Cap. 18 - Ateneonline

Biologia molecolare 2/ed
Robert F. Weaver
Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl
Capitolo 18
Meccanismi di base nella replicazione e nel riparo del DNA
PER IL RIPASSO
1. Fai riferimento alla Figura 18.1. La replicazione conservativa manterrebbe uniti i due
filamenti parentali in una molecola, e genererebbe un nuovo duplex con due filamenti
neosintetizzati. Nella replicazione semiconservativa, i due filamenti parentali si separano, e
ciascuno di essi genera un nuovo duplex. Nella replicazione dispersiva, i filamenti si
interrompono, e dopo la replicazione ciascun filamento è costituito da tratti di DNA nuovi e
vecchi.
2. Fai riferimento alle Figure 18.3 e 18.4. Meselson e Stahl marcarono il DNA parentale in
cellule di E. coli con l’isotopo pesante dell’azoto (15N), quindi fecero crescere le cellule per
parecchie generazioni in presenza del’isotopo normale dell’azoto (14N). Infine, misurarono la
densità del DNA a vari tempi dalla crescita con l’azoto leggero. Le densità ottenute erano
compatibili con il solo meccanismo di replicazione semiconservativa.
3. Fai riferimento alla Figura 18.5.
4. Fai riferimento alla Figura 18.6. La comparsa di piccoli frammenti di DNA marcato (i
frammenti di Okazaki) a tempi brevi dall’aggiunta di nucleotidi marcati a cellule di E. coli che
stanno replicando il DNA del fago T4 comporta che la replicazione sia semi-discontinua. Nel
caso il meccanismo fosse stato continuo, non si sarebbero osservati piccoli frammenti di DNA
marcato. Ulteriori esperimenti che limitavano rotture nel DNA dovute a incorporazione errata di
dUMP dimostrarono che metà del DNA marcato a tempi brevi è corto, e metà è lungo. Quindi, la
replicazione è semi-discontinua.
5. Quando nel DNA si incorpora dUMP, quest’ultimo induce l’enzima uracile N-glicosilasi per
rimuovere l’uracile, lasciando un sito apirimidinico, che è facilmente rotto. Ciò genera piccoli
pezzi di DNA che assomigliano ai frammenti di Okazaki, anche dal filamento che si sta
replicando in maniera continua.
6. Fai riferimento ai contenuti online 18.2. Tuneko Okazaki e colleghi isolarono frammenti di
Okazaki e li trattatrono con DNasi per rimuovere il DNA, lasciando solo i primer di RNA. Essi
ottennero i frammenti di Okazaki da cellule con mutazioni nell’RNasi H o nell’attività nucleasica
della DNA polimerasi I, o in entrambe. Questi ultimi sono i due enzimi che degradano più
attivamente i primers, cosicché le cellule mutanti accumulavano primers per lo più intatti, che
non sarebbero stati evidenziabili in cellule selvatiche. Infine, Okazaki e colleghi misurarono le
dimensioni dei primers di RNA mediante elettroforesi su gel, e trovarono taglie medie di 10-12
nucleotidi.
7. Fai riferimento alla Figura 18.9 ed ai contenuti online 18.4. La marcatura del DNA di B.
subtilis in corso di replicazione con due substrati radioattivi a crescente attività specifica, e
quindi l’autoradiografia, generano strisce più deboli nel mezzo, e più scure ad entrambe le
estremità. A causa di questa simmetria, sappiamo che ciascuna di queste strisce rappresenta due
forcelle di replicazione che si allontanano da un’origine di replicazione situata al centro. Quindi,
la replicazione è bidirezionale.
Microfotografie elettroniche di plasmidi ColE1 in corso di replicazione, tagliati con enzimi di
restrizione, mostrano che il DNA da un lato della bolla di replicazione si mantiene sempre della
stessa lunghezza, mentre il DNA dall’altro lato diventa sempre più corto, man mano che la la
bolla di replicazione si espande. Ciò è in accordo con la replicazione unidirezionale; solo la
forcella dal lato che cresce di meno si sta muovendo.
8. Fai riferimento alla Figura 18.12.
9. Fai riferimento alla Figura 18.13.
10. Alla DNA polimerasi I fanno capo tre distinte attività. L’attività DNA polimerasica replica il
DNA durante il riparo di danni e durante la sostituzione dei primer di RNA. L’esonucleasi 3'–>5'
rimuove nucleotidi male appaiati all’estremità 3’ di DNA in corso di sintesi. L’esonucleasi 5'–>3'
rimuove i primer di RNA o le sequenze di DNA intorno ai siti del danno, in corso di riparo per
escissione.
