20. Progetto P. Giavini: Interazione tra geni e sostanze

Fondazione CARIPLO
Bandi 2005
PRE-PROPOSTA PER IL BANDO
“PROMUOVERE LA RICERCA SCIENTIFICA E TECNOLOGICA
IN TEMA DI SALUTE E SCIENZE DELLA VITA”
TEMA DI RICERCA:
genomica e proteomica per la prevenzione e la diagnosi precoce delle
malattie;
studi sperimentali basati su metodologie che prevedano l’utilizzo delle
cellule staminali, escluse quelle staminali embrionali umane, in relazione
alla riparazione tessutale
x

.
TITOLO DEL PROGETTO: Interazione tra geni e sostanze chimiche ambientali nella
induzione di malformazioni cranifacciali.
AREA DISCIPLINARE DEL PROGETTO: 05 (Scienze biologiche)
RESPONSABILE SCIENTIFICO: Erminio Giavini
ALTRI PARTECIPANTI UNIMI (nome e struttura di appartenenza): Elena Menegola
(Dip. Biologia), Giorgio Scarì (Dip. Di Biologia), Graziella Cappelletti (Dip. Biologia);
Maria Luisa Broccia (Dip. Biologia); Enzo Chiesara (Dip. Farmacol. Chem. Tossicol.
Med.); Sonia Radice (Dip. Farmacol. Chem. Tosssicol. Med.); Laura Marabini (Dip.
Farmacol. Chem. Tossicol. Med.); Corrado L. Galli (Dip. Sc. Farmacologiche); Marina
Marinovich (Dip. Sc. Farmacologiche); Barbara Viviani (Dip. Sc. Farmacologiche).
PARTECIPANTI DI ALTRI ENTI (nome e struttura di appartenenza):
DURATA DEL PROGETTO: 2 anni
COSTO COMPLESSIVO DEL PROGETTO: 420.000 €
IMPORTO RICHIESTO ALLA FONDAZIONE: 210.000 €
PUBBLICAZIONI RECENTI DEL GRUPPO DI RICERCA (max 5): Menegola E,
Broccia ML, Di Renzo F, Massa V, Giavini E: Relationship between hindbrain
segmentation, neural crest cell migration and branchial arch abnormalities in rat
embryos exposed to Fluconazole and Retinoic acid in vitro. Reprod. Toxicol., 18: 121130, 2004.
Menegola E, Broccia ML, Di Renzo F, Giavini E: Pathogenic pathways in Fluconazole
induced branchial arch malformations. Birth Defects Research 67: 116-124, 2003.
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Clementi M, Giavini E, Mantovani A: Avoidance of bioflavonoids supplements during
pregnancy. The Lancet 361: 261-262, 2003
Radice S, Chiesara E, Marabini L: Estrogenic activity of procymidone in rainbow
trout hepatocytes: a possibile mechanism of action. Chemico-biological interactions
147: 185-193, 2004
Gennari A, Bleumink R, Viviani B, Galli CL, Marinovich M, Pieters R, Corsini E.
Identification by DNA macroarray of nur77 as gene induced by DBYC:
characterization of its role in thymocyte apoptosis. Toxicol.appl. Pharmacol. 181: 2731, 2002.
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DESCRIZIONE DEL PROGETTO (analisi del bisogno, obiettivi scientifici, piano di
intervento, piano finanziario, organizzazione; max 3500 caratteri spazi inclusi):
Le malformazioni cranio facciali sono tra le più diffuse e disabilitanti malformazioni congenite
nell’uomo. Le cause di queste malformazioni sono in larga misura sconosciute, anche se alcune di
esse sono state associate ad esposizione in utero ad agenti teratogeni chimici.
Nonostante le numerose ricerche sino ad oggi condotte, il meccanismo d’azione dei teratogeni
chimici è poco noto. In questi ultimi anni si è fatta sempre più strada l’ipotesi che alcuni agenti
teratogeni possano svolgere il loro effetto dismorfogenetico attraverso l’interferenza, diretta o
indiretta, con l’espressione di geni fondamentali per i processi di sviluppo.
