Applicazioni cliniche in
Microbiologia
Diamante Paola
Microbiologia e Virologia - Pordenone
SFIDA
Ridurre il tempo analitico
rispetto alle procedure standard,
in modo da ottenere
sostanziali benefici
per la gestione delle malattie infettive.
Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.
In questo modo i risultati di
microbiologia diventano
sempre più utili in termini
clinici.
Camporese A. Inf Med 2004;12:118-125
Raggiungere l’obbiettivo è possibile,
mediante nuove tecnologie, automazione
e test rapidi in grado di migliorare il flusso
di lavoro provvedendo nello stesso tempo
a mantenere l’alta qualità dei risultati.
Camporese A. Inf Med 2004;12:118-125
La rapidità delle tecniche Molecolari
combinate con l’automazione e con un più
facile utilizzo dei software, ha permesso
anche nella pratica microbiologica,una
significativa diffusione di strumentazione
ad esse dedicate.
Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology.
Tang, Yi-Wei; Stratton, Charles W. (Eds), 2006.
Infectious diseases diagnosis and
empirical approach
Physicians embraced an empirical approach
to the management of many infectious
diseases, favouring overuse of antibiotics.
Bissonnette L and Bergeron MG. CMI 2010.
Ancor oggi i tempi necessari per giungere alla
identificazione del patogeno e al rilevamento
delle relative resistenze, implicano una
terapia antibiotica empirica ad ampio spettro
basata sull’epidemiologia del reparto e sui
fattori di rischio del paziente.
Questo comporta un aumentato rischio di
effetti collaterali avversi, favorisce l’insorgenza
di resistenza ai farmaci antibatterici,
induce un generale incremento della mortalità
ed aumenta i costi di gestione dei pazienti.
Obbiettivi di una diagnosi eziologica
•
•
Evitare un trattamento antibiotico empirico.
Permettere un utilizzo più ristretto dello
spettro di antibiotici disponibili o un uso più
appropriato di farmaci antivirali.
• Provvedere ad una più accurata informazione
epidemiologica per provvedere a formulare
raccomandazioni e terapie appropriate.
• Diminuire i tempi di ospedalizzazione e
ridurre i costi di gestione.
Ieven, M. J Clin Virol. 2007
L’approccio diagnostico basato sui test
Molecolari costituisce il principale strumento
che può alleviare dal bisogno di colture e
consentire l’dentificazione di uno o più
patogeni da uno spettro di microorganismi
associati ad una sindrome infettiva.
Bissonnette L and Bergeron MG. CMI 2010.
In casi di sindromi cliniche particolari come
la sepsi, possono aiutare a individuare
velocemente una situazione in cui la terapia
antibatterica è rilevante.
Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.
Nelle infezioni virali delle basse vie
respiratorie, può limitare la prescrizione
di terapie antibatteriche e la necessità di
test addizionali.
Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.
Entrance into the diagnostic cycle (0–6 hours):
hours):
patient arrival,
arrival, triage,
triage, primary evaluation,
evaluation, questionnaire and physical examination by physician,
physician,
presumptive diagnosis,
diagnosis, physician laboratory analysis request(s),
request(s), clinical sampling,
sampling, transfer to laboratories,
laboratories, etc.
Conventional diagnostics
Antigen tests and/or
screening methods
24 h or more
Identification
and drug
susceptibility
Microbiology
Laboratory
Rapid,
Rapid,
multiparametric
tests
12 h or more
12 h or more
Positive
culture results
Approximately 1 h
Approximately 1 h
Microbiology
Laboratory
Molecular diagnostics
in Microbiology and Virology
Conventional
Molecular test
Serological confirmation
Results of analyses and healthcare decision process (hours to days):
transmission of results, interpretation,
interpretation, patient management, therapeutic
intervention,
intervention, confirmatory testing,
testing, treatment adjustment,
adjustment, etc.
Immediate healthcare decision
hours to days
Bissonnette L and Bergeron MG. CMI 2010. Modified.
Modified.
Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate al
“S.Maria degli Angeli” di Pordenone
Laboratorio di Microbiologia-Virologia
SEPSI
•
• Leptospira
• Antrace
Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate al
“S.Maria degli Angeli” di Pordenone
Laboratorio di Microbiologia-Virologia
MRSA
VIRUS
H1-N1
BK MDR
SEPSI
Sepsi: una complessa cascata di eventi
INFEZIONE
MEDIATORI ANTIINFIAMMATORI
MEDIATORI PROINFIAMMATORI
INFIAMMAZIONE
AUMENTO PAI-1
DANNO ENDOTELIALE
ESPRESSIONE FATTORE TISSUTALE
ATTIVAZIONE DELLA COAGULAZIONE
GENERAZIONE DI TROMBINA
ATTIVAZIONE TAFI
SOPPRESSIONE
FIBRINOLISI
CONSUMO DI PROTEINA C
CARENZA DI PROTEINA C
COAGULOPATIA
OCCLUSIONE MICROVASCOLARE
IPOPERFUSIONE/ISCHEMIA
DISFUNZIONE D’ORGANO/SHOCK
MORTE
Scatenata dalla presenza di un
processo infettivo grave e
consistente es. polmone,
addome, vie urinarie dovuta
all’interazione tra l’agente
infettivo e l’ospite, che porta
ad una risposta infiammatoria
sistemica e abnorme, con
alterazioni emodinamiche,
respiratorie, metaboliche e
immunologiche.
L’invasione microbica
del circolo ematico non è
indispensabile dal momento
che la diffusione sistemica
dei prodotti microbici è
sufficiente a innescare tale
reazione (LPS, peptidoglicano,
esotossine)
• E’ una sindrome complessa che è difficile
definire, diagnosticare e trattare. Alcuni dei
sintomi della sepsi come la febbre o la
tachicardia o la dispnea sono generici e si
possono riscontrare in una serie di altre
situazioni.
• Ciò crea un ritardo nella formulazione della
diagnosi o addirittura la formulazione di una
diagnosi errata.
L’efficacia complessiva delle emocolture è
bassa ed il risultato può essere falsato da molteplici fattori:
quantità di sangue prelevata
Momento e frequenza di campionamento.
Modalità e sede di prelievo dei campioni.
Presenza di antibiotici nel flacone per terapia antibiotica
in atto
Germi difficili o germi con esigenze colturali diverse.
Fenomeni di autolisi (es pneumococco).
Sviluppo e crescita estremamente lenti.
Localizzazione endocellulare non si può mettere in
evidenza con i normali sistemi
Emocolture
Una grande limitazione delle emocolture è
di avere i risultati disponibili non prima di
2 giorni.
Questo comporta l’utilizzo di una terapia
antibiotica empirica.
Paolucci M, Landini MP, Sambri V. International Journal of Antimicrobial Agents. 2010
Turnaround time medio
emocolture 2010:
Media italiana:
>90% entro 72 ore
80% entro 96 ore
Goglio A, Nicoletti P. Microbiol Med 2004; 19: 1-13
Sepsi
• Nella diagnostica della sepsi la“variabile tempo” è un
valore di assoluta rilevanza in termini di outcome clinico
• In caso di sepsi grave la probabilità di sopravvivenza e
l’outcome clinico si esprimono in termini di ore
• Ogni giorno perso per la diagnosi aumenta di una – due
volte la probabilità di decesso del paziente
•Bouza E. e altri Clin Infect Dis 2004
High-speed testing is essential for the rapid treatment
Administration
of antibiotics
1 hr delay
8%
Increase of
mortality rate
<Medical Information of Eulji General Hospital Pharmacy Department July, 2008>
Sepsi
Quanto più l’accertamento eziologico in corso
di sepsi avviene rapidamente
tanto più è possibile intervenire prontamente
con una terapia corretta ed appropriata
arrivare ad una concreta riduzione
della mortalità
PCR in batteriologia
L’uso della PCR in batteriologia richiede un’attenzione
differente rispetto alla PCR in virologia.
Diversi microrganismi sono presenti sulla pelle o
sulle superfici di lavoro
Attrezzatura di laboratorio
• Indossare un camice monouso
• Evitare di toccare il palmo e le dita dei guanti
indossandoli.
• Evitare l’esposizione della pelle. Indossare i guanti
sopra le maniche del camice da laboratorio.
