PARTE II
GUIDA ALLE ESERCITAZIONI
Vengono for nite esercitazioni per gli studenti sia
pratiche che teoriche. Presentate come una serie di
lezioni, queste attività sono raggruppate in cinque
sezioni che sottolineano concetti fondamentali.
La Sezione A spiega i concetti di base della biologia
molecolare: la struttura e la funzione del DNA.
Le Sezioni B e C si concentrano sulla manipolazione
del DNA e sul suo trasferimento da un organismo
ad un altro. Queste sezioni illustrano come una
profonda comprensione dei sistemi biologici
per metta di utilizzarli a nostro vantaggio.
La Sezione D funge da connessione tra i campi della
genetica e della biologia molecolare, illustrando
come la comprensione dei processi biologici a livello
molecolare possa spiegare le osservazioni genetiche
a livello dell’organismo. La Sezione E, novità di
questa edizione, introduce le tecniche utilizzate
nell’analisi dei genomi e spiega come gli studi
genomici siano applicati in modo da far progredire
la nostra comprensione dell’evoluzione e della
variabilità individuale. La Sezione F si occupa di
proteine, evoluzione e bioinfor matica. Gli studenti
si concentrano su un enzima comune a tutti i regni,
attraverso attività pratiche in laboratorio e di
esplorazione di risorse bioinfor matiche in rete.
Consultate le appendici e il sito e-cathedra per
infor mazioni sulla biosicurezza in laboratorio, le
apparecchiature, le ricette per le soluzioni e gli
elenchi di fonti di ulteriori infor mazioni.
A. STRUTTURA E FUNZIONE DEL DNA
Struttura del DNA
Esercitazione Costruzione di un modello
di carta del DNA
7 Duplicazione del DNA
Esercitazione Duplicazione del DNA
8 Espressione dell’informazione genetica
Esercitazione Dai geni alle proteine
Esercitazione Produzione di un antisenso:
la regolazione dell’espressione genica con l’RNA
Esercitazione avanzata Regolazione genica
Esercitazione avanzata Antisenso ed interferenza da RNA
9 Modelli delle dimensioni dei genomi
Esercitazione Dimensioni dei genomi dell’uomo
e di E. coli
1 0 Estrazione del DNA
Esercitazione Estrazione di DNA batterico
6
B. MANIPOLAZIONE ED ANALISI DEL DNA
1 1 Enzimi di restrizione
Esercitazione Forbici che tagliano il DNA
1 2 Elettroforesi su gel
Esercitazione La corsa del DNA
1 3 Analisi di restrizione
Esercitazione Analisi di restrizione del DNA lambda
1 4 DNA ricombinante
Esercitazione Plasmidi ricombinanti di carta
1 5 Fogli di lavoro di prove di analisi di restrizione
Esercitazione Prova di analisi di restrizione
1 6 Rivelazione di sequenze specifiche di DNA:
analisi di ibridazione
Esercitazione Rivelazione di sequenze specifiche di DNA.
Parte I. Pescare il DNA
Esercitazione Rivelazione di sequenze specifiche di DNA.
Parte II. Combinazione di analisi di restrizione e
ibridazione
Esercitazione Rivelazione di sequenze specifiche di DNA.
Parte III. Ibridazione di Southern
1 7 La reazione a catena della polimerasi
Esercitazione La PCR di carta
1 8 Sequenziamento del DNA
Esercitazione Sequenziamento del DNA:
i terminatori
Lettura: I terminatori della catena come farmaci antivirali
C. IL TRASFERIMENTO DELL’INF ORMAZIONE
G ENICA
1 9 La trasformazione
Lettura: Trasferimento genico, Escherichia coli e malattie
Esercitazione Trasformazione di Escherichia coli
20 La coniugazione
Esercitazione Il trasferimento coniugativo della resistenza
ad un antibiotico in Escherichia coli
Lettura: Trasferimento genico e diffusione della resistenza
agli antibiotici
21 Trasduzione
Esercitazione La trasduzione di un gene di resistenza ad
un antibiotico
22 Trasferimento di geni nelle piante tramite Agrobacterium
tumefaciens
Esercitazione Agrobacterium tumefaciens: un ingegnere
genetico dei vegetali
D. BIOLO GIA MOLECOLARE E G ENETICA
23 Genetica mendeliana a livello molecolare: dominanza
e recessività
Esercitazione Un’avventura nel pelo del cane. Parte I
24 Genetica mendeliana a livello molecolare: un esempio
di epistasi
Esercitazione Un’avventura nel pelo del cane. Parte II:
i labrador gialli
25 Genetica molecolare umana
Esercitazione Genetica molecolare umana
Lettura: Genetica molecolare del cancro
26 “Il medico investigatore”: una storia di genetica in azione
Esercitazione Genetica in azione
E. G ENOMICA
27 Confronto fra genomi
Esercitazione Il confronto dei genomi
Esercizio 1: Le STR possono provocare un RFLP
Esercizio 2: La PCR può rivelare differenze a livello di
loci microsatelliti
Lettura: Il DNA mitocondriale
28 Tipizzazione del DNA in medicina legale
Esercitazione Tipizzazione del DNA in medicina legale
Esercizio 1. Confusione all’ospedale
Esercizio 2. Un caso di paternità
Esercizio 3. Il caso del pugnale insanguinato
Lettura: Utilizzo forense del DNA: un caso archeologico
29 Mappatura del genoma
Esercitazione Mappatura di un gene responsabile di una
malattia
Lettura: Il Progetto Genoma Umano: scienza, applicazioni
e problemi
30 Microarray ed analisi genomica
Esercitazione Analisi dell’espressione genica con i
microarray
Lettura: Genomica personale
F. BIOINF ORMATICA E ANALISI EVOLUTIVA
DELLE PROTEINE
31 L’amilasi, un enzima conservato durante l’evoluzione
Esercitazione Test per l’attività dell’amilasi
32 Elettroforesi delle proteine
Esercitazione Elettroforesi di campioni di amilasi
33 Analisi dei cambiamenti evolutivi
Esercitazione Costruzione di un albero evolutivo
dell’amilasi
34 Bioinformatica
Esercitazione Un’esplorazione della bioinformatica
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G U I D A
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A. STRUTTURA E FUNZIONE DEL DNA
Un principio base della biologia afferma che la struttura
deve servire la funzione. Possiamo vedere esempi di questo principio quando osserviamo la struttura di un’ala di
un uccello in relazione al volo o la struttura dell’occhio
umano in relazione alla vista. La stessa relazione tra struttura e funzione sussiste a livello molecolare. Da nessuna parte tale relazione è più evidente che a livello della
molecola del DNA. La sua struttura è meravigliosamente adatta alla sua duplice funzione: la replicazione e la
traduzione dell’informazione, oltre a permettere una facile regolazione attraverso numerosi meccanismi.
Queste lezioni si concentrano sulla molecola del DNA.
Modelli, simulazioni e discussioni illustrano la struttura
del DNA, il compattamento e la conservazione, la replicazione del DNA, i processi della trascrizione e della traduzione, e alcuni aspetti della regolazione genica riguardanti il campo della tecnologia antisenso. Chiudono
la sezione semplici metodi di laboratorio per estrarre
DNA da Escherichia coli, tessuti vegetali, tessuti animali
e lievito di birra disponibile in commercio.
Per insegnare la struttura e le funzioni del DNA, non c’è
nulla di paragonabile ai modelli, sia che stiate insegnando a studenti di scuola media o a persone adulte. Sono
disponibili in commercio molti modelli eccellenti per illustrare la struttura e la replicazione del DNA, oltre che
la trascrizione e la traduzione. Se utilizzate già alcuni di
questi materiali per spiegare la struttura del DNA e la sintesi proteica, è possibile che troviate alcune idee nelle
esercitazioni sulla replicazione del DNA, sulla regolazione genica e sulla tecnologia antisenso, che potreste facilmente includere nelle vostre lezioni. Se non avete un
modello di DNA di quelli reperibili in commercio, questa lezione inizia con un modello economico di carta che
tutti i vostri studenti sono in grado di costruire.
3
4
6 Struttura del DNA
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6
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Struttura del DNA
Descrizione dell’esercitazione
a p. 177
In questa esercitazione gli studenti preparano un modello di carta di una molecola di DNA. Molti studenti, sia
giovani che adulti, spesso trovano difficile visualizzare la
struttura del DNA. Fare assemblare agli studenti un modello di DNA è probabilmente il modo più utile per comunicare informazioni concernenti la struttura del DNA
a quell’ampia fascia di studenti che imparano una cosa
facendola. Se non disponete già di un modello di DNA
di quelli in commercio, questa lezione fornisce un modello economico alla cui costruzione possono partecipare tutti gli studenti. Esiste anche un eccellente precedente storico per i modelli cartacei di DNA: Watson e
Crick usavano modelli ritagliati e incollati quando provavano ad immaginarsi la struttura del DNA.
L’esercitazione è adatta a studenti di varie età e con capacità diverse. Noi l’abbiamo utilizzata con successo in
ambiti scolastici di diverso livello. Sebbene l’esercitazione possa sembrare troppo semplice per studenti
avanzati o universitari, la nostra esperienza suggerisce
altrimenti. Anche se gli studenti di livello avanzato hanno solitamente familiarità con le coppie di basi, spesso
non comprendono l’orientamento antiparallelo dei due
filamenti di DNA e in genere non hanno coscienza del
fatto che le estremità 5! e 3! dei filamenti sono differenti. Procedimenti avanzati, quali il sequenziamento
del DNA e la reazione a catena della polimerasi, dipendono da queste differenze e gli studenti devono
comprendere questi aspetti della struttura del DNA prima di poter capire i metodi. L’esame del modello sembra rendere le informazioni comprensibili a molti studenti più di quanto non lo facciano le illustrazioni di
un libro.
Questo semplice modello può anche aiutare a correggere un concetto frequentemente sbagliato riguardo al
DNA, spesso causato dai disegni che utilizzano lettere al
posto delle basi (come succede in molti disegni di questo libro). Il malinteso è che il DNA possa essere capovolto o ruotato all’indietro, in quanto le lettere hanno un
solo orientamento corretto. Potete usare questo modello per aiutare gli studenti a capire che il solo orientamento che ha senso in una molecola di DNA è l’orientamento dal 5! al 3! della sua ossatura.
Appendere il modello del DNA al soffitto o attaccarlo al
muro è utile per insegnare le altre attività di questo libro, che richiedono quasi tutte di visualizzare una molecola di DNA. Questo modello fornisce agli studenti una
struttura concreta che serve da base a concetti più astratti e difficili. Il modello cartaceo può essere utile nell’insegnamento della replicazione, della trascrizione e della
restrizione del DNA.
Lezioni richieste: 1 o 2 lezioni di 45 o 50 minuti
Introduzione
La seguente discussione è intesa semplicemente come infor mazione per il docente. Non è necessario condividerla tutta (e neppure la maggior parte!) con gli studenti. A
v o s tr o g i u d i z i o v a l u ta te q u a n to s i a a d e g u a ta p e r v o i o
quanto le vostre classi possano assorbir ne. Vi potrà essere utile anche rivedere parti del Capitolo 4.
Il DNA è il progetto della vita. Controlla la forma, le funzioni e l’aspetto del corpo codificando le proteine che
formano i mattoni e la malta dei tessuti, che svolgono attività metaboliche, che combattono le infezioni, che regolano la crescita e che sintetizzano grassi e pigmenti.
Chimicamente il DNA è composto da piccole unità che
si ripetono. L’unità ripetitiva del DNA è piuttosto semplice; è composta da tre parti: lo zucchero deossiribosio,
un gruppo fosfato ed una di quattro basi organiche, adenina, citosina, timina o guanina. Questa unità è chiamata nucleotide o, più propriamente, deossinucleotide (Figura 6.1). (L’RNA è anch’esso costituito da nucleotidi ma
utilizza lo zucchero ribosio; perciò si dice che l’RNA è
costituito da ribonucleotidi.) Per costruire un polimero
di DNA, molti deossinucleotidi vengono uniti da legami
fosfodiestere tra i gruppi fosfato e gli zuccheri.
I legami fosfodiestere formano un ponte tra il carbonio
numero 5 della porzione di deossiribosio di un nucleotide e il carbonio numero 3 della porzione di deossiribosio del nucleotide adiacente. (La Figura 6.1 mostra la
numerazione.) Usando i numeri del carbonio, si può
parlare di direzione relativamente ai polimeri di DNA.
Nella Figura 6.2, il trinucleotide è mostrato dal 5! al 3!,
dall’alto al basso, poiché viene prima il carbonio 5! del
A. Struttura e funzione del DNA
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Base
(adenina, guanina,
citosina, o timina)
O–
O
O
P
5
CH 2
Base
O
OH
Gruppo
fosfato
4C
H
3
H
C
C2
OH
H
H
Deossiribosio
Figura 6.1 Il deossinucleotide.
primo nucleotide. Immaginate di ruotare il trinucleotide invertendo l’alto con il basso. Ora, viene prima il carbonio 3! con il gruppo OH del nucleotide “T”; questo
è l’orientamento dal 3! al 5!.
Le quattro basi del DNA sono di due tipi: purine e pirimidine. Adenina e guanina sono basi puriniche, e citosina e timina sono basi pirimidiniche. Queste basi sono
capaci di formare due coppie specifiche: adenina con timina e citosina con guanina. Da notare che una purina
si accoppia sempre con una pirimidina. Le basi puriniche sono più grandi di quelle pirimidiniche. Una coppia
purina-purina sarebbe molto più spessa di una coppia
pirimidina-pirimidina. Le due coppie di basi purina-pirimidina hanno invece le stesse dimensioni (Figura 6.3) e
possono quindi adattarsi con precisione all’interno dell’elica del DNA, in qualunque ordine casuale. Le coppie
di basi sono unite da deboli legami chimici chiamati legami idrogeno. (Vedi il Capitolo 4 per maggiori inforEstremità 5! OH
O
P
Sebbene le coppie di basi siano all’interno dell’elica, è
possibile che le proteine cellulari percepiscano l’identità e la sequenza di quelle coppie di basi. I “bordi” delle
coppie di basi sono “visibili” per le proteine cellulari tra
i filamenti a spirale dell’ossatura di zucchero-fosfato. Il
O
O
H
P
O
N
C
C
C
N
O
C
Legame 5!
Legame fosfodiestere
O
O
H
P
O
O–
N
CH 2
Adenina
T
O
N
C
C
C
N
N
C
C
C
O
O
N
H
Legami
idrogeno
H
H
C
N
H
H
O
N
N
C
C
Guanina
C
C
N
N
C
H
5
OH H
Figura 6.2 Un trinucleotide.
H
H
H
Estremità 3!
Citosina
N
N
N
H
C
Timina
H
O
O–
CH 3
H
C
CH 2
5
H
H
C
O
O–
Legame 3!
La struttura a doppia elica del DNA è adatta in modo perfetto all’ambiente cellulare della molecola. La cellula è
un ambiente a base d’acqua, e molecole che sono cariche o elettricamente polari (quali i gruppi fosfato carichi
e le molecole di zucchero) interagiscono velocemente
con l’ambiente circostante. Le basi organiche del DNA,
invece, sono non polari e perciò idrofobiche (idrorepellenti). Esse sono molto stabili quando interagiscono con
altre molecole idrofobiche anziché con l’acqua. Nella
doppia elica le basi sono rivolte l’una verso l’altra, lontano dal citosol acquoso. Tra le ossature di zucchero-fosfato, le piatte coppie di basi idrofobiche si impilano insieme, e queste cosiddette “interazioni da impilamento”
stabilizzano ulteriormente la struttura a doppia elica.
G
CH 2
5
mazioni.) A causa delle strutture chimiche delle basi, adenina e timina risultano unite da due legami idrogeno
mentre citosina e guanina sono unite da tre legami idrogeno.
3
O
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In una molecola di DNA, due polimeri di DNA complementari sono uniti da legami idrogeno tra queste coppie
di basi. L’ossatura zucchero-fosfato dei polimeri è orientata in direzione opposta: una va dal 5! al 3!, e l’altra dal
3! al 5!. Infine, i due polimeri (normalmente chiamati filamenti) sono avvolti l’uno sull’altro per formare la famosa doppia elica (Figura 6.4).
C1
H
A L L E
3
Ossatura zucchero-fosfato
Figura 6.3 Coppie di basi complementari nel DNA.
6
6 Struttura del DNA
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Ossatura zucchero-fosfato
C
G
A
A
G
T
T
C
T
C
A
G
Base
G
C
T
A
A
T
Legami idrogeno
Figura 6.4 Modello a nastro dell’elica del DNA.
bordo di ogni base presenta una diversa configurazione
chimica verso l’esterno, così che una proteina che interagisce direttamente col DNA può “leggere” la sequenza
delle basi. In questo modo, la RNA polimerasi può riconoscere un promotore, le proteine repressore possono
trovare le loro sequenze di legame, e le proteine della
replicazione del DNA possono identificare i loro siti di
“inizio”, le origini della replicazione (vedi l’Esercitazione
7, Duplicazione del DNA).
il centro di simmetria non è al centro delle coppie di basi ma al loro esterno tra gli “involucri” dello scheletro
zucchero-fosfato (nella scanalatura principale). Il DNA di
forma Z è ancora più differente. I DNA A e B sono eliche destrorse, mentre il DNA Z è sinistrorso. Ha circa 12
bp per giro di elica, e la geometria dei legami zuccherobase è alterata. Se volete dettagli sulla struttura delle eliche A e Z, vi preghiamo di riferirvi ad un testo avanzato.
Se avete un modello tridimensionale del DNA, potete
osservare le due scanalature che formano una spirale all’esterno dell’elica tra gli scheletri zucchero-fosfato. A
causa della geometria dell’elica, una di queste scanalature risulta più grande dell’altra. Quella più grande è
chiamata scanalatura principale del DNA; quella più
piccola è la scanalatura secondaria. La caratteristica importante delle scanalature del DNA è che si tratta delle
posizioni dove le proteine interagiscono con sequenze
specifiche di DNA. La maggior parte delle interazioni
DNA-proteina sequenza-specifiche attualmente note
coinvolge il legame della proteina al DNA a livello della scanalatura principale. (Per un esempio di un’interazione specifica proteina-DNA, vedi I r epr essori lambda
e Trp: pr oteine che legano il DNA nel Capitolo 4.)
Il modello cartaceo del DNA, descritto sotto, permette
agli studenti di costruire una grande elica di DNA. Il modello può essere utilizzato nelle lezioni successive sulla
replicazione e sulla trascrizione del DNA, sugli enzimi di
restrizione, sul sequenziamento del DNA, ecc. Gli studenti possono fare delle miniature di carta dei modelli
di DNA per usarli in piccoli gruppi, se riducete lo schema dello stampo con una fotocopiatrice. (A seconda delle dimensioni dei modelli e la rigidezza della carta che
utilizzate, i modelli più piccoli potrebbero non avvolgersi
bene, ma funzioneranno per le esercitazioni sulla replicazione del DNA.) Il paragrafo Suggerimenti fornisce
consigli sul modo in cui adattare il modello per le classi
più giovani o per le classi più avanzate.
Quando la struttura del DNA fu proposta per la prima
volta da Watson e Crick nel 1953, si pensava che la struttura ad elica che avevano descritto fosse fissa e immutabile. Da allora, abbiamo imparato che l’elica del DNA
può assumere forme leggermente differenti, può piegarsi ed attorcigliarsi e può anche svolgersi. Tutte queste
forme diverse sembrano essere importanti per la funzionalità della cellula. La forma “standard” del DNA è chiamata elica di forma B. Ha 10,5 coppie di basi (bp, dall’inglese base pairs) per giro completo, ed il suo centro
di simmetria è lungo il centro delle coppie di basi. L’elica di forma B è il tipo che verrà costruito dalla vostra
classe. È stata però dimostrata l’esistenza di altre due forme di elica chiamate A e Z.
Il DNA di forma A ha circa 11 bp per giro completo, ed
Obiettivi
L’obiettivo di questa lezione è quello di costruire un modello di carta dell’elica del DNA. Gli studenti svolgeranno questo compito preparando i singoli nucleotidi. I
membri della classe quindi uniranno i loro nucleotidi per
formare una doppia elica.
Alla fine di questa esercitazione, gli studenti dovrebbero essere in grado di:
1 . Descrivere la struttura del DNA.
2. Stabilire quali basi formano le coppie complementari
del DNA.
3. Identificare le basi puriniche e pirimidiniche, e stabilire quali sono le più grandi.
4. Descrivere che cosa si intende con estremità 5! e 3!
dei filamenti (solo per gli studenti avanzati).
A. Struttura e funzione del DNA
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Materiali
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Estremità 5!
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Estremità 3!
• Copie delle sagome stampate (sito e-cathedra; cartella Modelli)
• Carta per modelli o carta per stampante di sei colori
diversi
• Forbici, possibilmente una per studente
• Colla
• Cucitrice e graffette
Preparazione
• Scrivete sulle sagome il colore che dovrebbero avere
le basi, lo zucchero e il fosfato (per esempio, citosina, gialla; guanina, verde; adenina, rosa; timina, blu;
fosfato, nero; deossiribosio, rosso).
• Fotocopiate o stampate copie delle sagome. Stampare o copiare su carta colorata risparmierà tempo in
classe.
Procedimento
Per assemblare i nucleotidi (compito degli studenti)
Figura 6.5 Un segmento non avvolto del modello assemblato.
1 . Ritagliate la sagoma dei nucleotidi assegnati.
2. Mettete la sagoma sulla carta per modelli di colore appropriato e ritagliarla.
3. Etichettate il pezzo di carta come è etichettato il disegno (omettete il nome del colore).
4. Incollate la base azotata alla molecola di zucchero facendo combaciare i punti.
5. Incollate il gruppo fosfato sul modello facendo combaciare gli asterischi.
6. Il docente unirà i nucleotidi per formare un’elica.
Per assemblare l’elica (compito del docente)
Affinché l’elica risulti regolare, dovete tener conto di
quanti nucleotidi di ciascun tipo sono disponibili. Un modo semplice per farlo consiste nell’utilizzare esattamente la metà di tutte le A, le T, le C e le G per costruire il
primo filamento (mettete le basi in qualunque ordine);
così sarete sicuri di avere il giusto numero di basi complementari per assemblare il secondo filamento.
Per costruire il primo filamento, cucite con punti metallici il gruppo fosfato in corrispondenza del carbonio
3! sulla molecola del deossiribosio (guardate la Figura
6.1 per i numeri degli atomi di carbonio, le posizioni
sono indicate da quadrati sulle sagome). Assemblate il
fosfato con gli zuccheri “lato destro in alto” (i gruppi
fosfato saranno rivolti verso l’alto; questo orientamento sarà dal 5! al 3!).
Per assemblare il secondo filamento, uno studente deve
tenere in mano il primo filamento. Chiedete ai vostri studenti quale nucleotide possa appaiarsi col primo nucleotide. Poi selezionate quel nucleotide, rovesciatelo per
simulare l’orientamento dal 3! al 5! (il gruppo fosfato dovrebbe essere rivolto verso il basso). Ricordate alla classe che i due filamenti di un’elica vanno in direzioni opposte. Regolate la posizione del nucleotide, e fissate con
graffette il gruppo fosfato alla posizione 3! dello zucchero, sovrapponendoli in parte come rinforzo. Costruite le coppie di basi fissando le due basi insieme; sovrapponetele per ottenere una buona resistenza. Chiedete agli studenti quale dovrebbe essere il nucleotide
successivo. Unitelo al precedente fissando il gruppo fosfato alla posizione 3! dello zucchero. Continuate finché
non avrete completato il secondo filamento (Figura 6.5).
Per costruire l’elica, avvolgete la scala di carta. Il risultato
sarà migliore se tenete la scala in verticale mentre esercitate la torsione; fate tenere un’estremità ad uno studente
oppure appendete l’elica al soffitto. Alcuni docenti “decorano” le loro classi con i modelli, facendoli correre lungo i muri e attaccandoli al soffitto. Tenete l’elica nella vostra stanza come modello avvolto o disteso. Sebbene l’elica sia una rappresentazione migliore del DNA, la forma
distesa illustra le caratteristiche più importanti, la sequenza
lineare dei nucleotidi e la complementarità dei filamenti.
7
8
6 Struttura del DNA
G U I D A
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Suggerimenti
Utilizzate questa esercitazione solo per gli studenti principianti. Le domande possono essere utilizzate per qualunque classe, sebbene alcune di esse siano piuttosto
semplici per studenti avanzati. Giudicate voi se utilizzare le domande più avanzate per i vostri studenti.
Potrebbe essere utile ritagliare i modelli in una lezione
ed incollarli il giorno successivo. Dividete le classi in
gruppi. Assegnate ad ogni gruppo un nucleotide, il fosfato o lo zucchero da ritagliare. Assicuratevi che li etichettino in modo appropriato.
In una classe media, fate ritagliare agli studenti tutti e
quattro i nucleotidi.
In una classe sopra la media, non dite agli studenti come
assemblare il modello (non fate loro consultare il foglio
dell’esercitazione). Lasciate che lo scoprano da soli. Gli
studenti possono essere divisi in piccoli gruppi e si può
chiedere loro di fare delle miniature delle molecole di
DNA utilizzando sagome di dimensioni ridotte. Due riduzioni del 64% delle sagome producono una dimensione ancora valida, ma fate attenzione perché a questa scala una molecola di DNA costruita con carta pesante non
si avvolge bene. Potreste voler provare con carta più sottile se volete che gli studenti costruiscano modelli avvolti da usare individualmente. (Modelli distesi che abbiano
le dimensioni di un banco sarebbero ottimi per l’esercitazione sulla replicazione del DNA.)
Alle classi di livello avanzato può essere richiesto di modificare questo modello molto semplice per renderlo più
accurato. Gli studenti dovrebbero marcare tutti i gruppi
funzionali sullo zucchero e numerare gli atomi di carbonio per determinare le estremità 5! e 3!. (Guardate il materiale introduttivo per la numerazione.) Si può chiedere loro di creare sagome migliori affinché le basi azotate simulino correttamente le strutture a singolo e doppio
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anello delle purine e delle pirimidine. Questi studenti
possono anche costruire piccoli modelli individuali.
La replicazione del DNA può essere insegnata con questo modello facendo preparare altri nucleotidi agli studenti, simulando lo svolgimento dell’elica, e costruendo
nuovi filamenti. (Vedi la lezione successiva, La duplicazione del DNA.) Il grande modello a elica è anche utile
per introdurre gli enzimi di restrizione (vedi l’Esercitazione 11, Forbici che tagliano il DNA); potete costruirlo
come un palindromo e “tagliarlo” per creare estremità
nette o adesive. Potete anche far riferimento alla grande
elica durante l’Esercitazione 9, Dimensioni del genoma
umano e di E. coli per ricordare agli studenti la struttura
della molecola del DNA. Usate la vostra immaginazione
per trovare altri modi di impiegare questo modello economico.
Risposte alle domande per gli studenti
Timina
Citosina
Il nucleotide (deossinucleotide)
Una doppia elica
Adenina e guanina
Citosina e timina
A causa della chimica delle basi; a causa delle esigenze di spazio dell’elica
8. Deossiribosio
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Risposte alle domande avanzate
9. TCGAGTC
10. C, perché il filamento opposto è antiparallelo al fila-
mento dato. Nella risposta alla domanda 9 la sequenza dovrebbe essere nella direzione dal 3! al 5!.
11. 55. In 100 bp ci sono 200 basi. Ci sono 45 citosine
quindi ci sono anche 45 guanine (così si spiegano 90
basi). Nella molecola ci sono altre 110 basi, A e T. Ci
deve essere un egual numero di A e di T, dal momento che si appaiano tra loro. Perciò ve ne sono 55
di ognuna.
A. Struttura e funzione del DNA
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7
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Duplicazione del DNA
Descrizione dell’esercitazione
a p. 179
La duplicazione del DNA è un argomento solitamente
presentato nei corsi di biologia di primo livello. Il fatto
essenziale della duplicazione del DNA è che le regole
dell’accoppiamento delle basi rendono molto facile la
generazione a partire da un’elica di due nuove eliche
identiche. Questa informazione fondamentale costituisce tutto ciò che è realmente necessario conoscere per
i giovani studenti riguardo alla duplicazione. Studenti
più avanzati che affronteranno il sequenziamento del
DNA e la reazione a catena della polimerasi devono
avere una conoscenza un po’ più approfondita della duplicazione del DNA, in modo da poter comprendere
queste interessanti applicazioni. L’approccio scelto in
questa lezione è quello di fornire informazioni dettagliate al docente nel materiale introduttivo e quindi di
dividere l’esercitazione in due parti. La prima è pensata per gli studenti più giovani; gli studenti di livello più
avanzato eseguiranno entrambe le parti della lezione.
La prima parte della lezione descritta sotto è una semplice (e necessariamente poco accurata) simulazione su
carta della duplicazione del DNA. È comunque sufficiente per la maggior parte degli studenti di primo livello, dal momento che mette in evidenza il fatto che i due
filamenti della doppia elica parentale vengono utilizzati
come stampo per sintetizzare i due filamenti figli. I modelli cartacei di DNA descritti in questa sezione possono
essere utilizzati nell’esercitazione. Se avete a che fare con
studenti più esperti usate l’esercitazione di base come
punto di partenza e quindi introducete un’immagine più
accurata della duplicazione del DNA tramite la seconda
esercitazione.
La seconda esercitazione è una lettura per lo studente
sulla DNA polimerasi, l’enzima centrale della duplicazione del DNA. Questa lettura fornisce quei dettagli di
cui gli studenti avranno bisogno per comprendere le lezioni successive. Contiene domande, una delle quali richiede l’uso delle informazioni derivate dalla lettura al
fine di identificare le inesattezze nel modello semplice
che hanno appena utilizzato. Potete fornire loro le informazioni aggiuntive che riterrete necessarie. L’informazione di base nell’introduzione seguente contiene
molti più dettagli sulla duplicazione del DNA di quelli
che è necessario condividere con gli studenti e sono stati riportati soltanto per vostra informazione. I due aspetti della sintesi del DNA che gli studenti avanzati devono
conoscere (se faranno le esercitazioni sul sequenziamento del DNA e/o sulla reazione a catena della polimerasi) sono che la sintesi è unidirezionale e che richiede assolutamente un primer.
Lezioni richieste: 1
Background
Tutti gli organismi devono copiare le loro informazioni
genetiche, sia durante la divisione cellulare che per la
trasmissione alla loro progenie. Questo compito cruciale è svolto da un gruppo di proteine che agiscono insieme, ma il protagonista è l’enzima DNA polimerasi. La
DNA polimerasi seleziona i nuovi nucleotidi corretti verificando che il nucleotide si accoppi correttamente con
la base dello stampo e quindi forma il nuovo legame fosfodiestere unendo il nuovo nucleotide alla catena di
DNA in crescita. Non è sorprendente che le caratteristiche della DNA polimerasi determinino le caratteristiche
generali della duplicazione del DNA all’interno della cellula e in provetta.
Nella reazione di sintesi del DNA, un deossinucleotide
in entrata si lega alla polimerasi. Questo nucleotide deve essere in forma trifosfato; l’enzima non lega mono- o
difosfonucleotidi per l’incorporazione nel DNA. (Un poco di terminologia: una molecola nucleotidica consistente
solo dello zucchero e della base è chiamata nucleoside;
i nucleotidi sono talvolta indicati come nucleosidi monofosfato, difosfato, o trifosfato per specificare quanti
gruppi fosfati sono attaccati.) Successivamente la polimerasi controlla se il nucleotide in entrata si accoppia
correttamente con la base dello stampo. Se lo fa, l’enzima forma un legame tra il primo dei tre fosfati sul carbonio 5! del nuovo nucleotide ed il gruppo 3! ossidrile
(OH) sull’ultimo nucleotide della catena in crescita (Figura 7.1). La formazione di questo legame lascia uno dei
gruppi fosfato nella catena in crescita e libera una molecola di fosfato inorganico, un “pirofosfato”, con gli altri due atomi di fosforo.
9
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7 Duplicazione del DNA
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Infine, molte polimerasi, ma non tutte, possiedono anche una funzione di correzione di bozze che controlla il
nuovo accoppiamento di basi per verificare che sia accurato. Se la nuova base non si appaia correttamente con
la base dello stampo, allora il nuovo nucleotide viene rimosso dalla catena, e l’enzima prova di nuovo. Le polimerasi prive della capacità di correzione delle bozze,
quali le trascrittasi inverse, accumulano più errori durante
la sintesi del DNA delle polimerasi che possono fare tali controlli.
Quanto frequentemente le DNA polimerasi commettono
errori nella duplicazione del DNA? Secondo studi in vitro, l’enzima di Escherichia coli aggiunge una base sbagliata una volta ogni 105 o 106 coppie di basi, ma la sua
capacità di controllare e correggere i propri errori porta
la sua percentuale di errore finale al di sotto di un errore ogni 108 bp. All’interno della cellula, ulteriori enzimi
di correzione degli appaiamenti non corretti abbassano
la percentuale di errore in vivo ad uno ogni 1010 bp. Il
genoma di E. coli contiene circa 4,6 " 106 bp, così il batterio commette meno di un errore per divisione cellulare durante la duplicazione del DNA. Al contrario, la trascrittasi inversa dei retrovirus (come il virus dell’immunodeficienza umana che causa l’AIDS) è una polimerasi
meno precisa dell’enzima di E. coli, priva anche della capacità di correzione delle bozze. Questi enzimi commettono un errore nella duplicazione circa ogni 104 bp.
Questa duplicazione del materiale genetico incline all’errore è considerata la causa dell’alta frequenza di mutazione del virus dell’immunodeficienza umana.
Due caratteristiche importanti della reazione della DNA
polimerasi sono la direzione della sintesi del DNA e la
necessità di un primer. Si noti (Figura 7.1) che l’enzima
unisce sempre il 5! fosfato del nucleotide entrante al
gruppo 3! OH della catena in crescita. Questa caratteristica della duplicazione del DNA implica che la sintesi
del DNA è unidirezionale, dal 5! al 3!. L’unidirezionalità
presenta un problema per la duplicazione del cromosoma che verrà discusso più avanti.
L’altra caratteristica della reazione è che la DNA polimerasi deve avere un nuovo filamento in crescita da unire
al nucleotide in entrata. Nessuna DNA polimerasi nota
può iniziare a sintetizzare un filamento complementare
su una molecola di DNA a singolo filamento nuda. Se il
singolo filamento ha invece un corto oligonucleotide
complementare appaiato in qualunque punto, la sintesi
del DNA può iniziare all’estremità 3! di quel nucleotide
e continuare in direzione 5! → 3! fino alla fine del singolo filamento. In questo esempio, il singolo filamento
lungo è il filamento stampo, ed il corto oligonucleotide
complementare associato ad esso è chiamato primer. In
generale, un primer è un oligonucleotide (o DNA o RNA;
Filamento figlio
Filamento stampo
5!
3!
O
–O
O
P
O
O
H2C
T
O
O
A
CH 2
O
O
O
–O
P
O
O
O
H2C
3!
O
HO
O
P
O
O–
P
O–
O–
P
O
G
O
C
CH 2
O
O
O–
P
OH
O
O
O
P
O–
O
CH 2
O
C
O
G
CH 2
O
O
Direzione dal 5! al 3!
della crescita
della catena
O–
P
OH
O
O
A
CH 2
O
O
O–
P
O
T
O
CH 2
O
5!
Figura 7.1 La DNA polimerasi (non mostrata) controlla
l’appaiamento di un deossinucleoside in entrata con la base dello
stampo e quindi forma un nuovo legame fosfodiestere tra il gruppo
5! fosfato del nuovo nucleotide ed il gruppo 3! ossidrile del
precedente nucleotide.
molte DNA polimerasi utilizzano primer di RNA) appaiato allo stampo con un gruppo 3! OH disponibile all’estremità come sito di inizio della sintesi. La molecola
stampo solitamente si estende molto oltre l’estremità del
primer. La natura ha escogitato molti modi per fornire
primer per la sintesi del DNA, alcuni dei quali sono menzionati qui di seguito.
Quando si lavora con le DNA polimerasi fuori dalla cellula (come nelle applicazioni biotecnologiche), per ottenere la sintesi del DNA è necessario fornire uno stampo
con un primer appaiato, deossinucleosidi trifosfato, ed
un appropriato tampone. La direzione della sintesi sarà
sempre da 5! a 3! iniziando dall’estremità 3! del primer.
I ricercatori usano la selezione del primer per determinare se e dove avrà luogo la sintesi del DNA.
Molto spesso, il primer è un oligonucleotide sintetico (vedi il Capitolo 5) aggiunto separatamente alla miscela di
A. Struttura e funzione del DNA
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reazione. Il DNA stampo e il primer possono essere appaiati tramite riscaldamento e raffreddamento (maggiori
informazioni a questo riguardo si trovano nel Capitolo
16, Rivelazione di sequenze specifiche di DNA: analisi di
ibridazione). Così, il ricercatore può decidere dove debba iniziare la sintesi del DNA e può sintetizzare un primer complementare che abbia la sua estremità 3! in quel
sito (ammesso che conosca la sequenza del DNA della
regione).
La specificità del primer può essere utilizzata anche per
determinare se una particolare molecola di DNA è presente in una miscela, per esempio, se in un campione di
tessuto è presente un microrganismo che causa una malattia. Nei saggi basati sulla reazione a catena della polimerasi (vedi il Capitolo 17), vengono sintetizzati primer
che si appaiano solo con il DNA dell’organismo di interesse. Se l’organismo è presente nel campione i primer
possono appaiarsi e la sintesi del DNA potrà avvenire.
Se l’organismo non è presente, i primer non si appaieranno, e non potrà avvenire nessuna sintesi. La presenza o l’assenza della sintesi del DNA viene utilizzata per
determinare se l’organismo di interesse è nel campione.
La necessità di un primer appaiato è un potente mezzo
di controllo su quando e dove la sintesi del DNA può avvenire in vitro.
Il DNA cellulare normalmente non esiste in forma di singolo filamento con i primer appaiati. I cromosomi degli
organismi sono generalmente molecole di DNA completamente a doppio filamento. In vitro, la DNA polimerasi non darà inizio alla sintesi del DNA su una molecola
di DNA perfettamente a doppio filamento. I ricercatori
fanno uso di manipolazioni, quali la denaturazione delle molecole a doppio filamento e l’accoppiamento di corti primer ai filamenti singoli, affinché la sintesi del DNA
possa avvenire in provetta. Come fanno le cellule a superare il problema?
Il modo in cui le cellule riescono ad iniziare la duplicazione del DNA (e scelgono il momento opportuno e la
controllano) è oggetto di ricerche in corso in molti laboratori nel mondo. Affinché la duplicazione del DNA
abbia inizio, tre eventi principali devono avere luogo: (1)
devono assemblarsi sul DNA le proteine della duplicazione, (2) l’elica del DNA deve essere aperta per esporre le basi non appaiate al fine di usarle come stampo, e
(3) deve essere fornito un primer. La seguente descrizione dell’inizio della duplicazione del DNA è una generalizzazione che si basa su scoperte in sistemi diversi
e non si applica a tutti i casi presi singolarmente.
La duplicazione del DNA cromosomico ha solitamente
inizio in siti specifici lungo il DNA chiamati origini della duplicazione. In generale, questi siti contengono spe-
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cifiche sequenze di basi alle quali si legano speciali proteine di inizio della duplicazione. Le origini spesso contengono anche una regione composta principalmente di
coppie di basi A-T, presumibilmente perché è più facile aprire una regione di un’elica di DNA che è ricca di
coppie A-T (solo due legami idrogeno legano la coppia
A-T, mentre tre legano la coppia G-C). Le proteine di
inizio si legano al sito di riconoscimento nell’origine della duplicazione, e questo legame innesca l’assemblaggio delle proteine della duplicazione. La doppia elica si
apre a livello dell’origine, o nelle sue vicinanze, ed un
primer si appaia o viene sintetizzato. Il primer è solitamente di RNA. Può essere un trascritto della regione di
origine che era stato sintetizzato in precedenza, o può
essere un breve RNA speciale sintetizzato sul posto. Come potete immaginare, l’uso di RNA per innescare la duplicazione del DNA significa che l’inizio della duplicazione del DNA è spesso sovrapposto alla trascrizione,
ed alcuni dei meccanismi di inizio meglio compresi sono piuttosto complicati. Molti scienziati stanno cercando di chiarire i differenti metodi di inizio della duplicazione del DNA in diversi organismi.
Dopo che la doppia elica è stata aperta e il primer si è
reso disponibile, la DNA polimerasi può iniziare a replicare il DNA. La polimerasi è assistita nel suo compito da
proteine ausiliarie; le funzioni tipiche di queste proteine
sono quelle di svolgere lo stampo a doppio filamento davanti alla polimerasi, proteggere qualunque regione a
singolo filamento esposta (queste regioni sono molto vulnerabili alla degradazione da parte di enzimi cellulari), e
aiutare a risolvere il problema della duplicazione sul filamento opposto.
Qual è il problema sul filamento opposto? Il problema è
la direzione della sintesi del DNA e la mancanza di primer. Il primer posizionato all’origine permette alla DNA
polimerasi di sintetizzare il DNA in direzione 5! → 3! allontanandosi dal primer e dall’origine della duplicazione, utilizzando come stampo il filamento appaiato al primer. Cosa succede sul filamento opposto? Si sa che il filamento opposto viene replicato insieme al primo filamento poiché il complesso della duplicazione si muove
allontanandosi dall’origine. Dal momento che la sintesi
del DNA può avvenire soltanto da 5! a 3!, la duplicazione sul filamento opposto dovrebbe svolgersi all’indietro
verso l’origine della duplicazione, nella direzione opposta. Tuttavia, immagini al microscopio elettronico del
DNA in duplicazione mostrano chiaramente che la duplicazione del DNA avviene lungo entrambi i filamenti a
livello di una “forcella” (una giunzione a forma di Y tra
il DNA parentale non replicato ed i due filamenti figli)
che si muove in una sola direzione lungo lo stampo di
DNA parentale. Come fanno le cellule a coordinare la
sintesi del DNA in direzioni opposte?
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7 Duplicazione del DNA
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Primer
5
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3
Stampo del filamento leader
A
DNA polimerasi
Nuovo DNA
Filamento leader
5
3
Filamento ritardato
DNA parentale
Stampo a singolo
filamento
del filamento
ritardato
A
3
Precedente
primer di RNA
A
B
Fin dagli anni ’60 si sa che la duplicazione del filamento opposto genera brevi frammenti, detti di Okazaki.
Mentre un filamento complementare al primo filamento
(il filamento leader) viene sintetizzato in un lungo tratto
continuo che parte dal primer dell’origine, il filamento
complementare al secondo filamento (il filamento ritardato) viene sintetizzato in piccoli pezzi (Figura 7.2). Come avviene questa sintesi frammentata del filamento ritardato, e da dove vengono i primer?
La ricerca sulla duplicazione del DNA nel batteriofago T4
ha mostrato che, quando si assemblano le proteine della duplicazione del fago, due molecole di DNA polimerasi si uniscono al complesso. Una è responsabile della
sintesi del filamento leader, e l’altra è responsabile del filamento ritardato. Il modo in cui si pensa che queste due
molecole funzionino insieme per replicare entrambi i filamenti del DNA stampo è mostrato nella Figura 7.3.
Questa figura è complicata; osservatela mentre leggete
la spiegazione nel testo. A, B e C sui filamenti di DNA
nella figura sono semplicemente posizioni di riferimento per aiutarvi a seguire il movimento delle molecole della polimerasi lungo il DNA.
Nuovo DNA
Primer di RNA
5
Figura 7.2 Il filamento ritardato è sintetizzato sotto forma di
frammenti di Okazaki durante la replicazione del DNA.
C
B
C
C
B
A
A
B
Nuovo primer di RNA
C
B
C
A
Nuovo
frammento
di Okazaki
Precedente
frammento
di Okazaki
A
Il complesso della polimerasi (con le sue proteine ausiliarie) si sposta lungo il DNA parentale per alcune centinaia di nucleotidi, sintetizzando il filamento leader mentre procede. Nel frattempo, l’altro filamento stampo viene lasciato a singolo filamento e viene rivestito con proteine speciali che lo proteggono. Ad un certo punto, una
delle proteine ausiliarie del complesso sintetizza un breve primer di RNA sul secondo filamento stampo. La seconda molecola di DNA polimerasi (la prima è occupata sul filamento leader) comincia la sintesi di un frammento di Okazaki all’estremità 3! di questo primer.
Osservate le prime due immagini nella figura. Il filamento
di DNA in alto in ogni immagine è lo stampo per il filamento leader. Immaginate le due molecole di polimera-
B
C
C
B
A
Figura 7.3 Questo modello per la replicazione contemporanea di
entrambi i filamenti di DNA (descritto nel testo) è stato chiamato
“modello del trombone”.
A. Struttura e funzione del DNA
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si associate che si muovono da sinistra verso destra lungo il DNA (da A a B lungo la molecola), sintetizzando il
filamento leader in un segmento continuo. Nel frattempo, lo stampo per il filamento ritardato si ripiega in una
struttura a forcina. Ciò orienta correttamente lo stampo
per la sintesi da 5! a 3!. Si noti che il filamento di DNA
ritardato viene sintetizzato da A verso B – in direzione
opposta al filamento principale. Le polimerasi non si
muovono indietro verso l’origine della duplicazione durante questa operazione ed è invece lo stampo per il filamento ritardato che viene tirato attraverso il complesso di duplicazione. Notate che l’ansa che sporge alla sinistra della polimerasi diventa più grande passando dalla prima alla seconda immagine. Questo movimento ricorda il modo in cui la coulisse di un trombone si muove fuori dallo strumento.
Quando i segmenti appena sintetizzati del filamento ritardato raggiungono il primer precedente, il nuovo DNA
duplex viene rilasciato e viene sintetizzato un altro primer per iniziare il successivo frammento di Okazaki
(guardate la seconda e la terza immagine nella Figura
7.3). Questo nuovo frammento di Okazaki si estenderà
da B indietro verso il primer vicino ad A (quarta immagine). I primer di RNA saranno rimossi successivamente
e sostituiti con DNA, e quindi i frammenti di Okazaki verranno uniti dall’enzima DNA ligasi.
Questo metodo apparentemente complicato di duplicazione del DNA è la conseguenza della direzionalità della sintesi del DNA e della necessità di primer. Tali vincoli governano l’uso delle DNA polimerasi fuori dalla cellula. Queste importanti limitazioni possono però fornire
ai ricercatori metodi per controllare la sintesi in vitro del
DNA (come discusso sopra).
Un ultimo problema della duplicazione causato dalla unidirezionalità e dalla necessità di primer è quello “dell’estremità”. Osservate la Figura 7.2 ed immaginate cosa accade quando il complesso di duplicazione raggiunge l’estremità della molecola di DNA (l’estremità destra nell’immagine). È chiaro che il filamento leader potrebbe essere replicato fino all’estremità di un’elica a doppio filamento, ma il filamento ritardato ha un’altra volta un problema. In generale, non viene sintetizzato un primer di
RNA all’estremità terminale del cromosoma, ma molte
strategie differenti superano il problema creato dalla specificità degli enzimi di duplicazione del DNA. Alcuni organismi hanno un DNA circolare. Altri organismi ancora
(i virus in particolare) fanno uso di interessanti combinazioni di sintesi del DNA e ricombinazione genetica per
ottenere la duplicazione completa del loro DNA.
Gli eucarioti posseggono strutture chiamate telomeri
alle estremità dei loro cromosomi. I telomeri conten-
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gono brevi sequenze ripetute di basi, nei vertebrati
5!-TTAGGG-3!. I telomeri sono sintetizzati dalla telomerasi, un interessante enzima che porta una molecola di
RNA che costituisce uno stampo per l’unità ripetuta del
telomero. La telomerasi è in realtà una forma di trascrittasi inversa che legge lo stampo di RNA e sintetizza repliche di TTAGGG. Nei vertebrati è espressa solo nelle
cellule embrionali e nelle cellule della linea germinale.
Quando la cellula comincia a differenziarsi, ogni ciclo di
divisione cellulare porta a telomeri sempre più corti.
Si pensa che l’accorciamento dei telomeri sia la causa
dell’invecchiamento e della morte cellulare. Normalmente le cellule prelevate da un organismo e cresciute
in coltura possono replicarsi per un certo numero di cicli di divisioni, e quindi muoiono. Nel 1998 alcuni ricercatori hanno trasformato cellule somatiche normali con
la telomerasi ed hanno dimostrato che continuavano a
dividersi in coltura. Si è trovato che la maggior parte delle cellule del cancro esprime telomerasi, che forse contribuisce alla loro capacità di continuare a dividersi.
Se trovate interessante il processo di duplicazione del
DNA e volete maggiori informazioni e dettagli, una buona discussione si trova su Biologia molecolare del gene
(Zanichelli Bologna 2009), di Watson et al. Gli esperimenti
sulla telomerasi sono descritti in un chiaro articolo di de
Lange (Science 279: 334-335, 1998) e nell’articolo originale di Bodmar et al. (Science 279:349-352, 1998).
Obiettivi
Dopo l’esercitazione di simulazione, tutti gli studenti dovrebbero essere in grado di:
1 . Descrivere come la struttura a coppie di basi complementari permetta che due nuove eliche identiche siano prodotte a partire da una singola elica stampo.
2. Stabilire che la duplicazione del DNA è effettuata da
proteine all’interno della cellula.
Dopo l’esercitazione, gli studenti avanzati dovrebbero essere capaci di:
3. Spiegare che cosa si intende con l’affermazione “la duplicazione del DNA è unidirezionale”.
4. Spiegare che cosa si intende con l’affermazione “la duplicazione del DNA richiede un primer”.
5. Dare un nome all’enzima centrale coinvolto nella duplicazione del DNA (DNA polimerasi).
6. Stabilire che le proteine di duplicazione purificate nelle giuste condizioni possono sintetizzare DNA in laboratorio.
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7 Duplicazione del DNA
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Materiali
Simulazione della duplicazione del DNA
Modelli di DNA che mostrano separatamente lo zucchero, il fosfato, e le basi. Questi possono essere di carta colorata ritagliata dal modello presentato in una lezione
precedente, modelli a palline disponibili commercialmente, o altri materiali. Ne servono abbastanza per permettere agli studenti di lavorare in piccoli gruppi o da
soli.
Preparazione
• Assemblate i materiali del kit o i ritagli di carta. Se state usando i ritagli, fotocopiate le sagome su carta di
diversi colori e lasciate che ogni studente ritagli diversi “zuccheri”, “fosfati”, e “basi” (tutte e quattro) prima di iniziare l’esercitazione.
• Se avete fatto modelli cartacei di DNA e li avete conservati, utilizzateli come stampi di duplicazione con i
ritagli di carta.
Procedimento
1 . Simulazione della duplicazione del DNA
• Chiedete agli studenti perché una cellula dovrebbe voler fare una copia del proprio DNA. Chiedete se pensano che avrebbe importanza che la copia fosse una
copia esatta. (L’obiettivo è che si rendano conto che
se un organismo deve generare una progenie identica a se stesso, deve trasmettere una copia del suo materiale genetico.)
• Chiedete agli studenti che cos’è che copia il DNA all’interno della cellula. Essi potrebbero non saperlo, ma
la risposta corretta è gli enzimi, e gli enzimi sono proteine. Noi vogliamo che si rendano conto che tutto il
corpo ed i processi biologici coinvolgono proteine e
che il ruolo centrale del DNA è quello di trasmettere
l’informazione necessaria per fabbricare tutte queste
proteine importanti.
• Assicuratevi che ogni studente (o gruppo di studenti)
abbia la propria molecola di partenza (che sia un modello di carta che si sono preparati o un modello da
un kit; la sequenza delle basi è totalmente ininfluente). Potreste chiedere agli studenti principianti come
la molecola di partenza potrebbe venir utilizzata come modello per la sintesi del nuovo DNA.
• Dite agli studenti che i blocchi da costruzione del DNA
sono i nucleotidi (uno zucchero, un fosfato, ed una
base). Fate loro assemblare alcuni nucleotidi di vario
genere a partire dai componenti dei loro modelli. Non
è importante sollevare la questione dei nucleosidi trifosfato con gli studenti principianti.
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• Spiegate ai vostri studenti (se non ci sono arrivati da
soli) che la cellula utilizza ciascun filamento della molecola del DNA parentale come uno stampo (modello) per ottenere un secondo filamento. Se necessario,
spiegate che la molecola parentale viene svolta (il termine corretto è denaturata o fusa) per esporre le basi non appaiate e che i nuovi nucleotidi vengono aggiunti uno alla volta, in ordine, a formare una catena
complementare che si appaia con lo stampo.
• Gli studenti devono svolgere le loro molecole di DNA
in modo che vengano esposte le basi non appaiate.
Quindi devono costruire un frammento complementare su ogni filamento parentale, utilizzando i precursori nucleotidici. Verificate il lavoro degli studenti per
assicurarvi che abbiano coppie di basi corrette nelle
loro nuove molecole.
• Parlate agli studenti delle loro nuove molecole. Quelle nuove sono esattamente come la molecola parentale? (Dovrebbero esserlo.) Quanti “vecchi” filamenti
ci sono in una nuova molecola? (Uno.) Quanti “nuovi” filamenti? (Uno.)
Questa è una trattazione sufficiente della duplicazione
del DNA per gli studenti principianti.
2. Attività di lettura dello studente
Per una trattazione più dettagliata della duplicazione del
DNA, comunicate ai vostri studenti avanzati che sebbene l’esercitazione che hanno appena completato spieghi
un punto veramente basilare, è imprecisa in quasi tutti i
dettagli. Fate leggere agli studenti l’Esercitazione 7, Duplicazione del DNA e fateli rispondere alle domande. Assicuratevi che capiscano che la porzione di figura stilizzata del nucleoside trifosfato nella figura rappresenta lo
zucchero deossiribosio e la base col gruppo 5! fosfato ed
il gruppo 3! OH mostrati (dal momento che sono i gruppi funzionali che partecipano alla formazione del nuovo
legame). Potreste mostrare loro la Figura 7.1 dalla Guida per il docente.
Chiedete agli studenti quali caratteristiche della semplice esercitazione di duplicazione non sono accurate (per
esempio, la DNA polimerasi lega solo nucleosidi trifosfato per l’incorporazione, sebbene il modello utilizzi nucleosidi monofosfato; il modello non usa primer, il modello non tiene conto della direzionalità della sintesi del
DNA). Assicuratevi che abbiano notato la necessità di un
primer e la direzionalità della sintesi del DNA. Potreste
usare uno dei loro modelli per mostrare che la DNA polimerasi dovrebbe sintetizzare il DNA da sinistra verso
destra in un filamento ma da destra verso sinistra sull’altro per mantenere la direzione da 5! a 3!. Giudicate voi
quante informazioni fornire sui meccanismi della duplicazione dei cromosomi. Non è necessario (e sarebbe
molto difficile) provare a preparare il modello dettaglia-
A. Struttura e funzione del DNA
© 978-88-08-06411-0
to della duplicazione della Figura 7.3 con ritagli di carta, ma se volete, potete disegnare o riprodurre il modello per farlo vedere agli studenti.
Risposte alle domande per gli studenti
1. La sintesi del DNA avverrà sugli stampi B e D. Gli
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stampi A e C non hanno primer. Sia in B che in D, la
sintesi comincerà all’estremità 3! del primer e continuerà verso destra (solo il corto filamento sulla sinistra nello stampo D può servire da primer, dal momento che non c’è nessuno stampo che sporge oltre
il corto filamento a destra).
2. Vedi sopra.
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Espressione dell’informazione
genetica
Descrizione dell’esercitazione
a p. 181
In questa lezione gli studenti lavorano su trascrizione e
traduzione, ai loro banchi con modelli di carta oppure
interpretando dei ruoli e muovendosi nella stanza. Potete semplicemente fare un modello del processo nei procarioti o negli eucarioti oppure ampliare l’esercitazione
come mezzo per esplorare le differenze nei segnali che
regolano i processi genetici e nelle strutture dei geni nei
procarioti e negli eucarioti. Questa esercitazione costituisce anche una buona introduzione alla discussione sui
vari significati della regolazione genica. Abbiamo fornito
ulteriori informazioni di base sulla regolazione genica e
idee per le esercitazioni di regolazione genica dopo la
descrizione dell’esercitazione di trascrizione/traduzione.
Questo capitolo comprende anche un’esercitazione avanzata sull’interferenza da RNA (RNAi) e una sull’RNA antisenso. Le informazioni di base per questa esercitazione
seguono il materiale sulla regolazione genica.
Lezioni richieste: da 1 a 3
Background
Il DNA determina le caratteristiche di un organismo specificando le sequenze amminoacidiche (e pertanto le strutture e le funzioni) delle sue proteine (vedi il Capitolo 4
per una rassegna). Per dirigere la sintesi di una proteina,
il DNA non deve solo contenere i codoni per ognuno degli amminoacidi di quella proteina, ma anche sequenze
regolatrici che indichino al macchinario della sintesi proteica della cellula dove iniziare e dove fermarsi. Sebbene
i procarioti e gli eucarioti utilizzino lo stesso codice genetico, hanno evoluto segnali regolatori differenti.
La trascrizione e la traduzione vengono generalmente trattate nei testi di biologia della scuola superiore in dettagli
talvolta eccessivi. La possibile eccezione a questa affermazione è la frequente mancanza di una discussione dei
segnali e della regolazione dei processi genetici. La questione di come l’RNA polimerasi identifichi l’inizio di un
gene viene spesso ignorata.
Vi incoraggiamo ad includere i segnali regolatori nell’insegnamento della trascrizione e della traduzione. Non è
necessario entrare nei dettagli, ma vogliamo che gli studenti sappiano che la trascrizione e la traduzione non
avvengono nel vuoto: i segnali ci sono e fanno parte del
genoma di tutti gli organismi.
Un’altra singolare mancanza in molti testi della scuola superiore è la pratica comune di presentare la struttura, la
replicazione, la trascrizione del DNA e la traduzione senza nessuna contestualizzazione che permetta di comprendere perché è importante produrre proteine. Il Capitolo 4 fornisce diversi esempi specifici della struttura e
della funzione delle proteine, e la Sezione D Biologia
molecolare e genetica mette in relazione diverse proteine con tratti osservabili.
La prima importante regione regolatrice della sintesi proteica è il promotore, la sequenza di basi del DNA che
l’RNA polimerasi riconosce ed a cui si lega prima di iniziare la trascrizione. Senza un promotore, la trascrizione
non avviene. I promotori procariotici ed eucariotici sono
diversi, come lo sono le RNA polimerasi procariotiche ed
eucariotiche. Un tipico promotore batterico consiste nella sequenza 5!-TTGACA separata da 17 basi dalla sequenza TATATT-3! (è ammessa una certa variabilità).
I promotori eucariotici sono più variabili. Un componente del promotore eucariotico è la sequenza TATA, localizzata circa 30 basi a monte del punto di inizio della
trascrizione nei lieviti e 60 basi a monte nei mammiferi.
Questo componente è spesso chiamato “TATA box”. Solitamente, altri due componenti promotori si ritrovano
molto più a monte della TATA box. Tali sono la sequenza CCAAT e una sequenza ricca di GC. Comunque ricordate dal Capitolo 4 che l’RNA polimerasi eucariotica
da sola non riesce a iniziare la trascrizione a partire da
un promotore. I promotori eucariotici sono associati a
diverse sequenze, gli enhancer, siti sul DNA dove vari
fattori di trascrizione trans-attivanti si legano e stimolano la trascrizione (vedi il Capitolo 4).
La trascrizione comincia a valle del promotore e continua fino al raggiungimento di un terminatore della trascrizione. Le sequenze di DNA dei terminatori sono complicate; ci sono classi diverse di terminatori con differenti
strutture, e inoltre i terminatori procariotici differiscono
da quelli eucariotici. La funzione di un terminatore è
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8 Espressione dell’informazione genetica
G U I D A
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E S E R C I T A Z I O N I
quella di provocare un blocco della trascrizione del DNA
da parte dell’RNA polimerasi ed il rilascio dello stampo
di DNA.
La sequenza nucleotidica dell’RNA messaggero (mRNA)
è tradotta in proteina a livello del ribosoma. La traduzione non inizia semplicemente all’estremità 5! di un
messaggio terminando alla sua estremità 3!. Ulteriori elementi regolatori che dirigono i ribosomi nell’inizio e nella fine della traduzione sono contenuti nell’RNA stesso.
Le basi dell’RNA all’estremità 5! e all’estremità 3! non
vengono tradotte in proteine.
Nei batteri il principale di questi elementi regolatori è il segnale per il riconoscimento ribosomale. Nei batteri, questo elemento ha comunemente una sequenza 5!-GAGG-3!
o 5!-AGGA-3! ed è localizzato da 8 a 13 nucleotidi a monte del codone di inizio. Il ribosoma riconosce l’elemento
e si lega all’RNA in quel punto. Come avviene il legame?
L’RNA ribosomale batterico (rRNA) contiene una sequenza di basi complementare all’elemento di riconoscimento
ribosomale (RRE) sull’mRNA, e l’rRNA e l’mRNA si ibridano a tale livello. Poiché l’RRE è vicino al codone di inizio,
il codone di inizio viene portato nella posizione appropriata per l’inizio della traduzione.
Il quadro non è altrettanto chiaro negli eucarioti. Nel modello più semplice, si pensa che i ribosomi eucariotici si
leghino all’estremità 5’ dell’mRNA alla ricerca del primo
codone di inizio per iniziare la traduzione. Esperimenti
in alcuni laboratori suggeriscono che questo semplice
modello non si adatti a tutte le situazioni.
Sia nei procarioti che negli eucarioti la traduzione comincia col codone di inizio, AUG. Questo codone specifica l’amminoacido metionina. I ribosomi procariotici ed eucariotici utilizzano una speciale forma modificata della metionina (metionina formilata in Escherichia
coli) per iniziare la sintesi proteica. In E. coli, l’inizio
della sintesi proteica richiede anche tre proteine chiamate fattori di inizio. Negli eucarioti sono necessari
molti altri fattori proteici. Una volta iniziata, la sintesi
proteica continua lungo l’mRNA finché non viene raggiunto un codone di stop, a quel punto il ribosoma rilascia l’mRNA.
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3!
5!
DNA
5!
ATG
Promotore RRE
RNA
5!
Sequenza
codificante
3!
Codone Terminatore
di stop
AUG
RRE
Codone
di stop
3!
Proteina
Amminoacidi
corrispondenti ai codoni
Figura 8.1 I principali segnali di traffico genetico nei batteri.
Questi segnali dicono alla RNA polimerasi dove cominciare e
terminare la trascrizione, rendono il ribosoma capace di
riconoscere l’RNA, e dirigono il ribosoma a iniziare e terminare la
sintesi proteica.
Molti geni eucariotici, ma non tutti, contengono introni
(vedi il Capitolo 4). Un introne è una sezione di DNA,
inclusa in una regione di un gene codificante una proteina, che non viene rappresentata nell’mRNA o nella sequenza proteica. Il DNA intronico è trascritto nell’RNA
insieme con le regioni codificanti per formare un lungo
RNA precursore. Gli introni sono rimossi dall’RNA precursore tramite lo splicing, che avviene nel nucleo.
I meccanismi dello splicing sono attualmente oggetto
di ricerca. Sembra che ce ne siano almeno tre: uno per
l’RNA transfer (tRNA), uno per l’mRNA, ed uno per l’rRNA.
Ciascun meccanismo utilizza una serie diversa di segnali
per determinare precisamente quali sequenze devono essere rimosse dall’RNA precursore. Un modello generico
di splicing è mostrato nella Figura 8.2. Lo splicing accurato è molto importante; diversi tipi di talassemia (una
malattia del sangue) nell’uomo sono causati da mutazioni nei segnali di splicing del gene dell’emoglobina che
portano ad errori di splicing nell’RNA dell’emoglobina e
quindi ad una sintesi non corretta della proteina.
Per questa lezione
I segnali genetici di regolazione coinvolti nella conversione delle sequenze di DNA in proteine (nei procarioti) sono riassunti nella Figura 8.1.
La descrizione presentata qui è superficiale; ulteriori letture su un testo di biologia molecolare forniranno maggiori dettagli, se volete approfondire maggiormente. Non
è ovviamente necessario trasmettere tutte queste informazioni agli studenti. Potete descrivere tanti elementi regolatori quanti ritenete opportuni; il promotore è sicuramente il più importante.
Nei procarioti il prodotto della trascrizione è l’mRNA. Negli eucarioti, invece, l’RNA polimerasi sintetizza un trascritto primario che deve essere ulteriormente modificato prima di poter funzionare da messaggio. Uno di questi passaggi di modificazione è lo splicing.
I modelli da ritagliare (sito e-cathedra; cartella Modelli)
permettono di simulare la sintesi proteica nei procarioti
e negli eucarioti. Il modello più completo della sintesi
proteica batterica dovrebbe comprendere il promotore,
il terminatore e la sequenza di riconoscimento del ribo-
A. Struttura e funzione del DNA
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Esone
Esone
Esone
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Esone
DNA
Promotore
Introne
Introne
Introne
Terminatore
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Figura 8.2 Splicing dell’RNA precursore
per produrre mRNA. Gli esoni del DNA
contengono la sequenza codificante la
proteina.
Trascrizione
Giunzione di splicing
RNA
precursore
Splicing
mRNA
soma. Il modello eucariotico più completo dovrebbe
comprendere il promotore, il terminatore e i segnali d’inizio e fine di splicing (le giunzioni di splicing).
Obiettivi
Dopo questa lezione gli studenti dovrebbero essere capaci di:
1 . Descrivere la funzione del DNA come materiale ereditario fondamentale che controlla l’attività cellulare tramite il controllo del sistema enzimatico della cellula.
2. Descrivere la trascrizione e la traduzione.
3. Descrivere le funzioni del promotore e del terminatore.
4. (Opzionale) Confrontare i segnali procariotici ed eucariotici di regolazione dei geni.
Materiali
•
•
Forbici
Fogli delle triplette del codice genetico del DNA/RNA
stampati dal sito (e-cathedra; cartella Modelli), insieme a qualunque foglio desiderato di elementi regolatori.
Varianti di questa esercitazione
La maggior parte della discussione seguente è correlata
ad una forma di esercitazione in cui gli studenti interpretano la trascrizione e la traduzione muovendosi per
la classe. Alcuni insegnanti utilizzano regolarmente questa forma di esercitazione e la trovano utile. L’esercitazione funziona anche come una dimostrazione: potete
attaccare i cartoncini del DNA stampo sulla lavagna e
mostrare come si forma l’RNA.
Un’altra opzione consiste nel far lavorare gli studenti in
coppia ai loro banchi. Riducete i disegni da ritagliare con
una fotocopiatrice e raggruppateli in qualche foglio. Date ad ogni squadra una serie di fogli. Gli studenti possono ritagliare i modelli come semplici quadrati di carta
per risparmiare tempo e quindi usare i ritagli per simulare la trascrizione e la traduzione ai loro banchi.
Preparazione
Modificate la preparazione secondo la variante della lezione che decidete di utilizzare.
Prima della lezione, ritagliate le tessere del codice genetico fornite sul sito e-cathedra, cartella Modelli (o fatele
ritagliare dagli studenti in classe). I ritagli di DNA sono
in coppie complementari; un ritaglio contiene lettere piene; il suo complemento ha lettere contornate. Il filamento
con le lettere contornate rappresenterà il filamento codificante del DNA; il filamento con le lettere piene sarà
il filamento non codificante. Unite con delle graffette le
tessere del DNA complementare in serie di due. Sistemate i ritagli in quattro pile: DNA, mRNA, tRNA, ed amminoacidi. Mettete la sequenza di “inizio” (TAC) nella seconda posizione della pila del DNA e la sequenza di termine (ATC) in fondo. La tessera del promotore dovrebbe quindi essere posta sopra tutti i ritagli di DNA con i
terminatori sul fondo.
Decidete quale modello (procariotico o eucariotico) userete e quali segnali volete utilizzare. Ritagliate le tessere
dei segnali. Se usate la tessera RRE, questa dovrebbe andare tra il primo ritaglio di DNA e la tessera di “inizio”
(TAC). Se usate le tessere di inizio e di termine dello splicing, queste possono andare ovunque tra le tessere di
“inizio” e di “termine” purché non sottoponiate a splicing l’intero gene! Alcuni allineamenti campione per i
modelli procariotici ed eucariotici sono mostrati nella pagina successiva (Figura 8.3).
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8 Espressione dell’informazione genetica
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Modello procariotico
Promotore
DSC
RRE
Modello eucariotico
Promotore
DSC
TAC
TAC
DSC
DSC . . . DSC
DSC . . . DSC
splicing
DSC
DSC . . . DSC
Figura 8.3 Allineamenti campione di sequenze di DNA per la
trascrizione. Le giunzioni di splicing ed il passaggio di splicing sono
opzionali. DSC, tessera di sequenza di DNA con tre basi qualsiasi;
Suggerimenti
1 . Fotocopiate o stampate le triplette dei codoni su carta colorata usando, se possibile, colori diversi per
DNA, mRNA, tRNA ed amminoacidi.
2. Se possibile, plastificate le tessere così che possano
essere usate più volte.
3. Assicuratevi che gli studenti capiscano l’importanza
delle proteine nel determinare le caratteristiche di un
organismo prima di iniziare l’esercitazione (guardate
il materiale introduttivo).
4. Alcuni insegnanti incollano i ritagli su quadrati di carta più grandi e quindi fanno passare un filo attraverso buchi rinforzati nei quadrati per costruire dei cartelloni. Gli studenti possono appenderli sulle spalle
come etichette durante la simulazione. Questi cartelloni possono essere riutilizzati di anno in anno.
Procedimento per interpretare
la trascrizione e la traduzione
Nota: queste istruzioni sono rilevanti sia che pianifichiate di svolgere l’esercitazione come una dimostrazione sia
che facciate utilizzare agli studenti modelli di carta ai loro banchi.
1 . Preparate la scena. Se state usando il modello eucariotico, può essere utile preparare la scena per gli studenti come segue.
• Il pavimento della classe, i muri, e il soffitto sono
gli analoghi della membrana cellulare.
• Designate un’area come “nucleo”, dove avviene
la trascrizione.
• Designate un’altra area come “ribosoma”, dove
avviene la traduzione.
• Tutte le altre aree nella stanza che non sono nucleo sono il “citoplasma”.
Impor tan te: se volete usare il modello di E. coli, ricordate che i batteri non hanno nucleo. Il cromosoma e i
ribosomi sono associati con la membrana cellulare. Stabilite di conseguenza un’area ribosomale, e lasciate che
stop
splicing
DSC
terminatore
DSC . . . DSC
stop
DSC
terminatore
TAC, tessera di DNA codificante con una sequenza di basi TAC (la
corrispondente tessera codificante è ATG); . . ., qualunque numero
di tessere di sequenza di DNA; stop, il codone di stop.
il “DNA” sia vicino alla membrana. Inoltre, ricordate che
E. coli utilizza gli RRE ma non utilizza lo splicing. (Non
dovete parlare di riconoscimento ribosomale, ma non
mostrate lo splicing nei batteri.)
Il modello eucariotico non usa gli RRE (lasciate che il ribosoma riconosca l’estremità 5! del messaggio) e può
usare lo splicing. Se siete molto ambiziosi ed avete tempo, potete utilizzare entrambi i modelli per far sì che gli
studenti apprezzino le somiglianze e le differenze.
2. Distribuite agli studenti le coppie delle tessere della sequenza del DNA, gli elementi regolatori desiderati, ed
i codici di mRNA corrispondenti. Le lettere grandi sulle tessere si riferiscono alla prima lettera delle basi nucleotidiche (A = adenina, C = citosina, G = guanina, T
= timina, e U = uracile). Non distribuite le tessere dei
tRNA e degli amminoacidi fino al passaggio 10.
3. Ricordate brevemente la struttura del DNA se necessario. La parte informativa del DNA è dentro le basi
appaiate, così la trascrizione non inizia finché l’RNA
polimerasi non svolge i due filamenti di DNA. L’RNA
polimerasi catalizza l’appaiamento delle basi esposte
del DNA con i nucleotidi complementari di RNA che
capitano vicino.
Gli studenti possono confondersi sul ruolo dei due filamenti di DNA. Un filamento (in questo caso rappresentato da tessere con le lettere contornate) è il filamento
codificante. Esso contiene i codoni di tre basi che si ritroveranno nell’mRNA. Per portare l’informazione codificante al ribosoma per la traduzione, la cellula fa una
copia di mRNA. Come può la cellula fare una copia del
filamento codificante? Sintetizzando mRNA complementare al filamento non codificante.
Il processo è simile alla replicazione del DNA, eccetto
che solo un filamento della molecola di DNA viene usato come stampo. L’mRNA generato è una copia del filamento codificante. Come fa l’RNA polimerasi a “sapere” quale filamento utilizzare come stampo per la sintesi? La sequenza del promotore orienta correttamente
l’enzima.
A. Struttura e funzione del DNA
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Trascrizione
4. Gli studenti con le coppie di tessere del DNA si allineano nell’area della classe designata come “nucleo”.
Lo studente con la tessera del promotore dovrebbe
stare sulla sinistra rispetto alla classe. Non è importante quale tessera di sequenza del DNA sia la prima
dopo il promotore. Lo studente con la tessera del DNA
con le lettere piene “TAC” e quelle contornate “ATG”
(sequenza di inizio) dovrebbe essere la seconda sequenza di DNA (il terzo studente in assoluto, con il
primo studente che ha il promotore). Il codice di DNA
TAC produrrà il codone di inizio dell’mRNA, AUG. La
tessera con le lettere piene “ATC” (sequenza di termine) dovrebbe essere la penultima; l’identità dell’ultima tessera non è importante. Se usate RRE per il modello di E. coli, lo studente deve stare tra il primo codone di DNA ed il “TAC”. Tutte le altre tessere di DNA
possono essere mescolate in qualunque ordine. Per
alcuni esempi riferitevi ai diagrammi.
Gli studenti devono tenere le tessere davanti a loro con
le lettere rivolte verso la classe. Le tessere con le lettere
piene dovrebbero essere tenute sopra le tessere con le
lettere contornate, con le basi complementari l’una davanti all’altra. Dovreste vedere sopra una fila di tessere
con lettere piene e sotto una fila complementare di tessere a lettere contornate che formano i due filamenti di
una sequenza di DNA. Questa è la rappresentazione della molecola di DNA a coppie di basi. Lo studente con il
promotore dovrebbe stare sulla sinistra.
5. Designate uno studente per rappresentare l’RNA polimerasi. Questo studente cammina verso lo studente
promotore e gli dà la mano, intendendo che l’RNA polimerasi ha riconosciuto l’inizio di un gene. Dopo la
stretta di mano, gli studenti DNA dovranno abbassare
le tessere con le lettere contornate (la fila più bassa),
esponendo uno stampo a singolo filamento per l’RNA
polimerasi. Essi dovrebbero tenere le tessere a lettere
contornate per il successivo confronto con l’mRNA.
6. Ripassate le seguenti regole con gli studenti che hanno le tessere dell’mRNA.
• La citosina dell’RNA si appaia sempre con la guanina del DNA.
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• L’uracile dell’RNA si appaia sempre con l’adenina
del DNA.
• L’adenina dell’RNA si appaia sempre con la timina del DNA.
• La guanina dell’RNA si appaia sempre con la citosina del DNA.
7. Utilizzando queste regole, gli studenti con le tessere
dell’mRNA devono trovare i loro compagni di DNA.
Fateli appaiare in ordine, iniziando con la prima tessera di sequenza di DNA e progredendo verso il terminatore, dove l’appaiamento si interrompe. Quando il DNA e l’RNA si saranno correttamente appaiati
ed il terminatore sarà stato raggiunto, confrontate la
sequenza dell’RNA con la sequenza delle tessere di
DNA a lettere contornate che gli studenti stanno tenendo (il filamento codificante del DNA). Gli studenti
dovrebbero vedere che le sequenze delle basi delle
tessere a lettere contornate e quelle dell’RNA sono
identiche, fatta eccezione per la sostituzione della U
al posto della T nell’RNA. La sequenza dell’RNA è
complementare alle tessere della sequenza di DNA
con le lettere piene.
8. Gli studenti del DNA possono sedersi, lasciando una
catena di RNA. (Potreste voler ricordare agli studenti che nella realtà la catena di DNA si estende oltre il
terminatore in direzione del gene successivo, perciò
è importante avere un “segnale di terminazione” per
l’RNA polimerasi.) Dite agli studenti che hanno effettuato la trascrizione. Essi hanno costruito una sezione complementare di RNA molto corta (più corta
che nella realtà) che riflette perfettamente la sequenza di basi della molecola di DNA.
Nota: dopo che gli studenti avranno appaiato le loro tessere, non sarà necessario che siano nell’ordine mostrato
nella Figura 8.4, ma gli appaiamenti DNA/mRNA dovrebbero combaciare verticalmente come nella figura.
9. Se volete simulare lo splicing, fatelo ora. Per simulare lo splicing, fate restare l’RNA nel nucleo. Le due
giunzioni di splicing e ogni altro studente tra di esse
si allontanino e si siedano, e siano lasciate adiacenti
tra loro le sequenze di RNA immediatamente a monte della prima giunzione di splicing e quelle a valle
della seconda.
DNA (codificante)
CCG
ATG
AAT
GTC
GAG
CTA
TCC
TAC
GGC
DNA (non codificante)
GGC
TAC
TTA
CAG
CTC
GAT
AGG
ATG
CCG
mRNA
CCG
AUG
AAU
GUC
GAG
CUA
UCC
UAC
GGC
Figura 8.4 Appaiamenti di sequenze DNA/mRNA.
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8 Espressione dell’informazione genetica
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Traduzione
Gli studenti noteranno che le tessere del tRNA sono disposte in gruppi di tre lettere. La sequenza di tre basi del
tRNA rappresenta il suo anticodone. Inoltre, ogni tessera di tRNA ha un’abbreviazione di tre lettere (nella parte “a freccia” della tessera) per ognuno dei 20 amminoacidi (Tabella 8.1). Questa lezione include soltanto 7
dei 20 amminoacidi utilizzati per fabbricare le proteine.
1 0. Distribuite separatamente le tessere dei tRNA e degli
amminoacidi, una per studente. Gli studenti con i due
tipi di tessere dovrebbero sparpagliarsi a caso nel “citoplasma”. Se includete il riconoscimento ribosomale nella vostra simulazione, designate uno studente
come ribosoma ed effettuate la funzione di riconoscimento. Questo studente dovrebbe stare nell’area
definita come ribosomale.
