BIO-FLASH ®
VEDI CAMBI RISALTATI
®
BIO-FLASH anti-HCV
3000-8572
100 test
BIO-FLASH anti-HCV è un immunotest a chemiluminescenza a due step totalmente automatizzato per la
determinazione qualititativa degli anticorpi IgG contro il virus dell'Epatite C (HCV) nel siero e nel plasma
umano con lo strumento BIO-FLASH.
Introduzione
L’epatite C è un’infezione virale del fegato che era stata correlata alla trasmissione parenterale della “epatite non
A, non B”, fino all’identificazione dell’agente causale nel 1989. La scoperta e la caratterizzazione del virus
dell’epatite C (HCV) ha condotto alla comprensione del suo ruolo primario nell’epatite post-trasfusionale e la
1
tendenza a indurre un’infezione persistente.
Il virus dell’epatite C (HCV) è un virus a RNA incapsulato, a filamento singolo, a senso positivo. Il virus infetta le
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cellule epatiche e può causare una grave infiammazione del fegato con complicazioni croniche. L’insorgenza della
malattia è generalmente insidiosa, con anoressia, un vago disagio addominale, nausea e vomito, febbre e fatica,
fino all’ittero in circa il 25% di pazienti. Tra quelli esposti all’HCV, circa il 40% guarisce completamente, mentre i
restanti (sia che abbiano sintomi o meno) diventano portatori cronici. Il 20% di questi sviluppa la cirrosi. Tra quelli
3,4
affetti da cirrosi, una percentuale che può arrivare fino al 20% svilupperà un tumore del fegato.
L’HCV è la principale causa di epatite acuta e di malattie epatiche croniche, tra cui la cirrosi e il tumore del fegato.
Si stima che a livello globale 170 milioni di persone siano infette dall’HCV e che 3-4 milioni di persone siano
infettate ex novo ogni anno. L’HCV si diffonde principalmente tramite il contatto diretto con il sangue umano. Le
cause maggiori di infezione da HCV in tutto il mondo sono rappresentate dall’uso di sangue non selezionato per le
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trasfusioni e il riutilizzo di aghi e siringhe non adeguatamente sterilizzati.
La presenza di anticorpi anti-HCV non può essere confermata fino a 12-27 settimane dopo l’esposizione e questo
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crea un periodo finestra di sieronegatività e potenziale infettività.
Principio
Quando le microparticelle paramagnetiche del BIO-FLASH anti-HCV si mescolano e si incubano con il campione,
se esso presenta anticorpi specifici anti-HCV, questi ultimi si combinano con gli antigeni del HCV che ricoprono le
microparticelle. Dopo una separazione magnetica ed un lavaggio volto ad eliminare il campione residuo, si
aggiunge un tracciatore consistente in un anticorpo monoclonale anti-IgG umana marcato con isoluminolo, che si
unisce agli anticorpi IgG anti-HCV catturati dalle microparticelle. Dopo una seconda incubazione, una separazione
magnetica ed un altro lavaggio, si aggiungono i reagenti che attivano la reazione chemiluminescente. Il
luminometro del BIO-FLASH misura la luce emessa in unità relative di luce (URL), che sono direttamente
proporzionali alla concentrazione di IgG anti-HCV del campione.
Il BIO-FLASH utilizza un metodo di riduzione dei dati con adattamento ad una curva logistica a 4 parametri (4PLC)
per generare una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM). Questa curva è predefinita, dipende dal lotto e viene
memorizzata nello strumento mediante il codice a barre della cartuccia. Con la misurazione dei calibratori (forniti in
un kit a parte), la CCM predefinita si trasforma in una nuova Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica
per lo strumento. Le concentrazioni dei calibratori sono incluse nei codici a barre delle provette dei calibratori.
Schema della reazione:
Attivatori
(Triggers)
URL
Particella magnetica
Campione
Tracciatore
Emissione di luce
BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN
3000-8572 R02 07.2012 ita.doc
0459
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Componenti
Cartuccia reagenti
Il kit BIO-FLASH anti-HCV contiene una cartuccia reagenti per 100 determinazioni (REF 3000-8572).