Yes
• In caso di contaminazione, sostituire immediatamente i
guanti o trattarli con un reagente di decontaminazione
del DNA
No
Diagnosi molecolare di sepsi con
SeptiFast ® Roche Diagnostics
•
•
A partire da 3 ml di sangue intero in provette
contenenti EDTA permette la diagnosi eziologica di
sepsi in circa 5 ore
Il sistema è una PCR real-time di tipo multiplex in
grado di rilevare ed identificare a livello di specie un
pannello di 25 patogeni batterici e fungini,
complessivamente responsabili di più del 90%
dei casi di sepsi microbiologicamente confermati
E’utilizzato come supporto nella gestione di pazienti con
sospetta sepsi ed altre infezioni di natura batterica o micotica
del torrente circolatorio
in combinazione con le evidenze cliniche e con i risultati delle
emocolture (metodo gold standard)
Vantaggi del test vs emocoltura
più veloce : possibilità di intervento terapeutico tempestivo
individua patogeni vivi/morti e acido nucleico libero
elevata sensibilità di rilevazione dei funghi
capacità di rilevare infezioni multiple
E’in grado di rilevare/identificare contemporaneamente
25 diversi patogeni (batteri e funghi) direttamente da un
singolo campione di sangue intero, senza necessità di
coltura preliminare
E’impiegato per l’identificazione di quei batteri che,
essendo già trattati con antibiotici, non potrebbero
essere rilevati con i tradizionali metodi di coltura.
Fornisce i risultati in meno di 5 ore
(contro i 2-5 giorni richiesti dalle tradizionali metodologie).
LightCycler ® SeptiFast
Sangue intero
3 mL
Purificazione del DNA
PCR real-time
Gram (-)
Gram (+)
Funghi
Staphylococcus epidermidis1
Staphylococcus haemolyticus1
Streptococcus agalactiae2
Streptococcus pyogenes2
Streptococcus mitis2
MRSA (mecA)
~ 90% dei microrganismi isolati
LightCycler SeptiFast Test
Regione target – Internal Transcribed Spacer
si trova tra i geni per rRNA 16S e 23S dei
batteri o 18S e 28S dei funghi.
primer
primer
Spacer Region (ITS)
(Internal Transcribed Spacer)
•
•
•
Presente in copie multiple > sensibilità analitica
Ben conosciuta
Adatta per identificazione di specie
LightCycler SeptiFast Test
Flusso di lavoro
1
MagNA
Lyser
lisi meccanica
purificazione , preparazione MM e dispensazione
PCR Real-time – Analisi di melting
Interpretazione automatica dei risultati
Identificazione di specie
SepstiFast Identification Software (SIS)
2
3
LightCycle r2.0
Estrazione del campione (3 mL sangue-EDTA)
SeptiFast LysTest
1
MagNA Lyser
SeptiFast PrepTest
Purificazione
1
SeptiFast Test
1
1
Sample
Negative Control
Lysis
Reagent Control
The LightCycler
Instrument
G+/G-/Fungi
The
LightCycler
SeptiFast Kit
Gram (-)
Extraction
Purified
NA
Gram (+)
Fungi
Capillari
100µl and 20µl
Accessori
Caroselli per
capillari da 100µl e 20µl
1
Dispensazione
MM
Neg.Control (NC)
2
Amplificazione PCR in tempo reale del DNA
bersaglio in 3 reazioni parallele batteri
Gram positivi, batteri Gram negativi, Funghi
e rivelazione con sonde di ibridazione
specifiche fluorescenti
LightCycler2.0
LightCycler 2.0 IVD
Caratteristiche
Monitoraggio della fluorescenza in tempo reale
Termociclazione ad alta velocità
Eliminazione dei rischi di contaminazione
Software versatile
Analisi muliplex/
multicolor detection
Rapida identificazione del prodotto con l’analisi della Melting-Curve
LightCycler
Termociclazione accurata
e rapida
• Riscaldamento ad
aria
• Capillari in
borosilicato
3
Identificazione automatica delle
specie e dei controlli
mediante softwere dedicato.