1 1 . Gli studenti con le tessere di tRNA devono trovare gli
studenti con i loro amminoacidi specifici e stare insieme. Per esempio, la tessera di tRNA “GGC” con le
lettere PRO deve trovare l’amminoacido prolina. Nella cellula c’è un enzima specifico per ogni tipo di molecola di tRNA che unisce il tRNA al proprio amminoacido corretto.
1 2. Gli studenti con le tessere di mRNA dovrebbero camminare verso l’area designata come “ribosoma” e fermarsi appena fuori di essa. Nella cellula eucariotica,
lo studente con la primissima tessera di mRNA (il 5!)
dovrebbe dare la mano allo studente che effettua il
Tabella 8.1 • Abbreviazioni degli amminoacidia
Abbreviazioni
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
Amminoacido
Alanina
Arginina
Asparagina
Acido aspartico
Cisteina
Glutammina
Acido glutammico
Glicina
Istidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
a Queste abbreviazioni standard di tre lettere vengono utilizzate frequentemente nella letteratura scientifica per indicare gli amminoacidi.
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riconoscimento del ribosoma, per indicare che il ribosoma ha trovato l’estremità 5! del messaggio. Nel
modello di E. coli, il ribosoma dà la mano all’RRE.
1 3. Ripassate le seguenti regole.
• La citosina del tRNA si appaia sempre con la guanina dell’mRNA.
• L’uracile del tRNA si appaia sempre con l’adenina dell’mRNA.
• L’adenina del tRNA si appaia sempre con l’uracile dell’mRNA.
• La guanina del tRNA si appaia sempre con la citosina dell’mRNA.
1 4. Gli studenti amminoacido e quelli tRNA dovrebbero
camminare insieme verso l’area del ribosoma. Iniziando con il codone AUG, fate appaiare il corretto
tRNA con il suo codone. Quando il secondo tRNA troverà il suo posto sul filamento di mRNA, il primo ed
il secondo amminoacido uniranno le mani. Quindi, il
primo tRNA si staccherà dal suo amminoacido e ritornerà verso il “citoplasma.” Gli amminoacidi rimangono nel “ribosoma.” Continuate lungo la molecola di
RNA, usando i tRNA per unire ogni nuovo amminoacido alla catena crescente. Appena si aggiunge un
nuovo tRNA, quello precedente si allontana. La traduzione si interrompe quando si raggiunge il codone
di stop. A questo punto, la catena amminoacidica viene rilasciata e l’mRNA e la nuova catena amminoacidica lasciano il ribosoma.
Gli amminoacidi uniti in questo modo sono chiamati peptidi. Lunghe catene di amminoacidi uniti sono spesso chiamati polipeptidi. La traduzione è completa quando una sequenza di informazioni di mRNA è tradotta in un polipeptide. Una proteina può essere un polipeptide o un’associazione di più di un polipeptide (vedi il Capitolo 4).
Gli appaiamenti mRNA-tRNA degli studenti dovrebbero
corrispondere in senso verticale a quelli mostrati nella
Figura 8.5.
1 5. Utilizzate le Domande per gli studenti come base per
una discussione di classe o assegnatele come compiti a casa.
Attività successive (opzionali)
•
•
Questa esercitazione è un buon punto di partenza per
una discussione sulla regolazione della trascrizione.
(Vedi il Capitolo 4 per informazioni.) Se decidete di
discutere della regolazione della trascrizione, assicuratevi di includere il promotore nella vostra esercitazione.
Per classi avanzate, è divertente esaminare tutti i passaggi del percorso che conduce dal gene alla protei-
A. Struttura e funzione del DNA
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mRNA
tRNA
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CCG
AUG
AAU
GUC
GAG
CUA
UCC
UAC
GGC
nessuno
UAC
UUA
CAG
CUC
GAU
AGG
AUG
nessuno
Met
Asn
Val
Glu
Leu
Ser
stop
Amminoacidi
Figura 8.5 Appaiamenti di mRNA, tRNA, ed amminoacidi.
I due codoni senza tRNA non sono appaiati poiché si trovano
prima del codone di inizio e dopo il codone di stop.
•
A L L E
na ed immaginare dei modi per regolare la sintesi
proteica ad ogni tappa. È molto probabile che in natura esistano veramente esempi di ogni meccanismo
regolatore immaginato. Se discutete la regolazione
genica in questa occasione, assicuratevi di esporre l’idea dell’RNA antisenso (vedi l’Esercitazione avanzata Antisenso ed inter ferenza da RNA).
Se a voi e alla vostra classe piace questo genere di
cose, pensate alla possibilità di fare un video dell’esercitazione e di mostrarlo a una classe di grado
inferiore per spiegare la trascrizione e la traduzione.
Se questi codoni si trovassero tra i segnali di inizio e termine della
traduzione, si sarebbero appaiati, rispettivamente, con GGC/Pro
e CCG/Gly.
di iniziare la traduzione, il peptide risultante sarebbe
corto a causa di sequenze di termine casuali.
(Secondo il livello di preparazione dei vostri studenti,
potreste voler discutere con loro i seguenti aspetti della
trascrizione. L’RNA polimerasi non può trascrivere il filamento sbagliato dopo il riconoscimento del promotore.
L’RNA polimerasi, come la DNA polimerasi, sintetizza l’acido nucleico in direzione 5!-3!. Solamente un filamento
del DNA è nel giusto orientamento, relativamente al promotore, per essere utilizzato; l’altro filamento è rivolto
all’indietro.)
5. Una base extra inserita vicino all’inizio del gene mo-
Risposte alle domande per gli studenti
1. Le sequenze sono complementari.
2. Sono la stessa sequenza, eccetto il fatto che l’mRNA
usa l’uracile al posto della timina.
3. Il filamento non codificante è complementare al-
l’mRNA.
4. Certamente il filamento non codificante non può es-
sere utilizzato per produrre la stessa proteina che è
codificata dal filamento codificante; le sequenze di
DNA sono diverse. È improbabile che il filamento
non codificante di un gene possa contenere un promotore ed un ATG nel giusto allineamento per la trascrizione e la traduzione. Inoltre, è molto probabile
che, anche se si potesse iniziare la trascrizione e quin-
dificherebbe l’intera sequenza codificante. Verrebbero codificati amminoacidi completamente differenti,
e probabilmente si incontrerebbe un codone di termine prima dell’estremità corretta della proteina. Gli
esempi sono molteplici.
6. La risposta ovvia è che la traduzione ne risentirebbe
poiché l’amminoacido mancante non sarebbe disponibile per legarsi al suo tRNA e non potrebbe essere
incorporato nella catena peptidica. Una risposta meno ovvia è quella che, alla fine, anche la trascrizione
ne risentirebbe poiché l’RNA polimerasi non potrebbe essere più sintetizzata in maniera corretta a causa
dell’amminoacido mancante.
7. Vedi la Figura 8.6.
8. Vedi la Figura 8.7.
C
ATG
TCC
CCG
GAG
AAT
GTC
GAG
CTA
TCC
GGC
TAG
NC
TAC
AGG
GGC
CTC
TTA
CAG
CTC
GAT
AGG
CCG
ATC
mRNA
AUG
UCC
CCG
GAG
AAU
GUC
GAG
CUA
UCC
GGC
UAG
tRNA
UAC
AGG
GGC
CUC
UUA
CAG
CUC
GAU
AGG
CCG
nessuno
Ammin oacido
Met
Ser
Pro
Glu
Asn
Val
Glu
Leu
Ser
Gly
nessuno
DNA
inizio
Figura 8.6 Schema di risposta alla domanda 7. Le sequenze del
DNA non codificante e del tRNA sono identiche, eccettuato il fatto
che il tRNA contiene uracile al posto della timina. Per le
stop
abbreviazioni degli amminoacidi, vedi la Tabella 8.1. C, filamento
codificante; NC, filamento non codificante.
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8 Espressione dell’informazione genetica
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DNA
C
ATG
CTA
GTC
CCG
GGC
AAT
TCC
GAG
CCG
GTC
TAG
DNA
NC
TAC
GAT
CAG
GGC
CCG
TTA
AGG
CTC
GGC
CAG
ATC
mRNA
AUG
CUA
GUC
CCG
GGC
AAU
UCC
GAG
CCG
GUC
UAG
tRNA
UAC
GAU
CAG
GGC
CCG
UUA
AGG
CUC
GGC
CAG
nessuno
Amminoacido
Met
Leu
Val
Pro
Gly
Asn
Ser
Glu
Pro
Val
stop
Figura 8.7 Risposta alla domanda 8. Per le abbreviazioni degli amminoacidi vedi la
Tabella 8.1. C, filamento codificante; NC, filamento non codificante.
Altre idee per l’insegnamento
della trascrizione e della traduzione
Qui sono riportate alcune esercitazioni per l’insegnamento della trascrizione e della traduzione che hanno
funzionato bene per noi o per i nostri colleghi.
•
•
Estendete il modello cartaceo dell’elica utilizzando
colori diversi per lo zucchero ribosio e la base uracile, fate assemblare i ribonucleotidi agli studenti così
come hanno assemblato i deossiribonucleotidi nel
Capitolo 6 e quindi utilizzate l’elica di carta del DNA
come uno stampo per sintetizzare mRNA. Alcuni insegnanti hanno preparato anche tRNA ed amminoacidi di carta ed hanno svolto l’esercitazione fino alla
traduzione.
Una traduzione di carta semplificata.
Tagliate quadrati di carta colorata per rappresentare
gli amminoacidi. Utilizzate 20 colori diversi ed assegnate un colore ad ogni amminoacido. Date agli studenti una sequenza di DNA da tradurre in proteina.
Lavorando a coppie, gli studenti dovrebbero incollare insieme o unire con graffette i quadrati colorati nell’ordine corretto. Successivamente, assegnate ad ogni
coppia di studenti una mutazione diversa. Includete
inserzioni, delezioni, sostituzioni e mutazioni ambra
(cambiamenti della sequenza nucleotidica che producono codoni di termine dentro al gene, causando
terminazione prematura della traduzione). Ora ogni
coppia di studenti deve modificare la sequenza originale del DNA in base alla mutazione assegnata e quindi tradurre la nuova sequenza. Ogni coppia di studenti
deve mostrare la nuova catena proteica alla classe,
•
identificare la mutazione e spiegare come la mutazione ha causato un’alterazione (se c’è stata) nella sequenza proteica. La funzionalità di questo sistema è
che i cambiamenti nella sequenza della proteina si
rendono immediatamente evidenti nell’aspetto della
catena di quadrati di carta colorata, e la varietà di proteine alterate che la classe otterrà è sorprendente.
Uso di modelli a perline.
Un’alternativa ai modelli semplificati con i quadrati
di carta è costituito dall’uso di perline. Procuratevi 20
tipi diversi di perline (procuratevene di molto diverse) e assegnate un tipo di biglia per amminoacido.
Seguendo il modello precedente, fate tradurre agli
studenti le sequenze di DNA in proteine, infilando le
perline al posto degli amminoacidi.
Anche il codice genetico può essere rappresentato
con perline. Procuratevi quattro colori di perline.
Queste rappresenteranno le basi del DNA. Preparate
un codice genetico a colori usando i colori delle perline. Per esempio, se A è una perlina rossa, la T o la
U una perlina blu, e la G una perlina gialla, allora rosso-blu-giallo codificherà la metionina.
Un aspetto interessante dell’uso di perline uguali per
il DNA e di perline molto diverse per gli amminoacidi è che ciò si avvicina alla realtà. I nucleotidi sono
molto simili, mentre gli amminoacidi hanno una struttura molto variabile. Il DNA è una molecola regolare, fatta di unità ripetute piuttosto simili. Le proteine,
d’altro canto, sono molto diverse. Il modello regolare di perline uguali del DNA e i modelli delle proteine composti da perline multicolori che indicano gli
amminoacidi illustrano bene questo fatto.
A. Struttura e funzione del DNA
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E S E R C I T A Z I O N I
Regolazione genica
Esercitazione avanzata
Tutte le cellule regolano l’espressione dei loro geni. Essenzialmente ogni gene batterico che sia stato studiato è
regolato a qualche livello durante la sua espressione. Viene utilizzata un’impressionante varietà di meccanismi regolatori, fra i quali la regolazione dell’inizio della trascrizione (come descritto per gli operoni lac e trp in Regolazione dell’espressione genica nel Capitolo 4), la regolazione della terminazione della trascrizione, la degradazione dell’mRNA, il controllo dell’inizio della traduzione (attraverso oligonucleotidi antisenso o proteine), e l’alterazione del riconoscimento del promotore. Si
può tranquillamente affermare che qualunque meccanismo di regolazione genica si possa immaginare, questo
è utilizzato da qualche parte nel mondo naturale.
di regolazione è presente nel batterio Bacillus subtilis.
Questo organismo forma spore quiescenti a lunga vita in
risposta a condizioni ambientali avverse. La formazione
della spora richiede l’espressione di un gruppo di geni
che non sono attivi durante il ciclo di vita normale del
batterio. Inoltre, la normale attività genica cessa completamente durante lo stadio di spora. Per acquisire questi notevoli cambiamenti di espressione genica, il B. subtilis sintetizza una speciale proteina che si lega alla sua
RNA polimerasi e che le fa riconoscere solo gli speciali
promotori che controllano i geni della sporulazione.
Repressione della traduzione
Alterazione del riconoscimento del promotore
La regolazione dell’espressione genica può essere esercitata attraverso il controllo della frequenza di traduzione di un mRNA. Un valido esempio di repressione della
traduzione si può trovare nella sintesi delle proteine ribosomali di E. coli. I ribosomi di E. coli sono costituiti da
grandi molecole di rRNA e da diverse proteine che si legano a specifiche regioni dell’RNA. I geni per le proteine ribosomali sono allineati in operoni. Un singolo
mRNA è trascritto da ogni operone e tradotto in diverse
proteine. Appena vengono tradotte, le proteine trovano
rRNA liberi nel citoplasma e si legano ai loro siti di riconoscimento. Quando tutto l’RNA disponibile ha formato
complessi con le proteine, una delle proteine prodotte
dall’operone si lega invece alla regione di inizio della traduzione dell’mRNA dell’operone. Il legame di quella proteina con l’mRNA impedisce l’ulteriore traduzione. Per
ognuno degli operoni delle proteine ribosomali, una delle proteine codificate agisce come repressore della traduzione. Attraverso questo meccanismo, si ottiene un bilanciamento tra la quantità di rRNA e quella delle proteine ribosomali disponibili.
Le alterazioni del riconoscimento del promotore servono quando è richiesto un drastico cambiamento nell’espressione genica, cioè quando si deve trascrivere un
nuovo gruppo di geni e/o un gruppo normalmente trascritto deve essere spento. Per esempio, molti virus codificano proteine che si legano all’RNA polimerasi dell’ospite. L’RNA polimerasi modificata potrà riconoscere
in seguito solo i promotori del virus, che hanno una sequenza di basi diversa dai normali promotori dell’ospite. In questa maniera, il virus sposta la trascrizione dai
geni dell’ospite ai suoi. Un altro esempio di questo tipo
La regolazione genica antisenso è stata scoperta negli anni ’80 nel corso di studi su plasmidi, trasposoni, e batteriofagi. Diversi esempi naturali di questa forma di regolazione sono stati descritti. Due esempi ulteriori di regolazione antisenso si trovano nella sintesi di due proteine
della membrana esterna di E. coli e nella sintesi della proteina trasposasi del trasposone 10. In questi esempi di
regolazione genica antisenso, un breve RNA esattamente complementare all’estremità 5! di un mRNA si appaia
Fra gli esempi specifici dei vari meccanismi di regolazione genica ci sono i seguenti.
Attivazione e repressione della trascrizione
La regolazione della frequenza di trascrizione è il più importante livello di controllo genico esercitato nei sistemi
batterici. La più comune forma di controllo trascrizionale è effettuata da proteine regolatrici specifiche che si legano dentro o vicino alla sequenza promotrice e bloccano o stimolano la trascrizione. Due esempi di vie utilizzate per rispondere alle condizioni ambientali si trovano negli operoni lac e trp, come descritto nel Capitolo 4. Gli attivatori della trascrizione generalmente si legano vicino al promotore ed interagiscono direttamente
con l’RNA polimerasi per incrementare la frequenza della trascrizione. Questo tipo di interazione sembra essere
di particolare importanza negli eucarioti.
Regolazione tramite RNA antisenso
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8 Espressione dell’informazione genetica
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alla regione di inizio della traduzione dell’mRNA e ne impedisce la traduzione. All’inizio si pensava che l’RNA antisenso impedisse la traduzione bloccando l’attacco dei
ribosomi all’mRNA. Alla luce della scoperta del meccanismo dell’RNAi, potrebbe essere necessario rivedere
questa conclusione.
La regolazione genica antisenso ha generato grande entusiasmo per la possibilità di controllare artificialmente i
geni. Diverse industrie biotecnologiche si sono concentrate sulla regolazione antisenso come mezzo di controllo
dell’espressione genica nelle piante da raccolto, per controllare le malattie virali, e nel trattamento del cancro e
di altre malattie umane. Esse hanno ottenuto alcuni successi, ed un farmaco antivirale antisenso è ora sul mercato. La regolazione genica antisenso verrà discussa ulteriormente nell’esercitazione successiva, insieme a quella esercitata dall’RNAi.
Regolazione tramite RNAi
I tentativi di usare l’RNA antisenso per regolare l’espressione genica hanno portato alla scoperta dell’RNAi. Nell’RNAi, la presenza di un RNA a doppio filamento
(dsRNA) innesca la degradazione enzimatica dell’mRNA
che ha la stessa sequenza di basi del dsRNA. Ricerche recenti hanno dimostrato che le cellule usano la via dell’RNAi per regolare l’espressione genica, in particolare in
una maniera tessuto-specifica o temporalmente specifica. I ricercatori hanno compreso rapidamente la potenzialità dell’RNAi negli esperimenti tesi a determinare la
funzione dei geni, dal momento che l’introduzione del
dsRNA in una cellula può spegnere l’espressione quasi
di qualunque gene. L’RNAi è diventata una tecnica così
importante che sarà discussa in maggiore dettaglio nell’esercitazione successiva.
Dopo che la classe ha completato l’Esercitazione 8 Dai
geni alle proteine e compreso come l’informazione genetica nel DNA si manifesti nella struttura delle proteine,
introducete i concetti di base della regolazione genica.
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Alcuni di questi concetti di regolazione genica possono
essere illustrati tramite giochi di ruolo come estensione
dell’Esercitazione 8 Dai geni alle pr oteine o semplicemente tramite discussioni in classe.
Idee per le esercitazioni
di regolazione genica
•
•
•
•
•
Assegnate i ruoli ed interpretate il repressore lac che
impedisce la trascrizione dei geni lac quando il lattosio non è presente e permette la trascrizione quando il lattosio è presente (riferitevi al Capitolo 4). Questo processo potrebbe essere illustrato semplicemente con i codoni del DNA, il promotore, l’RNA polimerasi, una proteina repressore, ed il lattosio; non c’è
nessuna necessità di produrre anche l’RNA e di arrivare alla traduzione.
Assegnate i ruoli e interpretate il repressore trp che
controlla l’espressione dei geni della sintesi del triptofano (riferitevi al Capitolo 4).
Fate escogitare agli studenti modi nei quali una cellula potrebbe regolare la sintesi di una particolare
proteina. Potreste utilizzare le loro idee come punto
di partenza per introdurre alcuni dei meccanismi di
regolazione genica menzionati sopra.
Fate interpretare agli studenti la repressione della traduzione. A questo scopo, potreste partire con l’mRNA,
l’area del ribosoma (con dentro un “riconoscitore”),
e qualcuno assegnato alla proteina che reprime la traduzione.
Illustrate il potere di regolazione della modificazione
del riconoscimento del promotore rappresentando
una serie di geni come linee sulla lavagna. Indicate i
promotori alle estremità sinistra delle linee, con PN
per promotori normali e PS per promotori della sporulazione. Mostrate agli studenti che quando l’RNA
polimerasi viene modificata per riconoscere solo i PS,
tutti i geni PN vengono spenti.
A. Struttura e funzione del DNA
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Antisenso ed interferenza
da RNA
Gli oligonucleotidi antisenso sono segmenti di DNA o
RNA perfettamente complementari nella sequenza di basi e antiparalleli per orientamento ad un gene di interesse. Nella regolazione genica antisenso, un anti-RNA si
appaia all’estremità 5! di una molecola di mRNA, impedendo al ribosoma di riconoscere il sito di inizio della
traduzione e quindi bloccando la traduzione dell’mRNA.
La regolazione antisenso è stata scoperta negli anni ’80
durante studi su plasmidi, batteriofagi e trasposoni.
Un esempio di regolazione antisenso naturale può essere osservato nella replicazione dei plasmidi batterici della famiglia R1. L’inizio della replicazione del DNA, dal sito di origine R1, richiede la proteina di replicazione
RepA codificata dal plasmide. La sua espressione è controllata da un RNA antisenso che è trascritto dal filamento
opposto a quello che codifica l’mRNA del RepA. L’antimRNA del RepA si lega all’RNA del RepA e ne impedisce la traduzione, bloccando la replicazione del plasmide. Quando la concentrazione dell’anti-RNA nella cellula è alta viene sintetizzato poco RepA. In queste condizioni la replicazione del plasmide è limitata, e ci saranno poche copie del plasmide R1 nella cellula. Quando
la concentrazione dell’anti-RNA è bassa viene tradotta
una quantità maggiore di proteina RepA. In questo caso
la replicazione del plasmide sarà maggiore e nella cellula saranno presenti molte copie.
La regolazione genica antisenso ha prodotto una grande
eccitazione tra i biotecnologi per il suo potenziale di controllare artificialmente l’espressione genica. In teoria, l’espressione di qualunque gene potrebbe essere soppressa
mediante l’introduzione di una sufficiente quantità di un
appropriato oligonucleotide antisenso, permettendo la repressione o la modulazione di un qualunque processo guidato dall’espressione di geni specifici. Il primo farmaco
antisenso sul mercato, il Vitravene, è stato approvato per
l’uso nel 1999. Il suo bersaglio è la proteina replicasi del
citomegalovirus (CMV), che può causare gravi malattie in
pazienti immunosoppressi. Farmaci antisenso per il cancro indirizzati contro fattori di crescita ed oncogeni sono
al momento in vari stadi di trial clinici, oltre a farmaci antisenso contro malattie virali, quali l’epatite C, ed il papillomavirus umano, la malattia di Lou Gehrig (sclerosi laterale amiotrofica, o ASL), e il morbo di Crohn.
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Esercitazione avanzata
L’RNAi è stata scoperta casualmente da due ricercatori
che stavano tentando di usare RNA antisenso per bloccare l’espressione dei geni coinvolti nella crescita e nello sviluppo del nematode Caenorhabditis elegans. Essi
stavano cercando di comprendere i ruoli specifici svolti da diversi prodotti genici nello sviluppo del verme. Il
loro piano sperimentale prevedeva l’introduzione di
RNA antisenso nel verme, essenzialmente immergendo
il verme in una soluzione di anti-RNA. Il loro esperimento funzionava e l’espressione del gene bersaglio veniva bloccata. Come controllo, immersero invece alcuni vermi nella versione “senso” dell’RNA. Con loro sorpresa, l’espressione genica veniva bloccata anche in
questi vermi. Un attento esame dei metodi e dei reagenti rivelò che l’agente responsabile non era né l’RNA
senso né quello antisenso, ma piuttosto una versione a
doppio filamento dell’RNA che era presente come contaminante minore nelle loro preparazioni. Essi trovarono che il dsRNA promuoveva il “silenziamento” dell’espressione del gene appaiato, fenomeno ora conosciuto come RNAi. I loro esperimenti iniziali sono stati pubblicati nel 1998.
Nei due o tre anni successivi, si è compreso il meccanismo con cui funziona l’RNAi, illustrato nella figura
dell’esercitazione. Il dsRNA viene tagliato in brevi (da
21 a 23 coppie di basi) frammenti da una nucleasi chiamata Dicer. Queste piccole molecole di RNA, chiamate
siRNA, per small inter fering RNA, vengono legate da un
complesso proteico chiamato RISC che degrada un filamento del dsRNA, lasciando un RNA a singolo filamento legato al complesso. Questo RNA a singolo filamento si appaia con la sua sequenza complementare
ad una molecola di mRNA, innescando il taglio dell’mRNA.
I ricercatori hanno riconosciuto rapidamente il potenziale
dell’RNAi nello studio della funzione genica, tanto quanto nello sviluppo di farmaci. L’RNAi permette ai ricercatori di spegnere l’espressione praticamente di qualunque
gene noto tramite l’introduzione di un siRNA appropriato. Questo può essere fatto iniettando il siRNA direttamente od introducendo una molecola di DNA clonata
contenente un promotore ed un’appropriata sequenza di
basi per la produzione del siRNA.
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8 Espressione dell’informazione genetica
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Nel 1993 in C. elegans è stata scoperta una molecola di
RNA che era complementare alla regione non codificante al 3! (oltre il codone di stop) di un mRNA specifico.
Gli esperimenti hanno dimostrato che, durante lo sviluppo del verme, questo piccolo RNA si legava all’mRNA complementare, bloccando la sua traduzione ed innescando la transizione del verme verso lo stadio successivo di sviluppo dalla larva all’adulto. Le implicazioni di questa scoperta non sono state comprese per alcuni anni. Dal momento della scoperta della RNAi, è diventato evidente che piccoli RNA, ora chiamati microRNA, o miRNA, sono importanti sia nel normale sviluppo dell’organismo che nello sviluppo anomalo, come nel
caso del cancro. I miRNA sono trascritti come brevi molecole autocomplementari che si ripiegano su se stesse
a formare una struttura a stelo-ansa che ricorda una forcina (confrontatela con un braccio dell’immagine a trifoglio del tRNA nella Figura 4.11). L’RNA ripiegato viene
processato nella via Dicer ed inibisce l’espressione genica attraverso lo stesso meccanismo dei siRNA.
Per ironia della sorte i ricercatori sapevano da anni che
le preparazioni di acidi nucleici contenevano una grande quantità di piccole molecole di RNA. Non sapevano
che questi piccoli RNA potevano avere ruoli importanti
nella regolazione genica e ritenevano che fossero spazzatura. Ora i piccoli RNA sono un argomento di grande
interesse e di intensa ricerca.
Il quadro che sta emergendo gradualmente è che i miRNA
aiutano a regolare l’espressione dei geni in un modo tempo- o tessuto-specifico e quindi sembrano svolgere ruoli chiave nel differenziamento e nello sviluppo. Centinaia
di miRNA sono stati scoperti in cellule animali, comprese le cellule umane. Un dato miRNA è espresso tipicamente solo in un tessuto specifico o in un gruppo di tessuti e/o in un dato momento dello sviluppo. L’espressione del miRNA riduce l’espressione dei geni il cui
mRNA contiene sequenze nucleotidiche complementari.
Le analisi globali delle sequenze di mRNA suggeriscono
che gli mRNA codificanti le proteine che sono richieste
da tutte le cellule ed in tutti i momenti (perciò chiamati
“geni housekeeping”) non contengano sequenze complementari a nessuno dei miRNA noti e perciò non siano da loro regolati. Gli mRNA delle proteine che sono
espresse in maniera tessuto- o tempo- specifica contengono sequenze omologhe ai miRNA e sembrano essere
i bersagli di questo tipo di regolazione.
Le potenziali applicazioni terapeutiche della tecnologia
antisenso o dell’RNAi fanno presagire grandi progressi
nel trattamento di molte delle malattie più temute. Il cancro e le infezioni virali sono tra quelle malattie che sono una conseguenza dell’espressione inappropriata dei
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geni dell’organismo o dell’espressione di geni estranei
all’interno delle nostre cellule. L’odierna chemioterapia
per il cancro e le infezioni virali, fra le quali l’AIDS, interferisce con gli enzimi necessari alla crescita cellulare
e colpisce sia le cellule malate che quelle sane. I pazienti
sottoposti a questi trattamenti frequentemente si ammalano gravemente per gli “effetti collaterali”. Al contrario,
il trattamento di queste malattie attraverso il blocco specifico o la riduzione dell’espressione dei geni che causano la malattia rappresenta invece una terapia ideale.
Per sviluppare un farmaco antisenso o RNAi o un regolatore genico, è essenziale una precisa comprensione del
sistema genetico che deve essere regolato. Per le terapie
contro le malattie virali si devono conoscere le funzioni
dei geni virali nell’infezione. Nel trattamento di un cancro specifico deve essere chiara la genetica di quel particolare cancro. Gran parte della ricerca di biologia molecolare nel corso degli ultimi dieci anni o più ha cercato di trovare risposta a queste domande genetiche e di
tipo meccanicistico. Le tecnologie antisenso e di RNAi
offrono ora la prospettiva di risultati concreti in una molteplicità di applicazioni.
Risposte alle domande per gli studenti
Nota: non esistono risposte “corrette” a queste domande. Le domande sono formulate in modo che gli studenti
ragionino sul modo in cui funziona la regolazione antisenso, sull’enorme potenziale del metodo, sulle sue insite limitazioni, sul genere di cose che i ricercatori dovrebbero considerare nello sviluppo di una particolare
strategia di regolazione genica antisenso.
1. Qui trovate alcuni esempi delle cose che i ricercatori
dell’Isis avrebbero dovuto sapere e sottoporre a test.
I ricercatori dovevano sapere quali geni avesse il CMV
e che lo spegnimento di uno di questi geni avrebbe
bloccato la replicazione virale. Dovevano conoscere
le sequenze di mRNA dei loro potenziali geni bersaglio. Dovevano produrre degli oligonucleotidi sintetici e vedere se potevano bloccare la replicazione virale in un sistema modello, quale una coltura cellulare.
Dovevano assicurarsi che l’oligonucleotide potesse
bloccare la replicazione del CMV in un modello animale senza far ammalare l’animale. Dovevano assicurarsi che il farmaco fosse sicuro per gli esseri umani
e che fosse efficace contro l’infezione (questi passaggi sono richiesti per legge per l’approvazione della
FDA, Food and Drug Administration).
2. Le tecnologie antisenso e dell’RNAi riducono l’espressione genica. Esse non sarebbero probabilmente efficaci contro malattie che sono causate dalla mancanza di un prodotto genico (o dalla mancanza di un
corretto prodotto genico), invece che dall’espressione inappropriata di un gene. Un esempio di una tale
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malattia è la fibrosi cistica, causata da due copie difettose di un gene per una proteina della membrana
cellulare. Spegnere l’espressione di questi geni difettosi lascerebbe il paziente del tutto senza proteine di
membrana, cosa che sarebbe peggiore di una proteina difettosa. Le malattie genetiche causate da mutazioni dominanti (per esempio la malattia di Huntington) possono essere trattabili con farmaci antisenso.
In queste malattie il paziente ha in genere una copia
buona del gene ed una copia mutante che domina e
causa la malattia. Se si potesse progettare una molecola antisenso che potesse bloccare solamente l’espressione della forma mutante del gene, avremmo
un’eccellente terapia. Potreste voler discutere di questa possibilità con la vostra classe. Chiedete agli studenti quali informazioni dovrebbero essere disponibili per progettare una tale molecola antisenso (esempi: deve essere noto il gene della malattia, questo ed
il gene normale devono essere sequenziati e le differenze devono essere comprese, e deve essere determinato se una molecola antisenso è efficace nel bloccare solamente la forma mutante).
3. L’idea è quella di far pensare gli studenti a quanto si
debba sapere di un sistema al fine di applicare la tecnologia antisenso o di RNAi e di investigare un sistema particolare con queste tecnologie in mente. Essi
dovranno ricercare informazioni sul virus dell’immunodeficienza umana (HIV) e sui suoi geni, e imparare i ruoli che le proteine svolgono in un’infezione da
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HIV. Dovranno quindi selezionare un bersaglio per la
terapia antisenso e giustificarlo. È più importante che
gli studenti ragionino sul ciclo vitale dell’HIV e su quale sarebbe un posto logico per bloccarlo piuttosto che
diano una risposta specifica qualunque. Il Capitolo 18,
Sequenziamento del DNA, contiene una lettura su alcuni farmaci anti-HIV. Questa informazione è semplicemente per il vostro interesse; se gli studenti non
hanno scelto queste proteine come bersaglio, non significa che le loro risposte siano sbagliate.
Letture scelte
Antebi, A. 2005. The tick-tock of aging? Science
310:1911-1912.
Gibbs, W. 2003. The unseen genome: gems among the junk.
Scientific American 289: 26-33. [Tr ad. it.: “Il genoma
invisibile: perle nella spazzatura”, Le Scienze, Milano 2004.]
Hammond, S. M., et al. 2001. Post-transcriptional gene
silencing by double-stranded RNA. Nature Reviews
Genetics 2:110-119.
Lau, N., e D. Bartel. 2003. Censors of the genome. Scientific
American 289:34-41. [Tr ad. it.: “I censori del genoma”, Le
Scienze, Milano 2003.]
Stix, G. 2004. Hitting the genetic off switch. Scientific
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Zamore, D. Z. 2002. Ancient pathways programmed by small
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Modelli delle dimensioni
dei genomi
Descrizione dell’esercitazione
a p. 187
Questa esercitazione utilizza modelli per mostrare le dimensioni relative della cellula di Escherichia coli, del
cromosoma di E. coli, di un plasmide tipico e di un gene. I modelli dimostrano graficamente quanto il cromosoma di E. coli sia più lungo della cellula. I calcoli presenti nelle domande per gli studenti utilizzano le analogie dei caratteri di un libro e dei chilometri di rotaie
ferroviarie per suggerire le dimensioni del genoma umano. Questa lezione si accompagna perfettamente con l’Esercitazione 10 Estrazione del DNA batterico. Può essere svolta come un’esercitazione o come una dimostrazione del docente.
Lezioni richieste: da 1/2 a 1
Background
Il DNA è conservato nella cellula sotto forma di cromosomi e plasmidi. La quantità di DNA richiesta per conservare le informazioni necessarie anche per produrre un
organismo semplice, come una cellula batterica, è molto grande. Una delle meraviglie della biologia è che le
cellule sono capaci di conservare le notevoli lunghezze
di DNA necessarie per codificare la loro informazione
ereditaria e di accedervi.
Il genoma del batterio E. coli è stato sequenziato completamente. È costituito da 4 629 221 coppie di basi (bp)
e contiene 4377 geni. Di questi geni, 4290 codificano proteine mentre il resto codifica RNA che non vengono tradotti (per esempio RNA ribosomali e RNA transfer). Il gene batterico “medio” che codifica una proteina è lungo
1200 bp. Un plasmide tipico è lungo circa 3000 bp e contiene solo pochi geni.
Quali sono le dimensioni fisiche di queste molecole di
DNA? Il cromosoma di E. coli è costituito da una grande
molecola di DNA circolare che, in forma estesa, sarebbe
lunga approssimativamente 10–3 m (1 mm). In confronto, la cellula di E. coli ha una lunghezza che va solamente
da 1 ! 10–6 a 2 ! 10–6 m. La molecola del DNA di E. coli è quindi 1000 volte più lunga della cellula! Persino un
plasmide di sole 3000 bp sarebbe lungo 10–6 m se fosse
lineare, approssimativamente la lunghezza della cellula.
Eppure, il cromosoma di E. coli costituisce solo dal 2 al
3% del peso della cellula ed occupa solo il 10% del suo
volume.
Il DNA occupa una frazione così piccola del volume della cellula (considerando la sua enorme lunghezza) in
quanto è una molecola estremamente sottile. È capace
di elevati gradi di ripiegamento ed avvolgimento, una caratteristica essenziale per il compattamento nella cellula.
Sebbene il grado di ripiegamento richiesto per adattare
il DNA di E. coli al batterio sia impressionante, il ripiegamento necessario per impacchettare il DNA nella cellula umana è ancora più notevole.
La cellula umana ha un diametro approssimativo di
2 ! 10–5 m, e il genoma umano consiste di 3,3 miliardi
di bp. Se il DNA di una singola cellula umana venisse esteso, sarebbe lungo circa 2 metri, 100 000 volte più lungo
della cellula! Eppure non solo tutto questo DNA si adatta
nella cellula, ma è anche accessibile agli enzimi cellulari
per il trasferimento e la replicazione dell’informazione.
Questa esercitazione utilizza modelli 10 000 volte maggiori rispetto alle dimensioni reali (! 10 000). È utile notare che un ingrandimento di 10 000 equivale a gonfiare una formica fino alle dimensioni di un TIR completo
di rimorchio. (È divertente chiedere agli studenti di immaginare quanto sarebbe grande una formica ingrandita 10 000 volte.) Un modello adatto per una cellula di E.
coli 10 000! è una capsula di gelatina di 2 cm (20 mm)
(che si può acquistare in farmacia o in erboristeria). La
capsula è un buon modello per molte ragioni; è a forma
di bacchetta, come E. coli, ed ha una parete esterna analoga alla membrana esterna del batterio. Se svolgete questa esercitazione insieme all’estrazione del DNA, potete
usare la capsula per illustrare il fatto che la membrana
cellulare deve essere dissolta per rilasciare il contenuto
della cellula, compreso il DNA.
I modelli del DNA possono essere costituiti da un filo,
un filato di lana o uno spago di lunghezza appropriata.
Il filo è il più adatto poiché è il più sottile, ma il filato di
lana o lo spago sono più visibili se fate una dimostrazione. Il cromosoma di E. coli 10 000! è rappresentato
da un filo di 10 m di lunghezza. Usate il filo più sottile
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9 Modelli delle dimensioni dei genomi
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che riuscite a trovare, e ricordate agli studenti che rappresenta una doppia elica. La dimensione di un plasmide 10 000! è rappresentata da 10 mm di filo, filo di lana o spago. Un singolo gene 10 000! è lungo solo 4 mm,
un pelo della lana se state usando del filato.
Obiettivi
4 . Incollate il pezzo di 10 mm sulla seconda scheda
7 ! 12 ed etichettatela “lunghezza di un tipico plasmide batterico”. Se utilizzate filo o spago, incollatela a cerchio per simulare il plasmide circolare. Se volete, potete fare un modello a doppio filamento di un
plasmide.
5. Mettete un pezzo di filo di 10 m e una coppia di schede in ogni busta con le capsule di gelatina.
Alla fine di questa esercitazione lo studente dovrebbe essere capace di:
1 . Descrivere le dimensioni relative della cellula di E.
coli, del cromosoma, dei geni, e dei plasmidi.
2. Spiegare che i filamenti del DNA sono estremamente sottili e devono essere avvolti molto strettamente;
l’immensa lunghezza del DNA si adatta al volume relativamente piccolo della cellula.
3. Elencare alcune differenze tra i genomi di E. coli e
dell’uomo.
4. (Opzionale) Usare la notazione scientifica per fare i
calcoli che riguardano le dimensioni del DNA.
Materiali
•
•
•
•
Pennarello
Forbici
Colla
Metro (per misurare il filo)
Per ogni gruppo di laboratorio di quattro studenti, dovete procurarvi una busta da lettera e i seguenti oggetti.
•
•
•
•
Una capsula di gelatina di 2 cm (N. 0; compratela in
farmacia o in erboristeria), 10 m di filo bianco; 10 m
di filo colorato.
Due filamenti di 20 mm di filo, filato di lana, o spago bianco e colorato
Un pezzo da 4 mm di filo, filato di lana, o spago colorato
Due schede 7 ! 12 cm con del filato incollato sopra
come descritto sotto
Preparazione
1 . Mettete una capsula di gelatina in ogni busta.
2. Utilizzate il metro e le forbici per tagliare per ogni
gruppo di studenti:
• Un pezzo di filo di 10 m
• Un pezzo di filo, filato o spago colorato di 4 mm
• Un pezzo di filo, filato o spago colorato di 10 mm
3. Incollate il pezzo di filo, filato o spago colorato di 4
mm sulla scheda 7 ! 12 ed etichettatela “lunghezza
media di un singolo gene batterico”.
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Suggerimenti
1 . Se il tempo a disposizione lo permette, fate preparare ai vostri studenti le schede del “gene” e del “plasmide” e misurate la lunghezza di 10 m di filo.
2. Le domande per lo studente che comportano l’uso
della notazione scientifica dovrebbero essere assegnate tenendo conto delle capacità matematiche degli studenti. Esse possono essere risolte come classe,
servendo da ripasso della notazione scientifica.
Procedimento
1 . Ripassate o presentate tutto il materiale di background.
2. Per un’esercitazione di classe, dividete gli studenti in
gruppi di quattro e fate loro seguire il procedimento
riportato sul foglio dell’esercitazione. (Nel passaggio
7, il modo migliore di adattare il filo in una capsula è
quello di ripiegare a metà il filo diverse volte finché
non costituirà uno “stoppino”. Inserite un’estremità dello stoppino nella sezione più lunga della capsula e
spingete il resto con un movimento di torsione.)
3. Gli studenti rispondono alle domande in classe o a
casa.
Procedimento alternativo
Questa esercitazione funziona bene come dimostrazione associata all’esercitazione successiva, Estrazione del
DNA batterico. Un buon momento per farlo è durante
l’incubazione a 65 °C. La preparazione di DNA non subirà danni, anche se incuberete le cellule più a lungo di
15 minuti.
Risposte alle domande per gli studenti
Ogni filo potrebbe rappresentare un filamento di una
doppia elica di DNA.
2. Se ogni gene è lungo 4 mm, ci dovrebbero essere 250
geni in un metro, o 2500 in 10 m. Parte del DNA di
E. coli è non codificante; si stima che il batterio abbia circa 2000 geni.
1.
A. Struttura e funzione del DNA
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3. Il DNA reale di E. coli occupa solo il 10% del volu-
13. Il numero varierà, secondo il libro di testo. In un li-
me della cellula. Il filo occupa una porzione più grande del volume della capsula; perciò il filo è troppo
spesso per un’accurata rappresentazione del DNA.
10 m per il genoma di E. coli.
10 000 m per il genoma umano
(3,0 ! 106) ! (3,4 ! 10–10) " 10,2 ! 10–4 m " 1,02
! 10–3 m
(1,2 ! 103) ! (3,4 ! 10–10) " 4,08 ! 10–7 m
(3,0 ! 103) ! (3,4 ! 10–10) " 10,2 ! 10–7 m " 1,02
! 10–6 m
(1,02 ! 10–3) ! (1,0 ! 104) " 10,2 ! 101 m " 10,2 m
(4,08 ! 10–7) ! (1,0 ! 104) " 4,08 ! 10–3 m " 4 mm
(1,02 ! 10–6) ! (1,0 ! 104) " 1,02 ! 10–2 m " 10,2 mm
(3,0 ! 109 traversine ferroviarie) ! (0,6 m per traversina ferroviaria) " 1,8 ! 109 m
1,8 ! 109 m " 1 800 000 km.
1 800 000 km (40 000 km/circonferenza) " 47,3 giri
intorno alla Terra.
bro con 100 caratteri per riga (una stima alta), 50 righe per pagina, e 600 pagine, ci saranno 3 ! 106 caratteri. Si dovrebbero prendere 1000 di questi libri per
contenere abbastanza caratteri (3 ! 109) da rappresentare il genoma umano.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Nota: Occasionalmente appaiono discrepanze nelle discussioni sulle dimensioni del genoma umano rispetto
alla quantità di DNA nella cellula umana, che sono dovute al fatto che le cellule umane contengono due copie
di ogni cromosoma. Poiché 3,3 ! 109 bp è la quantità di
DNA in una copia di ogni cromosoma, se voi sequenziate tutte queste basi, avete sequenziato il genoma umano. Ogni cellula contiene una seconda copia del genoma nei cromosomi omologhi. Perciò, il contenuto di
DNA di una cellula umana è 2 ! (3,3 ! 109 bp), e dovrebbe essere 2 ! (3,3 ! 109) ! (3,34 ! 10–10 m) "
22,04 ! 10–1 m, o 2,2 m in lunghezza.
33
A. Struttura e funzione del DNA
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Estrazione del DNA
Descrizione dell’esercitazione
a p. 189
In questa esercitazione, gli studenti possono osservare
una massa di fibre filiformi di DNA precipitare dalle cellule batteriche o, in alternativa, da lievito e tessuti vegetali o animali. L’estrazione del DNA batterico è molto facile da effettuare. Potete far crescere i batteri e utilizzare materiali da drogheria, o potete ordinare cellule già
cresciute e soluzioni da ditte di forniture scientifiche. Il
procedimento riportato qui è per cellule cresciute in casa; i materiali forniti commercialmente arrivano con le
proprie istruzioni. Vengono forniti anche ulteriori metodi per l’estrazione del DNA da lievito e tessuto animale
o vegetali.
la digestione enzimatica del materiale della parete cellulare o la distruzione fisica tramite mezzi come il mescolamento o la macinazione.
Il trattamento con il detergente fornisce un ulteriore vantaggio nella preparazione del DNA: la denaturazione delle proteine. Quando una proteina viene denaturata, la
catena amminoacidica si apre e la sua struttura tridimensionale viene alterata o persa. La denaturazione blocca l’attività enzimatica, il che è importante, poiché tutte
le cellule contengono enzimi chiamati deossiribonucleasi (DNasi) che digeriscono il DNA. Se non sono denaturate dopo la lisi cellulare, le DNasi di una cellula digeriranno il DNA cellulare in piccoli frammenti. Anche il calore denatura la maggior parte delle proteine.
Lezioni richieste: 1
Background
La preparazione del DNA da qualunque tipo di cellula
comporta gli stessi passaggi generali: (1) rottura della cellula (e della membrana nucleare, se possibile), (2) rimozione delle proteine e degli altri detriti cellulari dagli acidi nucleici e (3) purificazione finale. Esistono molti modi diversi per eseguire ognuno di questi passaggi, e il
metodo scelto generalmente dipende da quanto puro
debba essere il campione finale di DNA e dalla convenienza relativa delle opzioni disponibili.
Se una cellula è racchiusa da una sola membrana (come
Escherichia coli o una cellula animale), il contenuto della cellula può essere rilasciato dissolvendo la membrana
con detergenti. Le membrane della cellula sono costituite da proteine e grassi. Proprio come i detergenti sciolgono i grassi in una padella per friggere, una piccola
quantità di detergente dissolve le membrane cellulari. (Il
processo di rottura di una cellula è chiamato lisi.) Appena la membrana cellulare si dissolve, il contenuto cellulare fuoriesce, formando una miscela di acido nucleico, membrane dissolte, proteine cellulari ed altri contenuti cellulari a cui ci si riferisce come lisato cellulare. Ulteriori trattamenti sono necessari per le cellule con pareti, quali le cellule vegetali o di lievito, e quelle dei batteri Gram positivi. Questi trattamenti possono includere
Dopo la lisi cellulare, il passaggio successivo nella preparazione del DNA comporta la rimozione delle proteine dall’acido nucleico. Il trattamento con enzimi che digeriscono le proteine (proteinasi) e/o estrazioni con il
solvente organico fenolo sono due metodi comuni di rimozione delle proteine. Le proteine sono solubili in fenolo, ma non lo è il DNA. Estraendo una mistura acquosa
DNA-proteine (quale il lisato cellulare) con fenolo si separano le proteine nel fenolo e si lascia il DNA nell’acqua. Dopo rimozione delle proteine, il DNA è solitamente soggetto a ulteriore purificazione. I metodi di purificazione finale includono precipitazione, dialisi e centrifugazione ad alta velocità. Il livello di purificazione richiesto dipende dagli scopi per cui verrà utilizzato il
DNA.
Un approccio differente alla purificazione del DNA prevede l’uso di membrane o matrici alle quali il DNA si
lega in condizioni specifiche. In questo caso, le cellule
sono lisate in una soluzione che facilita il legame selettivo del DNA alla matrice. Il lisato viene applicato alla matrice, e il DNA si lega ad essa. I contaminanti sono rimossi dal DNA lavando con tamponi il DNA legato alla matrice. Infine, il DNA viene eluito dalla matrice con un tampone studiato per superare le forze attrattive tra il DNA e la matrice. Questi materiali che legano il DNA sono spesso preparati in piccole colonne
all’interno di provette da centrifuga. Le tappe di legame, lavaggio ed eluizione vengono effettuate centrifugando le provette.
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10 Estrazione del DNA
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Nell’esercitazione qui descritta, non viene fatto nessun
tentativo di purificare il DNA, dal momento che si desidera solo di poterlo vedere. Gli studenti liseranno le cellule di E. coli con detergenti e stratificheranno una piccola quantità di alcol sopra al lisato cellulare. Si può usare sia etanolo che isopropanolo (alcol da frizione). Il
DNA è insolubile in qualunque alcol e formerà una massa (precipitato) bianca, disposta all’interfaccia tra gli strati dell’alcol e dell’acqua. Muovendo un bastoncino di vetro su e giù attraverso gli strati, gli studenti potranno raccogliere il DNA precipitato sul bastoncino. Questo DNA
è molto impuro; la massa contiene proteine cellulari ed
altri detriti, ma le fibre filiformi sono DNA. Questo metodo facile e divertente fa vedere coi propri occhi il DNA
agli studenti e ne mostra la natura fibrosa.
Questa procedura economica di laboratorio può servire
da supporto alle discussioni che riguardano gli enzimi,
la struttura cellulare, le membrane lipidiche, la denaturazione, la solubilità, l’interazione detergente-lipide, la
densità e la natura del genoma batterico.
Obiettivi
Al termine di questa esercitazione di laboratorio, gli studenti dovrebbero:
1 . Capire come estrarre una massa visibile di DNA.
2. Avere familiarità con certe proprietà fisiche e chimiche del DNA, quali la solubilità e l’alta massa molecolare.
Materiali
Attrezzature
•
•
Un termometro centigrado
Una piastra riscaldante e un grande recipiente
Materiali
•
•
•
•
•
•
•
Cellule di E. coli (voi e i vostri studenti potete farle
crescere. In alternativa, ditte di forniture scientifiche
vendono cellule disidratate per l’estrazione del DNA).
Brodo non inoculato come controllo degli studenti
del metodo di estrazione
Contagocce
Etanolo (al 95%) o alcol da frizione (isopropanolo)
Provette da coltura da 15 ml
Soluzione al 50% in acqua di detergente per piatti o
shampoo (senza balsamo), o sodio dodecil solfato
(SDS) al 10%
Bastoncini di vetro per rimescolare
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Per far crescere le cellule (vedi la Preparazione sotto),
avrete bisogno di:
•
•
•
•
•
Un mezzo, quale il brodo di soia triptico, il brodo di
Luria, o brodo nutriente
Coltura di E. coli
Ansa (e) per inoculazione
Una grande fiasca (se volete ottenere una grande coltura)
Incubatore (opzionale)
Nota: le ricette del mezzo sono sul sito e-cathedra, cartella In laboratorio, e i metodi per crescere E. coli si possono trovare nell’Appendice D.
Preparazione
Se fate crescere le vostre cellule dovete cominciare qualche giorno prima. Strisciate alcune piastre con E. coli. Fate utilizzare agli studenti tecniche sterili per inoculare 4
ml di brodo di soia triptico o brodo di Luria in una provetta da 15 ml. Inoltre, fate preparare loro un controllo
non inoculato di 4 ml di brodo (una provetta per gruppo di laboratorio). Lasciate crescere le cellule finché non
sono piuttosto dense (almeno tutta la notte). Procedete
con l’estrazione. Il metodo funziona molto bene con le
cellule che sono sospese in brodo.
In alternativa, inoculate voi stessi una grande coltura, lasciatela crescere, e fornite 4 ml di cellule agli studenti,
insieme con una seconda provetta contenente 4 ml di
brodo non inoculato.
Le cellule cresciute in casa possono essere tenute in frigorifero per un giorno prima dell’uso.
Per l’esercitazione
1 . Se state usando liquido per lavare i piatti o shampoo,
preparate una soluzione al 50% in acqua (approssimativamente 6 ml per gruppo di studenti). Il liquido
per lavare i piatti deve essere diluito, perché altrimenti è troppo viscoso per versarlo facilmente. Potete anche usare SDS al 10% (conosciuto anche come lauril solfato), un altro detergente, in acqua. Per
preparare SDS al 10%, sciogliete 10 g di SDS in 100
ml di soluzione.
2. Quando gli studenti sono pronti a estrarre il DNA,
avrete bisogno di un bagno di acqua calda dai 60 ai
70 °C. Potete usare una grande pentola da cucina, un
termometro e una piastra riscaldante. La sola reale necessità è quella di ottenere un volume d’acqua grande
abbastanza da impedire che la temperatura scenda sotto i 60 °C durante il processo di denaturazione.
A. Struttura e funzione del DNA
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Suggerimenti
1 . Spiegate il metodo appropriato per stratificare l’alcol
ed avvolgere il DNA mentre i campioni degli studenti
vengono incubati nel bagno di acqua bollente. La
stratificazione è più facile se inclinate la provetta e lasciate che l’alcol scenda lentamente.
2. Approfittate dei 15 minuti necessari per l’incubazione per ricordare agli studenti la lunghezza del DNA
di E. coli (vedi l’Esercitazione 9, Dimensioni del genoma umano e di E. coli) e per assicurarsi che capiscano che quello che vedranno è il DNA derivato da
milioni di cellule di E. coli agglutinato in una massa
fibrosa.
3. La precipitazione funziona meglio se l’alcol è freddo.
Conservatelo in un congelatore se possibile. (Il metodo funziona anche con alcol a temperatura ambiente.)
4. La domanda 2 fornisce un buon punto di partenza per
una discussione sul modo in cui la densità influenza
la stratificazione dei liquidi, se volete addentrarvi nella questione. Divertenti dimostrazioni con concentrazioni diverse di saccarosio (per esempio, allo 0%, al
20%, ed al 50%) colorato con diversi colori per alimenti
possono illustrare ulteriormente il punto.
Procedimento
1 . Ripassate o presentate qualunque materiale di background necessario. Questa esercitazione costituisce
una buona verifica dell’Esercitazione 9 Dimensioni
del genoma umano e di E. coli. Spiegate i passaggi
fondamentali dell’estrazione del DNA (lisi delle cellule, distruzione delle DNasi, e precipitazione).
2. Dite agli studenti quale metodo useranno. Se i materiali lo permettono, fate preparare ad ogni studente
il proprio DNA, seguendo le istruzioni. Spiegate la
tecnica di stratificazione/avvolgimento.
3. Rispondete alle domande.
Risposte alle domande per gli studenti
La struttura complementare a doppio filamento rende semplice la replicazione della molecola. Rende
semplice anche sintetizzare una copia di RNA di un
filamento usando il secondo filamento come stampo.
Se un filamento viene danneggiato, l’informazione
della sequenza è mantenuta sull’altro filamento. Il filamento non danneggiato può essere utilizzato come
stampo per riparare il filamento danneggiato.
2. L’alcol è meno denso dell’acqua, perciò può galleggiare sopra di essa. Se l’alcol fosse più denso del brodo o del lisato cellulare, precipiterebbe sul fondo della provetta.
1.
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I seguenti metodi sono stati condivisi con noi da esperti insegnanti di scuola superiore.
Estrazione di DNA
da tessuto vegetale
Materiali
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Una cipolla media o sei fragole
Frullatore
Detergente liquido diluito 50:50 con acqua
Due provette o altri contenitori, quali piccoli becker
Filtri conici (vanno bene sia un filtro da caffè che un
cerchio di carta da filtro da laboratorio ripiegato)
Becker (da 400 a 600 ml è una buona dimensione)
NaCl
Una bacchetta di vetro o un bastoncino di legno
Etanolo al 95% o isopropanolo al 70% freddi
Procedimento
Nota: è possibile aumentare la scala del procedimento.
Potete lavorare con più di 7 ml di succo di cipolla o di
fragole, o potete preparare per i vostri studenti diverse
quantità di succo di cipolla da precipitare.
1 . Sbucciate e tagliate a pezzi una cipolla di dimensioni medie, o scegliete sei fragole medie o grandi o l’equivalente volume di altre bacche.
2. Mettete la cipolla o le bacche tagliate in un frullatore con 60 ml di acqua.
3. Iniziando a bassa velocità, frullate la cipolla, incrementando la velocità per liquefare e rompere completamente il tessuto della pianta. Frullate finché non
rimangono più pezzi grossi. Versate il liquido in un
becker. Dal momento che le bacche sono molli, potete macinarle in un mortaio o anche ridurle in poltiglia in una busta di plastica chiusa invece di usare
il frullatore, ma devono essere completamente schiacciate così che non rimangano pezzi grossi.
4. Aggiungete un cucchiaino di cloruro di sodio (sale
da cucina) e mescolate per scioglierlo.
5. Versate 7 ml di succo in una provetta o in un altro
contenitore appropriato contenente 7 ml di detergente. Mescolate delicatamente, senza produrre
schiuma.
6. Mettete in un bagno riscaldato per 15 minuti. È importante che la temperatura sia tra i 60 ed i 70 °C.
7. Filtrate la miscela frullata attraverso il filtro in un becker e scartate i solidi. Versate il liquido in una provetta.
8. Stratificate un ugual volume di etanolo freddo sul filtrato. Estraete col bastoncino il DNA arrotondandolo
come descritto nella procedura per l’estrazione del
DNA batterico.
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10 Estrazione del DNA
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Estrazione di DNA di lievito
Procedimento per lo svolgimento
dell’esercitazione a piccoli gruppi
Il metodo di estrazione del DNA da bacche può essere
modificato per gruppi di studenti. Per gruppi da 10 a 12,
sciogliete 1 cucchiaio di sale in 60 ml di acqua. Date ad
ogni gruppo una fragola o un volume equivalente di altre bacche e 5 ml di acqua salata. Gli studenti dovrebbero ridurre completamente in poltiglia le bacche in un mortaio, in una busta di plastica sigillata, o in un altro contenitore. Una volta schiacciate le bacche aggiungete l’acqua
salata e mescolate finché il tessuto e l’acqua non sono
completamente mescolati e non rimangono grossi pezzi.
Aggiungete mescolando con cautela 5 ml di detergente diluito, evitando la formazione di schiuma. Incubate nell’acqua calda e quindi filtrate la miscela ed estraete il DNA
arrotolandolo come descritto sopra nei passaggi dal 6 all’8.
Estrazione del DNA da tessuto animale
Materiali
•
•
•
•
•
Testicoli congelati di cane o gatto, o tessuto di timo
Mortaio e pestello
SDS al 10% o soluzione detergente al 50%, come descritto sopra
Etanolo o isopropanolo freddi
Bacchetta di vetro per mescolare
Contattate un veterinario e chiedete a lui o lei di tenere
e congelare testicoli di gatto o cane derivati da operazioni di sterilizzazione. Anche un macellaio potrebbe fornirvi del tessuto di gonadi o timo. Dopo che avrete raccolto il tessuto dal veterinario o dal macellaio, tenetelo
in congelatore. Se non potete trovare una fonte appropriata di tessuto animale, gli insetti, dopo rimozione delle appendici e dell’esoscheletro, sono ottime fonti di
DNA animale.
Per estrarre il DNA, prendete un organo o un pezzo di organo dal congelatore e macinatelo nel mortaio. Aggiungete la soluzione detergente, mescolate, e trasferite l’intero contenuto del mortaio in una provetta. Incubate in un
bagno d’acqua a 65 °C per 15 minuti circa. Stratificate l’alcol freddo, ed estraete come per il DNA batterico.
Assicuratevi di chiedere agli studenti perché ci sia così
tanto DNA nel tessuto del testicolo.
Lo stesso metodo funziona anche con il tessuto del timo.
Timo di vitello, chiamato animella, è spesso disponibile
dal macellaio.
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Questo metodo per l’estrazione del DNA di lievito, descritto per intero in un articolo di Larry Wegmann (The
Science Teacher, Dicembre 1989) utilizza materiali che gli
studenti possono portarsi da casa. Il procedimento è semplice ed affidabile e può essere utilizzato con studenti dell’ultimo anno delle superiori o più giovani.
Materiali
•
•
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•
•
•
•
Lievito di birra in cubetti
Deodorante-detersivo per scarpe da ginnastica
Soluzione di papaina
Etanolo o isopropanolo (alcol da frizione)
Bacchette di vetro
Becker da 250 ml (o di dimensioni simili)
Piastra riscaldante o altri mezzi per scaldare l’acqua
Procedimento
1 . Scaldate 100 ml di acqua del rubinetto in un becker
portandolo a 50 a 60 °C.
2. Aggiungete mezzo cubetto di lievito e mescolate finché non è completamente disciolto.
3. Aggiungete 5 ml di detersivo per scarpe da ginnastica.
4. Mantenete la soluzione per 5 minuti fra 50 e 60 °C,
mescolando saltuariamente.
5. Sciogliete 3 g di soluzione di papaina (una proteinasi) nella soluzione. (Il tenderizer della carne contiene papaina.)
6. Mantenete la temperatura da 50 a 60 °C per 20 minuti.
A questo punto le soluzioni possono essere conservate
nel frigorifero per tutta la notte.
7. Lasciate che la soluzione raggiunga la temperatura
ambiente.
8. Inclinate il becker e aggiungete lentamente 100 ml di
etanolo o isopropanolo in modo da formare due fasi.
9. Lentamente inserite la bacchetta di vetro attraverso l’alcol nel lisato di lievito e agitate delicatamente le fasi
proprio a livello dell’interfaccia. Non mescolate le fasi. Si formerà un precipitato di DNA all’interfaccia.
1 0. Dopo averla mescolata per alcuni minuti, lasciate riposare la soluzione per diversi minuti.
Il DNA di lievito non si arrotolerà sulla bacchetta di vetro. Presumibilmente, nella preparazione c’è un’attività
nucleasica (o dei lieviti stessi o del tenderizer) che taglia
il DNA in frammenti troppo piccoli per arrotolarsi. Comunque, il metodo produce in maniera affidabile una
massa visibile di DNA.
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B. MANIPOLAZIONE ED ANALISI
DEL DNA
Negli ultimi quattro decenni, le nostre conoscenze della
struttura e della funzione del DNA, e dei processi biochimici che le cellule utilizzano per modificare la struttura e svolgere le funzioni, sono cresciute in maniera
esplosiva. Questa vasta e nuova conoscenza ha reso possibile manipolare ed analizzare il DNA fuori dall’ambiente cellulare. Per esempio, possiamo tagliare il DNA
in piccoli frammenti, separarli ed isolarli, unirli, copiare
il DNA, e determinare la sua sequenza di basi. Stiamo
usando la nostra capacità di manipolare i geni per ottenere conoscenze ancora maggiori del modo in cui si svolgono i processi di base della vita e per generare prodotti
utili per la vita quotidiana.
Le esercitazioni di questa sezione si occupano dei metodi di manipolazione ed analisi del DNA: digestione di
restrizione, legatura, elettroforesi su gel, analisi di ibridazione, sequenziamento del DNA e reazione a catena
della polimerasi. Molte di queste esercitazioni sono adatte per studenti principianti, ma possono anche essere utilizzate da studenti più esperti.
La prima esercitazione utilizza modelli di carta per illustrare la digestione di restrizione e l’elettroforesi su gel.
Quindi due esercitazioni in laboratorio fanno eseguire
agli studenti digestioni di restrizione ed elettroforesi su
gel di agarosio. Successivamente gli studenti simulano
una digestione di restrizione e una legatura per costruire un plasmide ricombinante di carta. Quindi dei
Fogli di lavoro impegnano gli studenti ad applicare
quello che hanno imparato riguardo alla digestione di
restrizione, alla legatura, e all’elettroforesi in problemi
pratici. Infine, le più sofisticate tecniche di analisi di
ibridazione, sequenziamento del DNA e reazione a catena della polimerasi vengono illustrate attraverso simulazioni su carta.
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11 Enzimi di restrizione
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Enzimi di restrizione
Descrizione dell’esercitazione
a p. 192
Nell’esercitazione di questo capitolo, gli studenti vengono introdotti agli enzimi di restrizione e simulano l’azione degli enzimi di restrizione con le forbici. Essi vengono introdotti anche alle mappe di restrizione e verrà
chiesto loro di fare semplici previsioni basate su una
mappa.
Una seconda esercitazione con modelli di carta, Plasmidi ricombinanti di carta (Capitolo 14) avvicina gli studenti al clonaggio di un gene in un plasmide e alla preparazione di un plasmide ricombinante a partire da due
diversi plasmidi. Plasmidi ricombinanti di carta tratta anche il processo di trasformazione e chiede agli studenti
di pensare al modo di selezionare diverse cellule trasformate. È molto efficace far seguire a queste esercitazioni il laboratorio di trasformazione e/o un laboratorio
di analisi di restrizione.
Lezioni richieste: da 1/2 a 1
Background
Gli enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione, o endonucleasi di restrizione,
sono proteine che riconoscono e legano specifiche sequenze di DNA e tagliano il DNA a livello del o vicino
al sito di riconoscimento. Una nucleasi è un qualunque
enzima che taglia i legami fosfodiestere dello scheletro
del DNA; un’endonucleasi taglia in un punto interno ad
una molecola di DNA. Al contrario, un’esonucleasi taglia
i legami fosfodiestere partendo da un’estremità libera e
lavorando verso l’interno.
Gli enzimi di restrizione sono stati scoperti originariamente per la loro capacità di frammentare DNA estraneo.
Gli enzimi di restrizione possono distinguere tra il DNA
normalmente presente nella cellula ed il DNA estraneo,
come il DNA infettante di un batteriofago. Essi difendono la cellula dall’invasione tagliando il DNA estraneo in
pezzi rendendolo così non funzionale. Gli enzimi di restrizione sembrano essere prodotti esclusivamente dai
procarioti.
Gli enzimi di restrizione comunemente usati in laboratorio generalmente riconoscono sequenze specifiche di
DNA di 4 o 6 coppie di basi. Questi siti di riconoscimento
sono palindromi, nel senso che le sequenze di basi dal
5! al 3! sui due filamenti sono le stesse. La maggior parte degli enzimi produce tagli nell’ossatura fosfodiestere
del DNA in posizioni specifiche all’interno del sito di riconoscimento, col risultato di un taglio nel DNA. Questi
siti di riconoscimento/taglio sono chiamati “siti di restrizione”. Sotto sono riportati alcuni esempi di enzimi di restrizione (con i nomi in una combinazione di lettere e
numeri romani) e le loro sequenze di riconoscimento,
con le frecce che indicano i siti di taglio.
EcoRI:
↓
↓
5 GAATTC 3 HindIII: 5 AAGCTT 3
3 CTTAAG 5
3 TTCGAA 5
↑
↑
↓
BamHI: 5 GGATCC 3 AluI:
3 CCTAGG 5
↑
SmaI:
↓
5 CCCGGG 3 HhaI:
3 GGGCCC 5
↑
↓
5 AGCT 3
3 TCGA 5
↑
↓
5 GCGC 3
3 CGCG 5
↑
Notate che i filamenti “superiore” e “inferiore” hanno la
stessa sequenza dal 5! al 3!; questa caratteristica definisce un DNA palindromo. Notate anche che alcuni degli
enzimi introducono due tagli sfalsati nel DNA, mentre altri tagliano ogni filamento nello stesso punto. Gli enzimi
come SmaI che tagliano entrambi i filamenti nello stesso punto producono estremità “nette”. Gli enzimi come
EcoRI lasciano due estremità identiche di DNA con sporgenze a singolo filamento:
5 G
3 CTTAA
AATTC 3
G5
In condizioni appropriate (concentrazione salina, pH e
temperatura), un dato enzima di restrizione taglierà un
tratto di DNA in una serie di frammenti. Il numero e le
dimensioni dei frammenti dipendono dal numero e dalle posizioni dei siti di restrizione per quell’enzima in un
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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dato DNA. Una specifica combinazione di 4 basi capiterà in maniera casuale solo una volta ogni alcune centinaia di basi, mentre una specifica sequenza di 6 basi si
ripeterà casualmente solo una volta ogni alcune migliaia
di basi. È possibile che una molecola di DNA non contenga nessun sito di restrizione per un dato enzima. Per
esempio, il DNA del batteriofago T7 (approssimativamente 40 000 bp) non contiene siti EcoRI. L’azione degli
enzimi di restrizione è discussa e spiegata con l’uso di
modelli nell’Esercitazione 11 Forbici che tagliano il DNA.
Riunione dei frammenti di restrizione
I frammenti di DNA generati dalla digestione di restrizione possono essere riuniti con l’enzima DNA ligasi, che
forma legami fosfodiestere fra le estremità 5! e 3! dei nucleotidi. Come ci si potrebbe attendere, qualunque DNA
ad estremità nette può essere legato a qualunque altro
DNA ad estremità nette, indipendentemente dalle sequenze delle due molecole. I frammenti di restrizione
con sporgenze a singolo filamento, come i prodotti di
EcoRI mostrati sopra, sono “una scelta migliore”. Per una
legatura efficiente, le regioni a singolo filamento devono essere capaci di appaiarsi ad una regione complementare a singolo filamento. L’idea della riunione dei
frammenti di restrizione e la necessità di complementarità nelle “code” a singolo filamento vengono introdotte
nell’Esercitazione 11 Forbici che tagliano il DNA.
Questa necessità di complementarità può sembrare limitante, ma un esame dei prodotti di digestione di EcoRI
mostrati sopra rivela che le due “estremità” EcoRI sono
perfettamente complementari. Due frammenti qualunque di DNA prodotti dalla digestione con EcoRI possono essere legati insieme, poiché le loro sporgenze a
singolo filamento sono complementari. Infatti, frammenti con sporgenze complementari a singolo filamento si legano molto più prontamente dei frammenti
ad estremità nette, probabilmente perché l’appaiamento tra le regioni a singolo filamento mantiene i frammenti insieme in una posizione appropriata per il legame. Poiché queste sporgenze a singolo filamento effettivamente facilitano l’unione dei segmenti del DNA
con sporgenze che combaciano, esse sono chiamate
spesso “estremità adesive”.
Gli enzimi di restrizione e la DNA ligasi hanno ruoli da
protagonisti nel clonaggio del DNA. Per un biologo molecolare, “clonare” un segmento di DNA significa aggiungere quel segmento ad un plasmide o ad un altro
vettore e quindi rimettere il plasmide (o l’altro vettore)
nella cellula ospite. Uno dei metodi più semplici di clonaggio consiste nel legare un frammento di restrizione
in un plasmide che è stato tagliato una volta con lo(gli)
stesso(i) enzima(i) di restrizione. Il frammento di restrizione diventa parte del plasmide quando la DNA ligasi
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forma legami fosfodiestere tra le due molecole di DNA
precedentemente separate. Questo tipo di clonaggio è
mostrato come modello negli esercizi 1 e 2 dell’Esercitazione 14 Plasmidi ricombinanti di carta. L’esercizio 3
presenta un modello della ricombinazione di due plasmidi per produrre un nuovo plasmide contenente i geni della resistenza sia per l’ampicillina che per la kanamicina.
Enzimi di restrizione e ingegneria genetica
Si legge spesso che la scoperta degli enzimi di restrizione ha reso possibile l’ingegneria genetica. In effetti gli
enzimi di restrizione hanno consentito per la prima volta di lavorare con piccoli frammenti definiti di DNA. I
cromosomi sono enormi molecole solitamente contenenti molti geni. Prima della scoperta degli enzimi di restrizione, un ricercatore avrebbe potuto stabilire che un
cromosoma conteneva un gene per un enzima richiesto
per fermentare il lattosio poiché sapeva che il batterio
poteva fermentare il lattosio e poteva purificare la proteina dalle cellule batteriche; il ricercatore avrebbe potuto anche utilizzare l’analisi genetica per dire quali altri
geni fossero vicini al “suo” gene. Ma non era possibile
né localizzare fisicamente il gene sul cromosoma né manipolarlo.
Il ricercatore poteva purificare il cromosoma dal batterio, ma poi avrebbe avuto un enorme segmento di DNA
contenente migliaia di geni. Il solo modo per spezzare
il cromosoma in frammenti più piccoli era quello di usare la forza fisica e di romperlo a caso. Quindi cosa si sarebbe ottenuto? Una provetta piena di frammenti casuali.
Potevano essere clonati? Non come tali. Se si introduce
un semplice frammento lineare di DNA (come quello ottenuto tramite frammentazione fisica) nella maggior parte dei batteri, esso verrà rapidamente degradato dalle
nucleasi cellulari. Il clonaggio solitamente richiede un
vettore per introdurre e mantenere il nuovo DNA. Il nostro ricercatore avrebbe potuto usare un vettore, come
un virus o un plasmide, per clonare i suoi frammenti di
DNA? No. Al fine di clonare del DNA in un vettore, è
necessario tagliare il DNA del vettore per inserire il nuovo pezzo. Avrebbe potuto semplicemente studiare i
frammenti casuali? No. Ogni singolo cromosoma di ogni
cellula batterica produrrebbe frammenti diversi, impedendo un’analisi sistematica. Perciò, per molti anni, la
manipolazione fisica del DNA è stata praticamente impossibile.
La scoperta degli enzimi di restrizione ha fornito ai ricercatori un modo per tagliare il DNA in segmenti definiti. Ogni volta che un dato segmento di DNA veniva tagliato con un enzima, venivano prodotti gli stessi frammenti. Questi segmenti definiti potevano essere riuniti in
nuovi modi. È stato coniato un nuovo termine per de-
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11 Enzimi di restrizione
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scrivere una molecola di DNA assemblata da diverse molecole di partenza: DNA ricombinante.
Questa scoperta apparentemente semplice che permetteva di tagliare in maniera riproducibile le molecole di
DNA ha aperto un intero nuovo mondo di possibilità
sperimentali. Ora i ricercatori possono studiare piccole
regioni specifiche dei cromosomi, clonare segmenti di
DNA in plasmidi e virus e manipolare in altro modo segmenti specifici di DNA. La scienza della biologia molecolare è letteralmente esplosa con le nuove informazioni disponibili, ed è diventata possibile l’ingegneria genetica, che è essenzialmente la manipolazione diretta di
tratti specifici di DNA.
Separazione dei frammenti di restrizione
Dopo la digestione di restrizione, i frammenti di DNA
vengono spesso separati tramite elettroforesi su gel. Le
informazioni di base riguardo all’elettroforesi, una simulazione cartacea del processo, e due esercitazioni pratiche seguono l’Esercitazione 11 Forbici che tagliano il
DNA.
dIII) che potreste tagliare come dimostrazione per evidenziare il fatto che le estremità sporgenti sono le stesse dal 5! al 3!.
!Risposte alle domande
I numeri si riferiscono ai numeri delle voci in Esercizi e
domande nell’esercitazione. Due delle voci, 1 e 5, contengono solo istruzioni e nessuna domanda e quindi non
sono riportate le risposte.
2. Il DNA dovrebbe essere tagliato in modo che 5! AATT
sporga da ogni estremità. Le estremità sono “adesive”.
3. Il DNA dovrebbe essere tagliato completamente tra
4.
6.
7.
Obiettivi
Alla fine di questa esercitazione gli studenti dovrebbero
essere capaci di:
1 . Descrivere un tipico sito di restrizione quale un palindromo di 4 o 6 bp.
2. Descrivere l’azione di un enzima di restrizione (riconosce e taglia il suo sito di restrizione).
3. Utilizzare una mappa di restrizione per prevedere
quanti frammenti verranno prodotti in una data digestione di restrizione.
Materiali
•
•
Copie dei tratti di sequenza di DNA (dal sito e-cathedra)
Forbici
Suggerimenti
Quando gli studenti utilizzeranno i modelli di carta, ricordate loro che il DNA reale è tridimensionale e non
ha lati “fronte” e “retro”, né è importante se le lettere
che rappresentano le basi sono capovolte. Se avete costruito il modello di carta in classe e lo avete ancora,
potrebbe essere un utile aiuto visivo. Se avete tempo,
potreste preparare un breve tratto del modello di carta
con un sito di restrizione incluso (quale EcoRI o Hin-
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8.
9.
la C e la G nel mezzo del sito SmaI. Le estremità sono nette.
Il DNA dovrebbe essere tagliato in modo che 5!
AGCT sporga da ogni estremità. Le estremità sono
“adesive.”
Le due code sono (EcoRI) 5! AATT 3! e (HindIII) 5!
AGCT 3!. Non sono complementari.
Ogni coda a singolo filamento ha la sequenza 5!
AATT 3!. Esse sono complementari. Ricordate che per
trovare la complementarità, dovete confrontare la sequenza dal 5! al 3! di un filamento con la sequenza
dal 3! al 5! dell’altro filamento.
Se i frammenti sono stati generati in una digestione
con EcoRI, tutti avranno le estensioni a singolo filamento 5! AATT 3! alle estremità. Le estremità di tutti
i frammenti saranno complementari.
Le risposte possono variare. È più facile per la DNA
ligasi formare un legame fosfodiestere tra i due frammenti EcoRI a causa delle code complementari a singolo filamento. L’appaiamento tra le basi nelle code
porta le ossature proprio nella giusta posizione per
la risigillatura. Con le code non complementari
(HindIII ed EcoRI), le coppie di basi non complementari mantengono le ossature degli oligonucleotidi lontane dalla posizione appropriata per la formazione del legame. È molto difficile ottenere che due
frammenti con “estremità adesive” non complementari si risigillino con la DNA ligasi. Due frammenti di
qualsiasi sequenza con estremità nette possono essere uniti dalla DNA ligasi. È più difficile ottenere che
si uniscano frammenti ad estremità nette che frammenti con estremità adesive complementari, ma molto più facile rispetto a frammenti non complementari ad estremità adesive (cosa che non succede quasi
mai). In un certo senso, “estremità adesive” è un termine inappropriato per le estremità a singolo filamento, poiché queste estremità sono adesive solamente rispetto alle estremità adesive complementari
mentre non lo sono affatto rispetto alle “estremità
adesive” non complementari.
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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10. Due frammenti lineari di 942 e 4599 (5541 – 942 =
13. Il frammento di 942 bp non contiene nessun sito
4599) bp.
11. Due frammenti lineari di 2003 (2035 – 32) e 3538
(5541 – 2003) bp.
12. Tre frammenti lineari di 2003, 2881 (4916 – 2035), e
657 [5541 – (2003 + 2881)] bp.
PvuII e non dovrebbe essere tagliato. Il frammento
di 4599 dovrebbe essere tagliato in due frammenti di
2305 (3247 – 942) e 2294 (4599 – 2305) bp, ottenendo tre frammenti complessivi.