11. Il frammento di Klenow mantiene l’attività DNA polimerasica e l’esonucleasi 3’->5’, ma non
conserva l’esonucleasi 5'–>3'. Nella nick translation si utilizza la DNA polimerasi I intatta, in
quanto è richiesta l’attività esonucleasica 5'–>3' per rimuovere il DNA a valle dell’interruzione .
Per il riempimento delle estremità è opportuno utilizzare il frammento di Klenow, per evitare che
l’esonucleasi 5'–>3' rimuova la regione che si estende al 5’, che costituisce lo stampo per la
sintesi di riempimento del DNA.
12. Solo la DNA polimerasi III è essenziale per la replicazione del DNA. Possiamo affermarlo,
in quanto mutanti privi di DNA polimerasi I o II sono vitali, mentre mutanti difettivi di DNA
polimerasi III non lo sono.
13. La subunità alfa della DNA polimerasi III è quella con l’attività polimerasica. Possiamo
affermarlo, in quanto il gene per la subunità alfa è stato clonato ed espresso, e la proteina che ne
deriva possiede l’attività polimerasica.
14. La subunità  della DNA polimerasi III è quella con l’attività di correzione delle bozze. La
Figura 18.17 mostra che il prodotto purificato del gene della subunità  possiede l’attività
esonucleasica 3’->5’, ma solo su duplex di DNA con appaiamenti sbagliati alle estremità.
15. Il sistema della correzione delle bozze comporta che l’estremità 3’ del DNA debba essere
perfettamente appaiata al suo filamento complementare, altrimenti la replicazione non può
proseguire. Inoltre, la DNA polimerasi non può sintetizzare DNA in assenza di un innesco
precedentemente formato. Quindi, un enzima che non effettua correzione delle bozze, e che non
richiede un’estremità 3’ perfettamente appaiata dovrà sintetizzare un primer per far iniziare la
sintesi del DNA.
Biologia molecolare 2/ed
Robert F. Weaver
Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl
16. Fai riferimento alla Tabella 18.2. La DNA polimerasi alfa è l’unica polimerasi eucariotica
con attività primasica, per cui si ritiene che sintetizzi i primers su entrambi i filamenti stampo. La
DNA polimerasi delta, con il suo partner PCNA, è l’enzima maggiormente processivo, e sembra
che sintetizzi il DNA sia sul filamento veloce che su quello lento. La polimerasi beta non è per
niente processiva, cosicché essa è richiesta esclusivamente per il riparo del DNA. Anche la
polimerasi epsilon svolge le sue funzioni nel riparo del DNA. Infine, la polimerasi gamma si
trova esclusivamente nei mitocondri, ed è responsabile della replicazione del DNA
mitocondriale.
17. Un’elicasi srotola il DNA a valle della forcella di replicazione. Una DNA topoisomerasi
rilassa i superavvolgimenti positivi che si formano con lo srotolamento dei filamenti stampo
parentali.
18. Le proteine di legame al DNA a singolo filamento (SSB) si legano cooperativamente ai
filamenti denaturati, prevenendone la riassociazione. Inoltre, le SSB batteriche stimolano le
rispettive DNA polimerasi e prevengono la degradazione del DNA in replicazione. Le SSB
eucariotiche possono stimolare le DNA elicasi.
19. L’incisione (nicking) di un filamento di DNA superavvoltopermette la rotazione libera del
filamento di DNA intatto opposto all’incisione, il che rilassa il superavvolgimento.
20. Wang e colleghi hanno “intrappolato” la DNA girasi mentre rilassa una superelica di DNA,
denaturandola. Quindi essi esaminarono questo intermedio e riscontrarono che la girasi era
covalentemente legata a ciascuna estremità del duplex di DNA da essa interrotto. Ulteriori
esperimenti con DNA marcato mostrarono che un residuo di tirosina nell’enzima è associato alle
estremità marcate del DNA.
21. Fai riferimento alla Figura 18.23.
22. I raggi UV hanno un’energia relativamente bassa, e inducono la formazione di dimeri
pirimidinici sul DNA. I raggi X e gamma hanno un’energia molto più alta,, e sono in grado di
ionizzare le molecole, specialmente l’acqua, in prossimità delle molecole di DNA. Alcune di
queste specie ionizzate sono radicali liberi dell’ossigeno, composti altamente reattivi che
attaccano, ed alterano, le basi del DNA, o causano interruzioni nei filamenti di DNA.
