Appunti sulla Parte Generale

CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA I
Corso M-Z per Farmacia (Prof. G. Ortar)
Appunti sulla Parte Generale
INTRODUZIONE
Generalità sui farmaci
La chimica farmaceutica si interessa della scoperta, progettazione, identificazione e preparazione dei composti biologicamente attivi, dello studio delle loro proprietà, del loro metabolismo,
dell’ interpretazione del loro meccanismo d’ azione a livello molecolare, della costruzione delle relazioni struttura-attività. E’ una disciplina fondata sulla chimica che coinvolge anche numerosi
aspetti delle scienze biologiche, farmacologiche e mediche e che applica i principi di tali scienze
alla creazione di conoscenze finalizzate all’ introduzione di nuovi utili farmaci.
I farmaci sono tutte quelle sostanze di natura organica, metallorganica od inorganica,
ottenute per via estrattiva, fermentativa o sintetica che vengono impiegate per la diagnosi, la
prevenzione e il trattamento delle malattie umane o animali.
Più in dettaglio i farmaci possono essere impiegati per uno dei seguenti scopi:
●Somministrazione di elementi di cui l’ organismo è carente (vitamine, sali, ormoni, idrolizzati
proteici);
●Prevenzione di una infezione (sieri, vaccini);
●Trattamento di una infezione (chemioterapici);
●Blocco temporaneo di una funzione fisiologica (anestetici locali, contraccettivi);
●Correzione di una funzione fisiologica alterata (antiipertensivi, antiaritmici);
●Detossicazione dell’ organismo (antidoti);
●Diagnosi della funzionalità o dello stato di mantenimento di un organo (tests di funzionalità,
mezzi di contrasto).
Le principali classi di farmaci sono:
●Farmaci agenti sul sistema nervoso;
●Agenti farmacodinamici (farmaci che agiscono sui processi dinamici dell’ organismo, ad esempio
sistema cardiovascolare, apparato respiratorio e gastrointestinale);
●Chemioterapici;
●Farmaci agenti su funzioni endocrine e su malattie metaboliche (ad esempio antiinfiammatori,
antiartritici, antidiabetici).
La grande maggioranza dei farmaci impiegati attualmente è costituita da composti organici e
loro sali. Alcuni sono prodotti dal metabolismo di particolari microrganismi e vengono
isolati dai brodi di coltura nei quali questi microrganismi crescono (antibiotici); altri sono
MINERALI
8%
ANIMALI
isolati da organi animali, da parti di piante, da
6%
prodotti di queste. La maggior parte dei
SINTESI PARZIALE
MICROORGANISMI
11%
farmaci però viene ottenuta per sintesi, totale o
7%
parziale (questo ultimo termine si riferisce a
VACCINI
5%
modificazioni chimiche di sostanze di origine
PIANTE
SIERI
8%
naturale). Con riferimento alla loro origine è
2%
mostrata a fianco la distribuzione percentuale
dei farmaci essenziali elencati dalla OrganizSINTESI
zazione Mondiale della Sanità (OMS) (i far52%
maci essenziali, circa 300, sono i farmaci che
soddisfano le esigenze sanitarie della maggior
parte della popolazione e che dovrebbero perciò essere sempre disponibili in adeguata
quantità e nelle opportune forme di dosaggio).
Negli ultimi 15 anni sono emerse come importante fonte di nuovi agenti terapeutici le bioORIGINE DEI FARMACI ESSENZIALI DELL' OMS
1
tecnologie e circa una cinquantina sono i farmaci approvati ottenuti in questo modo.
I farmaci, intesi come principi attivi, vengono commercializzati in forme adeguate alla somministrazione (forme farmaceutiche) e nelle quantità necessarie a dare una risposta farmacologica
(dose terapeutica). La forma farmaceutica nel suo assieme (principio attivo + ingredienti inerti con
funzioni varie, di riempimento, lubrificante, legante, conservante, antiossidante) costituisce il
medicamento. Una forma farmaceutica può contenere più principi attivi (preparato
in associazione).
DL50
Una indicazione piuttosto sommaria del margine di sicurezza di un farmaco
IT =
DE50
è fornita dal suo indice terapeutico IT, definito come il rapporto tra dose letale nel
50% degli animali da esperimento e dose efficace nel 50% degli individui.
Il tempo richiesto per la
genesi di un nuovo farmaco si è
progressivamente allungato nel
TEMPO NECESSARIO PER LO SVILUPPO DI UN NUOVO FARMACO
corso degli ultimi 40 anni a
Anni
causa, soprattutto, delle maggiori
richieste regolatorie da parte
14
delle autorità sanitarie e della
+
complessità scientifica dello
+
12
sviluppo di molecole i cui targets
+
sono spesso patologie persistenti
10
+
e degenerative. Esso è attualmente compreso tra gli 8 e i 12
8
anni (figura a lato).
Le molteplici e comples+
6
se fasi richieste per l’ individuazione di una promettente sostan4
za biologicamente attiva e per il
+
suo sviluppo completo a medica2
mento sono alla base dell’ elevato costo di un nuovo farmaco
1975
1985
1995
2005
1965
(qualche centinaio di milioni di
euro). Nella figura successiva
sono indicate schematicamente le principali fasi di sviluppo di un nuovo farmaco ed il numero dei
composti esaminati che superano le varie fasi.
Il numero di nuovi farmaci introdotti in commercio nel mondo ogni anno si aggira nell’ ul-
PROBABILITA' DI SUCCESSO
NUMERO COMPOSTI
PER STADIO
RICERCA DI BASE E APPLICATA
5000-10000
Fasi 1 e 2
Fase 3
SVILUPPO PRECLINICO
250
FASE I DI SVILUPPO CLINICO
Fase 4
FASE II DI SVILUPPO CLINICO
5
FASE III DI SVILUPPO CLINICO
AIC
autorizzazione immissione
in commercio
2
4
6
8
10
12
14
2
16
Tempo in anni
1
timo quinquennio mediamente attorno ai 30. Il numero di farmaci e di loro associazioni in vendita
in Italia (2005) è:
●sostanze singole: 1375 (sali esclusi);
●associazioni: 718.
Quello delle specialita' medicinali è:
●confezioni a base di una sola sostanza: 7145;
●a base di piu' sostanze: 1412.
Individuazione di nuovi farmaci e loro sviluppo a medicamenti
Di norma, i farmaci di utilità clinica non vengono ‘scoperti’. Ciò che viene invece
inizialmente individuato è il cosiddetto ‘lead compound’, o composto guida. Il lead compound è una
molecola prototipo che possiede una attività biologica interessante, ma anche quasi sempre
caratteristiche indesiderate quali bassa potenza, eccessiva tossicità, problemi di stabilità chimica e/o
metabolica, di assorbimento, eccetera. Tali difetti fanno
si che raramente un lead approdi alla approvazione e
CH 3 COO
O
OH
quindi alla commercializzazione. Esistono, ovviamente,
O
O H3C
delle eccezioni. Una di queste è rappresentata dal
N
O
paclitaxel (chiamato precedentemente taxolo), approvato
H
OH
O
nel 1993, laddove l’ indagine iniziale sull’ estratto della
H
HO
OCOCH
corteccia del Tasso del Pacifico (Taxus brevifolia) che
3
O
O
evidenziò una azione citotossica, dovuta al paclitaxel
Paclitaxel
appunto, risale al 1962, mentre la delucidazione della
struttura del principio attivo è del 1972.