SeptiFast Identification Software
Interpretazione automatica dei dati
Turnaround time (TAT) medio
a confronto in rapporto agli isolati
rilevato a Pordenone
Microrganismo
SeptiFast
(range)
Colorazione di
GRAM
Identificazione
biochimica
FUNGHI
14 ( 5/29 )
36 ±12
96 ±12
BACILLI GRAM -
14 ( 5/29 )
36 ±12
84±12
COCCHI GRAM +
14 ( 5/29 )
36 ±12
84±12
Diamante et al RIMeL / IJLaM 2010
Il tempo necessario per refertare un
risultato negativo con l’emocoltura è
stabilito dagli standard CLSI (Clinical and
Laboratori Standard Institute, 2007) in 7 giorni.
Test molecolare diretto:
risposta negativa in 5 h
PCR vs EMOCOLTURA: pro e contro
Il valore predittivo negativo è elevato. E già questo
giustifica ampiamente l’utilizzo del test.
Nel caso di SeptiFast, la sensibilità appare comunque
nettamente superiore a quella espressa dalla
Avolio et al. Congresso Trento gennaio 2011
emocoltura.
Non influenzata dalla terapia antibiotica e/o antimicotica
Non consente (perché non sono disponibili i rispettivi
target) di identificare alcuni microrganismi.
Consente di ottenere solo un’identificazione di specie
e non un test di sensibilità.
Infezione/
Trauma
SIRS
Sepsi
Sepsi
Grave
Shock
Settico
MODS
SIRS = Systemic Inflammatory Response Syndrome
non necessariamente a eziologia infettiva
Temperatura > 38°C o < 36°C
Battito
> 90 battiti / min
Respirazione > 20 / min o PaCO2 <32 mm Hg
Leucociti
> 12.000/mm3 o < 4.000/mm3 or >10 % immature
SEPSI=risposta infiammatoria sistemica ad una infezione accertata
SIRS più infezione e sito di infezione documentato
SEPSI GRAVE= Sepsi associate a disfunzione d’organo e ipoperfusione o
ipotensione
Indicazioni per l'utilizzo del SeptiFast
sepsi/sepsi grave/shock settico
criteri SIRS + diagnosi accertata o sospetta di infezione
± disfunzione d’organo
Sospetta endocardite* e/o infezioni da protesi endovascolari
Pazienti con quadro clinico di polmonite
Infezioni di cute e tessuti molli
Pazienti settici immunodepressi**
Sospetta infezione fungina invasiva
Pazienti non responder alla terapia (anziché colturale dopo
wash-out)
*Casalta et al.
al Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009
** Varani et al.
al Journal of Infection 2009
Dall’esperienza clinica sperimentale
alla condivisione di un percorso diagnostico
nei pazienti candidati ad impianto
di endoprotesi aortica.
Avolio et al. Congresso Trento gennaio 2011
MRSA
Multidrug Resistant S.aureus (MRSA)
MRSA è attualmente il patogeno
antibiotico-resistente più comune
identificato negli ospedali in molte
parti del mondo.
Gordon RJ and Lowry FD. CID, 2008
MRSA epidemiology and
background
Approximately 20% of individuals are
persistently nasally colonized with S.aureus
and 30% are intermittently colonized.
Colonization clearly increases the risk for
subsequent infection.
Gordon RJ and Lowy FD. CID, 2008
Werthein HF et al. Lancet Infect Dis, 2005
Lo studio ISABEL
che tra settembre 2004 e maggio 2005 ha
arruolato 3648 pazienti in 27 ICU
italiane ha dimostrato nei pazienti positivi
allo screening al momento del ricovero una
% di malattia da MRSA pari al doppio
rispetto ai pazienti negativi ed una % quasi
10 volte superiore durante la degenza.
(Italian Staphylococcus Aureus Benchmarketed Epidemiology),
(Unità di Terapia Intensiva),
PROTOCOLLO PER LA SORVEGLIANZA DI MRSA IN AOSMA.
Comitato infeioni settembre 2008
SOLUZIONE
Ridurre le infezioni associate all’RMSA
mediante una rapida ed attiva sorveglianza.
Procedure adottate per il contenimento
della diffusione di MRSA
nelle strutture sanitarie.
Scrupolosa igiene delle mani
Adeguati programmi di controllo dell’uso
degli antibiotici (antibiotic stewardship)
Sorveglianza attiva per l’identificazione di
pazienti con infezione e/o colonizzazione
Eventuale decolonizzazione e isolamento
del paziente colonizzato.