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B. Manipolazione ed analisi del DNA
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Elettroforesi su gel
Descrizione dell’esercitazione
a p. 194
La corsa del DNA è una lettura ed un’esercitazione su carta che introduce l’elettroforesi. Gli studenti dovrebbero
aver familiarità con l’attività degli enzimi di restrizione
avendo eseguito l’Esercitazione 11. Forbici che tagliano
il DNA. Questa lezione fornisce agli studenti informazioni
di base sufficienti per continuare con esercitazioni (analisi di ibridazione, sequenziamento del DNA, fingerprinting del DNA, ecc.) che richiedono una certa conoscenza del processo ed è anche un’eccellente introduzione
se intendete effettuare un’elettroforesi nella vostra classe. I Fogli di lavoro Pr ova di analisi di r estrizione del
Capitolo 15 illustrano alcune applicazioni dell’elettroforesi in laboratorio. Gli studenti dovrebbero completare
questa esercitazione e i Plasmidi ricombinanti di carta
prima di usare quei fogli di lavoro.
Lezioni richieste: 1
Procedimento
Questa esercitazione si spiega da sé. Gli studenti possono leggere i fogli informativi e fare gli esercizi. Mostrate
loro più materiale reale (o fotografie) che potete: apparecchi da elettroforesi, alimentatori, un vecchio gel, o una
fotografia di un gel, mettendoli in relazione all’esercitazione e alla lettura.
Risultati dell’esercizio
Se possibile, controllate il lavoro degli studenti mentre
eseguono l’esercizio. Assicuratevi che allineino correttamente i frammenti tra le corsie e all’interno delle singole
corsie del gel (per esempio, che il frammento HindIII di
2500 coppie di basi [bp] sia allineato tra i frammenti
BamHI di 2000 bp e di 3000 bp e con il frammento EcoRI di 2500 bp). Usate le etichette di dimensione dei frammenti per aiutarvi.
Background
Leggete l’introduzione al Capitolo 13 per informazioni
generali di base.
Obiettivi
Alla fine di questa esercitazione gli studenti dovrebbero
essere capaci di:
1 . prevedere il numero e la disposizione delle bande in
un gel dopo digestione ed elettroforesi utilizzando
una semplice mappa di restrizione.
2. Spiegare perché l’elettroforesi causa separazione di
frammenti di DNA di dimensioni diverse.
EcoRI
Dimensioni del
frammento, bp
8000
6000
4000
3000
Materiali
•
L’Esercitazione La corsa del DNA, mappe di restrizione e schema del gel
2000
BamHI
HindIII
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B. Manipolazione ed analisi del DNA
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13
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Analisi di restrizione
Descrizione dell’esercitazione
Elettroforesi su gel di agarosio
a p. 198
In questa esercitazione gli studenti eseguono un’elettroforesi utilizzando dei campioni pretagliati di DNA lambda, o eseguono prima le digestioni di restrizione e poi
effettuano l’elettroforesi con i loro campioni. Le istruzioni
sono divise in due parti che coprono la digestione di restrizione del DNA lambda e l’elettroforesi su gel del DNA
lambda. Non è necessario effettuare la digestione di restrizione in classe, poiché è reperibile in commercio DNA
predigerito. Se scegliete di utilizzare campioni di DNA
pretagliati, saltate semplicemente la sezione delle istruzioni che riguarda la digestione di restrizione. Prima di
questo esercizio, gli studenti dovrebbero aver svolto le
Esercitazioni 11 Forbici che tagliano il DNA e 12 La corsa del DNA. Forbici che tagliano il DNA include l’uso di
mappe di restrizione per predire le dimensioni dei frammenti di DNA dopo la digestione. Mostrate loro la mappa di restrizione del batteriofago lambda in questo capitolo e fate loro predire le dimensioni dei frammenti che
vedranno nei loro gel.
Lezioni richieste: 1 per la digestione di restrizione e
2 per l’elettroforesi e l’analisi dei dati. Se avete 3 ore di
laboratorio o potete programmare a blocchi, potreste
riuscire a effettuare sia la digestione di restrizione che
l’elettroforesi in un’unica esercitazione. Se gli studenti
riescono a mettere i loro gel nella soluzione di colorazione prima della fine della lezione, potrete trasferire i
gel in acqua per la decolorazione e lasciarli in acqua o
tampone per tutta la notte.
Il metodo standard per separare i frammenti di DNA è
l’elettroforesi su gel di agarosio. L’agarosio è un polisaccaride, come l’agar e la pectina, che si scioglie in acqua
bollente e quindi gelifica appena si raffredda. Nell’elettroforesi, il DNA è inserito su una fetta di agarosio gelificato, quindi una corrente elettrica viene applicata attraverso il gel. Poiché il DNA è carico negativamente nel
sistema tampone usato per l’elettroforesi, migra lungo il
gel verso l’elettrodo positivo.
La velocità di migrazione del DNA lungo l’agarosio dipende dalla dimensione del frammento. Più piccolo è il
frammento di DNA, più velocemente può progredire attraverso l’agarosio. La velocità di migrazione dei frammenti lineari lungo l’agarosio è inversamente proporzionale al log10 dei loro pesi molecolari. Non sorprende che
la velocità di migrazione sia influenzata anche dalla forma della molecola di DNA; molecole circolari (come i
plasmidi) migrano diversamente da frammenti lineari dello stesso peso molecolare.
Un altro fattore importante nell’elettroforesi è la concentrazione di agarosio nel gel. Più alta è la concentrazione di agarosio, più lento sarà il movimento di tutti i
frammenti. Perciò è meglio usare concentrazioni di agarosio relativamente alte per separare e osservare piccoli
frammenti di DNA e basse concentrazioni se siete interessati a grandi frammenti. Quanto grandi, e quali concentrazioni? Esempi di concentrazioni di agarosio e delle dimensioni delle molecole di DNA che possono separare efficientemente sono forniti nella tabella.
Background
Ambito di separazione efficace di molecole lineari
di DNA (coppie di kilobasi) in un gel
Leggete l’introduzione a Forbici che tagliano il DNA per
informazioni sugli enzimi di restrizione.
% Agarosio
0,3
60-5
Questo materiale introduttivo fornisce informazioni sui
differenti metodi di colorazione del DNA e di registrazione dei dati. Il procedimento schematizzato nell’esercitazione è stato progettato per le colorazioni più sicure,
che sono anche le meno sensibili.
0,6
20-1
0,9
7-0,5
1,5
2,0a
4-0,2
3-0,1
a
Un gel di agarosio al 2% è un gel molto solido.
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13 Analisi di restrizione
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I gel di agarosio devono essere preparati e fatti correre
in un tampone. Il tampone è necessario perché durante
l’elettroforesi vengono generati ioni che altrimenti farebbero diventare l’anodo alcalino ed il catodo acido. Se
un gel venisse preparato senza questa precauzione e fatto correre in acqua, le bande del DNA avrebbero un brutto aspetto. Ricordate che un tampone è una miscela di
un acido debole con il suo sale, o di una base debole
con il suo sale. L’elettroforesi tipica è preparata con la
base debole Tris [tris(idrossimetil)amminometano], e il
sale del Tris è preparato aggiungendo acido borico. Viene anche aggiunto il chelante dei metalli EDTA (acido
etilendiamminotetraacetico). Il tampone che ne risulta è
chiamato TBE, per Tris-borato-EDTA. Altri tamponi usati talvolta per l’elettroforesi su gel di agarosio sono il TEA
(Tris-acetato-EDTA; preparato con acido acetico) e TPE
(Tris-fosfato-EDTA, preparato con acido fosforico).
Il voltaggio applicato al gel determina quanto velocemente
migra il DNA. Più alto è il voltaggio, più velocemente corre il gel, ma bisogna raggiungere un compromesso. I gel
fatti correre ad alti voltaggi non separano i frammenti di
DNA così efficientemente come fanno i gel fatti correre
lentamente. Per una buona separazione, i gel dovrebbero essere fatti correre a non più di 5 volt/cm di lunghezza del gel. Dovete decidere quale voltaggio volete che i
vostri studenti usino. Raccomandazioni specifiche vengono fatte nei procedimenti delle esercitazioni.
Colorazione dei gel
Per renderli visibili dopo l’elettroforesi, i frammenti di
DNA devono essere colorati. Il colorante del DNA preferito dai ricercatori è il bromuro di etidio, che è fluorescente sotto luce ultravioletta (UV) quando è legato al
DNA. È un colorante sensibile, ma ha diverse controindicazioni per un uso nelle scuole superiori. La prima controindicazione è che per renderlo visibile deve essere utilizzata una luce UV. La seconda è che il bromuro di etidio è un mutageno e richiede una manipolazione ed una
procedura di smaltimento molto attente.
Il blu di metilene è una colorante alternativo per i gel di
DNA raccomandato per l’uso in classe dalla National Association of Biology Teachers (americana). Non è sensibile come il bromuro di etidio e quindi si deve caricare
una quantità maggiore di DNA sui gel, ed è particolarmente inefficace per piccoli frammenti di DNA, quali
quelli con meno di 500 coppie di basi (bp). Tutti i protocolli di laboratorio in questo manuale sono stati preparati per la colorazione con blu di metilene.
Colorazione con blu di metilene
Immergete il gel in blu di metilene allo 0,025% per 2030 minuti. Usate un imbuto per recuperare quanto più
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colorante possibile nel contenitore. L’intero gel probabilmente apparirà blu scuro. Non preoccupatevi se nessuna banda di DNA sarà visibile in questo momento. Lavate il gel con acqua di rubinetto e quindi lasciatelo immerso per diversi minuti in parecchi cambi d’acqua fresca. Le bande di DNA diventeranno sempre più distinte
mentre il gel si decolora. Prima che il DNA sia chiaramente visibile occorreranno circa 2 ore. Per un migliore
risultato, continuate a decolorare il gel per tutta la notte
in poca acqua. Osservatelo sopra un transilluminatore o
su un proiettore da lucidi, ma non troppo a lungo, perché il colorante sbiadisce.
Colorazione con bromuro di etidio
Se volete usare il bromuro di etidio, limitate il suo uso a
una piccola area dell’aula. Indossate dei guanti quando
preparate il colorante, maneggiate gel colorati ed eliminate i rifiuti. Non lasciate che gli studenti utilizzino il colorante. Il più grande rischio è quello di inalare la polvere di bromuro di etidio quando la sciogliete. Il modo
più sicuro è quello di acquistare una soluzione madre
già pronta.
Per colorare con bromuro di etidio, diluite la soluzione
madre fino a 1 µg/ml. Immergete il gel in questa soluzione per 5-10 minuti. Utilizzate un imbuto per recuperare quanto più colorante possibile nel contenitore di
conservazione (idealmente una bottiglia di vetro scura).
Se volete, immergete il gel colorato in acqua per 5 minuti o più per schiarire lo sfondo di bromuro di etidio
del gel. Guardate il gel sotto una sorgente di luce UV o
su un transilluminatore UV.
Per l’eliminazione del bromuro di etidio utilizzate il metodo seguente. Se necessario, aggiungete sufficiente acqua per ridurre la concentrazione del bromuro di etidio
a meno di 0,5 mg/ml. Se state eliminando dei gel, metteteli in acqua o nella soluzione di colorazione che volete eliminare. Aggiungete un volume di KMnO4 0,5 M e
mescolate con cura. Aggiungete un volume di HCl 2,5 N
e mescolate con cura. Lasciate la miscela a temperatura
ambiente per diverse ore (o tutta la notte). Aggiungete
un volume di NaOH 2,5 N e mescolate con cura. Eliminate la soluzione da smaltire nello scarico del lavandino.
Sgocciolate i gel da smaltire ed eliminateli nel cestino
della spazzatura. Attenzione: il KMnO4 è un irritante ed
un forte ossidante, e dovrebbe essere maneggiato sotto
una cappa chimica.
Colorante commerciale di DNA
La colorazione con blu di metilene funziona ma non è
l’ideale, in quanto richiede elevate concentrazioni di
DNA ed una notevole quantità di tempo. Il bromuro di
etidio è sensibile e veloce ma richiede la luce UV per la
visualizzazione e presenta rischi chimici. In generale, se
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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il DNA è abbondante (come il DNA del batteriofago
lambda fornito commercialmente o i prodotti di PCR fortemente amplificati) ed i frammenti sono di oltre circa
800 bp di lunghezza, potete visualizzarli con blu di metilene o altri coloranti visivi. Se state utilizzando minipreparazioni di DNA o state visualizzando piccoli (500
bp o meno) prodotti di PCR, il bromuro di etidio darà risultati migliori.
Alcune aziende che vendono materiale biotecnologico e
forniture didattiche offrono coloranti per visualizzare il
DNA a marchio registrato che a loro dire costituiscono
un miglioramento rispetto al blu di metilene convenzionale. Il colorante del DNA Carolina BLU della Carolina
Biological Supply Company si aggiunge al gel di agarosio e al tampone. Deboli bande di DNA possono essere
osservate dopo elettroforesi senza ulteriore colorazione.
Alcuni minuti di ulteriore colorazione aumentano la visibilità. L’azienda dichiara che questo colorante può essere usato con la metà della quantità di DNA richiesta
per la colorazione con blu di metilene, il che, pur essendo un miglioramento, ancora non è adeguato per visualizzare piccoli prodotti di PCR. Se decidete di provare il Carolina BLU (o qualunque altro colorante disponibile), assicuratevi di seguire attentamente le istruzioni del
produttore.
Registrazione dei dati
Fotografia
Un modo per registrare i dati di elettroforesi su gel è
quello di fotografare i gel. Le aziende di forniture biotecnologiche vendono fotocamere e sistemi di fotocamere progettati per fotografare i gel, che sono utili ma
possono essere molto costosi.
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Copiatura del profilo del gel
Il modo più semplice per copiare il profilo di bande di
un gel colorato è quello di posare un pezzo di plastica
trasparente (come un foglio per lucidi) sul gel e tracciare le bande con attenzione.
I dati di un gel umido possono anche essere conservati
nella seguente maniera. Attaccate un pezzo di carta millimetrata su un tavolo. Coprite la carta con pellicola trasparente evitando di formare pieghe e bloccatela in posizione con nastro adesivo. Depositate il gel umido sulla pellicola ed allineatelo in modo che i pozzetti siano
su una linea tracciata. Utilizzate un ago o uno spillo per
forare con attenzione attraverso il gel la carta millimetrata al centro del margine anteriore di ciascuna banda.
Quando tutte le bande sono state segnate, rimuovete il
gel e la pellicola. Disegnate linee per rappresentare le
bande nel gel unendo i fori di spillo. Marcate la linea dove erano i pozzetti. La distanza di migrazione di ogni
frammento può essere letta direttamente sulla carta millimetrata contando i quadratini.
Se volete approfondire la relazione matematica tra dimensioni dei frammenti di DNA e migrazione, provate
a mettere in grafico la distanza di migrazione (la distanza dal fronte del pozzetto al bordo anteriore di ogni
banda) sull’asse delle x e il log10 delle dimensioni del
frammento in coppie di basi (sostituto del peso molecolare, dal momento che sono direttamente proporzionali) sull’asse delle y. Discutete sui modi di usare la migrazione dei frammenti di DNA come illustrazione dell’uso dei logaritmi o della carta semilogaritmica per tracciare i dati.
Conservazione dei gel
Per fotografare un gel colorato con blu di metilene, usate una fotocamera Polaroid con una pellicola di tipo 667,
un’apertura di f/8, ed una velocità dell’otturatore di
1/125 di secondo. Per la fotografia in luce UV dei gel
colorati con bromuro di etidio, usate una pellicola Polaroid di tipo 667 (ASA 3000). Impostate l’apertura della fotocamera a f/8 ed una velocità B dell’otturatore. Tenete premuto l’otturatore per 2 o 3 secondi. La pellicola di tipo 667 può essere acquistata nei negozi di materiale fotografico.
I gel umidi colorati con blu di metilene o con Carolina
BLU possono essere tenuti in frigorifero per molto tempo in contenitori sigillati o in buste di plastica sigillate.
Aggiungete una piccola quantità di soluzione decolorante al gel (pochi millimetri), abbastanza da mantenere umido il gel ma non da permettere ulteriore decolorazione.
Un tipo di pellicola correlata, la 665, viene utilizzata nella stessa maniera ma produce un’immagine positiva in
bianco e nero più un negativo. Il negativo deve essere
immerso in una soluzione di sviluppo (chiedete al negozio di fotografia). Avere il negativo è importante solo
se volete fare degli ingrandimenti delle fotografie (per
esempio, per una pubblicazione o per un’esposizione).
L’altro gel utilizzato per l’elettroforesi del DNA è la poliacrilamide. Questa sostanza forma un reticolo più stretto di quello dell’agarosio, così che i gel di poliacrilamide possono separare molecole più piccole. La poliacrilamide ha anche un potere di risoluzione più grande, il
che significa che un gel di poliacrilamide può separare
molecole i cui pesi molecolari differiscono di poco. Per
Elettroforesi su gel di poliacrilamide
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13 Analisi di restrizione
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esempio, nel sequenziamento del DNA si usano lunghi
gel di poliacrilamide per separare frammenti di DNA che
differiscono in lunghezza di un solo nucleotide. Essi vengono utilizzati nelle applicazioni forensi del fingerprinting del DNA, nelle quali è cruciale determinare se due
frammenti di DNA sono esattamente della stessa dimensione. I gel di poliacrilamide sono usati anche per l’elettroforesi delle proteine.
La poliacrilamide è un polimero del composto chimico
acrilamide. Per preparare un gel di poliacrilamide, l’acrilamide viene sciolta in un tampone, insieme all’agente che forma legami crociati bisacrilamide. Si aggiungono dei catalizzatori per iniziare la polimerizzazione. La
miscela liquida viene quindi versata velocemente in un
sottile spazio tra due lastre di vetro o di plastica. Dopo
la polimerizzazione del gel, le lastre vengono fissate su
un supporto perpendicolare e fatte correre verticalmente, anziché orizzontalmente. I gel di poliacrilamide utilizzati per separare il DNA sono solitamente preparati e
fatti correre in un tampone TBE, proprio come i gel di
agarosio. Si può aggiungere il composto chimico urea al
gel per mantenere il DNA a singolo filamento per applicazioni come il sequenziamento del DNA.
Elettroforesi di proteine
Le proteine vengono normalmente separate mediante
elettroforesi su gel di poliacrilamide, in quanto sono
molecole molto più piccole dei frammenti di DNA comunemente separati in agarosio. Per esempio, una proteina di dimensioni medie può avere una massa molecolare di circa 60 000 dalton (Da). L’elettroforesi dovrebbe essere capace di separarla chiaramente da una
proteina di 55 000 Da. Una singola coppia di basi di
DNA ha una massa molecolare di circa 660 Da. Perciò,
una proteina di 60 000 Da ha la stessa massa molecolare di un frammento di DNA di 91 bp. Una proteina di
55 000 Da ha la stessa massa molecolare di un frammento di DNA di 83 bp. Mentre i gel preparati con alte concentrazioni di agarosio standard possono separare grandi proteine con una buona risoluzione, l’agarosio standard non ha un potere di risoluzione tale da separare le miscele di proteine presenti nella maggior parte delle preparazioni.
Gli agarosi a piccoli pori possono separare le proteine
molto meglio dell’agarosio standard, ma non danno bande così nette come quelle che si formano nell’acrilamide e non raggiungono lo stesso grado di risoluzione. I
gel di agarosio a piccoli pori possono però essere usati
con gli stessi apparati che si usano per l’agarosio standard, permettendo un risparmio significativo di denaro
rispetto all’elettroforesi su gel di poliacrilamide che ri-
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chiede un apparato diverso. L’esercitazione dell’elettroforesi di proteine nel Capitolo 32 utilizza gel di agarosio
a piccoli pori.
Elettroforesi su gel di poliacrilamide
in classe
L’elettroforesi delle proteine offre diversi vantaggi rispetto all’elettroforesi del DNA. Gli studenti di solito vogliono analizzare il DNA di organismi familiari, spesso
cercando di identificare gli organismi dallo schema dei
frammenti di restrizione. Sfortunatamente, persino i genomi dei batteri sono troppo grandi per produrre un numero risolvibile di frammenti in un gel. Le proteine sono un caso diverso. Gli studenti possono estrarre proteine da fonti familiari, come diversi tipi di pesce, carne,
e persino piante, e vedere profili diversi sui gel di poliacrilamide. Gli studenti possono seguire progetti, come
identificare le fonti di campioni di carne, confrontando i
profili delle proteine.
Se volete eseguire un’elettroforesi su gel di poliacrilamide in classe avete bisogno di un apparato da elettroforesi verticale. A causa della difficoltà di preparare gel di
poliacrilamide e della tossicità della acrilamide monomerica, vi raccomandiamo di acquistare gel già pronti. I
gel prepolimerizzati sono prodotti e commercializzati da
aziende di forniture biologiche e sono facili da usare.
Semplicemente fissateli alla camera di elettroforesi, aggiungete il tampone ed il campione, e fateli correre. Poiché l’acrilamide polimerizzata (poliacrilamide) non è tossica, i gel già pronti non sono pericolosi.
I gel prepolimerizzati sono costosi. Siate certi di sapere
quale sistema tampone è necessario per i vostri gel prima di ordinarli. Il tampone più comune utilizzato per l’elettroforesi di proteine contiene Tris base, l’amminoacido glicina e il detergente sodio dodecil solfato. Il sodio
dodecil solfato è aggiunto al tampone per denaturare le
proteine del campione e per fornire una carica negativa
a tutte le proteine del campione.
Obiettivi
Alla fine di questo laboratorio, gli studenti dovrebbero
essere capaci di:
1 . Descrivere i tre passaggi necessari nell’analisi di restrizione: digestione di restrizione, elettroforesi e colorazione.
2. Analizzare i frammenti di DNA marcati del DNA
lambda in un gel e confrontarli con una mappa di restrizione.
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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Materiali
Questo procedimento è progettato per l’uso con coloranti di DNA non intercalanti, e la concentrazione del
DNA richiesta per la visualizzazione con questi coloranti è molto più elevata di quella richiesta dal bromuro di
etidio o altri intercalanti.
G U I D A
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•
Micropipette da 0,5 a 10 !l ο da 1 a 20 !l (che sono
le più costose)
Da uno a cinque tubi microcapillari di vetro Wiretrol
da 10 !l
Pipettatore graduato con puntali graduati
Siringhe di plastica da 1 cm3 adattate per l’uso con
puntali da micropipetta e puntali graduati
Congelatore (non no-frost, se possibile); se usate enzimi disidratati il congelatore non è necessario
Un refrigeratore o un secchiello di ghiaccio
Un bagno termostatato o un incubatore a secco a
37 °C
Microcentrifuga (opzionale)
Attrezzature per elettroforesi su gel
•
•
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•
•
•
•
Forno a microonde o piastra riscaldante per fondere
l’agarosio
Bagno d’acqua bollente (opzionale, per mantenere
l’agarosio fuso)
Camera di elettroforesi e vassoi per i gel
Alimentatori
Dispositivi per caricare i gel, quali:
• Pipette di plastica a punta sottile con tettarella
(l’opzione meno costosa)
• Tubi microcapillari di vetro Wiretrol con pistoni
• Pipettatore graduato con puntali semplici
• Siringhe di plastica da 1 cm3 adattate per l’uso con
puntali da micropipetta
• Micropipette digitali e puntali (l’opzione più costosa)
• Recipienti per colorare e decolorare i gel (qualunque contenitore piccolo e poco profondo sarà adeguato)
Transilluminatore (opzionale)
Fotocamera Polaroid con pellicola di tipo 667 (opzionale)
Materiali per la digestione di restrizione
•
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•
DNA lambda, da 0,4 a 0,5 !g/!l; 2 !l per digestione
Enzimi di restrizione (EcoRI, HindIII e BamHI)
Tampone per digestione di restrizione (generalmente fornito con gli enzimi)
Colorante per caricare il campione
Acqua sterile
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•
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Puntali sterili per micropipetta
Provette sterili per microcentrifuga
Pennarelli indelebili (o altri sistemi di marcatura)
Un contenitore o supporto per provette da microcentrifuga per gruppo di studenti (andrà bene una scatola di polistirolo piena di ghiaccio a pezzetti; il ghiaccio serve semplicemente per fornire un supporto)
•
•
•
Agarosio
Tampone TBE
Beuta per sciogliere l’agarosio; ogni gruppo di studenti avrà bisogno dai 30 ai 50 ml di soluzione di agarosio allo 0,8% fuso (preparato in tampone TBE 1")
Acqua distillata o deionizzata
Nastro adesivo di carta
DNA lambda digerito con EcoRI e HindIII, o BamHI;
da 1,0 a 1,5 µg di DNA totale per campione, con aggiunto il colorante per caricare il campione
DNA lambda digerito con un secondo enzima dell’elenco, con aggiunto il colorante per caricare il campione
50 ml di soluzione di blu di metilene od altra soluzione colorante per gruppo
Carta millimetrata (opzionale, per registrare i dati;
possono portarla gli studenti)
Pellicola per alimenti (opzionale, per registrare i dati)
Attrezzature per la digestione di restrizione
Dispositivi per misurare volumi in microlitri, quali:
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Materiali per elettroforesi su gel
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•
Possibili fornitori del materiale
Se non avete l’attrezzatura per l’elettroforesi, la serie Exploring Electrophoresis della Carolina Biological Supply
Company offre kit economici che contengono apparati
per gel alimentati da batterie, con tutte le attrezzature ed
i campioni necessari per effettuare un esperimento. Gli
apparati per gel sono riutilizzabili. Sono disponibili diversi kit da utilizzare in classe o per dimostrazione.
Il DNA lambda, gli enzimi di restrizione, il TBE concentrato, e il DNA lambda già tagliato sono disponibili presso molte aziende di forniture (vedi il sito e-cathedra; cartella In laboratorio). Alcune industrie offrono enzimi di
restrizione disidratati che possono essere conservati a
temperatura ambiente indefinitamente e che sono predosati per esperimenti di singoli studenti per ridurre sprechi ed errori. La Carolina Biological Supply Company li
commercializza come “Instant Enzymes”. Questi enzimi
semplificano notevolmente l’esercitazione in classe, dal
momento che tutto ciò che gli studenti devono fare è aggiungere la soluzione del DNA agli enzimi disidratati.
Nella nostra esperienza, il colorante del DNA non tossico
“Carolina BLU” funziona un po’ meglio del blu di metilene, ma è più costoso. Il Carolina BLU può essere incor-
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13 Analisi di restrizione
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porato nel gel e inizia a colorare il DNA durante l’elettroforesi, velocizzando la colorazione. Se voi scegliete di acquistarlo, seguite le istruzioni per l’uso del produttore.
I seguenti kit sono venduti dalla Carolina Biological
Supply Company.
Restriction Enzyme Cleavage of DNA, n. 21-1149, contiene tutte le attrezzature necessarie per l’elettroforesi
su gel del DNA di lambda pretagliato (sono disponibili ricariche).
Outbreak!, n. 21-1208, contiene tutte le attrezzature necessarie per l’elettroforesi su gel di DNA pretagliato,
ma l’esercizio è presentato come un racconto nel quale gli studenti devono usare l’analisi di restrizione per
distinguere tra due tipi di virus mortali fittizi (sono
disponibili ricariche).
Introductory Gel Electrophoresis Kit, n. 21-1148, fornisce
materiali per studenti per separare sostanze colorate
su un gel di agarosio come introduzione all’elettroforesi.
DNA Restriction Analysis Kit, n. 21-1103, fornisce materiali per la digestione di restrizione e per l’elettroforesi (sono disponibili ricariche).
Preparazione per la digestione
di restrizione
Se avete ordinato enzimi disidratati potete conservarli a
temperatura ambiente. Se avete ordinato enzimi in soluzione, metteteli con il tampone di restrizione concentrato in un congelatore immediatamente dopo la consegna.
Se il congelatore è no-frost, è una buona idea tenere gli
enzimi nel congelatore in una scatola di polistirolo con
un pacchetto refrigerante. I congelatori no-frost eseguono cicli di riscaldamento per eliminare la formazione del
ghiaccio. Tenendo gli enzimi in un contenitore di polistirolo su un pacchetto refrigerante all’interno del congelatore si mantengono freddi durante questi cicli.
Il DNA disidratato può essere conservato anche a temperatura ambiente. Tenete il DNA in soluzione nel frigorifero. L’agarosio e il TBE possono essere conservati a
temperatura ambiente.
Un giorno prima dell’esperimento
sulla digestione di restrizione
1 . (Saltate questo passaggio se avete ordinato enzimi
disidratati.) Suddividete l’enzima di restrizione in diverse piccole serie per l’uso da parte degli studenti,
al fine di proteggere la vostra scorta. Poiché ogni digestione utilizza 1 !l di enzima, 1 !l di enzima per
gruppo di studenti dovrebbe essere sufficiente. In
realtà, probabilmente non lo sarà. In effetti, dovreste
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calcolare per 8 gruppi l’uso di circa 12 !l. Ci sono
due ragioni per questo: errori di pipettamento degli
studenti e (più importante) la tendenza della soluzione viscosa dell’enzima ad attaccarsi ai puntali della pipetta. Tenete l’enzima nel congelatore o in ghiaccio.
2. (Saltate questo passaggio se avete ordinato digestioni enzimatiche disidratate.) Scongelate i tamponi di
restrizione (sono 10"; non diluiteli). Mettete da 5 a
6 !l di tampone di restrizione 10" in una provetta
sterile da microcentrifuga per ogni gruppo di studenti. Tenete il tampone scongelato nel frigorifero o
in ghiaccio fino alla lezione.
3. Diluite il DNA lambda approssimativamente a 0,5
!g/!l, se non è vicino a questa concentrazione; 0,4
!g/!l sono adeguati. Per fare la diluizione utilizzate
la seguente formula:
(Concentrazione di partenza) x = (0,5 !g/!l)
(volume desiderato),
dove x è la quantità di DNA con la quale iniziare.
Esprimete la concentrazione di partenza in microgrammi per microlitro (per esempio, se il vostro DNA
è 1 mg/ml, utilizzate 1 !g/!l come concentrazione
di partenza). Il volume desiderato è la quantità della
soluzione 0,5 !g/!l che volete, così se volete 100 !l
di DNA lambda 0,5 !g/!l e la soluzione che avete
comprato è 2,0 !g/!l:
(2 !g/!l) x = (0,5 !g/!l) (100 !l)
x = 25 !l
Prendete un volume x (in questo caso, 25 !l) della
soluzione di partenza e mettetela in una provetta sterile da microcentrifuga. Aggiungete (nel volume desiderato – x) TE sterile. In questo caso 100 !l sono il
volume desiderato, così 100 !l – x (25 !l) sono 75 !l
di TE. Perciò, nel nostro esempio, 25 !l di soluzione
di partenza più 75 !l di TE danno 100 !l di DNA a
0,5 !g/!l.
Mettete 20 !l di DNA lambda non tagliato a 0,5 !g/!l
in una provetta da microcentrifuga sterile per ogni
gruppo di studenti. Se avete ordinato DNA lambda
disidratato, reidratatelo secondo le istruzione del fornitore.
4. Mettete 20 !l di acqua sterile in una provetta sterile
da microcentrifuga, una per ogni gruppo.
Preparazione per l’elettroforesi su gel
Per preparare il DNA lambda predigerito seguite semplicemente le istruzioni per la digestione di restrizione
(inclusa la diluizione del DNA, se necessario), ma modi-
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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ficate la scala della dimensione della miscela di reazione moltiplicando ogni componente per, diciamo, 10, ad
eccezione dell’enzima. Potete ottenere un’ottima digestione con molto meno enzima ed evitando sprechi. Per
esempio, usate 40 !l di DNA non tagliato (da 0,4 a 0,5
!g/!l), 10 !l di tampone 10" (fornito con gli enzimi),
45 !l d’acqua, e 5 !l di enzima. Incubate la digestione
per diverse ore e quindi aggiungete, per fermarla, da 15
ai 20 !l di colorante di carica. Conservate il DNA pretagliato in frigorifero o in congelatore. In alternativa, ordinate DNA predigerito commerciale. La Carolina Biological Supply Company offre DNA predigeriti che possono
essere conservati a temperatura ambiente.
1 . Se necessario, diluite il tampone TBE concentrato alla concentrazione 1". Per esempio, diluite il tampone TBE 20" a 1" aggiungendo 19 volumi di acqua
distillata per 1 volume di TBE 20" (950 ml di acqua
più 50 ml di TBE 20"). La soluzione tampone 1" è
usata nella camera del gel e per dissolvere l’agarosio
in polvere.
2. Preparate la soluzione di agarosio.
Calcolate quanta soluzione di agarosio allo 0,8% sarà
necessaria per preparare i gel. Ogni gel richiede dai
30 ai 50 ml di soluzione di agarosio, a seconda delle dimensioni del vassoio del gel. Per esempio, 0,8 g
di polvere di agarosio mescolati a 100 ml di tampone
TBE 1" (dal passaggio 2, sopra) produrranno 100 ml
di una soluzione di agarosio allo 0,8%.
Scaldate l’agarosio e il tampone in una beuta pulita
utilizzando un bagno d’acqua bollente (dai 30 ai 60
minuti) o un forno a microonde (dai 3 ai 6 minuti)
per sciogliere la polvere di agarosio. Non chiudete la
beuta durante il riscaldamento. Il gel può essere versato quando il contenitore sembra caldo ma non bollente. Se versate il gel quando l’agarosio è troppo bollente, potreste deformare il vassoio. L’agarosio fuso
può essere tenuto in un bagno d’acqua a 55 °C (o più
caldo) fino al momento di versare i gel.
Suggerimenti
1 . Prima di iniziare l’esercitazione, rivedete lo schema
dell’intera esercitazione. Proponete un ripasso sugli
enzimi di restrizione e l’elettroforesi se necessario.
2. Fate leggere agli studenti il procedimento del giorno
molto attentamente prima di iniziare. Il successo dipende dal seguire accuratamente le istruzioni.
3. Se gli studenti non hanno mai usato prima micropipette e apparati per elettroforesi o versato gel, è una
buona idea lasciarli far pratica con le pipette, caricando un gel di prova e montando un apparato da
elettroforesi. Per l’esercizio di caricamento, fate un
gel extra in anticipo; potete ritagliare i pozzetti cari-
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cati e fondere il resto del gel per riutilizzarlo. Lasciate che gli studenti facciano pratica di caricamento
con i loro gel solidificati. Mescolate il colorante di
carica e l’acqua in una proporzione 1 a 5 o 1 a 10
per una soluzione di carica di prova. In alternativa,
ordinate le Practice Pipetting Stations della Carolina,
n. 21-1145, che sono fornite con coloranti di carica
di prova. Queste possono essere lavate con acqua e
riutilizzate e si possono conservare indefinitamente
in frigorifero, purché rimangano umide.
4. La maggior parte dei pettini dei gel ha almeno otto
pozzetti. Questo numero è sufficiente per far condividere un gel a due gruppi di studenti, se desiderato. Assicuratevi che gli studenti registrino con cura
quale campione è andato in quale pozzetto.
5. I gel di agarosio possono essere preparati un giorno o
più prima dell’uso e conservati coperti con tampone
TBE 1" a temperatura ambiente (proprio nell’apparato del gel, pronto da caricare il giorno successivo).
6. L’agarosio solidificato può essere rifuso ed utilizzato
di nuovo. Conservate l’agarosio solidificato in un contenitore chiuso a temperatura ambiente. Non riutilizzate gel in cui è stato caricato DNA o che sono stati
colorati.
7. Il tampone TBE può essere riutilizzato alcune volte.
8. Piccoli gel possono essere fatti correre in meno di
un’ora a 130 volt, ma questo alto voltaggio può far sì
che le bande siano meno nette. Se potete regolare il
voltaggio, una corsa dai 40 ai 70 volt di 2 o 3 ore darà i risultati migliori con le digestioni di lambda. Dopo avere spento l’alimentatore, potete semplicemente lasciare i gel negli apparati fino al giorno successivo coperti con tampone. Potete anche far correre i
gel dai 12 ai 15 volt per tutta la notte.
9. Se colorate i gel con blu di metilene, immergeteli nel
colorante per 20-30 minuti. L’intero gel diventerà blu
scuro. Durante la decolorazione, all’inizio può sembrare che non sia presente DNA. Continuate a decolorare e il DNA apparirà man mano che il colorante
in eccesso diffonderà fuori dal gel. Cambiate la soluzione di decolorazione frequentemente per accelerare il processo. È utile permettere ai gel di decolorarsi per tutta la notte. Se usate il Carolina BLU e lo incorporate nell’elettroforesi su gel, deboli bande dovrebbero essere visibili quando l’elettroforesi è completa. Immergete i gel in altro Carolina BLU per renderle più scure (come indicato), e quindi decolorate
i gel per rimuovere l’eccesso di colorante.
1 0. Se fotografate i gel, assicuratevi di avere disponibili
le attrezzature. Altrimenti usate il metodo della carta
millimetrata per registrare i dati (vedi Registrazione
dei dati sopra). Gli studenti devono portare (o fornitela voi) della carta millimetrata. Portate la pellicola
trasparente in classe e assicuratevi di avere spilli o
aghi da dissezione per forare i gel.
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13 Analisi di restrizione
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1 1 . Discutete l’uso della carta semilogaritmica per tracciare la relazione tra migrazione del frammento e dimensione del frammento in coppie di basi (vedi Registrazione dei dati sopra)
1 2. In un’esercitazione di laboratorio di 3 ore, gli studenti
possono completare la digestione di restrizione e l’elettroforesi, se fate correre i gel ad alto voltaggio. Un
periodo di tempo di 90 minuti è sufficiente per completare l’elettroforesi del DNA pretagliato. I gel possono essere conservati in acqua o tampone (proprio
nell’apparato del gel, se volete) per tutta la notte o
più a lungo.
Procedimento
Rivedete l’esercitazione degli enzimi di restrizione, se necessario. Mostrate agli studenti la mappa di restrizione di
DNA lambda. Fate loro prevedere le posizioni relative
delle bande prodotte da digestioni diverse come apparirebbero in un gel.
Ci sono sette siti di restrizione HindIII, che producono
otto frammenti di DNA dopo la digestione di restrizione
con HindIII. Uno dei frammenti è lungo solamente 125
bp e non sarà visibile su comuni gel di agarosio. Un altro frammento è lungo 514 bp e non è detto che sia visibile. Le restanti sei bande dovrebbero essere chiaramente visibili. I cinque siti di restrizione EcoRI del DNA
di lambda producono sei frammenti di DNA dopo digestione. Anche BamHI taglia il DNA di lambda in cinque
siti, producendo sei frammenti di DNA. Dal momento
che ci sono due paia di frammenti di dimensioni abbastanza simili, potreste vedere solamente quattro bande
sul gel.
Digestione di restrizione
1 . Gli studenti devono studiare il procedimento del giorno.
2. Gli studenti devono seguire il procedimento attentamente, tenendo sempre gli enzimi in ghiaccio.
3. Le digestioni dovrebbero essere incubate da 30 minuti a diverse ore a 37 °C. Dopo digestione di restrizione, conservate le digestioni in congelatore se non
fate correre i gel immediatamente.
Elettroforesi su gel
1 . Seguite il metodo riportato nell’esercitazione per preparare i gel. Se voi o gli studenti avete preparato il
DNA, caricate 10 µl di DNA pretagliato più il colorante di carica per corsia. Se avete acquistato DNA pretagliato, caricate la quantità specificata dal fornitore. Ciò
può richiedere un’intera lezione.
2. Fate correre il gel al voltaggio che avete scelto. Quando l’elettroforesi è finita, i gel degli studenti possono
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essere semplicemente lasciati negli apparati da elettroforesi spenti fino al giorno successivo, quando gli
studenti li coloreranno. In alternativa, potete colorarli
voi stessi e metterli in un piccolo contenitore, appena coperti con acqua deionizzata o acqua distillata
per tutta la notte per decolorarli. Il giorno successivo i gel dovrebbero essere pronti per essere analizzati dagli studenti, sebbene possano richiedere ulteriore decolorazione.
3. Gli studenti devono registrare i loro risultati e rispondere alle domande.
!Risposte alle domande per gli studenti
Guardate lo schema di un gel ideale. Una differenza
comune tra i gel reali degli studenti e lo schema
“ideale” è che i gel degli studenti possono non aver
corso abbastanza a lungo per raggiungere lo stesso
grado di separazione. Le loro bande possono essere
più vicine tra loro e risolte meno bene, così che il gel
può sembrare che contenga meno bande più spesse.
2. No, perché i gel vi dicono solamente le dimensioni
dei frammenti e non danno informazioni sulle posizioni relative dei siti di restrizione.
3. Fate riferimento alla mappa di restrizione del batteriofago lambda nella Figura 13.1 dell’esercitazione. Ci sono sette siti HindIII e cinque siti EcoRI nel DNA lambda. Una digestione HindIII/EcoRI del DNA lambda taglierà il DNA lambda in 12 siti, dando luogo a 13 frammenti di restrizione. Questi frammenti dovrebbero avere le seguenti dimensioni in coppie di basi, secondo
la mappa di restrizione: 21 226, 1904, 2027, 947, 1375,
4268, 5148, 564, 125 584, 4973, 831, e 3530. Se volete
verificare la previsione effettuando una doppia digestione, mescolate 1 !l di ogni enzima in una provetta
da microcentrifuga e quindi aggiungete 1 !l della miscela ad una digestione. Se possibile incubatela per 2
ore. Per un’interpretazione più chiara, caricate il gel
con le singole digestioni di HindIII, di EcoRI, e con la
doppia digestione. Alcune delle bande nella doppia
digestione saranno uguali alle bande della singola digestione. Le bande della singola digestione forniranno
anche una scala di dimensioni per le bande della doppia digestione. Potrebbe essere un buon esercizio per
gli studenti prevedere gli schemi di migrazione dei tre
campioni affiancati.
4. Un esperimento per controllare che gli enzimi di restrizione taglino il DNA deve includere una digestione sperimentale con tampone, DNA ed enzima e una
digestione di controllo con tampone, DNA e nessun
enzima. Le due digestioni dovrebbero essere incubate in condizioni identiche e quindi fatte correre affiancate su un gel. Un buon secondo campione di
controllo dovrebbe essere semplicemente la corsa di
parte del DNA di partenza senza tampone e senza in1.
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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cubazione, per assicurarsi che il DNA di partenza sia
intatto. Dopo che il gel ha corso, dovrebbe essere colorato e decolorato, e si dovrebbero confrontare gli
schemi di bande di DNA.
5. La provetta di controllo serve per dimostrare che non
ci sono frammenti di restrizione se il DNA non è trattato con un enzima.
6. Il microlitro extra di acqua nella provetta di controllo sostituisce 1 !l di enzima non aggiunto. Aggiungendo un microlitro extra di acqua, i volumi finali in
tutte le provette saranno gli stessi.
7. La ragione per cui sono visibili (nel gel ideale dello
studente) solamente cinque frammenti EcoRI è che il
frammento di 5804 bp ed il frammento di 5643 bp non
si sono risolti in queste condizioni di elettroforesi. Se
fosse stato usato BamHI, non si sarebbero risolti i frammenti di 6770 da quelli di 6527 bp e non si sarebbero
risolti i frammenti di 5626 e da quelli di 5505 bp.
Per risolvere queste coppie di frammenti potreste far
correre il gel molto più a lungo (cosa che potrebbe
richiedere la preparazione di un gel più grande) o
preparare un gel a bassa percentuale di agarosio che
risolve più efficacemente i frammenti grandi (vedi sopra Elettroforesi su gel di agarosio).
Controllo,
nessun enzima
HindIII
23 130
EcoRI
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Controllo,
nessun enzima HindIII
EcoRI
BamHI
Pozzetti
Gel ideale (il frammento HindIII di 125 bp non sarà visibile; il
frammento HindIII di 564 bp probabilmente non sarà visibile e non
è mostrato).
BamHI
21 226
16 841
9416
6557
7412
7233
5804
5643
4878
6770
6527
4361
3530
5626
5505
2322
2027
Gel ideale con le dimensioni dei frammenti in
coppie di basi.
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B. Manipolazione ed analisi del DNA
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DNA ricombinante
Descrizione dell’esercitazione
a p. 203
L’Esercitazione 14 Plasmidi ricombinanti di carta presenta agli studenti alcune tecniche di base del DNA ricombinante. I modelli di carta sono utilizzati per dimostrare come il DNA plasmidico viene tagliato con enzimi
di restrizione e ricombinato per creare una molecola di
DNA ricombinante. Gli studenti dovrebbero avere già familiarità con i plasmidi dall’Esercitazione 9 Dimensioni
del genoma umano e di E. coli e dalla discussione in classe. Essi dovrebbero avere già fatto Forbici che tagliano
il DNA (Capitolo 11) come introduzione agli enzimi di
restrizione. Questa esercitazione è molto efficace quando usata in combinazione con un’altra sulla trasformazione batterica, come quella nel Capitolo 19. Se gli studenti hanno completato La corsa del DNA o sono a loro
agio con l’elettroforesi, i Fogli di lavoro Prova di analisi di restrizione (Capitolo 15) costituiscono un buon compito successivo.
Lezioni richieste: 1
Background
Il DNA “ricombinante” è semplicemente una molecola di
DNA che è stata assemblata a partire da pezzi presi da
più di una fonte di DNA. Costruire DNA ricombinante è
diventato possibile con la scoperta degli enzimi di restrizione e della DNA ligasi. Gli enzimi di restrizione sono usati per tagliare il DNA in frammenti riproducibili e
la ligasi è utilizzata per formare nuovi legami fosfodiestere tra di essi. Una molecola di DNA ricombinante si
crea quando si formano legami fosfodiestere fra tratti di
DNA provenienti da fonti diverse.
che sono duplicati dagli enzimi di replicazione del DNA
della cellula ospite e trasmessi alle cellule figlie durante
la divisione cellulare. Alcuni plasmidi mantengono un alto numero di copie nei loro ospiti, con 50 copie o più
per cellula. Altri possono avere un numero di copie molto basso, fino ad una per cellula. Il numero di copie è
una caratteristica del plasmide stesso.
Per essere duplicati dagli enzimi di replicazione dell’ospite, i plasmidi devono contenere un’origine di replicazione (vedi l’introduzione al Capitolo 7, Duplicazione del DNA). Un’origine di replicazione è una sequenza di basi all’interno di una molecola di DNA all’altezza della quale inizia il processo di replicazione del
DNA. La maggior parte dei plasmidi contiene anche uno
o più geni i cui prodotti hanno un ruolo nella replicazione del DNA plasmidico. Inoltre, molti plasmidi contengono geni che sono utili alla cellula ospite in alcune condizioni ambientali. Per esempio, alcuni plasmidi
contengono geni per prodotti tossici che uccidono i batteri che competono con i loro ospiti. Questi plasmidi
contengono anche geni che rendono i loro ospiti immuni alla tossina. Tuttavia, i geni più familiari derivanti da plasmidi sono probabilmente i geni per la resistenza ad un antibiotico.
Gli antibiotici sono sostanze naturali (o copie e derivati
di sostanze naturali prodotti dall’uomo) che uccidono dei
microrganismi o ne bloccano la crescita. Gli antibiotici in
natura sono prodotti anche dai microrganismi. Si è pensato che la produzione di un antibiotico possa conferire
un vantaggio di sopravvivenza al produttore permettendogli di uccidere i microbi vicini che normalmente competerebbero per i nutrienti.
La più importante applicazione della tecnologia del DNA
ricombinante è il clonaggio dei geni. Per clonare un gene, si deve isolare un frammento di DNA contenente il gene. Il frammento di DNA contenente il gene viene quindi
aggiunto ad una molecola di DNA vettore che verrà replicata all’interno di una cellula. Il tipo più comune di vettore è un plasmide, sebbene si usino anche altri vettori.
Dal momento che gli antibiotici sono comparsi in natura, non sorprende che anche la capacità di resistenza sia
naturale. Si presume che i geni per la resistenza agli antibiotici presenti sui plasmidi si siano evoluti in risposta
alla presenza di antibiotici in natura. Questo sistema naturale di antibiotico e gene di resistenza ha fornito ai biologi molecolari un mezzo potente per le applicazioni di
laboratorio. Un esempio è illustrato sotto.
I plasmidi sono molecole circolari di DNA (relativamente) piccole presenti in molti batteri ed in alcuni lieviti,
Dopo che un frammento di DNA è stato legato in un plasmide, il plasmide ricombinante viene introdotto in una
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58
14 DNA ricombinante
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cellula ospite. La cellula ospite replica il DNA plasmidico ricombinante quando si divide. Il DNA plasmidico è
spesso introdotto nelle cellule batteriche ospiti per trasformazione (vedi il Capitolo 19, La trasfor mazione). In
una tipica trasformazione, miliardi di batteri sono trattati ed esposti al DNA plasmidico. Solamente una frazione
(solitamente 1 su 1000) acquisirà il plasmide. I geni per
la resistenza all’antibiotico forniscono un mezzo per trovare queste cellule trasformate (trasformanti) tra tutte le
cellule che non lo sono.
Dopo la trasformazione con plasmidi contenenti geni di
resistenza ad un antibiotico, i trasformanti possono essere rivelati piastrando i batteri in un mezzo contenente
l’antibiotico. Solo i batteri che esprimono i nuovi geni
della resistenza all’antibiotico possono formare colonie
sulle piastre con l’antibiotico. Nella miscela di cellule trasformate e non trasformate, gli unici batteri che hanno i
geni della resistenza all’antibiotico sono quelli che hanno acquisito il plasmide: i trasformanti. Questo metodo
di selezionare i trasformanti permette ai ricercatori di trovare piuttosto facilmente la cellula su 1000 che ha acquisito il plasmide.
A causa della facilità con la quale possono trovare le cellule trasformate con plasmidi contenenti geni di resistenza all’antibiotico, ricercatori solitamente clonano i geni di interesse in questi plasmidi. Il gene di interesse può
non cambiare i batteri in un modo rilevabile facilmente,
rendendo impossibile determinare se un batterio è stato
trasformato con il gene. Tuttavia, se il gene di interesse
è in un plasmide che codifica la resistenza ad un antibiotico, il ricercatore dovrà soltanto selezionare quei batteri che diventano resistenti all’antibiotico dopo la trasformazione. Questi batteri dovrebbero contenere anche
il gene.
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mente nelle cellule, ed essenzialmente solo una molecola entra in una data cellula trasformata. Perciò, quella
cellula ora contiene un prodotto isolato di legatura. Se
una preparazione di cellule competenti viene trasformata con una miscela di reazione di legatura, probabilmente
nelle cellule batteriche entreranno rappresentanti di tutti i prodotti. Quei prodotti che contengono le origini di
replicazione saranno replicati dai loro nuovi ospiti e trasmessi alla progenie.
Se un ricercatore esegue una legatura con un vettore
contenente un gene per la resistenza all’ampicillina, trasformando il DNA legato dentro cellule sensibili all’ampicillina, e seleziona i trasformanti piastrando le cellule su un mezzo contenente ampicillina, otterrà una
collezione di cellule che contengono un plasmide con
un’origine di replicazione, un gene di resistenza all’ampicillina, e possibilmente altri componenti, secondo la reazione di legatura. In molti casi, tuttavia, un ricercatore si trova di fronte una collezione di trasformanti che possono contenere o non contenere il plasmide che desidera.
Per determinare se un dato trasformante contiene il plasmide ricombinante desiderato (invece di un prodotto alternativo di legatura), il ricercatore deve spesso preparare il DNA plasmidico da quel trasformante. Il DNA plasmidico viene quindi analizzato (per analisi di restrizione, sequenziamento del DNA, od altri mezzi) per determinare se ha la struttura desiderata.
In questa esercitazione, gli studenti assembleranno plasmidi che portano geni della resistenza all’ampicillina e
alla kanamicina. Iniziando con due plasmidi genitori, uno
che codifica la resistenza all’ampicillina e l’altro la resistenza alla kanamicina, gli studenti simuleranno la digestione di ciascun plasmide con BamHI ed HindIII. Successivamente legheranno insieme i frammenti per creare un plasmide ricombinante contenente entrambi i geni di resistenza.
Gli studenti solitamente chiedono come si possa essere sicuri che si otterrà dalla legatura il prodotto voluto
e non prodotti alternativi possibili, o perché si formi il
prodotto “giusto” invece del prodotto “sbagliato”. (Essi
formeranno sicuramente molti prodotti alternativi con i
loro plasmidi di carta.) Assicuratevi che capiscano che
in qualunque legatura si formeranno tutti i possibili prodotti. L’enzima ligasi è “cieco” e forma legami fosfodiestere fra molecole di DNA indipendentemente dalle
sequenze di basi di queste molecole. Perciò, dopo una
legatura, nella provetta ci sarà una miscela di prodotti.
Come si possono identificare e separare? I ricercatori
usano solitamente la trasformazione.
Alla fine di questa esercitazione, gli studenti dovrebbero essere capaci di:
La chiave per comprendere come la trasformazione possa identificare i prodotti di legatura è quella di rendersi
conto che la trasformazione è un processo veramente
inefficiente. Assai poche molecole di DNA entrano vera-
1 . Descrivere l’attività della DNA ligasi.
2. Definire il “DNA ricombinante”.
3. Descrivere come costruire un plasmide ricombinante da due plasmidi di partenza.
È molto efficace far seguire a questa esercitazione quella pratica Trasfor mazione di Escherichia coli.
Obiettivi
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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Materiali
•
•
•
Esercitazione 14 Plasmidi ricombinanti di carta
Modelli dei plasmidi (vedi sito e-cathedra; cartella
Modelli)
Forbici, colla, nastro adesivo
Suggerimenti
Quando gli studenti usano i modelli di carta, ricordate
loro che il DNA è tridimensionale e non ha “fronte” o
“retro”, né è importante se le lettere sono capovolte. Ciò
che realmente importa è la complementarità delle coppie di basi ed il corretto orientamento antiparallelo dei
filamenti.
Procedimento
1 . Fate leggere agli studenti le informazioni di base e/o
discutete il materiale di base.
2. Fate leggere le istruzioni ed assicuratevi che le capiscano. Potreste aver bisogno di ripassare le attività
degli enzimi di restrizione e della DNA ligasi.
3. Eseguite le attività indicate.
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4. Fate rispondere alle domande. Queste domande costituiscono un buon punto di partenza per il laboratorio di trasformazione.
!Risposte alle domande
Fate riferimento al disegno schematico. I frammenti di
restrizione (mostrati sotto i disegni schematici dei plasmidi) sono marcati. Esistono sei possibili combinazioni. (Ricordate che il DNA è tridimensionale, e non
è importante se le lettere sul modello di carta sono capovolte.) Se i due frammenti di pAMP sono chiamati
1A e 1B (vedi il disegno) mentre i due di pKAN sono
2A e 2B, le combinazioni saranno 1A-1B, 1A-2B,
2A-1B, 2A-2B, 1A-2A, e 1B-2B. Saranno rivelabili solamente quattro di queste: 1A-2A, 1A-1B, 1A-2B, e
2A-2B. 1B-2B non ha un marcatore selezionabile (resistenza ad un antibiotico), e 2A-1B non ha l’origine
della replicazione. Entrambe queste molecole potrebbero formarsi ed essere trasformate in batteri, ma
1B-2B non sarebbe rivelabile in un mezzo con un antibiotico. La molecola 2A-1B non verrebbe copiata una
volta che è entrata nella cellula e non verrebbe trasmessa alle cellule figlie che formano la colonia.
2. Gli elementi essenziali dell’esperimento sono i seguenti. Preparate due campioni di batteri da una col1.
Ba mHI
Ap
Ba mHI
ori
pAMP
pKAN
HindIII
ori
Km
HindIII
Entrambi i plasmidi sono digeriti con BamHI ed HindIII, che producono i seguenti frammenti:
pAMP
H
H
Ap:
Km:
ori:
B:
H:
pKAN
ori
Ap
B (1B)
B (1A)
(2A)
B
( 2B) B
Km
ori
resistenza all’ampicillina
resistenza alla kanamicina
origine della replicazione
estremità BamHI
estremità HindIII
Disegno schematico dei plasmidi di carta e dei loro prodotti di restrizione.
H
H
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14 DNA ricombinante
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tura. Trasformate uno dei campioni con la miscela di
DNA (esperimento). Sottoponete l’altro campione al
procedimento di trasformazione, ma non aggiungete
DNA (controllo). Piastrate i batteri dei campioni sperimentali e di controllo sui seguenti mezzi: (1) nessun
antibiotico (ci sono dei batteri vivi?), (2) ampicillina
(nessuno degli organismi di controllo dovrebbe crescere; questa è una prova dell’efficacia dell’ampicillina; alcuni degli organismi dell’esperimento dovrebbero formare colonie), (3) kanamicina (come la piastra di ampicillina), e (4) ampicillina più kanamicina
(dovrebbero crescere solamente cellule trasformate
con il plasmide ricombinante ampicillina-kanamicina).
3. Il punto critico riguardo a questi batteri è che sopravviveranno su una piastra con un antibiotico ma
non sull’altra né sulla piastra con due antibiotici. Per
trovarli, piastrate parte della miscela sperimentale su
una piastra di ampicillina e parte su una piastra di kanamicina. Dopo che le colonie sono cresciute sulle
piastre, trasferite alcune cellule da ciascuna colonia
su una piastra contenente l’altro antibiotico (o entrambi gli antibiotici). I batteri che voi cercate sono
quelli che sopravvivono su un antibiotico ma non ri-
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escono a produrre colonie sulle piastre contenenti
l’altro antibiotico. Due dei plasmidi previsti nella Domanda 1 cresceranno solo su ampicillina; uno crescerà solo su kanamicina.
4. La ragione più importante è che i ricercatori hanno
bisogno di poter identificare i batteri che sono stati
trasformati con il gene desiderato. Questi batteri
possono essere molto rari tra i batteri sperimentali.
Associare il gene desiderato ad un gene di resistenza ad un antibiotico dà un enorme vantaggio: piastrando gli organismi su un mezzo con un antibiotico, un ricercatore può selezionare solo quegli organismi che sono stati trasformati con il gene della
resistenza a quell’antibiotico e, per associazione,
con il gene di interesse. Un altro vantaggio nell’avere il gene della resistenza ad un antibiotico associato al gene desiderato è dato dal fatto che ciò fornisce un meccanismo per assicurare che il gene desiderato sia ancora presente. Propagando i batteri
trasformati su mezzi con antibiotici, il ricercatore
può continuamente selezionare solamente quei batteri che contengono il gene della resistenza e, per
associazione, il gene desiderato.
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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Fogli di lavoro di prove di analisi
di restrizione
Descrizione dei fogli di lavoro
a p. 206
I fogli di lavoro di prove di analisi di restrizione contengono tre problemi che illustrano gli usi attuali dell’analisi
di restrizione in laboratorio. I problemi, in particolare il
secondo e il terzo, richiedono un’analisi a più stadi e sono più appropriati per studenti avanzati o per studenti che
amano i problemi analitici. Gli studenti devono avere familiarità con gli enzimi di restrizione, la costruzione di molecole di DNA ricombinante, la DNA ligasi e l’elettroforesi su gel. Le informazioni di base necessarie si trovano nelle Esercitazioni Forbici che tagliano il DNA (11), Plasmidi ricombinanti di carta (14) e La corsa del DNA (12).
Questi fogli di lavoro richiedono agli studenti di applicare le loro conoscenze della costruzione di molecole di
DNA ricombinante e dell’analisi di restrizione a tre problemi simili a quelli incontrati ogni giorno nei laboratori di ricerca. I primi due problemi coinvolgono l’analisi
delle molecole prodotte durante una legatura, mentre il
terzo richiede agli studenti di generare una mappa di restrizione dai dati di analisi di restrizione.
Gli studenti possono aver bisogno di assistenza per affrontare i primi due problemi, poiché essi richiedono di
integrare e usare le informazioni di diverse lezioni. Potreste trovare utile svolgere il primo problema insieme a
tutta la classe e quindi far lavorare gli studenti ai rimanenti problemi individualmente o in piccoli gruppi.
Discussione
Quando un ricercatore inizia a preparare una molecola
ricombinante, deve pianificare come farà a riconoscere
quella molecola quando la otterrà. Di solito si osserva la
struttura della molecola del DNA che si vuole produrre
e la struttura degli altri prodotti che saranno presenti nella legatura (come il plasmide di partenza) e si progetta
un’analisi di restrizione che permetterà di identificare la
molecola desiderata. Gli studenti seguiranno questo stesso procedimento quando affronteranno le prove I e II.
Nella prova I la legatura descritta produrrà il vettore rigenerato (dove la ligasi ha semplicemente richiuso il sito EcoRI del vettore plasmidico), oltre alla molecola ri-
combinante desiderata. Il frammento EcoRI può essere
inserito in uno qualunque dei due orientamenti, ma in
questo problema non esiste nessun modo per distinguerli. È anche possibile che più di un frammento EcoRI
possa essere inserito nella stessa molecola vettore. In
realtà, il vettore risigillato sarebbe il prodotto più comune, seguito dai plasmidi ricombinanti che contengono un
inserto. In laboratorio di solito è poco comune ottenere
plasmidi con copie multiple di un inserto.
Gli studenti potrebbero voler sapere com’è possibile analizzare i singoli prodotti di una legatura quando la reazione avviene in una singola provetta. Potete spiegare
loro che il processo di trasformazione separa i prodotti
della legatura (vedi l’introduzione al Capitolo 14). L’efficienza di trasformazione è molto bassa: in un dato esperimento si può trasformare circa una cellula su mille o su
un milione. Ciascuna cellula trasformata contiene quindi una molecola di plasmide, che si può replicare in molte copie e viene propagata quando la cellula si divide.
Una cellula trasformata si divide per produrre una colonia su un appropriato mezzo con antibiotico, ed ogni cellula di quella colonia contiene un plasmide che è una
copia di una delle molecole originali di prodotto. Analizzando i plasmidi presenti in molte copie differenti di
trasformanti, è possibile osservare individualmente i diversi prodotti dalla stessa reazione di legatura. I ricercatori spesso analizzano i plasmidi di molti trasformanti
quando cercano un singolo prodotto di una legatura che
potrebbe produrre molti prodotti diversi.
La prova II è uno sviluppo delle idee introdotte nella prova I. Qui, il vettore è legato in presenza di due diversi
inserti: quello da rimuovere e quello desiderato. È possibile che entrambi gli inserti possano essere legati nel
vettore (con qualunque orientamento), ed è anche possibile che il vettore si richiuda semplicemente senza un
inserto. Notate che i prodotti della reazione da recuperare sono limitati a quelli con una singola origine di replicazione (una molecola di plasmide) con meno di 7000
coppie di basi (bp).
Utilizzate questo problema per aiutare i vostri studenti a
capire che la costruzione di una molecola ricombinante
può essere un compito complesso che richiede l’uso di
capacità analitiche per progettare ed identificare i vari
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15 Fogli di lavoro di prove di analisi di restrizione
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dei frammenti di DNA e, usando questi dati, deducono
l’identità degli enzimi.
prodotti. Questi esercizi dovrebbero indurre i vostri studenti a pensare in modo analitico ed aiutarli a capire come l’analisi di restrizione venga usata nei problemi della vita reale.
Risposte alle prove
La prova III dovrebbe essere eseguita separatamente.
Non c’è nessun metodo magico per risolvere il terzo problema; gli studenti devono semplicemente lavorare ad
esso. Se alcuni dei vostri studenti si divertono a determinare la mappa di restrizione, sfidateli a creare problemi simili per i loro compagni di classe. Essi devono immaginare una molecola di DNA con una mappa di restrizione e generare i dati. Fate disegnare loro un gel che
mostri i frammenti di restrizione. Lasciate che i loro compagni di classe costruiscano le mappe a partire dai dati.
Se ci sono problemi o ambiguità, gli altri studenti li troveranno. L’esercizio di immaginare una mappa di restrizione e di trarre i dati da essa derivati rinforzerà tutte le
lezioni sull’elettroforesi.
Il vettore plasmidico può essere distinto dalla molecola ricombinante con una digestione EcoRI o con
una digestione BamHI. Il vettore produce un singolo frammento EcoRI di 5000 bp, mentre il ricombinante produce quel frammento più il frammento dell’inserto di 1500 bp. Il vettore produce un singolo
frammento BamHI di 5000 bp, mentre il ricombinante
produce un singolo frammento di 6500 bp. Non c’è
nessun modo di distinguere i due possibili orientamenti dell’inserto con le informazioni fornite. Se gli
studenti hanno dei problemi, fate loro disegnare e
confrontare le strutture del vettore di partenza e del
plasmide ricombinante. Controllate i disegni dei gel
per assicurarvi che i frammenti siano segnati correttamente e disegnati in maniera comprensibile.
IIA. Ci sono cinque potenziali prodotti, date le limitazioni del problema (Disegno schematico 15.1). I due
plasmidi con l’inserto originale nei diversi orientamenti (B e C) sono indistinguibili date le informazioni disponibili.
IIB. Il modo migliore di distinguere i prodotti, date le informazioni disponibili, è quello di effettuare una digestione con BamHI. Il prodotto A (prodotto ricostituito senza nessun inserto) darà un singolo frammento di 5000 bp. I prodotti B e C (il vettore con
l’inserto originale in qualunque orientamento) daranno un singolo frammento di 6500 bp. Il prodotto
D darà due frammenti di 3500 e 3000 bp. Il prodotto E darà due frammenti di 4000 e 2500 bp. Una digestione EcoRI non distinguerà tra i vecchi e i nuoI.
Attività di mappatura di restrizione
in laboratorio
Kit per mappatura di restrizione di DNA plasmidico, Carolina Biological Supply Company (n. catalogo 21-1175).
Gli studenti preparano un gel e corrono campioni di
DNA predigeriti. Dopo l’elettroforesi, devono determinare le dimensioni dei frammenti di DNA e, utilizzando
questi dati, dedurre la mappa di restrizione del plasmide. Le istruzioni includono problemi pratici.
Kit per problemi di enzimi di restrizione, Carolina Biological Supply Company (n. catalogo 21-1190). Gli studenti digeriscono il DNA lambda con un enzima di restrizione noto e due ignoti, determinano le dimensioni
2000
2000
E
B
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E
B
A
2000
B
3000
3000
1500
E
3000
E
2000
E
1000
D
3000
C
1500
2000
B
E
B
E
B
500
B
E
500
B
E
1000
3000
E
Disegno schematico 15.1 Prova II. Possibili prodotti con un’origine di replicazione e lunghezza totale inferiore a 7000 bp.
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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vi inserti, dal momento che entrambi sono lunghi
1500 bp. Una digestione EcoRI più BamHI non distinguerà tra i prodotti D ed E. Ognuno darà frammenti di 2000, 3000, 500 e 1000 bp.
IIC. Se gli studenti danno delle buone risposte alla parte B, dovrebbe essere facile per loro disegnare il gel.
B
2,5
E
0,5
0,4
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Controllate i gel per assicurarvi che abbiano marcato correttamente e disegnato appropriatamente i
frammenti rispettando la scala delle dimensioni.
III. Guardate il Disegno schematico 15.2. Qualunque
orientamento è corretto. E, sito EcoRI; B, sito BamHI.
La scala delle dimensioni è in kilobasi (1000 bp).
E B
3,6
B E
3,0
A L L E
0,4
3,0
E B
3,6
0,5
2,5
Disegno schematico 15.2 Prova III. Mappa di
restrizione del frammento di DNA lineare.
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B. Manipolazione ed analisi del DNA
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Rivelazione di sequenze specifiche
di DNA: analisi di ibridazione
Descrizione dell’esercitazione
a p. 209
Le esercitazioni di questa lezione prevedono l’uso di modelli di carta per illustrare concetti di base dell’analisi di
ibridazione. L’ibridazione è una tecnica che si avvale della specificità dell’appaiamento delle basi per la rivelazione di sequenze specifiche in un campione misto ed è
uno dei metodi fondamentali per l’analisi del DNA. La
prima esercitazione (Pescare il DNA) richiede solamente
che gli studenti abbiano familiarità con la struttura del
DNA e con le regole dell’appaiamento delle basi. In questa sezione abbiamo aggiunto informazioni specifiche
sull’analisi di ibridazione fluorescente in situ (FISH). La
seconda e la terza esercitazione presuppongono che gli
studenti abbiano familiarità con gli enzimi di restrizione
ed i processi di elettroforesi. Se pensate di svolgere le lezioni successive sul sequenziamento del DNA, sulla reazione a catena della polimerasi, o sull’analisi del DNA
umano, è importante che la vostra classe conosca l’ibridazione.
Lezioni richieste: da 1 a 2
Introduzione
La digestione di restrizione, l’elettroforesi e la colorazione permettono ai ricercatori di tagliare le molecole in
frammenti riproducibili e osservare le dimensioni di quei
frammenti. Tuttavia, ciò non fornisce molte informazioni riguardo alla sequenza delle basi del DNA all’interno
dei frammenti. Sappiamo solo che il sito di restrizione è
presente all’estremità di ogni frammento, ma questo è
tutto. Spesso è importante sapere se una specifica sequenza di basi di DNA è presente in un campione e dove si trova rispetto ai siti di restrizione. Questo genere di
domande si presenta quando si esegue uno screening di
librerie di DNA (vedi il Capitolo 5), quando si cerca di
determinare se un certo gene è stato introdotto in un organismo, e quando si analizza la struttura di una certa
regione di DNA (come fingerprinting del DNA). La tecnica più comunemente usata per rispondere a queste domande è l’analisi di ibridazione.
In breve, l’analisi di ibridazione comporta la separazione dei filamenti (denaturazione) delle molecole di DNA
da analizzare e quindi il mescolamento di questi filamenti
separati con molte copie di una molecola di DNA o RNA
a singolo filamento. Questa molecola di DNA o RNA a
singolo filamento è il complemento della sequenza di basi di interesse ed è marcata per la rivelazione (spesso con
isotopi radioattivi). Essa è chiamata sonda.
Quando si mescola una sonda con il campione di DNA
a singolo filamento nelle giuste condizioni, si formano
legami idrogeno tra la sonda e la sua sequenza complementare nel campione di DNA. La formazione di legami idrogeno tra i due filamenti complementari singoli che ricostituisce una doppia elica è detta ibridazione
o annealing. Se il campione di DNA non contiene la sequenza di basi complementare alla sonda, nessuna molecola sonda si ibriderà con il campione. Dopo il tempo concesso per l’ibridazione, il campione viene lavato
per rimuovere la sonda non ibridata e quindi saggiato
per la presenza di sonda ibridata (vedi sotto). La sonda
ibridata indica la presenza della sequenza di DNA di interesse.
Denaturazione del DNA
Per separare i due filamenti di una molecola di DNA, i
legami idrogeno tra le coppie di basi devono essere rotti. La rottura di questi legami può essere ottenuta fisicamente col calore o chimicamente con una base (si
può usare anche un acido, ma in questo caso il processo distrugge parte dei nucleotidi). La severità delle
condizioni richieste per separare i due filamenti dipende da quanto stabilmente sono associati i due filamenti. Poiché le coppie G-C sono tenute insieme da tre legami idrogeno, mentre le coppie A-T sono unite solamente da due, occorrono temperatura o pH più elevati per separare filamenti con una percentuale maggiore
di coppie G-C. La temperatura richiesta per denaturare
una data molecola di DNA è chiamata temperatura di
fusione, e la temperatura di fusione di una particolare
molecola può essere prevista in base al suo contenuto
di G-C. Nelle applicazioni di ibridazione, le condizioni
di denaturazione sono generalmente impostate in modo che si denaturi qualunque molecola di DNA (per
esempio, dai 95 ai 100 °C). Il passaggio in cui il fattore
temperatura di fusione può diventare importante è
quando si ibrida la sonda con il campione (vedi sotto).
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16 Rivelazione di sequenze specifiche di DNA
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Ibridazione
Se viene bollita, una molecola di DNA in soluzione si denatura. Se si permette quindi alla soluzione di raffreddarsi, i filamenti si riappaiono e si forma di nuovo una
doppia elica. Nelle giuste condizioni avverrà ibridazione
tra qualunque singolo filamento complementare di DNA.
Non è richiesto nessun enzima. Come possiamo immaginare, piccole molecole complementari tendono ad ibridarsi molto più velocemente delle molecole lunghe, poiché è più facile per loro raggiungere l’allineamento corretto per l’appaiamento di basi in seguito a contatto casuale. Per facilitare l’ibridazione e la successiva rivelazione della sonda, il DNA da analizzare viene comunemente trasferito ad una membrana, solitamente di nylon
o nitrocellulosa.
Sonde
In teoria, qualunque molecola di DNA o RNA può essere usata come sonda. Spesso si impiegano piccoli oligonucleotidi sintetici di 15 o 30 basi in quanto sono facili
da ottenere (negli ambienti di ricerca) e il ricercatore ha
il controllo completo sulla sequenza delle basi. Si usano
anche frammenti di restrizione purificati, interi plasmidi
linearizzati, o prodotti della sintesi enzimatica in vitro di
DNA o RNA. Le sonde possono essere marcate radioattivamente con diversi metodi, inclusa la sintesi in presenza di nucleotidi radioattivi o il legame di un gruppo
fosfato terminale radioattivo mediante l’enzima polinucleotide chinasi. Si usano frequentemente anche metodi
di marcatura non radioattiva. In questi metodi la sonda
di DNA è modificata chimicamente con un sostituente
che dà luogo a un prodotto colorato o luminescente in
seguito ad una reazione di rivelazione (di solito enzimatica).
L’aspetto cruciale nella selezione della sonda è quello di
essere certi che la sonda si ibridi solamente con il DNA
di interesse. La possibilità di un evento casuale per qualunque particolare sequenza di DNA è 4n, dove n è il numero di basi della sequenza. Perciò, le possibilità di un’ibridazione casuale si riducono drasticamente con l’aumentare delle dimensioni della sonda. È tuttavia possibile che due molecole a doppio filamento in parte non
complementari ibridino fra loro. A causa di questa possibilità, sono importanti le scelte sia della sonda che delle condizioni di ibridazione.
Quando due molecole leggermente non complementari
ibridano fra loro, la doppia elica che si forma è meno stabile di un’elica perfettamente appaiata. (Considerate che
non ci sono legami idrogeno tra basi non complementari, oltre alla deformazione strutturale che un appaiamento non corretto può causare.) L’elica non perfettamente
appaiata si denatura ad una temperatura più bassa di
quella della sua controparte perfettamente appaiata. Per-
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ciò, a certe temperature, si formano e sono stabili le eliche perfettamente appaiate ma non quelle non del tutto
appaiate. Regolando la temperatura di ibridazione, i ricercatori possono permettere o bloccare l’ibridazione di
una sonda che non si appaia perfettamente.
È opportuno ibridare in condizioni che permettono l’ibridazione della sonda con una sequenza non perfettamente complementare? Sì, spesso. Quando i ricercatori “pescano” geni, una tecnica che usano spesso è
quella di impiegare un gene noto, ad esempio un gene
del lievito Sacchar omyces cer evisiae, come sonda per
la sua controparte in un organismo correlato alla lontana, come l’uomo. I ricercatori non si aspettano che il
gene del lievito si appai perfettamente con il gene umano, ma sperano che le due sequenze siano abbastanza
simili da permettere l’ibridazione in condizioni permissive. Questo tipo di approccio spesso ha successo. In
altre applicazioni, l’ibridazione può essere effettuata in
condizioni abbastanza rigide solamente da appaiamenti perfetti.
Screening di librerie di DNA
Una libreria di DNA è una raccolta di cloni che, nell’insieme, rappresentano l’intero genoma di un organismo.
Una libreria plasmidica può essere prodotta digerendo il
DNA di un organismo con un enzima di restrizione e
quindi legando i frammenti senza separarli in molecole
di DNA plasmidico che sono state precedentemente tagliate con lo stesso enzima (vedi il Capitolo 5). Il risultato è un grande numero di plasmidi contenenti frammenti di restrizione diversi del DNA dell’organismo: una
libreria di DNA. Ci sono molti modi per produrre librerie e sottoporle a screening, ma l’idea di base è la stessa. L’esempio riportato sotto descrive un metodo per lo
screening di plasmidi in colonie batteriche.
Per trovare un plasmide contenente una specifica sequenza di DNA (per esempio di un particolare gene),
l’intera libreria è trasformata in un ospite, come l’Escherichia coli. I trasformanti sono piastrati su agar per produrre colonie singole, ognuna delle quali contiene un
plasmide particolare (con un inserto specifico derivato
dal DNA dell’organismo). Successivamente, le cellule di
ciascuna colonia sono trasferite su una membrana premendo leggermente la membrana su una piastra di agar
(la maggior parte di ogni colonia rimane sulla piastra).
In questo modo, la disposizione delle colonie si mantiene sulla membrana (Figura 16.1).
Ora le cellule devono essere lisate per esporre il DNA,
ed il DNA deve essere denaturato. Ciò si può ottenere in
un solo passaggio immergendo la membrana in una soluzione di detergente (per lisare le membrane della cellula) e di una base (per denaturare il DNA). La mem-
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Ibridazione,
lavaggio ed
autoradiografia
Trasferimento
Colonie su piastra
d’agar
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Membrana
Autoradiogramma
che mostra colonie positive
Figura 16.1 Ibridazione delle colonie.
brana viene quindi lavata, e le molecole di DNA a singolo filamento possono essere fissate ad essa mediante
riscaldamento o esposizione a luce ultravioletta.
La membrana con il DNA fissato a singolo filamento è
ora pronta per il passaggio di ibridazione. Essa è immersa
in una soluzione di ibridazione, alla quale si aggiunge
una sonda marcata a singolo filamento. La composizione della soluzione e le condizioni (in particolare la temperatura) di ibridazione vengono variate per adattarle all’esperimento. Dopo che è trascorso il periodo di ibridazione, la membrana è lavata ripetutamente in modo
da rimuovere la sonda non ibridata ma senza spezzare i
legami idrogeno tra la sonda ibridata ed il campione di
DNA (le condizioni di lavaggio possono anche essere regolate in modo da rimuovere la sonda non perfettamente
ibridata).
Si lascia asciugare la membrana e si rivela la presenza
della sonda. Nel caso di una sonda radioattiva, la membrana è messa su una lastra fotografica. Se la sonda radioattiva si ibrida con il DNA di una delle colonie trasferite sulla membrana, la regione della lastra in corrispondenza di quella zona della membrana sarà esposta
e diventerà scura dopo essere stata sviluppata. In questa
maniera, qualunque colonia che conteneva un plasmide
con sequenze di DNA complementari alla sonda apparirà come un punto nero sulla lastra. Il processo di esposizione della lastra per contatto con il campione radioattivo è chiamato autoradiografia, e l’“immagine” risultante è chiamata autoradiogramma, o “autorad” in breve (Figura 16.1). Per la rivelazione di sonde non radioattive, la
membrana è solitamente immersa in una serie di soluzioni. Una soluzione chiave solitamente contiene un enzima associato ad una molecola che si lega alla sonda
marcata. L’altra soluzione chiave contiene un substrato
dell’enzima, che una volta tagliato genera un prodotto
colorato o luminescente.