Le vie più comuni per individuare un lead
compound sono le seguenti (da tenere presente che diversi prodotti biologicamente attivi sono stati
anche scoperti per caso, ad esempio le penicilline).
a) Miglioramento di farmaci esistenti
b) Screening sistematico
Osservazioni cliniche degli effetti collaterali
dei farmaci
c) Sfruttamento di
osservazioni biologiche
Isolamento e sintesi di sostanze naturali
d) Indagini sui meccanismi biochimici e patobiochimici nell' organismo
e) Indagini riguardanti il metabolismo dei farmaci
[Sintesi di profarmaci (prodrugs) o di farmaci labili (soft drugs)]
L’ utilizzo di farmaci già noti come modelli (approccio a) per individuare altre molecole
attive è una pratica largamente utilizzata a livello industriale. Questo approccio manca di originalità
ed i prodotti così ottenuti rientrano nella categoria dei cosiddetti ‘me-too products’ che permettono
a più ditte farmaceutiche di accedere, con limitati investimenti, a settori particolarmente
remunerativi. Sebbene molto criticata, questa strategia ha anche una sua validità dal punto di vista
3
scientifico, in quanto dalla somma di piccoli e graduali miglioramenti può discendere alla fine una
innovazione sostanziale.
Lo scrrening sistematico comprende lo screening estensivo e quello casuale (random). Nel
primo caso, l’ indagine è condotta su una serie relativamente piccola di molecole chimicamente
sofisticate e consiste in un’ ampia varietà di tests biologici e farmacologici. Nel secondo caso, il
numero di molecole saggiate è molto ampio, mentre il tipo di attività cercata è unico. Queste due
varianti sono state combinate a partire dagli anni '80 come conseguenza della robotizzazione e delle
miniaturizzazione delle metodologie di screening (high-throughput screening, screening ad alta
capacità) che consentono di valutare simultaneamente centinaia di composti in decine di tests
biologici. Il problema di porre la sintesi dei composti al passo con le nuove potenzialità degli
screenings è stato in parte risolto mediante la sintesi combinatoriale. L’ idea base della chimica
combinatoriale è quella di costruire ampie collezioni di composti contenenti un alto numero di
varianti di strutture fondamentali, procedere alla valutazione della loro attività biologica, isolare ed
identificare il/i prodotti attivi. La figura seguente illustra il principio della sintesi combinatoriale.
Nella sintesi classica una
Sintesi classica
molecola A viene fatta reagire con una
molecola B per dare un prodotto AB il
ABCD
A
D
B
C
quale, per reazione con C, fornisce il
= AB +
= ABC +
=
+
prodotto ABC, e così via. Nella sintesi
combinatoriale invece una serie di
1
1
1
1
1
1
1
molecole di tipo A (A1, A2, A3…An)
viene fatta reagire con una serie di
Sintesi combinatoriale
molecole di tipo B (B1, B2, B3…Bn’)
con ottenimento di tutte le possibili
combinazioni tra A e B per un totale di
A 1-n
A i B iC i
C 1-m
A iB iC iD i
+ B 1-n' = A iB i +
=
+ D 1-m'
=
nn’ composti. La reazione successiva
con una serie di reagenti di tipo C (C1,
C2, C3…Cm) porta ad.nn’m composti
n
n'
nxn'
m
nxn'xm
m'
nxn'xmxm'
del tipo ABC, e così via. Il numero dei
2
3
10
10
10
10
10 4
10
10
prodotti totali ottenibili N dipende dal
numero di reagenti disponibili in ogni
passaggio. Se ad ogni passaggio si usa sempre lo stesso numero di reagenti n (nell’ esempio 10) ed s
è il numero dei passaggi (nell’ esempio 4), N sarà = ns. (nell’ esempio 104).
Per quanto riguarda l’ approccio c), esso comprende le osservazioni cliniche degli effetti
collaterali dei farmaci e l’ isolamento (e l’ eventuale sintesi) di sostanze naturali. La storia della ricerca farmaceutica è ricca di esempi in cui gli effetti collaterali osservati durante la sperimentazione clinica hanno suggerito manipolazioni della struttura originale
allo scopo di produrre nuove moSO 2 NH ETEROCICLO
H 2N
lecole nelle quali un effetto seSulfamidico
condario è stato amplificato, fino
(Antibatterico) H C
SO 2 NH CONHBu
3
a diventare quello principale. Uno
Tolbutamide
di tali esempi è costituito dalla
(Ipoglicemizzante)
sulfanilamide, il precursore di tutN
N
ti i sulfamidici; la sostituzione di
H 2N
SO 2 NH 2
un idrogeno dello azoto solfonCH 3CONH
S
SO 2 NH 2
ammidico con un eterociclo ha
Acetazolamide
Sulfanilamide
(Diuretico)
(Antibatterico)
notevolmente aumentato la potenAzioni secondarie:
H
za antibatterica del capostipite,
Cl
N
Diuretica
Idroclortiazide
eliminando nello stesso tempo le
Ipoglicemizzante
(Diuretico)
HN
azioni secondarie diuretica e ipoS
SO 2 NH 2
glicemizzante. Tali azioni sono
O
O
4
state invece evidenziate attraverso altri tipi di modifiche che hanno portato alla introduzione in
terapia degli ipoglicemizzanti a struttura solfonilureica e dei diuretici solfonammidici.
I prodotti di origine naturale, in particolare quelli provenienti dal mondo vegetale, sono la
più antica fonte di farmaci. Punto di partenza per l’ isolamento, la delucidazione strutturale e la
sintesi di sostanze naturali è l’ osservazione, casuale o derivante da uno screening sistematico, di
una attività interessante nell’ estratto di una parte di pianta, di un organo animale, di una coltura
batterica o fungina. La ricerca in questo settore può anche essere in qualche modo guidata dalle
indicazioni della medicina tradizionale (etnofarmacologia).
Gli approcci d) ed e) rappresentano due tipi di strategie razionali per l’ individuazione di
nuovi lead. Secondo il modello ‘medico’, le malattie sono la conseguenza della deregolazione di
una normale funzione dell’ organismo che può essere definita in termini biochimici ed influenzata
da opportuni interventi chimici o fisici. Una volta che il processo biochimico deregolato sia stato
individuato e caratterizzato nei dettagli molecolari, il lead può essere rappresentato da una o più
sostanze endogene che intervengono nella deregolazione (ad esempio neurotrasmettitori, ormoni,
fattori di crescita, citochine, substrati enzimatici vari).