Nota: il disegno della cartuccia è protetto da brevetto (US D565,741 / Disegno CE 000762992-0001)
Composizione della cartuccia reagenti:
La cartuccia è composta da 4 contenitori, così composti:
A.
1 contenitore cilindrico per la sospensione di
microparticelle ricoperte con HCV ricombinante
che rappresentano epitopi di HCV: Core, NS3,
NS4 e NS5.
B.
1 contenitore del tampone del test. Contiene
< 0,1% di sodio azide e 1,0% di Triton X-100.
C.
1 contenitore opaco del tracciatore, consistente in
un anticorpo monoclonale di topo anti-IgG umana
marcato con isoluminolo. Contiene < 0,1% di
sodio azide e 8,0% di etilenglicole.
D.
1 contenitore con diluente dei campioni. Contiene
< 0,1% di sodio azide.
Preparazione
Si veda la seguente figura.
Cartuccia: le microparticelle sedimentano durante il trasporto e lo stoccaggio, pertanto si devono mescolare
affinché si risospendano.
La prima volta che si utilizza la cartuccia la si deve capovolgere con cura per 30 volte senza che si formi
schiuma (le bolle possono far sì che i sensori di liquido dello strumento diano letture errate).
Verificare che le microparticelle si siano risospese completamente. In caso contrario, continuare a
capovolgere la cartuccia finché le microparticelle non saranno risospese nella loro totalità.
Se le microparticelle non si risospendono o se si riscontra la rottura del sigillo dei reagenti, NON UTILIZZARE
LA CARTUCCIA.
Dopo che le microparticelle si saranno risospese, collocare la cartuccia su una superficie solida e rimuovere
con attenzione la linguetta rossa di sicurezza per il trasporto.
Mantenendo la cartuccia sulla superficie solida, stringere le due linguette situate ai lati del tappo perforatore
(parte grigia) e premere la parte superiore della cartuccia fino a raggiungere la posizione di bloccaggio. Una
volta raggiunta la posizione di bloccaggio, le strisce dovranno rimanere nascoste. Non capovolgere la
cartuccia aperta.
Lasciare riposare la cartuccia per 5 minuti prima di caricarla nello strumento.
Dopo aver caricato la cartuccia, lo strumento mescola il suo contenuto in modo automatico ad intervalli periodici.
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Precauzioni
I reagenti BIO-FLASH sono solo per uso diagnostico IN VITRO.
Uso esclusivo per utilizzatori professionali.
Il tampone del test contiene < 0,1% di sodio azide e 1,0% di Triton X-100. Nocivo in caso di ingestione (R22).
Rivolgersi ad un medico in caso di ingestione (S46).
Il tracciatore contiene < 0,1% di sodio azide e 8% di etilenglicole. Nocivo in caso di ingestione (R22). In case of
ingestion, obtain medical attention (S46).
La sodio azide può reagire con i tubi e le tubature di scarico in piombo o rame, formando azidi metalliche altamente
esplosive. Al momento dello smaltimento dei residui di reagenti, sciacquare con abbondante acqua.
ATTENZIONE: MATERIALE A RISCHIO BIOLOGICO.
Smaltire tutti i materiali usati in appositi recipienti per materiale biocontaminante.
Si prega di non riutilizzare né reintrodurre alcun reagente nelle cartucce o nei contenitori.
Raccolta e conservazione dei campioni
Usare siero fresco (possono essere utilizzate anche provette con gel separatore di siero) o plasma (EDTA,
Li-eparina, Na-eparina, citrato e ACD). Controllare altri anticoagulanti prima del loro uso. I campioni non devono
essere inattivati mediante calore. Le particelle in sospensione devono essere eliminate per centrifugazione.
Consultare le direttive CLSI H18-A3 e H21-A5 per ulteriori informazioni relative a manipolazione, trasporto,
processo e conservazione dei campioni.
Siero
I campioni di siero possono essere conservati tra 2 °C e 8 °C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di
tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 °C. I campioni possono
essere congelati/scongelati al massimo 3 volte. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i
campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell’analisi.
Plasma
I campioni di plasma possono essere conservati tra 2 °C e 8 °C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di
tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 °C. Scongelare il plasma a
37 °C. Scongelare i campioni una volta sola. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i
campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell’analisi.