23. La DNA fotoliasi ripara direttamente i dimeri di pirimidine rompendo i legami tra le
pirimidine. Fai riferimento alla Figura 18.28 per un’illustrazione del meccanismo.
L’O6 metilguamina metiltrasferasi accetta un gruppo metilico o etilico da basi alchilate nel
DNA. In questo modo, lo stesso enzima ne risulta inattivato irreversibilmente. Fai riferimento
alla Figura 18.29 per un’illstrazione schematica di questo meccanismo.
24. Il riparo per escissione della base generalmente agisce su basi alterate del DNA, mentre il
riparo per escissione di nucleotidi interviene su cambi più imponenti del DNA, come i dimeri di
pirimidine, in grado di distorcere l’elica. Fai riferimento alle Figure 18.30 e 18.33,
rispettivamente, per illustrazioni schematiche dei due meccanismi in E. coli. Fai riferimento alle
Figure 18.31 e 18.34, rispettivamente, per la descrizione di questi meccanismi nell’uomo.
25. Nel riparo per escissione della base (BER) umano, l’endonucleasi APE1 rimuove gli errori
commessi durante la fase di riempimento del gap da parte della DNA polimerasi beta. Evidenze
per l’importanza di APE1in questo processo provengono da due fonti. Innanzitutto, l’attività
esonucleasica 3’->5’ di APE1 è 50-150 volte più efficiente su un disappaiamento terminale,
rispetto ad una coppia di base ben appaiata. Inoltre, APE1 stimola la ligazione in vitro dei due
DNA, di cui uno dei de ha un disappaiamento terminale. Presumibilmente l’enzima ripara il
disappaiamento terminale, prima che avvenga l’unione dei DNA.
26. Le strutture dei cristalli mostrano che sia oxoG che la normale G sono estruse dalle rispettive
coppie di basi con il loro partner C. Tuttavia, oxoG si dispone in una diversa tasca dell’enzima,
rispetto a quella occupata dalla normale G. La tasca in cui è estrusa oxoG è il sito attivo della
glicosilasi, che rimuove l’oxoG dal DNA. Siccome la normale G è esclusa da questo sito, non
verrà rimossa.
27. Il riparo NER accoppiato a trascrizione sfrutta le stesse proteine del NER genomico globale,
ad eccezione di XPC. Mentre il NER genomico globale usa la proteina XPC per riconoscere gli
evidenti danni al DNA da riparare, il NER accoppiato a trascrizione sfrutta l’RNA polimerasi,
che naturalmente indugia sul sito del danno, in attesa delle altre proteine, per lo più proteine XP,
che operano il riparo.
28. Fai riferimento alla Figura 18.35. Nei passaggi (e) ed (f) si formano dei lembi, che vengono
rimossi, il che comporta la perdita di nucleotidi dal prodotto finale.
29. Il riparo per escissione di nucleotidi (NER) è mancante nella maggior parte dei casi di
Xeroderma pigmentosum. Poiché il NER è il meccanismo principale per la rimozione dei dimeri
di pirimidine, causati dai raggi UV, i pazienti XP sono particolarmente sensibili alla luce UV. Il
principale sistema di back-up nei pazienti XP è costituito dai sistemi di bypass del danno, che
replicano il DNA in corrispondenza dei dimeri di pirimidine. Spesso ciò comporta sintesi priva
di errori, specialmente nel caso della DNA polimerasi eta, che replica un dimero di pirimidine.
30. I pazienti XP-V sono privi della DNA polimerasi eta. L’incidenza di tumori della pelle in
queste persone è più bassa di quella dei tipici pazienti XP, in quanto esse hanno a disposizione il
sistema NER, per rimuovere efficacemente i dimeri di pirimidine. Il sistema di backup in questi
pazienti per i dimeri di pirimidine non riparati dal sistema NER è il bypass che produce errori,
catalizzato da altre DNA polimerasi specializzate, come la DNA polimerasi zeta.
31. Quando i cromosomi si rompono, i nucleosomi possono posizionarsi sulle interruzioni, o
nelle vicinanze, rendendo difficile il riparo. Il rimodellamento della cromatina sposta i
nucleosomi, in modo da consentire il riparo.