Nell’ultimo passaggio del processo, l’autoradiogramma è
allineato con la piastra originale dalla quale sono state
trasferite le colonie. I punti neri sull’autoradiogramma
(che rappresentano la sonda ibridata) corrisponderanno
a colonie specifiche. Le cellule di queste colonie dovrebbero contenere plasmidi con la sequenza di interesse. Per verificare che sia così, le colonie indicate sono
trasferite in colture separate, da cui si prepara il DNA plasmidico, di solito per sequenziarlo.
Ibridazione mediante Southern blot
Un’altra importante applicazione dell’analisi di ibridazione è l’analisi dei prodotti di una digestione di restrizione per determinare quali frammenti contengano una
certa sequenza di DNA o per determinare le dimensioni
di un frammento contenente una sequenza particolare.
Il metodo usato più comunemente per questo scopo consiste in un processo chiamato “Southern blot” seguito da
analisi di ibridazione. Applicazioni specifiche dell’ibridazione di un Southern blot possono essere trovate su
questo libro nelle lezioni sulle malattie genetiche e sul
fingerprinting del DNA.
Per iniziare l’analisi, il campione di DNA è digerito con
enzimi di restrizione ed i frammenti risultanti sono separati tramite elettroforesi su gel di agarosio in modo
standard. Sfortunatamente, non si può effettuare un’efficiente ibridazione su molecole di DNA incluse in agarosio. Nel 1975 un ricercatore di nome Southern pubblicò
un metodo per trasferire i frammenti da un gel di agarosio su una membrana in un modo che preservava la disposizione dei frammenti sul gel. Questo metodo è chiamato trasferimento di Souther n (Southern transfer) o
Souther n blot (Southern blotting).
Nel trasferimento di Southern, il gel di agarosio è immerso in una base per denaturare i frammenti di DNA.
Quindi il gel è posto su un lungo pezzo di carta assorbente le cui estremità sono sospese in un contenitore di
soluzione salina. La membrana viene posta direttamente
sul gel, ed una pila di carta assorbente asciutta (in genere si usano asciugamani di carta) è messa sulla membrana (Figura 16.2). La carta assorbente agisce come uno
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16 Rivelazione di sequenze specifiche di DNA
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Una volta che i frammenti denaturati di DNA sono stati
trasferiti sulla membrana, il metodo di ibridazione è esattamente quello descritto sopra per lo screening delle librerie. L’autoradiografia di un Southern blot mostra bande scure in corrispondenza delle bande nel gel che contenevano sequenze di DNA complementari alla sonda
(Figura 16.3).
Ibridazione in situ fluorescente
B
Figura 16.2 Assemblaggio di un Southern blot. (A) Lo studente
sta mettendo la membrana sopra al gel. (B) L’apparato completo di
trasferimento. La bottiglia sopra il vetro serve semplicemente da
peso.
stoppino, aspirando il fluido dal contenitore attraverso il
gel nella pila di carta asciutta. Questo processo è spinto
dall’azione capillare, proprio come avviene quando l’angolo di un foglio di carta è messo in un bicchiere di vetro. In alternativa si può essere usato un dispositivo che
usa corrente elettrica per spingere il DNA fuori dal gel.
In questo caso il metodo si chiama elettroblot.
Il fluido che migra verso l’alto attraverso il gel contiene
i frammenti di DNA denaturato. Quando i frammenti raggiungono la membrana sopra al gel, vi si attaccano e restano bloccati. L’apparato di stoppino, gel, membrana e
carta è preparato in modo che i frammenti di DNA siano trasferiti direttamente verso l’alto, esattamente nello
schema che era presente nel gel, e si attacchino alla
membrana esattamente con quello schema, duplicando
quello presente nel gel.
L’ibridazione con sonde marcate fluorescenti è utilizzata
per rivelare la posizione di specifiche sequenze di acido
nucleico in un metodo chiamato ibridazione in situ fluorescente (FISH). Nella FISH le sonde di acido nucleico
vengono ibridate con cromosomi intatti, cellule, o sottili sezioni di tessuto. La sonda legata è rivelata tramite microscopia a fluorescenza, che identifica la posizione della sequenza bersaglio. La disponibilità di cromofori di diversi colori (la porzione del marcatore che produce colore) rende possibile ibridare campioni con una miscela
di sonde in modo da visualizzare più di una sequenza in
un unico esperimento.
Fra le applicazioni della FISH visivamente più spettacolari ci sono la rivelazione di aspetti del cromosoma, quali i centromeri, i telomeri e specifiche sequenze ripetute
di DNA, ed un metodo chiamato ver niciatura del cromosoma (chromosome painting). Nella verniciatura del
cromosoma, le sonde che ibridano lungo un dato cromosoma sono tutte marcate con lo stesso cromoforo. Le
sonde sono preparate isolando il cromosoma bersaglio
ed usandolo come substrato per un’amplificazione di
PCR con inneschi casuali. Un singolo cromosoma può
essere microdissezionato, e pezzi del cromosoma dissezionato possono essere utilizzati per produrre sonde dirette verso singoli bracci o bande. Dopo l’applicazione
della sonda fluorescente sul campione, il resto del cromosoma è marcato con un colorante non specifico, quale il DAPI (4!,6!-diamidino-2-fenilindolo) (blu) o lo ioduro di propidio (rosso), in modo da rendere visibile l’intero cromosoma al microscopio.
La Tavola a colori 1 mostra esempi di FISH che usano
sonde per differenti aspetti del cromosoma. La Tavola a
colori 2 mostra un esempio nel quale una porzione del
cromosoma dell’erba della pampa (Thinopyrum intermedium) è stata traslocata nel genoma del grano (Triticum aestivum). I ricercatori che hanno effettuato l’esperimento illustrato stavano studiando la resistenza al virus
dell’orzo giallo nano, che attacca i raccolti di grano, avena ed orzo. L’erba della pampa è resistente ad alcuni ceppi del virus dell’orzo giallo nano, e i ricercatori della Purdue University hanno ricondotto la resistenza a uno dei
cromosomi dell’erba della pampa ed hanno introdotto
quel cromosoma nel genoma del grano. Poiché non è
auspicabile la presenza dell’intero cromosoma nel gra-
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Ibridazione,
lavaggio ed
autoradiografia
Trasferimento
di Southern
Gel colorato
Membrana
B
1
2
1
Autoradiogramma
che mostra i frammenti
di restrizione positivi
2
kb
5–
4–
3–
2–
no, i ricercatori stanno studiando linee di grano nei cui
cromosomi sono stati traslocati tratti dei cromosomi di T.
inter medium per identificare i più piccoli tratti di cromosoma traslocato che possono conferire resistenza al
virus. Nella tavola a colori, la FISH è stata usata per “verniciare” il segmento traslocato del cromosoma di T. inter medium. I cromosomi del T. aestivum sono stati controcolorati con ioduro di propidio.
Altri usi dell’ibridazione
L’ibridazione non è sempre usata come metodo analitico a sé. Essa svolge un ruolo cruciale in altri procedimenti di laboratorio, quali il sequenziamento del DNA
Figura 16.3 Analisi di ibridazione di Southern.
(A) Rappresentazione schematica. (B) Due corsie colorate di un gel
ed i risultati di un’ibridazione su quelle corsie. kb, dimensioni del
frammento in coppie di kilobasi.
e la reazione a catena della polimerasi (illustrata nelle
lezioni successive). Entrambi questi metodi utilizzano la
sintesi di DNA in vitr o tramite l’enzima DNA polimerasi. La DNA polimerasi deve avere un primer dal quale
iniziare la sintesi (vedi il Capitolo 7, Duplicazione del
DNA). In vitr o, il primer è solitamente un corto oligonucleotide sintetico ibridato con la molecola di DNA
stampo. Molto spesso, la molecola stampo inizia come
DNA a doppio filamento. Primer in eccesso è aggiunto
alla soluzione, che quindi viene scaldata a circa 100 °C
per denaturare lo stampo. Non appena la soluzione si
raffredda, i brevi primer ibridano con i filamenti dello
stampo.
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16 Rivelazione di sequenze specifiche di DNA
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Questo processo di ibridazione dei primer è il primo
passaggio sia nel sequenziamento del DNA che nella
reazione a catena della polimerasi. Come descritto in
una lezione successiva, la reazione a catena della polimerasi può essere utilizzata come tecnica analitica, e la
sua specificità è in realtà la specificità di ibridazione tra
i primer e il DNA stampo (vedi l’Esercitazione 17, La
PCR di carta).
Obiettivi
Dopo aver completato la parte I della lezione (Pescare
il DNA), gli studenti dovrebbero essere capaci di:
1 . Definire l’ibridazione.
2. Descrivere come il DNA a singolo filamento possa essere usato per rivelare una sequenza di DNA di interesse.
Dopo aver completato le parti II e III, gli studenti dovrebbero essere capaci di:
3. Descrivere come usare una sonda di DNA e l’analisi
di restrizione per determinare quale frammento di restrizione di una data molecola contenga una sequenza di interesse.
4. Avendo a disposizione una sequenza di una sonda e
la sequenza di una molecola bersaglio, prevedere
quali frammenti di restrizione del bersaglio si ibrideranno con la sonda.
Materiali
Parte I. Pescare il DNA
•
•
•
Esercitazione Parte I. Pescare il DNA
Foglio di lavoro 16.I
Forbici
Parte II. Combinazione di analisi di restrizione
ed ibridazione
•
•
Esercitazione Parte II. Combinazione di analisi di restrizione e ibridazione
Fogli di lavoro 16.I e 16.II
Nastro adesivo
•
Foglio di lavoro 16.III
•
Parte III. Ibridazione di Southern
Preparazione
Fate qualunque fotocopia o stampa necessaria dal sito
e-cathedra.
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Procedimento
Parte I. Pescare il DNA
1 . Ricordate ai vostri studenti quanto è grande la molecola di DNA di ogni organismo. Se avete svolto l’Esercitazione 9 Dimensioni del genoma umano e di E.
coli, riprendete i modelli in scala del cromosoma e
del gene di E. coli. Mostrate alla classe i modelli del
cromosoma e del piccolo gene, e ponete agli studenti
il problema di sapere se una particolare sequenza di
DNA, come un dato gene, è presente in un’enorme
molecola, come il cromosoma batterico. Sequenziare l’intero cromosoma sarebbe la risposta, ma non è
pratico; richiederebbe molto tempo e costerebbe
molto denaro.
2. Fate leggere agli studenti la lettura a p. 209 in Pescare
il DNA e svolgete l’esercitazione. Può essere d’aiuto
riprendere il vostro modello di DNA per mostrare alla classe il DNA a singolo filamento. Date loro tante
informazioni aggiuntive sull’ibridazione quante ritenete appropriato. Discutete le domande.
Pescare il DNA è un’introduzione sufficiente all’ibridazione per gli studenti meno esperti.
Parte II. Combinazione di analisi di restrizione
e ibridazione
Dopo aver completato Pescare il DNA, fate leggere agli
studenti Combinazione di analisi di restrizione ed ibridazione a p. 211 e svolgete l’esercitazione. Date loro tutte le informazioni riguardanti il Southern blot che giudicate appropriate. Una classe avanzata dovrebbe essere
capace di completare le Parti I e II nel corso di una lezione in classe.
Parte III. Ibridazione di Southern
Il Foglio di lavoro dell’ibridazione di Southern può essere svolto in classe o come compito a casa. Esso mostra
come l’ibridazione di Southern possa essere utilizzata per
mappare la posizione di un gene.
! Risposte alle domande per gli studenti
– Parte I. Pescare il DNA
1. L’ibridazione del DNA è l’appaiamento di basi complementari tra due molecole di DNA per formare una
doppia elica.
2. Gli studenti dovrebbero descrivere l’uso di sonde per
trovare una specifica sequenza di DNA in un campione.
3. Assicuratevi che gli studenti abbiano il corretto orientamento dal 5! al 3! – dal momento che la sequenza
scritta è dal 5! al 3!, la sequenza della risposta dovrebbe essere dal 3! al 5! (tralasciate questa richiesta
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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per gli studenti più giovani se pensate che sia troppo specifica).
– Parte II. Combinazione di analisi di
restrizione e ibridazione
1. La striscia di DNA è tagliata in sei pezzi di 93, 18, 83,
47, 65, e 73 coppie di basi (bp); la sonda ibrida con
il frammento di 65 bp.
Effettuate l’analisi di ibridazione di Southern su un
campione di DNA di virus, usando la sonda per il gene desiderato. Questa analisi mostrerà che il frammento di restrizione contiene il gene di interesse. Digerite un secondo campione di DNA di virus, effettuate l’elettroforesi e la colorazione e quindi ritagliate il corretto frammento dal gel e purificatelo per il
clonaggio.
– Parte III. Ibridazione di Southern
Pr oblema A
1. Controllate che i disegni degli studenti siano marcati correttamente.
2. Il gene della DNA polimerasi si trova nella regione dove si sovrappongono il frammento BamHI di 10 500
bp ed il frammento EcoRI di 5500 bp.
3. Dal momento che l’intero gene della DNA polimerasi è stato usato come una sonda e non ha ibridato né
con il frammento BamHI di 7500 bp né con il frammento EcoRI di 4000, l’intero gene della DNA polimerasi del virus X è probabilmente all’interno dell’area indicata, né alla destra del sito EcoRI né alla si-
Gel di elettroforesi marcato
BamHI
HindIII
16 000
*
*
8000
*
4000
2000
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nistra del sito BamHI. Ovviamente, c’è ancora qualche incertezza, dal momento che non sappiamo
quanto i due geni siano veramente simili, ma non è
necessario discutere questa sottigliezza in classe a
meno che il problema non venga sollevato dagli studenti.
4. Il punto di questa domanda è che gli studenti si rendano conto che le proteine che svolgono la stessa funzione in organismi differenti spesso hanno sequenze
amminoacidiche e di DNA molto simili. Solitamente
più gli organismi sono correlati strettamente, più la somiglianza è pronunciata. Spesso è perciò efficace usare un gene noto per cercare un gene che codifica lo
stesso genere di proteina in un organismo differente.
Pr oblema B
Osservate il diagramma sottostante.
Laboratori pratici di ibridazione
L’analisi di ibridazione non è difficile da eseguire, ma richiede diversi passaggi in più (periodi extra di laboratorio) rispetto all’analisi di restrizione, e dovete fare attenzione. I passaggi extra richiedono anche materiali e soluzioni extra.
Se avete familiarità con l’analisi di ibridazione e sapete
quello che state facendo, vi raccomandiamo un sistema
di marcatura/rivelazione come il kit “Genius” della Boeh-
Risultati di un’analisi di ibridazione
BamHI
Dimensioni, bp
24 000
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*
*
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16 Rivelazione di sequenze specifiche di DNA
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ringer Mannheim per marcatura e rivelazione non radioattiva della vostra sonda. Se comprate questo kit, avrete ancora da preparare diverse soluzioni.
Se non avete esperienza di analisi di ibridazione, ma
volete comunque provarla nella vostra classe, vi raccomandiamo fortemente di prendere un kit per l’intera
esercitazione. La Carolina Biological Supply Company
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offre un kit di ibridazione di Southern del DNA, n. di
catalogo 21-1215, che utilizza un sistema di rivelazione
biotina-avidina. Alla vostra classe serviranno diversi
giorni per completare l’esercitazione, e gli studenti dovranno seguire le istruzioni con attenzione. Questo kit
è stato preparato in modo da dover preparare solamente alcune soluzioni combinando e diluendo i materiali forniti.
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La reazione a catena
della polimerasi
Descrizione dell’esercitazione
a p. 214
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è diventata un
mezzo importante di ricerca nel campo della biologia molecolare e nelle applicazioni biotecnologiche. La maggior
parte degli studenti di qualsiasi livello non comprende il
meccanismo della PCR finché non ne esamina attentamente tutti i passaggi, facendo dei disegni o manipolando dei modelli. Nell’esercitazione, gli studenti usano modelli di carta per simulare i passaggi della PCR. L’esercizio
con il modello dimostra come la DNA polimerasi possa
essere utilizzata per fare molte copie di un frammento specifico di DNA e mostra come la tecnica possa essere utilizzata per rivelare una molecola specifica di DNA (come
un cromosoma di un microrganismo che causa una malattia) in un campione. Gli studenti dovrebbero aver svolto entrambe le esercitazioni del Capitolo 7, La Duplicazione del DNA, ed essere stati introdotti all’ibridazione prima di svolgere questa esercitazione.
Le Figure 17.1 e 17.2 si trovano nell’esercitazione.
Lezioni richieste: da 1 a 2
Introduzione
La PCR è diventata una tecnica standard nella ricerca, in
medicina legale e in clinica. Questa tecnica ingegnosa
permette di produrre molte copie da una singola copia
di un segmento specifico di DNA ed è estremamente utile come metodo di rivelazione e come strumento di clonaggio. La PCR può essere utilizzata per rivelare patogeni in campioni di tessuto, per amplificare DNA raro
(come da piccole macchie di sangue) in modo da poterlo analizzare, o anche per studiare DNA antico da
campioni di museo. Anche il sequenziamento automatico del DNA si basa sulla tecnologia della PCR (vedi il Capitolo 18).
La PCR è una tecnica semplice che combina sintesi del
DNA in vitr o ad opera di una DNA polimerasi ed ibridazione. Essa richiede una soluzione contenente un
campione di partenza, due primer (molte molecole di
ognuno), un enzima DNA polimerasi e nucleotidi liberi. I primer sono brevi frammenti di DNA a singolo fi-
lamento, di norma lunghi dalle 15 alle 20 basi. Un primer della coppia si ibrida con uno dei due filamenti del
DNA del campione ad una delle estremità del frammento che deve essere amplificato. Primer in grande
eccesso sono mescolati con il DNA del campione. Per
iniziare la reazione, il DNA a doppio filamento del campione presente nella miscela viene denaturato in singoli filamenti scaldandolo (solitamente a 95 °C). La miscela viene quindi raffreddata in modo che possa avvenire l’ibridazione dei filamenti complementari. Poiché i primer sono in grande eccesso, una molecola di
primer si appaierà ad ogni singolo filamento prima che
i filamenti del campione di DNA possano appaiarsi fra
loro (Figura 17.1).
Nel passaggio successivo, l’enzima DNA polimerasi sintetizza un secondo filamento di DNA su ciascuno dei due
filamenti originali, utilizzando i nucleotidi liberi nella soluzione. Il primer ibridato serve da punto di partenza (Figura 17.1). Il nuovo DNA è sintetizzato dall’estremità 3!
di ogni primer, estendendosi solamente in una direzione. Il risultato sono due eliche dove prima ce n’era solo
una. (Gli enzimi DNA polimerasi devono avere un’estremità 3! dalla quale iniziare a sintetizzare e possono
aggiungere nucleotidi solamente in una direzione; vedi
il Capitolo 7, Duplicazione del DNA.)
Il processo di denaturazione, ibridazione e sintesi viene
quindi ripetuto, producendo quattro eliche. Ulteriori cicli ne producono 8, poi 16, poi 32, e così via. Una tipica PCR richiede dai 25 ai 40 cicli di amplificazione. Quasi tutte le nuove molecole di DNA hanno i primer come
estremità e sono della stessa lunghezza.
Nei primi impieghi di PCR si doveva aggiungere nuova
DNA polimerasi dopo ogni ciclo di denaturazione, poiché l’alto calore necessario per la denaturazione distruggeva l’enzima. Ora, invece, i ricercatori hanno purificato un enzima DNA polimerasi da un batterio che vive in sorgenti bollenti (Ther mus aquaticus). Questo enzima, la Taq polimerasi, resta attivo dopo essere stato riscaldato a 95 °C e non richiede di essere aggiunto dopo
ogni ciclo di denaturazione. La Taq polimerasi ha reso
semplice automatizzare la PCR: tutto ciò che serve è un
apparecchio per riscaldare con cicli di temperatura programmabili. “Le macchine da PCR”, chiamate ciclatori ter-
73
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17 La reazione a catena della polimerasi
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mici, sono diventate parte dell’equipaggiamento standard
di un laboratorio.
La PCR può produrre abbastanza DNA, anche da una piccola quantità di stampo, da essere visibile in un gel dopo elettroforesi. I biotecnologi spesso usano questa tecnica per produrre molte copie di un segmento di DNA
da clonare. La PCR è anche usata nella tipizzazione del
DNA (vedi il Capitolo 27), e poiché il processo della PCR
dipende dall’appaiamento specifico delle basi dei primer
con il DNA stampo, la PCR può essere usata come mezzo diagnostico.
Nella diagnosi basata su PCR, i primer sono scelti in modo che ibridino solamente con una porzione specifica
del DNA dell’organismo bersaglio o che la distanza tra i
siti di ibridazione dei primer sia peculiare del bersaglio.
Per determinare se è presente l’organismo bersaglio, si
effettua la PCR sul campione. Se nessun DNA del campione può ibridare con i primer, non sarà sintetizzato alcun prodotto specifico di PCR. D’altro canto, se il DNA
bersaglio desiderato è presente, ci sarà un unico prodotto
che rappresenta il segmento tra i siti di ibridazione dei
primer. Poiché la PCR produce così tante copie del segmento, il prodotto di DNA può essere facilmente rivelato con vari metodi, che includono l’elettroforesi su gel di
agarosio e la semplice colorazione.
I vantaggi della PCR come mezzo diagnostico sono la
specificità conferita dall’appaiamento delle basi dei primer alla sequenza bersaglio e la capacità della PCR di
amplificare DNA rari. L’amplificazione permette di rivelare minuscole quantità di DNA specifico. In molti campioni clinici, l’organismo che causa la malattia è presente in quantità molto ridotte. La PCR può rivelare la presenza di questi organismi senza doverli fare crescere in
coltura. La PCR permette anche l’uso di campioni molto
piccoli. Questo vantaggio ha reso la PCR un mezzo preziosissimo nello studio di antichi campioni di DNA. I ricercatori possono usare piccoli campioni di materiale da
museo per produrre sufficiente DNA per l’analisi, preservando essenzialmente intatto il campione originale.
Poiché i prodotti della PCR non sono solitamente progettati per essere più lunghi di 2000 bp circa, la PCR funziona bene anche sui campioni nei quali il DNA è andato incontro a una notevole frammentazione. (Per maggiori informazioni sull’uso della PCR nello studio di campioni antichi, vedi le Letture scelte.)
La PCR può anche essere utilizzata per determinare la
quantità di una specifica sequenza nucleotidica (DNA o
RNA) presente in un campione misto. Un approccio a
questa “PCR quantitativa” utilizza un colorante che emette fluorescenza quando si lega all’acido nucleico a doppio filamento. Man mano che il prodotto a doppio fila-
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mento si accumula, viene legato in proporzione più colorante, ed aumenta il segnale fluorescente. La velocità
di accumulo del prodotto è proporzionale alla quantità
di stampo presente nel campione.
Più avanti troverete un’esercitazione di PCR su carta che
potete fare con i vostri studenti. Sebbene i primer delle
PCR reali siano lunghi almeno 15 nucleotidi (per fornire
una maggiore specificità), i primer di carta sono lunghi
solamente 5 nucleotidi. Inoltre, i segmenti amplificati dalla PCR sono lunghi solitamente centinaia di nucleotidi,
mentre questa esercitazione amplifica un frammento corto. Comunque, questo modello su carta spiega molto accuratamente i passaggi della PCR e mostra come un segmento specifico di DNA possa essere amplificato a partire da una copia singola. La seconda parte dell’esercitazione illustra come la PCR viene usata come strumento
diagnostico.
Obiettivi
Dopo questa lezione gli studenti dovrebbero essere capaci di:
1 . Descrivere i passaggi della PCR e spiegare come questi passaggi possono generare molte copie di un frammento specifico di DNA.
2. Descrivere come la PCR può essere utilizzata nella
diagnosi di una malattia.
Materiali
•
•
•
•
•
•
Strisce di carta colorata chiara e scura (almeno otto
di ognuna per gruppo di studenti)
Nastro rimovibile (un rotolo per gruppo)
Forbici (un paio per gruppo)
Una molecola di DNA parentale “a doppio filamento” per gruppo (Foglio di lavoro 17.1)
Una pagina di “campione 1” e di “campione 2” per
gruppo (Foglio di lavoro 17.3)
Una copia per ogni studente delle domande per gli
studenti
Risorse per l’insegnamento
La Carolina Biological Supply Company produce una videocassetta, n. di catalogo 21-2734, contenente una dimostrazione di questa esercitazione. La dimostrazione e
l’allegata spiegazione della PCR richiedono circa 20 minuti. La seconda metà della videocassetta dimostra l’amplificazione manuale della PCR descritta più avanti (vedi sotto La PCR in classe).
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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Preparazione
3!
Tagliate strisce di carta chiara e scura circa della larghezza dei modelli del primer e dello stampo. Stampate
tante copie dei Fogli di lavoro 17.1 e 17.2 con le sequenze del DNA parentale e dei primer quante richieste
dalla vostra classe. Per la parte dell’esercitazione che illustra l’uso della PCR nella diagnosi di una malattia, fate abbastanza fotocopie per la vostra classe del Foglio di
lavoro 17.3 (o fate dei lucidi).
Procedimento
1. La PCR
Riferitevi alle Figure dalla 17.3 alla 17.8.
Ogni gruppo di studenti ha una molecola di DNA parentale, primer e strisce di carta colorata che rappresenteranno DNA appena sintetizzato (queste strisce sono in
qualche modo analoghe ai nucleotidi liberi nella soluzione). Non c’è niente che rappresenti la DNA polimerasi in questo modello; la “sintesi” del DNA sarà effettuata dagli studenti (Figura 17.3).
– Passaggio 1. Denaturazione
Questo è il passaggio a 95 °C. Gli studenti dovrebbero
denaturare il loro DNA a doppio filamento in due filamenti singoli rimuovendo il nastro che tiene uniti i filamenti.
– Passaggio 2. Ibridazione
La temperatura viene ridotta, e l’ibridazione può avvenire. Poiché ci sono così tanti primer nella soluzione, essi
ibridano col DNA parentale prima che i due filamenti parentali possano ibridare fra loro (possibilmente, gli studenti dovrebbero avere molti di più di otto primer di ogni
colore sui loro banchi). Gli studenti dovrebbero “ibrida-
3!
T CG A A
5! 5! C C C G G
3!
5! C C C G G
3!
5!
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3!
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5!
5! C C C G G
ATGCTGGGCCACAGTTTCAATCGAATCAGT
TACGACCCGGTGTCAAAGTTAGCTTAGTCA
5! C C C G G
3!
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3!
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3!
3!
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3!
3!
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5! C C C G G
T CG A A
5!
3!
5!
3!
5!
3!
5!
Figura 17.3 Stampo di partenza e primer per la PCR di carta. Le
strisce di carta colorata non sono mostrate.
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A T G C T G G G C C A C A G T T T C A A T C G A A T C A G T 5!
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3!
5! T A C G A C C C G G T G T C A A A G T T A G C T T A G T C A
3!
T CG A A 5!
3!
Figura 17.4 PCR di carta. I primer ibridano con i filamenti di
stampo denaturati.
re” i primer con i lunghi filamenti di DNA facendo appaiare le sequenze del primer alle loro sequenze complementari ed attaccare in posizione i primer con un pezzo di nastro. Assicuratevi che gli studenti ibridino i primer nel corretto orientamento: se il filamento parentale
è orientato con l’estremità 5! sulla sinistra, l’estremità 3!
del primer deve essere sulla sinistra. Non è importante
se le lettere sono capovolte! I filamenti reali di DNA sono avvolti in un’elica. Dato il modo in cui sono stati progettati i primer, un primer scuro dovrebbe sempre ibridarsi con un filamento chiaro di DNA (Figura 17.4).
– Passaggio 3. Sintesi del DNA
Gli studenti “sintetizzeranno” il DNA attaccando col nastro un’estremità di una striscia di carta colorata chiara
all’estremità 3! del primer chiaro che è ibridato con il singolo filamento scuro. La striscia di carta colorata chiara
(il nuovo filamento di DNA) deve estendersi fino all’estremità dello “stampo” di DNA parentale, e quindi si deve ritagliare la carta eccedente. Il nuovo filamento di
DNA colorato chiaro deve essere attaccato con nastro al
suo filamento complementare scuro per rappresentare la
nuova molecola di DNA a doppio filamento. Infine, gli
studenti devono scrivere la corretta sequenza di DNA sul
nuovo filamento, iniziando dall’estremità 3! del primer.
Seguite lo stesso procedimento con il primer scuro che
ibrida con il filamento di colore chiaro, e sintetizzate un
nuovo filamento scuro.
Dopo un “ciclo” di sintesi, ci saranno due molecole di
DNA a doppio filamento [un’estremità di ognuna sarà diseguale (Figura 17.5)].
Ora ripetete i passaggi da 1 a 3 con le due molecole di
DNA. Notate: i primer che “hanno iniziato” la sintesi dei
filamenti nel precedente ciclo fanno ora parte dei nuovi
filamenti di DNA e devono essere usati come parte dei
nuovi stampi (Figura 17.6). I prodotti saranno quattro
molecole a doppio filamento (Figura 17.7). Notate come
stanno cambiando le lunghezze dei nuovi filamenti.
Ripetete i passaggi da 1 a 3 ancora una volta. Questa ripetizione produce otto molecole a doppio filamento, due
17 La reazione a catena della polimerasi
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3!
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ATGCTGGGCCACAGTTTCAATCGAATCAGT
5' C C C G G T G T C A A A G T T A G C T T A G T C A
5!'
3!
5! T A C G A C C C G G T G T C A A A G T T A G C T T A G T C A
3!
A T G C T G G G C C A C A G T T T C A A T C G A A 5!
3!
Figura 17.5 PCR di carta, prodotti del primo ciclo di sintesi del
DNA. Notate che i primer fanno parte dei filamenti di DNA del
prodotto. La sequenza delle basi dei filamenti del prodotto è stata
scritta sulle strisce di carta.
A T G C T G G G C C A C A G T T T C A A T C G A A T C A G T 5!
5! C C C G G
3!
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T C G A A 5!
3!
5' C C C G G T G T C A A A G T T A G C T T A G T C A
3!
5! C C C G G 3!
A T G C T G G G C C A C A G T T T C A A T C G A A 5!
3!
3!
Figura 17.6 PCR di carta, ibridazione per il secondo ciclo di
sintesi del DNA. Non è importante che le lettere su alcuni dei
filamenti siano capovolte.
3!
A T G C T G G G C C A C A G T T T C A A T C G A A T C A G T 5!
5! C C C G G T G T C A A A G T T A G C T T A G T C A
3!
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5! C C C G G T G T C A A A G T T A G C T T A G T C A
delle quali si estendono solamente da un primer all’altro
(Figura 17.8; notate i due prodotti con estremità pari che
si estendono tra i siti di ibridazione dei primer).
Chiedete ai vostri studenti di prevedere i prodotti di un
altro ciclo di sintesi. I prodotti previsti possono essere
disegnati su carta o sulla lavagna o fatti con materiali di
carta. (Se fate eseguire agli studenti un altro ciclo di sintesi su carta, essi avranno bisogno di otto strisce di carta aggiuntive chiare e scure, oltre a otto primer in più
chiari e scuri.) Ci saranno 16 molecole, e 8 di esse saranno di tipo corto. Un altro ciclo produrrà 32 molecole, 22 delle quali saranno di tipo corto. Un sesto ciclo
di sintesi produce 64 eliche, 52 delle quali sono corte.
Al termine del procedimento il numero di molecole con
le sequenze dei primer alle loro estremità aumenta
enormemente, formando la grande maggioranza dei
prodotti.
È importante che gli studenti capiscano che i prodotti
della PCR sono quasi tutti identici e che sono segmenti
di DNA a doppio filamento che iniziano e finiscono con
le sequenze dei due primer.
2. Analisi del DNA con la PCR
TACGACCCGGTGTCAAAGTTAGCTTAGTCA
5! T A C G A C CC G G T G T C A A A G T T A GC T T A G T C A
3!
T C G A A 5!
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3!
Dite ai vostri studenti di prendere le sequenze del DNA
dei campioni 1 e 2 e dei primer. Fate loro ritagliare i primer. La sequenza di DNA in ogni campione rappresenta una molecola singola che inizia con la riga di sopra e
continua lungo la riga di sotto. Spiegate agli studenti che
i fogli di campione rappresentano DNA preparati da due
diverse fonti. Se pensate che sia una buona idea, fate ritagliare agli studenti le strisce ed attaccatele insieme con
il nastro in ordine dalla prima all’ultima. (In questo caso, avranno bisogno di nastro adesivo, ed è importante
che le strisce vengano unite nell’ordine corretto.) Gli studenti sono tecnici di laboratorio, ed eseguiranno la PCR
su entrambi i campioni, utilizzando i primer forniti. Essi
devono supporre di avere grandi quantità di primer.
Fate prevedere agli studenti le sequenze di DNA dei prodotti principali delle due reazioni separate.
Il prodotto del campione 1 è il seguente (le sequenze dei
primer sono sottolineate):
3!
3!
5' C C C G G T G T C A A A G T T A G C T T
3!
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AAGGTCGGTCTCAGAGCCTTGATCGGAATAC
3!
Figura 17.7 PCR di carta, prodotti del secondo ciclo di sintesi
del DNA.
Non c’è nessun prodotto del campione 2; i primer non
ibridano.
Gli studenti noteranno che “c’è qualcosa di sbagliato” nel
campione 2 e che i primer non si ibridano da nessuna
parte. Fateli discutere su questo punto. Chiedete loro co-
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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3!
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Figura 17.8 PCR di carta, prodotti del terzo ciclo di sintesi del
DNA. Questi prodotti includono le prime molecole di quello che
sarà il prodotto principale di molti cicli di sintesi: i corti prodotti che
si estendono esattamente da un primer all’altro. Queste molecole
sono la terza della colonna di sinistra e la seconda della colonna di
destra.
sa vedrebbero se effettuassero semplicemente le reazioni sui due campioni e quindi caricassero i prodotti su un
gel e li sottoponessero ad elettroforesi e li colorassero.
(Vedrebbero una banda di prodotto nella corsia del campione 1 ma nessuna nella corsia del campione 2.) Chiedete loro se pensano che sarebbe possibile utilizzare la
PCR per determinare se uno specifico microrganismo sia
presente in un campione o se uno specifico gene sia presente in un organismo.
2. Preparate dei primer lunghi. Più lungo è il primer,
Spiegate alla classe che la PCR può essere usata per rivelare la presenza di microrganismi che causano una malattia in campioni clinici. Il DNA è preparato da un campione preso dal paziente (sangue, tessuto, saliva ecc.), e
la PCR viene effettuata con primer che ibridano solamente
con il DNA del microrganismo di interesse. I tecnici di laboratorio possono quindi stabilire se il microrganismo è
presente nel campione osservando la presenza di un prodotto di DNA. Questo genere di test può essere usato
nella diagnosi delle malattie.
Fate rispondere gli studenti alle domande (in classe o come compito a casa).
!Risposte alle domande per gli studenti
1.
Dovrebbe conoscere la sequenza del DNA del virus
abbastanza da progettare primer che ibridino con
quel DNA. Dovrebbe fare delle prove per assicurarsi che quei primer non si ibridino con DNA umano
o con campioni preparati da pazienti sani (che potrebbero contenere piccole quantità di DNA di altri
microrganismi). Potrebbe utilizzare confronti al computer di sequenze di DNA per qualcuno dei primer
progettati (per assicurarsi che la sequenza del primer
non sia presente in nessun organismo noto eccetto
che nel virus X).
meno probabilmente si ibriderà accidentalmente con
altre molecole di DNA, dal momento che le probabilità che una data sequenza di basi capiti casualmente sono 4n, dove n è il numero di basi della sequenza (vedi il Capitolo 16).
3. 2n.
4. 2n.
5. No. Con un primer solamente, sareste sempre limitati alla sintesi di un filamento, e non potreste mai sintetizzare il filamento complementare. Dopo un ciclo,
avreste un nuovo filamento singolo. Per il secondo
ciclo, avreste ancora solamente uno stampo per il primer, e potreste produrre solamente un altro nuovo
singolo filamento, e così via.
La PCR in classe
Se non avete un ciclatore termico
In teoria, si potrebbe eseguire una PCR senza un ciclatore termico. Nei primi tempi della PCR, tali strumenti
non esistevano, e tutte le PCR venivano fatte manualmente. Avrete bisogno di tre bagni a temperatura costante impostati alle temperature specificate nel procedimento. In realtà, la maggior parte delle PCR sarebbe
molto noiosa da effettuare per gli studenti. Le reazioni
richiedono in genere 30 cicli di circa 3 minuti. Se sono
molto disciplinati, motivati e poco distratti, gli studenti
possono ottenere dei risultati accettabili.
Alcune PCR si adattano meglio al ciclo manuale di altre. La Carolina Biological Supply Company vende il
materiale per una semplice PCR manuale in classe. Essa richiede due bagni, uno bollente e l’altro impostato
a 55 °C. Sono incluse le istruzioni per il docente e per
gli studenti.
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17 La reazione a catena della polimerasi
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Dovete fornire l’equipaggiamento di elettroforesi per separare i prodotti. Questo kit dimostrativo è stato specificamente progettato per lavorare nelle condizioni non
ideali di due bagni. Il sistema a due bagni non darà prodotti rilevabili con kit che richiedono un ciclatore termico.
Se avete un ciclatore termico
Il kit dell’esperimento menzionato sopra, che è progettato per l’insegnamento, può essere utilizzato con un ciclatore termico.
© 978-88-08-06411-0
Letture scelte
Mullis, K. B. 1990. The unusual origin of the polymerase
chain reaction. Scientific American 262:56-65. [Tr ad. it.:
“La scoperta della reazione a catena della polimerasi”, Le
Scienze, febbraio 1990 Milano.]
Paabo, S. 1993. Ancient DNA. Scientific American 269:86-92.
[Tr ad. it.: “Antichi DNA”, Le Scienze, gennaio 1994
Milano.]
Poinar, G. 1999. Ancient DNA. American Scientist 87:446457.
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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Sequenziamento del DNA
Descrizione dell’esercitazione
a p. 218
In questa lezione, simulazioni con carta e graffette sono
utilizzate per illustrare i più comuni metodi di sequenziamento del DNA. Sono mostrati due approcci, entrambi basati sulla stessa biochimica. La differenza è che uno
impiega una DNA polimerasi resistente al calore in una
variante della reazione a catena della polimerasi (PCR)
(“sequenziamento ciclico”), mentre l’altra utilizza una regolare DNA polimerasi in un singolo ciclo di reazioni
(“approccio originale”). L’approccio originale è quello
che è stato presentato nella prima e nella seconda edizione di questo libro, e rispecchia il sequenziamento enzimatico del DNA così come è stato pubblicato la prima
volta. Abbiamo aggiunto la simulazione del sequenziamento ciclico poiché al momento è il metodo di sequenziamento più diffuso. Entrambe le versioni dell’esercitazione illustrano comunque i principi del sequenziamento basato sulla DNA polimerasi. Se avete dei modelli a palline per il DNA, potete usarli al posto della carta e delle graffette.
Lezioni richieste: da 1 a 2
Background
I metodi più comunemente utilizzati per sequenziare il
DNA su piccola scala impiegano composti chiamati terminatori di catena, sostanze chimiche che interrompono specificamente l’allungamento di un nuovo filamento di DNA ad opera della DNA polimerasi. Per le informazioni di base sul funzionamento del metodo di terminazione della catena del sequenziamento del DNA,
leggete l’introduzione all’Esercitazione 18.
Il metodo di sequenziamento con i dideossinucleotidi
è illustrato nel modo più semplice nell’esercitazione
successiva. Se non siete sicuri di come il metodo funzioni, provate prima l’esercitazione. Nell’esercitazione,
la vostra classe “sequenzierà” un pezzo di DNA. Gli studenti sintetizzeranno un filamento di DNA basato su
uno stampo di carta utilizzando graffette colorate per
rappresentare i nuovi nucleotidi. I dideossinucleotidi
sono rappresentati dai colori. I risultati dell’intera classe saranno messi insieme e “fatti correre” simbolica-
mente in un gel di sequenza. Questa esercitazione non
solo illustra il metodo di sequenziamento del DNA, ma
riprende le regole dell’appaiamento delle basi, il meccanismo della sintesi del DNA da parte della DNA polimerasi, ed il principio della separazione elettroforetica per dimensioni.
Diversi terminatori di catena sono usati anche come farmaci antivirali. La lettura alla fine di questo capitolo spiega come funzionano i terminatori per combattere il virus
dell’immunodeficienza umana e il virus dell’herpes.
Sequenziamento ciclico
Anche il sequenziamento ciclico usa il metodo dideossi
per determinare la sequenza. In questo caso, la DNA polimerasi è la Taq polimerasi utilizzata nella PCR, e le reazioni di sequenza si basano su cicli termici, come nella
PCR. Una differenza importante tra il sequenziamento ciclico e la PCR è che nel sequenziamento ciclico è presente solamente un primer invece della coppia utilizzata per l’amplificazione del DNA. Poiché è presente solo
un primer, solo un filamento della molecola di DNA parentale viene usato come stampo.
L’approccio più comune al sequenziamento ciclico usa
dideossinucleotidi marcati, ognuno dei quali (A, G, C e
T) è marcato con un colorante fluorescente di colore diverso (per esempio, A è verde, G è viola, T è rosso e C
è giallo). Con questo sistema di marcatura, una molecola che termina con una dideossiadenosina (ddA) ha attaccato un colorante fluorescente verde, una che termina con una C ha un colorante giallo, ecc. Nel sequenziamento ciclico, i dideossinucleotidi A, G, C e T sono
aggiunti in una singola provetta di reazione.
Durante il sequenziamento ciclico, la polimerasi sintetizza nuovo DNA complementare solamente ad un filamento finché non incorpora un terminatore. Il passaggio
di denaturazione della PCR separa i filamenti, e quindi
avviene il secondo ciclo di sintesi. Viene usato lo stesso
filamento stampo, poiché è stato aggiunto solo un primer, così i prodotti del secondo ciclo sono identici ai prodotti del primo ciclo ad eccezione del fatto che il nucleotide terminatore potrebbe essere incorporato in po-
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18 Sequenziamento del DNA
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sizioni differenti. Ogni ciclo successivo di sintesi è uguale, il risultato è l’accumulo di una popolazione di molecole figlie a singolo filamento, tutte identiche ad eccezione del fatto che terminano in posizioni differenti con
un terminatore fluorescente il cui colore corrisponde all’identità della base. L’approccio con i coloranti fluorescenti potrebbe essere utilizzato con DNA polimerasi che
non sono resistenti al calore, ma l’uso di cicli multipli di
sintesi di DNA permette l’accumulo, a partire dalla stessa quantità di stampo, di un numero maggiore di molecole figlie marcate. I cicli multipli assicurano che vengano prodotte quantità rilevabili di molecole figlie che terminano in corrispondenza di ciascuna posizione nucleotidica estendendosi per diverse centinaia di coppie
di basi dal 3! dei primer.
I prodotti vengono caricati in una singola corsia di un
gel all’interno di uno strumento che include un laser ed
un fotorivelatore posizionato sul fondo del gel. Man mano che i frammenti di DNA migrano verso il basso, attraversano il raggio laser uno alla volta. Il raggio laser eccita la molecola di colorante fluorescente, facendole
emettere luce del suo colore caratteristico (verde per A,
blu per C, ecc.). Il fotorivelatore rivela il colore (lunghezza d’onda) della fluorescenza emessa, che identifica la base di terminazione in quella posizione. Il risultato di un sequenziatore automatico è un grafico generato dal computer che mostra una serie di picchi di differenti colori, insieme alla sequenza determinata di DNA.
I picchi corrispondono alle diverse lunghezze d’onda della luce emessa da ciascun frammento di DNA che passa
attraverso il fotorivelatore. Un programma traduce la sequenza di picchi in sequenze di basi che vengono conservate in archivi di dati che possono essere trasferiti in
programmi bioinformatici per l’analisi.
quenziare simultaneamente dozzine di molecole diverse
di stampo clonato, con pochissimo lavoro per stampo. Il
sequenziamento ha fatto molta strada da quando gli studenti leggevano i propri gel di sequenziamento, muovendosi con attenzione lungo la lastra a raggi X utilizzando un righello per assicurarsi di leggere le bande nel
giusto ordine, registrando la sequenza a mano e quindi
copiandola con cura sul computer.
Obiettivi
Dopo questa lezione, gli studenti dovrebbero essere capaci di:
1 . Spiegare cos’è un terminatore di catena e perché provoca il blocco della sintesi del DNA.
2. Spiegare come sono usati i terminatori di catena per
rivelare la sequenza di basi di una molecola di DNA.
3. Leggere una sequenza di DNA da un gel di sequenza.
4. Spiegare le somiglianze e le diversità fra il sequenziamento ciclico e la PCR.
Materiali
•
•
Centri di sequenziamento del DNA
Negli anni ’80 e nei primi anni ’90, il sequenziamento del
DNA era solitamente effettuato da singoli ricercatori nei
loro laboratori. Da quel momento, spronati in larga misura dai progressi e dalla crescente enfasi sulla genomica, i centri di sequenziamento del DNA hanno monopolizzato gran parte di questo lavoro. Questi centri, siano
università o aziende commerciali, richiedono che il DNA
da sintetizzare sia inviato sotto forma di cloni. Presso il
centro si prepara una serie di provette contenenti gli
stampi clonati nello stesso vettore, a ciascuna delle quali viene aggiunta la stessa miscela di reazione di polimerasi, nucleotidi, dideossinucleotidi marcati, ed un primer complementare al vettore (spesso per mezzo di un
robot). L’estremità 3! del primer è diretta verso gli inserti clonati, così che le reazioni di sequenza siano dirette
allo stampo desiderato. In questo modo si possono se-
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•
•
•
Copie ingrandite dello stampo e dei primer (Fogli di
lavoro 18.1 e 18.2; sito e-cathedra; cartella Fogli di
lavoro) (uno stampo e quattro primer per studente
per il sequenziamento ciclico, quattro stampi e quattro primer per studente per l’approccio originale)
Graffette colorate
• Per il sequenziamento ciclico, 80 graffette zincate (regolari), 4 rosse, 4 blu, 4 verdi e 4 gialle per
ogni studente
• Per l’approccio originale, cinque colori, con 20 di
ognuno dei quattro colori per studente e 4 del colore di “terminazione” per studente
Bicchieri di carta (o altri contenitori), 4 per studente
Forbici
Un grande pannello di sughero o foglio di carta su
una parete della classe; spilli; grandi lettere A, G, C, e
T (una di ognuna); ed etichette P (per “primer” ) " 1,
P " 2, ecc. fino a P " 16 (una di ognuna)
Questi materiali sono per la preparazione del “gel di sequenza” (vedi sotto).
Preparazione
•
Stampate ed ingrandite gli stampi e i primer (dal sito
e-cathedra; cartella Fogli di lavoro). Se possibile, plastificateli, fate un buco all’estremità del primer (per
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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•
•
attaccare la prima graffetta), e rinforzate il buco. Teneteli per un uso futuro.
Separate le graffette in base al colore.
Preparate il gel di sequenza sul pannello di sughero o
disegnatelo sulla lavagna come mostrato (vedi sotto).
Per il sequenziamento ciclico, preparate semplicemente le etichette verticali (P " 1, ecc.). Per l’approccio originale, preparate anche quattro “corsie di
gel” marcate A, G, C e T, come mostrato sotto.
A
P
P
•
•
•
P
P
P
P
G
C
T
" 16
" 15
"
"
"
"
4
3
2
1
Procedimento
Per entrambi gli approcci
Riprendete il meccanismo di sintesi del DNA ad opera
della DNA polimerasi. Assicuratevi di sottolineare il fatto che il gruppo ossidrilico al 3! è necessario per formare un nuovo legame nella catena di DNA in crescita (Figura 18.2). Mostrate agli studenti la struttura dei dideossinucleotidi (Figura 18.1) e spiegate che possono essere
incorporati proprio come normali deossinucleotidi ma
che poi la sintesi del DNA si blocca.
Sequenziamento ciclico
1 . Distribuite gli stampi del DNA (entrambi i filamenti),
uno per studente, e quattro primer per studente. Spiegate loro che sequenzieranno lo stampo usando il
metodo del sequenziamento ciclico, con graffette rappresentanti i nuovi nucleotidi. Le graffette zincate rappresentano i nucleotidi non marcati, e le graffette colorate rappresentano i dideossinucleotidi (ddATP,
ddGTP, ddCTP, e ddTTP) marcati con coloranti fluorescenti.
2. Ogni studente dovrebbe prendere quattro bicchierini di carta e marcarli A, G, C e T. Mettete 20 graffette zincate, che rappresentano i nucleotidi non marcati, in ogni contenitore. Aggiungete quattro graffette verdi, che rappresentano il ddATP, al contenitore
marcato A; quattro graffette blu o viola, che rappresentano il ddGTP, al contenitore G; quattro graffette
rosse, che rappresentano il ddTTP, al contenitore T;
e quattro graffette gialle, che rappresentano il ddCTP,
al contenitore marcato C. Assicuratevi che le graffette siano ben mescolate.
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3 . Gli studenti dovrebbero allineare la loro molecola
stampo con le coppie di basi complementari e avere i contenitori a portata di mano. Fate denaturare
gli stampi agli studenti. Gli studenti devono separare i filamenti. Successivamente fate loro ibridare il
primer con il corretto filamento stampo. L’estremità
5! del primer deve ibridare con l’estremità 3! dello
stampo.
4. Ora, la classe deve cominciare a sintetizzare il nuovo DNA dall’estremità 3! del primer di carta. Basandosi sull’identità del primo nucleotide del primer
(una A), gli studenti devono estrarre un nucleotide
complementare (una T) dal corretto bicchierino di
carta e legarlo al primer di carta (forando la carta).
L’estrazione dovrebbe essere fatta in maniera casuale (ad occhi chiusi). Se uno studente estrae una graffetta di terminazione (in questo caso, quella rossa),
quello studente deve aggiungere la graffetta di terminazione al primer e quindi mettere da parte lo
stampo. Nessun altro nucleotide può essere aggiunto ad esso.
5. Ripetete il passaggio 4 per la base successiva dello
stampo (la seconda A), collegando la seconda graffetta della T alla prima. Ancora, se uno studente seleziona casualmente una graffetta di terminazione, quella
graffetta deve essere aggiunta al filamento in crescita
del DNA, ma quello stampo deve essere messo da parte e nessun altro nucleotide deve essere aggiunto ad
esso. Ricordate agli studenti che le graffette di terminazione sono dideossinucleotidi che mancano del
gruppo ossidrile al 3! per formare un nuovo legame.
Continuate lungo lo stampo fino alla fine.
6. Ciclo 2. Denaturate lo stampo e il filamento appena
sintetizzato. Il primer è parte del filamento di nuova
sintesi e rimane con la sua catena di graffette che rappresenta i nucleotidi aggiunti di recente. Mettete da
parte con attenzione i filamenti figli sintetizzati di recente per l’uso successivo.
7. Ibridate un nuovo primer con lo stampo. Assicuratevi che gli studenti capiscano che la sola molecola sui
loro banchi con la quale il primer può ibridare è il filamento stampo, non il suo filamento opposto (della molecola di stampo originale) o il filamento figlio
appena sintetizzato.
8. Ripetete i passaggi da 4 a 7 per un totale di quattro
cicli di sintesi.
9. Ora è tempo di simulare il caricamento del gel e di
effettuare l’elettroforesi. I prodotti della reazione di
sequenziamento del DNA sono denaturati prima di
essere caricati, così gli studenti dovrebbero “denaturare” le loro molecole un’ultima volta separando il
primer e l’ultima molecola figlia dallo stampo di carta, lasciando il primer attaccato alla graffetta.
1 0. Dite agli studenti che tutte le molecole che la classe
ha sintetizzato rappresentano i prodotti nella provet-
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18 Sequenziamento del DNA
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ta di reazione. Tutti dovrebbero essere caricati in un
singolo pozzetto di un gel di sequenza. L’elettroforesi li separerebbe secondo il peso, e la classe disporrà le bande nel gel in questo ordine: dal più piccolo
al più grande.
1 1 . Domandate chi ha il prodotto che consiste del primer
più una sola graffetta. Scegliete uno studente tra quelli che hanno risposto e fate attaccare allo studente
con uno spillo o in altro modo il prodotto vicino a
“P " 1” sullo schema del vostro gel di sequenza. Ripetete per P " 2, P " 3, ecc., fino a P "16. Notate
che anche la molecola stampo ed il filamento opposto della molecola stampo sono di dimensione P " 16.
Anch’essi possono essere messi sul gel; solamente il
colorante fluorescente sarà rivelato.
1 2. Ora è il momento di leggere e interpretare il gel. Leggete il colore della graffetta terminale, iniziando da
P " 1 e continuate fino a P " 16. Registrate i colori
in ordine, e traduceteli in basi (verde è la A, e così
via). Gli studenti devono capire che l’ordine dei nucleotidi terminali nel gel corrisponde alla sequenza
complementare dello stampo.
Metodo originale di sequenziamento
del DNA mediante terminazione
della catena
1 . Distribuite gli stampi di DNA (entrambi i filamenti) e
i primer, quattro per studente. Dite agli studenti che
sequenzieranno lo stampo usando il metodo originale dei dideossinucleotidi, con graffette che rappresentano i nuovi nucleotidi radioattivi.
2. Assegnate agli studenti le A, le G, le C e le T. Ogni
studente condurrà solo un tipo di reazione sulle quattro molecole stampo. La ragione per la quale si suggerisce che ogni studente “sintetizzi” quattro molecole è di assicurarsi che una graffetta di terminazione sia incorporata da qualcuno in tutte le posizioni
possibili. Ci dovrebbero essere almeno 8 (preferibilmente da 10 a 12) nuovi filamenti sintetizzati per ciascun tipo di reazione. Potete modificare il numero di
filamenti che ogni studente sintetizza secondo le dimensioni della vostra classe.
3. Assegnate un colore alle graffette che saranno le A,
uno alle G, e così via. Il quinto colore sarà il dideossinucleotide, il nucleotide di “terminazione”.
4. Ogni studente dovrebbe avere quattro bicchieri di
carta e marcarli A, G, C e T. Gli studenti “A” mettono
20 graffette del colore corretto nei contenitori G, C,
e T. Nel contenitore A, ne mettono 16 del colore A e
4 del colore di terminazione e le mescolano accuratamente. Il colore di terminazione rappresenta le molecole di ddA.
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Gli studenti G prendono 20 graffette A, C, e T e quindi mettono 16 G e 4 graffette di terminazione nei loro contenitori G (mescolati bene). Questa volta, le
graffette di terminazione rappresentano le molecole
ddG.
Gli studenti C e T devono preparare le loro “miscele
di reazione” appropriatamente con le loro graffette.
5. Gli studenti devono allineare le quattro molecole
stampo sui banchi, con i bicchieri di carta facilmente raggiungibili. I due filamenti dello stampo dovrebbero essere allineati con le coppie di basi complementari. Fate denaturare gli stampi agli studenti
separando i due filamenti. Successivamente, fate loro ibridare lo stampo con il filamento stampo corretto. L’estremità 5! del primer deve ibridare col 3! dello stampo.
6. Assicuratevi che i contenitori che contengono le graffette “dideossi” siano mescolati bene. Ora, la classe
deve cominciare a sintetizzare il nuovo DNA dall’estremità 3! del primer di carta. Basandosi sull’identità del primo nucleotide dello stampo (una A), gli studenti devono estrarre un nucleotide complementare
(una T) dal corretto contenitore di carta ed unirlo al
primer di carta (forando la carta). Gli studenti devono farlo quattro volte, una volta per ogni molecola
stampo. L’estrazione dovrebbe essere fatta in maniera casuale (ad occhi chiusi). Se uno studente con
la reazione “T” estrae una graffetta di terminazione
per uno stampo, deve aggiungere la graffetta di terminazione al primer e quindi mettere da parte lo
stampo. Nessun altro nucleotide può essere aggiunto ad esso.
7. Ripetete il passaggio 6 per la base successiva dello
stampo (la seconda A), unendo la seconda graffetta
della T alla prima. Di nuovo, se uno studente seleziona in maniera casuale la graffetta di terminazione,
quella graffetta deve essere aggiunta al filamento di
DNA in crescita, ma poi quello stampo deve essere
messo da parte con nessun altro nucleotide aggiunto ad esso. Ricordate agli studenti che le graffette di
terminazione sono dideossinucleotidi che mancano
del gruppo ossidrile al 3! per formare un nuovo legame.
8. Continuate lungo lo stampo fino alla fine. La Figura
18.5 mostra tutti i possibili prodotti per la reazione
“C”. Notate che ci sono prodotti che si bloccano ad
ogni G dello stampo più un prodotto a lunghezza
completa per il quale lo studente non ha mai estratto una graffetta di terminazione dal contenitore delle graffette C.
9. Ora è tempo di caricare il gel e di effettuare l’elettroforesi. I prodotti della reazione di sequenziamento del
DNA vengono denaturati prima di essere caricati, co-
B. Manipolazione ed analisi del DNA
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proprio al livello P " 5 (ci possono essere molte di
tali molecole; appendetele con spilli una sopra l’altra). Se state usando una lavagna, disegnate semplicemente una banda nella corsia A a livello P " 5.
Continuate a chiedere molecole fino a P " 16. Dovreste ottenere prodotti a P " 5, 9, 10 e 16 dagli studenti della reazione A. Fate la stessa cosa per gli studenti della reazione G (dovreste ottenere P " 4, 7, 13,
15 e 16), per gli studenti della reazione C (P " 3,
6, 11, 14 e 16) e per gli studenti della reazione T
(P " 1, 2, 8, 12 e 16).
.
Figura 18.5 Prodotti di reazione della reazione C. I quattro
prodotti più corti sono stati ottenuti quando uno studente ha
estratto una graffetta di terminazione in corrispondenza della
corrispettiva G sulla sequenza stampo. Il prodotto lungo si è
ottenuto quando ad uno studente è capitato di non estrarre una
graffetta di stop a livello di nessuna G dello stampo.
La Figura 18.6 mostra la corsia C del gel caricato con
i prodotti della reazione rappresentati nella Figura
18.5. Questa figura illustra anche come disegnare lo
schema del gel. La Figura 18.7 mostra come apparirà il vostro “gel” completo.
1 1 . Ora leggete il gel di sequenza. Iniziando da P " 1,
identificate la corsia dove si trova la banda (T). Scrivete “T” sulla lavagna. Continuate con P " 2, P " 3
ecc., scrivendo la sequenza mentre proseguite. Confrontate la sequenza di basi che scrivete sulla lavagna
con la sequenza del filamento di DNA appena sintetizzato (dovrebbero essere identiche). Confrontatela
sì gli studenti devono “denaturare” le loro molecole
eliminando il primer di carta dallo stampo di carta; lasciate il primer di carta attaccato alle graffette.
Indicate il modello del gel e dite agli studenti che tutti i prodotti della reazione A saranno caricati e fatti
correre nella corsia A, i prodotti della reazione G nella corsia G, e così via. Gli studenti dovrebbero immaginare di aver caricato i loro prodotti nella corsia
appropriata e di aver eseguito l’elettroforesi.
1 0. Per visualizzare lo schema delle bande, concentratevi su una corsia alla volta. Per esempio, chiedete agli
studenti della reazione A se qualcuno ha una molecola di prodotto con un solo nuovo nucleotide (graffetta) aggiunto al primer (nessuno dovrebbe averla,
dal momento che il primo nucleotide aggiunto è una
T). Ponete la stessa domanda per due, tre, quattro e
cinque nuovi nucleotidi. Qualcuno del gruppo “A”
dovrebbe avere una molecola con esattamente cinque nuovi nucleotidi, dal momento che c’è una T in
quella posizione dello stampo. Se state usando un
pannello di sughero, lo studente deve farsi avanti ed
attaccare con uno spillo la molecola nella corsia A
Figura 18.6 I prodotti della reazione C sono stati “caricati” e
“separati” su un “gel”. Le loro lunghezze sono P + 3, P + 6, P + 11,
P + 14, e P + 16 (riferitevi alla Figura 18.5).
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con la sequenza dello stampo di carta (dovrebbero
essere perfettamente complementari).
1 2. (Opzionale) Proiettate un lucido della fotografia del
gel di sequenza della Figura 18.4 e fate leggere agli
studenti un tratto di sequenza di DNA.
1 3. (Opzionale) Leggete e discutete la lettura I ter minatori della catena come far maci antivirali (p. 222).
!Risposte alle domande per gli studenti
Le molecole dello stampo sono presenti nel gel (sono caricate insieme al resto della miscela di reazione), ma non potete vederle perché non sono marcate.
2. La replicazione del DNA.
3. Aumentare la concentrazione dei dideossinucleotidi
nella miscela di reazione accrescerebbe le probabilità che la polimerasi incorpori un terminatore invece
di un normale nucleotide. La lunghezza media dei
prodotti della reazione si ridurrebbe.
4. ddC.
1.
Letture scelte
Figura 18.7 Il gel di sequenziamento completato. La sequenza è
letta dal basso verso l’alto: TTCGACGTAACTGCG. Essa è un
complemento perfetto della sequenza stampo.
Bartlett, J., e R. Moore. 1998. Improving HIV therapy.
Scientific American 279:84. [Tr ad. it.: “Migliorare le
terapie anti-HIV”, Le Scienze, settembre 1998.]
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C. IL TRASFERIMENTO
DELL’INFORMAZIONE GENICA
Le esercitazioni della Sezione B erano concentrate sulla
manipolazione e sull’analisi del DNA. La maggior parte
di questi metodi dipende dalla disponibilità di un grande numero di molecole di DNA identiche. I ricercatori
ottengono queste molecole identiche principalmente tramite il clonaggio del DNA. Parte del processo di clonaggio è stata illustrata nelle precedenti esercitazioni: la
costruzione di una molecola di DNA ricombinante e la
sua analisi tramite restrizione e sequenziamento del DNA.
L’altra parte essenziale del processo di clonaggio è il trasferimento genico: l’introduzione di nuova informazione
genica in un organismo.
I ricercatori utilizzano il trasferimento genico nel clonaggio come mezzo per propagare le molecole di DNA ricombinante. La molecola di DNA ricombinante è replicata all’interno della cellula ospite quando questa si moltiplica, producendo un numero di copie praticamente illimitato. I ricercatori usano il trasferimento genico anche
per cambiare deliberatamente il genotipo di un organismo al fine di fargli acquisire un nuovo tratto o sintetizzare un prodotto utile. Per esempio, i ricercatori hanno
prodotto del grano resistente ad alcuni bruchi parassiti introducendo un gene di una proteina batterica insetticida.
I ricercatori hanno indotto Escherichia coli a produrre insulina umana introducendo una copia di DNA complementare (cDNA) all’RNA messaggero umano (mRNA).
Questa sezione si focalizza sul processo del trasferimento genico. Le prime tre esercitazioni pratiche illustrano i
metodi naturali di trasferimento genico in E. coli: coniugazione, trasformazione e trasduzione. Dal momento che
alcune persone possono preoccuparsi per il fatto che gli
studenti lavorano con un batterio che è associato a malattie gravi, questa sezione inizia con informazioni di base sui motivi per cui alcuni ceppi di E. coli causano una
malattia mentre altri (come i ceppi di laboratorio usati in
queste esercitazioni) non lo fanno. Sebbene sia facile
considerare questi metodi semplicemente come strumenti biotecnologici (e in quanto tali sono strumenti importanti), il trasferimento genico per mezzo di ciascuno
di questi meccanismi avviene in natura con una frequenza significativa. Il materiale introduttivo all’inizio di
ciascun capitolo fornisce esempi dell’importanza medica di ognuno di questi metodi di trasferimento genico
naturale. La Lettura del Capitolo 20 si concentra sulla diffusione della resistenza agli antibiotici, un esempio dei
rapidi cambiamenti evolutivi dovuti a trasferimento genico per il quale gli esseri umani hanno fornito la pressione selettiva.
Dopo le esercitazioni con E. coli viene riportato un esercizio che mostra l’alterazione genica di una pianta vivente ad opera di Agrobacterium tumefaciens.
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La trasformazione
Descrizione dell’esercitazione
a p. 229
Questa esercitazione costituisce un protocollo economico ed affidabile che insegna agli studenti un metodo per inserire nuova informazione genetica nei batteri. Gli studenti dimostrano che l’Escherichia coli non
può crescere in presenza dell’antibiotico ampicillina.
Essi quindi inseriscono un plasmide con un gene per
la resistenza all’ampicillina nel batterio. Dopo il processo di trasformazione, alcuni dei batteri di E. coli trattati esprimono il gene della resistenza all’antibiotico e
crescono in presenza del farmaco. Gli studenti osservano la prova fenotipica di un cambiamento genotipico in E. coli.
Per osservare il fenotipo trasformato gli studenti spargono alcune delle cellule trasformate e non trasformate su
terreni solidi con e senza antibiotico. Per questo esperimento, dovete preparare o procurarvi delle appropriate
piastre di agar e supervisionare l’uso da parte degli studenti dell’alcol e del fuoco o fornirvi di tamponi sterili o
di palline di vetro.
Lezioni richieste: da 1 a 2 lezioni da 50 minuti o 1 lezione da 90 minuti, più l’osservazione e la registrazione
dei dati nei due o tre giorni successivi. Nel procedimento c’è un punto in cui questo può essere interrotto.
Introduzione
La trasformazione ha luogo quando le cellule assumono
molecole di DNA libero dall’ambiente ed esprimono l’informazione codificata. Questo fenomeno è di grande importanza per la biologia molecolare sperimentale, poiché fornisce un mezzo per inserire nuovi geni nelle cellule. La trasformazione è stata osservata per la prima volta da Frederick Griffith, il quale scoprì che mescolando
un ceppo vivente di pneumococco non capsulato (“ruvido”) (Str eptococcus pneumoniae, precedentemente
chiamato Diplococcus pneumoniae) con cellule morte di
un ceppo capsulato (“liscio”), le cellule ruvide venivano
“trasformate” nella forma a colonia liscia. Nel 1944,
Oswald Avery, Maclyn McCarty e Colin McLeod dimostrarono che il DNA purificato proveniente dalle cellule
lisce era la sostanza che causava la trasformazione.
Le cellule batteriche che sono in uno stato in cui possono essere trasformate sono dette competenti. Solo alcuni
ceppi di batteri, come quelli di pneumococco, sono per
natura competenti. Le cellule naturalmente competenti
contengono proteine preposte al processo di trasformazione. Proteine di superficie di questi organismi legano il
DNA e lo trasportano nella cellula. Proteine interne quindi confrontano la sequenza di basi del nuovo DNA con
il genoma dell’organismo. Se viene trovata una somiglianza (omologia) sufficiente, il nuovo DNA viene ricombinato ed espresso nel genoma. Come parte del genoma viene quindi replicato e trasferito alle cellule figlie.
Se non ha una sequenza simile al genoma dell’organismo, il nuovo DNA non viene incorporato e viene perso. In questo modo, le cellule naturalmente competenti
hanno accesso alla variabilità genetica tramite la trasformazione, ma non sprecano il loro tempo esprimendo geni del tutto irrilevanti. Si pensa che la trasformazione naturale sia un rilevante meccanismo di scambio genetico
per numerose specie importanti per l’uomo, in particolare lo S. pneumoniae, un agente eziologico della polmonite. Maggiori informazioni sul trasferimento genico
naturale e su S. pneumoniae sono riportate in questa sezione nella lettura Trasferimento genico e diffusione della resistenza agli antibiotici a p. 235.
Le cellule che non sono naturalmente competenti spesso
possono essere indotte artificialmente ad incorporare
DNA. Nel 1970 due ricercatori hanno sviluppato un metodo che rende E. coli capace di incorporare ed esprimere DNA. Il loro metodo prevedeva il trattamento delle cellule con una soluzione di cloruro di calcio, seguito da
shock termico. Essi scoprirono che cellule in crescita rapida (fase log) incorporavano DNA molto più efficientemente dopo questi trattamenti. Ad oggi nessuno sa esattamente perché questi trattamenti inducano E. coli ad incorporare DNA. Ovviamente alcune caratteristiche della
membrana cellulare devono essere alterate per permettere alle molecole di DNA di entrare. Il metodo del trasferimento genico chiamato elettroporazione, che è simile alla trasformazione, utilizza alti voltaggi allo stesso scopo.
Una volta all’interno di E. coli, il DNA deve essere espresso perché si realizzi la trasformazione. Questo passaggio
può essere un problema. E. coli contiene enzimi chia-
C. Il trasferimento dell’informazione genica
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mati esonucleasi che degradano i frammenti lineari di
DNA, partendo dalle estremità e andando verso l’interno. Nella maggior parte dei casi, i nuovi frammenti di
DNA lineare sono distrutti prima di avere persino una
possibilità di ricombinarsi nel genoma di E. coli. Questa
è una ragione per cui i ricercatori trasformano E. coli con
i plasmidi. I plasmidi sono circolari e quindi sono immuni all’attacco dell’esonucleasi (poiché non hanno
estremità).
Un’altra ragione per cui i ricercatori utilizzano i plasmidi è che i plasmidi contengono le loro origini di replicazione e così vengono replicati e trasmessi alle cellule figlie. Non è necessario che un plasmide ricombini nel genoma di E. coli per essere mantenuto ed espresso, così
i plasmidi non hanno bisogno di avere una sequenza di
basi simile al cromosoma di E. coli. I plasmidi perciò costituiscono veicoli (o vettori) molto adatti per introdurre
del nuovo materiale genetico in E. coli.
Da dove derivano i plasmidi? I plasmidi sono stati trovati
in molte specie differenti di batteri e nei lieviti. I plasmidi
sembrano essere dei tratti supplementari di DNA; non
contengono nessun gene che sia essenziale alla vita dell’organismo. Essi però contengono spesso (ma non sempre) materiale genetico che fornisce alla cellula vantaggi di sopravvivenza in certe condizioni, come geni per
la resistenza agli antibiotici, per la resistenza a metalli pesanti normalmente velenosi, per la degradazione di composti chimici inusuali o per uccidere altri batteri.
Questo esercizio di laboratorio usa il metodo del calcio
cloruro-shock termico per introdurre un plasmide in E.
coli. Il plasmide porta un gene per la resistenza all’ampicillina che è usato per rivelare la sua presenza nelle
cellule trasformate. Questo antibiotico blocca la formazione delle pareti cellulari in E. coli (e in molti altri batteri), impedendo ai batteri la produzione di nuove cellule. Il gene della resistenza all’ampicillina codifica un
enzima chiamato beta-lattamasi che demolisce la molecola dell’ampicillina, permettendo alle cellule di moltiplicarsi in mezzi contenenti ampicillina.
È possibile che notiate un fenomeno interessante sulle
piastre contenenti ampicillina dove stanno crescendo i
trasformanti. Dopo un periodo di incubazione, minuscole colonie cominciano a crescere sulle piastre di ampicillina nell’alone intorno alle colonie originali resistenti all’ampicillina dei batteri trasformati. Queste sono chiamate “colonie satelliti.” Esse si formano perché l’enzima beta-lattamasi prodotto dalle cellule trasformate si diffonde
nel mezzo, distruggendo l’ampicillina nelle vicinanze della colonia. Quando è stato distrutto abbastanza antibiotico, le cellule non trasformate sensibili all’ampicillina, che
sono state tutto il tempo sulla piastra ma non potevano
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formare colonie a causa dell’antibiotico, cominciano a
moltiplicarsi con successo, formando le colonie satelliti.
Nota: questa esercitazione può essere svolta anche con
altri plasmidi, quali pKAN, pUC18, o pBR322. Gli ultimi
due plasmidi contengono un gene di resistenza all’ampicillina e possono essere sostituiti nel procedimento senza nessun cambiamento. pKAN contiene invece un gene
di resistenza alla kanamicina. Se usate pKAN, dovete sostituire la kanamicina al posto dell’ampicillina nel mezzo
selettivo (le ricette sono nel sito e-cathedra, cartella In laboratorio), ma per il resto il procedimento è lo stesso.
La kanamicina agisce diversamente dall’ampicillina; invece di interferire con la costruzione della parete cellulare,
blocca la traduzione. Il blocco della traduzione è letale
per le cellule. Ci sono molti geni diversi di resistenza alla kanamicina, ma tutti funzionano essenzialmente nello
stesso modo. Tutti codificano enzimi che modificano la
molecola della kanamicina così che non possa entrare nelle cellule di E. coli. (Le diverse versioni degli enzimi di resistenza alla kanamicina causano modificazioni diverse al
farmaco.) Gli enzimi di resistenza alla kanamicina si trovano nello spazio periplasmatico (l’area tra le membrane
interna ed esterna di E. coli) dove modificano il farmaco
così che non possa attraversare la membrana interna. Poiché gli enzimi si trovano all’interno della cellula, non vedrete colonie satelliti sulle piastre di kanamicina.
Sono disponibili anche plasmidi che conferiscono un
nuovo aspetto ai trasformanti, quale un colore blu o verde o la capacità di emettere fluorescenza. Il metodo di
trasformazione è lo stesso, sebbene possa richiedere l’aggiunta di indicatori chimici al mezzo o l’incubazione a
temperature diverse.
Obiettivi
Alla fine di questo laboratorio, gli studenti dovrebbero:
1 . Essere in grado di discutere come il procedimento di
trasformazione renda capaci alcune cellule di E. coli
di formare colonie su mezzi contenenti antibiotico.
2. Aver migliorato le loro conoscenze del genotipo e del
fenotipo.
3. Comprendere l’importanza delle tecniche di sterilità
quando si maneggiano batteri.
Materiali
Attrezzature
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Termometri centigradi
Pipettatori da 0,5 a 10 !l o altri dispositivi di misurazione sterile di piccole quantità
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Pipettatori da 100 a 1000 !l o altri dispositivi di misurazione sterile di piccole quantità
Frigorifero (facoltativo)
Autoclave o pentola a pressione (facoltativo per preparare le piastre e sterilizzare le provette)
•
Materiali
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Coltura di E. coli cresciuta per una notte strisciata su
piastre (ceppo MM294 o JM101 o altro ceppo adatto)
Cloruro di calcio 0,1 M (100 mM)
DNA plasmidico (pAMP o altro)
Contenitori di polistirolo
Un tipo di piastre nutrienti di agar (come piastre di
brodo triptico di soia o piastre di brodo di Luria)
Piastre nutrienti più ampicillina a 100 !g/ml
Provette sterili da coltura da 15 ml
Pennarelli indelebili
Provette per microcentrifuga
Puntali sterili per pipettatori da 0,5 a 10 !l
Puntali sterili per pipettatori da 100 a 1000 !l
Ghiaccio
Anse per inoculare
Soluzione sterilizzante di lisolo o varechina
Supporto per tenere le provette da microcentrifuga
Le ricette per i mezzi e le soluzioni si trovano nel sito
e-cathedra, cartella In laboratorio.
Fonte dei materiali
Molte aziende offrono kit per esercitazioni di trasformazione. Noi abbiamo utilizzato ed abbiamo esperienza dei
prodotti offerti dalla Carolina Biological Supply Company
e li elenchiamo qui per vostra comodità.
•
•
•
Kit di trasformazione di colonie della Carolina Biological Supply Company 21-1142, 21-1146, e 21-1088.
Questi kit corrispondono tutti alla stessa esercitazione di trasformazione, ma utilizzano plasmidi con differenti geni marcatori, che includono un gene fluorescente e due diversi fenotipi colorati.
DNA plasmidico, E. coli, antibiotici, agar, cloruro di
calcio e terreno sterile possono essere acquistati separatamente.
Se volete evitare di preparare le piastre, provate il kit
della Carolina 21-1078, che utilizza cartoncini pronti
all’uso con nutrienti solubili attaccati ad essi. Quando gli studenti aggiungono le sospensioni cellulari, il
mezzo si forma lì per lì.
Preparazione
Ogni gruppo di laboratorio avrà bisogno dei seguenti
materiali:
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Pennarelli indelebili
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•
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Pipettatori da 100 a 1000 !l e puntali sterili o altro
dispositivo di misurazione
Pipettatori da 0,5 a 10 !l e puntali sterili o altro dispositivo di misurazione
Bicchiere da caffè di polistirolo da usare come bagno
riscaldato
Termometro centigrado
Contenitore per ghiaccio
500 µl di soluzione di cloruro di calcio 100 mM
0,25 µg di DNA plasmidico
Due provette da microcentrifuga sterili da 1,5 ml
Ansa per inoculare
Accesso ad una fiamma o ad altro sistema di sterilizzazione per l’ansa
1 ml di terreno sterile
Per piastrare le miscele di trasformazione:
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•
•
•
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Due piastre di mezzo nutriente (agar di brodo triptico di soia [TSA], agar di Luria, o agar nutriente)
Due piastre di mezzo nutriente più antibiotico
Diffusore batterico (bacchetta piegata di vetro)
Alcol in una piastra di Petri (sufficiente per bagnare
il diffusore)
Accesso ad una fiamma (bruciatore Bunsen o ad alcol)
Al posto del bruciatore, dell’alcol, o della fiamma, gli studenti possono anche usare quattro bastoncini cotonati
sterili e 1 ml di terreno sterile o alcune palline sterili di
vetro.
1 . Preparate le piastre di agar con (AMP") e senza
(AMP–) ampicillina. Avrete bisogno di quattro piastre
per gruppo di studenti più una piastra per gruppo come piastra di partenza.
2. E. coli. Preparate una piastra strisciata ogni due gruppi di laboratorio il giorno prima di fare questa esercitazione. Questo metodo funziona meglio con piastre incubate per 1 gior no a 37 °C o 2 gior ni a temperatura ambiente (dai 20 ai 25 °C). Se volete, fate
preparare a ciascun gruppo di studenti una piastra
strisciata il giorno prima dell’esercitazione.
3. DNA plasmidico. Il DNA plasmidico dovrebbe essere alla concentrazione di circa 0,05 !g/!l (equivalenti
a mg/ml). La maggior parte delle aziende vende DNA
in soluzioni più concentrate, così potreste dover diluire il DNA prima dell’uso. Per esempio, se il vostro
DNA è alla concentrazione di 1 mg/ml (uguale a
1 !g/!l), voi dovrete diluirlo 20 volte. Aggiungete 5
!l di DNA plasmidico a 95 !l di acqua o tampone
Tris-EDTA. Ciò produce 100 !l di DNA a 0,05 !l/!g,
sufficiente per gli esperimenti di 20 studenti. Mettete
il DNA diluito nel frigorifero se avete bisogno di conservarlo per tutta la notte.
C. Il trasferimento dell’informazione genica
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4. Cloruro di calcio (la ricetta è sul sito e-cathedra, cartella In laboratorio).