Per quanto concerne il punto e), i farmaci subiscono comunemente trasformazioni chimiche
nell’ organismo ad opera di sistemi enzimatici. Talvolta, l’ azione farmacologica del farmaco è
dovuta in parte o del tutto ad uno o più di questi prodotti di biotrasformazione. Nell’ ambito degli
studi sul metabolismo dei farmaci rientra anche la progettazione di profarmaci (prodrugs) e di
farmaci labili (soft drugs). I primi sono sostanze inattive che vengono attivate ‘in vivo’, mentre i
secondi sono sostanze attive che subiscono ‘in vivo’ una inattivazione metabolica prevedibile e
controllata.
Una volta che sia stato identificato un nuovo lead, il passo successivo consiste nell’ ottimizzarne le caratteristiche farmacologiche attraverso opportune modifiche della sua struttura. Gli
obiettivi principali del processo di
Lead compound
ottimizzazione sono: aumento della
potenza, miglioramento della specificità d’ azione, riduzione della
Ottimizzazione
tossicità e miglioramento delle prodella struttura
Ricerca di base
prietà farmacocinetiche del lead.
ed applicata
Le modifiche strutturali vengono
guidate da criteri di scelta di caratSostanza attiva adatta ad
tere qualitativo e quantitativo. I
essere sviluppata a medicamento
dettagli di tali strategie verranno
esaminati successivamente nel capitolo delle relazioni struttura-attiElaborazione
Elaborazione chimica,
vità.
farmacocinetica,
chimico-analitica
Il processo di ottimizzaziofarmacodinamica
e galenica
ne conclude la fase della ricerca di
Sviluppo esplorativo
e tossicologica
(preclinico)
base ed applicata. Ad esso fanno
seguito una serie di operazioni di
varia natura che costituiscono la
Medicamento
fase di sviluppo preclinico (figura
a lato). Per elaborazione farmacoSperimentazione
Sviluppo di un metodo
cinetica si intende la definizione
clinica
di produzione industriale
dei dati di assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione
Sviluppo
completo
dei principi attivi ottimizzati; la
elaborazione
farmacodinamica
Prodotto pronto
consiste
nel
completamento
del
per il mercato
quadro del loro profilo di attività;
l’ elaborazione tossicologica ri5
guarda la definizione delle loro tossicità acuta, subacuta e cronica. Nell’ elaborazione chimica viene
messa a punto una procedura di preparazione dettagliata, ben riproducibile, il più possibile
economica e facilmente trasferibile su scala industriale dei composti ottimizzati mentre nella
elaborazione chimico-analitica vengono messi a punto i saggi di identificazione e di determinazione
della purezza. La elaborazione galenica consiste nell’ elaborazione dei principi attivi in una o più
formulazioni. La sperimentazione clinica condotta sull’ uomo per confermare le proprietà finora
definite negli animali da esperimento si articola in 3 fasi (fasi I-III) che differiscono tra loro per il
numero dei soggetti coinvolti, la durata ed il grado di approfondimento della sperimentazione. Dopo
la registrazione e l’ introduzione in commercio, il farmaco viene ulteriormente controllato in una
fase IV (farmacovigilanza).
Classificazione dei farmaci
I farmaci possono essere classificati in base a vari criteri: struttura chimica, azione
farmacologica, impiego terapeutico, meccanismo d’ azione. La classificazione raccomandata dalla
OMS e curata in Italia dal Ministero della Salute è la classificazione ATC (Anatomica-TerapeuticaChimica). Il sistema base divide i farmaci in 14 Gruppi Anatomici Principali (1° livello) , ognuno
dei quali viene poi articolato in Gruppi Terapeutici Principali, Sottogruppi Terapeutici, Sottogruppi
Chimico/Terapeutici e Sottogruppi Chimici per un totale di 5 livelli gerarchici come mostrato di
seguito. Ad ogni farmaco è associato un codice alfanumerico. I testi di Chimica Farmaceutica
impiegano generalmente una classificazione simile a quella ATC, anche se meno capillare.
GRUPPI ANATOMICI PRINCIPALI
Antimicrobici generali per uso sistemico
Sangue ed organi emopoietici
Apparato gastrointestinale e metabolismo
Sistema cardiovascolare
Dermatologici
Sistema genito-urinario ed ormoni sessuali
Farmaci antineoplastici ed immunomodulatori
Sistema muscolo-scheletrico
Farmaci antiparassitari, insetticidi e repellenti
Sistema nervoso centrale
Organi di senso
Sistema respiratorio
Preparati ormonali sistemici, esclusi gli ormoni
sessuali
Vari
Classificazione ATC
Esempio: Aspirina N02BA01
1° livello - Gruppo Anatomico Principale
1°
N (Sistema Nervoso)
2° livello - Gruppo Terapeutico Principale
2°
02 (Analgesici)
3° livello - Sottogruppo Terapeutico
3°
B (Analgesici non Oppioidi)
4° livello - Sottogruppo Chimico/Terapeutico
4°
A (Acido Acetilsalicilico e Derivati)
5° livello - Sottogruppo Chimico
5°
01 (Acido Acetilsalicilico)
↓
↓
↓
↓
6
Denominazione dei farmaci
I farmaci sono caratterizzati da vari tipi di nomi: nomi chimici (costruiti secondo le regole di
nomenclatura dell’ IUPAC), nomi brevettati (nomi delle specialità che contengono quel farmaco) e
nomi (o denominazioni) comuni. Questi ultimi sono quelli di uso più diffuso, in quanto evitano le
difficoltà della nomenclatura chimica, con l’ eccessiva lunghezza dei termini, e la varietà dei nomi
brevettati contenenti lo stesso principio attivo. Sono nomi di uso libero facilmente pronunciabili e
traducibili nelle varie lingue, raccomandati o proposti dall’OMS e vengono espressi in latino,
inglese (INN, international nonproprietary name, denominazione comune internazionale inglese) e
francese (DCI, dénomination comune internationale). Dopo traduzione nelle lingue dei vari paesi,
essi divengono denominazioni comuni nazionali (ad esempio DC.IT, denominazione comune
italiana). L’ OMS raccomanda l’ utilizzo e la protezione delle denominazioni comuni, attraverso la
adozione di provvedimenti atti ad evitare la registrazione di specialità con nomi coincidenti o molto
simili a quelli delle denominazioni comuni. Per l’ assegnazione di nuove denominazioni comuni,
sempre l’ OMS raccomanda di evidenziare l’ analogia esistente con altre sostanze appartenenti allo
stesso gruppo terapeutico alle quali già siano state attribuite denominazioni comuni. Ciò può essere
realizzato inserendo nel nome sillabe o gruppi di sillabe ben codificate ed ampiamente utilizzate.
Alcuni esempi sono riportati qui di seguito.