Volume di campione
Il volume di campione necessario per condurre un’unica prova con BIO-FLASH anti-HCV varia in base al tipo di
recipiente utilizzato. Utilizzando il recipiente per campione raccomandato (REF 3000-8209), per un test saranno
necessari almeno 26 µL più il volume morto, equivalente a 200 µL.
Altri materiali
I seguenti materiali non vengono forniti con la cartuccia reagenti e devono essere acquistati separatamente.
REF 3000-8573
REF 3000-8574
BIO-FLASH anti-HCV Calibrators (Calibratori)
BIO-FLASH anti-HCV Controls (Controlli)
Se si desiderano ulteriori informazioni, leggere attentamente le relative istruzioni.
Non utilizzare altri calibratori. Le informazioni necessarie allo strumento BIO-FLASH per calibrare il test
BIO-FLASH anti-HCV sono incluse nei codici a barre dei contenitori.
L’uso di controlli di altri fabbricanti può originare risultati imprevisti.
Prima di processare campioni, calibratori o controlli, assicurarsi che nello strumento BIO-FLASH vi sia una quantità
sufficiente dei seguenti consumabili:
REF 3000-8206
BIO-FLASH Cuvettes (Cuvette)
Nota: Il disegno delle cuvette è protetto da brevetto (US D560,816 / Disegno CE 000762984-0001)
REF 3000-8204
BIO-FLASH Triggers (Attivatori)
REF 3000-8205
BIO-FLASH System Rinse (Soluzione del sistema)
Strumento / conduzione del test
Nella Guida per l’Utente del BIO-FLASH si troveranno le istruzioni complete per condurre il test.
Calibrazione
Il codice a barre della cartuccia contiene una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM), valida per il lotto di reagenti.
Tuttavia, per tutti i reagenti è necessaria una Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per ciascun lotto e
valida fino alla data di scadenza di quest’ultimo. Quando i risultati dei controlli escono dal range di accettazione o
quando sono state effettuate regolazioni sullo strumento, si deve ottenere una nuova CCL.
Per configurare una CCL, leggere attentamente la Guida per l’Utente del BIO-FLASH.
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Controllo di qualità
Per effettuare un programma completo del controllo di qualità si raccomandano due livelli di controllo. I controlli
BIO-FLASH anti-HCV negativo e positivo sono stati progettati per il suddetto programma. I controlli devono essere
analizzati almeno ogni 24 ore per giorno di uso. Assicurarsi che i risultati dei controlli si trovino all’interno del range
di accettazione, perché in caso contrario si potranno avere risultati non validi e l’utente dovrà adottare misure
correttive. In questo caso esaminare tutti i risultati ottenuti dall’ultima verifica positiva del controllo di qualità
dell’analita in questione. Può rendersi necessaria la ricalibrazione dello strumento. Nella Guida per l’Utente dello
strumento si troveranno ulteriori informazioni. Per l’individuazione e la risoluzione di situazioni anomale relative al
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controllo di qualità consultare Westgard et al.
Conservazione e stabilità
I reagenti non ancora aperti si mantengono stabili fino alla data di scadenza riportata sull’etichetta della cartuccia
se conservati ad una temperatura di 2-8 °C in posizione verticale.
Una volta aperta, la stabilità della cartuccia caricata nello strumento BIO-FLASH o conservata a 2-8 °C è di
6 settimane.
Interpretazione dei risultati
La quantità di analita in ciascun campione si determina partendo dalla luce emessa (URL), mediante interpolazione
nella Curva di Calibrazione di Lavorazione memorizzata. I risultati del BIO-FLASH anti-HCV sono espressi in
S/CO (rapporto segnale/cut-off). Si tratta di un test qualitativo, in cui il valore numerico del risultato è solamente
indicativo del numero di anticorpi presenti.
La determinazione delle IgM anti-HCV con il test BIO-FLASH anti-HCV è interpretato come segue:
I campioni con un risultato < 0,90 S/CO si considerano non reattivi (negativi).
I campioni con un risultato ≥ 0,90 e < 1,00 S/CO si considerano indeterminati (zona grigia).
I campioni con un risultato ≥ 1,00 S/CO si considerano reattivi (positivi).
