivo (acido cloridrico 10 M) Controllo negativo (acqua distillata) Sostanza test - Eliminare la tensione superficiale della pelle con etanolo al 70% Reidratare la pelle con soluzione di MgSO4 154 mM Volume di liquido da testare è di 150 µl Incubazione 24 ore a 20-23 °C La sostanza viene eliminata con un getto d’acqua a 30°C Misurazione della resistenza in soluzione di MgSO4 154 mM Una successiva fase di colorazione del tessuto è prevista dalla procedura come test di conferma per i risultati positivi inclusi quelli con valori vicino al 5kΏ. Falsi positivi? Sostanze che riducono la TER Sostanze corrosive Falsi positivi Colorazione con sulforodamina B Discrimina un semplice aumento di permeabilità agli ioni dall’azione corrosiva che distrugge gli strati superficiali dell’epidermide La quantità di colorante estratto dai dischi di pelle viene calcolata spettroscopicamente mediante il coefficiente di estinzione molare (λ565nm = 8,7 x 104) e una retta di calibrazione. - Interpretazione dei risultati I risultati si accettano solo se i controlli cadono nei rispettivi range. - Il valore TER > 5kΏ - - La sostanza si considera NON CORROSIVA se: Il valore TER ≤ 5kΏ e Il disco di pelle non mostra danni evidenti e - Il contenuto di colorante estratto dal disco è molto inferiore a quello del controllo positivo. La sostanza si considera CORROSIVA se: Il valore TER ≤ 5kΏ e Il disco di pelle mostra evidenti danni - - Il valore TER ≤ 5kΏ e Il disco di pelle non mostra danni evidenti e Il contenuto di colorante estratto dal disco è ≥ a quello del controllo positivo. Diagramma di flusso operativo TER ≥ 5kΏ TER < 5kΏ NON CORROSIVO Sono presenti danni evidenti nella struttura della pelle? si CORROSIVO no Colorazione con sulforodamina B ≥C+ CORROSIVO <C+ NON CORROSIVO Come riportare i dati - - I valori di resistenza (kΏ) e del contenuto di colorante (µg/disco) vanno riportati in tabelle come dati singoli e medie ± SD inclusi i replicati del singolo test e le ripetizioni dei test. Informazioni del test report: - Caratteristiche delle sostanze utilizzate Caratteristiche degli animali Condizioni del test Risultati Discussione e conclusioni Punti critici - Età e ceppo del ratto - Per ogni studio i dischi di pelle devono provenire da un singolo animale Sensibilità e correlazione con uomo dimostrate in fase di validazione del test Quality control (TER > 10 Ώ) Controllo positivo (acido cloridrico 10 M) Controllo negativo (acqua distillata) Sostanza test - Un aumento di TER nei dischi trattati indica la presenza residua di sostanza test sulla superficie della pelle. - Il tipo di apparato e la procedura influenzano i risultati: il valore soglia di corrosività di 5kΏ è il risultato dello studio di validazione con l’apparato e la procedura indicati nella linea guida. Calibrazione del metodo e valori soglia di resistenza. Corrosione cutanea in vitro II Test su epidermide umana ricostruita (RhE) Riferimento: linea guida OCSE TG 431 L’epidermide umana ricostituita a partire da cheratinociti umani in particolari condizioni di coltura è altamente rappresentativa delle proprietà fisiologiche e biochimiche del tessuto d’origine. I modelli di pelle umana sono disponibili in commercio (EpiDermTM e EPISKINTM) Corrosione cutanea in vitro II Test su epidermide umana ricostruita (RhE) Riferimento: linea guida OCSE TG 431 Gli studi di validazione hanno stabilito la capacità di RhE di discriminare tra corrosivi e non corrosivi noti. Sensibilità 82% (23/28) Specificità 84% (27/32) Campo di applicabilità - Può essere utilizzato con sostanze singole o preparati liquidi, solidi e semi-solidi. - Permette la discriminazione tra Corrosivi e Non Corrosivi. Caratteristiche del test Le sostanze corrosive penetrano nello strato corneo per diffusione o erosione e sono tossiche per le cellule degli strati sottostanti. Endpoint di citotossicità valutato Endpoint misurato Vitalità cellulare Attività della succinato deidrogenasi Conversione enzimatica (deidrogenasi) MTT Sale tetrazolio di bromuro Sale blu formazan Technical proficiency «Prior to