L’acido retinoico (AR) è un importante morfogeno che controlla lo sviluppo di molti organi. La sua
attività a livello embrionale si esplica attraverso la regolazione della trascrizione di numerosi geni,
mediata da recettori nucleari (RARs). Affinché l’espressione dei geni controllati da AR, nei diversi
distretti embrionali, avvenga in maniera corretta nel tempo e nello spazio, sono in atto
nell’embrione sofisticati meccanismi di controllo che includono: a) recettori citoplasmatici di AR,
in grado di sequestrarlo a livello citosolico (Cellular Retinoic Acid Binding Proteins, CRABPs), b)
sistemi enzimatici preposti alla sintesi di AR a partire dal retinolo (retinolo deidrogenasi,
retinaldeide deidrogenasi); c) sistemi enzimatici preposti al catabolismo dell’AR (CYP26). La
distribuzione e la concentrazione di AR durante l’embriogenesi sono regolate da una bilanciata
attività degli enzimi della sintesi e del catabolismo. Concentrazioni di AR embrionale in eccesso o
in carenza rispetto ai valori fisiologici sono causa di alterazioni dello sviluppo embrionale.
Recenti studi in vitro hanno evidenziato che sostanze appartenenti alle famiglie dei derivati
triazolici e imidazolici (sostanze ad attività antimicotica, ampiamente utilizzate in campo agricolo e
clinico) sono in grado di indurre gravi malformazioni a livello degli archi branchiali I e II e dei
nervi cranici V – X, in embrioni di roditori. Tali malformazioni sono di particolare interesse poiché
dal I e II arco branchiale originano le principali strutture della faccia e sono correlabili ad
alterazioni della segmentazione del romboencefalo embrionale e, conseguentemente, della
migrazione delle cellule delle creste neurali (NCC) che partendo dal romboencefalo colonizzano gli
archi branchiali. Sia la segmentazione del romboencefalo embrionale che la migrazione delle NCC
sono sotto il controllo di uno specifico Hox code , a sua volta controllato da AR .Le malformazioni
indotte da esposizione a derivati triazolici sono del tutto simili a quelle riscontrate in embrioni di
roditori esposti ad eccesso di AR; inoltre, l’esposizione contemporanea di embrioni di roditori a
dosi subteratogene di triazoli e di AR ha un effetto sinergico, producendo malformazioni nei
distretti previsti.
a. L’ipotesi che si vuole valutare è che i derivati triazolici e imidazolici svolgano la loro
attività dismorfogenetica aumentando le concentrazioni endogene di AR embrionale ed
alterando l’espressione dei geni controllati da AR. E’ noto dalla letteratura che gli azolo
derivati sono dei buoni inibitori del metabolismo mediato da CYP26 e che membri di questa
famiglia enzimatica (CYP26) sono coinvolti nel metabolismo dell’AR; inoltre CYP26 sono
stati individuati a livello embrionale. Con la presente ricerca ci si propone di identificare i
possibili geni coinvolti nella induzione delle MC indotte da derivati triazolici in embrioni di
roditori. A tale fine verranno valutati i seguenti parametri:Caratterizzazione attraverso
colture in vitro di embrioni di roditori e studi in vivo attraverso trattamento di femmine
gravide di ratto e topo, in periodi specifici della gravidanza, della tipologia delle
malformazioni indotte da fungicidi triazolici;
b. identificazione dei geni/proteine selettivamente modulati in seguito ad esposizioni di
embrioni o colture di cellule embrionali a triazoli tramite tecniche di genomica (cDANA
macroarray) e proteomica differenziale;
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c. studio del ruolo dei recettori dell’acido retinoico (RAR e RXR) e delle sue proteine
regolatrici (CRABP e CRBP) nell’induzione delle malformazioni (analisi western blot di
omogenati embrionali; analisi mediante EMSA con anticorpi specifici per le diverse
isoforme e analisi supershift degli estratti nucleari ottenuti da embrioni di controllo ed
esposti ai teratogeni in studio;
d. valutazione dell’espressione e dell’attività di CYP26 embrionale, con particolare riferimento
a CYP26A1 e CYP26B1 che si esprimono a livello del romboencefalo e degli archi
branchiali.
Piano finanziario
Costi per il personale
Materiale di consumo
Spese correnti
Prestazioni di terzi
Altri (congressi, reprints etc)
210.000 €
140.000 €
13.000 €
30.000 €
27.000 €