Cardiovascolari ACE-inibitori
Benazepril
Captopril
Cilazapril
Enalapril
Lisinopril
Perindopril
Quinapril
Ramipril
Cardiovascolari β-bloccanti
Acebutololo
Atenololo
Celiprololo
Nadololo
Pindololo
Propranololo
Timololo
Ipolipemizzanti inibitori della
HMG CoA reduttasi
Atorvastatina
Cerivastatina
Fluvastatina
Pravastatina
Simvastatina
Antimicotici imidazolici
Bifonazolo
Clotrimazolo
Econazolo
Fenticonazolo
Isoconazolo
Ketoconazolo
Miconazolo
Tioconazolo
Meticillina
Mezlocillina
Piperacillina
Ticarcillina
Antibatterici-Chinoloni
Ciprofloxacina
Enoxacina
Lomefloxacina
Norfloxacina
Ofloxacina
Pefloxacina
Rufloxacina
Antibatterici-Tetracicline
Clortetraciclina
Doxiciclina
Metaciclina
Minociclina
Tetraciclina
Antibatterici-Penicilline
Amoxicillina
Ampicillina
Bacampicillina
Cloxacillina
7
Antibatterici-Cefalosporine
Cefacloro
Cefalexina
Cefalotina
Cefamandolo
Cefazolina
Cefoxitina
Ceftazidima
Cefuroxima
Sulfamidici
Sulfadiazina
Sulfalene
Sulfamazone
Sulfametoxazolo
Sulfametrolo
Ansiolitici-Benzodiazepine
Bromazepam
Diazepam
Lorazepam
Medazepam
Oxazepam
Pinazepam
MOMENTI D’ AZIONE DEI FARMACI
Introduzione
La maggior parte dei farmaci produce i suoi effetti farmacologici in conseguenza della interazione con una specifica macromolecola biologica (proteine o acidi nucleici, soprattutto) al
cosiddetto sito d’ azione o biofase (il distretto dell’ organismo dove è localizzato il tessuto
bersaglio). Da tenere presente che non necessariamente il sito d’ azione ed il tessuto che manifesta
la risposta farmacologica coincidono. L’ azione di un farmaco richiede che esso raggiunga una
concentrazione adeguata nel fluido che circonda il tessuto bersaglio. Oltre che nella biofase, il
farmaco si distribuisce però in tutta una serie di altri distretti e quindi il farmaco ‘utile’ ai fini della
azione terapeutica è solamente una frazione della dose somministrata. La concentrazione raggiunta
dal farmaco al sito d’ azione dipende, oltre che dalla dose, anche dall’ entità e dalla velocità con cui
si svolge una serie di processi che avvengono successivamente alla sua somministrazione e che
costituiscono i vari momenti d’ azione di un farmaco.
Tali processi si suddividono tradizionalmente in tre fasi: fase farmaceutica, fase farmacocinetica e fase farmacodinamica.
La fase farmaceutica comForma Farmaceutica
porta la liberazione del farmaco dalla forma farmaceutica in cui esso è
Somministrazione
contenuto, ad esempio la disgregazione della compressa e la disaggregazione dei granuli risultanti, il
passaggio in soluzione del principio
Liberazione del farmaco
attivo e la sua diffusione al sito di
FASE FARMACEUTICA
dalla forma farmaceutica
assorbimento. Lo studio delle relae passaggio in soluzione
zioni che intercorrono tra forma
farmaceutica ed attività terapeutica
è di pertinenza della Biofarmaceutica, una branca della Tecnica Farmaceutica, disciplina che si occupa
della trasformazione dei principi atAssorbimento
tivi in forme farmaceutiche adeguaDistribuzione
FASE FARMACOCINETICA
te alla somministrazione (formulaMetabolismo
zione).
Escrezione
La fase farmacocinetica
comprende invece il processo di assorbimento ed il passaggio in circolo, la distribuzione ai vari distretti dell’ organismo, biofase inclusa, il metabolismo e l’ escrezione del farmaco (ADME).
Interazione farmacoFASE FARMACODINAMICA
La fase farmacodinamica,
macromolecola biologica
specifica nella biofase
infine, riguarda il comportamento
del farmaco in biofase. La sua azione può anche essere rivolta verso un
biosistema estraneo all’ organismo
(ad esempio un microrganismo invasore), in tal caso si parla di fase
Effetto
chemioterapica.
8
Fase Farmaceutica
Un farmaco può essere somministrato per via topica o per via sistemica. Nel primo caso esso
esplica un effetto localizzato al sito a cui è stato somministrato, essendo scarsamente assorbito nel
torrente circolatorio. Un tipico esempio di somminstrazione per via topica è quella epidermica. Nel
secondo caso il farmaco
esplica un effetto sistemico,
Principali Vie di Somministrazione dei Farmaci
cioè su siti lontani da quello
di somministrazione, in seguito a passaggio in rilevante
quantità nella circolazione
Epidermica
Vie Topiche
Polmonare
sanguigna. Le principali vie
Oculare
sistemiche di somministrazione sono quelle enterali
(orale, rettale, sublinguale) e
Sublinguale
parenterali (intravascolare,
Enterali Orale
Rettale
intramuscolare, sottocutanea).
Vie Sistemiche
E' bene ricordare che in
Intravascolare (Endovenosa, Endoarteriosa)
diversi casi farmaci sommiParenterali Intramuscolare
nistrati topicamente sono
Sottocutanea
capaci di entrare nel torrente
circolatorio in quantitativi
sufficienti da provocare effetti sistemici. Di solito tali effetti sono indesiderati. Esistono tuttavia
anche esempi di sistemi di rilascio controllato (es. cerotti transdermici) che hanno lo scopo di
assicurare la cessione graduale del farmaco alla circolazione sistemica. Viceversa, alcuni farmaci
somministrati per via sistemica (ad es. orale) hanno effetti prevalentemente topici (ad es. a livello
del tratto gastrointestinale, perchè sono caratterizzati da scarso assorbimento, oppure a livello
urinario, perchè, pur essendo bene assorbiti non raggiungono concentrazioni ematiche sufficientemente elevate e per un tempo suffcientemente lungo da esercitare un' azione sistemica).
Spesso si può scegliere la via attraverso la quale somministrare un agente terapeutico e
quindi ha importanza essenziale la conoscenza delle caratteristiche, dei vantaggi e degli svantaggi
delle differenti vie di somministrazione. Così, ad esempio, la via orale è conveniente, sicura ed
economica ma richiede la cooperazione del paziente, l’ assorbimento può essere variabile o limitato
ed essa può causare irritazione gastrica; la somministrazione intravascolare aggira gli eventuali problemi di assorbimento, produce un effetto rapido, permette un dosaggio esatto ma aumenta il rischio
di effetti indesiderati, non è normalmente impiegabile per sostanze
non sufficientemente idrosolubili e
Et
O
O
richiede personale specializzato; la
Pentobarbitale
via sottocutanea è adatta per soHN
NH
spensioni insolubili, ma può proO
durre dolore e necrosi.
