GENOMICA STRUTTURALE:
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GENOMICA FUNZIONALE:
Anatomia dei genomi
8. Funzionamento dei genomi
Il genoma dei procarioti
Modificazioni della cromatina e l’espressione del
Il genoma degli eucarioti
genoma
La mappatura dei genomi
Microarray e RNA-seq
Mappatura genetica
Metil-seq
Mappatura fisica
Chip-seq
Il sequenziamento automatico del DNA
Il principio del sequenziamento secondo Sanger
Il sequenziamento su larga scala
La lettura dei tracciati di sequenziamento
Il sequenziamento del genoma
I nuovi metodi di sequenziamento
Il sequenziamento gerarchico
Il sequenziamento shogun
Piattaforme di sequenziamento di interi genomi
Assemblaggio e annotazione del genoma
Copertura del genoma
Phrap/Consed
Approccio Overlap-Layout-Consensus ed Euleriano
La verifica delle sequenze
Le caratteristiche funzionali delle sequenze genomiche
I Progetti Genoma
Il Progetto Genoma Umano
Il Progetto Genoma Animali
Il Progetto Genoma Piante
Il Progetto Genoma Microrganismi
Genotipizzazione
Gli SNP e la variazione
La genotipizzazione degli SNP
la diversità è ricchezza
variabilità
genetica
La riproduzione sessuata mantiene
elevata la diversità biologica
La riproduzione asessuata produce tutti
discendenti identici al progenitore (cloni)
Le mutazioni sono la fonte principale
per la diversità biologica
Da che cosa sono causate le mutazioni?
Un certo numero di errori durante la replicazione del DNA avviene
spontaneamente.
Il tasso di mutazione può
essere
enormemente
aumentato
dall’esposizione ad agenti
mutageni
Agenti fisici (ad es raggi X o UV)
Agenti mutageni chimici
I diversi tipi di mutazioni
Mutazioni geniche (o puntiformi)
Mutazioni cromosomiche
Mutazioni geniche
Le mutazioni geniche o puntiformi sono dovute in gran parte alla
sostituzione di una singola base nucleotidica del DNA con un’altra
Altri tipi di mutazione si originano in seguito alla perdita
(delezione) o alla inserzione di una base nel filamento del DNA
Sostituzione
Delezione
Inserzione
Sostituzione di una base nucleotidica con un’altra
Single Nucleotide Polymorphism
La sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno
grandi sul prodotto finale (la proteina specificata da quel gene). In
base alle conseguenze se ne distinguono tre tipi:
• mutazioni silenti
• mutazioni di senso
• mutazioni non senso
Mutazioni silenti. Se in seguito alla sostituzione di una base si ottiene
una tripletta che specifica per lo stesso aminoacido la proteina
prodotta sarà la stessa
il codice genetico è degenerato
Le sostituzioni silenti riguardano solitamente la terza base del
codone, quella che varia tra codoni diversi che specificano lo stesso
aminoacido
Mutazioni di senso. Nella maggior parte dei casi la nuova tripletta
codifica per un diverso aminoacido
il codice genetico è degenerato
CCU
GCU
Prolina
Alanina
CAU
CAA
Istidina
Glutamina
ACU
AAU
Treonina
Asparagina
La proteina avrà quindi lo stesso numero di aminoacidi
ma una sequenza che differisce per un aminoacido
GAG → GTG = Glu6Val
Mutazioni nonsenso. Se il nuovo codone che si forma dalla
sostituzione codifica per il segnale di stop avremo una proteina più
corta della precedente
AAG
UAG
Lisina
codone di STOP
Delezione o inserzione di una base
mutazioni per spostamento della griglia di lettura
Talvolta l’errore consiste nell’inserire una base in più nella sequenza del
DNA. Altre volte durante la replicazione o durante la riparazione del DNA
si ha la perdita di una base
In entrambi i casi la lettura di tutta la sequenza che segue viene
completamente alterata
inserzione
A
A U G A G G A C U C C C G G A U U A
Met
Arg
Thr
Pro
Gly
Leu
A U G A G G A A C U C C C G G A U U A
Asp
Ser
Arg
Iso
I diversi tipi di mutazioni
Mutazioni geniche (o puntiformi)
Mutazioni cromosomiche
Mutazioni nel numero dei cromosomi
Mutazioni nella struttura
Mutazioni nella struttura dei cromosomi
Esistono 4 tipi principali di
mutazione della struttura dei
cromosomi
• delezione
• duplicazione
• inversione
• traslocazione
Mutazioni nel numero dei cromosomi
aneuploidia
Monosomie e trisomie
Accade talvolta che alla meiosi i due
omologhi anziché separarsi, migrino
entrambi nella stessa cellula figlia (non
disgiunzione). In questo modo si creano
due cellule figlie, una con un cromosoma in
meno e una con un cromosoma in più
Monosomia
Trisomia
Che cosa significare genotipizzare?