Precauzioni da contatto e sorveglianza
attiva ottenuta con lo screening hanno la
capacità di ridurre morbilità e mortalità
nei pazienti risultati colonizzati.
Questi pazienti, infatti, se non individuati
tempestivamente, possono essere esposti
a un maggiore rischio di sviluppare
un’infezione MRSA correlata durante la
degenza, soprattutto in contesti ad elevata
criticità, quali ad esempio le Unità di
Terapia Intensiva (ICU).
Inoltre, è dimostrato che i pazienti
asintomatici colonizzati rappresentano
la più efficace fonte di trasmissione di
MRSA nelle strutture sanitarie.
GeneXpert
GeneXpert automatizza le fasi di
preparazione del campione eseguendo
tutti gli step necessari all’estrazione ed alla
real time PCR, mediante un sistema
avanzato di cartuccia microfluidica.
La base di questa tecnologia sono le cartuccie
brevettate monouso che nelle differenti camere
contengono tutti i reagenti in forma liofilizzata
necessari all’estrazione e all’amplificazione in
real time PCR del target.
La cartuccia deve essere ricostituita all’inzio
dell’esperimento aggiungendo nelle diverse
camere le soluzioni fornite con la cartuccia
stessa (unico step manuale della metodica).
GeneXpert è un sistema che automatizza i
tre processi necessari per eseguire una
real time PCR: preparazione del campione,
amplificazione e rilevamento.
E’un sistema modulare che consente di
eseguire da 1 a 4 analisi
contemporaneamente anche per differenti
analiti.
Il software del GeneXpert è
completamente automatico ed elimina le
problematiche relative alla soggettiva
interpretazione dei risultati.
I risultati qualitativi sono visualizzabili
mediante le curve di Real Time PCR che
appaiono a monitor per ogni modulo dello
strumento.
Xpert® MRSA provvede a dare una
risposta in 66 minuti circa contro i
due/tre giorni dei metodi colturali.
PROTOCOLLO DI SORVEGLIANZA
PER MRSA IN ICU
Analisi eseguita con metodo molecolare rapido
(GeneXpert-Cepheid) e refertata in giornata.
Identificazione tempestiva di eventuale
colonizzazione nasale da MRSA in tutti i pazienti
che afferiscono in ICU.
Il monitoraggio individua tempestivamente
eventuali portatori di MRSA, mettendo in
atto immediatamente tutte le procedure
previste per la decolonizzazione e
l’isolamento del paziente e per indirizzare
in modo tempestivo e mirato la terapia in
caso di sviluppo di malattia infettiva
correlabile a MRSA.
In caso di positività
per MRSA
• Decolonizzazione nasale con
mupirocina (Bactroban
pomata) endonasale (3
applicazioni/die per 5 gg).
• Decolonizzazione generale
con clorexidina gluconato al
5% (Neoxene Soluz 5%), una
volta al giorno per 5 gg.
• Isolamento del paziente in
stanza singola o per coorte e
applicazione delle precauzioni
da contatto.
In caso di insorgenza di
malattia da infezione
• Campionamento
microbiologico rapportato alla
sede di infezione
• Inizio trattamento con
vancomicina o altro farmaco
anti-MRSA, da scegliersi in
base alla farmacocinetica
rapportata al sito di infezione e
alla MIC rilevata, se
disponibile.
MRSA NASAL CARRIERS
(ICU, Mar 09- Sept 10)
Number of patients
400
350
376
350
300
250
MRSAP
200
MRSAN
150
TOT ADMISSIONS
100
50
26 (7%)
0
1
Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate al
“S.Maria degli Angeli” di Pordenone
Laboratorio di Microbiologia-Virologia
RESPIRATORI
Virus
H1-N1
VIROLOGIA
Respiratori
Infezioni respiratorie acute sono
la principale causa di malattia nel
mondo
Herman Goossens BMJ 2006
Le infezioni delle basse vie respiratorie LRTI
(lower respiratory tract infections)
infections) sono le più comuni infezioni di
adulti e bambini.
Murdoch DR. APMIS 112: 713–27, 2004
La popolazione più a rischio per lo sviluppo
di una malattia respiratoria fatale sono bambini,
anziani ed immunocompromessi.