La forte influenza della modalità di somministrazione di un
farmaco sull' inizio, sulla intensità
e sulla durata dell' azione è esemplificata nella figura accanto che
riporta il caso del pentobarbitale
(anestetico generale) somministrato per via endovenosa, intramuscolare, sottocutanea, rettale ed
orale nel coniglio.
9
Fase Farmacocinetica
Una volta che il farmaco somministrato si sia liberato dalla forma farmaceutica in cui è
contenuto e si sia reso disponibile per l’ assorbimento mediante solubilizzazione si verifica una
serie di eventi schematicamente illustrati nella figura seguente. Un farmaco si muove nell’ organismo secondo due modalità: per trasferimento di massa mediante la circolazione sanguigna e per
DEPOSITI
TISSUTALI
Legato
Libero
SITO D' AZIONE
Biopolimero bersaglio
Legato
Libero
CIRCOLAZIONE
SISTEMICA
Farmaco libero
ASSORBIMENTO
ESCREZIONE
Farmaco legato
Metaboliti
BIOTRASFORMAZIONE
trasferimento diffusionale. Mentre nel trasferimento mediante il flusso sanguigno le proprietà chimico-fisiche del farmaco non hanno grande influenza, le caratteristiche diffusionali differiscono
marcatamente tra i singoli farmaci. E’ in particolare il movimento tra i vari compartimenti (per
compartimento si intende un distretto dell' organismo omogeneo dal punto di vista farmacocinetico,
ad es. tratto gastrointestinale, sangue, tessuto adiposo), che generalmente comporta la penetrazione
di barriere idrofobiche, a determinare dove e per quanto tempo un farmaco sarà presente nell’ organismo.
Assorbimento
Con il termine di assorbimento si indica il trasferimento del principio attivo dal sito di
assorbimento al torrente circolatorio. Un assorbimento adeguato costituisce il presupposto per una
interazione significativa con il sito attivo e quindi per la produzione dell' effetto terapeutico.
Un farmaco, per abbandonare il sito di assorbimento, deve attraversare una complessa
barriera lipidica rappresentata da una o più membrane biologiche. Il processo di assorbimento è
assente nel caso di somministrazione intravascolare. Nella Tabella successiva sono indicate le
membrane assorbenti per le varie vie di somministrazione.
Vie di somministrazione e membrane assorbenti
Vie
Membrane
Orale
Sublinguale
Rettale
Intravascolare
Sottocutanea, Intramuscolare
Inalatoria
Epidermica
Mucose del tratto gastroenterico
Mucosa sublinguale
Mucosa rettale
Nessuna
Endotelio dei capillari vascolari e linfatici
Mucosa del tratto respiratorio
Epitelio cheratinizzato e annessi cutanei
10
Il passaggio attraverso le membrane biologiche è anche implicato nei successivi processi di
distribuzione, metabolismo ed escrezione poichè, in generale, i farmaci passano attraverso le cellule
e non tra cellula e cellula. Quindi le membrane biologiche rappresentano una barriera comune ai
movimenti dei farmaci. Sono perciò molto importanti i fattori chimico-fisici che influenzano il passaggio dei farmaci attraverso le membrane e che saranno esaminati più in dettaglio successivamente. Oltre ad essi, influiscono sul processo anche altri fattori quali la concentrazione del farmaco,
il flusso sanguigno che irrora il sito di assorbimento ed infine l' area della superficie assorbente.
I farmaci somministrati in soluzione acquosa vengono assorbiti più rapidamente di quelli
somministrati in sospensione o in forma solida. Per quelli somministrati in forma solida, la velocità
di dissoluzione può essere il fattore limitante nel loro assorbimento. La legge di
Noyes-Whitney esprime la dipendenza della velocità di dissoluzione da una seq DA(cs − c)
rie di parametri: D = coefficiente di dissoluzione; A = area superficiale totale
=
delle particelle di farmaco; cs = solubilità del farmaco; c = concentrazione del
t
h
farmaco al tempo t; h = spessore dello strato di diffusione, cioè del sottile film
stazionario adiacente alla superficie della particella solida con una concentrazione del farmaco pari
a cs. Uno dei parametri sui quali agire per aumentare la velocità di passaggio in soluzione è l’ area
superficiale complessiva A. Per rendere tale area elevata si può somministrare il farmaco in forma
micronizzata (cioè polverizzata mediante l’ impiego di un mulino a getto d’ aria) oppure facendo in
modo che finissime particelle di farmaco si generino nei pressi del sito di assorbimento. Ad esempio,
l’ aspirina è un acido debole ed è relativamente
Strato di
diffusione
Strato di
insolubile nel contenuto
diffusione
acido dello stomaco. La
aggiunta di una sostanza
Succo gastrico
tampone (idrossido di
pH 1-3
magnesio ed alluminio
Torrente
Ridissoluzione
glicinato basico) crea
circolatorio
Auno strato di diffusione
con un pH superiore a
Microprecipitato
pH 5-6
di AH
quello dello stomaco che
è in grado di solubilizzare il farmaco sotto forCO 2 H
Granulo di aspirina AH
con sostanza tampone
AH =
ma di sale. In un seconMembrana del tratto
OCOCH 3
gastroenterico
do tempo, venendo a
contatto per diffusione
con il pH più basso dello stomaco, l’ aspirina precipiterà come acido indissociato sotto forma di
finissime particelle che si scioglieranno poi rapidamente a causa dell’ elevato valore di A.
Un parametro farmacocinetico legato al grado di assorbimento e di metabolizzazione presistemica (cioè precedente all’ ingresso nella circolazione generale) di un farmaco è la sua
biodisponibilità, definita come la quota di farmaco che è in grado di raggiungere intatta la circolazione sistemica ed è disponibile per esercitare il suo effetto sistemico. Essa dipende non solo dalla
formulazione ma anche da variazioni nell’ attività di enzimi farmaco-metabolizzanti.
Se consideriamo ad esempio un farmaco somministrato per via orale che viene assorbito nel
tratto gastrointestinale, esso deve, prima di raggiungere la circolazione sistemica, entrare in contatto
con la mucosa intestinale e poi attraversare il fegato mediante la circolazione portale. Se il farmaco
viene in parte metabolizzato nell’ intestino e/o nel fegato (e ciò avviene comunemente), una quota
di esso verrà persa prima del raggiungimento della circolazione generale, anche nel caso di un
assorbimento completo. Con l’ espressione “effetto di primo passaggio” si intende la diminuzione di
biodisponibilità dovuta alla degradazione metabolica di un farmaco assunto per via orale nel corso
del primo passaggio nell’ intestino e nel fegato.
Si parla di biodisponibilità assoluta (indicata con F, fraction escaping metabolism) quando
viene misurata la quantità totale di farmaco che raggiunge la circolazione sistemica. Essa viene
11
Concentrzione plasmatica
generalmente confrontata con quella di una somministrazione per endovena per la quale si assume
una biodisponibilità completa, applicando un fattore correttivo nel caso di dosi diverse.