genotyping
• Analizzare le variazioni nella sequenza
di DNA
• genotipo = la costituzione genetica di
un individuo
Allele
• forma alternativa di un gene o sequenza di DNA,
in una determinata posizione cromosomica
(locus)
• in ciascun locus un individuo possiede 2 alleli,
uno ereditato dal padre, uno dalla madre
→ genotipo: è la somma dei due alleli in tutte le
posizioni
differenze genetiche :
• Possono causare o predisporre ad una malattia
• Determinano le risposte individuali a stimoli
chimici/ambientali
• Vengono usate come MARCATORI per identificare
geni
→ sono necessarie tecnologie di genotipizzazione su
larga scala high-throughput genotyping technologies
POLIMORFISMO GENETICO
Un sito viene definito polimorfico se di esso si
conoscono almeno due forme alleliche la più rara
delle quali ha una frequenza di almeno l’1%
SNP markers
• Single Nucleotide Polymorphism
GTGGACGTGCTT[G/C]TCGATTTACG
Sostituzione di una base nucleotidica con un’altra
Single Nucleotide Polymorphism
Sostituzione di una base nucleotidica con un’altra
Single Nucleotide Polymorphism
La sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno
grandi sul prodotto finale (la proteina specificata da quel gene). In
base alle conseguenze se ne distinguono tre tipi:
• mutazioni silenti
• mutazioni di senso
• mutazioni non senso
Sostituzione di una base nucleotidica con un’altra
Single Nucleotide Polymorphism
A seconda della regione di sequenza in cui cadono, i polimorfismi possono
essere definiti SNP non codificanti e SNP codificanti.
Gli SNP non codificanti coinvolgono regioni di DNA non trascritte in 5’ o 3’ (NTR),
regioni non tradotte in 5’ o 3’ (UTR), introni, oppure tratti intergenici. Sono
anche detti polimorfismi di non sostituzione e possono comunque avere un
effetto determinante sulla funzionalità genica, influenzando la regolazione della
trascrizione e della traduzione oppure l’aatività del promotore, lo splicing e la
stabilità dell’RNA.
Gli SNP codificanti riguardano segmenti di DNA tradotto e possono a loro volta
essere distinti in polimorfismi di sostituzione, se modificano l’aminoacido
codificato, e in polimorfismi sinonimi se cambiano il codone ma non
l’aminoacido.
... SNP markers
• È il polimorfismo più semplice
• Altamente abbondante; uno SNP ogni 1000 bp nel
genoma umano
• La maggior parte non alterano le funzioni cellulari
• Largamente usati come marcatori
Genotipizzazione dei polimorfismi
nucleotidici singoli
L’elevata frequenza delle variazioni presenti nella
sequenza del DNA del genoma umano, particolarmente in
forma di polimorfismi nucleotidici singoli (SNP), fornisce
una fonte abbondante e preziosa di marcatori genetici utili
per studi di mappature genomica. Inoltre l’ottenimento
della stesura completa del genoma umano hanno aperto
una nuova era per la caratterizzazione sistematica dei
25.000 geni umani stimati, ed hanno reso possibile l’analisi
delle funzioni geniche e la loro associazione con le malattie
di origine genetica.
A) Metodiche classiche per l’identificazione di Polimorfismi
Metodi enzimatici
• Sequenziamento del DNA (metodo Sanger)
• Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
• Flap endonucleasi (FEN)
• Primer extension
• Oligonucleotide ligase assay (OLA)
Metodi basati sulle proprietà fisiche del DNA
• Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
• Single Stranded Conformation Polymorphism (SSCP)
• Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC)
Metodi basati sull’ibridazione
• 5’ nuclease assay (TaqMan assay)
• Allele-Specific Oligonucleotide Hybridization (ASO)
• Dynamic Allele-Specific Hybridization (DASH)
• Molecular beacons
B) High-throughput SNP genotyping
PCR e Sequenziamento del DNA (metodo Sanger)
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)
Elettroforesi su gel a gradiente denaturante (DGGE)
Analisi del polimorfismo di conformazione del filamento
singolo (SSCP)
Cromatografia liquida denaturante ad alta risoluzione
(DHPLC)
JOE SUTLIFF
“A prerequisite to understanding the complete biology of an
organism is the determination of its entire genome sequence”
Fleischmann et al. 1995
High-throughput genotyping
