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UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA
Retrovirus
HIV
HIV
• 1978: casi isolati di sindrome da
immunodeficienza negli Usa, Haiti,
Africa.
• 1981: Soggetti omosessuali con
sarcoma di Kaposi e rare infezioni, età
inferiore ai 60 anni.
• 1982: CDC stabilisce la definizione di
AIDS.
• 1983: AIDS: è legata alle trasfusioni di
sangue, droghe per via IV, infezioni
transplacentari.
• 1983-84: HIV, identificato negli USA e
Francia.
• 1984: Primi casi di AIDS in Africa.
• 1984: Test anti-HIV.
• 1986: WHO strategia globale per il
controllo dell’AIDS.
• 1997: inizio dell’HAART
• Il sarcoma di Kaposi è un tumore che
prende origine dalle cellule che ricoprono
l’interno dei vasi sanguigni o linfatici
(cellule endoteliali) e può manifestarsi a
livello di cute, mucose e organi interni
• La crescita incontrollata delle cellule
endoteliali genera la comparsa di macchie
rosso-violacee a livello della pelle.
2002
2006
Retrovirus
I retrovirus:
codificano per una DNA polimerasi RNA-dipendente o
trascrittasi Inversa (reverse transcriptase, RT)
si replicano attraverso un intermedio a DNA (provirus)
1970
D. Baltimore e H. Temin: scoperta della trascrittasi inversa
1975
Baltimore, Temin, Dulbecco: premio Nobel
Classificazione dei Retrovirus
3 sottofamiglie:
1. Oncovirinae B (MMTV), C (HTLV-1, -2 -5)
e D (HTLV-1, leucemia acuta a cellule T
nell’adulto, mielopatia associata all’HTLV-1)
HTLV-2 (leucemia a cellule capellute)
2. Lentivirinae (HIV-1, HIV-2)
3. Spumavirinae (Human foamy virus)
epidemiologia: origine
• HIV è entrato nella popolazione umana
dai primati da 30 a 100 anni fa, epoca in
cui in lontane regioni dell’Africa subsahariana, si sono differenziati
rispettivamente da
SIV( Simian Immunodeficiency virus )
La prima documentata evidenza di
infezione da HIV deriva dal sangue di un
africano (Congo) prelevato nel 1959
Diffusione di HIV
sono state formulate due teorie per chiarire il
rapido diffondersi dell’epidemia umana negli
ultimi 30 anni:
• 1) Hooper: cellule di rene di scimpanzè
coltivate in Africa per il vaccino orale antipolio potrebbero essere state contaminate dal
virus SIV  trasmesso ai vaccinati negli Anni
’50. Tuttavia non è stata trovata nessuna
traccia di DNA di scimpanzè nei campioni
esaminati (inoltre SIV si replica male nelle
cellule di rene di scimmia).
Diffusione di HIV
• 2) Marx: uso di siringhe non sterilizzate negli
ultimi 60 anni ha contribuito alla diffusione del
virus già presente nella popolazione africana
da molti anni
• Deforestazione, incremento della caccia 
esposizione dell’uomo a SIV
HIV: tipi, sottotipi (cladi) e isolati (strains)
HIV: tipi e sottotipi
HIV - Caratteri generali
- Forma sferica
- 2 copie di RNA a polarità +
- Presenza di mantello
- Diametro di 80-120nm
Presenza di:
 una RT (trascrittasi inversa)
 una integrasi
 due RNA di trasferimento
cellulari (tRNA)
I tRNA si associano a ciascuna
copia del genoma mediante
appaiamento di basi e vengono
utilizzati come primer dalla
trascrittasi inversa.
Genoma HIV - 1
Due filamenti singoli di RNA, polarità positiva, 9.7
kb.