routine use of any RhE test method that adheres to this Test Guideline, laboratories should demonstrate technical proficiency, using the twelve Proficiency Chemicals recommended in Table 1.» - Uguale numero di corrosivi e non corrosivi Sostanze facilmente reperibili e che coprono le classi chimiche più importanti Sono inclusi corrosivi forti e meno forti Si utilizzano senza l’impiego di sostanze che implichino pericolo maggiore della corrosività Procedura pre-test Prove da effettuare al momento della ricezione dei campioni di RhE: - Verifica delle proprietà di barriera tramite l’utilizzo di una sostanza marker: IC50 o ET50 - Il valore OD del colorante MTT estratto dal controllo negativo deve essere almeno 20 volte superiore a quello del solvente di estrazione in assenza di colorante (bianco). Procedura - Si utilizzano due replicati per ogni condizione (tempi di esposizione) inclusi i controlli. Al termine del periodo di esposizione la sostanza viene dilavata con un tampone salino. Si procede con il test colorimetrico MTT. - I campioni liquidi si distribuiscono uniformemente (minimo 25 µl) sulla superficie del tessuto. I campioni solidi si applicano uniformemente sulla superficie del tessuto e vanno inumiditi con acqua distillata per assicurare un buon contatto. Per ogni test in parallelo alle sostanze si devono sempre utilizzare i controlli negativo (0,9% NaCl o acqua ) e positivo (8N KOH). - - - Al termine del periodo di esposizione la sostanza viene dilavata con un tampone salino. Si procede con il test colorimetrico MTT. Interpretazione dei risultati - Si calcola la percentuale di vitalità relativa al valore di OD di ogni trattato rispetto al valore OD del controllo negativo posto arbitrariamente come 100%. - Il valore cut-off della percentuale di vitalità che permette di discriminare tra sostanze corrosive e non è stabilito per ogni modello di RhE durante gli studi di validazione. - Esempio: criteri per la predizione di corrosività con il modello EpiDermTM vitalità: - 3’ ≥ 50% - 15’ ≥ 15% vitalità: - 3’ < 50% NON CORROSIVO CORROSIVO vitalità: - 3’ ≥ 50% - 15’ < 15% Punti critici - - Proficiency exercise: verifica della performance del modello sperimentale. - Quando: al momento del ricevimento dei campioni RhE e, se questi vengono utilizzati di routine, le prove si effettuano ogni sei mesi un anno. - Verifica delle proprietà di barriera tramite l’utilizzo di una sostanza marker: IC50 o ET50 Nel test MTT: - il valore di OD del controllo negativo deve essere almeno 20 volte superiore di quello del solvente di estrazione tal quale (bianco). - Verifica di eventuali interazioni tra il reagente MTT e le sostanze da testare. Irritazione cutanea L’irritazione cutanea si manifesta con eritema ed edema come il risultato di eventi a cascata innescati in seguito alla penetrazione dell’agente irritante attraverso lo strato corneo e alla sua azione citotossica sui cheratinociti che rilasciano citochine che danno inizio al processo infiammatorio nel derma sottostante. I cheratinociti dei modelli RhE riproducono in vitro gli eventi iniziali del processo quindi consentono una quantificazione del processo stesso. Irritazione cutanea EpiSkinTM Studi di validazione linea guida OCSE TG 439 EpiDermTM SkinEthicTM Stessi modelli della TG 431 ma il protocollo è diverso. I cheratinociti dei modelli RhE presentano gli stessi meccanismi d’azione e innescano la cascata di reazioni infiammatorie del processo di irritazione cutanea in vivo. Campo di applicabilità - Può essere utilizzato con sostanze singole o preparati liquidi, solidi e semi-solidi. - Limite fondamentale del metodo: non consente la classificazione degli irritanti leggeri. Possibili applicazioni di questo metodo in ambito regolatorio: - Test di «replacement» come «stand-alone» test. - Parziale «replacement» come parte di una strategia di test integrati. Caratteristiche del test Endpoint di citotossicità Endpoint misurato Vitalità cellulare Attività della succinato deidrogenasi Conversione enzimatica (deidrogenasi) MTT Sale tetrazolio di bromuro