5 . Assicuratevi che i rifiuti microbici siano sottoposti al
trattamento corretto. Materiali di vetro o di plastica
o qualunque altro materiale che è entrato in contatto con le cellule dovrebbero essere posti in una soluzione di lisolo al 10% (o in una soluzione di varechina al 20%) per tutta la notte. Autoclavare il materiale a 120 °C per 15 minuti costituisce un metodo alternativo ma non necessario se usate le soluzioni disinfettanti in maniera appropriata. Preparate
contenitori dei rifiuti contrassegnati in modo adeguato per la vostra classe.
Suggerimenti
1 . Gli studenti dovrebbero studiare attentamente il protocollo prima di iniziare. Il successo dipende da
un’accurata esecuzione dei passaggi.
2. Nel passaggio 4 del procedimento, è importante utilizzare una massa di cellule sufficientemente grande.
Se le piastre non contengono abbastanza colonie di
3 mm, dite agli studenti di prelevare diverse colonie
più piccole. Le piastre incubate per 24 ore a 37 °C o
48 ore a temperatura ambiente dovrebbero contenere colonie sufficientemente grandi.
3. Nel passaggio 5 è veramente importante che gli studenti ottengano una buona risospensione delle cellule. Non dovrebbe rimanere nessun aggregato visibile. È anche importante che risospendano prima la
provetta “"”, poiché le cellule avranno così tempo di
preincubare nel cloruro di calcio mentre le cellule
nella provetta “–” vengono risospese. La preincubazione aumenta l’efficienza di trasformazione.
4. Dopo lo shock termico e l’aggiunta del terreno alle
provette, le cellule possono essere incubate per diverse ore prima di essere piastrate o inoculate in mezzo liquido. Otterrete risultati migliori con il pKAN se
lascerete le cellule nel brodo per almeno 30 minuti
prima di piastrarle; le cellule trasformate di recente
hanno bisogno di tempo per esprimere l’enzima della resistenza alla kanamicina che le proteggerà dall’effetto letale dell’antibiotico. Questo periodo di sviluppo non è importante nel caso dell’ampicillina. Le
cellule trasformate con la resistenza per l’ampicillina
possono essere piastrate immediatamente. Se avete
bisogno di conservare le cellule fino al giorno successivo a quello della piastratura, lasciatele a temperatura ambiente o a 37 °C per un breve periodo e
quindi mettetele in frigorifero per tutta la notte. Se la
vostra classe termina alla fine della giornata scolastica, allora mettetele in frigorifero, ma tiratele fuori al
mattino e incubatele a temperatura ambiente per un
breve periodo prima della lezione.
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5. Ci dovrebbe essere una crescita abbondante (confluente) su entrambe le piastre TSA, alcune colonie
sulle piastre TSA-AMP" (i trasformanti), e nessuna colonia sulle piastre TSA-AMP–.
Discussione in classe e risultati previsti
È importante che gli studenti riflettano bene su quello
che sta accadendo e siano in grado di prevedere se le
cellule cresceranno su ciascuna delle quattro piastre sulle quali hanno sparso le cellule. Potete discuterne con
loro prima o dopo l’esercitazione, ma prima che vedano
i loro risultati. Le domande con cui iniziare la discussione potrebbero includere le seguenti.
Che cos’è necessario per la crescita dei batteri? (Gli studenti dovrebbero essere capaci di pensare a fattori
come nutrienti, temperatura adatta, nessun inibitore, ambiente adeguato per quanto riguarda l’ossigeno.)
Che cosa può inibire la crescita batterica? (La mancanza
dei nutrienti necessari, temperatura sbagliata, presenza di inibitori ecc.)
Abbiamo bisogno di controlli in questo esperimento? Per
cosa? Perché? Quali piastre sono i controlli (o come
potreste impostare i controlli necessari)? (Vedi la risposta alla Domanda 2 sotto.)
! Risposte alle domande per gli studenti
I risultati attesi sono forniti sopra. Se gli studenti ottengono risultati diversi (come crescita sulla piastra
TSA-AMP–), dovrebbero spiegarli.
2. La piastra TSA-AMP– è un controllo per assicurarsi
che l’ampicillina inibisca la crescita delle cellule non
trasformate. Non ci dovrebbe essere nessuna crescita. La piastra TSA– è un controllo per verificare la vitalità delle cellule che sono passate attraverso il procedimento di trasformazione, ma non hanno ricevuto DNA. Anche la piastra TSA" è un controllo per la
vitalità cellulare che utilizza le cellule alle quali è stato aggiunto il DNA. La piastra TSA-AMP– dimostra che
l’ampicillina inibisce la crescita delle cellule non trasformate. La piastra TSA-AMP" serve a verificare se
qualche cellula sia stata trasformata dal DNA plasmidico. Solo le cellule che esprimono il gene di origine batterica della resistenza all’ampicillina possono
crescervi.
3. Nessuna cellula è cresciuta sulla piastra TSA-AMP–
perché il mezzo conteneva ampicillina, ed i batteri
non sono resistenti e non hanno avuto l’opportunità
di essere trasformati dal plasmide della resistenza all’ampicillina.
1.
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19 La trasformazione
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4. Il risultato atteso per questa esercitazione è che le co-
lonie compariranno sulle piastre TSA-AMP sulle quali gli studenti hanno piastrato le cellule “" DNA”, e
non ci saranno colonie sulle piastre TSA-AMP sulle
quali gli studenti hanno piastrato le cellule “– DNA”.
Ci dovrebbe essere crescita su entrambe le piastre
di TSA senza ampicillina. Se questo è il risultato ottenuto, gli studenti dovrebbero affermare che le co-
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lonie sulle piastre TSA-AMP sulle quali sono state
piastrate le cellule “" DNA” sono dei trasformanti.
Il motivo è che le colonie sono resistenti all’ampicillina (stanno crescendo in presenza di ampicillina)
e sono presenti solamente nelle colture alle quali è
stato aggiunto il DNA plasmidico.
5. Le risposte varieranno.
Nota tecnica
Le piastre con il mezzo di coltura e le soluzioni contenenti antibiotici possono essere conservate in frigorifero
per un mese o due senza perdita dell’attività dell’antibiotico. Gli antibiotici nei mezzi perderanno la loro attività durante la conservazione a lungo termine. Non conservate i mezzi con antibiotico da un anno all’altro. Se
utilizzate un mezzo con antibiotico che è troppo vecchio,
l’esperimento sembrerà non aver funzionato; le cellule
non trasformate cresceranno sulle piastre di “antibiotico”
(poiché l’antibiotico non è più attivo). Le soluzioni madri degli antibiotici (vedi il sito e-cathedra, cartella In laboratorio) possono essere conservate nel congelatore per
anni. Preparate una madre e congelatela in piccole quantità. Quando avete bisogno di mezzo con antibiotico,
scongelate una provetta ed aggiungete il farmaco a del
mezzo fresco.
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La coniugazione
Descrizione dell’esercitazione
a p. 232
Questa è un’esercitazione rapida e facile che permette
agli studenti di osservare il trasferimento per coniugazione di un marcatore di resistenza ad un antibiotico da
un ceppo di Escherichia coli ad un altro. L’esercitazione
è stata utilizzata con successo in lezioni di vario livello.
Lezioni richieste: 1 per l’esperimento; parte di una seconda lezione per prendere nota dei risultati.
Introduzione
Nel 1946 Joshua Lederberg e Edward Tatum scoprirono
che cellule di E. coli possono scambiarsi geni in un processo che richiede il contatto diretto fra le cellule e uno
speciale fattore di fertilità (F) nella cellula donatrice. Questo processo venne denominato “coniugazione”, ma è
anche conosciuto con il nome di sessualità batterica dal
momento che prevede una donazione diretta di materiale genetico. Dal 1946 sono stati scoperti altri fenomeni di coniugazione molto simili a quello basato sul fattore F.
La forma di base in cui si trova il fattore F è il plasmide
F, un plasmide molto grande che contiene vari geni necessari al suo trasferimento tramite coniugazione. Qualsiasi cellula contenga il plasmide F può sintetizzare (a
partire dai geni F) tutte le proteine necessarie per la coniugazione ed è pertanto “fertile”. Le cellule fertili sintetizzano una speciale struttura chiamata pilo, un’appendice tubiforme che protrude dalla membrana esterna. Il
pilo si lega alla cellula ricevente (una cellula priva di F)
provocando l’avvicinamento delle due cellule. In un processo che non è stato ancora completamente caratterizzato, il plasmide F viene poi copiato dalla cellula fertile
a partire da una speciale origine di replicazione/trasferimento ed una copia viene trasferita alla cellula ricevente. La cellula ricevente diventa pertanto fertile e lo rimane anche la cellula donatrice.
Geni aggiuntivi possono essere incorporati nel plasmide
F, sia in processi naturali di ricombinazione, sia attraverso manipolazioni in laboratorio. Plasmidi F che conten-
gono altri geni sono spesso chiamati plasmidi F! (si legge F primo). Tali geni aggiuntivi sono pertanto trasferiti
durante la coniugazione. Talora, infine, il plasmide F ricombina all’interno del cromosoma di E. coli. Di conseguenza, quando tali cellule fertili iniziano la coniugazione tentano di replicare e trasferire il loro intero cromosoma circolare! (Di fatto possono trasmettere l’intero cromosoma a patto che restino appaiate per un lasso di tempo sufficientemente lungo.)
Vari plasmidi oltre all’F codificano proteine che permettono loro di essere trasmessi per coniugazione. Questi
plasmidi coniugativi occasionalmente possono permettere anche la trasmissione di plasmidi non coniugativi e,
per questo, praticamente ogni plasmide può essere trasferito di tanto in tanto. Alcuni plasmidi possono replicarsi solo in alcuni tipi di ospite e provocano la coniugazione solo fra questi ospiti. Altri, tuttavia, hanno uno
spettro di ospiti estremamente ampio e promuovono la
coniugazione in centinaia di specie batteriche.
Le implicazioni mediche della coniugazione sono notevoli: praticamente ogni gene di resistenza ad un antibiotico clinicamente rilevante è trasportato da un plasmide. La coniugazione permette la diffusione di plasmidi non solo fra differenti individui della stessa specie
batterica ma anche fra specie e, addirittura, generi differenti. La coniugazione è stata osservata direttamente nel
suolo, sulla superficie delle piante, nei laghi, nei fiumi,
negli oceani, nei sedimenti, negli impianti di trattamento delle acque di scarico e all’interno di piante, insetti,
polli, topi ed esseri umani. Si ritiene generalmente che
la coniugazione sia la principale via di trasmissione della resistenza ad un antibiotico nella maggior parte dei
batteri che causano malattie. Una lettura sulla diffusione
della resistenza agli antibiotici è presente alla fine del capitolo.
In questa esercitazione gli studenti osserveranno la trasmissione coniugativa della resistenza all’ampicillina in
cellule che sono già resistenti alla streptomicina. L’antibiotico streptomicina agisce legandosi ad una proteina
ribosomale e impedendo la sintesi proteica. Nel ceppo
di E. coli che sarà usato per l’esperimento, la resistenza
alla streptomicina è conferita da una mutazione cromo-
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somica a livello del gene per tale proteina ribosomale.
Tale mutazione specifica altera la forma della proteina ribosomale così da impedire alla streptomicina di legarvisi, lasciando tuttavia la proteina funzionalmente attiva.
Dal momento che è dovuta ad una mutazione cromosomica, la resistenza alla streptomicina non è normalmente trasmessa per coniugazione. La resistenza all’ampicillina, invece è conferita da un gene trasportato
da un plasmide e può essere facilmente trasferita da un
plasmide coniugativo. Gli esperimenti di coniugazione
sono effettuati in modo che le cellule riceventi che effettivamente ricevono le informazioni genetiche di interesse siano facilmente identificabili. In questo esperimento le cellule donatrici sono resistenti all’ampicillina
e le cellule riceventi sono resistenti alla streptomicina.
Solo i prodotti di coniugazione desiderati risulteranno
resistenti ad entrambi gli antibiotici. In questo modo,
piastrando i batteri su terreno contenente entrambe gli
antibiotici, permetteremo la crescita dei soli prodotti di
coniugazione.
Nella lettura che segue l’esercitazione, gli studenti impareranno che i ricercatori impegnati nei primi esperimenti riguardanti i fenomeni di resistenza ad un antibiotico avevano scoperto che mutanti resistenti nascevano spontaneamente con una frequenza approssimativamente compresa fra 1 su 10 milioni (107) e 1 su un
miliardo (109). Avevano pertanto concluso che la resistenza agli antibiotici non avrebbe rappresentato un
problema clinico di rilievo. La ragione per la quale i ricercatori avevano raggiunto questa conclusione era che
di solito prendevano in esame la frequenza con cui organismi cresciuti in colture pure diventavano spontaneamente resistenti alla streptomicina. In colture pure,
senza possibilità di contatto con ceppi batterici che trasportano plasmidi con geni di resistenza, l’unico modo
con il quale un organismo può diventare resistente alla streptomicina è andare incontro a una mutazione
spontanea che alteri la proteina della subunità ribosomale 30S nella maniera descritta sopra. Questa mutazione spontanea, di fatto, accade molto raramente. La
resistenza alla streptomicina può anche essere conferita da un gene trasportato da un plasmide che è trasferito per coniugazione. Se i ricercatori avessero utilizzato ceppi batterici contenenti il plasmide, avrebbero probabilmente raggiunto conclusioni del tutto differenti
sulla frequenza con cui possono insorgere fenomeni di
resistenza agli antibiotici.
Dopo che gli studenti hanno letto la lettura, provate a
sfidarli ad immaginare come i ricercatori fossero giunti
alla loro conclusione sui fenomeni di resistenza ad un
antibiotico, senza fare nessun “errore” nei loro esperimenti. Gli studenti sanno (dalla Tabella 20.2 della lettura) che la resistenza alla streptomicina può essere con-
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ferita sia con un gene trasportato da un plasmide sia da
una mutazione cromosomica.
Obiettivi
Alla fine di questa esercitazione gli studenti dovrebbero
essere in grado di:
1 . Definire il termine coniugazione.
2. Descrivere come impostare un esperimento di coniugazione batterica e spiegare come identificare i
prodotti di coniugazione.
3. Fare un esempio in cui la coniugazione batterica è
un fenomeno rilevante per l’uomo.
Materiali
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Cellule E. coli del ceppo cI (cellule riceventi streptomicina-resistenti) congelate o conservate in agar in
provetta
Cellule E. coli del ceppo cII (cellule donatrici ampicillina-resistenti) congelate o conservate in agar in
provetta
Brodo di soia triptico, brodo di Luria, brodo nutritivo o altro mezzo di coltura per batteri
Soluzione di ampicillina
Soluzione di streptomicina
Piastre di agar di soia triptico (o altro mezzo come
brodo di Luria-Agar), una per gruppo di studenti
Piastre di agar di soia triptico con ampicillina, una per
gruppo di studenti
Piastre di agar di soia triptico con streptomicina, una
per gruppo di studenti
Piastre di agar di soia triptico con ampicillina e streptomicina, una per gruppo di studenti
Micropipette e puntali sterili
Opzionale: altri strumenti sterili da inoculo come anse, bacchette cotonate sterili, ecc.
Piccole provette sterili (come provette da microcentrifuga o altri contenitori)
Pennarelli per scrivere sulle piastre di Petri
Nota: le ricette per i mezzi e le soluzioni degli antibiotici sono fornite nel sito e-cathedra; cartella In laboratorio.
Possibili fornitori del materiale
I ceppi batterici cI e cII sono disponibili alla Carolina Biological Supply Company nel Bacterial Conjugation Kit
Refill 21-1125A, nel kit completo Introductory Bacterial
Conjugation 21-1125 e nel kit Advanced Bacterial
Conjugation 21-1127.
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Preparazione
Prima di iniziare
Il giorno dell’esperimento avrete bisogno di colture fresche dei due ceppi di cellule cI e cII fatte crescere per
una notte intera. Ciascun gruppo di studenti utilizzerà da
200 a 400 µl di ciascuna coltura, quindi pianificate le cose in modo da averne un volume opportuno (10 ml sono più che sufficienti per gruppi di 20 studenti). Il mezzo di coltura può essere preparato e sterilizzato nei giorni precedenti e conservato a temperatura ambiente in
contenitori chiusi fino al momento dell’utilizzo. Il giorno
prima di quello in cui avete pianificato l’esperimento, aggiungete ampicillina in una fiasca da coltura e inoculatela con i batteri cII. Aggiungete streptomicina ad un’altra fiasca e inoculatela con cI. Lasciate crescere le cellule senza agitarle (o in modo blando) a 37 °C o a temperatura ambiente.
Se si preferisce, si potrà fare in modo che ciascun gruppo di studenti inoculi una piccola coltura di cI e cII da
far crescere durante la notte e utilizzare il giorno successivo. A seconda di quanto tempo avete a disposizione potrete anche far fare agli studenti uno striscio batteriologico di ciascun ceppo batterico sull’appropriato
mezzo antibiotico e successivamente utilizzare le colonie ottenute per inoculare le colture da far crescere durante la notte.
Preparate le piastre in anticipo. Se avete dei contenitori
sterili potrete preparare un certo quantitativo di agar, sterilizzarlo e suddividerlo in quattro contenitori sterili mentre è ancora liquido. Aggiungete gli antibiotici a tre dei
contenitori e versateli nelle piastre. In alternativa preparate quattro parti di agar, sterilizzatele e successivamente mettete gli antibiotici in tre di esse. Le piastre con il
mezzo contenente gli antibiotici si possono conservare
in frigorifero per alcune settimane.
Sterilizzate qualsiasi altra cosa vi occorra.
Il giorno dell’esperimento
Preparate dei contenitori di candeggina o Lysol diluito 1:5
come raccoglitori per i puntali delle micropipette e degli
altri materiali che entreranno in contatto con i batteri.
Ogni gruppo di studenti avrà bisogno di:
•
•
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•
•
Una piastra di ciascuno dei quattro tipi di piastre
Tre piccoli contenitori sterili
Micropipette e puntali sterili
Opzionale: strumento sterile per inoculo (come bacchette cotonate o anse per inoculo)
Pennarelli
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Procedimento
1 . Riassumete il concetto di coniugazione batterica. Invitate gli studenti a guardare la Figura 20.2 nella descrizione dell’esercitazione e suggerite un metodo per
identificare esclusivamente i processi di coniugazione che hanno avuto successo. Discutete quali debbano essere i controlli appropriati: si dice che il ceppo cI è resistente alla streptomicina ma sensibile all’ampicillina, ma cosa dovremmo fare per accertarcene? E per il ceppo cII?
2. Fate seguire agli studenti il procedimento descritto
nell’esercitazione. Dal momento che le cellule devono essere lasciate coniugare per circa 20 minuti, potrete approfittare del tempo per continuare la discussione. Potreste proporre la domanda 1 come
un’attività da svolgere in classe durante questo periodo di tempo. Chiedete agli studenti che cosa pensano che succeda ai loro batteri intestinali quando il
medico prescrive loro dell’ampicillina per risolvere
un’infezione all’orecchio. Gli studenti dovrebbero alla fine rendersi conto che l’ampicillina uccide i batteri intestinali sensibili, lasciando però qualsiasi forma batterica resistente più libera di replicarsi. Queste forme resistenti possono quindi trasmettere i loro
geni di resistenza. La diffusione delle resistenze agli
antibiotici fra i microbi che provocano malattie è un
problema medico rilevante ed in continua crescita
(vedi l’introduzione a questa sezione).
3. Il giorno successivo: fate in modo che gli studenti osservino e prendano nota dei risultati. Se le cellule non
sono cresciute a sufficienza, incubatele per un altro
giorno.
Suggerimenti
Gli studenti possono utilizzare un qualsiasi strumento volumetrico sterile per misurare le cellule cI e cII. Il volume esatto non è importante (sebbene il protocollo parli
di 100 o 200 µl), limitatevi a sincerarvi che mescolino volumi uguali delle due cellule.
Non è importante che le piastre indicatrici siano inoculate utilizzando una micropipetta. Un qualsiasi strumento sterile da inoculo andrà benissimo. Ad esempio,
funzioneranno perfettamente delle bacchette cotonate
sterili acquistabili in farmacia. Accertatevi che gli studenti utilizzino una bacchetta cotonata differente per
ogni singolo inoculo. Le cellule possono essere anche
sparse sulle piastre utilizzando una bacchetta di vetro
flambata in etanolo, come descritto nell’esercitazione
sulla trasformazione, oppure utilizzando sferette di vetro o bacchette cotonate (fate riferimento al Capitolo 19
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per le istruzioni). Se avete deciso di spargere le cellule
sulle piastre indicatrici, avrete bisogno di tre piastre normali, tre di ampicillina, tre di streptomicina e tre di
streptomicina più ampicillina per ciascun gruppo di studenti visto che su ogni piastra può essere sparso un solo campione.
Possibili approfondimenti
Invitate una persona che lavora in un laboratorio di analisi cliniche (o un medico con una buona preparazione)
a parlare alla vostra classe della diffusione dei fenomeni
di resistenza agli antibiotici negli organismi patogeni.
Questo argomento collega tematiche scientifiche e sociali. Si ritiene che la responsabilità di gran parte dei fenomeni di diffusione della resistenza ad un antibiotico
ricada sull’uso indiscriminato degli antibiotici in zootecnia, che chiama in causa regolamenti pubblici e politica
globale. La resistenza agli antibiotici e la sua diffusione
sono un ottimo argomento per i progetti di ricerca degli
studenti.
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!Risposte alle domande per gli studenti
Assicuratevi che gli studenti riempiano correttamente la tabella e capiscano quali cellule stanno esaminando in ciascun caso (vedi la Tabella 20.1). Esaminate la tabella durante la lezione e riferitevi ad essa
discutendo i risultati osservati nell’esperimento.
2. Solo i prodotti di coniugazione (cioè le cellule riceventi che hanno effettivamente ricevuto il gene di resistenza all’ampicillina dalle cellule donatrici) possono crescere sui due antibiotici insieme. Entrambi i
ceppi parentali non potranno crescervi.
3. È grazie alla resistenza alla streptomicina dei batteri
riceventi che è possibile selezionare i prodotti di coniugazione rispetto ai ceppi parentali. I prodotti di
coniugazione hanno una peculiare combinazione di
resistenze che nessuno dei due ceppi parentali ha. Se
il ceppo ricevente fosse stato sensibile alla streptomicina (come il ceppo donatore, cII), non sarebbe
stato possibile identificare i prodotti di coniugazione
(resistenti all’ampicillina ma sensibili alla streptomicina) dalle cellule donatrici, anch’esse resistenti all’ampicillina e sensibili alla streptomicina.
1.
Tabella 20.1 • Risposte attese sulla copia per gli studenti della Tabella 20.1
Inoculato con:
Mezzo
Solo agar:
Ti aspetti crescita?
Motivi?
Agar ampicillina
Ti aspetti crescita?
Motivi?
Agar ampicillina
Ti aspetti crescita?
Motivi?
Agar
Ampicillina/Streptomicina
Ti aspetti crescita?
Motivi?
cI
cI I
cI
cII
Sì
Nessun antibiotico
nel mezzo
Sì
Nessun antibiotico
nel mezzo
Sì
Nessun antibiotico nel mezzo
No
Il ceppo cI è sensibile
all’ampicillina
Sì
Il ceppo cII è resistente
all’ampicillina
Sì
La miscela contiene cellule cII che
sono resistenti all’ampicillina più i
prodotti di coniugazione che sono
resistenti sia a streptomicina sia ad
ampicillina
Sì
Il ceppo cI è resistente
all’ampicillina
No
Il ceppo cII è sensibile
alla streptomicina
Sì
La miscela contiene cellule cI che
sono resistenti alla streptomicina
più i prodotti di coniugazione che
sono resistenti sia a streptomicina
sia ad ampicillina
No
Il ceppo cI è sensibile
all’ampicillina
No
Il ceppo cII è sensibile
alla streptomicina
Sì
La miscela contiene i prodotti di
coniugazione che sono resistenti sia
a streptomicina sia ad ampicillina
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Letture scelte
Amabile-Cuevas, C., M. Cardenas-Garcia, e M. Ludgar. 1995.
Antibiotic resistance. American Scientist 83:320–329.
Levy, S. 1998. The challenge of antibiotic resistance. Scientific
American 278 (3):46. [Tr ad. it.: “La sfida della resistenza
agli antibiotici”, Le Scienze, maggio 1998 Milano.]
Miller, R. 1998. Bacterial gene swapping in nature. Scientific
American 278 (1):67. [Tr ad. it.: “Scambio di geni tra batteri
in natura”, Le Scienze, marzo 1988 Milano.]
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Price, L., E. Johnson, R. Valles, e E. Silbergeld. 2005.
Fluoroquinolone-resistant Campylobacter isolates from
conventional and antibiotic-free chicken products.
Environmental Health Perspectives 113:557–560.
Disponibile gratuitamente on line
(http://www.ehponline.org/ members/2005/7647/
7647.html).
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Trasduzione
Descrizione dell’esercitazione
a p. 241
Questa è un’esercitazione di laboratorio estremamente
semplice per mostrare agli studenti la trasmissione di un
gene di resistenza ad un antibiotico da parte di un virus
batterico. La parte di laboratorio è tecnicamente abbastanza facile da essere eseguita da studenti principianti,
se sono sufficientemente preparati da capire quello che
stanno vedendo e facendo. L’esercitazione, con una discussione più approfondita e con le modifiche opzionali
suggerite nell’introduzione per il docente, può essere inclusa in lezioni a livello universitario di microbiologia,
virologia o genetica.
Lezioni richieste: una per l’esperimento; osservazione
e registrazione dei risultati in un giorno successivo.
Introduzione
Nel processo di trasduzione un virus batterico (batteriofago) trasporta geni da una cellula ad un’altra. Molti batteriofagi diversi sono capaci di trasdurre geni; i dettagli
del processo di trasduzione utilizzati da ciascuno di essi
dipendono dal particolare ciclo vitale del singolo batteriofago.
I virus riconoscono la loro cellula ospite tramite interazioni molecolari fra la superficie della cellula e quella del
virus. Quando avviene un’interazione corretta, si verificano dei cambiamenti che provocano l’iniezione del materiale genetico virale all’interno dell’ospite. A questo
punto due tipi differenti di infezione possono avere luogo, a seconda del tipo di virus.
Infezioni virali litiche e infezioni latenti
Dopo che ha infettato la sua cellula ospite, un virus litico si impossessa del macchinario cellulare. Il normale
metabolismo cellulare viene rallentato o si ferma, gli enzimi cellulari vengono dirottati verso la produzione di
numerose nuove copie del materiale genetico virale e
delle varie proteine virali. Non appena la cellula inizia a
riempirsi dei componenti virali, le nuove particelle virali cominciano ad assemblarsi. Alla fine la cellula ospite
muore rilasciando la progenie virale nell’ambiente circostante. In alcuni casi il rilascio della progenie virale è
un processo graduale; in altri casi la cellula infettata scop-
pia (si lisa), rilasciando tutte le nuove particelle virali contemporaneamente.
Il corso di un’infezione latente è molto differente. Dopo
che un virus latente ha iniettato il suo materiale genetico nella cellula ospite, esso non dirotta il metabolismo
cellulare. Al contrario, dirige la produzione di alcune proteine virali che promuovono l’incorporazione del DNA
virale all’interno del cromosoma dell’ospite. Se la cellula ospite è un batterio, l’ospite infettato da un virus latente è detto lisogeno. I batteriofagi che provocano infezioni latenti sono chiamati batteriofagi lisogeni; lambda è il più conosciuto di questo gruppo. Il DNA virale risiede in forma quiescente nel cromosoma dell’ospite sino a quando un segnale specifico lo induce ad iniziare
un ciclo di infezione attivo (spesso litico). Nella maggior
parte dei casi la natura di questo segnale è sconosciuta.
Durante la fase attiva del ciclo, viene riprodotto il materiale genetico e vengono costruite le proteine virali: nuove particelle virali sono assemblate e rilasciate.
Ci sono variazioni sul tema delle infezioni litiche e latenti. Per esempio, il virus della varicella infetta un ospite umano e causa l’omonima malattia. Durante la malattia, il virus va incontro a cicli di infezione attiva, tuttavia,
quando il paziente guarisce, il virus non scompare. Copie del DNA virale rimangono in stato latente, integrate
nei cromosomi di alcune cellule. Questo DNA virale può
rimanere quiescente per il resto della vita del paziente o
può riattivarsi, causando una seconda malattia nota come herpes zoster (fuoco di Sant’Antonio).
I ricercatori spesso utilizzano i virus per introdurre DNA
esogeno all’interno delle cellule. I genomi di alcuni piccoli virus possono essere facilmente manipolati e i ricercatori li usano spesso come vettori di clonaggio. I virus sono importanti in particolare per lavorare con le cellule di mammifero: si possono clonare geni di interesse
all’interno del DNA virale (spesso dopo la rimozione dei
geni virali per inattivare il virus) e successivamente impacchettare il DNA ricombinante in particelle virali che
alla fine immetteranno il DNA nelle cellule bersaglio. Alcuni virus ricombinano il proprio DNA all’interno del genoma delle cellule di mammifero, altri invece si replicano nel citoplasma in un modo simile a quello dei plasmidi batterici.
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21 Trasduzione
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Trasduzione
In generale, la trasduzione è il risultato di un errore nella riproduzione di un batteriofago. Quando si riproduce,
un batteriofago replica il suo materiale genetico e produce contemporaneamente anche dei nuovi involucri virali. L’involucro (più propriamente denominato capside)
è un complesso di proteine virali assemblate. A qualche
livello del processo di costruzione del nuovo virus, il materiale genetico di nuova produzione deve essere impacchettato all’interno del capside per creare una nuova
particella virale. Alcuni batteriofagi, occasionalmente,
fanno un errore e impacchettano una porzione del DNA
dell’ospite al posto del proprio genoma. Questo è di solito un evento casuale, così qualsiasi gene batterico può
finire all’interno di una particella virale.
Le particelle virali che contengono DNA batterico invece del DNA virale sono perfettamente capaci di attaccarsi ad una nuova cellula ospite e iniettare il DNA (queste funzioni sono espletate dalle proteine del capside e
sono indipendenti dal suo contenuto). Una volta all’interno della nuova cellula, il DNA batterico può ricombinarsi con il genoma residente e può essere espresso
e trasmesso alle future generazioni di batteri: quando
ciò succede si dice che è avvenuto un fenomeno di trasduzione.
Alcune volte, geni batterici diventano a tutti gli effetti parte del cromosoma del batteriofago: questi eventi accadono in infezioni lisogene, in cui il materiale genetico
del fago si integra nel genoma dell’ospite per un certo
periodo. Quando il DNA del fago fuoriesce dal cromosoma dell’ospite per riprodursi e per impacchettarsi, occasionalmente cattura al suo interno un tratto del DNA
dell’ospite. Il DNA dell’ospite, a questo punto, agisce come parte del genoma virale e viene replicato e trasmesso insieme ad esso. Le nuove cellule infettate riceveranno quel particolare frammento di DNA batterico invece
di un frammento casuale come descritto sopra.
Un tempo si pensava che la trasduzione fosse un fenomeno piuttosto raro in natura, tuttavia studi sulle acque
dolci e salate hanno mostrato che le acque naturali pullulano di batteriofagi. Molti di essi infettano una sola specie di batteri ma alcuni invece sono in grado di infettare
varie specie. La trasduzione naturale è stata osservata nel
suolo, sulla superficie di piante, nei laghi, negli oceani,
nei fiumi, negli impianti di trattamento delle acque di scarico e all’interno dei più svariati organismi quali ostriche
e topi.
L’importanza medica della trasduzione
Si è scoperto che il trasferimento di geni mediato da
batteriofagi è importante nella creazione di nuovi ceppi di batteri patogeni. Ad oggi conosciamo vari esempi
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di eventi specifici di trasduzione che hanno una grande importanza per la medicina. Essi coinvolgono la seconda forma di trasduzione descritta sopra, quella in
cui un gene batterico diventa parte del cromosoma di
un batteriofago e viene trasferito in altri ospiti. Due casi specifici coinvolgono il trasferimento di geni che codificano tossine associate a malattie molto gravi: il gene della tossina shiga-like, che si pensa sia responsabile della sindrome emolitica-uremica, e che si trova all’interno del genoma dei ceppi di Escherichia coli enteroemorragici (come descritto nella Lettura Trasferimento genico, Escherichia coli, e malattie nel Capitolo
19) e i geni per la tossina associata alla sindrome da
shock tossico streptococcica.
L’intossicazione alimentare, normalmente letale, chiamata botulismo è una malattia mediata da un fago. Il botulismo è associato al batterio Clostridium botulinum, ma
la malattia in sé è causata solo da una particolare proteina prodotta da tale organismo: la tossina botulinica (si
tratta della stessa tossina che ha trovato ampio uso nei
trattamenti cosmetici per paralizzare alcuni muscoli facciali e di conseguenza ridurre le rughe). Il gene per la
tossina botulinica è portato da un batteriofago che infetta C. botulinum e si pensa che sia stato trasdotto da un
altro batterio. Senza il fago non ci sarebbe botulismo.
Anche l’intossicazione alimentare da Staphylococcus aureus è associata in modo simile ad un virus batterico. La
forma più comune della tossina coinvolta in questa malattia è codificata da un gene che si trova in un fago lisogeno. Un’altra malattia associata a S. aureus è la sindrome da shock tossico, anche questa causata da una
tossina prodotta da un gene che si sposta da un ceppo
di S. aureus ad un altro tramite trasduzione.
La difterite è causata dal batterio Corynebacterium
diphtheriae, ed una singola tossina prodotta dal batterio
è responsabile essenzialmente di tutti i sintomi e gli effetti di questa grave malattia. Il gene che codifica la tossina difterica è trasportato da un batteriofago integrato
nel cromosoma di C. diphtheriae.
Anche il colera è associato alla trasduzione: i sintomi più
gravi del colera sono causati da una singola proteina, la
tossina colerica. Così come nella difterite, il gene che codifica questa tossina è trasportato all’interno del cromosoma da un fago lisogeno. Quando infetta il batterio Vibrio cholerae, il fago integra il proprio DNA nel cromosoma batterico e il batterio acquista, di conseguenza, la
capacità di produrre la tossina. È interessante che qualche caratteristica delle condizioni dell’intestino degli organismi ospiti (come gli esseri umani) induca il fago a
trasferirsi in nuove cellule batteriche, diffondendo il gene della tossina durante l’infezione.
C. Il trasferimento dell’informazione genica
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Dimostrazione di trasduzione casuale
Questa esercitazione di laboratorio dimostra la trasmissione mediata da un batteriofago chiamato T4 di un gene per la resistenza all’ampicillina ad E. coli. La trasduzione casuale, in realtà, comporta due successivi cicli di
infezione: nel primo ciclo, alcuni frammenti del genoma
dell’ospite sono impacchettati “per sbaglio” nei virus; nel
secondo ciclo, il gene batterico viene inserito in nuove
cellule ospiti. In questa esercitazione, tuttavia, voi e vostri studenti effettuerete solo la seconda fase. Il “lisato”
batteriofagico (una sospensione di particelle fagiche) con
cui lavorerete contiene particelle virali al cui interno è
già impacchettato DNA batterico. La sospensione di particelle virali è chiamata “lisato” poiché il fago è stato raccolto da una coltura infettata di E. coli dopo che esso ha
provocato la lisi delle cellule.
Il lisato per la trasduzione è stato prodotto facendo crescere uno speciale ceppo (vedi sotto) di batteriofago T4
in cellule ospiti che contenevano un plasmide con un
gene di resistenza all’ampicillina. Durante la replicazione e l’impacchettamento del proprio DNA, il batteriofago occasionalmente avrà impacchettato per sbaglio
il DNA plasmidico. Ogni 10 000 particelle virali prodotte in questa infezione potremo osservare un evento di
trasduzione che coinvolge il DNA plasmidico.
Il trasferimento del DNA plasmidico nel nuovo ospite
renderà tale ospite resistente all’ampicillina, così che le
cellule trasdotte potranno essere selezionate mediante
piastratura su un mezzo contenente ampicillina. Come
detto, le particelle trasducenti rappresentano solo lo
0,01% dei virus nel lisato. Ma cosa faranno le altre particelle fagiche che normalmente infettano e uccidono
Escherichia coli? Questi virus normali renderebbero piuttosto difficile l’identificazione delle cellule trasdotte, perché il virus normale si riprodurrebbe e potrebbe uccidere tutte le cellule ospiti presenti, trasdotte o meno. Per
evitare questo problema, il lisato è stato prodotto utilizzando un particolare ceppo di fago T4.
Mutazioni ambra e soppressori ambra
Il ceppo di fago T4 trasduttore porta una mutazione in
due geni differenti che cambiano un codone per un amminoacido in un codone di stop UAG. Questo particolare codone di stop ha il nome di “ambra”, datogli ai tempi della sua scoperta, e le mutazioni che lo producono
sono chiamate mutazioni ambra. Le mutazioni ambra fanno terminare la sintesi proteica e di solito hanno come
risultato la perdita di funzione di una proteina (se la mutazione ambra è molto vicina alla fine della sequenza codificante la proteina, potrebbe non avere grandi effetti).
Nel ceppo trasduttore T4 le due mutazioni ambra bloccano la produzione di due proteine essenziali per il batteriofago e sono pertanto letali.
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Le mutazioni ambra nei batteriofagi sono molto utili per
i ricercatori, in quanto, in combinazione con particolari
ceppi ospiti, costituiscono un interruttore “acceso-spento” per la crescita del fago. Il sistema “acceso-spento”
funziona in questo modo: i codoni ambra (e gli altri due
codoni di stop) bloccano la traduzione poiché non c’è
un RNA transfer (tRNA) che possa appaiarsi all’anticodone. Quando un codone ambra in un RNA messaggero (mRNA) raggiunge il ribosoma, nessun nuovo amminoacido viene aggiunto alla catena polipeptidica in crescita, che quindi termina. Non c’è niente di magico riguardo alla sequenza di basi di un codone terminatore
eccettuato il fatto che non esiste alcun tRNA che vi si appai per aggiungere un amminoacido.
Tuttavia, anche le molecole di tRNA sono codificate nel
DNA (per produrre un tRNA, la sequenza di basi del
DNA è semplicemente trascritta in RNA da una speciale
RNA polimerasi). La sequenza di basi di qualsiasi tRNA
può essere cambiata da mutazioni nel gene che lo codifica. In alcuni ceppi batterici, mutazioni cambiano l’anticodone di un tRNA così che esso possa riconoscere
quello che normalmente è uno dei codoni di stop. In
questi ceppi, tale codone non è più un codone di stop
ma codifica qualsiasi amminoacido sia trasportato dal
tRNA mutante. Se il tRNA mutante riconosce il codone
di stop ambra e inserisce un amminoacido nella sua posizione, il codone ambra non funzionerà più da terminatore della sintesi proteica. Un ceppo batterico che produce un tRNA che riconosce il codone ambra è chiamato “soppressore ambra”.
Nei ceppi soppressori ambra, le mutazioni ambra sono,
in sostanza, annullate. Gli effetti di una mutazione ambra derivano dalla sua capacità di bloccare la sintesi di
una proteina; in un ceppo soppressore ambra, la sintesi
proteica non viene portata a termine. Dal momento che
i tRNA mutanti di solito non inseriscono l’amminoacido
originale a livello del sito della mutazione ambra, la proteina potrebbe avere problemi di funzionamento ma
spesso è ancora in grado di funzionare sufficientemente
bene. In questo modo i batteriofagi che portano mutazioni ambra, normalmente letali, possono riprodursi in
batteri ospiti che sopprimono le mutazioni a causa di una
mutazione di un loro tRNA.
Il nostro ceppo trasduttore T4 corrisponde a questa descrizione. In ospiti batterici con tRNA normali il virus risulta “morto” (non è in grado di produrre nuove particelle virali) a causa delle sue mutazioni ambra. Tuttavia,
in ceppi che producono un tRNA mutante, che sopprime il codone di stop ambra, il fago si può riprodurre abbastanza bene. In questo modo i ricercatori possono controllare la replicazione del fago scegliendo il ceppo batterico ospite. Le mutazioni ambra nel nostro batteriofa-
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go T4 sono un esempio di mutazioni letali condizionali:
in alcune condizioni risultano letali, mentre in altre condizioni non lo sono.
Il lisato per la trasduzione prevista in questa esercitazione è stato prodotto mediante l’infezione di un ceppo batterico soppressore ambra che portava il plasmide descritto sopra. Il ceppo soppressore ha permesso
al batteriofago di riprodursi. Per identificare senza interferenza le cellule trasdotte, il lisato verrà utilizzato
per infettare Escherichia coli del ceppo BE che non sopprime i codoni ambra. Il ceppo T4 non può crescere in
batteri del ceppo BE, e pertanto non si osservano placche fagiche, tuttavia qualsiasi particella trasducente che
è stata prodotta durante il primo ciclo di infezione può
trasdurre il ceppo BE, rendendolo resistente all’ampicillina. In questo modo, quando la miscela di cellule e
fago T4 viene piastrata su terreno contenente ampicillina, le cellule trasdotte possono essere identificate senza l’interferenza dovuta all’uccisione delle cellule da
parte del virus.
Se volete che i vostri studenti vedano la lisi cellulare di
Escherichia coli indotta da T4 o che osservino direttamente come funziona una mutazione letale condizionale, usate il ceppo soppressore ambra denominato
CR63, come descritto sotto nella parte B. Questo ceppo permette al fago T4 di crescere, sopprimendo la mutazione ambra che si trova in due geni essenziali. Se
mescolate il lisato con le cellule CR63 e successivamente le piastrate, potrete vedere che il fago uccide le
cellule.
Obiettivi
Dopo il completamento di questa esercitazione gli studenti dovrebbero essere in grado di:
1 . Descrivere come avviene la trasduzione casuale di
geni batterici.
2. Dire che cosa accade nella prima infezione in una trasduzione e che cosa succede nella seconda.
3. Se decidete di includere nella lezione il materiale relativo, spiegate che cos’è una mutazione ambra, perché può essere molto dannosa per un organismo, che
cos’è un ospite “soppressore ambra” e come esso elimina gli effetti di una mutazione ambra.
Materiali
Parte A: dimostrazione della trasduzione
•
Coltura di Escherichia coli del ceppo BE cresciuta durante la notte
•
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•
•
•
•
•
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Lisato T4 per trasduzione (non congelare mai un lisato T4)
Provette sterili: i gruppi di studenti avranno bisogno
di quattro provette per mescolare le cellule e i fagi
(0,5 ml di volume totale); per le diluizioni avrete bisogno di almeno tre provette per l’intera classe (una
di esse deve poter contenere 10 ml senza problemi)
Micropipettatori e puntali sterili da 10 !l
Micropipettatori e puntali sterili da 100 e 500 !l
Pipette sterili per misurare 1 ml e 10 ml
Piastre di agar di brodo triptico di soia (o L. Agar o
agar nutritivo; le ricette sono nel sito e-cathedra, cartella In laboratorio) con ampicillina: ne occorreranno
quattro per ciascun gruppo di studenti
Portaprovette, becker, o vaschette per il ghiaccio per
tenere le provette verticali
Rastrellino di vetro (una bacchetta di vetro piegata ad
L); uno per ciascun gruppo di studenti; in alternativa
delle bacchette cotonate sterili
Un becco Bunsen o un bruciatore ad alcol (non necessario se si usano bacchette cotonate)
Becker con metanolo o etanolo, abbastanza grande
da contenere i rastrellini di vetro (non necessario se
si usano bacchette cotonate
Parte B: materiale opzionale aggiuntivo
per la visualizzazione della lisi cellulare
•
•
•
Coltura di Escherichia coli del ceppo CR63 cresciuta
durante la notte
Quattro provette sterili per ciascun gruppo di studenti
Quattro piastre di agar di soia triptico senza antibiotico
Possibili fornitori del materiale
Al momento l’unica fonte commerciale che produce il lisato per trasduzione è la Carolina Biological Supply Company. Anche i ceppi batterici possono essere acquistati
presso di loro, che forniscono anche un kit di materiali
per questo esperimento denominato “Transduction of an
Antibiotic Resistance Gene, 21-1128”.
Preparazione
Da preparare in anticipo
Preparate le piastre di agar (le indicazioni sono nel sito
e-cathedra, cartella In laboratorio). Sterilizzate le provette
e tutti gli altri strumenti necessari. Avrete inoltre bisogno
di brodo di soia triptico o brodo di Luria sterile per il
giorno dell’esperimento.
Il giorno prima della lezione
Inoculate una coltura di E. coli del ceppo BE. Se ne avete previsto l’uso, inoculate anche la cultura di CR63.
C. Il trasferimento dell’informazione genica
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Il giorno della lezione
Preparate alcuni contenitori con candeggina diluita 1:5 o
Lysol da usare per raccogliere i rifiuti biologici. Il lisato
del fago T4 non è pericoloso e può essere smaltito come E. coli.
Suddividete per gli studenti piccoli quantitativi (da 100 a
200 !l) di lisato fagico in provette sterili marcate “non
diluito”. Per diluire il lisato per la trasduzione, avrete bisogno di almeno una provetta sterile (a seconda del volume finale di lisato diluito necessario) contenente 900 !l
(0,9 ml) di brodo sterile e almeno una contenente
1 ml di brodo. Queste provette possono essere preparate anche il giorno prima e mantenute refrigerate durante la notte. Preparate le diluizioni del fago (a cui si fa riferimento nell’esercitazione). Mettete 100 !l di lisato fagico nella provetta contenente 900 !l di brodo sterile
(utilizzando un puntale sterile). Picchiettate la provetta
delicatamente con le dita per mescolarla. Contrassegnate questa provetta “1 a 10”.
Con un puntale nuovo, mettete 10 !l di lisato fagico
non diluito nella provetta contenente 1 ml di brodo,
mescolate picchiettando la provetta delicatamente e
contrassegnatela “1 a 100”. Nell’aspirare la sospensione
fagica con la pipetta cercate di agire delicatamente, se
la sospensione di fago schizza sul pistone del pipettatore, questo si contaminerà. Per questa ragione non è
raccomandabile permettere agli studenti di preparare le
diluizioni del fago.
Se preparate le diluizioni in anticipo mettetele in frigorifero o in ghiaccio per conservarle.
Calcolo delle diluizioni
Diluizione 1 a 10
100 !l di fago aggiunti a 900 !l di brodo
Volume iniziale di fago = 100 !l
Volume finale del fago = 1000 !l (brodo più fago)
Volume finale = 100 !l/1000 !l = 1/10
Diluizione 1 a 100
100 !l di fago vengono aggiunti a 900 !l di brodo
Volume iniziale di fago = 10 !l
Volume finale del fago = 1010 !l
Volume iniziale/volume finale = 10 !l/1010 !l =
1/101 oppure, approssimativamente 1/100
Se volessimo ottenere un’esatta diluizione 1 a 100
avremmo dovuto mettere 10 !l di fago in 990 !l di
brodo. (Se preferite fate così, il risultato non cambierà
in modo significativo).
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Procedimento
Discutete con la classe il processo di trasduzione, assicuratevi che gli studenti abbiano capito che cosa succede. Quando aggiungeranno il lisato virale diluito alle cellule ospiti, ci saranno molti più batteri che particelle virali: in questo modo se una cellula viene infettata, sarà
molto probabilmente infettata da un solo virus. Se il virus è una normale particella virale, inietterà il suo DNA
ma non sarà in grado di riprodursi a causa della mutazione discussa in precedenza. Se il virus è invece una
particella trasducente, inietterà il DNA dell’ospite originario nella cellula e questa potrebbe risultare trasdotta.
Gli studenti dovranno identificare le cellule trasdotte con
il DNA plasmidico: chiedete loro come potrebbe essere
individuato il DNA pKK061. Gli studenti dovrebbero essere in grado di suggerire un test basato sulla resistenza
all’ampicillina.
La figura mostra il DNA plasmidico replicato nei fagi come una molecola lineare. Ciò è corretto, perché quando
il fago T4 replica il DNA plasmidico produce una lunga
molecola lineare contenente molte copie del DNA plasmidico: si immagini un tovagliolo di carta strappato da
un rotolo. Quando questa molecola di DNA lineare entra nella nuova cellula ospite, ricombina con se stessa e
si circolarizza. È possibile isolare il DNA plasmidico circolare dalle cellule trasdotte generate in questo esperimento. Se volete farlo, sarà sufficiente utilizzare il protocollo di miniprep che troverete in DNA Science (vedi
sotto in Letture scelte).
Seguite il protocollo descritto nell’esercitazione. Il lisato
è diluito in modo che venga prodotto un numero ragionevole di cellule trasdotte. Provando differenti concentrazioni di lisato, dovreste ottenere almeno una o due
piastre con un buon numero di cellule trasdotte e ciò vi
darà l’opportunità, se lo desiderate, di discutere con gli
studenti delle diluizioni.
Se volete mostrare la lisi cellulare indotta dal batteriofago, fate svolgere agli studenti anche la parte B nell’esercitazione. Le piastre a cui è stata aggiunta la quantità maggiore di virus potrebbero apparire come “rovinate” dopo l’incubazione a causa della lisi cellulare. Se usate del top agar morbido per piastrare le cellule il risultato sarà migliore (questo metodo non è, tuttavia, necessario; non vi preoccupate se non sapete come fare).
Riguardo alla mutazione ambra, spiegate solo quanto
pensate sia necessario: potreste anche limitarvi a dire ai
vostri studenti che le cellule del ceppo BE non permettono la crescita del fago T4 mentre le CR63 la permettono.
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Suggerimenti
Potreste decidere di far leggere ai vostri studenti l’esercitazione il giorno prima della lezione. Parlate loro delle basi scientifiche e fate in modo che disegnino un diagramma di flusso dell’esperimento basandosi sulle opzioni che avete scelto. Gli studenti potranno rispondere
a molte delle domande prima di fare l’esperimento.
L’esercitazione può essere modificata per studenti di livello avanzato facendo loro produrre il lisato per la trasduzione o facendo recuperare il plasmide in forma circolare a partire dalle cellule trasdotte, utilizzando il protocollo di miniprep illustrato in DNA Science.
!Risposte alle domande per gli studenti
– Parte A
1. La sospensione del fago è stata diluita in maniera da
ottenere un numero sufficiente di cellule trasdotte in
una o due piastre. La sospensione originaria era troppo concentrata e avrebbe prodotto troppe cellule trasdotte.
2. Non ci dovrebbero essere colonie nella piastra senza fago. La piastra contiene, infatti, ampicillina e la
provetta che contiene cellule senza fago dovrebbe
contenere solo Escherichia coli del ceppo BE. Tale
ceppo non è resistente all’ampicillina e non dovrebbe crescere nella piastra. Se vedete delle colonie isolate significa che c’è stata contaminazione: o del fago è stato accidentalmente aggiunto ai batteri, dando luogo ad alcune cellule trasdotte resistenti all’ampicillina, oppure la coltura era contaminata con degli organismi resistenti all’ampicillina. La ragione che
ci ha spinto a preparare una piastra senza fago è quella di avere un controllo negativo. Questa piastra dovrebbe servire a verificare il fatto che senza l’aggiunta di un fago trasducente non ci sono cellule resistenti
all’ampicillina nella cultura. Se la piastra senza fago
non contiene colonie possiamo concludere che le colonie ampicillina-resistenti che si vedono nelle piastre che contengono il fago sono dovute al fago.
3. Le colonie che crescono nella piastra a cui è stato
aggiunto il fago sono trasdotte (a meno che non ci
siano colonie anche nella piastra senza fago, nel
qual caso non possiamo essere sicuri di ciò che esse rappresentano). Esse conterranno il DNA plasmidico trasdotto dal fago. Ci dovrebbero essere approssimativamente 10 volte più colonie nella piastra
marcata come “non diluito” di quante ce ne siano
nella piastra “1 a 10” poiché la sospensione fagica
non diluita dovrebbe avere 10 volte più fagi della
diluizione 1 a 10. A sua volta la piastra 1 a 10 dovrebbe avere 10 volte più colonie della piastra 1 a
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100 poiché ad essa è stata aggiunta una sospensione fagica 10 volte più concentrata (e quindi 10 volte più fagi).
4. Sulla piastra non diluita ci si aspetta di trovare 500
colonie in quanto contiene 10 volte più lisato fagico.
Nella piastra 1 a 100 ci si aspetta di trovare cinque
colonie (vedi la domanda 3).
– Parte B
La piastra senza fago dovrebbe presentare un tappeto
uniforme di cellule che la ricoprono; le piastre a cui è
stato aggiunto il fago dovrebbero apparire o completamente vuote (se tutte le cellule sono state lisate) o screziate o macchiate (se solo alcune cellule sono state lisate). Le piastre potrebbero anche sembrare tutte simili, a seconda della capacità di diffondersi che ha avuto
il fago.
Le piastre con il fago dovrebbero risultare differenti
dalle piastre senza fago. La differenza sta nel fatto che
il fago è in grado di lisare le cellule CR63 e i nuovi
fagi prodotti possono poi infettare le cellule vicine.
Potrebbero anche non esserci affatto cellule che crescono sulle piastre con il fago a causa della diffusione del fago in grado di riprodursi. D’altro canto potrebbe esserci qualche segno di crescita cellulare, a
seconda dell’efficienza della diffusione del fago.
2. Lo scopo di preparare una piastra senza fago è quello di mostrare quale sia l’aspetto di una normale piastra di cellule CR63 in modo da poterla confrontare
con le piastre in cui è stato aggiunto il fago. Le differenze fra le piastre con e senza fago (che sono state trattate in maniera identica, ad esclusione dell’aggiunta del fago) sono attribuibili al fago stesso. Le piastre senza fago rappresentano un controllo.
1.
Letture scelte
Micklos, D., and G. Freyer. 1990. DNA Science: a First Course
in Recombinant DNA Technology. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Questo testo di
facile lettura (sebbene un po’ vecchio) racconta la storia
dello sviluppo della biologia molecolare, spiegandone le
basi scientifiche. Il testo copre tutte le principali tecniche
della scienza del DNA più una serie di applicazioni. Il libro
può essere utilizzato come testo di riferimento per un corso
di biologia molecolare per studenti di livello avanzato degli
ultimi anni della scuola superiore o studenti universitari.
Esso costituisce anche un libro di riferimento di facile
lettura per i docenti. [Tr ad. it.: La scienza del DNA: corso
introduttivo sulle tecnologie del DNA ricombinante con
esercitazioni di laboratorio, Piccin, Padova 1996.]
Miller R., 1998. Bacterial gene swapping in nature. Scientific
American 278(1):67. [Tr ad. it.: “Scambio di geni tra
batteri”, Le Scienze, marzo 1998 Milano.]
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Trasferimento di geni
nelle piante mediante
Agrobacterium tumefaciens
Descrizione dell’esercitazione
a p. 245
In questa semplice esercitazione, gli studenti inoculeranno delle piante con il batterio Agrobacterium tumefaciens e osserveranno la conseguente formazione di un
tumore vegetale. Studenti principianti hanno effettuato
questa esercitazione con successo, sebbene i principi
scientifici di base siano abbastanza sofisticati anche per
studenti avanzati. Agr obacterium tumefaciens causa la
formazione di tumori in quanto trasferisce dei geni alla
pianta. Questa proprietà lo rende particolarmente utile
per l’ingegneria genetica in campo vegetale. La lezione
include informazioni sul modo in cui Agrobacterium tumefaciens è utilizzato in ingegneria genetica.
Lezioni richieste: una per inoculare le piante e pochi
minuti durante varie altre lezioni per l’osservazione.
Introduzione
Il comune batterio del suolo Agrobacterium tumefaciens
provoca una patologia denominata “galla del colletto” in
molte piante dicotiledoni. La galla del colletto è un tumore vegetale, il risultato di una proliferazione massiccia di cellule vegetali. I ceppi virulenti di A. tumefaciens
contengono geni che forzano le cellule vegetali a dividersi. A. tumefaciens provoca la galla del colletto inserendo questi geni e alcuni altri all’interno del genoma
della pianta ospite. In questo modo A. tumefaciens è un
ingegnere genetico naturale. È interessante notare che
A. tumefaciens, come molti biologi molecolari umani, usa
un plasmide per modificare il genoma delle piante. Il plasmide usato da A. tumefaciens è il plasmide “tumor-inducing” o Ti.
Sostanze chimiche secrete dai tessuti vegetali appena
danneggiati attraggono A. tumefaciens sul sito del danno. Il batterio si lega alle pareti delle cellule rotte (morte) e penetra al loro interno, da dove poi inietta un segmento del plasmide Ti nelle cellule vegetali sane adiacenti.
Il DNA batterico iniettato dirotta il macchinario della cellula vegetale, forzandolo ad eseguire compiti che supportano la crescita e la riproduzione del batterio A. tumefaciens. Le cellule vive che circondano il sito del danno proliferano, diventando un tumore, o galla, che ospita e protegge il batterio. Queste cellule tumorali, che si
dividono rapidamente, sintetizzano nuovi composti chimici, le opine, che costituiscono nutrienti fondamentali
per il batterio ma inutili per la pianta. Le opine sono costituite da amminoacidi legati a comuni intermedi metabolici, come il piruvato.
Differenti ceppi di A. tumefaciens inducono la produzione di opine diverse: le opine sintetizzate da un particolare tumore possono essere catabolizzate (demolite)
solo dal particolare ceppo che ha causato il tumore. Le
opine specifiche di un ceppo promuovono anche il trasferimento coniugativo dei plasmidi da ceppi di Agr obacterium virulenti a ceppi non virulenti (senza plasmide).
La galla indotta da A. tumefaciens è localizzata a livello
del suolo, dove le radici si congiungono al fusto (il colletto). Le opine specifiche di un ceppo prodotte da una
galla penetrano nel suolo, aiutando quel ceppo specifico di A. tumefaciens nella competizione con gli altri ceppi, in modo che il plasmide trasportato da tale ceppo viene trasferito con maggiore efficienza. Non si può forse
pensare che sia A. tumefaciens, sia il tumore vegetale da
esso indotto siano solo dei mezzi usati dal plasmide per
produrre più copie di se stesso?
Il plasmide Ti
Il plasmide Ti codifica proteine che mettono in grado
A. tumefaciens di infettare le piante e di indurre la formazione della galla. La porzione del plasmide Ti che viene inserita nel cromosoma della pianta è denominata
“DNA trasferito” o T-DNA. Questo segmento di DNA contiene geni che codificano la sintesi delle opine oltre a geni che favoriscono la proliferazione cellulare delle piante facendo aumentare la produzione di ormoni vegetali,
quali citochinine e auxine. Nessuno dei geni del T-DNA
è coinvolto nel processo di trasferimento.
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22 Trasferimento di geni nelle piante mediante Agrobacterium tumefaciens
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A sinistra del segmento T-DNA ci sono i geni di virulenza (vir) che codificano proteine che controllano le fasi
del processo infettivo: il legame del batterio alle pareti
cellulari vegetali e il trasferimento del T-DNA nelle cellule della pianta. Pertanto i geni vir risultano essenziali
per il trasferimento genico, ma essi stessi non vengono
trasferiti. I succhi secreti dalla pianta danneggiata inducono l’espressione dei geni vir. I geni per il catabolismo
delle opine e per il trasferimento coniugativo del plasmide sono localizzati altrove sul plasmide Ti.
A
T-DNA
Plasmide Ti
Cromosoma
della pianta
Nucleo
Cromosoma
batterico
Il plasmide Ti “disarmato”
La singolare biologia di A. tumefaciens fornisce uno strumento fondamentale per l’ingegneria genetica vegetale.
Prima di poter sfruttare le capacità naturali di ingegneria
genetica di A. tumefaciens, i ricercatori devono però “disarmare” il plasmide Ti, rimuovendone i geni che causano la formazione del tumore. I geni vir che controllano la capacità di trasferimento genico restano, invece, intatti. I ricercatori, a questo punto, possono sostituire i geni del T-DNA con uno o più geni esogeni che vogliono
inserire nella pianta (Figura 22.1). Il plasmide “disarmato”, contenente il nuovo gene (o i nuovi geni), viene introdotto di nuovo in A. tumefaciens, che viene fatto crescere in coltura in modo da produrre molti batteri ingegnerizzati. I frammenti delle piante che devono essere
ingegnerizzati vengono quindi messi in soluzione insieme agli A. tumefaciens geneticamente modificati.
A tutt’oggi, i biologi vegetali utilizzano plasmidi di A. tumefaciens disarmati come vettori per la trasformazione
genetica di una vasta gamma di dicotiledoni. Più di 20
piante importanti per l’agricoltura sono state ingegnerizzate con successo utilizzando A. tumefaciens. L’ingegnerizzazione di un determinato carattere di interesse all’interno di una pianta di solito comprende due differenti
processi biotecnologici: la tecnologia del DNA ricombinante viene utilizzata per isolare i geni di interesse, per
prepararli allo spostamento nella nuova pianta ospite e
per spostarli materialmente in singole cellule vegetali.
Tuttavia le cellule vegetali ingegnerizzate, da sole, non
sono di molta utilità per la maggior parte degli agricoltori e dei giardinieri, che hanno bisogno di piante intere. Una volta quindi che singole cellule vegetali hanno
ricevuto l’informazione genetica, il problema diventa come generare piante intere da queste cellule.
La tecnologia utilizzata per generare piante intere a partire da cellule o tessuti singoli è chiamata coltura tissutale vegetale. Con l’uso di speciali terreni e trattamenti
ormonali è possibile generare una pianta completa a partire da una singola cellula. La coltura tissutale vegetale
rende pertanto possibile ingegnerizzare geneticamente
singole cellule vegetali e successivamente ricreare piante intere ingegnerizzate.
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Agrobacterium
tumefaciens
Cellula
vegetale
B
Geni per la
formazione
del tumore
Geni per
la sintesi
dell’opina
Confini
del T-DNA
Geni
di virulenza
Geni del
catabolismo
dell’opina
Plasmide Ti
Gene
esogeno
Confini
del T-DNA
Geni
di virulenza
Geni del
catabolismo
dell’opina
Plasmide Ti “disarmato”
contenente il nuovo gene
Figura 22.1 Trasferimento del T-DNA di Agrobacterium ad una
cellula vegetale.
A. tumefaciens è un vettore efficiente per il tabacco, le
petunie, il pomodoro ed altre dicotiledoni (cioè piante
che hanno due foglie embrionali), ma non può penetrare nelle cellule della maggior parte delle monocotiledoni. Questa è una limitazione importante visto che le monocotiledoni includono la maggior parte delle varietà cerealicole di valore alimentare quali mais, grano, orzo, riso e segale. Questo difetto ha spinto i ricercatori a guardare oltre A. tumefaciens, per trovare metodi di trasferimento di DNA esogeno nelle monocotiledoni.
– Microiniezione
La microiniezione è una versione recente di una vecchia
idea. I biologi usavano, già alla fine dell’800, sottili microstrumenti di vetro per dissezionare tessuti animali. Oggi i ricercatori utilizzano microscopi composti e micromanipolatori con piccole pipette di vetro per iniettare il
DNA direttamente nel nucleo di cellule vegetali. La maggior parte delle cellule vegetali tuttavia ha pareti così
spesse che, di solito, devono essere eliminate mediante
C. Il trasferimento dell’informazione genica
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digestione enzimatica, prima che il DNA possa esservi
iniettato. Tali cellule prive di parete, denominate protoplasti, possano essere usate per formare delle intere piante in vitro.
•
•
•
•
– Elettroporazione
Utilizzando l’elettroporazione, i ricercatori inducono uno
shock elettrico sui protoplasti che diventano così ricettivi al DNA esogeno. Una scarica elettrica ad alta tensione apre temporaneamente dei fori nelle membrane dei
protoplasti, permettendo al DNA esogeno di penetrarvi,
prima che la membrana si risigilli autonomamente. I protoplasti possono poi essere coltivati fino ad ottenere delle intere piante.
•
– Biolistica
Quando i vettori batterici, la microiniezione, l’elettroporazione o altre tecniche non sono utilizzabili per una particolare pianta, i ricercatori sempre più spesso si rivolgono alla “biolistica”: parola che combina il termine “biologia” con “balistica”. Utilizzando una “pistola” calibro
0,22 soprannominata “Bioblaster”, i biologi molecolari
vegetali bombardano le cellule con microproiettili metallici ricoperti di DNA. I ricercatori hanno già utilizzato
questa pistola per trasformare lieviti, alghe, piante superiori, cellule animali e umane, e prevedono che questo
possa diventare uno degli strumenti più utili e versatili
per l’ingegneria genetica vegetale.
Esercitazione pratica
In questa esercitazione, gli studenti produrranno delle lesioni a fusti e foglie di piante del genere kalanchoe e le
inoculeranno con A. tumefaciens. Sono disponibili varie
piante del genere kalanchoe, una delle quali, Kalanchoe
daigr emontiana, è una pianta ornamentale in vendita
presso i fioristi.
Obiettivi
•
•
•
•
•
•
•
Stuzzicadenti sterili
Portaprovette
Due pezzi quadrati di Parafilm, 1 cm ! 1 cm
Una provetta contenente da 5 a 10 ml di acqua sterile
Due piccole piante del genere kalanchoe o altre dicotiledoni (non Brassicacee)
Accesso ad una coltura su agar inclinato (agar slant)
di Agrobacterium tumefaciens
Una soluzione di Lysol in acqua (30 ml di Lysol in 4
litri di acqua) o un’altra soluzione disinfettante
Un ago da inoculo
Un fornello ad alcol o un becco Bunsen
Alcol denaturato e bastoncini cotonati o batuffoli di
cotone per pulire la superficie delle piante
Campioni di piante del genere kalanchoe e colture di
Agrobacterium tumefaciens possono essere ordinati
alla Carolina Biological Supply Company. Agrobacterium tumefaciens può essere ordinato anche ad altre ditte di materiale biologico.
Il Plant Cancer Kit della Carolina Biological Supply
Company può essere utilizzato in questo procedimento. In tale kit l’organismo sperimentale è il girasole.
Preparazione
Preparate dei lucidi dei diagrammi se volete utilizzarli
per discutere la biologia del plasmide Ti.
Raccogliete i materiali e preparate il disinfettante.
Procedimento
Fate leggere agli studenti il materiale introduttivo dell’esercitazione. Assicuratevi che capiscano come funziona
il plasmide Ti e come può essere utilizzato come vettore per l’ingegneria genetica. Fate loro inoculare le piante seguendo il protocollo che avete loro fornito.
Suggerimenti didattici
•
Materiali
Ciascun gruppo di studenti avrà bisogno di:
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Possibili fornitori del materiale
Al termine di questa esercitazione, gli studenti dovrebbero essere in grado di:
1 . Spiegare le basi biologiche molecolari della galla del
colletto e della formazione del tumore vegetale.
2. Descrivere come A. tumefaciens può essere usato per
modificare geneticamente le piante.
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•
Assicuratevi di riassumere le procedure di sicurezza
agli studenti prima di cominciare. Ricordate loro che
l’alcol denaturato è infiammabile; assicuratevi che
sia tolto dal banco di lavoro prima che i fornelli vengano accesi. L’intero procedimento dovrebbe essere mostrato dal docente prima che inizino gli studenti.
Mostrate agli studenti una pianta infettata con una
galla del colletto, se ne avete una disponibile. Po-
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22 Trasferimento di geni nelle piante mediante Agrobacterium tumefaciens
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•
•
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trebbero infatti volerci delle settimane prima che gli
studenti vedano formarsi una galla nelle loro piante.
La differente suscettibilità di diverse piante può essere presa in esame. Le monocotiledoni e le piante
del genere brassica (ad esempio broccoli, cavolfiore,
cavolo rapa) risultano resistenti all’infezione.
Differenti porzioni di piante diverse possono essere
lesionate e analizzate per verificarne la suscettibilità
all’infezione.
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Letture scelte
Chilton, Mary-Dell. 1983. A vector for introducing new genes
into plants. Scientific American 48(6):50–59. [Tr ad. it.: “Un
vettore che introduce nuovi geni nelle piante”, Le Scienze,
agosto 1983 Milano.]
Ronald, P. 1997. Making rice disease-resistant. Scientific American 277(5):100.
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D. BIOLOGIA MOLECOLARE
E GENETICA
Questa serie di letture ed esercitazioni ha lo scopo di collegare la nostra conoscenza crescente della biologia molecolare alla genetica classica (mendeliana). Nel preparare questa sezione, abbiamo dato per scontato che i vostri studenti abbiano già delle basi di genetica, apprese
nel corso introduttivo di biologia. Il nostro obiettivo non
è quello di insegnare la genetica classica, ma piuttosto
di dimostrare come le osservazioni della genetica classica possano essere spiegate e comprese tramite la biologia molecolare.
Per gli esseri umani, generalmente, gli esseri umani stessi risultano più interessanti di qualsiasi altro soggetto.
Sfortunatamente si tratta di un sistema inadatto alla descrizione della genetica. In confronto ai sistemi sperimentali in cui ci sono ceppi puri e una quantità enorme
di dati genetici, la nostra comprensione della genetica
molecolare umana è scarsa. Di fatto, gran parte delle conoscenze della biologia molecolare umana deriva dal
confronto con sistemi animali. Abbiamo imparato che cosa cercare studiandolo negli animali e poi lo abbiamo ritrovato in noi stessi.
Abbiamo scelto come organismo modello ciò che può
essere considerato la seconda miglior scelta: il cane.
Questa lezione comincia con una discussione di semplici casi di variazione del colore del mantello dei cani, collegando alle osservazioni genetiche una spiegazione molecolare. La spiegazione si basa sulla conoscenza delle funzioni di enzimi e di recettori proteici e
sugli effetti delle mutazioni sulla funzione delle proteine. Il cane è un buon mezzo per ripassare questi concetti fondamentali.
Dopo aver studiato l’ereditarietà delle variazioni del mantello dei cani, il capitolo successivo mostra esempi di genetica umana che si basano sulla stessa biochimica ed
include letture e discussioni di problemi inerenti a malattie genetiche umane che si concentrano sulle loro basi molecolari. Una delle esercitazioni, ad esempio, prevede che gli studenti progettino un test basato sul DNA
per l’anemia falciforme. È compresa anche una breve lettura sulla genetica molecolare del cancro.
Il capitolo finale di questa sezione si basa su un articolo, uscito per la prima volta sullo Smithsonian nel febbraio 2006, che racconta il lavoro di un genetista medico nelle comunità degli Amish e dei Mennoniti in
Pennsylvania e mostra molti esempi reali dei principi trattati in queste esercitazioni.
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23 Genetica mendeliana a livello molecolare: dominanza e recessività
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Genetica mendeliana
a livello molecolare:
dominanza e recessività
Descrizione dell’esercitazione
! p. 248
Questo capitolo contiene una lettura e un’esercitazione
teorica che mostrano il legame fra la genetica dei caratteri dominanti e recessivi osservati e la biologia molecolare, utilizzando come esempio il colore del mantello del
Labrador retriever. Gli studenti devono leggere, rispondere alle domande e risolvere i problemi. L’esempio riportato in questo capitolo è semplice; il Capitolo 24 ne
elaborerà il concetto per introdurre un altro livello di
complessità.
Questa esercitazione dà per scontato che gli studenti abbiano già seguito delle lezioni di genetica classica nel
loro corso introduttivo di biologia e non intende soltanto
fornire elementi di genetica, ma piuttosto cerca di spiegare le osservazioni di genetica classica attraverso la biologia molecolare che ne è alla base. Sebbene siano introdotti qui i termini dominante, recessivo, genotipo e
fenotipo, ciò deve essere inteso come ripasso. È essenziale che gli studenti abbiano già capito la genetica della formazione dei gameti prima di iniziare questa sezione, e potrebbero avere bisogno di ripassare prima la
meiosi.
Rispetto alla precedente edizione di questo libro, abbiamo cambiato il modo in cui ci riferiamo ai geni delle proteine coinvolte nella produzione del pigmento. Dai tempi di quella edizione, c’è stata un’esplosione nella ricerca sul genoma e sulla biologia molecolare del cane, inclusa la pubblicazione dell’intera sequenza del suo genoma. Di fatto i cani di razza pura sono attualmente considerati un organismo modello per la ricerca genetica.
Nella letteratura scientifica sono apparsi molti articoli in
cui i ricercatori hanno studiato i geni della colorazione
del mantello del cane e oggi le proteine correlate alla tirosinasi vengono chiamate proteine correlate alla tirosinasi 1 e 2 con l’acronimo TYRP1 e TYRP2 invece che
TRP-1 e TRP-2; abbiamo pertanto adattato questa edizione a questo uso dei termini.
Lezioni richieste: 1 o 2
Introduzione
Questo capitolo si focalizza sulla biologia molecolare della pigmentazione nera/marrone nel Labrador retriever,
sia perché è semplice sia perché la maggior parte degli
studenti conosce questi animali. Molti studenti potrebbero avere o aver avuto un Labrador retriever come animale da compagnia. La biologia molecolare della pigmentazione nera o marrone (chiamata cioccolato in questa razza) del Labrador retriever è basata sulla presenza
o assenza di un solo enzima.
Si può considerare che la via metabolica dei pigmenti
nero e marrone (le eumelanine) inizi con l’amminoacido tirosina. La tirosina è sintetizzata nelle cellule animali, ma può anche essere assunta dall’organismo per l’ingestione e digestione di proteine. Nei melanociti (le cellule che producono il pigmento) la tirosina è, per prima
cosa, convertita in dopachinone, il quale poi è convertito da un secondo enzima, TYRP2, nella forma marrone
del pigmento eumelanina. La eumelanina marrone è convertita, infine, nella forma nera da un terzo enzima:
TYRP1.
Se il melanocita non può produrre TYRP1, il pigmento
marrone non è convertito in nero e il cane risulta un Labrador cioccolato. La base genetica del colore marrone
del mantello del cane è costituita da un allele non funzionale di TYRP1. Il carattere cioccolato è recessivo rispetto al nero poiché una singola copia del gene TYRP1
funzionale è sufficiente a produrre abbastanza pigmento
nero. Un Labrador, per essere cioccolato, deve avere entrambe le copie dei geni di TYRP1 non funzionali.
Il Capitolo 24 presenta un’elaborazione di questo semplice sistema, con una spiegazione della biologia molecolare alla base della colorazione gialla del Labrador. Tale spiegazione coinvolge un recettore proteico e la regolazione della sintesi degli enzimi TYRP1 e TYRP2. Nel
Capitolo 25, la biologia molecolare della sintesi dei pigmenti viene messa in relazione con due fenotipi umani:
l’albinismo e la fenilchetonuria. Entrambe queste condizioni sono basate sulla stessa biochimica. Nel Capito-
D. Biologia molecolare e genetica
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lo 24 sarà presentato un riassunto di alcune ricerche sulla pigmentazione del cane pubblicate di recente che corrispondono perfettamente agli esempi di questi due capitoli.
Obiettivi
Dopo aver completato questa esercitazione, gli studenti
dovrebbero essere in grado di:
1 . Fornire una spiegazione del perché i Labrador cioccolato sono marroni, basandosi sulla biochimica della produzione del pigmento.
2. Spiegare cosa sia il gene “cioccolato” in termini molecolari (un allele non funzionale dell’enzima 3, che
converte la eumelanina marrone nella forma nera).
3. Spiegare questa frase: “affermare che un particolare
allele è dominante non spiega l’osservazione, la descrive soltanto”.
Procedimento
Gli studenti potranno svolgere questa esercitazione indipendentemente o in piccoli gruppi oppure potete discuterne in una lezione.
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b. Gli studenti probabilmente diranno che il rosso è
dominante. Questa affermazione si accorda con
gli esempi precedenti.
c. Gli studenti prevederanno probabilmente di vedere rossi i bocciolotondo ottenuti dall’incrocio
rosso ! bianco, in modo simile all’esempio dei
fiori porpora dei genifiore.
e. I bocciolotondo rosa hanno un allele funzionale
e uno non funzionale dell’enzima Q. Di conseguenza possono produrre soltanto metà della
quantità di enzima Q prodotta da una cellula con
due alleli Q funzionali. È possibile che un livello più basso di enzima Q abbia come conseguenza un più basso livello di sintesi del pigmento rosso della pianta, la quale potrebbe non
essere in grado di produrre abbastanza pigmento per colorare i propri fiori di rosso ma solo di
rosa.
!Risposte ai Fogli di lavoro
– Foglio di lavoro 23.1
Mezzanotte può dare ai suoi gameti l’allele per il colore
nero. Cacao può dare ai propri gameti l’allele per il colore marrone.
Tabella 1
!Risposte alle domande per gli studenti
1.
a.
b.
c.
d.
2. a.
b.
c.
3. a.
yy, seme verde.
YY, seme giallo.
Yy, seme giallo.
Il carattere seme giallo è dominante poiché è il
colore dei semi della progenie.
La varietà blu non può produrre l’enzima Y; per
questa ragione il pigmento blu non viene convertito in quello color porpora, e i fiori risultano
blu. Nella varietà blu, il gene per l’enzima Y è difettoso.
Il colore porpora è dominante e il blu è recessivo.
Le piante che contengono un gene funzionale per
l’enzima Y possono produrre l’enzima Y nelle loro cellule, di conseguenza, il pigmento blu è convertito in pigmento porpora. In questo modo una
pianta con un unico “gene blu” (un allele non funzionale dell’enzima Y) e un gene “porpora” (un
allele funzionale dell’enzima Y) risulterà porpora.
Il carattere porpora è di conseguenza definito come dominante rispetto al blu.
La variante rossa può produrre l’enzima Q e può
convertire la sostanza bianca in un pigmento rosso. La variante bianca non sintetizza l’enzima Q e
di conseguenza non ha pigmento rosso.
In dividuo
Gen i del color e
del man tello
Color e del man to
Mezzanotte
Cacao
Cuccioli
BB
bb
Bb
Nero
Cioccolato (o marrone)
Nero
Tabella 2 • Colore del mantello e TYRP1
In dividuo
Gen i del color e I melan ociti
del man tello
pr oducon o
TRP1 ?
Color e
del
man tello
Mezzanotte
Cacao
Cuccioli
BB
bb
Bb
Nero
Marrone
Nero
Sì
No
Sì
– Foglio di lavoro 23.2
Tabella 1 • Genetica dei bocciolotondi
Var ietà
Gen otipo
L’en zima Q
vien e pr odotto?
Color e
Rosso
Bianco
RR
WW (o rr)
Sì
No
Rosso
Bianco
Perché la progenie di un incrocio rosso ! bianco potrebbe essere rosa invece di rossa? (La risposta in Risposte alle domande per gli studenti, domanda 3.e)
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23 Genetica mendeliana a livello molecolare: dominanza e recessività
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Letture scelte
Barsh, G. 1996. The genetics of pigmentation: from fancy
genes to complex traits. Trends in Genetics 12:299–305. È
una rassegna piuttosto complessa della genetica della
pigmentazione.