32. Fai riferimento alla Figura 18.36.
Biologia molecolare 2/ed
Robert F. Weaver
Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl
33. Fai riferimento alla Figura 18.37.
34. Fai riferimento alla Figura 18.38.
35. Il riparo per ricombinazione e il sistema di bypass che produce errori non sono veri processi
di riparo, in quanto essi semplicemente permettono al DNA danneggiato di essere replicato.
Questi meccanismi non riparano il danno.
36. Fai riferimento ai contenuti online 18.8. Hanaoka preparò substrati per il bypass di danni al
DNA con vari tipi di danno su un filamento, ed un filamento opposto che consisteva in un primer
marcato che terminava giusto prima del danno. Egli aggiunse questi substrati a sistemi di bypass
in vitro in presenza di nucleotidi e di DNA polimerasi alfa o di DNA polimerasi eta. Se il danno
era superato, il primer veniva esteso fino alla sa lunghezza massima di 30 nucleotidi. Se il danno
non veniva superato, il primer si fermava in corrispondenza del danno. La differenza è
facilmente analizzabile mediante elettroforesi su gel. In questo esperimento, la DNA polimerasi
eta riusciva a superare un dimero di timine e un sito AP, ma non un fotoprodotto [6-4]. Al
contrario, la DNA polimerasi alfa non riusciva a superare nessuna di queste lesioni.
PER L’APPROFONDIMENTO
1. Probabilmente non osserveremmo mai un meccanismo della replicazione completamente
continuo, perché sarebbe richiesta la sintesi di uno dei filamenti in direzione 3’->5’, e non è stata
identificata nessuna DNA polimerasi in grado di procedere in questa direzione. Inoltre, il
meccanismo di questa polimerasi dovrebbe essere molto particolare. Ad esempio, dovrebbe
preservare il 5’-trifosfato di un filamento di DNA in crescita, per evitare lo stallo della
replicazione. Nella sintesi 5’->3’, la catena in allungamento del DNA possiede un gruppo
ossidrilico libero al 3’, che è particolarmente stabile. Il gruppo trifosfato instabile si trova sui
substrati deossinucleotidici, che possono essere sostituiti nel caso venissero degradati.
2. In primo luogo, allestisci un substrato marcato per la DNA elicasi, simile a quello mostrato in
Figura 18.18a. Quindi, aggiungi frazioni che potrebbero avere attività elicasica, e sottoponile a
elettroforesi su gel per separare il substrato dai prodotti. Se la DNA elicasi è attiva, il filamento
marcato si separerà dal più grande filamento non marcato, e risulterà visibile in fondo al gel.
Questo è il prodotto, dosabile, della DNA elicasi. In assenza di attività DNA elicasica, dovresti
osservare il substrato inalterato, e quantità di prodotto sempre maggiore, all’aumentare di elicasi
aggiunta, e all’amentare del tempo di reazione.
3. Per saggiare l’attività di una topoisomerasi, come la DNA girasi, in grado di aumentare il
contenuto di superelica del DNA, allestisci un substrato di DNA circolare rilassato, privo di
interruzioni (nick). Quindi, aggiungi quantità diverse di topoisomerasi, o la stessa quantità di
enzima, facendolo agire a tempi di incubazione diversi. Quindi, sottoponi i prodotti ad
elettroforesi e visualizzali mediante colorazione con bromuro di etidio. A quantità crescenti di
topoisomerasi, o a più lunghi tempi di incubazione, corrisponderanno aumentati livelli di
superavvolgimenti, visibili come bande di mobilità elettroforetica sempre crescente, come puoi
osservare in Figura 18.21. (A più alto contenuto di superelica corrisponde aumentata mobilità
elettroforetica).
4. I danni al DNA consistono in cambi strutturali del DNA che non modificano l’appaiamento tra
le basi. Esempi di danni al DNA sono l’alchilazione di una base, o la formazione di un dimero di
pirimidine. Una mutazione è la conversione di tale danno in una coppia di basi alterata (ad
esempio, il cambio di una coppia O6-metilguanina-citosina ad una coppia adenina-timina).
Mutazioni nella DNA polimerasi V di E. coli effettivamente rendono il batterio maggiormente
suscettibile a mutazioni. Ciò, perché la DNA polimerasi V è responsabile del bypass di danni al
DNA soggetto ad errori. Se la DNA polimerasi V è attiva, essa converte i danni al DNA in
effettive mutazioni. Tuttavia, in mutanti della DNA polimerasi V, l’enzima è inattivo, e i danni al
DNA permangono, ma in assenza di mutazioni. Ciò si verifica, perché mutanti di DNA
polimerasi V sono meno suscettibili a mutazioni.