Il termine bioequivalenza si riferisce a due preparazioni diverse dello
stesso tipo per le quali non vi è apprezzabile differenza nella biodisponibilità
AUCorale Doseiv
del principio attivo.
100
F=
Oltre ad un esteso effetto di
AUCiv Doseorale
primo passaggio possono costituire motiIniezione
vo di scarsa biodisponibilità per un farendovenosa
maco: a) una bassa stabilità all’ ambienAUC iv
te acido dello stomaco; b) una bassa
idrosolubilità; c) una bassa liposolubiliAUC orale
tà. Infatti, la capacità di attraversare le
barriere idrofobiche di diffusione rappresentate dalle membrane cellulari è fortemente influenzata dalla liposolubilità,
Somministrazione
orale
mentre una certa idrosolubilità è necessaria per un adeguato assorbimento e per
il trasporto del farmaco dal momento che
è la diffusione acquosa a rilasciare le
tempo in ore
molecole di farmaco alle/e dalle barriere
AUC iv e AUC orale = aree sotto le curve della concentrazione plasmatica in funzione del tempo
relative alla somminstrazione per endovena ed orale, rispettivamente
non acquose.
Movimento dei farmaci attraverso le membrane cellulari
I doppi strati lipidici che costituiscono la matrice delle membrane cellulari sono
intrinsecamente impermeabili agli ioni ed alle molecole altamente polari. Per tali specie il passaggio
attraverso le membrane è eventualmente reso possibile dalla presenza di canalicoli acquosi o di
sistemi di trasporto specifici. Le molecole apprezzabilmente lipofile invece passano con relativa
facilità attraverso le membrane, diffondendo attraverso il doppio strato lipidico. I quattro principali
meccanismi di attraversamento delle membrane biologiche sono:
● diffusione attraverso i pori acquosi presenti sulla membrana (trasporto convettivo);
● diffusione passiva attraverso il doppio strato lipidico;
● trasporto mediato da una proteina trasportatrice (carrier);
● endocitosi.
La diffusione attraverso i pori è relativamente poco importante per i farmaci, in quanto i pori
sono di diametro troppo piccolo (circa 0.4 mµ) per consentire il passaggio della maggior parte di
essi. Comunque, molecole idrosolubili e di piccole dimensioni diffondono attraverso i canalicoli
acquosi con una velocità regolata dalla equazione a fianco in cui q è la
quantità di farmaco che attraversa la membrana di spessore ∆ nel tempo t, η
q nr 2 S (c1 − c2 )
=
è la viscosità del liquido negli n pori di raggio r con area superficiale S e c1t
η∆
c2 è il gradiente di concentrazione ai due lati della membrana.
Il processo di diffusione passiva è quello predominante nell’ assorbimento e nella distribuzione dei farmaci. Comporta la ripartizione del farmaco tra il fluido acquoso
in cui esso è disciolto ed i lipidi di membrana, la diffusione attraverso la membrana da un lato allo
altro e la ripartizione tra la membrana ed il fluido acquoso ricevente. La
velocità del processo q/t dipende dal gradiente di concentrazione c1-c2 ai
q SDP (c1 − c2 )
due lati della membrana, dalla superficie S della membrana, dal suo spes=
sore ∆ e dal coefficiente di ripartizione del farmaco tra fase lipidica (doppio
∆
t
strato) e fase acquosa P secondo la legge di Fick. D è il coefficiente di dif12
fusione, costituisce una misura della mobilità delle molecole all’ interno del doppio strato lipidico e varia solo leggermente tra i vari farmaci. P è il rapporto all’ equilibrio tra le concentrazioni del farmaco
in fase lipidica ed acquosa. Per la determinazione sperimentale di P si
impiega come fase lipidica n-ottanolo o CHCl3 ed un tampone fosfato
a pH 7.4 come fase acquosa. Come si evidenzia dalla legge di Fick, vi è una stretta correlazione tra
liposolubilità di un farmaco e permeabilità della membrana ad esso. Per questo motivo la liposolubilità costituisce uno dei fattori più importanti per le caratteristiche farmacocinetiche di un farmaco
e numerose proprietà quali il grado e la velocità di assorbimento nel tratto gastrointestinale, la
penetrazione nei tessuti e nel cervello ed il grado di eliminazione renale possono essere predette
dalla conoscenza della liposolubilità del farmaco. Un esempio del ruolo di P è illustrato nella figura
successiva in cui si osserva una soddisfacente correlazione lineare tra % di farmaco assorbito dal
colon di ratto e relativo coefficiente di ripartizione CHCl3/H2O per una serie di barbiturici.
[ farmaco ] fase lipidica
P=
[ farmaco ] fase acquosa
R
R'
O
P
CHCl3
H2O
400
50
.
.
.
.
.
.
HN
NH
Esetale
O
Secobarbitale
Pentobarbitale
5
.
..
R
R'
Esetale
Ciclobarbitale
Butetale
10
1
O
Secobarbitale
Allobarbitale
Aprobarbitale
Fenobarbitale
Pentobarbitale
Ciclobarbitale
Butetale
Barbitale
20
Allobarbitale
40
60
% Assorbimento
Aprobarbitale
Fenobarbitale
Barbitale
Sebbene i farmaci di elevata lipofilia e quindi con un elevato coefficiente di ripartizione
siano nella condizione di venire facilmente assorbiti, è tuttavia indispensabile che essi abbiano
anche un certo grado di solubilità in acqua, dal momento che i fluidi biologici sono per loro natura
acquosi. Quindi da un punto di vista pratico è necessario che i farmaci possiedano un corretto
rapporto tra lipofilia ed idrofilia. Si ha generalmente un buon assorbimento per valori di log P
compresi tra -2 e +4.
Un fattore complicante il processo di diffusione passiva è che molti farmaci sono acidi o
basi deboli e quindi esistono nelle forme non ionizzata ed ionizzata in equilibrio tra loro. Il rapporto
tra esse dipende dai valori di pK e di pH secondo
le note equazioni di Henderson-Hasselbach che
[
A−
B]
assumono le due forme indicate a fianco per un
pH = pK a + lg
; pH = pK a + lg
acido debole AH
A- + H+ e per una base
[AH ]
BH +
+
debole B
BH , rispettivamente (pKa è riferito
in quest' ultimo caso all' acido coniugato BH+). In
entrambi i casi le specie ionizzate BH+ e A- hanno una liposolubilità molto bassa e non sono
virtualmente in grado di permeare le membrane per diffusione passiva, mentre le specie neutre AH
e B per molti farmaci sono sufficientemente lipofile da permettere una rapida permeazione.
[ ]
[
]
13
+
+
La velocità con cui si attua in particolare il processo di assorbimento di un farmaco elettrolita debole per diffusione passiva è quindi proporzionale al gradiente di concentrazione ai due lati
della membrana della forma neutra. I fluidi biologici presentano una gamma piuttosto ampia di pH.