Ellgren, H. 2005. The dog has its day. Nature 438:745–746.
Una notizia/commento sulla prima pubblicazione della
sequenza completa del genoma del cane.
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O’Brien, S., e W. Murphy. 2003. A dog’s breakfast? Science
301:1854–1855. Un riassunto dei progressi della genetica e
della genomica del cane.
Pennisi, E. 2004. Genome resources to boost canines’ role in
gene hunts. Science 304:1093–1094. Una discussione su
come i progressi nella comprensione del genoma del cane
e lo sviluppo di strumenti molecolari, come i marker
microsatellitari, hanno reso i cani di razza pura
un’inestimabile risorsa per i cacciatori di geni.
D. Biologia molecolare e genetica
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Genetica mendeliana
a livello molecolare:
un esempio di epistasi
Descrizione dell’esercitazione
! p. 252
Questa è una seconda esercitazione teorica con problemi da risolvere che unisce la genetica basata sull’osservazione alla biologia molecolare. Questa sezione spiega
il fenomeno del labrador giallo. Si basa sul concetto di
recettori proteici introdotto nel Capitolo 4.
Rispetto alla precedente edizione di questo libro abbiamo cambiato il modo con cui ci riferiamo all’ormone che
avevamo chiamato ormone stimolante i melanociti, e che
ora chiamiamo melanocortina 1 (MC1). Da quando è stata preparata la precedente edizione del libro, ci sono state molte nuove pubblicazioni sull’effetto degli alleli del
recettore della melanocortina 1 (MC1R) sulla pigmentazione degli animali, e tali lavori si riferiscono a questo
ormone usando la nuova terminologia, sebbene il termine ormone stimolante i melanociti si usi ancora. Alla
fine dell’introduzione forniamo un breve riassunto di alcuni importanti studi riguardanti il colore del pelo dei cani che sono stati pubblicati nello scorso decennio.
Lezioni richieste: 1
Introduzione
La colorazione nero/marrone dei labrador retriever è determinata dalla capacità dei loro melanociti di sintetizzare TYRP1 e convertire così l’eumelanina marrone in eumelanina nera. La biologia molecolare dei labrador gialli è molto diversa. Il colore giallo del pelo è dovuto alla
capacità dei melanociti del follicolo di ricevere un segnale ormonale che induce la produzione di TYRP2 e di
TYRP1. Questi enzimi, che convertono il dopachinone
rispettivamente in pigmenti marroni e neri, non sono
prodotti costitutivamente nei melanociti.
I melanociti ricevono un segnale dall’ormone MC1, che
stimola le cellule a produrre gli enzimi. Il segnale ormonale è trasmesso quando l’ormone si lega al recettore
proteico di membrana MC1R. Se non c’è questo legame
il segnale non è trasmesso e quindi TYRP2 e TYRP1 non
vengono sintetizzate.
Nei labrador gialli non c’è questa segnalazione. Il “gene
per il colore giallo del pelo” è un allele non funzionale
della proteina MC1R. I melanociti dei labrador gialli non
possono ricevere il segnale ormonale necessario per produrre TYRP2 e TYRP1. Nei melanociti dei loro follicoli,
la tirosina è convertita in dopachinone, ma la via di sintesi dell’eumelanina si ferma qui (Figura 24.1). Il dopachinone viene convertito in un’altra classe di pigmenti:
la feomelanina. Nei labrador gialli la feomelanina è gialla; per questo il pelo degli animali è giallo. Nel Capitolo 25 gli studenti apprenderanno che la feomelanina
umana è responsabile del colore dei capelli rosso fuoco
presente in alcune persone.
I Capitoli 23 e 24 forniscono un’ottima opportunità di ripassare la funzione dei geni (che dirigono la sintesi proteica) e i diversi ruoli svolti dalle proteine nella cellula.
Stato dell’arte della ricerca
Nell’ultimo decennio sono stati pubblicati alcuni studi
scientifici interessanti riguardanti gli esempi presi in esame in questi due capitoli. Nel 2000, un gruppo di ricercatori olandesi ha pubblicato uno studio nel quale venivano confrontate le sequenze del gene MC1R in labrador retriever neri e gialli. Questi studiosi hanno scoperto che i labrador gialli sono omozigoti per una mutazione C-T che cambia un’arginina in un codone di stop eliminando così i 10 amminoacidi carbossi-terminali del recettore.
In uno studio pubblicato nel 2002, i ricercatori dell’Università di Saskatchewan hanno analizzato il genotipo di
43 cani marroni (inclusi quelli marroni e bianchi), 34 cani neri (inclusi quelli tricolore, quelli neri e rossi e quelli bianchi e neri), e 23 cani che sono stati descritti come
gialli, rossi, albicocca, oro o arancio. Questi ricercatori
hanno prelevato delle biopsie di pelle e hanno eseguito
111
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24 Genetica mendeliana a livello molecolare: un esempio di epistasi
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delle PCR per determinare la sequenza codificante del
gene TYRP1. Hanno trovato due varianti comuni che
possono spiegare il colore del pelo marrone – un codone di stop prematuro nell’esone 5 e la delezione di una
prolina, sempre nell’esone 5 – in aggiunta ad una variante meno comune.
Il metodo di sequenziamento con la PCR usato non permette necessariamente di conoscere quale dei cromosomi (materno o paterno) porti una data variante, ma permette di conoscere quali alleli sono presenti. Tutti i 43
cani marroni hanno due o più varianti alleliche, il che
suggerisce che essi siano omozigoti per la versione inattiva di TYRP1. Viceversa, nessuno dei cani neri ha due
mutazioni inattivanti, e 10 cani neri hanno una sola variante, risultando così eterozigoti con un solo allele inattivo.
I cani gialli, rossi, albicocca, oro o arancio sono tutti
omozigoti per la stessa mutazione da C a T nel gene
MCR1 che i ricercatori olandesi hanno identificato nei labrador gialli. Questo gruppo di 23 cani contiene 13 cani
con il naso nero e 10 cani con il naso marrone. I ricercatori hanno analizzato i loro alleli del gene TYRP1 e
hanno trovato che i cani con il naso marrone hanno la
stessa variante del gene TYRP1 dei cani marroni.
Nelle popolazioni naturali, al contrario delle popolazioni di razza pura, l’associazione tra il gene MC1R e la pigmentazione non è così assoluta, anche se l’associazione
rimane comunque forte. Molti studi hanno associato varianti del gene MC1R umano (chiamato nell’uomo sia
MSHR che MC1R), con i capelli rossi e anche con un aumentato rischio di sviluppare il melanoma. Queste ricerche sono raccolte nella banca dati OMIM (“Online Mendelian Inheritance in Man”, vedi il Capitolo 34, Bioinformatica; se siete interessati cercate nella banca dati il gene MC1R).
In uno studio pubblicato nel 2006, i ricercatori dell’Università di San Diego-California e dell’Università della Carolina del Sud hanno analizzato il genotipo di topi appartenenti a popolazioni naturali di Per omyscus polionotus. Molte popolazioni di questa specie sono grigiomarrone, mentre la popolazione che vive sull’isola di
Santa Rosa nel golfo della Florida ha un colore molto più
chiaro. Questi animali vivono su un terreno formato da
sabbia chiara, perciò la loro pigmentazione chiara gli permette di nascondersi meglio dai predatori.
I ricercatori hanno sequenziato il gene MC1R nei topi che
vivono sulla spiaggia e nei topi di terraferma ed hanno
trovato che i topi di spiaggia hanno una differenza in un
solo nucleotide che comporta il cambiamento di un’arginina (un amminoacido carico positivamente) in cistei-
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na (un amminoacido privo di carica) nel dominio intracellulare della proteina. I ricercatori hanno studiato colture cellulari ingegnerizzate in modo da esprimere o la
versione del recettore dei topi di terraferma o quella dei
topi di spiaggia e hanno scoperto che la versione del recettore dei topi di spiaggia ha sia una minore affinità di
legame per l’ormone sia una minore risposta intracellulare. Il recettore MC1R comunque non spiega completamente il motivo della pigmentazione dei topi di spiaggia. Gli incroci tra i topi di spiaggia e i topi di terraferma hanno mostrato che il colore non segrega perfettamente con gli alleli del gene MC1R, e un secondo tipo
di popolazione chiara nella costa atlantica della Florida
presenta alleli normali per il gene MC1R.
Obiettivi
Alla fine di questa esercitazione, gli studenti saranno in
grado di:
1 . Spiegare perché l’eliminazione della proteina MC1R
produce dei labrador retriever gialli.
2. Guardare la foto di un labrador giallo, dire di che colore sarebbe stato il suo pelo se avesse avuto una proteina MC1R funzionale, e dire il genotipo del cane a
livello del locus nero/marrone.
3. Prevedere il genotipo e il fenotipo della progenie derivata da incroci tra labrador di colore nero, cioccolato e/o giallo.
Materiale
Esercitazione e Fogli di lavoro.
Preparazione
Se necessario preparare fotocopie del materiale.
.
!Risposte alle domande per gli studenti
Il genotipo di entrambi i genitori dei cani era Bb. Un
quarto della progenie dovrebbe essere BB (nera), metà Bb (nera) e un quarto bb (marrone).
2. Questi genitori hanno un genotipo Rr nel locus del
gene MC1R. Una copia funzionale del gene è necessaria per produrre una proteina MC1R funzionale.
Quando questi cani vengono incrociati, un quarto
della loro progenie dovrebbe essere RR (nera), metà
Rr (nera) e un quarto rr (gialla). Le loro labbra e i loro nasi sono neri perché hanno almeno un gene B
nel locus nero/marrone, il che implica che possano
produrre TYRP1 e di conseguenza il pigmento nero.
1.
D. Biologia molecolare e genetica
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Il gene R riguarda solo i melanociti nel follicolo del
pelo.
3. I genotipi e i fenotipi della progenie possono essere
previsti nel modo seguente: un quarto BbRr (labrador nero), un quarto bbRr (labrador cioccolato), un
quarto Bbrr (labrador giallo con labbra nere), e un
quarto bbrr (labrador giallo con labbra marroni).
Letture scelte
Everts, R. E., J. Rothuizen, e B. A. van Oost. 2000.
Identification of a premature stop codon in the melanocyte
stimulating hormone receptor gene (MC1R) in Labrador
and Golden retrievers with yellow coat colour. Animal
Genetics 31:194–199.
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Hoekstra, H., R. Hirschmann, R. Bundey, P. Insel,
e J. Crossland. 2006. A single amino acid mutation
contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science
313:101–104.
Schmutz, S. M., T. G. Berryere, e A. D. Goldfinch. 2002.
TYRP1 and MC1R genotypes and their effects on coat color
in dogs. Mammalian Genome 13:380–387.
!Risposta al Foglio di lavoro 24.1
Genotipo del gamete maschile:
Genotipo del gamete femminile:
Genotipo dei cuccioli:
Fenotipo dei cuccioli:
BR
br
BbRr
nero
!Risposta al Foglio di lavoro 24.2
Questo genotipo sintetizza:
Genotipo
Numero di presenze
nel quadrato di Punnett
MC1R?
TYRP1?
Fenotipo
Colore
del pelo
Colore
delle labbra
BBRR
1
Sì
Sì
Nero
Nero
BBRr
2
Sì
Sì
Nero
Nero
BbRr
4
Sì
Sì
Nero
Nero
BbRR
2
Sì
Sì
Nero
Nero
Bbrr
2
No
Sì
Giallo
Nero
BBrr
1
No
Sì
Giallo
Nero
bbRR
1
Sì
No
Marrone
Marrone
bbRr
2
Sì
No
Marrone
Marrone
bbrr
1
No
No
Giallo
Marrone
– Riassunto
Fen otipo
Labrador
Labrador
Labrador
Labrador
nero
cioccolato
giallo con labbra nere
giallo con labbra marroni
Numer o di pr esen ze
n el quadr ato di Pun n ett
9
3
3
1
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D. Biologia molecolare e genetica
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Genetica molecolare umana
Descrizione dell’esercitazione
! p. 256
Questa esercitazione estende agli esseri umani la discussione delle basi molecolari della genetica. Nel capitolo è inclusa un’ampia introduzione per i docenti, che
comprende una trattazione piuttosto tradizionale delle
anomalie cromosomiche e delle malattie legate a singoli geni. La parte introduttiva per gli studenti si concentra
su specifiche malattie causate da singoli geni e sulle difficoltà di studiare la genetica negli esseri umani. Saranno fornite alcune informazioni riguardanti casi immaginari ma agli studenti sarà richiesto di applicare alle malattie umane quanto hanno appreso in questo libro, soprattutto nei due capitoli precedenti.
La parte introduttiva per gli studenti contiene la descrizione della scoperta della fenilchetonuria (PKU) e del
modo in cui è stata dedotta la genetica dell’anemia falciforme. Alla fine ci sono tre esercizi e alcune domande
come spunti di riflessione. Le domande possono essere
usate per ampliare la discussione effettuata in classe e
per rivedere i concetti riguardanti la relazione esistente
tra la struttura e la funzione delle proteine, l’analisi di
ibridazione e la meiosi. Gran parte del materiale presente
nel capitolo riservato ai docenti non è presentato in quello per gli studenti, ma queste informazioni possono essere fornite anche agli studenti. Questa esercitazione richiede che gli studenti conoscano il significato di carattere dominante e recessivo, il meccanismo di generazione dei gameti attraverso la meiosi, e abbiano svolto l’esercitazione sulla tipizzazione del DNA.
Questo capitolo comprende una lettura sulla genetica
molecolare del cancro. Il Capitolo 26 descrive il lavoro
che il medico genetista Holmes Morton ha svolto all’interno della comunità Amish.
Lezione richieste: 1 o 2
Introduzione
I nostri geni codificano tutte le proteine presenti nel nostro corpo: gli enzimi, le proteine strutturali, gli ormoni,
le proteine del sistema immunitario ecc. Alcune modificazioni che avvengono nei geni provocano cambiamen-
ti in queste proteine – assenza di espressione, espressione non corretta o espressione di una forma proteica
alterata – mentre altri cambiamenti non hanno alcun effetto. Una qualsiasi variazione nell’espressione della proteina può causare problemi. Alcune di queste risultano
fatali in stadi prenatali, altre causano uno sviluppo non
completo delle funzioni fisiche o mentali, altre ancora
provocano difetti metabolici cronici o indeboliscono il
sistema immunitario. Ogni malattia causata da mutazioni geniche è una malattia genetica. Le caratteristiche delle malattie genetiche possono essere molto diverse poiché dipendono dal tipo di alterazione e dal gene in cui
avvengono.
Le malattie genetiche possono essere divise in tre categorie: aberrazioni cromosomiche, malattie che coinvolgono un singolo gene e malattie multigeniche. Le aberrazioni cromosomiche includono la mancanza di cromosomi, la presenza di cromosomi in eccesso, il riarrangiamento o la delezione di porzioni cromosomiche.
Le malattie causate da mutazioni in singoli geni (malattie mendeliane) comprendono caratteri dominanti o recessivi portati sia dagli autosomi sia dai cromosomi sessuali. Le malattie multigeniche comprendono una serie
di condizioni influenzate da molti geni. Non è possibile
determinare in modo preciso la frequenza delle malattie
genetiche nell’uomo, ma è stato stimato che circa il 2%
della popolazione sia affetto da una malattia mendeliana o da un difetto cromosomico.
Difetti cromosomici
Le aberrazioni cromosomiche comprendono l’acquisizione o la perdita di un intero cromosoma (aneuploidia),
la perdita di una porzione di uno o più cromosomi (delezione), lo spostamento di un segmento di cromosoma
su un altro cromosoma (traslocazione) e il cambiamento della direzione di una regione di un cromosoma (inversione). Considerando che sono coinvolti molti geni,
non sorprende che le aberrazioni cromosomiche siano
spesso letali durante le prime fasi di sviluppo embrionale. È stato stimato che fino al 50% degli aborti siano dovuti a difetti cromosomici. Esistono tuttavia aberrazioni
cromosomiche che permettono a un individuo di svilupparsi e nascere. Tali individui presentano “sindromi”,
molteplici sintomi e anomalie fenotipiche presumibilmente causate dal numero errato e/o dall’espressione
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25 Genetica molecolare umana
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non corretta dei vari geni coinvolti nell’anomalia cromosomica.
La malattia cromosomica più conosciuta è la sindrome di
Down, causata da un cromosoma 21 in eccesso, e che
ha un’incidenza di 1 caso su 600-800 nascite e comporta ritardo mentale, un aspetto caratteristico e difetti cardiaci congeniti. Il motivo per cui la presenza di una copia in più del cromosoma 21 produca questa serie di effetti non è noto.
Un’altra malattia cromosomica abbastanza comune è la
sindrome di Turner. Le persone affette da questa sindrome hanno un solo cromosoma X e sono prive del cromosoma Y o di un secondo X, fenotipicamente sono
femmine ma mancano di ovaie funzionali e non sviluppano i caratteri sessuali secondari, oltre a presentare altre anomalie. Questa sindrome si manifesta con un’incidenza di un caso ogni 1500-5000 bambine.
Un secondo difetto cromosomico che coinvolge i cromosomi sessuali è la sindrome di Klinefelter che è causata dalla presenza di due cromosomi X e un cromosoma Y. Questi individui sono fenotipicamente maschi, ma
non sono fertili poiché i loro testicoli non si sviluppano
correttamente; inoltre presentano altre anomalie mentali, fisiche e comportamentali. Questa sindrome compare
in un caso ogni 500-1000 bambini maschi.
Le delezioni cromosomiche, cioè la mancanza di una parte di un cromosoma, sono generalmente letali, ma in alcuni casi sono responsabili di malattie cromosomiche.
Alcune delezioni sono associate a tumori congeniti, come ad esempio il retinoblastoma o il tumore di Wilms.
Delezioni nel cromosoma Y possono portare allo sviluppo di individui XY che sono fenotipicamente femmine ma non fertili. Una delezione nel cromosoma 5 causa la sindrome del “cri-du-chat”, così chiamata per il particolare pianto dei bambini affetti da questa sindrome che
ricorda il miagolio di un gatto. Gli altri sintomi comprendono ritardo mentale, un aspetto caratteristico del
viso, ritardo motorio e della crescita.
La traslocazione, lo spostamento di una regione di un
cromosoma su un altro cromosoma, può essere più o
meno dannosa. Nelle traslocazioni dette bilanciate non
c’è né perdita né guadagno di materiale genetico, ma
soltanto un riarrangiamento dello stesso. Alcune di queste traslocazioni non causano problemi fino a quando
il cromosoma alterato non viene trasmesso ad un figlio
senza l’altro cromosoma che lo bilanciava (provocando nel figlio la presenza di copie di geni in più o la
mancanza di alcuni geni). Le traslocazioni possono anche essere coinvolte in patologie e ciò dipende a quanto pare dal sito di rottura o di riunione sul cromosoma.
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Le traslocazioni sono spesso presenti in vari tipi di cancro che si sviluppano successivamente nel corso della
vita di un individuo. Il cromosoma Philadelphia, che
causa una leucemia mieloide cronica, è il prodotto di
una traslocazione di un pezzo di cromosoma 22 sul cromosoma 9. Il linfoma di Burkitt (un tumore maligno
delle cellule che producono anticorpi) è associato alla
traslocazione di una regione del cromosoma 8 sul cromosoma 14.
Le traslocazioni e le delezioni possono fornire importanti
indicazioni sulla posizione e sulla funzione di particolari geni. La traslocazione che provoca il linfoma di Burkitt trasferisce un oncogene (vedi la Lettura, Genetica
molecolare del cancro) in una regione cromosomica coinvolta nella produzione di anticorpi. Le “femmine” XY
descritte sopra hanno permesso ai ricercatori di mappare sul cromosoma Y quei geni che sono necessari per la
formazione dei caratteri maschili. La delezione presente
nel retinoblastoma ha condotto altri scienziati alla scoperta di un gene soppressore dei tumori (vedi la Lettura, Genetica molecolare del cancro).
Malattie multigeniche
Le malattie multigeniche sono spesso descritte con la
frase: “una tendenza ereditaria a sviluppare…”. Questa
frase può essere completata ad esempio con: “alta pressione sanguigna”, “diabete dell’adulto”, “malattia mentale”, o altre malattie. Le malattie multigeniche sono difficili da analizzare geneticamente poiché non mostrano
uno schema chiaro di eredità, inoltre vari fattori ambientali possono influire sull’insorgenza o meno della
malattia.
Il cancro è una malattia multigenica; le prove sperimentali dimostrano che il cancro si sviluppa in seguito al malfunzionamento di più geni. Normalmente, queste alterazioni avvengono in singole cellule durante l’età adulta e
non sono ereditate. Ci sono però famiglie che presentano difetti congeniti in geni specifici coinvolti nel cancro.
Queste famiglie ereditano una predisposizione allo sviluppo del cancro, di solito in un’età precoce rispetto alla norma (vedi la Lettura, Genetica molecolare del cancro).
Malattie causate da un singolo gene
Come dice il nome, le malattie causate da un singolo gene sono indotte dall’alterazione di un solo gene. Queste
malattie di solito sono classificate come dominanti o come recessive e la mutazione può essere sia su un cromosoma sessuale (legato all’X) sia su un autosoma (tutti i cromosomi tranne quelli sessuali sono chiamati autosomi e sono uguali nei maschi e nelle femmine). Ad
oggi sono state caratterizzate più di 3000 patologie causate da singoli geni.
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In generale, le mutazioni di un singolo gene provocano
assenza di una proteina o produzione di una forma alterata di una proteina. Una malattia dominante indotta
da un singolo gene, quindi, è una malattia in cui la mancanza della funzione di una proteina o la produzione di
una forma alterata di una proteina da una copia di un
gene è sufficiente a causare la malattia anche in presenza della proteina normale prodotta dalla seconda copia
del gene. Viceversa, in una malattia genetica recessiva,
la perdita di una proteina funzionale prodotta da un gene (o la produzione di una forma alterata) può essere
adeguatamente compensata dalla produzione della proteina normale dall’altra copia del gene.
Prendete in considerazione una mutazione in un gene
che codifica un enzima che rende tale enzima inattivo.
Un individuo eterozigote per questo gene mutante ha
una quantità di enzima funzionale che corrisponde a metà della quantità normale (l’altra copia del gene produce, infatti, una proteina funzionale). Se un individuo si
ammala dipende dal fatto che sia sufficiente o meno una
quantità dimezzata di enzima funzionale.
Ora pensate ad una mutazione in un gene codificante
una proteina strutturale. Supponete che questa mutazione provochi la formazione di una forma alterata della proteina strutturale. Se questa mutazione causi o meno una malattia in eterozigosi dipende dal fatto che il
singolo gene normale produca una quantità della proteina normale sufficiente per le necessità della cellula
e anche dalla possibilità che la presenza della proteina
mutante alterata interferisca con la costruzione della
struttura normale. Su un totale di circa 3000 malattie genetiche descritte nell’uomo, circa 1000 sono dominanti. Due patologie dominanti le cui cause non sono ancora note sono la polidattilia (dita soprannumerarie delle mani e dei piedi) e l’acondroplasia (un tipo di nanismo).
Ipercolesterolemia familiare
Un esempio di malattia genetica dominante la cui causa
è ben nota è l’ipercolesterolemia familiare. Gli individui
affetti hanno un livello di colesterolo molto elevato nel
sangue e di solito muoiono di infarto. Gli individui eterozigoti normalmente muoiono prima dei 60 anni di età,
mentre gli omozigoti muoiono molto prima. Questa malattia è causata da mutazioni nel gene che codifica il recettore delle lipoproteine a bassa densità (LDL-R). Il colesterolo nel sangue è legato alle LDL e le cellule catturano il colesterolo (necessario per diverse funzioni, tra
cui la produzione delle membrane cellulari e la sintesi di
ormoni) legando i complessi LDL-colesterolo grazie ai
recettori per le LDL presenti sulle membrane cellulari. Un
individuo con una copia del gene LDL-R non funzionale produce soltanto metà del numero di recettori, pro-
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vocando un’alta concentrazione di colesterolo nel sangue
e un’aumentata frequenza di infarto cardiaco. La presenza quindi di una singola copia mutante del gene LDL-R
causa la malattia.
Malattia di Huntington
La malattia di Huntington (HD) è un’altra malattia ereditaria autosomica dominante ed è caratterizzata dalla presenza di movimenti spasmodici involontari e da una progressiva perdita delle funzioni intellettive. I sintomi non
compaiono fino all’età adulta, normalmente intorno ai 40
anni, perciò un individuo può avere dei figli prima di sapere di esserne affetto (o che un suo genitore è affetto)
e può quindi trasmettere il difetto genetico. Il gene responsabile della malattia HD è stato identificato nel 1993
e si trova sul cromosoma 4.
Studi svolti su individui affetti e non affetti appartenenti
ad una stessa grande famiglia del Venezuela, hanno mostrato una differenza interessante e costante nei loro geni per la HD. Il gene contiene una ripetizione in tandem della sequenza CAG, che codifica una glutammina. La proteina HD (huntingtina) contiene una regione
di residui di glutammina come risultato di questa sequenza ripetuta. Negli individui sani di questa famiglia,
entrambe le copie del gene HD raramente mostravano
più di 35 ripetizioni del codone per la glutammina. Viceversa, negli individui affetti una copia del gene aveva almeno 40 ripetizioni in tandem. Infine, tra le persone che avevano un cromosoma con un numero di ripetizioni compreso tra 36 e 39 alcuni erano sani ma altri risultavano affetti da Huntington. La proteina huntingtina degli individui affetti si aggrega e forma filamenti in vitr o. La non corretta interazione proteina-proteina, causata dalla presenza della regione di poliglutammina troppo lunga, è probabilmente responsabile
della malattia. Una sola copia del gene con troppe ripetizioni causa la produzione di una proteina errata e
può alterare la funzione della proteina normale prodotta dall’altra copia del gene, spiegando così la dominanza genetica della malattia HD.
La malattia di Huntington è un esempio delle malattie
con espansione di triplette nucleotidiche ripetute. Sono
state identificate almeno 12 di queste malattie e tutte implicano un aumento nel numero di ripetizioni di triplette. Due tra le malattie con espansione di triplette più conosciute sono la sindrome dell’X fragile e la distrofia muscolare miotonica. In tutte queste malattie, c’è un’espansione di generazione in generazione della regione ripetuta nelle famiglie affette. L’aumento di lunghezza della
regione ripetuta è correlato con la gravità della malattia
e anche con l’aumento della probabilità di ulteriori
espansioni. Il motivo dell’espansione non è del tutto noto ed è al centro della ricerca attuale.
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Fibrosi cistica
La fibrosi cistica è la malattia ereditaria più comune tra
gli europei d’America ed è una malattia recessiva. I pazienti affetti da fibrosi cistica hanno una secrezione alterata dell’acqua e dei sali e ciò comporta la produzione
di muco anormalmente denso nei polmoni, nel pancreas
e in altri organi. La digestione e la respirazione risultano
alterate. Le infezioni polmonari sono molto comuni poiché la presenza di muco denso ostacola la normale rimozione dei batteri dai polmoni. Le persone affette normalmente muoiono prima dei 30 anni, ma terapie migliori permettono attualmente sopravvivenze maggiori.
Il gene coinvolto nella fibrosi cistica è stato identificato
nel 1989 e codifica una proteina (chiamata CFTR, regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica) che permette agli ioni cloruro di attraversare la
membrana cellulare. I portatori eterozigoti della fibrosi
cistica sono completamente sani, perciò, una sola copia
del gene CFTR produce una quantità di proteina sufficiente per le normali funzioni cellulari.
Il gene della fibrosi cistica si trova sul cromosoma 7 e
comprende 250 000 coppie di basi! Il messaggero di
CFTR, comunque, è lungo soltanto 6500 bp e la proteina è formata da 1480 amminoacidi. La mutazione più comune che causa la fibrosi cistica è una delezione di 3 bp
nell’esone 10 che comporta la delezione di una fenilalanina nella proteina CFTR (questo rappresenta un altro
esempio di come l’alterazione anche di un solo amminoacido possa compromettere drasticamente la funzione di una proteina). Ad oggi, sono state caratterizzate circa 180 diverse mutazioni in grado di causare fibrosi cistica. Alcune mutazioni determinano forme più gravi della malattia rispetto ad altre mutazioni, probabilmente perché portano a livelli diversi di carenza della funzione della proteina.
Anemia falciforme
L’anemia falciforme è la malattia causata da un singolo gene ed è più comune tra gli afroamericani, con un’incidenza di un caso ogni 600 afroamericani. Questa malattia dolorosa e alla fine mortale è causata da una forma alterata dell’emoglobina, la proteina che trasporta l’ossigeno negli eritrociti. L’emoglobina è formata da quattro catene proteiche. Le singole catene proteiche sono chiamate globine e sono codificate dai geni delle globine. Le persone hanno normalmente vari tipi differenti di geni delle
globine e ciascuno è denominato con una lettera dell’alfabeto greco: alfa (!), beta ("), gamma (#), delta ($) ed
epsilon (ε). Nell’adulto, il tipo più comune di emoglobina è la A formata da due catene ! e da due catene ".
L’anemia falciforme è dovuta ad una mutazione che modifica l’acido glutammico nella posizione 6 della cate-
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na " in valina. Questa mutazione può essere causata da
una mutazione puntiforme di una A in una T, che cambia il codone dell’acido glutammico, GAA, nel codone
per la valina, GTA (vedi la Tabella 4.1 nel Capitolo 4).
La catena " mutante provoca l’aggregazione dell’emoglobina (vedi il Capitolo 3), che porta ad un cambiamento della forma dei globuli rossi da rotonda a falciforme. Le cellule a forma di falce non passano bene attraverso i capillari causando così difetti nella circolazione.
Un portatore eterozigote di anemia falciforme non presenta sintomi clinici della malattia, però, in condizioni
particolari come bassa pressione dell’ossigeno, si possono osservare nel suo sangue i globuli rossi falciformi poiché la catena " mutante è prodotta in questi individui e
viene inserita nell’emoglobina insieme alle catene " normali (prodotte dalla copia sana del gene della "-globina). Si dice che questi portatori eterozigoti hanno il tratto falciforme.
È interessante il fatto che le persone con il tratto falciforme sono più resistenti alla malaria rispetto alle persone
con un’emoglobina A “normale”. La maggior parte degli
afroamericani discende dagli schiavi portati dall’Africa occidentale, una regione dove la malaria è endemica. Per
quegli antenati africani, avere una copia del gene dell’anemia falciforme era probabilmente un vantaggio.
La malattia di Gaucher
La malattia di Gaucher è una malattia autosomica recessiva che colpisce 1 americano ebreo su 2500. I pazienti con la malattia di Gaucher presentano fegato e
milza ingrossati e possono avere dolorose lesioni ossee. Sia la gravità della malattia, sia l’età d’insorgenza
sono molto variabili, anche se le forme più gravi compaiono precocemente. La malattia di Gaucher è causata dalla mancanza dell’enzima glucocerebrosidasi, che
scinde il glicolipide glucocerebroside (una combinazione di carboidrati e lipidi). Il gene che codifica questo enzima è stato identificato e clonato. Questo gene
si trova sul cromosoma 1, è formato da 11 esoni ed è
lungo circa 7500 bp, mentre il messaggero maturo è
lungo circa 2000 bp. Una copia non mutata del gene
evidentemente produce una quantità di enzima sufficiente per le necessità dell’organismo dato che gli eterozigoti sono sani.
Gli studi sui pazienti con la malattia di Gaucher hanno
mostrato la presenza di mutazioni diverse nel gene della glucocerebrosidasi. La natura della mutazione stessa
determina se la forma della malattia è grave o lieve, sebbene due individui con la stessa mutazione possano anche presentare sintomi che differiscono per la gravità
(forse a causa di effetti dovuti ad altri geni). Una mu-
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tazione comune che porta ad un fenotipo lieve è la sostituzione di una A in una G in posizione 1226, che produce il cambiamento di un amminoacido da asparagina a serina. Questa mutazione (1226G) si trova nel 75%
dei geni mutati nella popolazione ebrea. È probabile
che questa sostituzione amminoacidica lasci la proteina parzialmente funzionante, spiegando così la scarsa
gravità della malattia in questi casi. Due mutazioni comuni che provocano una malattia grave sono: la sostituzione di una singola base da T a C in posizione 1448,
che causa il cambiamento di una leucina in prolina, e
l’inserzione di una singola G in posizione 84, che causa la perdita del quadro di lettura. La perdita precoce
del quadro di lettura del gene porta verosimilmente alla perdita totale della funzione della proteina. Analogamente, dato che l’amminoacido prolina ha caratteristiche chimiche molto diverse da quelle della leucina,
la sostituzione nella proteina di una prolina al posto di
una leucina probabilmente modifica fortemente la struttura della proteina e quindi anche la sua funzione. Ci
si aspetterebbe che queste due mutazioni (la sostituzione della leucina con la prolina e la perdita del quadro di lettura) compromettano la funzione dell’enzima
molto di più della sostituzione di un’asparagina con una
serina. Il fatto che queste due mutazioni causino una
forma molto più grave della malattia è in accordo con
questa previsione.
La diagnosi delle malattie genetiche
e della condizione di portatore
Negli ultimi tre decenni, la capacità dei medici di diagnosticare le malattie genetiche è aumentata enormemente. Due fattori fondamentali alla base di questi miglioramenti sono stati: l’aumento della conoscenza delle cause di varie malattie genetiche e la maggiore facilità di analizzare il DNA. I miglioramenti nella chimica
analitica e nella biochimica hanno fornito metodi per
cercare i prodotti metabolici utili a identificare i difetti
enzimatici e le anomalie proteiche evidenti (come le
cellule falciformi), ma non tutte le malattie genetiche
hanno difetti rilevabili. Sebbene recentemente sia stata
identificata la proteina la cui alterazione è responsabile della fibrosi cistica, questa non è un enzima il cui
prodotto finale sia quantificabile e ad oggi non c’è un
saggio clinico per la sua funzione.
A volte ci sono problemi con la diagnosi prenatale anche quando è possibile fare un test alla ricerca di difetti
specifici. Ad esempio, per diagnosticare l’anemia falciforme con i mezzi tradizionali, si devono esaminare i
globuli rossi del sangue (l’emoglobina non è un enzima, ma il difetto strutturale presente nell’anemia falciforme può essere individuato analizzandone l’effetto
sulla forma dei globuli rossi). Sebbene sia possibile ottenere un campione di sangue fetale, questo procedi-
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mento comporta dei rischi significativi per il feto. Infine, anche molti dei nostri metodi migliori non sono in
grado di rilevare i portatori. Potrebbe essere di grande
importanza per i futuri genitori sapere se sono portatori di un gene per una malattia recessiva, così da poter eseguire test prenatali appropriati.
Ora che possiamo analizzare direttamente il DNA, è possibile fare a meno dei test sulla funzione delle proteine
e osservare direttamente i geni colpiti. Con l’analisi del
DNA, teoricamente è possibile individuare qualunque
malattia che coinvolge un gene la cui posizione è nota.
I test prenatali sul DNA possono essere eseguiti sulle cellule amniotiche. Anche se la proteina responsabile della
malattia (come l’emoglobina nel caso dell’anemia falciforme) non è prodotta nelle cellule del fluido amniotico,
i geni sono presenti e possono svelare se c’è il difetto. I
test sul DNA dei genitori possono fornire informazioni
sulla condizione di portatori.
Molti problemi etici devono essere considerati quando
si prendono in considerazione i test per le malattie genetiche. Ad esempio, si dovrebbero sottoporre a screening le popolazioni per i geni di malattie comuni? I datori di lavoro dovrebbero avere accesso ai dati sulla predisposizione genetica alle malattie dei dipendenti? Alle
persone con alcune predisposizioni (per esempio al
cancro) dovrebbero essere proibiti quei lavori che potrebbero aumentare il loro rischio di sviluppare la malattia (come ad esempio un lavoro che comporta l’esposizione all’amianto)? Chi dovrebbe prendere queste
decisioni?
Un buon modello per affrontare i problemi etici è presentato nel Capitolo 38. Questo modello obbliga gli studenti ad analizzare le loro opinioni e a incanalare la discussione lungo quelle linee. Vi raccomandiamo di fare
prima riferimento a questo capitolo se volete sollevare
questioni etiche da discutere con la vostra classe.
Obiettivi
Dopo aver completato questa esercitazione, gli studenti
dovrebbero essere in grado di:
•
•
Spiegare alcune delle considerazioni molecolari che
determinano se una malattia genetica è dominante o
recessiva.
Proporre una spiegazione basata sulla funzione della proteina per spiegare perché alcune mutazioni in
un gene causano una malattia lieve mentre altre provocano una malattia grave.
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Materiali
•
Lucidi o fotocopie (o altra fonte) del codice genetico
come riferimento per rispondere alla domanda 1.
tute”, con le ultime notizie sulla ricerca scientifica e con
strumenti didattici. Maggiori informazioni riguardanti
l’atlante genomico del cancro “Cancer Genome Atlas”
possono essere trovate alla pagina http://cancergenome.nih.gov.
Fonti del materiale
L’Howard Hughes Medical Institute pubblica una serie di
relazioni sulla scienza biomedica a partire dal 1990. L’istituto fornisce copie gratuite delle sue relazioni agli insegnanti. L’indirizzo è Howard Hughes Medical Institute, 4000 Jones Bridge Road, Chevy Chase, MD 208156789.
La banca dati “Online Mendelian Inheritance in Man”
(OMIM) è un archivio di malattie ereditarie umane. Per
ciascuna malattia viene fornita una voce contenente informazioni di base aggiornate regolarmente. Alcune delle voci sono piuttosto brevi; altre sono ampie e comprendono alcuni dettagli come la descrizione di modelli animali e le terapie geniche. Per consultare OMIM, è
necessario andare alla pagina principale di NCBI sul sito http://www.ncbi.nlm.nih.gov ed entrare in OMIM.
Una volta raggiunta la pagina principale, si può effettuare
una ricerca in OMIM scrivendo la parola di interesse nella casella in prossimità del margine superiore della pagina o fare click su ”search OMIM” nel menù a sinistra
della pagina. L’ultima opzione permette di restringere la
ricerca ai titoli, alle varianti alleliche, o altre opzioni. Come risultato della ricerca si avrà una lista di corrispondenze. Dopo aver selezionato un elemento della lista, si
ottiene un altro menu con scelte quali testo, storia e modelli animali (Text, History and Animal Model). L’opzione “Text” fornisce una storia della malattia con collegamenti a riferimenti bibliografici. Le voci di questa categoria sono tecniche e a volte schematiche e possono essere di difficile comprensione, ma possono essere utili
con un minimo di conoscenze di base. Navigare in questa banca dati sarà interessante per i vostri studenti.
Un’altra opzione di ricerca è “Search Gene Map”. Per
effettuare una ricerca è necessario conoscere il nome
esatto del gene di interesse. Per esempio, il nome del
gene per il Fattore VIII, il gene che è mutato nell’emoglobina A, è F8C. Digitando F8C si arriva alla posizione q28 del cromosoma X dove è localizzato il gene. Invece, se si digita “hemoglobin A” nella casella di ricerca della mappa del gene, non si troverà nessuna corrispondenza. Si può digitare il nome di un cromosoma,
ad esempio “X”, e scorrere la mappa dell’intero cromosoma X.
Nel sito http://www.genome.gov potete trovare il sito
internet del “National Human Genome Research Insti-
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Procedimento
Usate la parte introduttiva e le domande come meglio si
adattano alla vostra classe. L’introduzione per gli studenti
continua a concentrarsi sulla biologia molecolare che è
alla base delle malattie genetiche e tende a fornire un
punto di partenza per la discussione. Le domande possono essere discusse in classe, incluse in piccoli progetti di gruppo, o assegnate a singoli studenti.
Suggerimenti
•
•
•
•
Potrebbe essere necessario ripassare la meiosi e le
basi di genetica prima di iniziare questa parte.
Gli studenti potrebbero chiedere perché le persone
con PKU sono pigmentate, dato che non possono formare tirosina a partire da fenilalanina. La tirosina, un
amminoacido, è presente nelle proteine della dieta,
perciò i pazienti con PKU assumono la tirosina dalle
proteine che mangiano. All’interno dell’organismo, la
tirosina ha altri possibili destini oltre ad essere convertita in dopachinone e pigmenti. Ad esempio, è utilizzata nella sintesi proteica e può essere anche metabolizzata per fornire energia.
La storia della PKU può essere usata come esempio
del modo in cui un’osservazione seguita da un’indagine possa portare a un’importante scoperta. Una madre notò l’odore di rancido nel pannolino del figlio
con ritardo mentale e lo descrisse ad un suo parente
il quale aveva la curiosità e la formazione professionale per indagare questo fenomeno. In questo modo
è stata scoperta la PKU.
James Neel, il medico che chiarì la genetica dell’anemia falciforme e il tratto falcemico, aveva una lunga
esperienza nella genetica umana che comprendeva
lo studio degli effetti genetici delle esplosioni atomiche sugli abitanti di Hiroshima e Nagasaki e l’osservazione del comportamento di esseri umani “allo stato naturale” tra i nativi dell’America del Sud. La sua
vita e i suoi studi possono essere un argomento interessante per un progetto di studio. Nel 2000, il giornalista Patrick Tierney ha pubblicato un libro, Darkness in Eldorado (“Tenebre in Eldorado”), nel quale
dichiarava che Neel aveva commesso un atto eticamente scorretto se non addirittura criminale durante
la sua ricerca in Sudamerica. Un’indagine su queste
accuse da parte della Società americana di genetica
D. Biologia molecolare e genetica
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•
umana, così come di altri studiosi, ha dimostrato che
le accuse erano senza fondamento (vedi il riferimento bibliografico nelle Letture scelte). L’accusa più grave presente nel libro è quella che Neel avesse fatto
scoppiare deliberatamente un’epidemia di morbillo,
affermazione che è stata riportata da giornali e riviste di tutto il mondo. Gli studiosi che hanno valutato queste affermazioni dopo la loro pubblicazione,
hanno concluso che questa accusa infondata era “falsa e ingiusta” e che Tierney aveva “distorto i fatti per
creare un ritratto sbagliato di Neel”. Se agli studenti
capitasse di leggere Darkness in Eldorado, fate in modo che leggano questo documento che confuta ogni
accusa fatta da Tierney.
Il gene per il recettore della melanocortina 1 (MC1R)
responsabile del tipo di pigmentazione nel labrador
giallo ha un omologo nell’uomo. Gli individui che
non esprimono MC1R hanno i capelli rosso fuoco.
Queste persone hanno l’equivalente umano della pigmentazione dei labrador gialli (vedi nelle Letture scelte l’articolo di Barsh).
Possibili approfondimenti
•
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•
•
•
•
Studiate la vita e il lavoro di James Neel. Egli ha scritto un’autobiografia intitolata Physician to the Gene
Pool (vedi le Letture scelte).
Scoprite la dieta dei malati di PKU.
Invitate un relatore da un laboratorio che esegue test
sul DNA per trovare malattie genetiche. (Il direttore
del vostro laboratorio diagnostico dovrebbe sapere
dove si trova il più vicino).
Invitate qualcuno del vostro laboratorio diagnostico
a parlare degli screening di routine sulla salute dei
neonati.
Se conoscete qualcuno con la PKU, la fibrosi cistica
o qualche altra malattia genetica, chiedetegli se vuole fornire informazioni riguardanti la sua malattia alla vostra classe.
Invitate un consulente genetico a parlare alla vostra
classe (un’ostetrica o il direttore di un laboratorio diagnostico dovrebbe sapere dove trovarne uno).
!Risposte alle domande per gli studenti
1.
a. Sequenza normale: valina, istidina, leucina, treo-
nina, prolina, acido glutammico, acido glutammico. Sequenza mutante: valina, istidina, leucina,
treonina, prolina, valina, acido glutammico. La
mutazione che causa l’anemia falciforme è la sostituzione in posizione 6 dell’acido glutammico
con la valina.
b. La sequenza normale del gene della "-globina
contiene un sito di restrizione per MstII. La muta-
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zione che causa l’anemia falciforme elimina anche il sito di restrizione all’interno del gene. Perciò è possibile identificare la mutazione valutando la presenza del sito per MstII.
Al fine di eseguire questo esperimento, digerite
un campione di DNA con l’enzima MstII, separate i frammenti in un gel, e fate un Southern blot
per trasferire i frammenti su una membrana. Rivelate i frammenti con una sonda che si ibrida con
il DNA a cavallo del sito per MstII nel gene della
"-globina. Gli individui omozigoti normali avranno due bande che si ibridano con la sonda, una
lunga circa 1150 bp e l’altra circa 200 bp. Gli individui omozigoti affetti avranno una sola banda lunga circa 1350 bp. I portatori eterozigoti avranno
tre bande: 1350 bp (del gene mutante), 1150 bp
e 200 bp.
Gli studenti potrebbero mettere a punto un metodo usando MstII ed un secondo enzima. Se logicamente ben organizzato questo metodo potrebbe funzionare.
La fase dell’ibridazione è essenziale. Se gli studenti propongono semplicemente di tagliare il
DNA con MstII, separare i frammenti su gel ed
esaminare il gel colorato, ricordate loro che tutto quello che vedrebbero sarebbe una strisciata. Il genoma umano contiene circa 3 miliardi di
coppie di basi che generano un vasto numero
di frammenti MstII. L’ibridazione permette di osservare in modo specifico la regione di interesse.
2. a. Il fatto che la progenie sia sana o malata dipende da quali cromosomi sono stati ereditati. Supponete che un genitore abbia una traslocazione
bilanciata in cui una regione di un cromosoma 3
è attaccata ad un cromosoma 5. Questo genitore
ha anche una copia normale del cromosoma 3 e
una del cromosoma 5, perciò quando si hanno
quattro possibilità: 3, 5 (entrambi normali); 3*, 5*
(entrambi mutati); 3*, 5; 3, 5*. Due di queste combinazioni producono una progenie sana: 3, 5 e
3*, 5*. Le altre due combinazioni producono un
gamete con un’informazione genetica carente o
in eccesso che non può produrre una progenie
sana.
b. Il motivo più probabile è che dipenda dal punto
esatto in cui avviene la rottura e dal punto in cui
il segmento si riattacca. Se uno dei due eventi distrugge un gene importante, le conseguenze possono essere gravi. Le traslocazioni innocue a
quanto pare non interferiscono con la normale
espressione genica.
121
122
25 Genetica molecolare umana
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3. a. Usate questa domanda per far sì che gli studenti
si rendano conto che alcune mutazioni possono
avere effetti minimi sulla funzione della proteina,
mentre altre possono annullarla completamente.
È probabile che le mutazioni che causano malattie lievi lascino all’enzima un certo livello di funzionalità, così che i sintomi della malattia sono
presenti, ma non gravi. Le mutazioni che causano una forma grave della malattia eliminano del
tutto la funzione della proteina. Se volete, fornite
alla classe le informazioni sulle mutazioni specifiche presenti nell’introduzione.
b. Di nuovo, le mutazioni che producono malattie
lievi probabilmente sono causate da un enzima
con una funzionale parziale. Quella proteina parzialmente funzionale è presente nell’eterozigote,
il quale ha due geni mutati diversamente. Perciò
un paziente con una mutazione lieve e una grave mostra un certo livello di attività enzimatica,
diversamente da un paziente con due mutazioni
gravi, e la sua malattia dovrebbe essere più lieve.
4. a. Recessiva. Una copia funzionale del gene produce una quantità di proteina sufficiente ad adempiere completamente la funzione cellulare della
proteina e la copia non funzionale del gene non
interferisce.
b. Questa malattia sembra essere dominante o intermedia tra dominante e recessiva. Una persona
con due copie mutate del gene non può sopravvivere, dato che nella domanda viene affermato
che se una cellula non può produrre quella proteina muore. Se una persona con due copie mutate del gene sopravvive, allora la mutazione sembrerebbe essere intermedia tra dominante e recessiva. Una cellula con una singola copia funzionale del gene può sopravvivere, ma avrà dei
problemi, così un eterozigote non è totalmente sano come una persona che ha due copie funzionali del gene.
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5. Se volete, potete discutere questa domanda in clas-
se.
!Risposte al Foglio di lavoro 25.1
Giovanni
Aa
Genotipo
Fenotipo
Maria
Aa
Figlio normale
Figlio normale
Figlio con
albinismo
AA o Aa
AA o Aa
aa
Genotipo
Questo gene è il gene della tirosinasi. Il “gene dell’albinismo” è la versione (allele) non funzionale della tirosinasi.
2. L’albinismo è recessivo, quindi un individuo albino
ha due copie mutate del gene della tirosinasi e non
può produrre la tirosinasi. Normalmente, l’enzima tirosinasi converte la tirosina in dopachinone che è il
precursore nella biosintesi del pigmento. Se un individuo non può convertire la tirosina in dopachinone
perché manca della tirosinasi, allora questa persona
non può produrre pigmenti ed è albino.
3. Il gene dell’albinismo è recessivo, dato che una singola copia funzionale del gene della tirosinasi porta
alla produzione di una quantità sufficiente dell’enzima tirosinasi da permettere alla persona in esame di
sintetizzare una normale quantità di pigmento. Un
eterozigote, perciò, ha un fenotipo normale, e l’albinismo si manifesta solo se l’individuo ha i due alleli
del gene della tirosinasi mutati.
1.
!Risposte al Foglio di lavoro 25.2
Scrivete i genotipi negli spazi bianchi.
È possibile che questo gene sembri dominante se
i feti con due copie mutate del gene non possono completare lo sviluppo e muoiono nell’utero.
In questo caso, gli unici bambini nati sono gli eterozigoti, che risultano malati, e gli omozigoti normali. Dato che la trasmissione di una sola copia
del gene mutato può causare un danno, la malattia può sembrare dominante.
c. Questa malattia sembrerà dominante. Se una persona eredita una sola copia non funzionale del
gene, la proteina mutata che viene prodotta danneggerà la funzione della proteina normale prodotta dall’altra copia del gene. Perciò, un eterozigote sarà malato come una persona omozigote
per l’allele mutato.
Roberto
Susanna
Pp
Pp
Figlio
pp
Una forma non funzionale dell’enzima fenilalanina
idrossilasi (PH).
2. Ciascun genitore ha un gene PH mutato e un gene
PH normale. Il gene normale promuove la sintesi di
1.
D. Biologia molecolare e genetica
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una quantità sufficiente di enzima PH cosicché il genitore è normale. Il bambino, però, eredita un allele
mutato da ciascun genitore, perciò non potendo sintetizzare l’enzima PH ha la PKU.
3. È possibile, e dipende dal genotipo dei gameti che
danno origine al bambino. C’è una probabilità su
quattro che erediti i due alleli normali da Roberto e
Susanna e abbia così un genotipo PP. C’è una probabilità su due che erediti un allele normale ed uno
mutato e sia Pp, con un fenotipo normale. C’è una
probabilità su quattro che erediti due alleli mutati e
sia pp, con PKU. Il fatto che il primogenito di Roberto
e Susanna abbia la PKU non influisce sulla probabilità che il secondo figlio abbia la malattia.
4. Guarda la risposta alla domanda numero 2. L’enzima
PH converte la fenilalanina in tirosina. In assenza di
questo enzima, la fenilalanina è degradata a fenilchetone ed escreta nelle urine. Quantità elevate di fenilchetone nell’organismo portano ad un errato sviluppo del sistema nervoso, perciò il bambino mostra
un ritardo mentale. Livelli di tirosina nel corpo più
bassi del normale causano una pigmentazione chiara poiché la tirosina è un precursore nella biosintesi
dei pigmenti.
5. Il gene PKU è una versione mutata del gene per la
fenilalanina idrossilasi. È recessivo poiché una sola
copia funzionale del gene PH produce una quantità
sufficiente di enzima PH che permette di avere un fenotipo normale. Perciò un eterozigote con una copia
del gene PH normale ed una copia mutata è sano.
!Risposte al Foglio di lavoro 25.3
L’anemia falciforme è un tratto omozigote; il tratto falciforme è eterozigote.
2. Un bambino con l’anemia falciforme ha due alleli “falciformi” del gene della "-globina e deve aver ereditato un allele da ciascun genitore. Perciò, ciascun genitore deve avere un allele falciforme e deve quindi
avere un tratto falciforme. I fratelli avranno spesso un
tratto falciforme, poiché per ciascun bambino c’è una
probabilità su due di ereditare un allele falciforme e
un allele normale.
3. L’esperimento di elettroforesi esaminava il gene della "-globina. Gli individui con l’anemia falciforme
hanno la forma mutata della "-globina, mentre gli
individui sani hanno la forma normale. Gli individui
con il tratto falciforme sono eterozigoti con un allele falciforme ed uno normale. Le loro cellule sintetizzano entrambe le forme di "-globina, perciò entrambe le forme sono visibili nell’esperimento di elettroforesi.
4. Neel affermava che i pazienti con anemia falciforme
erano omozigoti per l’allele falciforme, mentre le persone con il tratto falciforme erano eterozigoti. Que1.
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sta conclusione prevede che le persone sane sintetizzino una forma della "-globina, i pazienti con l’anemia falciforme sintetizzino una forma diversa, e le
persone portatrici le sintetizzino entrambe (poiché
hanno un gene normale ed un gene mutato). I risultati dell’elettroforesi confermano la sua ipotesi.
Letture scelte
American Society of Human Genetics. 2002. Response to
allegations against James V. Neel in Darkness in El Dorado,
by Patrick Tierney. American Jour nal of Human Genetics
70:1–10.
Barsh, G. 1996. The genetics of pigmentation: from fancy
genes to complex traits. Trends in Genetics 12:299–305.
Un articolo abbastanza complesso sulla genetica della
pigmentazione.
Ellegren, H. 2005. The dog has its day. Nature 438:745–746.
Un articolo sul ruolo emergente dei cani di razza negli
studi di genetica.
Haseltine,W. 1997. Discovering genes for new medicines.
Scientific American 276:92.
Neel, James. 1994. Physician to the Gene Pool. John Wiley &
Sons, Inc., New York, NY.
Nemeroff, C. 1998. The neurobiology of depression. Scientific
American 278:66. Questo articolo contiene poche
informazioni di genetica ma molte riguardanti la biologia
della depressione.
Pasternak, J. 1999. An Introduction to Human Molecular
Genetics. Fitzgerald Scientific Press, Bethesda, MD. [Tr ad.
it.: Genetica molecolare umana, Zanichelli, Bologna 2001.]
Un nuovo testo per l’università sulla genetica molecolare
umana, in particolare sulle malattie. È un buon testo di
riferimento.
Plomin, R., e J. DeFries. 1998. The genetics of cognitive
abilities and disabilities. Scientific American 278:62. [Tr ad.
it.: “La genetica delle capacità e delle disfunzioni
cognitive”, Le Scienze, ottobre 1998 Milano.]
Robbins, L. S., J. H. Nadeau, K. R. Johnson, M. A. Kelly, L.
Roselli-Rehfuss, E. Baack, K. G. Mountjoy, e R. D. Cone.
1993. Pigmentation phenotypes of variant extension locus
alleles result from point mutations that alter MSH receptor
function. Cell 72:827–834.Questo articolo della letteratura
scientifica avanzata descrive l’identificazione del gene
MSH-R responsabile della pigmentazione gialla nei
labrador (e di schemi simili di pigmentazione nel topo). Si
tratta di un articolo scientifico complesso, e lo
raccomandiamo soltanto se siete abituati a leggere la
letteratura avanzata.
Weiner, D., e R. Kennedy. 1999. Genetic vaccines. Scientific
American 281:50. [Tr ad. it.: “Vaccini genetici”, Le Scienze,
ottobre 1999, Milano.]
Welsh, M., e A. Smith. 1995. Cystic fibrosis. Scientific
American 273:52. [Tr ad. it.: “La fibrosi cistica”, Le Scienze,
febbraio 1996, Milano.]
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D. Biologia molecolare e genetica
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26
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“Il medico investigatore”:
una storia di genetica in azione
Descrizione dell’esercitazione
! p. 269
In questo capitolo, riproponiamo un articolo di Tom
Schachtman che è stato pubblicato sulla rivista Smithsonian nel febbraio 2006. L’articolo parla del lavoro di genetica medica di D. Holmes Morton svolto tra gli Amish
e i Mennoniti in Pennsylvania, e comprende tutti gli
aspetti della genetica, dagli studi genealogici classici all’identificazione di geni di malattia e ai microchip. Vi proponiamo questo articolo come un’avvincente storia che
ha per oggetto l’uomo, che può essere usata come base
per integrare le informazioni della genetica e della biologia molecolare, oltre che per inquadrare la genetica
medica in un contesto storico. Alcune domande qui proposte per la ricerca e la discussione richiederanno informazioni che non si trovano in questo articolo. Potete
usarle, sostituirle o aggiungere domande vostre, oppure
ignorarle del tutto. Riportiamo le risposte alle domande
scientifiche e suggerimenti per le domande storiche. Le
risposte alle domande non sono volutamente complete,
gli studenti potranno trovare molte più informazioni su
ogni argomento.
!Risposte alle domande per la ricerca
e la discussione
1.
A L L E
Gli Amish hanno un’alta frequenza di malattie genetiche rare poiché sono una popolazione altamente
consanguinea fondata da un piccolo numero di individui. Nell’intera popolazione umana, l’incidenza di
un particolare gene per una malattia recessiva potrebbe essere di 1/1000, portando la probabilità che
due portatori si sposino a 1/1 000 000. Invece, se una
popolazione è formata da 50 individui e uno di loro
è portatore del gene mutato, allora la frequenza in
quella popolazione è di 1/50. Se i membri della popolazione si sposano quasi esclusivamente tra loro,
la probabilità che due portatori si sposino aumenta
in modo significativo.
Potete costruire un modello della frequenza del gene nella popolazione. Assumete che gli eterozigoti
siano sani come gli individui omozigoti normali, che
tutti si sposino, che tutte le coppie abbiano quattro
bambini che sopravvivono, che i geni seguano una
distribuzione perfettamente mendeliana, e che le generazioni non si sovrappongano. I primi 50 individui
formano 25 coppie, una delle quali contiene l’individuo con la mutazione. Metà dei quattro bambini di
questa coppia porterà la mutazione. La generazione
successiva sarà quindi composta da 25 coppie con
quattro bambini per coppia, o 100 bambini (25 coppie ! 4 bambini per coppia = 100 bambini), con due
fratelli che hanno la mutazione. La frequenza del gene è ancora 1/50. Proseguiamo ancora in questo modo: ciascuno si sposa e ha quattro bambini. 100 bambini formano 50 coppie, e ciascuna ha 4 bambini.
Questa volta, due delle coppie hanno un individuo
che porta la mutazione, così metà dei loro 8 figli totali, cioè 4 figli, porta la mutazione. La frequenza del
gene è ancora 1/50, dato che ci sono 4 portatori su
200 bambini. Ora ci sono due gruppi di fratelli portatori che sono tra loro cugini di primo grado. La
prossima generazione produrrà fratelli, cugini di primo grado e cugini di secondo grado. In una popolazione che si sposa tra consanguinei, diventa possibile che alcuni di questi individui si sposino fra loro,
facendo sorgere la possibilità che i loro bambini siano omozigoti per la mutazione. Se il matrimonio fosse un evento completamente casuale all’interno della popolazione, la probabilità che due portatori si
sposino sarebbe 1/50 ! 1/50, ovvero 1/2500. Queste
probabilità sono 400 volte più grandi di quelle della
popolazione generale.
2. Un motivo è il matrimonio tra consanguinei: è molto
più probabile osservare un fenotipo recessivo in una
popolazione piccola e consanguinea piuttosto che in
una ampia in cui i matrimoni sono casuali. A meno
che non si possa identificare il fenotipo, non è possibile sapere se esiste una condizione genetica nascosta. Un secondo motivo è costituito da una buona documentazione. Questa permette ai genetisti di
ricostruire alberi genealogici e di dedurre il genotipo
degli individui. Queste informazioni possono essere
confrontate con i dati di genetica molecolare, come
descritto nel Capitolo 27, per determinare le posizioni dei geni responsabili. Infine, il fatto che tutti gli individui vivano in una piccola area permette più facilmente al genetista di trovarli, intervistarli e chiedere dei campioni per le analisi.
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26 “Il medico investigatore”: una storia di genetica in azione
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3. La malattia delle urine a sciroppo d’acero (MSUD o
leucinosi) è una malattia autosomica recessiva causata da un difetto in un complesso enzimatico necessario per la degradazione degli amminoacidi leucina, isoleucina, e valina. Questi amminoacidi e i loro prodotti di degradazione incompleta sono secreti
nelle urine, a cui conferiscono l’odore dolce, e si accumulano nel sangue, dove causano un danno neurologico. Alla nascita, i bambini con questa malattia
sembrano normali perché gli enzimi nel corpo della
madre hanno degradato gli amminoacidi in eccesso.
Una volta che i neonati non possono più trarre beneficio dagli enzimi materni, i prodotti di degradazione iniziano ad accumularsi. Se la malattia viene
diagnosticata velocemente, viene curata controllando
attentamente la dieta, limitando l’assunzione degli
amminoacidi cruciali, in maniera molto simile alla cura della fenilchetonuria.
Il signore e la signora Hoover devono essere stati entrambi eterozigoti per la malattia. I bambini malati
erano mutanti omozigoti, e i loro bambini sani erano
o omozigoti normali o portatori eterozigoti.
Maggiori informazioni si possono trovare sul sito web
del “National Institute of Health”:
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/000373,htm.
4. Morton sogna di costruire un microchip per determinare il genotipo dei bambini Amish. Il Capitolo 27
spiega come un microchip può essere usato per analizzare i genotipi. In questo caso, il DNA sul microchip rappresenterebbe i frammenti dei geni contenenti le mutazioni che causano le malattie nella popolazione Amish.
5. La teoria dei quattro umori è stata proposta dagli antichi greci per spiegare sia il temperamento sia le malattie. Si credeva che il corpo fosse permeato e influenzato da quattro tipi di fluidi, o umori, che corrispondevano ai quattro elementi della natura: il sangue (che corrispondeva all’aria), la bile nera (che corrispondeva alla terra), la bile gialla (che corrispondeva al fuoco), e il flegma (che corrispondeva all’acqua). Si credeva che questi umori influenzassero la
salute, e che uno squilibrio nei fluidi causasse la malattia. Si credeva che i fluidi producessero “vapori”
che influenzavano anche la personalità.
Questo modello di malattia diede origine a trattamenti pensati per riportare l’equilibrio tra gli elementi. Questi trattamenti includevano salasso, emetici (che inducono vomito), e purghe (che inducono diarrea). Questo approccio alla medicina è stata
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molto comune nella pratica medica fino agli inizi
dell’800.
A Louis Pasteur, che visse in Francia nel XIX secolo,
viene attribuita la scoperta che i microbi causano malattie. Nel corso della sua vita, questo scienziato combatté per convincere i medici che i germi esistevano
e portavano malattie e che mani e strumenti sporchi
potevano diffondere le infezioni. Pasteur scoprì che
forme indebolite di batteri e di virus potevano essere usate per proteggere gli individui da future infezioni, e inventò la pastorizzazione, un processo che
uccide la maggior parte dei batteri nel cibo senza alterare il cibo stesso.
Sebbene non sappiamo cosa pensasse Terry Sharrer
quando fece i commenti citati nell’articolo, possiamo
supporre che il suo paragone tra l’avvento della genetica nella pratica medica e l’avvento della teoria dei
germi si basi su due elementi. Uno è l’introduzione
di un nuovo modo di considerare la malattia: la composizione genetica di una persona ha un ruolo centrale nel determinare la risposta di un individuo a particolari stress ambientali, cure o altre condizioni. L’altro è che le analisi genetiche sono una nuova tecnologia che si sta introducendo nella pratica medica, così come la sterilizzazione è stata introdotta come conseguenza della teoria dei microbi di Pasteur. Probabilmente, il messaggio generale di Sharrer è che l’introduzione della genetica molecolare in medicina ne
trasformerà la pratica quanto lo ha fatto l’avvento della teoria dei microbi oltre 100 anni fa. Questa è, in
effetti, una previsione perfettamente azzeccata.
6. Albert Schweitzer nacque nel 1875 e iniziò la sua carriera come teologo, ministro del culto e rinomato organista. Decise di andare in Africa non come religioso ma come medico, e a 30 anni (1905) entrò in una
scuola di medicina. Nel 1913 fondò un ospedale nell’Africa equatoriale francese. Nel 1917, insieme a sua
moglie fu internato, come prigioniero di guerra, per
quasi un anno. Dopo il loro rilascio nel 1918, ritornarono in Europa per sei anni, dove Schweitzer predicò, seguì corsi di medicina, tenne conferenze e concerti, e scrisse dei libri. Nel 1924 ritornò nell’Africa
equatoriale francese, dove rimase per quasi tutto il
resto della sua vita. Spese i soldi ricavati dalla vendita dei suoi libri, i compensi per conferenze e concerti
per il suo lavoro di missionario e divenne famoso come studioso e filantropo. Schweitzer fu insignito del
premio Nobel per la pace nel 1952 per il suo lavoro
umanitario e spese i 33 000 dollari del premio per costruire un ospedale per i pazienti lebbrosi. Schweitzer morì nel 1965.
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E. GENOMICA
Nella Sezione B abbiamo presentato delle tecniche utili
per manipolare e analizzare specifici segmenti di DNA.
In questa sezione, allarghiamo la nostra attenzione a interi genomi. Questo spostamento dell’attenzione segue
il percorso della ricerca in biologia molecolare: negli anni ’70 e ’80, i ricercatori hanno usato strumenti e tecnologie nuove per analizzare singoli geni. Gli organismi,
però, hanno molti geni, e capire come il genotipo sia in
relazione con il fenotipo, o come cambi l’espressione genica durante lo sviluppo o nelle malattie, richiede di
comprendere l’espressione globale e le interazioni dei
geni.
Negli anni ’90 e all’inizio del XXI secolo, sono state sviluppate tecniche che permettono ai ricercatori di inizia-
re a rispondere a domande a questo livello, dando origine ad una nuova era e a un nuovo campo della scienza: la genomica, l’analisi del genoma. Queste lezioni si
concentrano sui metodi utilizzati per le analisi dei genomi: confrontare i genomi, classificarli con marcatori genetici, localizzare i geni e i marcatori, e analizzare l’espressione genica globale. Tutte le esercitazioni sono da
svolgersi con carta e penna o con simulazioni al computer. La genomica è un campo che si muove velocemente; il nostro scopo in questa sezione consiste nel fornire una base che aiuterà voi e i vostri studenti a seguire e comprendere le nuove evoluzioni e le nuove scoperte.
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27 Confronto fra genomi
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Confronto fra genomi
Descrizione dell’esercitazione
! p. 276
Questo capitolo introduce il concetto dell’utilizzo dei
marcatori, come le sequenze ripetute, per confrontare i
genomi e discute i vari livelli ai quali i genomi possono
essere confrontati: fra generi, fra specie, fra ceppi all’interno di una specie o fra individui. Il capitolo contiene
un’esercitazione teorica che fornisce le basi per capire
come l’analisi di restrizione e la reazione a catena della
polimerasi (PCR) possano essere utilizzate per confrontare i genomi e contiene una lettura sull’uso del DNA mitocondriale per studi genetici. Gli studenti dovranno
completare i Fogli di lavoro sull’ibridazione di Southern
e le lezioni sulla PCR prima di fare questa esercitazione,
dal momento che queste due lezioni introducono le tecniche di laboratorio che sono qui utilizzate.
L’introduzione dell’Esercitazione fornisce una breve rassegna del modo in cui cambiano i genomi e del tipo di
problemi che possono essere affrontati con il confronto fra genomi, spiega due approcci di tipizzazione del
DNA e ne illustra l’uso concentrandosi sull’analisi del
genoma del cane. Di seguito abbiamo fornito anche alcuni riferimenti sulla tipizzazione del DNA e sui cani.
Le letture introduttive per il docente comprendono informazioni sull’uso del confronto fra DNA in campi quali la biologia della conservazione, la biologia dell’evoluzione e la biologia del comportamento.
Il Capitolo 28 si concentra sulle applicazioni forensi della tipizzazione del DNA, include un’esercitazione che
mostra il calcolo delle probabilità utilizzato nell’analisi
dei dati di DNA in medicina legale, una lettura sull’applicazione della tipizzazione del DNA a un enigma archeologico e tre brevi esercizi che illustrano le applicazioni specifiche della tipizzazione del DNA sotto forma
di enigmi: Confusione all’ospedale; Un caso di pater nità
e Il caso del coltello insanguinato.
Entrambi i Capitoli 27 e 28 discutono l’uso di differenti
tipi di marcatori per il DNA senza spiegare come i marcatori vengano identificati. Il Capitolo 29 si occupa di
questo argomento, utilizzando come esempio di marcatori le brevi sequenze ripetute in tandem (short tandem
repeat, STR) e mostra come i marcatori del DNA vengono utilizzati nella mappatura fisica dei geni.
Lezioni richieste: 1 o 2
Background
Ci sono molte ragioni per confrontare i genomi o per
analizzare il grado di variabilità fra due o più genomi.
Un biologo evolutivo potrebbe voler comparare i genomi di specie differenti per misurare quanto esse siano
correlate. Uno studioso dei mammiferi potrebbe limitarsi a voler sapere quanto sia differente il genoma di un
chihuahua da quello di un cane danese e se ci sono delle regioni in cui si concentrano queste differenze. Un epidemiologo potrebbe voler sapere se un batterio che causa una malattia in due differenti aree geografiche è esattamente lo stesso o se si tratta di due varianti dello stesso ceppo.
Il modo più completo per rispondere a queste domande è ottenere le sequenze dei genomi e confrontarle.
Sebbene i ricercatori stiano completando il sequenziamento del genoma di un numero crescente di organismi,
questo metodo resta comunque un compito arduo per
gli organismi che possiedono genomi grandi, come gli
animali e molte piante. Il numero di genomi completamente sequenziati è soltanto una piccola frazione dei genomi esistenti che vorremmo conoscere.
In realtà, per molti studi utili di genomica comparativa,
conoscere l’intera sequenza genomica non è necessario.
I ricercatori di solito si occupano del confronto fra genomi concentrandosi su domande del tipo: come varia
il genoma fra gli individui di una stessa specie? Quanto
differenti sono due specie fortemente correlate, o come
è avvenuta la divergenza fra genomi di gruppi di organismi meno correlati fra loro durante l’evoluzione? Per
rispondere a queste domande è necessario osservare i
genomi attraverso lenti di differente distanza focale, che
consentano la diversa risoluzione dei caratteri generali e
dei più piccoli dettagli.
Se siete biologi dell’evoluzione e siete interessati allo studio dell’evoluzione dei canidi, per esempio, sarete interessati a come differisce il genoma di lupi, sciacalli, coyote, volpi e cani domestici. Le regioni del genoma che
sono uguali in tutti i canidi, ma differiscono, ad esem-
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pio, fra canidi, felini o bovini, non serviranno a rispondere alle vostre domande. I confronti tra genomi a tale
livello avranno una distanza focale troppo lunga, in modo simile, le regioni del genoma che variano fra i bassotti e i danesi oppure fra un barboncino ed un altro con
tutta probabilità non saranno d’aiuto. La distanza focale
necessaria per il confronto di questi cambiamenti dettagliati risulterebbe troppo corta per rispondere alle vostre
domande. Per rispondere ad esse, sarà necessario trovare le regioni del genoma che sono comuni a tutti i cani
ma che variano fra i cani e gli altri canidi.
Tuttavia, se siete interessati all’identificazione di geni che
sono responsabili della gigantesca taglia del danese o
delle gambe corte del bassotto, allora avrete bisogno di
una distanza focale più corta. Le regioni del genoma che
variano fra bassotti e danesi saranno per voi di grande
interesse mentre non lo saranno le regioni comuni a tutte le razze di cani. Se, infine, foste dei genetisti che effettuano un servizio di test di paternità per cani (ebbene
sì, esiste un servizio del genere), avrete bisogno di una
distanza focale ancora più corta, concentrandovi sulle regioni che variano fra un barboncino (per esempio) ed
un altro. Le regioni del genoma che tutti i barboncini
hanno in comune non sarebbero utili per i vostri scopi.
Così, la domanda che ci si pone determina il livello di
variabilità che viene considerato.
Le tecniche per il confronto dei genomi
L’introduzione all’Esercitazione descrive l’uso dell’analisi di restrizione e della PCR per osservare le sequenze
polimorfiche di DNA ripetuto nei genomi. Queste sequenze sono uno strumento prezioso per confrontare e
mappare i genomi. Esse consistono di sequenze ripetute di lunghezza variabile (da 10 a 15 basi, fino anche a
solo una o due) che si trovano in una posizione fissa (un
locus) all’interno del genoma, ma il cui numero di ripetizioni presenti su ogni dato cromosoma è altamente variabile. Questi loci sono chiamati microsatelliti.
L’analisi di PCR o di restrizione delle regioni microsatelliti è utilizzata sia per determinare la somiglianza complessiva fra genomi di differenti specie, ceppi o varianti
genetiche (come le differenze di razze di cani), sia per
confrontare i genomi di due individui, come nel caso della tipizzazione del DNA. La distanza focale del confronto dipende dalle regioni scelte per lo studio. Per confrontare genomi di specie o ceppi differenti, i microsatelliti più utili sono quelli piuttosto costanti all’interno di
una data specie o ceppo, in modo che la variazione che
si trova fra due ceppi non dipenda da una variazione casuale individuale ma rappresenti piuttosto una variazione fra i due ceppi. Per la tipizzazione del DNA degli individui, i microsatelliti di maggior utilità sono invece
quelli che variano da un individuo ad un altro.
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Come fanno i ricercatori a sapere quali microsatelliti sono appropriati per i vari tipi di confronto? All’inizio, di
fatto, non lo sanno. Quando vogliono studiare un gruppo di organismi il cui genoma non è stato caratterizzato
in precedenza, cominciano con un esame a tappeto, provando differenti serie di primer per PCR o di enzimi di
restrizione, osservando il livello di variazione trovato. Descriveremo in seguito il processo per identificare un marker microsatellitare.
L’analisi mediante PCR può essere utilizzata per confrontare i genomi anche quando non si hanno informazioni sulle sequenze del genoma in questione. Per fare
ciò, i ricercatori usano primer di 10 basi di lunghezza,
con una sequenza casuale. In questo modo si genererà
un prodotto di amplificazione per ogni regione in cui
due primer si possono ibridare nel corretto orientamento e a distanza sufficientemente breve. Il fatto che una
data coppia di primer dia o meno luogo ad un prodotto
e la lunghezza del prodotto stesso sono una funzione
della sequenza del genoma. Più simili saranno i due genomi e più prodotti di amplificazione avranno in comune. I ricercatori in genere provano molte serie di primer
casuali per identificare le giuste combinazioni per un dato genoma. Questa analisi si chiama amplificazion e casuale del DNA polimor fico.
Un altro tipo di variazioni osservate fra individui o fra
razze sono a carico di singoli nucleotidi (polimor fismo
a sin golo n ucleotide, o, SNP, pronunciato “snip”); in altre parole, differenti individui hanno basi diverse in particolari siti del genoma. La genotipizzazione basata sull’analisi degli SNP prevede brevi reazioni di sequenziamento specifiche, limitate a tali siti.
Mentre la caratterizzazione basata sul DNA microsatellite funziona bene per confronti fra genomi, come l’identificazione di una specie o il “DNA fingerprinting” di un
individuo, l’analisi degli SNP in una regione specifica fornisce informazioni su scala molto più dettagliata sulle differenze nel genoma, come, ad esempio, quali specifici
alleli di un gene sono presenti.
Lo sviluppo di tecniche di confronto
fra genomi basate su marcatori
Prima dello sviluppo dei metodi per studiare molecole isolate di DNA, i ricercatori avevano poche opzioni
per confrontare i genomi e non si sapeva molto delle
loro relative somiglianze o differenze. Le tecniche di
ibridazione dell’intero genoma e i confronti basati sull’aspetto dei cromosomi nei car iotipi sono stati gli unici metodi disponibili per confrontare genomi fino agli
anni ’80.
Gli enzimi di restrizione sono stati scoperti negli anni ’60
e durante i primi anni ’70 i ricercatori pubblicarono de-
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27 Confronto fra genomi
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scrizioni della costruzione dei primi plasmidi ricombinanti. Il metodo attualmente noto come ibridazione di
Southern fu pubblicato nel 1975. Armati di nuovi strumenti e nuove tecniche che permettevano loro di analizzare il DNA in un modo che non era mai stato possibile prima, i ricercatori cominciarono a cercare le differenze nel DNA che potevano essere correlate a differenze
nei caratteri ereditari. Questo tipo di ricerca non era affatto facile a quel tempo: il metodo basato sulla terminazione della catena per il sequenziamento del DNA non
era stato ancora sviluppato, non esistevano mappe genomiche e solo pochi cloni di DNA umano erano stati
caratterizzati. Uno degli approcci che i ricercatori potevano utilizzare era eseguire digestioni del DNA umano
con enzimi di restrizione e fare un’analisi di ibridazione
di Southern utilizzando come sonda i cloni di DNA umano disponibili.
Nel 1980, Arlene Wyman e Ray White pubblicarono un
articolo intitolato “A highly polymorphic locus in human
DNA” (“Un locus fortemente polimorfico nel DNA umano”). Questa fu la prima descrizione di un locus ipervariabile e altri ricercatori si resero conto immediatamente
di quanto preziosi potessero essere tali loci nei loro studi sull’ereditarietà, pertanto cominciarono a cercarne e
trovarne altri. Uno dei ricercatori coinvolti in questi studi pionieristici era Alec Jeffreys, il cui laboratorio stava
studiando l’eredità e l’evoluzione dei geni della globina.
Egli si rese conto che alcune delle sequenze ripetute appena scoperte, che furono chiamate minisatelliti, avevano in comune una parte centrale (core) di sequenza di
10 o 15 basi.
Nella speranza di sviluppare un metodo globale per trovare nuovi loci polimorfici, Jeffreys e i suoi collaboratori cominciarono ad analizzare delle genoteche utilizzando come sonda le regioni del minisatellite del gene della mioglobina e trovarono altri loci variabili che avevano in comune la parte centrale della sequenza del minisatellite. Essi decisero allora di provare una sonda che
consisteva della sola parte centrale della sequenza del
minisatellite: la provarono su un Southern blot contenente DNA di vari membri di una famiglia. La mattina di
lunedì 10 settembre 1984 svilupparono l’autoradiogramma e videro ciò che sembrava un profilo altamente variabile ereditato in una maniera mendeliana semplice. Essi si resero immediatamente conto di come questo tipo
di analisi poteva essere applicato in casi criminali, dispute di paternità, biologia della conservazione e così
via. Era nata la tecnica del “fingerprinting del DNA”. In
effetti, Alec Jeffreys stesso fu il primo ricercatore ad effettuare un test di fingerprinting del DNA, nel corso di
una disputa di maternità di un ragazzo africano per questioni di immigrazione. Un interessante articolo scritto retrospettivamente da Jeffreys su queste scoperte e sullo
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sviluppo della tecnica del fingerprinting del DNA è incluso nelle Letture scelte.