Tre geni strutturali: gag, pol, env
gag → proteine del capside (p 24), nucleocapside
(p 9, p 7), matrice (p17)
pol → enzimi virali (trascrittasi inversa, integrasi,
proteasi) p51, p66, p33
env → proteine dell’envelope (gp 120, gp41)
Organizzazione genoma virale
3 geni principali
gag “ group – antigen ”
pol “ polymerase “
env “ envelope”
LTR “long terminal repeat” non codificante , si lega a DNA
ospite
promotore della trascrizione
Organizzazione genoma virale
6 geni accessori , codificanti per proteine omologhe
vif, vpu,
vpr, tat,
rev,
nef
Proteine codificate dal genoma di HIV-1
Proteine strutturali:
• gag (p24, p17, p9, p7)
• pol (p10, p51, p32)
• env (gp120, gp41)
Proteine accessorie:
• vif, p23
• vpu, p15,16: vpr
Proteine regolatorie:
• tat p14-15
• rev p19
• nef p27
Prodotti dei geni accessori:
proteine regolatorie
tat (transactivating protein): transattivatore della traduzione di
geni virali e cellulari
rev (regulator of viral protein synthesis): regola il trasporto di
mRNA virale nel citoplasma
nef, è richiesto per mantenere elevati livelli virali in circolo
proteine accessorie
vif (virion infectivity factor): promuove assemblaggio e
maturazione
vpu (viral protein U): facilita il rilascio del virus
vpr trasporta il cDNA nel nucleo
HIV Genome and Gene Products
ATTACCO
FUSIONE
Tutte le molecole di RNA presentano strutture identiche denominate R
A fiano di ciascun segmento R ci sono sequenze caratteristiche U5 e U3
Rispettivamente in 3’e 5’.
Durante la sintesi di DNA le sequenze vengono retrotrascritte in ambedue gli estremi dando
origine a molecole più lunghe dell’RNA genomico .Le sequenze identiche ad ogni estremo
sono le LTR
Il legame del virus alla cellula inizia con il legame della
gp 120 e della gp 41 al recettore cellulare CD4.
È richiesto un secondo recettore
inizialmente la gp 120 si lega
a CD4 sulle cellule della linea
monocito-macrofagica (MØ, DC)
virus M-tropico
+ secondo recettore: CCR5
(NSI: non-syncytium inducing)
in seguito la gp 120 si lega a CD4 su linfociti T naïve o helper
virus T-tropico
+ secondo recettore: CXCR4
(SI: syncytium inducing)
n.b.: la deficienza genetica dei recettori per le chemochine
determina resistenza all’infezione (es. mutazione D32 di CCR5)
Ingresso e penetrazione
NB:
• Oltre ai linfociti T CD4 + sono cellule bersaglio
di HIV:
monociti
(sangue)
cellule follicolari dendritiche (linfonodi)
macrofagi alveolari
(polmoni)
cellule della microglia
(SNC)
• Monociti / macrofagi :
” serbatoio virale ”,
“ veicolo del virus ”
Replica di HIV
• Legame di gp120 a CD4 + 2° recettore
• Fusione del mantello con la membrana
cellulare
• Rilascio del genoma nel citoplasma
• La RT utilizza il tRNA del virione
come primer e sintetizza un filamento
di DNA a polarità negativa
• La RT poi sintetizza la molecola di DNA a
polarità positiva complementare (cDNA)
La RT commette facilmente degli errori
che rendono instabile
geneticamente il virus.
Il cDNA a doppio filamento migra nel
nucleo e si integra nel genoma della
cellula ospite mediante l’integrasi.
Una volta integrato, il DNA virale
viene trascritto come un gene
cellulare ad opera dell’RNApol II
della cellula ospite.
• Le proteine tradotte dagli mRNA
vengono sintetizzate sottoforma di
poliproteine e poi processate nelle
proteine funzionali.
• Gemmazione della particella virale.
• Rilascio del virus dalla cellula: la
proteasi virale determina il taglio
delle poliproteine
• L’azione delle proteasi determina la
formazione del virione maturo, fino
alla produzione di virioni infettanti. La
proteasi è un bersaglio dei farmaci
antivirali.
Meccanismo di replica di HIV ( I )
3) retrotrascrizione (sintesi DNA per trascrittasi
inversa da RNA)
4) degradazione dell’RNA da parte della RNAsi
5) sintesi del secondo filamento di DNA dal primo
filamento
6) migrazione del cDNA nel nucleo
7) integrazione (scissione del DNA ospite e DNA
virale in un punto preciso, inserimento nel genoma
del DNA complementare)
8) latenza (linfociti CD4 esprimono RNA virale)
Meccanismo di replica di HIV ( II )
9) Slatentizzazione del virus (replica virale)
10) Trascrizione e processazione dell’RNA
11) Sintesi proteica
12) Taglio (proteasi) e glicosilazione delle proteine
13) Assemblaggio del virus
14) Rilascio del virus
15) Maturazione
HIV Life Cycle
Patogenesi e immunità
Il virus causa
• infezione litica dei linfociti T
CD4+
• infezione persistente, con
produzione di bassi livelli
virali, nelle cellule della linea
macrofagica e nelle cellule
dendritiche.