I campioni con risultato inizialmente reattivo o indeterminato devono essere rianalizzati in duplicato. Se entrambi i
valori della ripetizione sono inferiori a 0,9 l’interpretazione finale del test è negativa per gli anticorpi HCV. Se uno
dei risultati della ripetizione del duplicato è positivo o indeterminato il campione deve essere ulteriormente
analizzato con test supplementari per avere una conferma del risultato. Un risultato ripetutamente positivo indica
un’infezione da HCV.
Limitazioni
Il risultato di un unico campione non è sufficiente per diagnosticare un’infezione primaria da HCV. Pertanto, oltre ai
risultati del BIO-FLASH anti-HCV, si devono considerare altri dati, come ad esempio la sintomatologia, l’anamnesi
clinica, i risultati di altri test ed altre informazioni rilevanti. Un risultato negativo non esclude la possibilità di
esposizione o infezione da HCV. Come in tutti i test immunologici sensibili vi è la possibilità di ottenere risultati
positivi non ripetibili.
Risultati attesi
L’incidenza dell’HCV su scala globale non è ben conosciuta in quanto l’infezione acuta è generalmente
5
asintomatica. Le persone cronicamente infettate (e che non sanno di esserlo) potrebbero essere almeno
2-4 milioni negli Stati Uniti, 5-10 milioni in Europa e circa 12 milioni in India. Ogni anno si verificano 150.000 nuovi
casi negli USA e in Europa occidentale, e circa 350.000 in Giappone. Di questi circa il 25% sono sintomatici, e il
60-80% può progredire ad una patologia epatica cronica, mentre il 20% sviluppa la cirrosi. Alla fine circa il 5-7% dei
1,2
pazienti può morire a causa delle conseguenze dell’infezione.
La maggior parte dei paesi europei riporta una prevalenza dell’HCV tra lo 0,5% e il 2% nella popolazione
1
generale.
L’OMS stima che circa il 3% della popolazione mondiale sia stata infettata dall’HCV e che esistano oltre 170 milioni
3
di portatori cronici a rischio per lo sviluppo di cirrosi epatica e/o tumore del fegato.
Tasso molto elevati di reattività anticorpale HCV (>70%) sono stati osservati nei tossicodipendenti e negli
1
emofiliaci. Nei pazienti sottoposti ad emodialisi è stata osservata una prevalenza intermedia tra il 20 e il 30%.
L’incidenza è in calo, dato che la trasmissione tramite emoderivati è stata praticamente ridotta a zero e nel settore
3
sanitario si ricorre a precauzioni universali.
Caratteristiche funzionali
NOTA: i seguenti dati sono rappresentativi; i risultati dei singoli esperimenti possono variare rispetto a tali dati.
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Specificità
La valutazione della specificità si basa sul test di campioni di siero da un donatore di sangue non selezionato,
inclusi coloro che donano per la prima volta, e da pazienti ospedalizzati. Stato sottoposto a test un totale di
5022 campioni non selezionati provenienti da due banche del sangue, 3509 dalla Banc de Sang i de Teixits de
Catalunya (Spagna), e 1513 dal EFS Centre Atlantique site de Tours (Francia). Inoltre sono stati valutati
250 campioni di siero non selezionati provenienti da pazienti ricoverati nell’ospedale di Santa Creu i Sant Pau
(Spagna).
I campioni “Ripetutamente Reattivi” sono stati ritestati ricorrendo ad un test supplementare. Quindi è stata calcolata
la specificità, con i risultati illustrati nella seguente tabella.
Campioni
testati
n
5022
250
Donatori di sangue
Pazienti ospedalizzati
Inizialmente
reattivi
(IR)
n
25
13
Ripetutamente
RR
RR
reattivi
risultanti
risultanti
(RR)
indeterminati positivi
n
n
n
20
4
0
13
0
13
Specificità
%
99,7
100
Sensibilità
La sensibilitè à stata valutata testando i campioni con positività anti-HCV verificata. successivamente è stata
calcolata la sensibilità per ogni gruppo di campioni, con i risultati illustrati nella seguente tabella:
Non genotipizzati
≤1 giorno dopo il
campionamento
genotipo 1
genotipo 2
genotipo 3
genotipo 4 (non-c, non-d)
genotipo 4c/4d
genotipo 5
genotipo 6
Totale campioni
genotipizzati
Campioni
testati
n
197
Reattivi
Sensibilità
n
197
%
100
37
37
100
91
24
55
37
13
14
1
91
24
55
37
13
14
1
100
100
100
100
100
100
100
235
235
100
Sensibilità alla sieroconversione
Sono stati eseguiti ulteriori studi di sensibilità testando i campioni di 30 pannelli commerciali di sieroconversione
HCV. I risultati sono stati comparati ai metodi commerciali autorizzati.