L’identificazione di un locus di ripetizioni
polimorfiche
La prima STR (o SSR, per “sequenza semplice ripetuta”)
nel DNA umano fu scoperta nel 1989 e aveva la sequenza
(5! CA 3!)n dove n è variabile. La sequenza fu osservata
in più di 50 000 differenti posizioni all’interno del genoma umano. Ciascuna di queste posizioni poteva potenzialmente essere un marcatore di DNA ipervariabile. Sono state identificate anche altre ripetizioni microsatelliti,
ma useremo (CA)n come esempio per mostrare in che
modo i loci di ripetizioni polimorfiche possono essere
identificati e mappati.
Il primo passo per identificare un locus STR polimorfico
è trovare un clone di una ripetizione specifica in una genoteca. Per fare ciò potreste analizzare una genoteca
contenente DNA genomico utilizzando una sonda marcata consistente, ad esempio, di 20 ripetizioni di “CA”
(CA)20. La vostra analisi potrebbe portare all’isolamento
di varie colonie batteriche contenenti plasmidi con inserti che contengono ripetizioni CA. Fra questi cloni positivi, potrete sceglierne uno o più per un’ulteriore caratterizzazione.
A questo punto, sequenziereste l’inserto clonato nel plasmide per determinare il numero esatto di ripetizioni CA
che contiene [dal momento che la vostra sonda è in grado di ibridare con varie differenti versioni di ripetizioni
(GT)n] e anche per trovare la sequenza delle regioni fiancheggianti. Affinché la particolare sequenza in oggetto
possa essere un marcatore utile, le regioni fiancheggianti
devono essere uniche così che si possa progettare uno
specifico primer di PCR. Una volta determinata la sequenza delle regioni fiancheggianti, dovreste preparare
delle sonde marcate fluorescenti utilizzando tali sequenze. Potreste, poi, utilizzare le sonde per fare un’analisi di
ibridazione in situ fluorescente (vedi il Capitolo 16) su
uno striscio di cromosomi umani per determinare se la
sonda ibrida in una sola posizione e su quale cromosoma. Se le regioni fiancheggianti ibridano solo in una posizione, dovreste produrre primer di PCR per le sequenze delle regioni fiancheggianti. Una reazione di PCR con
tali primer avrà come risultato l’amplificazione della regione contenente la vostra ripetizione.
A questo punto avreste tutti gli strumenti necessari per
determinare se un particolare locus è polimorfico. Per fare ciò, dovreste ottenere campioni di DNA di vari individui, eseguire una PCR con i primer delle regioni fiancheggianti e analizzare la lunghezza dei prodotti mediante elettroforesi su gel. Se i segmenti di DNA amplificati sono tutti della stessa lunghezza in tutti gli indivi-
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dui, allora il locus non sarà polimorfico; ma, se i prodotti
di PCR sono di lunghezze differenti, allora avrete un sito STR polimorfico, e i differenti prodotti di PCR rappresenteranno differenti alleli. Lo studio di un ampio numero di individui rivelerebbe la frequenza relativa di ciascun allele nella popolazione.
I loci che contengono polimorfismi nel numero di ripetizioni di DNA o nella lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) sono denominati secondo le regole del
DNA Committee of the International System for Human
Linkage Maps. Per esempio, D1S80 indica un locus identificato da una sonda di DNA (D) che ibrida sul cromosoma 1, con una sequenza a singola copia (S); “80” sta
ad indicare che la posizione costituisce l’ottantesimo marcatore registrato su tale cromosoma.
Mappatura fisica dei marcatori cromosomici
Ora che sappiamo di avere una STR polimorfica, potremmo voler sapere di più riguardo alla sua localizzazione. Un’analisi mediante ibridazione in situ fluorescente può mostrare quale cromosoma contiene la STR
e anche quale zona del cromosoma; tuttavia, una zona
di un cromosoma rappresenta ancora un’enorme quantità di DNA, potenzialmente centinaia di migliaia di coppie di basi. Il modo in cui si procede per delimitare la
localizzazione del nostro marcatore dipende dagli strumenti che abbiamo a disposizione. Se il genoma in questione è stato interamente sequenziato, il nostro compito è semplice: dobbiamo soltanto eseguire una ricerca
delle sequenze fiancheggianti uniche su un database
computerizzato. Ma che cosa si fa se la sequenza di un
genoma non è disponibile per un confronto? Ancora una
volta dipende da quali strumenti sono disponibili.
Uno strumento prezioso per la mappatura sono le cosiddette “linee cellulari ibride da radiazioni” che sono cellule di roditore, ciascuna delle quali contiene una o più
frammenti di cromosomi umani (o di altra specie di interesse). Tali linee cellulari vengono prodotte trattando
cellule umane con radiazioni ad alta energia (raggi X o
gamma) in quantità sufficienti per uccidere le cellule e
frammentare i cromosomi. Le cellule morte sono successivamente fuse con cellule di roditore. Una piccola
percentuale di queste ultime catturano frammenti di cromosomi umani e li incorporano nel loro genoma. Le singole cellule ibride vengono poi isolate e propagate in
coltura creando una linea cellulare ibrida da radiazioni.
Il frammento di cromosoma umano trasportato nella linea cellulare ibrida può essere riconosciuto dal modo in
cui si colora, esattamente come sono riconosciuti i cromosomi intatti.
Per determinare la localizzazione relativa di un marcatore STR, le regioni fiancheggianti sono utilizzate come
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sonda e provate in analisi di ibridazione sul DNA preparato da un gruppo di cellule ibride da radiazione. Le
linee cellulari con cui ibrida la sonda vengono analizzate per determinare i confini della regione in cui si sovrappongono i frammenti.
Se sono disponibili cloni con frammenti più piccoli appartenenti a quella stessa regione cromosomica si può ripetere la stessa analisi con essi. Dato il grande interesse
nel genoma umano, molti di questi strumenti erano disponibili prima che il sequenziamento fosse completato
e in questo modo è stato possibile costruire mappe a risoluzione piuttosto elevata. Le mappe basate sull’analisi
delle molecole di DNA sono chiamate mappe fisiche.
Le applicazioni del confronto fra genomi
nella ricerca
– Biologia della conservazione
Misurare le somiglianze genetiche e analizzare la parentela può essere molto importante nei programmi di riproduzione in cattività per le specie a rischio di estinzione. Poiché sia le popolazioni in cattività, sia quelle allo stato selvatico, delle specie che rientrano in questi programmi sono di solito piuttosto limitate, c’è stato un elevato numero di incroci fra individui consanguinei (sia in
cattività, sia nell’ambiente naturale), generando individui
che sono geneticamente molto simili. La somiglianza genetica causata dall’incrocio fra consanguinei crea problemi per le popolazioni e per gli individui. Popolazioni di individui geneticamente identici (o quasi) sono in
generale meno resistenti di fronte ai cambiamenti ambientali. Gli individui che derivano da un esteso incrocio fra consanguinei sono spesso meno sani e si riproducono con minor successo degli individui derivati da
incroci fra non consanguinei. I biologi che si occupano
della conservazione delle specie cercano quindi individui non correlati geneticamente da accoppiare, per il bene degli individui stessi e della specie; tuttavia, in una
popolazione in cui si è verificato un alto numero di incroci fra consanguinei, come in quella delle gru americane o dei ghepardi, il fatto che due animali vivano in
due differenti giardini zoologici non vuol dire che siano
geneticamente differenti. I biologi che si occupano di
conservazione hanno condotto analisi di tipizzazione del
DNA nelle gru americane per determinare quanto siano
simili geneticamente i vari individui ed usano i risultati
della tipizzazione per scegliere gli individui geneticamente più diversi per mettere insieme le coppie per la
riproduzione.
– Biologia evoluzionistica
L’analisi della variabilità genetica viene utilizzata anche
come indizio per ricostruire la storia dell’evoluzione. Il
ragionamento sotteso a questa applicazione è il se-
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guente: se l’accumulo di cambiamenti genetici è responsabile delle differenze fenotipiche fra specie, generi, famiglie, ordini e così via, allora la distanza evolutiva fra due gruppi di organismi dovrebbe essere correlata all’ampiezza della differenza genetica. In altre parole, due gruppi che si sono separati molto tempo fa
avranno un numero maggiore di differenze genetiche
fra loro rispetto a due gruppi che si sono separati di recente. Inoltre, un’analisi della natura delle differenze
può fornire indizi su quale fosse la configurazione genetica ancestrale.
Tenendo questo in mente, i biologi dell’evoluzione con
un’inclinazione molecolare analizzano campioni di DNA
di organismi correlati e confrontano la quantità di differenze. Utilizzando programmi computerizzati, analizzano la natura delle differenze e producono alberi genealogici ipotetici. Tali alberi mostrano come, con il minimo
numero di cambiamenti genetici totali, la configurazione attuale può essersi prodotta a partire da un’unica configurazione ancestrale (in modo simile all’albero evolutivo della proteina citocromo C discusso nel Capitolo 5).
L’introduzione dell’esercitazione descrive come un gruppo internazionale di ricercatori ha utilizzato l’analisi del
DNA per studiare l’evoluzione del cane. I dati molecolari hanno fornito ai ricercatori una messe di nuove informazioni su cui discutere e da incorporare all’interno dei
loro modelli sullo sviluppo delle specie. Allo stato attuale
non c’è modo di dimostrare che questi alberi prodotti siano corretti, essi tuttavia forniscono ai biologi dell’evoluzione un’altra serie di prove che supportano la teoria. Riprenderemo questa nozione nel Capitolo 33, nel quale
gli studenti costruiranno un albero evolutivo utilizzando
sequenze proteiche invece che di DNA.
– Epidemiologia
Nel caso di alcune epidemie può essere importante rintracciare la sorgente dell’organismo infettivo. Nel 2002
un uomo e sua moglie arrivarono in un ospedale di
New York lamentando sintomi simili a quelli dell’influenza, come febbre alta e linfonodi ingrossati. Essi risultarono positivi alla peste bubbonica. Erano forse le
prime vittime di un attacco bioterroristico? O erano essi stessi terroristi che cercavano di diffondere la malattia mortale?
La peste bubbonica, la morte nera del Medioevo, è causata dal batterio Yersinia pestis ed è trasmessa dalla puntura delle pulci che vivono sui ratti. Yersinia pestis è endemica in alcune popolazioni di roditori selvatici del sudest degli Stati Uniti, inclusi i “pack rat” e i cani delle praterie. Si verificano approssimativamente dai 10 ai 20 casi di peste bubbonica umana ogni anno negli Stati Uniti
e sebbene sia una malattia molto grave, la peste può essere curata con gli antibiotici.
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L’uomo e sua moglie erano turisti a New York, la loro
casa era vicina alla periferia di Santa Fé, nel New Mexico, un’area in cui i roditori selvatici sono portatori della
peste. In effetti, i ricercatori analizzarono i roditori dell’area intorno a Santa Fé, dove la coppia viveva, e riscontrarono che molti di essi erano positivi a Yersinia
pestis. Di conseguenza sembrò probabile che la coppia
avesse contratto la peste prima di lasciare il New Mexico e la possibilità che fossero vittime o autori di un attacco terroristico fu giudicata remota.
La tipizzazione del DNA del ceppo di Yersinia pestis che
aveva causato la malattia dette ulteriore supporto all’ipotesi che la coppia avesse contratto la malattia prima
della partenza. Dei marcatori microsatellitari possono essere utilizzati per distinguere i ceppi di Yersinia pestis.
Quando il ceppo che aveva infettato la coppia fu genotipato e confrontato con i ceppi dell’area di Santa Fé, la
somiglianza maggiore fu trovata in un batterio isolato da
roditori catturati vicino all’abitazione della coppia.
– Biologia del comportamento
Nella biologia del comportamento, la tipizzazione del
DNA può aiutare i biologi a determinare il grado di parentela fra membri di un gruppo. Determinare le effettive relazioni di parentela (se ve ne sono) fra animali è un
obiettivo importante nella biologia del comportamento.
Tuttavia, la determinazione della parentela non è sempre facile: a seconda del comportamento riproduttivo
delle specie l’osservazione può rivelare quale individuo
è il padre di una particolare cucciolata o nidiata. Sfortunatamente l’osservazione non dà sempre l’informazione
desiderata. Per esempio, gli scimpanzé maschi e femmine si accoppiano promiscuamente, rendendo impossibile dire, mediante la sola l’osservazione, quale individuo
sia il padre della prole. Questo problema ha frustrato a
lungo i primatologi, i quali cercavano di capire il ruolo
della parentela nelle interazioni sociali fra scimpanzé.
L’utilizzazione della tipizzazione dei gruppi sanguigni per
determinare la paternità non era un’alternativa perseguibile, dal momento che prevedeva di sedare gli animali,
causando loro potenzialmente dei traumi e disturbando
la loro vita sociale.
Nel 1994, un gruppo di ricercatori pubblicò una soluzione al problema: misero a punto una tecnica di tipizzazione del DNA basata sulla PCR utilizzando un piccolo numero di peli. Di notte, gli scimpanzé si costruiscono dei letti improvvisati sugli alberi e li abbandonano al mattino, costruendosi un nuovo letto la notte successiva. I ricercatori potevano aspettare che uno scimpanzé si alzasse dal letto la mattina per poi raggiungere il letto abbandonato e raccogliere qualche pelo perduto da utilizzare per la tipizzazione del DNA, senza
disturbare in nessun modo l’animale. I ricercatori han-
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no utilizzato il nuovo metodo per avere le informazioni sulle relazioni di parentela nell’analisi del comportamento sociale degli scimpanzé e sperano che altri etologi che studiano altre specie possano trarre vantaggio
da questo metodo di tipizzazione del DNA. Nel Capitolo 5 abbiamo descritto un’applicazione della tipizzazione del DNA per comprendere il comportamento sociale dei leoni.
– Tassonomia
Chi mai potrebbe entusiasmarsi studiando tassonomia?
Per la verità, un certo numero di biologi lo fa, e la tipizzazione del DNA sta fornendo loro nuovo materiale su
cui discutere. Tradizionalmente, i tassonomisti si basavano su differenze strutturali, fisiologiche e comportamentali per distinguere le specie. Quando furono sviluppate le tecniche di elettroforesi per le proteine, i tassonomisti iniziarono a considerare anche informazioni
sulle configurazioni enzimatiche. Alcuni biologi molecolari attualmente sostengono che la distanza genetica dovrebbe essere utilizzata come base per definire le specie. Per esempio, nello studio sugli scimpanzé descritto
in precedenza, i ricercatori hanno analizzato tre popolazioni di scimpanzé Pan troglodytes confrontando il loro
fingerprint del DNA ed il loro DNA mitocondriale. I risultati hanno dimostrato che la popolazione occidentale
di Pan troglodytes aveva un DNA mitocondriale significativamente differente da quello delle altre due popolazioni: le sequenze del gruppo occidentale non erano assolutamente presenti negli altri due gruppi orientale e
centrale. I ricercatori hanno calcolato che sono necessari circa 1,6 milioni di anni perché si possano accumulare così tante differenze.
Alcuni ricercatori hanno suggerito che una tale quantità
di differenze genetiche dovrebbe fare degli scimpanzé
occidentali una specie separata. Questa ipotesi è controversa: altri primatologi puntano maggiormente l’attenzione sulla somiglianza di aspetto e sui molti comportamenti simili fra due gruppi, argomentando che le
sequenze del DNA di per sé non fanno una specie. Di
fatto, c’è un profondo disaccordo su cosa definisca una
specie e quali tipi di criteri dovrebbero essere utilizzati
per distinguerla. La disputa tassonomica si sta diffondendo in molte aree della biologia man mano che i ricercatori iniziano a servirsi delle nuove tecniche molecolari per studiare differenze fra individui.
L’introduzione all’Esercitazione prende il genoma del cane come esempio del modo in cui il confronto fra genomi e la tipizzazione genomica possano essere utilizzati per rispondere a molte domande. Più avanti sono riportati riferimenti bibliografici ad articoli scientifici e rassegne sul genoma del cane e la sua analisi. L’esercitazione illustra come la PCR o l’ibridazione di Southern
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possano essere utilizzate per distinguere alleli dei microsatelliti.
Obiettivi
Dopo aver completato questa esercitazione, gli studenti
dovrebbero essere in grado di:
1 . Spiegare la seguente affermazione: il livello di variazione in un genoma che un ricercatore decide di studiare dipende dalla domanda che si pone.
2. Spiegare come la tipizzazione del DNA si basa sull’esame di regioni variabili del genoma.
3. Descrivere le due tecniche utilizzate nella tipizzazione del DNA: PCR e ibridazione di Southern.
4. Dire cosa è un RFLP e dare una spiegazione di come
si può originare un RFLP.
5. Spiegare perché è necessario utilizzare o l’ibridazione o la PCR nella tipizzazione del DNA.
Materiali
Copie della Esercitazione (letture, esercizi, e Fogli di lavoro), se necessario.
Procedimento
Riassumete l’analisi mediante ibridazione di Southern e
PCR, se necessario. L’Esercitazione dà per scontato che
gli studenti conoscano già queste tecniche.
L’esercitazione si spiega da sola: gli studenti leggeranno
i materiali didattici e faranno gli esercizi. Gli studenti tendono spesso a dimenticare che ciascuna persona ha due
copie di ciascun cromosoma e il risultato di qualsiasi analisi del DNA di una persona sarà la combinazione dei risultati su entrambi i cromosomi. Inoltre dal momento che
i due cromosomi derivano da individui differenti, con alta probabilità saranno diversi a livello delle regioni altamente variabili. Assicuratevi che la vostra classe abbia
ben chiare queste nozioni.
Ricordate agli studenti che l’esercizio mostra solo una minuscola regione di un singolo cromosoma (gli esempi
sono completamente immaginari). Nella realtà viene digerito l’intero genoma umano, generando un numero
enorme di frammenti. Senza l’utilizzo dell’ibridazione o
della PCR, il DNA di ciascuna persona sembrerebbe identico su un gel: una strisciata.
L’ibridazione permette a chi lavora in laboratorio di esaminare selettivamente certe aree del genoma. La PCR amplifica specificamente alcune regioni, producendo mi-
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lioni di copie di una specifica regione del genoma. I prodotti della PCR possono essere identificati mediante ibridazione, però, talvolta, possono essere visualizzati anche con una semplice colorazione, se il campione originale di DNA è presente a una concentrazione abbastanza bassa da non interferire (provocando un’intensa strisciata di sfondo).
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DNA
di Bob
Dimensioni del
frammento, bp
DNA
di Mary
Pozzetti
per i campioni
70
Questa esercitazione è fondamentale per capire come
funzionano i test di paternità basati sul DNA, la tipizzazione del DNA per uso forense e le diagnosi delle malattie genetiche basate sull’analisi del DNA.
Utilizzate i temi di discussione e le domande per assicurarvi che gli studenti abbiano capito i concetti presentati in questa lezione prima di arrivare al Capitolo 28.
60
50
!Risposta alla domanda per gli studenti
1.
L’AKC richiese anche il DNA di Piggy Paws oltre a
quello dei possibili padri e a quello dei cuccioli, poiché il profilo del DNA dei cuccioli era una combinazione di quello del loro padre e di quello della loro madre. All’AKC avevano pertanto bisogno del profilo del DNA di Piggy Paws in modo da poter sottrarre il suo contributo dai profili dei cuccioli. Ciò
che restava nel profilo dei cuccioli doveva per forza
derivare dal loro padre e pertanto l’AKC poteva trovare la corrispondenza con quello di Johnny o di
Zack.
Nota: Johnny ha attualmente raggiunto lo stato di
campione AKC.
!Risposte alle domande degli esercizi
– Esercizio 1
1. AGCT o una permutazione, come TAGC.
2. Il cromosoma materno di Bob darà un frammento di
41 coppie di basi (bp) (anche 3 e 12, ma queste sono le stesse in tutti i casi).
Il cromosoma paterno di Bob dà un frammento di 53
bp (la differenza consiste nelle tre copie extra della
ripetizione nel cromosoma paterno).
Il cromosoma materno di Mary dà un frammento di 61
bp; il cromosoma paterno dà un frammento di 41 bp.
3. Gli studenti devono lavorare sui vari passaggi per ottenere la soluzione. Essi devono determinare quali
frammenti verranno prodotti nella digestione (cosa
che, in realtà, avranno già fatto per la precedente domanda), quindi devono determinare quali di questi
frammenti possono ibridare con la sonda e infine disegnare uno schema di come dovrebbe apparire il risultato dell’ibridazione. Potreste doverli aiutare durante alcuni di questi passaggi.
40
4. La colorazione dei prodotti di digestione del DNA di
Bob o di Mary avrà l’aspetto di una strisciata, poiché
da un DNA di 3 miliardi di coppie di basi vengono
generati tantissimi frammenti. Sarà pertanto necessario l’uso dell’ibridazione per esaminare una particolare regione del genoma.
– Esercizio 2
Notate l’orientamento dei primer: il primo primer ibrida con il filamento complementare a quello mostrato.
Il secondo primer ibrida con il filamento di cui è mostrata la sequenza; ricordatevi di tener conto della direzione 5!-3!.
Il principale prodotto di PCR del cromosoma materno di Bob (lungo 53 bp): 5! GGCCTCTAGGACATGTAAAGCTAAAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAAGGCCTAGGTGCG 3!
2. Il principale prodotto di PCR del cromosoma paterno di Bob (lungo 65 bp): 5! GGCTCTAGGAGATGCTAAAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAAGGCCTAGGTGCG 3!
3. Il principale prodotto di PCR del cromosoma materno di Mary (lungo 73 bp): 5! GGCCTCTAGGACATGCTAAAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAAGGCCTAGGTGCG 3!
Il principale prodotto di PCR del cromosoma paterno di Mary (lungo 53 bp): 5!GGCCTCTAGGACATGCTAAAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAAGGCCTAGGTGCG 3!
4. I prodotti di PCR possono spesso essere osservati co1.
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lorandoli. Se viene utilizzata solo una piccola quantità di DNA, nelle corsie del gel ci sarà un background
molto leggero che interferisce con la visualizzazione
dei prodotti. Notate che Bob e Mary hanno un prodotto in comune.
DNA
di Bob
Dimensioni del
frammento, bp
DNA
di Mary
Pozzetti
per i campioni
70
60
50
40
Letture scelte
Ellgren, H. 2005. The dog has its day. Nature 438:745–746.
Un resoconto e un commento riguardo alla prima
pubblicazione del sequenziamento del genoma del cane.
Jeffreys, A. 2005. DNA fingerprinting. Nature Medicine 11(10):
xiv–xviii. Un articolo retrospettivo sullo sviluppo delle
tecniche del fingerprinting del DNA scritto dal ricercatore
che l’ha introdotto .
Morell, V. 1994. Decoding chimp genes and lives. Science
265:1172–1173. Una rassegna non tecnica sugli studi degli
scimpanzé
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E S E R C I T A Z I O N I
Morrell, V. 1997. The origin of dogs: running with the wolves.
Science 276:1647–1648. Un commento sullo studio
dell’evoluzione del DNA del cane che accompagnava la
pubblicazione su Science dell’articolo di Vila et al. riportato
più sotto.
Ostrander, E., e R. Wayne. 2005. The canine genome. Genome
Research 15:1706–1716.Una rassegna scritta da due dei
leader della ricerca sul genoma del cane che riassume gli
studi sull’evoluzione del cane, sulla diversità e sulle origini
delle razze, sulla mappatura dei geni di malattia e sulla
genetica del comportamento. Questo articolo è disponibile
gratuitamente presso http://www.genome.org (tutti gli
articoli pubblicati in questa rivista sono gratuiti a partire da
sei mesi dopo la pubblicazione).
Parker, H. G., et al. 2004. Genetic structure of the purebred
domestic dog. Science 304:1160–1164. Un articolo
scientifico originale nel quale marcatori microsatellitari
sono stati utilizzati per studiare le relazioni fra 85 razze
canine.
Pennisi, E. 2004. Genome resources to boost canines’ role in
gene hunts. Science 304:1093–1094. Una discussione di
come il progresso nella comprensione del genoma del
cane e lo sviluppo di tecniche molecolari come i marcatori
microsatellitari hanno reso le razze pure di cani una risorsa
inestimabile per i cacciatori di geni; accompagnava la
pubblicazione su Science dell’articolo di Parker
menzionato sopra.
Pollinger, J. P., et al. 2005. Selective sweep mapping of genes
with large phenotypic effects. Genome Research 2005
15:1809–1819. Questo articolo descrive lo studio che ha
dimostrato che la regione vicino al recettore per il fattore
di crescita dei fibroblasti (FGF) nel genoma del bassotto è
invariante. Si veda l’introduzione della Esercitazione.
L’articolo è disponibile gratuitamente presso
http://www.genome.org.
Vila, C., et al. 1997. Multiple e ancient origins of the domestic
dog. Science 276:1687–1689. Articolo scientifico originale
che descrive l’analisi dell’evoluzione del DNA
mitocondriale del cane e del lupo
Vila, C., J. Maldonado, e R. Wayne. 1999. Phylogenetic
relationships, evolution, and genetic diversity of the
domestic dog. Jour nal of Heredity 90:71–77.
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Tipizzazione del DNA
in medicina legale
Descrizione dell’esercitazione
! p. 286
Questo capitolo contiene tre facili esercitazioni che illustrano le applicazioni della tipizzazione del DNA e una
lettura che riguarda le applicazioni dell’analisi del DNA
a resti umani trovati in siti archeologici. I riferimenti originali riguardo il caso archeologico sono elencati sotto.
Nell’esercizio 1, gli studenti dovranno assegnare dei bambini alle corrette coppie di genitori basandosi sui profili
del DNA. Nell’esercizio 2, gli studenti analizzeranno dei
dati di tipizzazione del DNA per determinare se il signor
I. M. Megadollari, un multimiliardario recentemente
scomparso, è effettivamente il padre di uno dei tre bambini che si sospetta possano essere suoi eredi. Questa
esercitazione può essere effettuata con qualche approfondimento dagli studenti che hanno già completato Il
confronto dei genomi (Capitolo 27). Prima di affrontare
questa esercitazione, gli studenti dovrebbero avere anche completato l’Esercitazione Forbici che tagliano il
DNA (l’introduzione agli enzimi di restrizione, Capitolo
11) e La corsa del DNA (l’introduzione all’elettroforesi,
Capitolo 12).
Lezioni richieste: 1
Introduzione
I metodi di identificazione basati sul DNA si concentrano su regioni altamente variabili del genoma umano. Dal
momento che i genomi sono tanto grandi, non è possibile analizzare queste regioni mediante digestione con
enzimi di restrizione, elettroforesi e colorazione. I prodotti di digestione con un enzima di restrizione del DNA
umano appaiono come una gigantesca strisciata lungo
tutta la corsia del gel dal momento che 3 miliardi di coppie di basi generano un enorme numero di frammenti.
Le tecniche di ibridazione di Southern e quelle di PCR
permettono al ricercatore di analizzare specifiche regioni ignorando tutto il resto. Nell’analisi di Southern, le regioni esaminate dipendono dal punto in cui la sonda ibrida con il campione di DNA. Nella PCR, la specificità dipende dalla sequenza di basi del primer: la sequenza che
si trova fra due siti di un cromosoma sui quali ibridano
i primer è quella che verrà amplificata dalla reazione. Se
una di queste tecniche viene utilizzata per caratterizzare
varie regioni altamente variabili del genoma di un individuo, l’insieme dei dati generati viene chiamato “profilo del DNA” della persona o, con un termine inglese,
“DNA fingerprint”. Dal momento che il termine “DNA fingerprinting” è attualmente un marchio registrato della
azienda biotecnologica Cellmark, per riferirci al procedimento utilizzeremo in seguito il termine di “tipizzazione del DNA” o “costruzione di un profilo del DNA”.
Per eseguire una tipizzazione del DNA, sarà necessario
avere un campione contenente DNA. Nei casi di paternità dubbia, viene prelevato del sangue dal bambino, da
sua madre e dal presunto padre ed il DNA viene estratto dai globuli bianchi. Tuttavia, per l’analisi, può essere
utilizzato qualsiasi tessuto o fluido corporeo contenente
DNA, come follicoli piliferi, pelle o liquido seminale. I
risultati dell’analisi di tipizzazione del DNA vengono poi
confrontati con i risultati di identiche analisi su altri campioni. Nei casi giudiziari, il profilo del DNA ottenuto dai
campioni rinvenuti sulla scena del delitto (come sangue
o liquido seminale) viene confrontato con il profilo del
DNA del sospettato. Nei casi di paternità dubbia, il profilo del DNA del figlio viene confrontato con quello della madre e del presunto padre.
Il primo metodo di tipizzazione del DNA che è stato utilizzato è l’ibridazione di Southern; attualmente sono sempre più comuni le strategie basate sulla PCR, che hanno
il vantaggio di avere una sensibilità maggiore e possono
essere quindi impiegate con campioni molto più ridotti,
dal momento che amplificano il DNA che deve essere
identificato. Questo vantaggio è particolarmente importante sulla scena di un crimine, dove i campioni disponibili (come frammenti di pelle sotto le unghie della vittima) potrebbero essere estremamente ridotti. Inoltre, è
possibile selezionare primer di PCR tali da amplificare
segmenti di DNA relativamente corti (500 bp o anche meno) rendendo possibile l’analisi anche di DNA parzialmente degradato.
L’accuratezza della tipizzazione del DNA è stata a lungo
oggetto di controversie relative al suo uso forense, ma la
questione è stata ormai in gran parte risolta. Nessuno ha
mai messo in dubbio la teoria alla base della tipizzazione del DNA: il fatto che il DNA di ciascun individuo sia
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unico e differente dagli altri e fornisca, pertanto, un metodo chiaro di identificazione (ad eccezione dei gemelli
identici). I problemi riguardavano due questioni, entrambe ricorrenti nei casi giudiziari.
La prima questione era tecnica: in passato, la discussione in tribunale aveva rivelato in alcuni casi negligenze
nei procedimenti di laboratorio e nell’analisi dei dati. Pratiche di laboratorio impeccabili sono particolarmente importanti nei casi giudiziari. Il destino di una persona può
dipendere dal risultato di un test del DNA, e il campione che si trova sulla scena del crimine potrebbe essere
stato contaminato con altre sostanze, come ad esempio
un colorante per tessuti, potrebbe essere stato esposto a
temperature estreme o potrebbe essere di difficile analisi per qualche altra ragione. Fatto forse più importante è
che i campioni ad uso forense sono estremamente piccoli. Se il risultato di un’analisi del DNA è in qualche modo dubbio, potrebbe essere impossibile ripetere le analisi. In questi casi un’altissima qualità del lavoro di laboratorio è di estrema importanza.
In risposta a queste critiche tecniche, la National Academy of Science, nel 1992 promosse un’iniziativa per la
certificazione dei laboratori, il controllo della qualità e la
standardizzazione dei procedimenti tecnici. A ciò fece
seguito un consorzio organizzato dall’FBI, cui partecipavano ricercatori del mondo accademico, laboratori di criminologia e industrie private, chiamato “Technical Working Group on DNA Analysis Methods”, che stabilì una
serie di linee guida che includevano protocolli di laboratorio, indicazioni per la certificazione della qualità e sui
requisiti minimi di istruzione e formazione del personale. I laboratori di analisi che possiedono tali requisiti possono ricevere una certificazione da gruppi professionali
quali l’American Association of Blood Banks e il College of American Pathologists. I laboratori di analisi di alto livello aderiscono a queste linee guida e fanno in modo di avere la certificazione. Le linee guida per i laboratori di analisi forense sono pubblicate in una sezione del
sito Web dell’FBI denominata CODIS (Combined DNA
Index System). Leggerle potrebbe essere un esercizio interessante per i vostri studenti. Le linee guida riguardano i requisiti di formazione per il personale, per reagenti,
strumentazioni ed altro.
La seconda questione concernente l’affidabilità dei test
del DNA riguardava il punto a partire dal quale può essere ragionevolmente stabilito definitivamente che due
campioni di DNA provengono dalla stessa persona. Questa è una domanda più importante rispetto al problema
tecnico. Il seguente esempio illustra il problema. I laboratori forensi hanno compilato un ampio database di profili di DNA generati con le sonde che usano. Supponiamo che un campione raccolto sulla scena di un delitto
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ed il sangue di un sospettato vengano analizzati con una
sonda A e mostrino lo stesso profilo. Supponiamo che
un particolare profilo abbia una frequenza dell’1% rispetto a tutti i profili del database. Vi è dunque una probabilità dell’1% che un campione preso da una persona
a caso corrisponda al campione trovato sulla scena del
delitto. Supponiamo che i campioni siano analizzati con
le sonde B e C e che ancora rivelino un profilo identico.
Immaginiamo che il profilo generato dalla sonda B abbia, nel database, una frequenza del 5% e che quello della sonda C ne abbia il 10%. Quali sono le probabilità che
il profilo di DNA di una persona presa a caso corrisponda
a tutti e tre i profili? I laboratori forensi utilizzano la regola della moltiplicazione per calcolare questa probabilità e assumono che il profilo di DNA di una persona rispetto ad un locus (per esempio quello mostrato dalla
sonda A) sia indipendente dal profilo rispetto a un altro
locus (come quello mostrato dalla sonda B). In questo
caso la probabilità di trovare tutti e tre i profili in una
persona a caso può essere calcolato semplicemente
moltiplicando le probabilità individuali 0,01 (A) ! 0,05
(B) ! 0,1 (C) = 0,00005. Questo numero ci dice che solo cinque persone su 100 000 avrebbero lo stesso profilo rispetto a tutte e tre le sonde. Se il campione corrisponde utilizzando una quarta sonda, che rivela un profilo riscontrabile nel 2% dei profili presenti nel database,
le probabilità di una corrispondenza casuale scenderebbero a 1/1 000 000. Ovviamente, più grande è il numero
delle sonde utilizzate per analizzare due campioni, più
si riduce la probabilità che la corrispondenza perfetta a
livello di tutte le sonde dipenda dal caso. (Un’esercitazione che potreste utilizzare per mostrare questo tipo di
calcolo delle probabilità è descritta in questo capitolo subito dopo le soluzioni agli esercizi per gli studenti).
Questo è il punto in cui nacque la controversia: i critici
dicevano che la probabilità di una corrispondenza casuale
avrebbe potuto essere molto più alta di quella calcolata
con la regola della moltiplicazione. Per esempio, essi argomentavano che un database contenente i profili ottenuti da individui di etnia caucasica o afroamericana poteva risultare non corretto come base di confronto nel caso in cui il gruppo etnico rilevante in un particolare caso
giudiziario fosse stato polinesiano. Sebbene nel 1993 un
rapporto sull’analisi di più di 70 database di tutto il mondo portò alla conclusione che non c’erano differenze significative nei profili genetici fra gruppi etnici differenti,
questa questione è stata riproposta anche successivamente nelle aule dei tribunali in fase di dibattimento. Inoltre non è possibile escludere l’esistenza di un piccolo
gruppo etnico da qualche parte nel mondo che abbia uno
speciale profilo comune di DNA che non si osserva spesso in nessun altra popolazione, almeno fino a quando
non sia stato tipizzato chiunque e ovunque. In risposta a
questa critica, i laboratori, sia pubblici che privati, hanno
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stabilito dei database di profili di DNA ottenuti da differenti gruppi etnici da usare come base per i confronti.
L’uso sistematico dei profili di DNA
nei casi giudiziari
Secondo Bruce Budowle, degli FBI Academy Forensic Laboratories a Quantico, in Virginia, solo nel 1994 ci sono
stati approssimativamente 168 000 casi di stupro negli Stati Uniti e circa 149 000 tentati stupri. In circa un caso su
tre il colpevole era sconosciuto alla vittima. La maggior
parte degli aggressori sessuali sono recidivi e circa la metà di coloro che vengono condannati per violenza sessuale
sono in libertà vigilata in un dato momento. In risposta a
statistiche come queste, l’FBI ha fondato il CODIS, un database nazionale dei criminali condannati. Come si vede
nel suo sito Web, il CODIS genera indicazioni investigative per crimini in cui vengono recuperate tracce biologiche utilizzando due elenchi: l’elenco forense e l’elenco dei
criminali. L’elenco forense contiene profili di DNA ottenuti sulle scene del crimine, l’elenco dei criminali contiene il profilo del DNA degli individui condannati per reati
sessuali (e per altri crimini violenti), e vari altri Stati stanno allargando la propria legislazione in modo da includere altri tipi di reati. I singoli Stati sono liberi di partecipare al sistema e, a partire dal marzo 2006, tutti e 50 lo
hanno fatto. Nel marzo 2006 c’erano 134 075 profili nell’indice forense e 3 045 761 profili nell’indice dei criminali condannati.
Le corrispondenze individuate fra i profili dell’indice forense possono fornire legami fra più scene di reato, portando, potenzialmente, all’identificazione di criminali seriali. Basandosi su una corrispondenza, le polizie di varie giurisdizioni possono coordinare il loro lavoro investigativo e condividere linee di indagine che hanno sviluppato indipendentemente. Le corrispondenze ottenute fra l’indice forense e quello dei criminali fornisce agli
investigatori l’identità del colpevole (o dei colpevoli).
Dopo che il CODIS ha identificato una potenziale corrispondenza, degli esperti di laboratori qualificati si confrontano per convalidare o scartare la corrispondenza.
Per poter confrontare i profili di DNA, tutti gli Stati partecipanti devono analizzare gli stessi loci genetici quando effettuano le loro analisi di tipizzazione del DNA. Sono stati pertanto selezionati specifici marcatori genetici
e tutti i laboratori coinvolti si sono oggi accordati per
analizzare con la PCR gli stessi 13 loci STR (short tandem r epeat). Uno Stato partecipante genera profili di
DNA e li inserisce nel suo database: il CODIS mette in
collegamento gli Stati. In alternativa, le varie agenzie di
polizia di uno Stato possono inviare dei campioni al laboratorio dell’FBI che li esaminerà gratuitamente. I la-
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boratori dell’FBI forniscono anche una attestazione di testimonianza qualificata riguardo ai risultati delle loro analisi. A partire dal marzo 2006 il CODIS ha fornito 31 400
risultati e assistenza a 33 100 investigazioni.
Obiettivi
Dopo aver svolto gli esercizi, gli studenti dovrebbero essere in grado di:
1 . Spiegare come possono essere usati i profili di DNA
per determinare se un bambino è effettivamente figlio di una data coppia. Essi dovrebbero essere in
grado di fornire una chiara descrizione di che cosa
cercare nel confronto dei profili.
2. Spiegare il procedimento di analisi del DNA per determinare se un certo individuo sia il padre di un
bambino.
Esercizio 1. Confusione all’ospedale
Procedimento
Per gli studenti più esperti, l’esercizio si spiega da solo.
Una recente notizia di cronaca sarebbe un buon modo
per mettere in relazione l’esercitazione con la vita reale.
Secondo il livello della vostra classe, potreste suggerire
il procedimento analitico descritto sotto. Ricordate agli
studenti che metà dei cromosomi di una persona deriva
da ciascun genitore e, di conseguenza, avrà un corrispettivo nei profili di DNA dei genitori. Prima di iniziare
l’esercitazione, ritornate su questi concetti quanto ritenete sia necessario per la vostra classe.
Per analizzare il profilo di DNA, gli studenti dovrebbero
confrontare con cura i profili dei bambini con i profili di
ciascuna coppia (Figura 28.1). Per esempio, gli studenti
possono cominciare con il profilo di un bambino e confrontarlo con quello della prima coppia. Prima di tutto
dovrebbero concentrarsi su un membro della coppia per
confrontare il profilo del bimbo con quello di una persona (per esempio la madre). Ciascuna banda del profilo del bambino dovrebbe essere controllata per vedere
se corrisponde ad una banda nel profilo della prima donna scelta. Ogni banda che corrisponde dovrebbe essere
marcata leggermente con la matita. Se nessuna banda
corrisponde, la donna non può essere la madre del bimbo. Se invece alcune bande corrispondono, gli studenti
dovrebbero poi confrontare le rimanenti bande con il
profilo del DNA dell’uomo. Ciascuna banda residua nel
profilo del DNA del bambino dovrebbe corrispondere a
una banda del profilo di DNA dell’uomo se tale uomo è
il padre. Se alcune ma non tutte le bande corrispondono, allora quel bambino non è figlio della coppia. Gli
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studenti dovrebbero proseguire con la coppia successiva confrontando nello stesso modo il loro profilo con
quello del bambino.
Se volete utilizzare questa esercitazione con studenti meno esperti che non hanno seguito le lezioni sull’ibridazione di Southern, sulla PCR e sulla tipizzazione del DNA dovrete decidere quanto informarli sul modo in cui i profili
di DNA vengono generati. Per comprendere questa esercitazione, gli studenti avranno bisogno di avere chiare le
nozioni presentate nell’esercitazione sugli enzimi di restrizione e sulla elettroforesi su gel di frammenti di restrizione. Se pensate che sia necessario, eseguite un confronto
insieme alla vostra classe seguendo il procedimento descritto sopra. Mentre gli studenti lavorano alla soluzione,
spostatevi da uno all’altro e osservate il loro lavoro per assicurarvi che capiscano quello che stanno facendo.
!Risposta
Il bambino 1 è il figlio degli Stevenson. Il bambino 2 è
il figlio dei Jones. Il bambino 3 è il figlio degli Smith.
Controllate i fogli di ciascuno studente per vedere se hanno assegnato correttamente le bande materne e paterne.
Esercizio 2. Un caso di paternità
Procedimento
Questo esercizio si spiega da solo.
Potreste avere bisogno di ricordare agli studenti che metà dei cromosomi di una persona deriva dalla madre e
l’altra metà dal padre e che non tutte le bande che si vedono nel profilo della madre o del padre saranno nel
DNA del figlio (esattamente metà del DNA di un genitore non sarà rappresentato nel DNA della sua prole).
!Risposta
Il bambino Y può essere il figlio del signor Megadollari.
!Risposta alla domanda per gli studenti
Questa analisi prende in esame quattro regioni VNTR (ripetizioni in tandem di numero variabile). Dal momento
che abbiamo due copie di ciascun cromosoma, avremo
due alleli per ciascuna regione VNTR. Per esempio, se una
regione VNTR è sul cromosoma 1, uno dei nostri cromosomi 1 potrebbe avere 30 copie della ripetizione mentre
l’altro potrebbe averne 20. Pertanto ritroverete entrambe
queste bande dopo un’analisi di ibridazione di Southern
utilizzando una sonda che ibrida con la regione VNTR.
Dal momento che un figlio eredita un membro di ciascuna delle sue coppie di cromosomi dalla madre, l’al-
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lele VNTR su quel cromosoma corrisponderà a uno degli alleli di sua madre. L’altro membro di ciascuna coppia di cromosomi corrisponderà all’allele del padre.
Esercizio 3. Il caso del pugnale
insanguinato
Procedimento
L’esercizio si spiega solo.
!Risposta
La chiave di questo caso è il numero di bande del profilo di DNA ottenuto dal pugnale. Le regioni del cromosoma e i primer mostrano che ciascun cromosoma dovrebbe generare una banda. Dal momento che tutte le persone hanno due copie di ciascun cromosoma, ci dovrebbero essere due bande generate per ogni coppia di primer.
Poiché vengono analizzate due regioni cromosomiche sia
Milhouse (la vittima) sia Smink (il sospettato) hanno quattro bande nel loro profilo. Anche il profilo ottenuto sui vestiti di Milhouse mostra quattro bande che corrispondono
chiaramente a quelle del profilo di DNA di Milhouse. Il
profilo di DNA ottenuto dal pugnale, tuttavia, mostra otto bande, quindi o qualcosa è andato storto nell’analisi
(come una contaminazione dei campioni) oppure il sangue sul pugnale deriva da più di una persona.
Il confronto del profilo di bande mostra che quattro delle otto bande presenti nel profilo del pugnale corrispondono esattamente a quelle del profilo della vittima,
mentre le bande restanti corrispondono esattamente a
quelle di Smink. Date le circostanze, sembra altamente
probabile che il sangue sul pugnale sia una mescolanza
del sangue dei due uomini. Il pugnale è stato trovato sotto il corpo insanguinato, così è possibile che il sangue
della vittima si trovi su di esso anche se la vittima non
aveva ferite da taglio. Le mani di Smink potevano essere state ferite dal pugnale, magari in un tentativo di difesa da parte della vittima. D’altra parte, una scarsa attenzione in laboratorio potrebbe aver portato al mescolamento dei campioni del pugnale e di Smink durante
l’analisi. Il test del DNA dovrebbe essere ripetuto prestando particolare cura ad evitare tali contaminazioni.
Decisamente Smink non dovrebbe essere rilasciato. Le
prove ottenute suggeriscono fortemente che sul pugnale si trovi il sangue di Smink, e l’uomo dovrebbe essere
interrogato accuratamente. Inoltre, dovrebbero essere
eseguite ulteriori analisi del DNA su altre regioni cromosomiche altamente variabili per rinforzare la conclusione che il sangue “extra” trovato sul pugnale appartenga effettivamente a Smink.
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Letture scelte
Cappellini, E., et al. 2004. Biomolecular study of the human
remains from tomb 5859 in the Etruscan necropolis of
Monterozzi, Tarquinia (Viterbo, Italy). Jour nal of
Archaeological Science 31:603–612.
Jeffreys, A. 2005. Genetic fingerprinting. Nature Medicine
11(10):xiv–xviii. Il ricercatore a cui è dovuta l’invenzione
del concetto di tipizzazione del DNA racconta la nascita di
tale tecnica.
Menotti-Raymond, M., et al. 1997. Pet cat hair implicates
murder suspect. Nature 386:774. La storia del caso forense
del gatto Palla di neve.
Yoon, C. K. 1993. Forensic science. Botanical witness for the
prosecution. Science 268:894–895. La storia dell’uso della
tipizzazione del DNA di un albero per mettere in relazione
un sospettato alla scena di un delitto.
Il calcolo delle probabilità:
esercitazione dimostrativa
Parte I. Mescolare il mazzo di carte genetico
Questa esercitazione fornisce un’eccellente opportunità
per ricordare ai vostri studenti che la matematica ha un
ruolo chiave nell’identificazione per scopi forensi del
DNA. La tipizzazione del DNA è fondamentalmente un
gioco di numeri. Poiché nell’identificazione del DNA non
è possibile raggiungere in pratica la certezza matematica, la miglior cosa che si può fare è dire di aver raggiunto
una certezza “virtuale” poiché la probabilità che la corrispondenza sia casuale è estremamente bassa. Questa
esercitazione è progettata per insegnare agli studenti come calcolare le frequenze di un allele e le frequenze di
una serie di alleli semplicemente distribuendo carte da
gioco da un mazzo ben mescolato. Grazie a questo gioco di carte, gli studenti dovrebbero comprendere e apprezzare appieno la strategia che i ricercatori forensi utilizzano per ridurre la probabilità di una corrispondenza
casuale fra una prova ed un sospettato.
– Obiettivi
Dopo aver terminato questa esercitazione, di studenti dovrebbero essere in grado di:
1 . Determinare la frequenza prevista di un allele.
2. Applicare la regola della moltiplicazione per calcolare la frequenza con cui una serie di alleli si presenta
insieme.
3. Spiegare perché le probabilità sono influenzate dal
modo in cui è costruito un database
4. Discutere se le prove basate sul DNA sono da sole
sufficienti per condannare un sospettato di assassinio
in assenza di altre prove a sostegno.
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– Materiali
• Un mazzo di carte da gioco. Se è possibile, fate in
modo che ognuno porti il proprio mazzo in classe;
in questo modo tutti saranno coinvolti e il gioco procederà molto più rapidamente.
• Una calcolatrice.
– Procedimento
Dite agli studenti che utilizzeranno il mazzo di carte per
verificare praticamente la regola della moltiplicazione
utilizzata per calcolare la probabilità nella tipizzazione
del DNA. Ogni carta distribuita rappresenta un locus
(cioè uno specifico sito di un cromosoma). Il colore della carta (rosso o nero) o il suo seme (picche, quadri,
cuori o fiori) oppure uno specifico valore (ad esempio
re) o una combinazione di essi (ad esempio regina di
cuori) rappresentano gli alleli (sequenze o profili specifici di DNA che si trovano in un particolare locus; vedi sotto).
Queste sono le regole del gioco: scoprite una determinata carta o un gruppo di carte. Annunciate al resto della classe che questa carta (o gruppo di carte) rappresenta
un profilo di DNA ottenuto da un corpo di reato trovato sulla scena di un crimine. Dite ai vostri studenti che
sono tutti sospettati del crimine. La domanda è: quanti
di loro hanno un profilo di DNA che corrisponde a quello della prova? Fate calcolare agli studenti la probabilità
di una corrispondenza prima di cominciare a distribuire
le carte. Quindi fate estrarre a ciascuno studente lo stesso numero di carte dal proprio mazzo come avete fatto
voi. Contate quanti profili dei “sospettati” corrispondono al profilo ottenuto dal corpo di reato. Se ci sono delle corrispondenze confrontate i risultati sperimentali con
quelli delle loro probabilità calcolate.
Cominciate con eventi ad alta probabilità. Qui sotto è illustrata una possibile sequenza.
1 . Girate una carta rossa. La singola carta corrisponde
ad un locus analizzato con un’unica sonda. Il colore
rosso rappresenta l’allele rivelato dalla sonda in quel
locus. Quanti studenti dovrebbero estrarre una carta
rossa? (Risposta: 1 su 2; metà delle carte in un mazzo sono rosse e quindi la frequenza allelica del rosso è pari a 1/2, ossia 1 su 2).
A questo punto chiedete ai vostri studenti come fanno sapere che le probabilità sono una su due. Essi risponderanno naturalmente che sanno che la metà
delle carte di un mazzo sono rosse. Spiegate che i criminologi usano dei database di profili di DNA in modo da sapere quanto frequentemente si trova una particolare configurazione a livello di un locus. Se gli studenti stessero utilizzando un mazzo di carte di cui
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non sapessero nulla, non avrebbero potuto calcolare
le probabilità di estrarre una carta rossa. In modo simile i criminologi devono basarsi sui loro database
per fare i calcoli.
2. Scoprite una carta di fiori. Ancora una volta la singola
carta rappresenta un singolo locus; questo locus ha
quattro possibili alleli rappresentati dai quattro possibili semi. Quanti studenti dovrebbero trovare una
corrispondenza con l’allele “fiori”? (Risposta: 1 su 4;
la frequenza allelica per fiori è 1/4, ossia 1 su 4).
Al momento ancora troppi “sospettati” hanno una
corrispondenza casuale con il profilo trovato sul corpo del reato, facciamo dunque in modo di abbassare la probabilità di una corrispondenza accidentale:
potreste chiedere agli studenti come fare ad abbassare la probabilità; essi dovrebbero suggerirvi di utilizzare combinazioni di più carte o di utilizzare il loro valore.
3. Scoprite quattro carte rosse in successione. Ciò rappresenta l’utilizzo di quattro differenti sonde per esaminare quattro loci, ciascuno dei quali ha due alleli
(rosso o nero). Quanti studenti dovrebbero trovare
un profilo che corrisponde a quattro carte rosse? (Risposta: 1 su 16; 1/2 ! 1/2 ! 1/2 ! 1/2 =1/16.)
4. Scoprite quattro carte rosse in successione, una delle quali è un asso. Quanti “sospettati” avranno un
profilo corrispondente? (Risposta: 1 su 208. La probabilità di trovare tre carte rosse è 1/2 ! 1/2 ! 1/2 ,
la probabilità di trovare un asso rosso è 1/2 per il rosso e 1/13 per l’asso. La probabilità di ottenere le quattro carte descritte è pertanto 1/2 ! 1/2 ! 1/2 ! 1/13
ovvero 1/208. Notate come l’inclusione di un allele
con una frequenza relativamente bassa, l’asso rosso,
rende la probabilità di questa corrispondenza molto
più bassa di quella trovata nella domanda 3.)
Fate ancora qualche esempio con frequenze alleliche
più basse. La probabilità di trovare una carta specifica come la regina di cuori, è 1/52 (1/4 per il seme !
1/13 per la regina). La probabilità di trovare quattro
carte specifiche sarà approssimativamente 1/52 !
1/52 ! 1/52 ! 1/52.
Abbiamo detto approssimativamente perché uno studente acuto potrebbe rendersi conto che se estraete
una carta specifica da un mazzo (come la regina di
cuori) e volete quindi sapere le probabilità estrarre
un asso di picche, ci saranno solo 51 carte rimaste
nel mazzo. La probabilità di estrarre l’asso di picche
fra le carte rimanenti è 1/51. Tuttavia nelle analisi del
DNA non state rimuovendo alcunché dal “mazzo”
quando utilizzate una sonda per visualizzare uno specifico locus. Per essere totalmente corretti in questa
© 978-88-08-06411-0
simulazione, si dovrebbe estrarre separatamente ciascuna carta, annotarne l’identità rimetterla nel mazzo
prima che venga estratta una seconda carta. Se gli studenti non si accorgono di questo problema non vi
raccomandiamo di farlo!
5. Eliminate tutte le carte di cuori da tutti i mazzi. Adesso rispondete alla domanda 3. (Risposta 1/81; 1/3 !
1/3 ! 1/3= 1/81). Notate come alterando il database
è cambiata significativamente la probabilità di questa
corrispondenza rispetto al gruppo di alleli della domanda 3.
– Suggerimenti
• Nel caso di sequenze con bassa probabilità, come
quella della domanda 4, gli studenti dovrebbero
estrarre una mano di carte, quindi immettere le carte nel mazzo prima di estrarre una seconda mano. In
ogni caso, l’esercizio dovrebbe funzionare altrettanto bene, specialmente per alleli con alta probabilità,
anche se scegliete di saltare il passaggio del rimescolamento per ragioni di tempo.
• Talvolta, una combinazione “improbabile” viene
estratta nelle prime due o tre mani. Se questo accade, fate in modo che i vostri studenti continuino ad
estrarre mani di carte così da verificare la frequenza
osservata. Dovrebbe risultare ovvio che la probabilità osservata corrisponde alla probabilità calcolata solo quando si estrae un numero sufficiente di carte.
Questa strategia aiuterà i vostri studenti a capire che si
ottengono probabilità basse di una corrispondenza casuale scegliendo alleli a bassa frequenza e includendo
nel gioco più carte (loci). Fate notare ai vostri studenti
che includere più carte nel gioco corrisponde ad includere più di una sonda di DNA in un esperimento di analisi del polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP).
Parte II. Discussione
– La fallacia dell’accusatore
Ci sono due punti importanti riguardo all’interpretazione di una prova basata sul DNA. Il primo è: qual è la
probabilità che un individuo innocente corrisponda? La
seconda è: qual è la probabilità che un individuo che
corrisponde sia innocente? È la seconda domanda quella che interessa direttamente i tribunali. Le due domande sono piuttosto differenti. Un errore comune, la “fallacia dell’accusatore” consiste nel dare la risposta alla prima domanda in risposta alla seconda, ovvero, confondere la probabilità della corrispondenza con la probabilità di innocenza. La probabilità di innocenza dipende
dalla totalità delle prove.
Per esempio, consideriamo un sospettato il cui profilo di
DNA corrisponde a quello trovato sul corpo del reato
E. Genomica
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con una probabilità di 1/700 000 e tuttavia un testimone
oculare affidabile giura che egli era 1000 miglia lontano
dalla scena del crimine quando è stato commesso il delitto. Discutete quest’esempio con i vostri studenti. È importante che rendiate chiaro ai vostri studenti che una
piccola probabilità di corrispondenza casuale non può,
da sola, decidere la colpevolezza.
1 . Spiegate questa affermazione: ci sono più differenze
fra persone a livello del DNA che a livello delle proteine.
2. Spiegate che la tipizzazione del DNA si basa sull’esame di regioni variabili del genoma.
3. Descrivete i due metodi tecnici utilizzati nella tipizzazione del DNA: PCR e ibridazione di Southern.
4. Spiegate che cos’è un RFLP e spiegate il modo in cui
può originarsi un RFLP.
5. Spiegate perché è necessario utilizzare l’ibridazione
o la PCR nella tipizzazione del DNA.
Tipizzazione del DNA in classe
Varie aziende forniscono dei kit per il “DNA fingerprinting”, che sono simulazioni in cui gli studenti digeriscono diversi campioni di DNA (spesso denominati “scena
del crimine” e “sospettati”) con degli enzimi di restrizione, fanno correre i prodotti su un gel e infine confrontano il bandeggio ottenuto dalla colorazione per “identificare” il “colpevole”. Noi non ci troviamo a nostro agio
con queste simulazioni dal momento che tendono a dare un’impressione fortemente sbagliata della tipizzazione del DNA umano: ovvero che si possa eseguire semplicemente osservando prodotti di digestione di DNA
umano colorati. Essi trascurano l’enorme complessità del
genoma umano e il problema di analizzare selettivamente regioni ad alto contenuto di informazione.
Una semplice simulazione di laboratorio che troviamo
utile è il PCR For ensic Simulation Kit, numero 21.1210,
della Carolina Biological Supply Company. In questo
G U I D A
A L L E
E S E R C I T A Z I O N I
kit sono forniti direttamente campioni che rappresentano prodotti di PCR di vari sospettati e di oggetti trovati sulla scena del crimine. Tali “prodotti” possono essere separati su gel di agarosio ed esaminati. Questa è
una simulazione realistica, dal momento che i prodotti
di PCR possono essere visualizzati sui gel colorati.
Uno scenario leggermente differente di tipizzazione del
DNA è presentato nel kit Outbreak! Fingerprinting Virus
DNA numero 21-1208. Qui gli studenti utilizzano la digestione con enzimi di restrizione per tipizzare un ceppo di virus. Troviamo opportuna questa simulazione perché i genomi virali sono sufficientemente piccoli da permettere di ottenere una risoluzione fra i diversi frammenti
di restrizione.
Se disponete di un termociclatore (una macchina per
PCR) potreste ordinare un vero kit per tipizzazione del
DNA dalla Perkin-Elmer. I due loci più comunemente utilizzati sono il D1S80 e DQ-alpha: sono disponibili kit per
entrambi i loci. La Carolina Biological Supply Company
vende un kit didattico Human VNTR Polymorphism, numero 21-1233-1234 o -1235, che utilizza il locus pMCT118
(noto anche come D1S80) sul cromosoma 18. I prodotti
di queste amplificazioni sono spesso frammenti molto
piccoli e devono essere colorati con bromuro di etidio.
Colorazioni nello spettro del visibile non danno dei buoni risultati. Il kit contiene istruzioni per gli studenti e per
il docente. Tutti questi kit utilizzano cellule della mucosa orale come sorgente di DNA.
In collaborazione con il DNA Learning Center dei Cold
Spring Harbor Laboratories, la Carolina Biological Supply
Company fornisce un kit per amplificare il DNA mitocondriale umano (numero 21.1236, -1237 o -1238). I campioni amplificati del DNA degli studenti possono essere
spediti ai Cold Spring Harbor Laboratories, dove per una
piccola cifra verranno sequenziati e i risultati verranno
messi on-line. I dati ottenuti dagli studenti possono essere successivamente utilizzati per esplorare i database
genomici e per altre esercitazioni.
143
E. Genomica
G U I D A
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29
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Mappatura del genoma
Descrizione dell’esercitazione
! p. 293
Nel Capitolo 27 abbiamo discusso l’uso dei polimorfismi
del DNA per confrontare i genomi. In questo capitolo illustreremo come sono utilizzati i loci polimorfici nella
mappatura genetica, utilizzando come esempio un gene
umano per una malattia. L’Esercitazione 29 contiene molto materiale introduttivo, incluso un esempio dell’uso
della mappatura genetica per determinare la posizione
relativa di tre marcatori cromosomici (il locus ABO del
gruppo sanguigno, il locus della sindrome unghia-rotula, “nail-patella syndrome”, e il locus di un’ipotetica breve ripetizione in tandem polimorfica, STR).
L’esercitazione stessa è una simulazione di parte del processo di mappatura della posizione fisica di un gene. Qui
forniremo agli studenti un albero genealogico riguardante l’eredità di un marcatore genetico e un gel da analizzare per dedurre le informazioni sull’eredità di un marcatore STR. Gli studenti devono unire i dati genetici e molecolari e decidere se i dati ottenuti confermano un’ipotesi di associazione tra il marcatore STR e il gene. Il nostro
scopo non è quello di fornire un’analisi completa delle difficoltà della mappatura genetica, ma piuttosto quello di
dare agli studenti un’idea di come i ricercatori riescono a
capire dove si trovano i geni e del modo in cui i marcatori come le STR sono utilizzati in questo procedimento.
L’esercitazione contiene un numero abbastanza grande di
dati che possono essere analizzati dagli studenti. In confronto al lavoro reale dei ricercatori che mappano i loci
genici, la mole di questi dati è piuttosto piccola. Infatti, il
concetto che mappare i geni che causano malattie necessita di molto lavoro rientra negli scopi.
Questo capitolo include anche una lettura sul Progetto
Genoma Umano.
Lezioni richieste: a differ enza delle esercitazioni del
Capitolo 28, questa esercitazione presenta un problema
abbastanza complesso che richiede par ecchio tempo e
l’integrazione di molte informazioni di base. Gli studenti
potrebbero aver bisogno di un ripasso della meiosi e del
crossing over, e, se non conoscono abbastanza bene la
mappatura genetica, dovrete eseguire l’esercizio insieme
a loro o spiegar ne l’esecuzione mentr e lo leggono. Non
sappiamo stimare il tempo richiesto. Per alcune classi, po-
tr ebbe esser e sufficiente una lezione e poi assegnar e il
problema o le parti non ter minate come compito a casa.
Se volete che gli studenti svolgano la maggior parte del
lavoro in classe, questo richiederà probabilmente due o
più lezioni da 50 minuti.
Introduzione
Leggete le informazioni di base dell’Esercitazione.
Uno dei termini che abbiamo introdotto in questo capitolo è aplotipo, un’abbreviazione di genotipo aploide. Il
termine aplotipo si riferisce al contenuto di DNA di una
molecola contigua, come il genoma mitocondriale, un
singolo cromosoma, o una parte di un cromosoma, anche fino a regioni molte piccole. Un allele di un gene è
un aplotipo nel senso che rappresenta una sequenza di
DNA su un singolo cromosoma. A volte i termini allele
e aplotipo sono utilizzati in modo interscambiabile, ma
il termine allele si riferisce ad un singolo locus (un gene, parte di un gene, o una singola regione ripetuta)
mentre aplotipo può essere esteso ad un intero cromosoma. Talvolta il termine aplotipo è utilizzato per far riferimento a metà genoma, nel senso che un gamete contiene un aplotipo, ed è spesso usato per far riferimento
ad uno specifico genotipo mitocondriale.
Da quando i microsatelliti sono diventati così importanti per confrontare e mappare i genomi, molti articoli che
vi può capitare di leggere parlano di aplotipi nel senso
di aplotipi dei microsatelliti. Un aplotipo di un microsatellite è l’esatta configurazione di sequenze ripetute lungo un singolo cromosoma. La Figura 29.1 mostra aplotipi che includono sia marcatori genetici sia un microsatellite.
Obiettivi
Dopo aver completato questa lezione, gli studenti dovrebbero essere in grado di:
•
Spiegare che le mappe genetiche sono costruite osservando lo schema di eredità di caratteri e/o di marcatori sul DNA.
145
29 Mappatura del genoma
G U I D A
146
•
•
•
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Spiegare che quando sono molto vicini su un cromosoma, due caratteri hanno una maggiore probabilità di essere ereditati insieme rispetto al caso in cui
siano su cromosomi diversi o su uno stesso cromosoma ma molto lontani.
Spiegare che quando due caratteri sono su cromosomi diversi la loro probabilità di coeredità è del 50%.
Spiegare come la ricombinazione durante la meiosi
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separa i marcatori che si trovano sullo stesso cromosoma.
Preparazione
•
Se necessario, ripassate l’ereditarietà mendeliana e la
meiosi.
!Risposte al Foglio di lavoro 29.A
1.
Inserite i genotipi delle persone dell’albero genealogico A basandovi sull’analisi dell’eredità e sull’analisi dei dati molecolari dello schema del gel A.
Individuo
BFNC
STR
I1
Bb
6,8
I2
bb
7,9
II1
Bb
7,8
Genotipo
II3
II4
bb
bb
6,9
7,8
II2
bb
6,7
II5
Bb
8,9
II6
Bb
7,8
II7
bb
6,9
II8
Bb
7,8
2. Quali sono gli alleli STR del padre (individuo I1)?
6,8
3. Quali sono le quattro combinazioni degli alleli BFNC e STR che il padre può trasmettere ai figli? Questi sono i
possibili aplotipi paterni:
6B
,
,
6b
8B
,
8b
4. Inserite l’aplotipo paterno ereditato da ciascun membro della generazione II.
II1
8B
II2
6b
II3
6b
II4
8b
II5
8B
II6
8B
II7
6b
II8
8B
5. Inserite i quattro aplotipi paterni (della domanda 3) e riportate la frequenza con la quale ciascuno di essi com-
pare tra i membri della generazione II.
Aplotipo
6B
6b
8B
8b
Frequenza nella generazione II
0 /8
3 /8
4 /8
1 /8
6. Se i loci STR e BFNC sono associati, quali dovrebbero essere i due aplotipi non ricombinanti? 8B e 6b. E gli aplo-
tipi ricombinanti?
8b e 6B
7. Qual è la frequenza di questi ipotetici aplotipi non ricombinanti nella generazione II?
8. Qual è la frequenza degli aplotipi ricombinanti?
1 /8 + 0/8 =1 /8
4/8 + 3/8 = 7/8
!Risposte al Foglio di lavoro 29.B
1.
Inserite i genotipi delle persone dell’albero genealogico B basandovi sull’analisi dell’eredità e sull’analisi dei dati molecolari dello schema del gel B.
Genotipo
Individuo
II1
S1
III1
III2
III3
III4
III5
III6
III7
BFNC
Bb
bb
bb
Bb
Bb
bb
bb
Bb
bb
STR
7,8
5,6
7,5
8,5
8,6
7,5
7,6
7,5
7,5
E. Genomica
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147
2. Se il locus BFNC e il locus STR sono associati, quale allele STR è associato all’allele BFNC che causa la malattia
nell’individuo II1 (guardate i risultati sul Foglio di lavoro 29.A)?
3. Quali sono gli aplotipi non ricombinanti nell’individuo II1?
. E nell’individuo II8?
8
e
7b
. E in II8?
8
8B
8B
e
7b
4. Inserite gli aplotipi materni della progenie di II1 e gli aplotipi paterni della progenie di II8.
Progenie di II1
Progenie di II8
Aplotipo materno
Aplotipo paterno
III1
III2
III3
III4
III5
III6
III7
7b
8B
8B
7b
7b
7B
7b
5. Quanti aplotipi della generazione III sono non ricombinanti?
6
6. Quanti aplotipi della generazione III sono ricombinanti?
1
7. Sommando i risultati delle generazioni II e III, quanti aplotipi non ricombinanti ci sono?
13
. Qual è la lo. Quanti aplotipi ricombinanti ci sono?
2
. Qual è la loro frequenza?
ro frequenza?
1 3 /1 5
2/1 5
8. I dati dei Fogli di lavoro 29.A e 29.B confermano l’ipotesi che il locus STR e il locus BFNC sono associati? Spiegate la vostra risposta.
Sì, i dati son o in accor do con l’ipotesi di associazion e; 1 3/1 5 degli aplotipi n on son o r icombin an ti. Questo r isultato può avven ir e per caso, ma è impr obabile.
!Risposte al Foglio di lavoro 29.C
1.
Inserite i genotipi delle persone dell’albero genealogico C basandovi sull’analisi di eredità e sull’analisi dei dati
molecolari dello schema del gel C.
Genotipo
Individuo
III6
S3
IV1
IV2
IV3
IV4
BFNC
Bb
bb
Bb
bb
Bb
Bb
STR
5,7
6,6
6,7
6,5
6,7
6,7
Nessuna delle persone dell’albero genealogico C ha gli alleli STR presenti nell’individuo I1. I dati dell’albero genealogico C e dello schema del gel C sostengono l’ipotesi che i loci BFNC e STR sono associati? Spiegate la vostra risposta.
Sì, i dati son o in accor do con l’ipotesi di associazion e. Nessun o degli in dividui n ell’alber o gen ealogico
h a gli alleli STR dell’in dividuo I1 per ch é il padr e affetto, l’in dividuo III6, h a un aplotipo r icombin an te,
7B. Egli h a tr asmesso questo aplotipo a tr e dei suoi figli e h a tr asmesso l’altr o, l’aplotipo n on r icombin an te, 5b, al quar to figlio, per ciò tutti e quattr o i suoi figli h an n o er editato gli aplotipi n on r icombin an ti.
Guar dan do gli aplotipi r icombin an ti e n on r icombin an ti di ciascun a gen er azion e, vediamo la seguen te
situazion e:
Gen er azion e
Aplotipo n on r icombin an te
Aplotipo r icombin an te
II
7
1
III
6
1
IV
4
0
Totale
17
2
La fr equen za totale di r icombin azion e tr a il locus STR e l’allele BFNC è soltan to 2/1 9, in accor do con l’ipotesi di associazion e.
148
29 Mappatura del genoma
G U I D A
A L L E
Soluzione per l’albero genealogico mostrato in Figura 29.4. Sono
mostrati genotipi di ciascun individuo relativi al gene BFNC e al locus STR. *: aplotipo ricombinante.
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Generazione
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B b
b b
6, 8
7, 9
I
b b
B b
b b
b b
5, 6
7, 8
6, 7
6, 9
b b
B b
B b
b b
5, 7
5, 8
6, 8
5, 7
II
*
b b
B b
B b
b b
B b
b b
7, 8
8, 9
7, 8
6, 9
7, 8
5, 5
b b
b b
B b
b b
6, 7
6, 6
5, 7
III
*
5, 7
B b
b b
B b
B b
6, 7
5, 6
6, 7
6, 7
IV
E. Genomica
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Microarray e analisi genomica
Descrizione dell’esercitazione
! p. 306
Questa esercitazione è una simulazione interattiva al computer di un’analisi di microarray di espressione genica in
cellule normali e cancerose. La simulazione si trova nel sito internet del “Genetic Science Learning Center” (GSLC)
dell’Università dello Utah, a cui facciamo riferimento con
il loro permesso. L’URL per il GSLC è http://learn.genetics.utah.edu/ e quello dell’esercitazione è http://learn.genetics.utah.edu/units/biotech/microarray/. Ci hanno assicurato che l’esercitazione rimarrà on-line, e se l’URL dovesse cambiare, dovreste essere in grado di trovarla cercando nel sito del GSLC.
La lettura prende in esame un’applicazione di caratterizzazione del genotipo che un giorno potrebbe entrare a
far parte della cura medica dell’intera popolazione: la farmacogenetica.
Lezione richieste:1
Introduzione
L’analisi di ibridazione permette ai ricercatori di porsi domande su specifiche sequenze di acidi nucleici. Ibridando una sonda con il DNA, si può determinare se la sequenza dell’acido nucleico della sonda è presente nel
campione. Ibridando una sonda con l’RNA messaggero
(mRNA) si può sapere se l’RNA che contiene quella sequenza è stato sintetizzato. Il punto cruciale di queste analisi consiste nell’avere una sonda per il gene di interesse.
Negli anni ’90, il Progetto Genoma Umano ha portato a
fantastici progressi nella tecnologia del sequenziamento
del DNA e anche ad un enorme aumento delle sequenze di DNA note disponibili per i ricercatori. Dove prima
i genetisti erano soliti concentrarsi sui singoli geni, è diventato possibile studiare interi genomi.
I microarray
La tecnologia dei microarray, sviluppata più o meno nello stesso periodo, fornisce un modo per ottenere informazioni su migliaia di geni contemporaneamente. I mi-
croarray, chiamati anche “gene chip”, sono matrici ordinate di sonde di DNA a singolo filamento fissate su un vetrino. (“GeneChip” è un marchio registrato dell’Affymetrix,
Inc., un produttore di microarray. Un GeneChip è un tipo
particolare di array costruito con le stesse attrezzature utilizzate per produrre i chip per i computer.) Alla base del
loro utilizzo ci sono gli stessi principi di ogni altro saggio
di ibridazione, ma richiede una strumentazione ad alta tecnologia per la costruzione degli array e per la lettura dei
risultati e fornisce informazioni riguardanti molti geni contemporaneamente.
Un microarray assomiglia ad una piccola scacchiera su
un vetrino grande all’incirca come un coprioggetto. Secondo una ditta che li produce e li vende, ogni quadrato della scacchiera è di circa 8 µm2. Per avere un confronto, un capello umano ha diametro di circa 50 µm.
Negli 8 µm2, migliaia di copie della stessa sonda di DNA
sono attaccate al vetrino. Nel linguaggio dei microarray,
questo quadrato, con la sua sonda unica di DNA, è chiamato “feature”. Gli 8 µm2 adiacenti conterranno migliaia
di copie di una sonda di DNA diversa. Un chip di geni
grande circa quanto un’unghia del pollice può contenere almeno 400 000 “feature”.
Non c’è necessariamente una corrispondenza uno ad uno
tra “feature” e geni. Normalmente i produttori di microarray progettano molte sonde diverse in diverse porzioni
dello stesso gene. Questa struttura ridondante aiuta a diminuire gli errori che possono essere causati dall’ibridazione crociata di due geni diversi sulla stessa sonda. I produttori cercano in tutti i modi di progettare sonde che riducano al minimo l’ibridazione crociata. Per ottenere questo risultato, usano computer molto potenti e i dati accumulati dai progetti di sequenziamento del genoma.
Esperimenti con i microarray
Come è stato detto in precedenza, gli esperimenti con i
microarray utilizzano gli stessi principi generali validi per
qualsiasi esperimento di ibridazione, ma c’è una differenza. Nell’ibridazione fluorescente in situ o nell’ibridazione di Southern, la sonda di DNA è marcata. Nei microarray, le sonde sono fissate sul chip e ad esse sono
applicati i campioni marcati.
149
150
30 Microarray e analisi genomica
G U I D A
A L L E
E S E R C I T A Z I O N I
Il campione può essere sia DNA che RNA. Quando si
analizzano campioni di DNA con i microarray, lo scopo
è quello di ottenere informazioni sul genotipo. Il campione viene ibridato con sonde che rappresentano diversi alleli dei geni, e il genotipo viene individuato in base allo schema di ibridazione. Quando si analizzano campioni di mRNA, lo scopo è quello di ottenere informazioni riguardanti quali geni sono espressi. In questi esperimenti, normalmente l’RNA viene isolato dalle cellule
per essere confrontato. Per esempio, i ricercatori hanno
studiato la serie di geni espressi quando il lievito Saccharomyces cerevisiae viene fatto crescere in substrati diversi. Essi hanno confrontato gli RNA isolati da cellule
normali e tumorali. Le analisi sul DNA forniscono informazioni sul genotipo; le analisi sull’RNA forniscono informazioni sull’espressione genica.
Per effettuare un’analisi con i microarray, il campione di
acido nucleico viene isolato e marcato, spesso durante
l’amplificazione. Se il campione è costituito da RNA, viene normalmente convertito in DNA complementare
(cDNA) e marcato. Se il campione è formato da DNA,
questo viene tagliato in frammenti prima di essere marcato o viene amplificato in frammenti. Il campione di
DNA marcato viene poi applicato su un microarray per
permettere l’ibridazione. Il chip viene lavato per rimuovere tutto il campione che non si è legato, e il campione di DNA legato viene rilevato. La posizione del segnale
prodotto dal campione di DNA legato corrisponde alla
posizione della “feature” alla quale si è ibridato, e fornisce informazioni sulla sequenza di DNA del campione. Moltiplicate tutto questo per 400 000 “feature” ed otterrete un enorme numero di informazioni da elaborare. Le analisi con i microarray non sarebbero fattibili senza i computer. Gli scanner computerizzati leggono i chip
dopo l’ibridazione e interpretano gli schemi di ibridazione fornendo informazioni riguardanti sequenze o geni specifici.
Applicazioni della tecnologia
dei microarray
L’analisi del genotipo con i microarray permette ad un
ricercatore di analizzare contemporaneamente a livello
di molti loci quali alleli, tra i molti possibili, sono presenti nel genoma di una persona. Un’applicazione per la
quale ciò può risultare utile è la mappatura genetica. I
ricercatori possono preparare il DNA a partire da diversi membri di una famiglia e ibridarli sugli array che permettono di analizzare la presenza di molti polimorfismi
di un singolo nucleotide (SNP). Per progettare un microarray per analizzare la presenza di specifici SNP o altri piccoli cambiamenti di sequenza, i ricercatori nor-
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malmente allestiscono molte sonde, anche dozzine, per
lo stesso SNP per ridurre al minimo la probabilità di ibridazioni crociate e falsi positivi. L’analisi dei risultati può
mostrare se particolari SNP sono ereditati insieme con il
fenotipo (o SNP) di interesse. Nel capitolo precedente,
gli studenti hanno esaminato lo schema di un solo gel
che mostrava i risultati dell’analisi di un solo locus. Con
un microarray, il DNA di una persona può essere esaminato per la presenza di molti polimorfismi diversi in
una sola volta. Questo approccio fa risparmiare una grande quantità di lavoro rispetto alla singola analisi di ciascun locus.
Un’altra applicazione della genotipizzazione con i microarray consiste nel determinare gli alleli di un gene
specifico o dei geni presenti in una persona. Per esempio, oltre 1000 mutazioni nel gene CFTR possono causare la fibrosi cistica. Utilizzando un chip opportunamente progettato, sarebbe possibile esaminare contemporaneamente la presenza di tutte le 1000 mutazioni.
Un’applicazione potenziale di questo tipo di genotipizzazione è descritta nella Lettura Genomica personale.
Un altro tipo di esperimento in cui si utilizzano i microarray consiste nel confrontare gli schemi di espressione genica in tempi diversi o in circostanze diverse.
Negli studi di espressione genica, i ricercatori isolano
l’mRNA, perché rappresenta solo i geni che sono trascritti. L’esercitazione con la simulazione al computer nel
sito internet del GSLC mostra questa applicazione dei microarray in modo molto accurato.