Così ad esempio, per quanto riguarda il tratto gastrointestinale, nello stomaco il pH è compreso tra 1
e 2 a causa della secrezione di HCl; dopo il piloro nel duodeno e poi nell’ ileo il pH sale a valori
compresi tra 4 e 7, per arrivare fino ad 8 nel colon. L’ ambiente acido dello stomaco sarà perciò più
adatto all’ assorbimento di acidi organici
deboli, mentre invece le basi organiche
% Farmaco
deboli saranno solo scarsamente assorAssorbito
bite. Nell’ intestino la situazione è rove60
sciata: l’ ambiente è favorevole all’ assorbimento delle basi deboli, mentre è
Acido debole
Base debole
50
avverso a quello degli acidi deboli.
Riportando tali conclusioni sotto forma
di grafico, si avranno due curve ‘a for40
bice’ per gli acidi e per le basi deboli. E’
il cosiddetto ‘concetto di ripartizione se30
condo il pH’. Tuttavia, la ripartizione secondo il pH non rappresenta il determinante principale del sito preferenziale di
20
assorbimento nel tratto gastrointestinale
ed i farmaci, indipendentemente dalla
loro natura, sono assorbiti soprattutto
10
nell’ intestino. Ciò in quanto l’ intestino
9
0
1
2
3
4
5
6
7
ha un’ area assorbente notevolmente su8
pH Apparato Digerente
periore a quella dello stomaco per la presenza di villi e di microvilli.
La ionizzazione influenza non solo la velocità con cui un farmaco permea le membrane ma
anche la sua distribuzione tra compartimenti acquosi a diverso pH. Se si assume che solo la forma
non ionizzata può attraversare la membrana e quindi raggiungere all’ equilibrio concentrazioni eguali ai due lati della
membrana, la concentraCOMPARTIMENTO 2
COMPARTIMENTO 1
zione totale (forma ionizMembrana
pH più basso
zata + forma non ionizzata)
pH più elevato
del farmaco sarà differente
nei due compartimenti, essendo un farmaco acido
[AH]2
[AH]1
maggiormente concentrato
nel compartimento a pH
più elevato. Tuttavia, i gra[A -]2
dienti che si deducono dai
[A -]1
calcoli in realtà non si verificano in misura così eleAll' equilibrio:
[AH]1 = [AH]2
vata, primo, poiché non è
[A -]1 < [A -]2
realistica una totale impermeabilità nei confronti
Quindi:
[AH]1 + [A ]1 < [AH]2 + [A ]2
della specie carica e, secondo, raramente i compartimenti dell’ organismo raggiungono una situazione di equilibrio.
Parecchie membrane cellulari possiedono meccanismi di trasporto specializzati che regolano
l’ entrata e l’ uscita di importanti molecole fisiologiche quali zuccheri, aminoacidi, neurotrasmettitori e ioni inorganici. Generalmente, i sistemi di trasporto coinvolgono una proteina transmembrana carrier che lega una o più molecole o ioni, subisce una variazione conformazionale e rilascia
14
le specie sull’ altro lato della membrana. Tali sistemi possono operare passivamente, senza
dispendio di energia; in tal caso essi semplicemente facilitano il processo nella direzione del
gradiente di concentrazione od elettrochimico e per ciò si
parla di diffusione facilitata. Inizialmente il sito di
Membrana
cellulare
legame per la specie trasportata si trova sul lato esterno
della membrana. Una volta che la specie si sia legata, ha
luogo una modificazione conformazionale che permette
alla specie di attraversare la membrana. La proteina
trasportatrice rilascia la specie all’ interno della cellula e
recupera la conformazione originaria. Il processo può
avvenire nei due sensi e la direzione del trasporto
dipende dai gradienti di concentrazione o elettrochimici.
Altri sistemi di trasporto sono invece accoppiati
ad una fonte di energia (ATP o gradienti ionici). In
questo caso il trasporto può avvenire contro gradiente di
concentrazione o elettrochimico (trasporto attivo). Tra i
vari meccanismi fisiologici di trasporto attivo vi sono
quelli coinvolti nella secrezione di ioni H+ nel succo
gastrico, nella captazione di iodio da parte della tiroide,
nel riassorbimento di glucosio e di aminoacidi dall’ urina
al sangue e la Na+/K+ATPasi, la cosiddetta pompa del sodio, che trasporta da un lato all’ altro delle membrane
cellulari ioni Na+ e K+, sfruttando l’ idrolisi dell’ ATP
come fonte di energia. La Na+/K+ATPasi è in grado di asDiffusione facilitata
sumere due conformazioni diverse a seconda che essa sia
fosforilata o no, con diversa affinità per i due ioni. Il sito
di legame per gli ioni è rivolto verso l' interno della cellula in una conformazione e verso l’ esterno
nell’ altra. Un modello di funzionamento della pompa del sodio è mostrato nella figura seguente.
ESTERNO
CELLULA
ATP
3Na+
Legame
INTERNO
CELLULA
3Na +
3Na+
Fosforilazione
P
Na+/K+ATPasi
Inversione
P
3Na+
2K +
Rilascio
Rilascio
P
2K +
Inversione
2K +
P
2K +
P
2K +
Defosforilazione
Legame
Modello di Funzionamento della Na + /K + ATPasi
15
3Na+
Il legame dell’ Na+ all’ interno della cellula attiva la fosforilazione della pompa. Il processo
modifica la sua conformazione, cosicchè il sito di legame per gli ioni è rivolto ora verso l’ esterno
della cellula. La nuova conformazione ha bassa affinità per lo ione Na+ che viene quindi rilasciato,
mentre ha alta affinità per lo ione K+ che si lega al posto dell’ Na+. Il legame con lo ione K+
promuove la defosforilazione della pompa. La pompa defosforilata non è stabile nella
conformazione con il sito di legame per gli ioni rivolto verso l’ esterno e si riconverte in quella
iniziale che ha bassa affinità per lo ione K+ che viene ceduto all’ interno della cellula.
Esigenza comune per l’ esistenza di un meccanismo di
CO 2H
trasporto di un farmaco mediato da un carrier è che vi sia una
O
certa somiglianza strutturale tra il farmaco ed un qualche subR
N CO 2H
strato fisiologico che attraversa la membrana cellulare servenH
N
N
N
dosi di tale sistema. Così, ad esempio, l’ antineoplastico metoR
H 2N N N
1
tressato utilizza il sistema di trasporto attivo dell’ acido folico.
Da un punto di vista farmacocinetico, vi sono comunque solo
Metotressato: R = NH 2; R 1 = CH 3
Acido folico: R = OH; R 1 = H
pochi distretti dell’ organismo nei quali il trasporto di farmaci
mediato da carriers è importante: tubuli renali, tratto biliare,
barriera ematoencefalica, tratto gastrointestinale.
A differenza della diffusione passiva in cui la velocità del trasporto cresce in proporzione diretta con il gradiente di concentrazione, nel trasporto mediato da carriers i siti del trasportatore si
saturano ad alte concentrazioni di farmaco e la
velocità non aumenta ulteriormente oltre tale punto.