In nove (9) pannelli è stata osservata una reattività precoce, in venti (20) pannelli è stata osservata una reattività
equivalente, e solo in un (1) pannello di sieroconversione il BIO-FLASH anti-HCV ha evidenziato una reattività
ritardata.
Precisione
Si valutò in conformità alle direttive CLSI EP05-A2, la precisione intra-test e totale (test per test e giorno per giorno)
in svariati test. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella:
Controllo negativo
Controllo positivo
Intorno al valore di cut-off
Media (S/CO)
0,26
3,16
0,94
% CV Intra-test
7,1
4,3
4,6
% CV Totale
12,3
9,2
8,1
Riproducibilità
Si valutò la riproducibilità tra duplicati, tra lotti e tra strumenti è stata valutata utilizzando 50 campioni. I risultati si
mostrano nella seguente tabella:
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Duplicato 2 vs. Duplicato 1
Lotto 2 vs. Lotto 1
Strumento 2 vs. Strumento 1
N
50
50
50
Co-negatività
100%
100%
100%
Co-positività
100%
100%
100%
Interferenze
Studi conformi alle direttive CLSI EP7-A hanno dimostrato che le seguenti sostanze potenzialmente interferenti non
alterano i risultati del BIO-FLASH anti-HCV:
Sostanza potenzialmente interferente
Emoglobina
Bilirubina indiretta
Bilirubina diretta
Trigliceridi
Fattore reumatoide
HAMA
Concentrazione
500 mg/dL
18 mg/dL
18 mg/dL
1300 mg/dL
800 UI/mL
1 µg/mL
% Interferenza
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
Reattività crociata
134 campioni positivi per una serie di cross-reagenti e campioni di donne in stato interessante sono stati analizzati
con BIO-FLASH anti-HCV. Si suppone che un potenziale cross-reagente provochi una reattività crociata quando la
diagnosi passa da negativa a positiva o viceversa. I campioni reattivi sono stati comparati ad un test di riferimento
per il quale non è stata dimostrata alcuna reazione crociata con la sostanza potenzialmente interferente. I risultati
sono riepilogati nella seguente tabella:
Reattività crociata potenziale
anti-Toxoplasma
anti-CMV (anticorpi contro il virus citomegalovirus)
anti-Rubella
anti-HDV IgG (anticorpi contro il virus dell'Epatite D)
IgG elevate
Mononucleosis
RF (fattore reumatoide)
ANA (anticorpi antinucleari)
anti-HBs
anti-HBc
anti-VZV (anticorpi di contro il virus della Varicella-Zoster)
RPR (Rapid Plasma Reagin)
Donne in gravidanza
Donne in gravidanza (incluse multipare)
anti-EBV (anticorpi contro il virus di Epstein-Barr)
IgM elevate
anti-HEV (anticorpi contro il virus dell'Epatite E)
HBsAg
HAV-IgG (anticorpi contro il virus dell'Epatite A)
HAV-IgM (anticorpi contro il virus dell'Epatite A)
anti-HIV (anticorpi contro il virus dell’immunodeficienza umana)
anti-HSV 1 (anticorpi contro il virus Herpes simplex di tipo 1)
anti-E. coli
Concordanza
6/6
6/6
6/6
8/8
4/4
5/5
5/5
5/5
6/6
5/5
5/5
5/5
7/7
5/5
4/4
6/6
5/5
6/6
6/6
5/5
3/3
6/6
15/15
Limite di rilevamento
In conformità alle direttive CLSI EP17-A, il limite di rilevamento (LR) si situa a 0,08 S/CO.
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