Obiettivi
Dopo aver completato questa esercitazione, gli studenti
dovrebbero essere in grado di:
1 . Descrivere un microarray e due diversi tipi di esperimenti (la genotipizzazione e la costruzione di un
profilo di espressione genica) che possono essere
eseguiti con essi.
2. Descrivere i passaggi di un esperimento di microarray.
Materiali e procedimento
Questa è una simulazione al computer. Gli studenti hanno bisogno di un accesso ad Internet. L’esercitazione
spiega tutto passo per passo.
Quando è stato scritto il libro, l’URL della simulazione era
http://learn.genetics.utah.edu/units/biotech/microarray/.
Non abbiamo riportato l’URL nell’Esercitazione.
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F. BIOINFORMATICA E ANALISI
EVOLUTIVA DELLE PROTEINE
In questa sezione di esercitazioni, ci concentreremo sulle proteine e sulla loro evoluzione, usando come esempio l’enzima amilasi. Questa sezione consente di ripassare le relazioni tra struttura e funzione delle proteine,
oltre che di insegnare agli studenti come usare le banche dati presenti in Internet. Le banche dati sono una
risorsa dinamica, costantemente aggiornata tramite l’aggiunta di nuovi dati. Dopo che gli studenti hanno imparato ad usare queste risorse, potranno includere nelle future esercitazioni la ricerca nelle banche dati.
Nella prima esercitazione, gli studenti esamineranno materiali provenienti da diverse fonti per determinare se è
presente l’attività dell’amilasi. Questa esercitazione conferma che l’amilasi è presente in organismi che vanno dai
batteri alle piante agli animali. Gli studenti utilizzeranno
poi l’elettroforesi di proteine per osservare le dimensioni relative delle amilasi dei diversi organismi, identificandone le bande nel gel grazie all’attività enzimatica. In
seguito, confronteranno porzioni delle sequenze amminoacidiche di vari organismi. Utilizzando il grado di differenza presente tra le sequenze proteiche delle amilasi,
faranno ipotesi sul grado di parentela dei vari organismi
dai quali l’amilasi proviene. Alla fine, gli studenti useranno risorse bioinformatiche in Internet (banche dati
pubbliche di sequenze di DNA e di proteine, oltre a software analitici) per identificare gli organismi e le regioni
relativamente costanti delle proteine, e trovare altre sequenze di amilasi strettamente correlate.
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31 L’amilasi, un enzima conservato durante l’evoluzione
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L’amilasi, un enzima conservato
durante l’evoluzione
Descrizione dell’esercitazione
! p. 312
In questa esercitazione, gli studenti esamineranno le attività di amilasi provenienti da varie fonti, usando il test
con lo iodio per l’amido. Inizieranno esaminando la loro saliva e confrontando l’attività della loro amilasi con
quella di una preparazione industriale. Metteranno dei
campioni di terreno diluiti in acqua su piastre di amidoagar per rivelare l’attività dell’amilasi negli organismi che
vi crescono. Infine, esamineranno varie altre fonti, tra le
quali un fagiolo in germinazione, foglie, radici, lievito di
birra e saliva di cane.
Lezioni richieste: 2 o 3 nell’arco di qualche giorno, necessario per far crescere gli organismi del suolo e per
permettere agli studenti di portare materiale supplementare da analizzare.
Introduzione
Le piante utilizzano l’energia proveniente dalla luce solare per alimentare la sintesi di glucosio, che possono
usare subito o immagazzinare come amido, un polimero del glucosio. Quando le piante hanno bisogno dell’energia immagazzinata nell’amido (per esempio durante
la germinazione di un seme), gli enzimi della pianta idrolizzano l’amido in zuccheri. Anche gli animali usano l’amido per l’energia, ma invece di produrlo, lo ottengono
mangiando le piante. Quando un animale mangia l’amido, scinde l’amido in zuccheri attraverso l’azione degli
enzimi che lo idrolizzano.
I due enzimi che idrolizzano l’amido sono l’amilasi e
l’amiloglucosidasi. L’amilasi attacca una molecola di
amido come fosse un paio di forbici, tagliandola in catene di molecole di glucosio più piccole chiamate destrine. Alcune amilasi sono più specifiche di altre e tagliano accuratamente il glucosio in unità formate da due
molecole di glucosio dette maltosio o zucchero di malto. Le catene dell’amido possono avere diramazioni, e
l’amilasi non può tagliare i punti di diramazione. L’amiloglucosidasi taglia singole molecole di glucosio a
partire dalla estremità di una molecola di amido o di
destrina, formando solo glucosio. Per una conversione
completa dell’amido in glucosio, all’azione dell’amilo-
glucosidasi si deve aggiungere l’azione dell’amilasi.
L’introduzione all’esercitazione per gli studenti include
una descrizione del processo di fabbricazione della birra,
che coinvolge l’azione dell’amilasi. Dopo che la sorgente
di amido è stata trattata con amilasi (proveniente sia da
malto d’orzo sia da una sorgente industriale), ci sono ancora destrine nella soluzione. Il lievito non può fermentare le destrine. Quando viene aggiunto, il lievito fermenta
il maltosio rilasciato dall’amilasi e lascia le destrine nella
birra. Sebbene il lievito non possa digerire le destrine, noi
possiamo. Per il consumatore le destrine significano calorie aggiuntive. Per produrre una birra con una quantità
minore di calorie, “light”, i produttori usano l’amiloglucosidasi per convertire gli avanzi di destrina in glucosio.
Il lievito successivamente fermenta gli zuccheri, lasciando una minore quantità di calorie nella bevanda.
L’esercitazione mette in evidenza anche che gli esseri
umani hanno un’amilasi salivare e un’amilasi pancreatica, che sono codificate da geni diversi sebbene simili. Il
gene dell’amilasi della saliva ha un elemento nel suo promotore che permette la sua espressione nelle ghiandole
salivari. Molti animali che mangiano amido, come i cani,
non secernono amilasi nella saliva. Sebbene i cani mangino sicuramente amido, la loro saliva non rivela l’attività dell’amilasi. Analizzando tessuti canini, i ricercatori
hanno trovato l’RNA messaggero per l’amilasi nel pancreas, ma non nelle ghiandole salivari, a dimostrazione
del fatto che nel cane l’amilasi non vi è espressa.
In questa esercitazione, agli studenti sarà chiesto di esaminare la saliva di cane per la presenza di amilasi. Considerando la dieta tipica di un cane, gli studenti dovrebbero pensare che i cani producano l’amilasi. Gli studenti dovrebbero restare perplessi per il risultato negativo.
Se li fate riflettere sui geni umani dell’amilasi, potrebbero giungere all’ipotesi che i cani producono l’amilasi altrove nel loro corpo (ad esempio nel pancreas), ma non
la secernono nella saliva. Assicuratevi che prendano nota di questa ipotesi. Nell’ultimo capitolo di questa sezione, gli studenti impareranno ad usare le risorse bioinformatiche disponibili in Internet, che includono i programmi per eseguire ricerche nella letteratura biomedica recente. Se gli studenti cercheranno nella letteratura
“alpha amylase in dog tissue” (amilasi alfa nei tessuti di
F. Bioinformatica e analisi evolutiva delle proteine
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cane), troveranno l’articolo citato sopra. I risultati della
ricerca forniranno loro la citazione: dovranno fare “click”
e seguire il collegamento per ottenere un riassunto dell’articolo (notate che il tessuto parotideo è il tessuto della ghiandola salivare).
Obiettivi
Dopo aver completato questa esercitazione, gli studenti
saranno in grado di:
•
•
•
Esaminare molte sostanze per la presenza di amilasi.
Descrivere l’azione dell’amilasi.
Elencare diversi organismi che esprimono amilasi.
•
•
•
Parte 1: analisi della saliva umana per l’attività
dell’amilasi
•
•
Una piastra di amido-agar (fate riferimento al sito
e-cathedra, cartella In laboratorio, per la ricetta; potete utilizzare sia piastre di amido-agar nutriente sia
piastre di destrosio di patata-agar.)
Due bastoncini cotonati (non è necessario che siano
sterili)
Soluzione di iodio e pipette
Soluzione industriale di amilasi (0,5 g in 500 ml di
H2O)
Ciascun gruppo di studenti avrà bisogno delle seguenti
cose:
•
Bastoncini cotonati sterili o un pacco nuovo di cotton fioc (se gli studenti maneggiano i cotton fioc attentamente, il tampone sarà probabilmente privo di
microrganismi)
Raccomandiamo che gli studenti lavorino a coppie o in
piccoli gruppi in questa parte dell’esercitazione. Gli studenti esamineranno i materiali elencati durante la lezione ma potranno anche identificare e portare materiali aggiuntivi da esaminare o portare con sé le piastre per analizzare materiali presenti in casa (come ad esempio la saliva di cane).
•
Raccomandiamo che gli studenti lavorino a coppie o in
piccoli gruppi per questa parte dell’esercitazione. Il giorno in cui verranno piastrati i campioni di terreno, dovrete avere abbastanza terreno affinché ciascun gruppo
di studenti possa disporre di 1 g.
•
•
•
•
•
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Parte 3: analisi di materiale supplementare per
l’attività dell’amilasi
Materiali
Parte 2: analisi di organismi del terreno per
l’attività dell’amilasi
•
•
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Ciascun gruppo di studenti avrà bisogno di:
Ogni studente dovrebbe eseguire il test dell’amilasi. Ciascuno studente avrà bisogno di:
•
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Cinque piastre di amido-agar nutriente o amido-brodo di Luria o destrosio di patata-agar (PDA)
Un contenitore pulito da almeno 200 ml
Quattro provette da 15 ml pulite
Cinque pipette da 1 ml pulite
1 g di terra
Acqua, preferibilmente distillata, reperita in commercio, o acqua potabile
Soluzione di iodio e pipette, il giorno in cui si sviluppano le piastre
•
•
•
•
•
Un fagiolo borlotto o un altro fagiolo secco immerso
in acqua per tutta la notte
Foglie e radici di una pianta in crescita
Mortaio e pestello (o un frullatore) per tritare le radici e le foglie
Piastre di amido-agar
Lievito di birra
Una piccola quantità di zucchero per attivare il lievito
Tamponi di cotone (non è necessario che siano sterili)
Soluzione di iodio e pipette
Gli studenti possono portare del materiale aggiuntivo per
esaminarlo. Qui di seguito riportiamo alcuni spunti possibili.
•
•
•
•
Yogurt con fermenti lattici vivi
Steli di piante
Drosophila melanogaster (congelate diversi moscerini della frutta e sminuzzateli in un po’ d’acqua; analizzate l’estratto)
Saliva proveniente da erbivori e da carnivori
Fonti del materiale
La “Carolina Biological Supply Co.” vende un kit per
un’esercitazione chiamata “Caught by a Kiss” che contiene il materiale necessario per questa esercitazione:
agar con amido pronto da sciogliere e versare, piastre
di Petri, e la soluzione di iodio-ioduro di potassio. Il numero di catalogo del kit è 21-2017. Potete anche comprare delle piastre già pronte di amido-agar nutriente
(numero di catalogo 82-1996). La ditta vende anche amilasi industriale (numero di catalogo 20-2350) e la soluzione di iodio-ioduro di potassio (numero di catalogo
86-9051).
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31 L’amilasi, un enzima conservato durante l’evoluzione
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Preparazione
Parte 1: analisi della saliva umana per l’attività
dell’amilasi
Preparate le piastre di amido (consultate il sito e-cathedra, cartella In laboratorio, per la ricetta). Non è necessario che queste piastre siano sterili, sebbene dovreste
usare strumenti puliti. Le piastre di Petri monouso sono
dei contenitori adatti, ma piatti fondi (per esperimenti
multipli), contenitori per la conservazione del cibo, o altri contenitori possono andare bene, se gli studenti mettono in comune delle grandi piastre per l’esperimento.
Potete conservare le piastre con l’agar solidificato a temperatura ambiente per un giorno o due; per periodi più
lunghi, conservatele in frigorifero: preparate una quantità di piastre sufficienti anche per la Parte 3.
Preparate o comprate la soluzione di iodio (consultate il
sito e-cathedra, cartella In laboratorio, per la ricetta). Se
utilizzate la soluzione di iodio della Carolina Biological
Supply, diluitela 1:40 con acqua (per esempio, 5 ml di
soluzione in 195 ml di acqua). La soluzione concentrata
colora in modo eccessivo le piastre. Distribuite una parte della soluzione di iodio in diversi contenitori in modo che gli studenti possano accedervi facilmente.
Preparate dei contenitori di candeggina al 10-20% dove
buttare i tamponi usati.
Parte 2: piastratura degli organismi del suolo
per analizzare l’attività dell’amilasi
Preparate delle piastre di amido-agar nutriente (consultate il sito e-cathedra, cartella In laboratorio, per la ricetta). Queste piastre devono essere sterili. Le piastre
possono essere preparate molti giorni prima dell’esercitazione di laboratorio. Conservatele a temperatura ambiente per 2 o 3 giorni per far evaporare l’umidità in eccesso e quindi mettetele in frigorifero in buste di plastica. Le buste di plastica in cui sono confezionate le piastre di Petri possono essere ottime buste di stoccaggio e
possono essere chiuse con del nastro adesivo o con un
laccio. Le piastre di amido-agar nutriente possono essere usate fino a quando non seccano o non si contaminano.
Parte 3: analisi di altri materiali per l’attività
dell’amilasi
Preparate le piastre di amido e la soluzione di iodio come avete fatto nella Parte 1 di questa esercitazione. Fate in modo che ciascun gruppo di studenti abbia almeno 6 piastre.
Immergete i fagioli secchi in acqua per una notte prima
dell’esercitazione. Fate una lista dei campioni che gli studenti porteranno per analizzare l’attività dell’amilasi, in-
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sieme a tutti gli strumenti e i materiali che serviranno per
esaminare i loro campioni. Per esempio potrebbero aver
bisogno di una provetta da microcentrifuga e di un pestello per tubi da microcentrifuga per triturare i campioni di Drosophila congelati.
Suggerimenti
Le piastre di amido-agar nutriente usate per far crescere
gli organismi del suolo devono essere sterili in modo che
non possa crescervi nessun contaminante. Se potete disporre di acqua sterile, pipette sterili e provette sterili,
piastrate il terreno in modo asettico.
In base alla nostra esperienza, l’acqua in bottiglia o distillata commerciale è fondamentalmente sterile. Abbiamo eseguito questa esercitazione con l’acqua del rubinetto e abbiamo visto che anche in questo caso non si
hanno contaminazioni significative. Una piastra di controllo con l’aggiunta della sola acqua vi permetterà di capire se l’acqua o gli strumenti (tamponi o provette) stanno introducendo una contaminazione significativa nell’esperimento.
Procedimento
Assicuratevi che gli studenti leggano l’introduzione all’esercitazione. Se lo desiderate, potete fare un collegamento tra l’esercitazione di oggi e quanto hanno studiato precedentemente sul sistema digerente.
Parte 1: analisi della saliva umana per l’attività
dell’amilasi
Tutti gli studenti dovrebbero esaminare la propria saliva
e un’amilasi industriale di controllo.
Parte 2: piastratura degli organismi del suolo
per analizzare l’attività dell’amilasi
Dividete gli studenti a coppie o in piccoli gruppi. Fate
seguire loro la procedura descritta nell’Esercitazione. Incubate le piastre capovolte per 2-4 giorni, a temperatura ambiente. Gli studenti vedranno che la maggior parte delle colonie sulle piastre secerne amilasi. I risultati
sono più chiari sulle piastre che hanno colonie ben separate le une dalle altre.
Alla fine dell’esperimento, immergete le piastre per una
notte in candeggina al 10-20%, dopo averle sciacquate
gettatele nella spazzatura.
Parte 3: analisi di altri materiali per l’attività
dell’amilasi
Dividete gli studenti a coppie o in piccoli gruppi. Per prima cosa dovrebbero scambiarsi idee sul materiale ag-
F. Bioinformatica e analisi evolutiva delle proteine
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giuntivo da analizzare per valutare l’attività dell’amilasi.
Infine, potrebbero fare una lista di materiali e strumenti
di cui potrebbero aver bisogno per preparare i campioni per l’analisi (come ad esempio un mortaio e un pestello o provette da microcentrifuga e micropestelli). Valutate ciò che è disponibile in laboratorio. Alcuni studenti
potrebbero portare a casa alcune piastre di amido e della soluzione di iodio per esaminare la saliva animale.
Ricordate agli studenti di utilizzare il Foglio di lavoro 31.1
(e altre pagine se ne avessero bisogno) per fare previsioni riguardo alla presenza di amilasi nei campioni che stanno esaminando e per motivare la loro previsione in base
alla dieta, alla fisiologia, o all’ambiente dell’organismo dal
quale provengono i materiali. Le previsioni sono un buon
argomento per le discussioni sia a piccoli gruppi, sia di
classe e possono fornire il punto di partenza per ripassare la biologia di base o per esaminare l’ecologia di un organismo (come ad esempio gli organismi del suolo).
Il giorno successivo, gli studenti dovranno portare i materiali. Controllate che abbiano scritto le loro previsioni
e che le abbiano motivate. Preparate le attrezzature ne-
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cessarie insieme con le piastre di amido, i tamponi, e la
soluzione di iodio. Gli studenti dovrebbero essere in grado di svolgere gli esperimenti in maniera indipendente,
fare una tabella dei risultati e discuterli in classe.
!Risposte alle domande per gli studenti
Non c’è una risposta precisa per questa domanda,
poiché un’ampia varietà di organismi la secerne. Gli
studenti potrebbero guardare le piastre con un numero sufficiente di colonie isolate e contare quante
di queste secernono amilasi. Nei nostri campioni, la
maggior parte delle colonie la secerne.
2. Gli organismi del suolo sono decompositori. I tessuti delle piante morte contengono spesso amido, perciò è logico che questi organismi possano digerirlo.
L’amido per loro è una ricca fonte di energia, dato
che viene scisso per formare glucosio.
3. I fagioli contengono amido che fornisce l’energia per
la germinazione. La pianta in germinazione non può
svolgere subito la fotosintesi (non ha foglie; di solito
si trova sotto il terreno) e quindi per il suo nutrimento
dipende dal materiale immagazzinato nel seme.
1.
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Elettroforesi delle proteine
Descrizione dell’esercitazione
! p. 317
In questa esercitazione, gli studenti eseguiranno un’elettroforesi su gel di agarosio con campioni di amilasi. Nei
gel di agarosio sarà incorporato amido così gli studenti
potranno identificare le bande delle amilasi dall’attività
dell’enzima.
Lezioni richieste: la preparazione del gel può essere
fatta in anticipo. La preparazione del campione richiede
15 min, seguiti da 45-60 min per l’elettroforesi. Quando
l’elettroforesi sarà completata, metà del gel verrà colorato per 1 min, mentre l’altra metà sarà immersa in acqua
per 15 min-2 ore per rimuovere il sodio dodecil solfato
(SDS). Entrambe le metà del gel saranno poi incubate
per una notte per la decolorazione e la rivelazione dell’attività dell’amilasi.
Introduzione
Lo scopo di questa esercitazione consiste nel separare le
proteine dei campioni contenenti le amilasi mediante
elettroforesi, in modo che gli studenti possano vedere le
bande di diverse proteine e identificare le bande delle
amilasi grazie alla loro capacità di idrolizzare l’amido.
L’elettroforesi delle proteine è diversa dall’elettroforesi
del DNA per alcuni importanti aspetti. Per prima cosa, il
DNA ha uno scheletro uniformemente carico, perciò, tutte le molecole di DNA migrano nella stessa direzione in
un gel da elettroforesi. Le proteine invece possono essere prive di carica, cariche positivamente, o cariche negativamente. Una miscela di proteine applicate ad un gel
da elettroforesi probabilmente conterrà proteine di ciascun tipo. Un altro motivo riguarda il fatto che le proteine possono acquisire diverse forme, perciò due proteine con lo stesso peso molecolare e la stessa carica possono migrare in modo diverso in un gel.
Per fare in modo che migrino più uniformemente, le proteine sono spesso trattate con il detergente SDS. L’SDS è
un forte detergente anionico che ricopre le proteine con
un rivestimento di cariche negative. Inoltre, l’SDS denatura le proteine, facendo loro assumere una forma più
uniforme (anche se non perfettamente). Il tampone di
caricamento con SDS di solito contiene un forte agente
riducente, come il !-mercaptoetanolo, per spezzare i legami disolfuro e per denaturare le proteine. In un campo elettrico, le proteine nel tampone con SDS migrano
verso l’elettrodo positivo, e le distanze alle quali migrano sono in buona misura proporzionali ai loro pesi molecolari.
L’SDS è molto utile per l’elettroforesi ma è dannoso per
la funzione delle proteine, inclusa quella delle amilasi.
Dato che lo scopo di questa esercitazione consiste sia nel
separare le proteine a partire da campioni contenenti
amilasi, sia nel rivelare l’amilasi grazie alla sua attività,
l’SDS deve essere rimosso dopo l’elettroforesi. Per fare
ciò, i gel sono immersi in una soluzione di Triton X-100,
un leggero detergente non ionico. Il Triton X-100 si sostituisce all’SDS, permettendo all’amilasi di riprendere
una conformazione più normale. Il Triton X-100 è poi
sostituito dall’acqua immergendo il gel per tutta la notte, cosa che permette all’amilasi di recuperare una maggiore attività. In questa esercitazione, inoltre, i campioni
sono caricati in un tampone senza !-mercaptoetanolo
per mantenere i legami disolfuro.
Normalmente, i campioni vengono bolliti prima dell’elettroforesi su gel di SDS per denaturare ulteriormente le
proteine. In questo caso, la bollitura riduce notevolmente
la quantità di attività dell’amilasi che può essere recuperata in seguito all’elettroforesi. Abbiamo eliminato in questo protocollo la bollitura nella fase di preparazione dei
campioni.
In questa esercitazione, i gel sono stati allestiti con un agarosio a pori piccoli, che aumenta la risoluzione delle bande delle proteine. Al gel è aggiunto l’amido. Dopo l’elettroforesi, il gel viene tagliato a metà. Una metà del gel viene colorata per visualizzare le bande delle proteine, mentre l’altra metà è immersa prima in Triton X-100 e poi in
acqua per ripristinare l’attività dell’amilasi. Dopo che l’attività dell’amilasi si è ricostituita, l’enzima degraderà l’amido circostante, creando un’area chiara nel gel. Gli studenti confronteranno la metà colorata del gel con la metà che mostra l’attività dell’amilasi. Le aree chiare identificheranno le bande della proteina amilasi.
Uno dei campioni di amilasi che verrà separato è costituito da saliva umana. L’amilasi è il principale com-
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32 Elettroforesi delle proteine
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ponente proteico della saliva. La saliva umana corre su
gel in modo più netto se prima viene riscaldata. Infatti, la saliva forma uno schema di bandeggio leggermente differente se prima dell’elettroforesi viene riscaldata a 70 °C per 2-3 min. Gli studenti potrebbero
essere interessati a far correre sullo stesso gel un campione di saliva riscaldato e uno non riscaldato. Nella
maggior parte dei casi, la saliva scaldata mostrerà un’attività dell’amilasi notevolmente ridotta. Questo risultato potrebbe indurre una discussione sulle condizioni ottimali per l’enzima, sulla denaturazione irreversibile al
calore e sulla mobilità elettroforetica. Nel caso dell’amilasi, probabilmente il riscaldamento produce alcuni
cambiamenti conformazionali irreversibili che influenzano la mobilità elettroforetica.
Nel Capitolo 34, gli studenti impareranno ad usare le risorse bioinformatiche presenti in Internet. La proteina
usata come esempio in quel capitolo è l’amilasi pancreatica. Dopo che avranno imparato ad usare le banche
dati, gli studenti potranno cercare l’amilasi della saliva.
La struttura tridimensionale dell’amilasi della saliva umana è stata determinata, e un’immagine tridimensionale è
disponibile nella banca dati delle strutture proteiche (vedi il Capitolo 34 per ulteriori informazioni).
Obiettivi
•
•
•
•
•
•
Spiegare perché il detergente SDS è spesso aggiunto
ai campioni proteici prima dell’elettroforesi.
Spiegare come si identificano le bande dell’amilasi in
un gel di proteine.
Definire la denaturazione delle proteine.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
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•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
1,5 g di agarosio (a pori piccoli) per gel di proteine
per ogni studente
Tampone di corsa con basso contenuto di SDS
Amido
0,5 g di amilasi di fungo purificata
Colorante di Coomassie per proteine
Soluzione decolorante per il Coomassie
Soluzione al 5% di Triton X-100
Colorante per il caricamento a basso contenuto di
SDS
Apparecchiatura per l’elettroforesi
Micropipette e puntali per misurare volumi inferiori
ai 100 µl, o strumenti equivalenti
Pipette da 1 ml
Gel, tampone di corsa, contenitore per gel
Alcune provette da microcentrifuga per la preparazione dei campioni
Pestelli per provette da microcentrifuga per macinare i fagioli o un piccolo mortaio con un pestello
Uno strumento per misurare volumi piccoli
Pipette da 1 ml
Soluzione di amilasi di fungo
Due vassoietti per pesare
Circa 50 ml di Triton X-100 al 5% (possono essere
presi da un unico contenitore da condividere in classe)
Circa 50 ml di colorante Coomassie per proteine (possono essere presi da un unico contenitore da condividere in classe)
Circa 100 ml di soluzione decolorante per il Coomassie (possono essere presi da un unico contenitore da condividere in classe)
Un righello sottile di plastica o altro strumento per tagliare il gel a metà
Fonti dei materiali
La Carolina Biological Supply Co. vende le seguenti soluzioni:
•
•
Materiali
•
Due vassoietti per pesare per ciascun gruppo
Provette da microcentrifuga
Fagioli secchi, immersi in acqua per una notte (facoltativo)
Bagno a 70 °C
Ciascun gruppo di studenti avrà bisogno della seguente
attrezzatura:
Alla fine di questa esercitazione, gli studenti saranno in
grado di:
•
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•
•
•
•
•
Agarosio per gel di proteine (N° di catalogo 21-7088)
Tampone di corsa a basso contenuto di SDS (N° di
catalogo 21-1287; la “Carolina” lo chiama “Enzyme
Running Buffer”)
Colorante per il caricamento a basso contenuto di
SDS (N° di catalogo 21-1288; la “Carolina” lo chiama
“Non-Reducing Protein Loading Dye”)
Amilasi di fungo purificata (N° di catalogo 20-2350)
Colorante Coomassie per proteine (N° di catalogo 219784)
Decolorante per il Coomassie (N° di catalogo 219785)
Triton X-100 (acquistabile dalla Sigma Chemical Co.)
L’Amylase Electophoresis kit della Carolina (N. di catalogo 21-1280) contiene tutti i materiali (compreso l’agarosio pronto da sciogliere e versare per i gel di proteine) in quantità sufficiente per preparare 6 gel per gli studenti.
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Preparazione
I gel di amido e agarosio a piccoli pori devono essere
preparati esattamente come è descritto. Vi suggeriamo di
prepararli il giorno prima dell’esercitazione.
1 . Mescolate, per ciascun gel da colare, 1,5 g di agarosio con 40 ml di acqua in una piccola beuta.
2. Mescolate 0,25 g di amido in 10 ml di un tampone di
corsa Tris-glicina 5" a basso contenuto di SDS. Aggiungete la soluzione di amido alla beuta contenente la soluzione di agarosio disciolta e mescolatela bene facendola girare vorticosamente. L’amido deve essere risospeso uniformemente nel liquido prima di
essere aggiunto alla soluzione di agarosio. Non mettete semplicemente la polvere di amido e di agarosio
in una beuta aggiungendo poi il liquido; si formeranno dei grumi che non si scioglieranno più.
3. Dopo che le due soluzioni sono state mescolate accuratamente, mettete la beuta in un bagno con acqua
bollente per scaldare e sciogliere l’agarosio e l’amido, approssimativamente per 15 min per un campione da 50 ml. La miscela diventerà limpida e si formeranno numerose piccole bolle. Le bolle impediscono di vedere la soluzione perfettamente trasparente. Tenete la beuta nel bagno di acqua bollente il
più possibile per evitare una gelificazione prematura. Per ragioni di tempo, questo passaggio può essere eseguito prima della lezione.
4. Togliete la beuta dal bagno e versate immediatamente
il suo contenuto nel vassoio apposito. Aggiungete il
pettine. Cercate di rimuovere tutte le bolle d’aria grandi sia nella zona del pettine sia nel gel con la punta
di una pipetta, una matita o qualsiasi altro oggetto
appuntito. Non preoccupatevi delle bolle piccole. Fatelo velocemente per togliere le bolle prima che il gel
si sia solidificato.
5. Lasciate solidificare il gel. Non dovrebbe essere tiepido al tatto. Rimuovete il pettine e mettete il gel nella
camera da elettroforesi. Aggiungete alla camera elettroforetica il tampone di corsa Tris-glicina 1" a basso
contenuto di SDS fino a ricoprire il gel. Non conservate i gel nel tampone per tutta la notte, ma copriteli
con una pellicola di plastica per evitare che secchino.
Se avete programmato di usare i fagioli, immergeteli in
acqua per una notte.
Preparate 500 ml di una soluzione al 5% di Triton X-100
mescolando 25 ml di Triton X-100 con 475 ml di acqua
distillata o deionizzata.
Procedimento
Prima che gli studenti inizino l’esercitazione, chiedete
loro di dirvi quali differenze tra il DNA e le proteine po-
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trebbero influenzare il loro comportamento durante l’elettroforesi. Potreste avere bisogno di fare un ripasso
dell’elettroforesi e di come essa agisce sul DNA, chiedendo agli studenti anche queste cose. Le domande
possono essere un’opportunità per ripassare la struttura primaria e secondaria delle proteine. Il tipo di amminoacidi che costituiscono la proteina ne determina la
carica ad ogni dato pH. La struttura terziaria (forma) influenza la velocità di migrazione delle proteine attraverso il gel. Alla fine della discussione, gli studenti dovrebbero rendersi conto o ricordare che le proteine possono avere cariche e forme diverse e che queste caratteristiche influenzano il comportamento delle proteine
durante l’elettroforesi. Questa informazione è fornita
nell’introduzione per gli studenti, ma gli studenti trarranno un vantaggio maggiore da una discussione in
classe.
Dopo l’introduzione, gli studenti dovrebbero preparare
i campioni di saliva e di fagiolo. Un gruppo può preparare l’amilasi di fungo, oppure potete prepararla voi prima della lezione. Prima di iniziare, spiegate agli studenti che potranno aver bisogno di una diluizione maggiore di 1:2 dei campioni di saliva e dovranno decidere loro la diluizione in base al comportamento dei singoli
campioni.
Dopo aver preparato i campioni, gli studenti dovranno
seguire il protocollo per l’elettroforesi. Finita l’elettroforesi, dovranno colorare come descritto metà del gel per
1 min e poi eliminare il colorante e aggiungere la soluzione decolorante. Dopo che il gel si è decolorato per un
certo tempo, è meglio eliminare la soluzione decolorante
e aggiungere della soluzione fresca. Se la lezione si svolge durante la mattina, un buon momento per cambiare la
soluzione potrebbe essere alla fine della giornata. Se la lezione si svolge nel tardo pomeriggio, la soluzione può essere cambiata come prima cosa il mattino seguente.
L’altra metà dei gel deve essere immersa in Triton X-100
al 5% per un periodo di tempo variabile da 15 min a 2
ore. Dopo questo periodo di immersione, possono
comparire leggere bande chiarificate. Eliminate il Triton
X-100, e sostituitelo con l’acqua. Tenete immersi i gel per
una notte. Se è possibile, controllate i gel durante l’immersione. L’amido diffonde fuori dal gel dopo un’immersione prolungata, lasciando il gel completamente trasparente. Quando ciò accade, l’attività dell’amilasi non
sarà più visibile.
Quando gli studenti esamineranno i loro gel per cercare
le zone chiarificate, dovranno inclinare i gel rispetto alla luce per vederle bene. Le zone chiarificate attorno ai
campioni di amilasi di fungo e di saliva umana saranno
ben evidenti.
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32 Elettroforesi delle proteine
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!Risposte alle domande per gli studenti
1. L’altro tipo di legame è il legame disolfuro che si forma tra due residui di cisteina.
1. No. Un esempio è un albume d’uovo cotto.
3. L’amilasi di ciascun campione è leggermente diversa. Quella particolare amilasi potrebbe non essersi rinaturata
correttamente dopo essere stata immersa in Triton X-100.
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Analisi dei cambiamenti evolutivi
Descrizione dell’esercitazione
! p. 320
Durante questa esercitazione, gli studenti calcoleranno
le differenze nelle sequenze amminoacidiche dell’amilasi di sette diversi organismi e useranno i dati per costruire
un semplice albero evolutivo. Nel prossimo capitolo, useranno le risorse bioinformatiche in Internet per identificare gli organismi dai quali provengono queste sequenze ed effettueranno ulteriori confronti.
Lezioni richieste: 1 o 2 (la costruzione dell’albero può
essere assegnata come compito a casa).
Introduzione
In biologia l’evoluzione è un argomento unificante. Nei
libri di testo classici di biologia, l’evoluzione è trattata a
livello degli organismi. Spesso gli studenti studiano l’evoluzione di piante e animali da progenitori unicellulari, con una discussione dell’adattamento e delle nicchie
ambientali.
Questa lezione prende in esame l’evoluzione della proteina amilasi a livello molecolare. Gli studenti hanno imparato nel Capitolo 4 (Una breve panoramica sulla biologia molecolar e) che il fenotipo di un organismo dipende dalle sue proteine e dallo schema spaziotemporale della loro espressione; perciò, l’evoluzione del fenotipo deve essere il risultato di cambiamenti a livello
proteico. Questa esercitazione permette di stabilire una
connessione tra diversi eventi molecolari: mutazioni,
cambiamenti della struttura o dell’espressione delle proteine, e macroevoluzione.
Macroevoluzione ed evoluzione
delle proteine
Le proteine di organismi strettamente correlati sono molto più simili le une alle altre delle proteine di organismi
correlati meno strettamente. Allo stesso modo, il DNA di
organismi affini è più simile rispetto al DNA di organismi meno affini. Di fatto, data la piccola percentuale di
differenze nel DNA di specie molto vicine, come gli uomini e gli scimpanzé, è logico chiedersi come le due specie possano sembrare ed essere così differenti.
Una teoria che spiega come piccoli cambiamenti a livello
genetico possano tradursi in grandi cambiamenti morfologici afferma che alcune mutazioni abbiano un effetto profondo sullo sviluppo di un organismo. Fate riferimento al
Capitolo 4 dove abbiamo spiegato che l’organizzazione
delle proteine durante lo sviluppo è un fattore che determina il piano corporeo e che alcune proteine regolano
questa organizzazione. Una mutazione in una di queste
proteine può portare a grandi cambiamenti morfologici.
Un sequenziamento preliminare del genoma dello scimpanzé è stato pubblicato nel 2005 (“Chimpanzee Sequencing and Analysis Consortium”, Nature 437:69-87),
e gli autori di questo studio hanno fatto un confronto tra
i genomi dello scimpanzé e dell’uomo. Le sequenze codificanti proteine dello scimpanzé e dell’uomo sono molto simili: il 29% delle proteine sono identiche, e molte
delle proteine diverse differiscono solo per 1 o 2 amminoacidi. I ricercatori hanno trovato 202 elementi genomici molto conservati nei vertebrati, ma diversi tra gli
scimpanzé e gli uomini. Questi elementi si trovano soprattutto nel DNA non codificante, di solito vicino a geni associati alla trascrizione o al legame al DNA, il che
suggerisce che siano coinvolti nella regolazione dell’espressione genica.
Variazioni caratteristiche associate alla speciazione riguardano i tempi in cui viene raggiunta la maturità del
corpo e la riproduzione. Un esempio classico di questo
tipo di cambiamento è lo sviluppo dell’axolotl messicano, Ambystoma mexicanum. L’axolotl è una salamandra
acquatica. La maggior parte delle salamandre ha uno stadio larvale acquatico, durante il quale l’organismo ha le
branchie invece dei polmoni. La larva subisce una metamorfosi trasformandosi nella forma terrestre adulta che
ha i polmoni invece delle branchie e che è in grado di
riprodursi. L’axolotl invece non abbandona mai lo stadio
acquatico e mantiene le branchie. Si riproduce ad uno
stadio che per le altre salamandre sarebbe giovanile, ma
raggiunge le stesse dimensioni del corpo del suo corrispettivo terrestre. Questo cambiamento nello stadio riproduttivo e la relativa alterazione nell’espressione genica sono chiamati neotenia.
L’axolotl può essere indotto a svilupparsi nella forma terrestre con i polmoni grazie all’iniezione di un estratto di
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33 Analisi dei cambiamenti evolutivi
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tiroide. L’axolotl quindi ha mantenuto tutti i geni necessari per diventare un organismo terrestre, inclusi quelli
per i recettori dell’ormone tiroideo. Un’alterazione della
sua capacità di produrre gli ormoni tiroidei può essere
responsabile della neotenia e di conseguenza di molte
differenze morfologiche tra questo animale e le salamandre terrestri.
In tempi recenti, sono stati pubblicati diversi studi sulla
metamorfosi dell’axolotl. La maggior parte degli studi sono stati eseguiti da Randall Voss e dai suoi colleghi all’Università del Kentucky, che hanno pubblicato una
mappa di associazione genetica di Ambystoma nel 2005.
Nello stesso anno essi hanno pubblicato anche uno studio in cui hanno identificato un marcatore molecolare
associato alla neotenia nel 99% dei casi esaminati. Questi ricercatori hanno eseguito incroci accurati di specie
di Ambystoma neoteniche e non neoteniche e hanno
confrontato la presenza del marcatore genetico con quella del fenotipo neotenico. Hanno trovato una forte correlazione tra il marcatore e il fenotipo quando il genitore neotenico utilizzato per gli incroci genetici era un ceppo di axolotl di laboratorio. C’era un’associazione meno
forte quando il genitore neotenico era un axolotl selvatico. Questo studio è analogo all’esercitazione del Capitolo 29, nella quale gli studenti utilizzano dati molecolari e fenotipici per determinare se un ipotetico marcatore
rappresentato da una breve ripetizione in tandem è associato con un carattere.
Nel 2006, gli stessi autori hanno pubblicato i risultati di
studi di microarray effettuati per identificare i geni che
sono coinvolti nella metamorfosi della forma terrestre. I
ricercatori hanno isolato gli RNA messaggeri (mRNA) dall’epidermide di A. mexicanum prima del trattamento con
l’ormone tiroideo e a tempi diversi dopo il trattamento
con l’ormone tiroideo. Essi hanno utilizzato l’mRNA per
produrre il DNA complementare (cDNA) marcato e sondare un microarray di A. mexicanum e hanno scoperto
che, due giorni dopo il trattamento, solo un gene dell’array mostrava elevati livelli di trascrizione. Tuttavia dopo 12 e 28 giorni, centinaia di geni avevano livelli di trascrizione diversi, alcuni più alti e altri più bassi. In particolare, diversi geni della cheratina mostravano grandi
differenze di trascrizione (fino a 1000 volte). I cambiamenti di espressione dei geni della cheratina coincidevano con il rimodellamento dei tessuti epiteliali durante
il processo della metamorfosi.
L’accumularsi di sequenze genomiche ha permesso ai
ricercatori di seguire più facilmente i cambiamenti evolutivi. Tornate a leggere il Capitolo 27 per avere maggiori informazioni sul confronto dei genomi e sull’evoluzione dei cani, raccolte grazie a studi di genomica
comparativa.
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Selezione naturale e proteine
L’evoluzione richiede una variazione genetica, come mutazioni o riarrangiamenti cromosomici (ad esempio duplicazioni, inversioni, e rotture e riunioni), e la fissazione del nuovo genotipo nella popolazione. Secondo la
teoria evolutiva standard, i cambiamenti genetici che inducono un vantaggio per la sopravvivenza o per la riproduzione si fisseranno. Anche i cambiamenti genetici
che non hanno alcun effetto positivo o negativo sulla sopravvivenza o sulla riproduzione possono, per caso, fissarsi. Non possiamo tuttavia assumere che ogni cambiamento evolutivo in una proteina che si fissa in una popolazione sia positivo o neutro, perché l’organismo che
possiede il gene interagisce con un ambiente complesso. Se in un organismo avviene un cambiamento leggermente dannoso in una proteina che per un diverso motivo produce un vantaggio per la sopravvivenza, quel
cambiamento dannoso potrebbe essere fissato. L’unico
caso chiaro si ha quando un cambiamento in una proteina, qualunque sia, rende difficile o impossibile la sopravvivenza dell’organismo. Questo cambiamento sarà
eliminato dalla selezione naturale.
La digestione dell’amido è un mezzo importante per ottenere energia in molti organismi, perciò si pensa che ci
sia un vantaggio effettivo nella sopravvivenza di chi è in
grado di attuarla. Possiamo perciò supporre che ci sia
una pressione evolutiva per conservare questa funzione
dell’amilasi. Se consideriamo i cambiamenti di una proteina e la contemporanea conservazione della sua funzione, sembra ovvio che ci possono essere delle regioni
della proteina, come il sito di legame per l’amido, nelle
quali i cambiamenti hanno una maggior probabilità di
disturbare la funzione rispetto ai cambiamenti in altre regioni. Non è che queste regioni sensibili non possano
mai mutare, ma la maggior parte delle mutazioni è probabilmente dannosa.
Basandosi su questo tipo di logica, i ricercatori confrontano le sequenze delle proteine di organismi diversi e
cercano le regioni in cui le sequenze sono maggiormente
conservate fra gli organismi. Si ritiene che queste regioni conservate siano importanti per la struttura e la funzione della proteina. Gli studenti osserveranno regioni
conservate quando confronteranno le sequenze dell’amilasi. Le sequenze proteiche conservate sono a sostegno anche dell’ipotesi che le diverse proteine derivino
da una forma ancestrale.
L’esercitazione
Gli studenti dispongono delle sequenze del gene dell’amilasi di tre mammiferi (uomo, maiale e topo), di due insetti (Drosophila melanogaster e Drosophila orena), di un
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uccello (pollo), e di un gambero. Essi non sanno da dove derivano le sequenze, e per l’esercitazione è importante che non lo sappiano. Nell’esercitazione successiva
(Capitolo 34), dovranno eseguire una ricerca in Internet
nelle banche dati di proteine, per identificare gli organismi e valutare l’albero evolutivo che hanno costruito.
Un albero evolutivo è essenzialmente un’ipotesi di come
può essere avvenuta l’evoluzione. Ci sono molti metodi
per formulare queste ipotesi partendo dai dati molecolari, ciascuno dei quali richiede che si facciano alcune
ipotesi sull’evoluzione. Alcuni metodi si differenziano
fondamentalmente nelle loro premesse e perciò differiscono significativamente nel modo in cui sono analizzati i dati. La maggior parte dei ricercatori usa metodi diversi che di solito conducono alla stessa ipotesi.
L’argomento chiave di questa esercitazione non è il metodo con il quale si costruisce un albero evolutivo, ma piuttosto l’idea dell’evoluzione delle proteine. Per mantenere
gli studenti concentrati sul concetto che le proteine evolvono, utilizzerete un metodo di analisi molto semplice.
Se costruito correttamente, l’albero mostrerà che i tre
mammiferi sono strettamente imparentati e che l’uccello
è più vicino a loro rispetto che agli artropodi. Le due specie di Drosophila sono molto vicine, e il gamberetto, sebbene non sia molto vicino alle due Drosophila, è più simile a loro che al ramo dei mammiferi e degli uccelli.
Dopo che gli studenti hanno identificato gli organismi su
Internet, chiedete loro se ha senso il fatto che il gamberetto sia sulla stessa linea evolutiva degli insetti invece
che su quella dei mammiferi e degli uccelli.
Obiettivi
Dopo aver finito questa esercitazione, gli studenti saranno in grado di:
•
•
Usare i dati delle sequenze proteiche per costruire un
semplice albero evolutivo.
Spiegare perché le regioni conservate di una sequenza proteica rappresentano probabilmente parti
funzionalmente importanti della proteina.
Materiali
Il Foglio di lavoro 33.1 e l’Esercitazione.
Preparazione
Gli studenti avranno bisogno di ritagliare le sequenze
dell’amilasi dal Foglio di lavoro per rendere più facile il
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confronto. Se volete evitare di danneggiare il libro degli
studenti, stampate delle copie del Foglio di lavoro 33.1
dal sito e-cathedra.
Procedimento
Se necessario, fate un ripasso del rapporto tra sequenza
di DNA e sequenza proteica, sottolineando come cambiamenti del DNA possono causare dei cambiamenti nelle proteine. Ricordate agli studenti che un gene è molto
più della sua sequenza codificante, ci sono anche il promotore, le sequenze regolatrici, eccetera. Anche i cambiamenti in queste regioni possono influenzare l’espressione della proteina. Per esempio, gli esseri umani secernono l’amilasi nella loro saliva grazie all’inserzione di
un elemento a monte del gene dell’amilasi che ne causa
l’espressione nel tessuto della ghiandola salivare. Molti
mammiferi sono privi di questa sequenza e non secernono l’amilasi nella loro saliva.
Gli studenti dovrebbero leggere il materiale introduttivo.
Presentate i due esempi dell’Esercitazione in classe. Gli
studenti, se necessario, potranno successivamente fare
riferimento alla versione scritta degli esempi.
Prima di costruire l’albero evolutivo, fate osservare agli
studenti le sette sequenze proteiche per identificare le
possibili regioni conservate. Potreste far loro evidenziare queste regioni.
Fate costruire l’albero evolutivo agli studenti, facendoli
lavorare da soli o a coppie. Possono svolgere questo
esercizio anche come compito a casa.
Risultati
Questi sono i dati che gli studenti dovrebbero ottenere:
Confronto delle sequenze
amminoacidiche per gli organismi
A con A
A con B
A con C
A con D
A con E
A con F
A con G
Numero delle differenze
0
9
18
31
33
11
32
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33 Analisi dei cambiamenti evolutivi
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Albero evolutivo
A
B
F
C
E
G
D
30
20
10
Differenze amminoacidiche
0
!Risposte alle domande per gli studenti
1.
Per rispondere a questa domanda, gli studenti devono fare riferimento al diagramma e trovare il punto
dove le due linee evolutive si separano. Nel caso di
B rispetto a C, le linee si separano nello stesso pun-
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to in cui C si separa da A, a livello di 18 amminoacidi. Negli altri due casi, le linee si separano nel punto in cui D/E/G si separano dagli altri. Le differenze
tra le sequenze dell’amilasi di D, E, o G e l’organismo
A sono rispettivamente 31, 33 e 32. Il numero di differenze previsto tra gli organismi F e D/E/G dovrebbe essere compreso in questo intervallo.
Osservate la tabella sottostante:
Coppie
di organismi
Numero di differenze
attese
Numero di differenze
trovate
18
31–33
31–33
17
31
28
B con C
C con D
C con E
Letture scelte
Culotta, E., e E. Pennisi. 2005. Evolution in action. Science
310:1878–1879. Un riassunto semplice da leggere di alcune
recenti scoperte che fanno luce sulle basi molecolari della
speciazione e del cambiamento evolutivo.
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Bioinformatica
Descrizione dell’esercitazione
! p. 324
Questa esercitazione ha lo scopo sia di introdurre gli
studenti alle risorse bioinformatiche in rete, sia di ribadire il concetto che le proteine di organismi diversi sono piuttosto simili e si sono evolute a partire da proteine ancestrali comuni. Questa esercitazione è suddivisa in tre parti, nella prima gli studenti effettueranno
ricerche in database di proteine, disponibili in rete, per
identificare gli organismi le cui sequenze dell’amilasi
sono state utilizzate per costruire gli alberi evolutivi del
Capitolo 33. La seconda parte fornirà agli studenti ulteriori informazioni dettagliate riguardanti l’amilasi pancreatica umana, li introdurrà ad altri aspetti delle banche dati proteiche, e fornirà una buona rassegna sulla
struttura delle proteine. Nella terza parte dell’esercitazione, gli studenti faranno una ricerca nella letteratura
biomedica in rete per trovare informazioni riguardanti
l’amilasi e per imparare come si eseguono le ricerche
in rete.
Il numero di sequenze proteiche nelle banche dati è aumentato notevolmente dopo la pubblicazione della precedente edizione di questo libro. Sebbene ciò rappresenti un grande aiuto per la ricerca scientifica, ha reso
questa attività più impegnativa. Innanzitutto, ora nella
banca dati ci sono molte ripetizioni di varie sequenze di
amilasi umane che producono molti risultati ripetitivi
quando si cerca la sequenza umana nella banca dati. Anche le sequenze dell’amilasi di cane e di scimpanzé, che
non erano disponibili quando è stata scritta la precedente
edizione, sono molto simili all’amilasi umana. A causa
dell’elevata somiglianza delle sequenze del segmento più
piccolo del gene dell’amilasi umana e di quelle di cane
e di scimpanzé, abbiamo cambiato le istruzioni in modo
che gli studenti cerchino la seconda porzione più lunga
della sequenza
Lezioni richieste: questa è un’esercitazione senza limiti precisi in cui gli studenti possono esaminare le banche
dati per un tempo più o meno lungo. L’identificazione
degli organismi ai quali appartengono le sequenze dell’amilasi richiederà una lezione. Le altre due esercitazioni richiederanno almeno due lezioni.
Introduzione
Il governo degli Stati Uniti finanzia una serie di banche
dati pubbliche che raccolgono dati scientifici attraverso il
National Center for Biotechnology Information (NCBI).
L’NCBI è stato istituito nel 1988 come divisione della National Library of Medicine (NLM), la quale insieme a 18
differenti istituti sanitari (come ad esempio il National Cancer Institute, il National Institute for Environmental Health
Sciences, e il National Institute on Drug Abuse) e al National Center for Complementary and Alternative Medicine, è una divisione del National Institutes of Health (NIH).
Lo stesso NIH è una sezione del Department of Health
and Human Services. I dipartimenti della salute pubblica
del Department of Health and Human Services includono l’NIH, i Centers for Desease Control and Prevention, e
la Food and Drug Administration, insieme ad altri enti.
L’NIH è una delle principali organizzazioni per la ricerca medica. I suoi programmi di finanziamento sostengono la maggior parte della ricerca biomedica svolta oggi
negli Stati Uniti, ed ha quindi contribuito con i suoi fondi a molti, se non a tutti, i risultati descritti in questo libro. I suoi stessi laboratori offrono preziosi contributi in
molte aree della ricerca.
L’NCBI è una risorsa nazionale per le informazioni di biologia molecolare: crea banche dati e software pubblici
per l’analisi dei dati genomici, conduce ricerche di biologia informatica, e diffonde informazioni biomediche.
Le banche dati di biologia molecolare e i programmi per
svolgere ricerche e analisi sono disponibili sul sito Internet dell’NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov), insieme ad altre risorse. Per esempio, una funzione chiamata “Coffee Break” contiene le sintesi delle attuali scoperte della ricerca, con un sistema di tutoraggio integrato
che mostra come usare i vari programmi di ricerca. Vi incoraggiamo vivamente a dare un’occhiata al sito. Qui limitiamo la nostra descrizione alle funzioni utili per questa esercitazione, insieme a poche altre.
Informazioni disponibili tramite NCBI
– Sequenze nucleotidiche
GenBank è il database delle sequenze genetiche dell’NIH. Contiene tutte le sequenze dei geni disponibili
165
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34 Bioinformatica
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pubblicamente. GenBank è connesso con DNA DataBank del Giappone e con l’European Molecular Biology
Laboratory (EMBL). Queste tre organizzazioni si scambiano dati quotidianamente.
– Sequenze proteiche
Le informazioni sulle sequenze proteiche dell’NIH provengono da diverse banche dati: dalle traduzioni delle
sequenze nucleotidiche della GenBank, dalla banca dati europea SWISS-PROT, che condivide i dati con l’NIH
attraverso l’EMBL e dalle strutture tridimensionali della
Brookhaven Protein Data Bank.
– La struttura proteica
Tramite il sito dell’NCBI, si può accedere alla Brookhaven Protein Data Bank, che contiene informazioni sulle
strutture tridimensionali delle proteine e immagini tridimensionali. È possibile scaricare i software per guardare e interagire con le immagini.
– Letteratura biomedica
La banca dati MEDLINE per la letteratura è stata creata
ed è gestita dall’NLM. MEDLINE contiene oltre 10 000 000
di citazioni da più di 3800 riviste biomediche internazionali che coprono i campi delle scienze mediche, veterinarie, e precliniche. Gli articoli delle riviste sono elencati in MEDLINE utilizzando le voci controllate dall’NLM,
i “Medical Subject Headings”. Una lista dei termini “Medical Subject Headings” è disponibile sul sito web della
NLM. Le citazioni in MEDLINE includono anche i riassunti in lingua inglese di articoli scritti in altre lingue se
pubblicati con l’articolo.
Oltre a MEDLINE, l’NLM gestisce varie banche dati specializzate più piccole come, AIDSLINE, che contiene citazioni bibliografiche della letteratura riguardante la ricerca, gli aspetti clinici e le informazioni sanitarie sull’AIDS; BIOETHICSLINE, con citazioni bibliografiche riguardanti la bioetica; e ChemID, un dizionario dei prodotti chimici.
– Genetica umana
Victor McKusick con i suoi colleghi alla Johns Hopkins
University cura una banca dati, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), a cui si può accedere attraverso il sito dell’NCBI. Questa banca dati è un catalogo delle malattie ereditarie. Ogni voce contiene informazioni
riguardanti la malattia ed eventualmente sulla terapia genica, sui modelli animali, o su altri argomenti. La quantità e il tipo di informazioni non sono uguali per tutte le
voci poiché sono disponibili quantità diverse di informazioni per ogni malattia. Le informazioni non sono state necessariamente scritte per essere comprese da un
pubblico poco esperto. Nonostante ciò, può essere interessante darvi un’occhiata. Vedi il Capitolo 25 (Genetica
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molecolare umana) per maggiori informazioni per navigare in OMIM.
– Tassonomia
Selezionando la banca dati della tassonomia (“Taxonomy”) dal menu a tendina e inserendo il nome di un
organismo nella casella della ricerca, si aprirà la pagina
con le informazioni tassonomiche complete dell’organismo richiesto. Nella pagina dell’organismo ci sono collegamenti a voci di altre banche dati, come geni, proteine, strutture e progetti sul genoma. Ci sono anche collegamenti a siti esterni riguardanti l’organismo. Per esempio, se inserite la voce “Ambystoma mexicanum” nella
casella di ricerca e scegliete la banca dati della tassonomia, vedreste (nel 2006) che ci sono 34 647 sequenze nucleotidiche per A. mexicanum nella banca dati dei nucleotidi, 345 sequenze proteiche nella banca dati delle
proteine, un progetto genoma, due strutture proteiche,
ecc. Tutti questi risultati sono collegamenti che potete
seguire per avere ulteriori informazioni.
– I progetti genoma
La banca dati del progetto genoma riunisce le informazioni dei vari progetti genoma. Se la scegliete come banca dati e inserite il nome di un organismo nella casella
di ricerca sul sito Internet dell’NCBI, otterrete una pagina riassuntiva delle informazioni sul progetto(i) genoma
di quell’organismo, inclusi collegamenti a siti esterni. Una
ricerca dei progetti genoma per Canis familiaris (il cane
domestico) vi mostra che, nel 2006, c’è un progetto genoma sia per C. familiaris sia per Canis lupus (il lupo).
Facendo click sul collegamento del progetto genoma del
cane si apre una pagina riassuntiva con i disegni schematici dei cromosomi del cane, la foto di un boxer (presumibilmente Sasha, il boxer di cui è stato sequenziato
il genoma), i collegamenti alle pubblicazioni più importanti e alla sequenza del genoma, e i collegamenti a siti
esterni con informazioni in più.
Uno dei nostri collegamenti preferiti di questa pagina è
quello alla banca dati chiamata Online Mendelian Inheritance in Animals. Fate click su questo collegamento, e
si aprirà una pagina con una tabella che riassume, innanzitutto, quanti caratteri, “feni”, in una vasta gamma di
diversi animali, hanno una base molecolare nota. Ciascuno di quei numeri è un collegamento ad una lista dei
caratteri. Fate click sul numero per il cane (nel 2006 era
58). La lista dei caratteri comprende “Coat colour, brown”.
Facendo click su questo collegamento si arriva ad una pagina che identifica come gene responsabile del mantello
TYRP1 (Phene ID 2695 Group 001249) e cita un lavoro
pubblicato nel 2002 e intitolato “TYRP1 and MC1R genotypes and their effect on coat colour in dogs”. MC1R è
il recettore della melanocortina responsabile del colore
del pelo nei labrador gialli e in altri cani gialli e rossi.
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Software per ricerca e analisi
– PubMed
PubMed, al quale si può accedere attraverso i siti Internet dell’NCBI e dell’NLM (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov e http://www.nlm.nih.gov), esegue una ricerca in
MEDLINE e ha collegamenti alle banche dati dell’NCBI
per le sequenze proteiche, per le sequenze di DNA e
per le strutture proteiche. I collegamenti specifici per
ciascuna citazione compaiono con il riassunto dell’articolo. Ora PubMed fornisce anche collegamenti alle informazioni di base attraverso una versione elettronica
di Molecular Biology of the Cell (B. Alberts, et al., Garland Publishing, Inc., New York, NY, 2002). Le voci presenti nei riassunti degli articoli sono collegate a parti attinenti del libro.
– National Library of Medicine Gateway
NLM Gateway, a cui si accede attraverso il sito Internet
dell’NLM, fornisce accesso a MEDLINE e ad altre banche
dati dell’NLM (vedi sopra).
– BLAST
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) è un programma per l’identificazione ed il confronto delle sequenze. BLAST può eseguire una ricerca nelle banche
dati delle proteine e dei nucleotidi in diversi modi. Per
esempio, può confrontare una sequenza amminoacidica con le banche dati delle proteine, una sequenza nucleotidica con le banche dati delle sequenze nucleotidiche, una sequenza nucleotidica tradotta in tutti i quadri di lettura con le banche dati delle proteine, e una
sequenza proteica con le banche dati delle sequenze
nucleotidiche tradotte secondo tutti i possibili quadri di
lettura. Cerca sequenze simili alla sequenza richiesta e
le visualizza in ordine decrescente di corrispondenza,
calcolando dati statistici sulla qualità della corrispondenza.
– Entrez
Entrez è un sistema di ricerca nel sito Internet dell’NCBI
che recupera le informazioni da MEDLINE, GenBank,
OMIM, dalle banche dati delle sequenze e delle strutture proteiche, e da alcune altre banche dati. Per usare Entrez, dovete selezionare da un menù la banca dati in cui
volete eseguire la ricerca e scrivere i termini da ricercare. Entrez non è un programma per il confronto delle sequenze.
– Istruzioni per la ricerca (Search Tutorials)
Nel sito dell’NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), potete fare click su Education nel menù a lato. Questo vi porta ad una pagina dalla quale potete accedere alle istruzioni (tutorials) di PubMed e di BLAST. Se fate click su
Entrez dal sito dell’NCBI, arriverete ad una pagina dalla
quale potete avere le istruzioni per usare Entrez.
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Informazioni per la ricerca generale
Per eseguire una ricerca in MEDLINE con PubMed, andate nel sito dell’NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) ed utilizzate il menu a tendina vicino al bottone di ricerca
“search” sulla barra nella parte superiore della pagina. Selezionate PubMed dal menù, poi scrivete la vostra parola
da ricercare nella finestra e premete il bottone Go. Per
esempio, supponiamo di essere interessati ai geni dell’amilasi umana. Se scrivete “human salivary amylase” (amilasi salivare umana) come termine per la ricerca, noterete che la ricerca troverà oltre 1000 documenti (1272 ad ottobre 2006). È improbabile che vogliate leggere tutte quelle citazioni, perciò aggiungete la parola “gene” alla vostra
ricerca. Questo restringe considerevolmente i risultati (a
89 citazioni nell’ottobre 2006). Se fate click su qualunque
citazione, sarete connessi al riassunto dell’articolo.
Per fare una ricerca di una sequenza proteica, di una
struttura proteica, o di una sequenza di DNA, selezionate dal menù a tendina “Proteins”, “Structures”, o “GenBank” e scrivete la parola da cercare. Per esempio, se
scegliete la banca dati delle proteine (“Proteins”) dal menù a tendina e scrivete le parole “human salivary amylase”, otterrete una lista di voci della banca dati delle proteine che contengono le parole che avete scritto per la
ricerca. Ad ottobre 2006, c’erano 52 voci. Se la vostra ricerca dà come risultato troppi documenti, usate il comando “Modify Search” (modificare la ricerca) nella stessa pagina per aggiungere termini alla vostra ricerca, oppure andate indietro di una pagina e rifate la ricerca con
termini più restrittivi.
Ciascuna citazione ha diversi collegamenti: GenPept,
FASTA, MEDLINE, e altri. Facendo click su FASTA si aprirà una finestra che mostra la sequenza della proteina utilizzando il codice a una lettera per gli amminoacidi. Facendo click su GenPept si aprirà un documento annotato. Questo documento vi dice il numero “GI” (un importante numero identificativo preceduto dalle lettere GI)
nella parte superiore della pagina, fornisce un elenco bibliografico con i collegamenti ai riassunti degli articoli e
può dare informazioni sui domini della proteina o su
specifici amminoacidi presenti nel sito attivo. Alla fine
della pagina vi fornisce la sequenza amminoacidica usando il codice ad una lettera.
I risultati della ricerca con GenBank sono simili a quelli
della ricerca con Proteins, eccetto per il fatto che invece
di avere un collegamento a GenPept, le voci hanno un
collegamento a GenBank. Facendo click su GenBank di
un termine trovato arriverete ad una finestra simile alla
finestra di GenPept, con un numero GI, riferimenti bibliografici (se ci sono), ulteriori informazioni sulla sequenza del DNA (ad esempio in quale punto della sequenza nucleotidica si trova il codone d’inizio della pro-
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teina), la sequenza amminoacidica della proteina (se la
sequenza è una sequenza proteica), e, infine, la sequenza
nucleotidica.
Ricercando nell’ottobre 2006 nella banca dati Structures
(Strutture) i termini “human salivary amylase” si sono ottenute 10 voci. Facendo click sui numeri e le lettere che
identificano una voce arriverete ad una pagina chiamata “Structure Summary” e un bottone con sopra scritto
”View Structure” (visualizza la struttura). Quando è stato scritto il libro, la pagina aveva anche un collegamento per scaricare un software gratuito per la visualizzazione chiamato Cn3D. Dopo aver scaricato Cn3D, osservate la struttura o salvatela nella cartella dati creata da
Cn3D per guardarla successivamente. Cn3D vi permette
di ruotare la struttura, ingrandirla e selezionare il tipo di
visualizzazione. Sono disponibili entrambe le strutture
dell’amilasi umana pancreatica e salivare.
Nota: queste informazioni sono ben lontane dall’essere
complete. Il modo migliore per conoscere le risorse in
rete è quello di spenderci un po’ di tempo usandole, fare qualche ricerca, entrare nei collegamenti, e guardarsi
intorno.
L’esercitazione di oggi
In questa esercitazione, gli studenti utilizzeranno lo strumento BLAST di confronto di sequenze per identificare
da quali organismi derivano le sequenze dell’amilasi del
Capitolo 33. Gli studenti confronteranno i loro risultati
con l’albero evolutivo che hanno costruito. Utilizzeranno i dati ottenuti dalla loro ricerca per esplorare altre caratteristiche delle banche dati ed eseguiranno alcune ricerche in letteratura.
Obiettivi
Dopo aver completato questa esercitazione, gli studenti
saranno in grado di:
• Utilizzare le banche dati su Internet per identificare
l’origine di una proteina, a partire dalla sua sequenza amminoacidica.
• Fare una ricerca nella banca dati della letteratura biomedica MEDLINE.
• Fare una ricerca nelle banche dati su Internet per stabilire se sono state determinate le sequenze per un
particolare gene o proteina.
Materiali
•
•
•
Computer con accesso ad Internet
Foglio di lavoro 33.1
Alberi evolutivi degli studenti del Capitolo 33
© 978-88-08-06411-0
Preparazione
•
•
•
•
Eseguite gli esercizi per gli studenti in modo da conoscerli a fondo.
Se avete un proiettore per il computer preparatelo,
in questo modo, se fosse necessario, potrete mostrare agli studenti come fare le ricerche.
Se non avete un proiettore per il computer, stampate le pagine importanti mentre eseguite le esercitazioni e fatene dei lucidi. Non abbiamo fornito gli originali perché l’aspetto delle pagine può cambiare.
Se volete vedere le strutture tridimensionali delle proteine, scaricate Cn3D come abbiamo descritto in precedenza. Andate alla struttura 1HNY per l’amilasi pancreatica umana (dalla pagina principale dell’NCBI, fate una ricerca in “Structures” per l’amilasi pancreatica
umana), e salvate la struttura nel file di dati creato da
Cn3D per essere sicuri che la struttura sia visualizzabile correttamente. Se possibile, scaricate il programma sui computer che saranno utilizzati dagli studenti.
Procedimento
Prima di iniziare, richiamate l’attenzione degli studenti
sull’avviso all’inizio delle loro istruzioni. Abbiamo fornito informazioni specifiche su come condurre le ricerche
in Internet, ma gli studenti devono capire che le banche
dati sono in costante crescita per l’aggiunta di nuove informazioni. Potrebbero trovare informazioni alle quali
non abbiamo fatto riferimento perché sono state aggiunte
dopo la scrittura di questo testo).
Inoltre, le persone che curano il sito dell’NCBI aggiungono nuove funzioni nel sito e a volte cambiano l’aspetto
delle pagine del web. I vostri studenti potrebbero aprire pagine che non assomigliano alle figure che abbiamo
fornito. Non vi preoccupate se succede. Sarete comunque in grado di trovare le banche dati, i collegamenti e
i dati. Gli studenti dovrebbero usare il loro buon senso
per riuscire a capire che cosa fare nel caso in cui l’aspetto
sia cambiato. La navigazione nelle banche dati non è difficile.
Parte 1: effettuare una ricerca con BLAST
per identificare gli organismi a cui
appartengono le amilasi
Introducete l’argomento come pensate sia più appropriato. Le istruzioni per gli studenti dovrebbero permettere agli studenti di svolgere le ricerche in modo indipendente.
Gli studenti troveranno che la sequenza dell’organismo
A è l’amilasi pancreatica umana.
F. Bioinformatica ed analisi evolutiva delle proteine
© 978-88-08-06411-0
!Risposte alle domande della Parte 1
1. Uomo.
2. La seconda migliore corrispondenza alla seconda por-
zione della sequenza dell’amilasi pancreatica umana
(organismo A) è l’amilasi dello scimpanzé (anch’essa
pancreatica). Nota: questo risultato può cambiare al
crescere della banca dati. I valori E, “E value”, sono
una funzione della quantità di dati nella banca dati,
perciò non possiamo dare in un libro una risposta
che rimanga valida. Lo scopo di chiedere agli studenti
l’“E value” consiste nel far notare loro qual è la probabilità di una corrispondenza casuale con la loro sequenza.
3. L’“E value” rappresenta la probabilità di trovare per
la sequenza in esame una corrispondenza casuale
che sia buona come quella trovata. L’“E value” della porzione più corta della sequenza è più alto perché la sequenza è più corta. Le probabilità di una
corrispondenza casuale con una sequenza più corta sono maggiori di quelle di una corrispondenza
casuale con una sequenza più lunga. Le probabilità, comunque, sono estremamente basse in entrambi i casi.
4. Organismo A, uomo; organismo B, maiale; organismo C, pollo; organismo D, gamberetto bianco del
Pacifico; organismo E, Dr osophila melanogaster; organismo F, topo; organismo G, Dr osophila or ena. I
risultati della Drosophila saranno molto confusi, perché ora ci sono sequenze di amilasi di molte specie
di Dr osophila nelle banche dati. Non importa se gli
studenti scelgono o no la specie giusta; il punto importante è che le sequenze E e G derivano da due
specie diverse di Dr osophila.
5. Se gli studenti hanno costruito correttamente i loro
alberi evolutivi, i risultati dovrebbero essere correlati con schemi dell’evoluzione degli organismi. Il gamberetto e la Drosophila sono artropodi, e perciò divergono dalla linea uccelli-mammiferi prima di divergere l’uno dall’altra.
– Risultati del confronto dell’intera sequenza
dell’amilasi pancreatica umana
1 . Questa ricerca mostra che le corrispondenze migliori alla sequenza dell’amilasi pancreatica umana utilizzata per la ricerca sono relative ad altre voci della
banca dati per l’amilasi pancreatica umana. Non molto interessante né sorprendente. La corrispondenza
non umana più simile è lo scimpanzé, e la sua corrispondenza con l’amilasi pancreatica umana è migliore di quella esistente tra le amilasi umane salivare e pancreatica. La successiva corrispondenza più vicina non umana è la scimmia Macaca mulatta, seguita da cane, maiale, ratto e topo (all’ottobre 2006;
questi risultati probabilmente cambieranno quando
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un maggior numero di sequenze sarà immesso nella
banca dati). L’“E value” per tutti questi appaiamenti
è 0, e ciò mostra che fondamentalmente non ci sono
probabilità di avere una corrispondenza casuale nella banca dati.
2. Ipotesi 1. I geni salivari e pancreatici erano geni separati prima che la linea ancestrale dell’uomo e del
ratto divergessero. Perciò le amilasi pancreatiche del
ratto e dell’uomo sono più simili tra loro rispetto alle amilasi salivari e pancreatiche dell’uomo. Questa
ipotesi prevede che un confronto dell’intera sequenza dell’amilasi pancreatica umana con la banca dati
mostrerebbe una somiglianza con l’amilasi pancreatica del ratto maggiore di quella con l’amilasi salivare umana.
Ipotesi 2. Gli antenati del ratto e dell’uomo si sono
separati prima dei geni dell’amilasi pancreatica e salivare umana. Tuttavia, l’ambiente pancreatico pone
un vincolo evolutivo su alcune regioni della proteina amilasi. Come risultato, le amilasi pancreatiche rimangono simili in quella regione (o quelle regioni),
e noi abbiamo confrontato una di quelle. Stabilito che
la regione vincolata non è troppo grande, il confronto
delle sequenze proteiche intere dovrebbe mostrare
una migliore corrispondenza tra le amilasi pancreatica e salivare umane rispetto a quello tra l’amilasi pancreatica di ratto e di uomo.
3. Ci sono 419 amminoacidi identici su 495 tra le amilasi pancreatiche di ratto e di uomo.
4. Ci sono 481/495 uguaglianze tra le amilasi pancreatica e salivare umane. Quindi, l’amilasi salivare umana
è più simile all’amilasi pancreatica umana dell’amilasi
pancreatica di ratto, fatto che conferma l’ipotesi 2.
Parte 2: esplorazione della bioinformatica
delle proteine
L’esplorazione della voce del “GenPept” per l’amilasi
pancreatica umana fornisce un’eccellente opportunità
per prendere in rassegna la struttura proteica. Gli studenti esamineranno informazioni dettagliate sulla struttura dell’amilasi pancreatica umana. Le informazioni di
base di cui hanno bisogno si trovano nel Capitolo 4, Una
breve panoramica sulla biologia molecolare.
Anche le istruzioni per gli studenti per questa parte dell’esercitazione sono chiare in se stesse.
!Risposte alle domande della Parte 2
1.
D. Burk, Y. Wang, D. Dombrowski, A. Berghuis, S.
Evans, Y. Luo, S. G. Withers, e G. Brayer sono gli
autori del primo articolo, che è stato pubblicato nel
1993 sul Jour nal of Molecular Biology. G. Brayer, Y.
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Luo, e S. Withers sono gli autori del secondo articolo, che è stato pubblicato nel 1995 su Pr otein
Science.
2. Il legame disolfuro (–S–S–) si forma tra i gruppi –SH
di due residui di cisteina. È un forte stabilizzatore della struttura della proteina, dato che è un legame covalente.
3. Cinque.
4. Gli studenti devono connettere i residui 28 e 86, 70
e 115, 141 e 160, 378 e 384, 450 e 462.
– Osservazione della struttura tridimensionale
dell’amilasi pancreatica umana
Questa parte dell’esercitazione richiede che abbiate scaricato il programma Cn3D dal sito Internet dell’NCBI. Agli
studenti è richiesto essenzialmente di esplorare il programma, guardando la struttura dell’amilasi pancreatica
umana. Se avete tempo, esaminate la struttura insieme
alle informazioni del file di GenPept. Identificate le eliche, i foglietti beta e i legami disolfuro.
Parte 3: esplorazione dei riferimenti
bibliografici biomedici in rete
Di nuovo, seguendo le facili istruzioni, gli studenti saranno condotti in una ricerca dei riferimenti bibliografici per l’amilasi salivare umana in cui impareranno come usare il programma di ricerca e a restringere le loro ricerche aggiungendo delle parole. Possono anche
andare alla pagina “Education” (Istruzione) dalla pagina principale dell’NCBI e selezionare il tutor per PubMed.
!Risposte alle domande della Parte 3
Meisler e Ting lavoravano nel Dipartimento di Genetica Umana dell’Università del Michigan, Ann Arbor. L’articolo è stato pubblicato nel 1993.
2. Cinque.
3. L’inserzione di un retrovirus a monte del gene dell’amilasi. Contiene un “enhancer” specifico per la
ghiandola salivare.
4. Il fatto che l’espressione salivare dell’amilasi è nata
indipendentemente nei roditori e nei primati.
1.
– Risposte alle sfide
1 . Nell’ottobre 2006, abbiamo trovato due articoli che
parlavano dell’espressione del gene dell’amilasi di cane utilizzando come termini per la ricerca “dog amylase gene expression” (espressione del gene dell’amilasi di cane):
Mocharla, H., R. Mocharla, e M. Hodes. 1990. Alphaamylase gene transcription in tissues of normal dog.
Nucleic Acid Research 18:1031-1036.
© 978-88-08-06411-0
MacDonald, R., A. Przybala, e W. Rutter. 1997. Isolation and in vitr o translation of the messenger RNA
coding for pancreatic amylase. Jour nal of Biological
Chemistry 252:5522-5528.
Mocharla et al. hanno utilizzato il Northern blot e la
reazione a catena della polimerasi (PCR) con la trascrittasi inversa per cercare l’RNA dell’!-amilasi nei
tessuti di cane. Utilizzando i primer per l’amilasi umana, hanno trovato i trascritti dell’!-amilasi nel pancreas, fegato, intestino tenue, intestino crasso, e tube
di Falloppio, ma non nella ghiandola salivare (parotide). Questo risultato spiega perché i cani possono
digerire l’amido ma non hanno attività amilasica nella loro saliva.
MacDonald et al. hanno isolato l’RNA dal pancreas
di cane e lo hanno tradotto in vitr o. Hanno trovato
una grossa proteina che reagiva con gli anticorpi
(gamma globuline) contro l’amilasi e hanno proposto che questa fosse un precursore dell’amilasi. Hanno trovato che quasi tutto l’RNA dell’amilasi era associato con i poliribosomi legati al reticolo endoplasmatico (un bel ripasso della struttura cellulare!)
e anche che l’RNA messaggero (mRNA) era molto
più grande di quello che serve per codificare la proteina.
2. Hickey, D. A., B. F. Benkel, P.H. Boer, Y. Genest, S.
Abukashawa, e G. Ben-David. 1987. Enzyme-coding
genes as molecular clocks: the molecular evolution
of animal alpha-amylases. Jour nal of molecular evolution 26:252-256.
Le parole “amylase sequences molecular clocks” per
la ricerca porteranno a questo articolo. Abbiamo provato altre combinazioni di parole che non permettono di trovare l’articolo, come ad esempio “amylase
gene molecular clock”.
Questi autori hanno preparato una genoteca di DNA
complementare dal tribolio delle farine (Tribolium
castaneum) e l’hanno sottoposta a screening con il
gene clonato dell’amilasi di Drosophila. Hanno trovato così il gene dell’amilasi del tribolio, lo hanno sequenziato e lo hanno confrontato con la sequenza
dell’amilasi di Dr osophila e con altre sequenze di
amilasi pubblicate. Essi hanno scoperto che le !-amilasi animali sono molto conservate in tutta la loro lunghezza e che parti del gene sono conservate tra i procarioti, le piante e gli animali.
Sebbene gli studenti non abbiano accesso all’intero
articolo, noi lo abbiamo letto e abbiamo visto che gli
autori concludono da questo lavoro che l’evoluzione
dell’amilasi non può essere utilizzata come un oro-
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logio molecolare! I tassi dei cambiamenti sono molto diversi tra i diversi gruppi di organismi: 6,1 sostituzioni ogni 100 milioni di anni nel confronto tra insetti e mammiferi contro 23,7 nel confronto uomo-topo, contro 69,0 nel confronto topo-ratto.
– Attività supplementare
Nelle esercitazioni della sezione Biologia molecolar e e
genetica, gli studenti hanno imparato a conoscere la biologia molecolare del colore del pelo dei labrador retriever, la biologia molecolare di diverse malattie umane, e
qualcosa della biologia molecolare del cancro. Possono
ora esaminare le banche dati per avere informazioni riguardanti questi argomenti. Vi suggeriamo di far loro eseguire una ricerca in Taxonomy per Canis familiaris, che
vadano alla pagina di Online Mendelian Inheritance in
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Animals, e seguano i collegamenti per i tratti del cane
per i quali sono state determinate le basi molecolari.
Vi consigliamo di includere delle ricerche in rete nelle future esercitazioni, sia per consolidare quello che gli studenti hanno imparato in questo capitolo sia per collegare
le informazioni del loro libro di testo con il mondo esterno. Nella precedente edizione di questo libro, avevamo
messo questa parte delle esercitazioni prima della sezione Biologia molecolare e genetica. In questa edizione, con
la nuova sezione Genomica, sembrava che la successione degli argomenti non fosse quella migliore. Se preferite l’altro ordine, potete certamente sempre scegliere di fare queste esercitazioni prima delle sezioni di genetica e di
genomica, dato che questa sezione non richiede alcuna
informazione presentata in quei capitoli.
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![mutazioni genetiche [al DNA] effetti evolutivi [fetali] effetti tardivi](http://s1.studylibit.com/store/data/004205334_1-d8ada56ee9f5184276979f04a9a248a9-300x300.png)
![(Microsoft PowerPoint - PCR.ppt [modalit\340 compatibilit\340])](http://s1.studylibit.com/store/data/001402582_1-53c8daabdc15032b8943ee23f0a14a13-300x300.png)