Il virus induce la formazione di
sincizi dove le cellule,
esprimendo un n° elevato di
CD4 vanno incontro ad apoptosi
• Il virus altera le funzioni dei
linfociti T e dei macrofagi.
La diminuzione del numero di cellule T CD4+ può derivare da:
- citolisi indotta da HIV per danno alla membrana citoplasmatica
o per accumulo di macromolecole virali
- induzione di apoptosi
- distruzione di cellule con proteine dell'envelope virale espresse
o adese sulla membrana, ad opera di linfociti CD8+;
- produzione di anticorpi citotossici reagenti con antigeni dei
linfociti CD4+;
- fenomeni autoimmuni nei confronti di antigeni di classe II del
complesso maggiore di istocompatibilità modificati.
Forse i macrofagi rilasciano fattori
neurotossici o che inducono infiammazione.
Come HIV sfugge al sistema immune:
• infezione di linfociti e macrofagi: inattivazione
di elementi chiave
• In particolare, la inattivazione delle cellule
T helper CD4+ blocca la DTH
• variabilità antigenica di gp120: evasione delle
risposte anticorpali
Decorso e stadi della infezione da HIV
Infezione acuta
• Durata 3-6 mesi
• conta T CD4+ : 1000 / mm3
Latenza clinica:
• 1-10 anni
LAS (linfoadenopatia sistemica)
o PGL (persistent generalized limphoadenopathy)
• conta T CD4+ : 600 /mm3
ARC (AIDS-related complex, complesso AIDS-correlato))
• conta T CD4+ : 400 /mm3
AIDS conclamato
• conta T CD4+ : <150-200 /mm3
stadi della infezione da HIV
CD4+ T cell count (cells per µL)
HIV RNA copies per mL of plasma
Stadi della infezione da HIV
Pre-AIDS o LAS o PGL
• sintomi simil-influenzali e
simil-mononucleosici.
• linfoadenopatia
Sono presenti per un tempo
superiore ai 3 mesi:
• sudorazione notturna
• linfoadenopatia
• calo ponderale superiore al 10%
• febbre, diarrea, affaticamento,
astenia.
• diminuzione delle T helper
stadi della infezione da HIV
ARC (complesso AIDS-correlato)
Clinica:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
incubazione 3-6 settimane
febbre
astenia
calo ponderale
diarrea
sudorazione notturna
linfoadenopatia
disordini immunologici
disappetenza
piastrinopenia
stadi della infezione da HIV
ARC (complesso AIDS-correlato)
linfoadenite ascellare suppurativa
da Mycobacterium Avium Complex
AIDS
Criteri clinici:
- Presenza di 1 o più
infezioni opportunistiche,
segno di immunodeficienza
- Encefalopatie: la TAC di
pazienti con HIV mostra encefalopatie
(emisferi cerebrali raggrinziti)
Sindrome di indebolimento
Sudorazione notturna
Linfonodi cervicali ingrossati
Sarcoma di Kaposi un tumore che prende
origine dalle cellule che ricoprono l'interno dei vasi sanguigni
Polmonite da Pneumocystis
jirovecii
A)
Il virus può arrivare nel sangue
esclusivamente attraverso:
• rapporti sessuali con persone infette
• trasfusione di sangue infetto o
plasma o fattori della coagulazione
infetti
• siringhe o aghi contaminati con
sangue infetto
• la madre infetta il figlio durante la
gravidanza, al momento del parto o
durante l’allattamento
B)
Il pericolo d’infezione aumenta con
la frequenza di comportamenti a
rischio:
• cambiamento di partner sessuali
• rapporto anale
• scambio di siringhe tra
tossicodipendenti
C)
Non è stato mai dimostrato che vi siano
rischi nei contatti sociali
• ambiente familiare
• ambiente di lavoro
• scuola
• locali pubblici
• mezzi di trasporto
Non è dimostrata la trasmissione
attraverso acqua, stoviglie, servizi
igienici, piscine, spogliatoi.