Herman Goossens BMJ 2006
Se la diagnosi clinica di LRTI è relativamente facile
da fare, determinare l’agente eziologico responsabile
può essere più difficile a causa dei test diagnostici
convenzionali limitati
Murdoch DR. APMIS 112: 713–27, 2004
Durante gli anni recenti un notevole numero di
agenti respiratori sconosciuti sono stati scoperti e di
questi, le culture in vitro sono o molto lunghe o
irrealizzabili.
Ieven, M. J Clin Virol. 2007
In generale solo nel 50% dei casi l’agente eziologico
viene identificato
Loens K et al. J Clin Microbiol 2009
I test tradizionali virologici e sierologici per la
determinazione di microorganismi responsabili di
polmoniti hanno una bassa sensibilità, necessitano
di molto tempo per la loro identificazione ed
individuano solo uno o alcuni dei numerosi
agenti eziologici
Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008
Nuova filosofia e organizzazione
in Virologia
Passaggio da una “filosofia colturale” a una
“filosofia molecolare”.
Acquisizione di nuove tecnologie.
Nel solo 2008 sono state introdotte 25 nuove
diagnostiche molecolari, che garantiscono oggi il più
esteso panel di diagnostiche molecolari del
Dipartimento e la massima efficienza ed efficacia
diagnostica in numerosi contesti clinici.
Con le colture cellulari il TAT
di una risposta negativa è
tra i 10/15 giorni
In Europa il 90/95% degli antibiotici viene usato al di
fuori delle strutture ospedaliere e la gran parte viene
prescritta per le infezioni delle basse vie respiratorie
acquisite in comunità.
Herman Goossens BMJ 2006
Pneumonia in immuno-competent adults
National Standard Method
Multiplex
Real Time PCR
Multiplex
Real Time PCR
•
Parainfluenza virus 1
Parainfluenza virus 2
Parainfluenza virus 3
Adenovirus A/B/C/D/E
Coronavirus 229E/NL63
•
Coronavirus OC43
Rhinovirus A/B/C
Influenza A virus
RSV A
RSV B
•
Bocavirus 1/2/3/4
Influenza B virus
Parainfluenza virus 4
Enterovirus
4 ore e 15
elettrodi
gel
Seeplex®
RV 15 ONE STEP
Parainfluenza virus 1
Parainfluenza virus 2
Parainfluenza virus 3
Adenovirus A/B/C/D/E
Coronavirus 229E/NL63
Dual Priming
Oligonucleotide
technology
(Seegene)
Coronavirus OC43
Rhinovirus A/B/C
Influenza A virus
RSV A
RSV B
Bocavirus 1/2/3/4
Influenza B virus
Parainfluenza virus 4
Enterovirus
M.pneumoniae
C.pneumoniae
L.pneumophila
S.pneumoniae
H.influenzae
B.pertussis
Infezioni respiratorie ad eziologia virale a
Pordenone:
gennaio 2010- ottobre 2011
90 120
80
100
ENTERO
CORON
BOCA
ADE
CORON
RHINO
ADE
70
60
50
80
60
MPV
RHINO
PIV
MPV
40
PIV
INFLB
INFLB
INFLA
20
INFLA
RSV
RSV
40
30
20
10
0
0
gennaio
gennaio marzoaprilemaggio luglioluglio
settembre
ottobre
2010 test eseguiti con RV15
2011
RV12 SEEGENE
Influenza virus type A and B, parainfluenza
virus type 1, 2, 3, respiratory syncytial virus
(RSV) type A and B, and adenovirus are major
causes of lower respiratory tract infections in
infants and young children under 5 yr old.
Human metapneumovirus, also identified in
children with respiratory infection, rhinovirus,
and coronavirus are known as causative
agents of the common cold.
Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008
La disponibilità di metodi rapidi per la
diagnosi virale permetterà d’ora in poi
di decidere in modo più accurato il
trattamento, riducendo così l’uso di inutili
agenti antimicrobici ed abbreviando i
tempi di ospedalizzazione per i pazienti.
Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008
GRAZIE PER
L’ATTENZIONE
Tecniche
convenzionali
Tecniche
molecolari