Sale blu formazan Technical proficiency Le prove di performance e di proprietà di barriera si devono effettuare al momento della ricezione dei modelli RhE e si ripetono ad intervalli regolari. Lista dei «Proficiency chemicals» Procedura pre-test Valori di riferimento per le prove di funzionalità di barriera Valori di riferimento per le prove di vitalità (OD) Requisiti del test Un singolo set sperimentale di tre replicati è sufficiente per una sostanza da testare quando la classificazione è inequivocabile. In caso di risultati borderline (replicati non concordanti e/o vitalità = 50±5%) si procede con un secondo esperimento. Un terzo esperimento si prevede solo in caso di discordanza tra i primi due. La durata di esposizione e la temperatura dipendono da quale dei tre modelli RhE si utilizza. L’esposizione varia tra 15 e 60 minuti cui seguono 42 ore di post incubazione. La temperatura è compresa tra 20 e 37°C. Procedura - - - I campioni liquidi si distribuiscono uniformemente (minimo 25 µl) sulla superficie del tessuto. I campioni solidi si applicano uniformemente sulla superficie del tessuto e vanno inumiditi con acqua distillata per assicurare un buon contatto. Per ogni test, in parallelo alle sostanze, si devono sempre utilizzare i controlli negativo (acqua o PBS) e positivo (5% SDS). Al termine del periodo di esposizione la sostanza viene dilavata con un tampone salino. Si procede con il test colorimetrico MTT. Interpretazione dei risultati I valori di OD relativi alle sostanze test si esprimono in % di vitalità normalizzati rispetto al controllo negativo posto come 100%. Vitalità ≤ 50% IRRITANTE Vitalità > 50% NON IRRITANTE Irritazione oculare Definizione da Globally Harmonised System for the Classification of Chemical and Mixtures (GSH): Qualsiasi cambiamento nell’aspetto dell’occhio a seguito dell’applicazione di una sostanza sulla superficie anteriore dell’occhio che sia completamente reversibile entro 21 giorni dall’applicazione. Il metodo classico si basava sull’applicazione delle sostanze sugli occhi dei conigli (Test in vivo Draize TG405 aggiornata al 2012). Studi di validazione Test BCOP Bovine Corneal Opacity and Permeability TG 437 Test ICE Isolated Chicken Eye TG 438 Test BCOP Bovine Corneal Opacity and Permeability TG 437 Endpoint considerati: spessore, opacità, livello di idratazione e permeabilità alla fluoresceina della cornea. Struttura ed integrità della cornea determinati istologicamente. Limitazioni: la sensibilità del metodo non permette di discriminare i leggermente irritanti. In assenza di istologia si ha una sottostima per le sostanze che agiscono principalmente su iride e congiuntiva. Applicabile solo per la classificazione: distinzione tra corrosivi e severi irritanti. Test ICE Isolated Chicken Eye TG 438 Endpoint considerati: danno corneale (opacità, tumefazione, permeabilità). Struttura ed integrità della cornea determinati istologicamente. Limitazioni: la sensibilità del metodo non permette di discriminare i leggermente irritanti. Limitazioni per i solidi. Applicabile solo per la classificazione: distinzione tra corrosivi e severi irritanti. Metodo ex vivo I metodi BCOP e ICE possono essere usati solo all’interno di una strategia integrata di test In pre-validazione un test basato su epitelio di cornea umana per irritazione oculare con buone possibilità di discriminazione tra irritanti e non irritanti. Sensibilizzazione cutanea Metodi alternativi al test in vivo su guinea pig (OECD TG 406): - LLNA (Mouse Limph Node Assay): Reduction – Refinement Metodi in vitro per H4 e H8 Un parere dell’Istituto Superiore di Sanità suggerisce un processo decisionale a tappe per la classificazione «corrosivo» e «irritante». Rifiuto Pericoloso H8 Corrosivo > valore soglia Quantificazione Riserva acido-alcalina Test in vitro Corrosione cutanea < valore soglia Rifiuto Pericoloso H8 Corrosivo N e g a t i v o Positivo NON CORROSIVO Rifiuto Pericoloso H4 Irritante NON IRRITANTE Positivo Test in vitro Irritazione cutanea Negativo Grazie per l’attenzione [email protected]