Non è dimostrata la trasmissione
• per via aerea (goccioline di saliva,
sputo, colpi di tosse),
• per contatti casuali (stretta di mano)
• tramite alcuni liquidi biologici
(urina, saliva, lacrime)
• per contatti con animali, punture
d’insetto, zanzare.
HIV
A global view of HIV infection, 2005
1.5 million
200,000 in ‘05
IDU
7.6 million
830,000 in ‘05
Heterosexual
MSM
IDU
12.1 million
1.3 million in ‘05
Heterosexual
Source: UNAIDS 2006 Report on the Global AIDS Pandemic
AIDS: infezioni opportunistiche
Protozoarie
• Toxoplasmosi cerebrale
• Criptosporidiosi con diarrea
Fungine
• Esofagite da Candida
• Criptococcosi
• Histoplasmosi
• Coccioidomicosi
Virali
• CMV
• HSV
• EBV
Batteriche
• setticemia da salmonella
• Infezioni piogeniche
Lesioni orali associate all’infezione da HIV
• Candidosi: eritematosa, pseudomembanosa
• Sarcoma di Kaposi
• Linfoma non-Hodgkin(neoplasie
•
tessuto linfatico),
Malattia periodontale:
• Gengivite eritematosa
• Gengivite necrotizzante ulcerativa
• Periodontite necrotizzante ulcerativa
Caratteristiche cliniche di AIDS
Linfoadenopatia e febbre:
• Inizio insidioso
• Perdita di peso e malessere
Infezioni opportunistiche:
• Polmonite da Pneumocystis jirovecii
• Toxoplasmosi cerebrale
• Meningite criptococcica
• Candidosi
• Infezioni da Herpesvirus
• Malattie diarroiche
Tumori
• Sarcoma di Kaposi
• Linfoma non-Hodgkin
Demenza correlata all’AIDS
• Diminuzione delle funzioni motorie e
cognitive
Diagnosi di laboratorio
Sierologia: ricerca di antigene
p24 e/o anticorpi con metodi
diversi
• ELISA
• Agglutinazione su latex
• RIBA((Recombinant
ImmunoBlot Assay)
Isolamento del virus:
possibile su co-culture di
linfociti (solo a fini di ricerca).
Definizione di sieropositività
per HIV
Test di screening
1) Ricerca dell’antigene p24,
marker precoce d’infezione
(2-4 settimane dopo il contagio)
(test ELISA)
2) Se positivo, dopo 2 mesi,
ricerca di anticorpi anti p24
(test ELISA)
Test di conferma
3) Se positivo:
test di conferma con Western
blotting o RIBA
Diagnosi di laboratorio
Test di conferma:
HIV-RIBA
(Recombinant ImmunoBlotting Assay)
RIBA
positivo
RIBA
negativo
•
•
The RIBA HIV-1/2 SIA uses an immunoblot technique for the
detection of antibodies to HIV-1 and HIV-2. Each strip uses
four recombinant viral antigens, p24 (gag), gp41 (env), gp120
(env), and p31 (pol), from HIV-1 and one
recombinant viral antigen, p26 (gag), and a synthetic peptide
derived from the HIV-2 transmembrane envelope protein.
Criteri di interpretazione dei saggi di
conferma (CDC MMWR 38 del 21/7/1989
• POSITIVO = presenza di reattività per
almeno 2 delle seguenti bande: p24,
gp41, gp 120/160
• NEGATIVO = assenza di ogni banda
• INDETERMINATO= test con una o più
bande reattive che non rientra nel
criterio di positività sopra indicato
PCR
Determinazione di HIV-DNA
Questa metodica serve a svelare il virus HIV
integrato in forma di provirus o presente nel
citoplasma della cellula dell’ospite.
Sensibiltà > 99% e può svelare la presenza di 1-10
copie di DNA provirale di HIV 1.
Il ricorso a questa metodica risulta molto utile in
condizioni determinate (diagnosi nel neonato, in
caso di infezione acuta da HIV o come test di
conferma in caso di risultato indeterminato al
W.B.).
RT-PCR
Ricerca di virus nel sangue: determinazione di
HIV-RNA
Questa metodica non è utilizzata per la diagnosi
di infezione da HIV ma, per rilevare la quantità di
virus presente nel plasma di una persona con
infezione da HIV accertata.
Serve per verificare l’andamento dell’infezione e la
risposta alla terapia antiretrovirale.
Sensibilità: 20 copie/ml
Valutazione del
• numero di linfociti T CD4+
e del
• rapporto CD4/CD8 (nei soggetti normali: tra 1 e 2;
nei soggetti infetti: <<1)
Recentemente: valutazione della % di CD8+CD38+
come marker di progressione in AIDS
Non è un test diagnostico ma, insieme alla
valutazione dell’HIV-RNA viene impiegato:
a) per il follow-up (ogni 3-6 mesi) dei sieropositivi
b) per il monitoraggio della terapia HAART
Test rapidi per HIV-1 e HIV-2
A
B
Test “OraQuick®”
Prelievo di fluido orale
ruotando un apposito
tampone in gomma.
L’impiego di guanti non
è fondamentale: il
materiale di scarto non è
infettante
Inserire il tampone; il risultato è
visibile dopo 20 minuti
Positive
HIV-1/2
Reactive
Control
Positive
Negative
Controllo e prevenzione
•
•
•
•
Educazione sanitaria
Screening
Informazione
Sviluppo di un vaccino
Terapia HAART
(Highly Active AntiRetroviral Therapy:
terapia antiretrovirale altamente attiva)
La terapia HAART va iniziata:
quando i linfociti CD4+ scendono
al di sotto di 350 /mmc
e/o
Dr. David Ho
quando la concentrazione plasmatica
di HIV-RNA è > 100.000 copie/ml
o
quando sono presenti segni clinici
di malattia riconducibili all’infezione da HIV.
1996-97:
Terapia HAART
di solito comprende
• un analogo nucleosidico (DNA chain terminator)
• un analogo non-nucleosidico inibitore della RT (NNRTI)
• un inibitore della proteasi (PI)
Esempi
Indinavir + AZT + 3TC
Ritonavir + AZT+ 3TC
Nelfinavir + AZT + 3TC
Nevirapina+ AZT +ddI
Nevirapina + Indinavir + 3TC
Terapia antiretrovirale
•
•
•
•
Inibitori dell’ingresso:
Enfuvirtide
CD4 solubile
Anti –CCR5 (maraviroc, vicriviroc)
Anti-CXCR4
Analoghi dei nucleosidi
inibitori della RT:
• Abacavir
• Didanosina
• Emtricitabina
• Lamivudina
• Stavudina
• Tenofovir (inibitore
nucleosidico)
• Zalcitabina
• Zidovudina
Inibitori non nucleosidici
• Nevirapina
• Delavirdina
• Etravirina
• Efavirenz
Terapia antiretrovirale
• Inibitori dell’integrazione:
• Elvitegravir
• Raltegravir
• Antagonisti di Tat
Inibitori della proteasi
• Indinavir
• Ritonavir
• Saquinavir
• Nelfinavir
• Amprenavir
• Atazanavir
• Darunavir
• Lopinavir
• Tipranavir
• I farmaci antivirali limitano la progressione della
malattia.
• I vaccini per prevenire ed il trattamento sono in
fase di trials clinici.
• Sicurezza: sesso monogamo aiuta a limitare la
diffusione.
• Uso di aghi sterili monouso.
• Screening del sangue per trasfusioni, organi per
trapianti, fattori della coagulazione usati per Questo maledetto
AIDS ti preoccupa
emofiliaci.
molto, non è vero?
Procedimenti di disinfezione per materiali contaminati con
virus:
Autoclave: 121°C, 15’, 1atm
Ebollizione: 10’ in acqua bollente
Pastorizzazione. T° di 65°C (20’)
Incenerimento
Ossido di etilene (una notte)
Irradiazione con UV: 2400 A° (1’)
Ipocloriti Cloro attivo: 10.000 ppm (1’)
Cloro attivo 1000 ppm (amuchina) (30’)
Fenolici (10’)
Formalina (1 ora)
Glutaraldeide: soluzione al 2% in acqua (30’)
Beta propiolattone: soluzione in 35% di acqua.