Il termine endocitosi è riassuntivo delle due
denominazioni di fagocitosi e di pinocitosi con cui
si indicavano in precedenza l’ inglobamento, rispettivamente, di particelle solide e di soluti all’ interno della massa citoplasmatica. L’ endocitosi
comporta l’ invaginazione di una parte della membrana che ingloba il farmaco, la coalescenza delle
due facce della membrana, la separazione di una
vescicola che migra all’ interno della cellula dove
viene poi degradata dagli enzimi lisosomiali.
Questo meccanismo appare essere importante per il
trasporto di certe macromolecole come l’ insulina
che passa in tal modo la barriera ematoencefalica.
Distribuzione
Una volta che il farmaco abbia raggiunto il circolo, esso si distribuirà nei quattro principali
compartimenti acquosi dell’ organismo: fluido extracellulare (che comprende il plasma, il fluido
interstiziale e la linfa), fluido intracellulare (che è la somma dei fluidi contenuti in tutte le cellule
dell’ organismo) e fluido transcellulare (che comprende i fluidi cerebrospinale, intraoculare, peritoneale, pleurico e sinoviale e le secrezioni digestive). Per entrare nei compartimenti transcellulari da
quelli extracellulari, un farmaco deve attraversare una barriera cellulare. Un esempio particolarmente importante tra esse è la barriera ematoencefalica. La barriera ematoencefalica è una
barriera a permeabilità selettiva per la diffusione passiva di sostanze dal torrente circolatorio alle
varie regioni del sistema nervoso centrale (SNC). Non è completamente definita anatomicamente e
non è assoluta. La principale caratteristica strutturale che sta alla base della sua esistenza è la stretta
adesione degli astrociti alla membrana basale dei capillari. L’ SNC è inaccessibile a parecchi farmaci ad azione sistemica con insufficiente liposolubilità. Tuttavia, nel caso di infiammazione in forma di meningite si può avere una interruzione dell’ integrità della barriera ematoencefalica con conseguente possibilità di ingresso nell’ SNC di farmaci normalmente non permeanti.
16
In ognuno dei compartimenti acquosi, le molecole di farmaco esistono sia in forma libera
che in forma legata con componenti compartimentali; inoltre, i farmaci che sono acidi o basi deboli
sono soggetti anche all’ equilibrio di dissociazione. In definitiva, il profilo di distribuzione di un
farmaco tra i vari compartimenti dipende dai seguenti fattori:
●permeabilità tra le barriere tissutali;
●legame con i componenti compartimentali;
●ripartizione in funzione del pH;
●ripartizione tra fasi lipidiche e fasi acquose (coefficiente di ripartizione P).
Il volume apparente di distribuzione di un farmaco Vd è definito come il
volume di fluido richiesto per contenere la quantità totale di farmaco Q alla stessa
Q
concentrazione di quella presente nel plasma Cp. In altri termini è il volume che il
Vd =
Cp
farmaco occuperebbe se la quantità totale di esso nell’ organismo fosse in soluzione
ad una concentrazione uguale a quella plasmatica.
Il volume del plasma è ~ 0.05 lt/kg di peso corporeo. Farmaci con Vd intorno a
tale valore sono sostanze confinate nel compartimento plasmatico, poiché esse sono di dimensioni
troppo grandi per attraversare con facilità la parete dei capillari oppure, più spesso, a causa di un
forte legame con le proteine plasmatiche. Numerosi farmaci sono presenti nel plasma principalmente in forma legata con le proteine plasmatiche (in particolare albumina per i farmaci di natura
acida e α1-glicoproteina acida per i farmaci di natura basica). Alle normali concentrazioni terapeutiche, i siti di legame su tali proteine sono lontani dalla saturazione per cui la concentrazione di
farmaco legato varia in proporzione diretta con la concentrazione di farmaco libero. La relativa non
specificità dei siti di legame per numerosi tipi di farmaci fa si che si possa avere competizione tra
essi. La somministrazione di un farmaco B può cioè ridurre il legame con le proteine plasmatiche di
un farmaco A, somministrato in precedenza e quindi aumentarne la concentrazione della forma
libera, con conseguenze sull’ intensità della sua azione.
Il volume extracellulare totale è ~ 0.2 lt/kg e questo è approssimativamente il volume apparente di distribuzione per farmaci che non sono in grado di entrare facilmente nelle cellule a causa
della loro bassa liposolubilità e che quindi sono distribuiti prevalentemente nel compartimento
extracellulare.
I fluidi totali dell’ organismo si aggirano attorno ai 0.55 lt/kg. Questo volume di distribuzione è caratteristico di farmaci relativamente liposolubili che passano facilmente attraverso le membrane cellulari, non si legano ad alcun costituente tissutale e si distribuiscono quindi in maniera uniforme nell’ acqua corporea.
Infine, se un farmaco si lega selettivamente ad un qualche costituente tissutale al di fuori del
compartimento plasmatico, il valore del volume di distribuzione è superiore a quello totale della
acqua corporea dell’ organismo.
Escrezione
I farmaci vengono eliminati dall’ organismo immodificati o come metaboliti. Gli organi
escretori generalmente eliminano più facilmente i composti polari che le sostanze caratterizzate da
elevata liposolubilità. Il rene è l’ organo più importante per l’ eliminazione dei farmaci. Le sostanze
lipofile non sono eliminate facilmente dai reni. Di conseguenza, molti farmaci lipofili sono
metabolizzati a prodotti più polari i quali sono poi eliminati con le urine. L’ escrezione renale
implica tre processi: filtrazione glomerulare, secrezione e riassorbimento tubulari. Il primo ed il
terzo sono normalmente dei processi di diffusione passiva, mentre il secondo è un processo di
trasporto mediato da carriers. La quota di farmaco che entra nel lume tubulare per filtrazione
dipende dall’ entità del legame con le proteine plasmatiche, poiché solo la frazione di farmaco
libera viene filtrata. I principi che governano il riassorbimento dei farmaci dal filtrato glomerulare
sono gli stessi che sono stati esaminati per l’ assorbimento e la distribuzione. Farmaci con elevato
coefficiente di ripartizione sono facilmente riassorbiti. Il riassorbimento di acidi e basi deboli
dipende dal pH dell’ urina tubulare (4.5-8): gli acidi deboli sono scarsamente riassorbiti nel caso di
17
urine alcaline, così come le basi deboli in urine acide. Le cellule dei tubuli prossimali trasportano
attivamente numerose sostanze dal plasma all’urina tubulare. Oltre a meccanismi di trasporto attivo
specifici, esistono due sistemi di trasporto relativamente aspecifici, uno per i cationi organici, l’ altro per gli anioni organici, utilizzabili da numerosi farmaci.
Alcuni farmaci e metaboliti di farmaci che si formano nel fegato sono secreti nella bile. Tali
sostanze hanno in genere un peso molecolare superiore a 500, mentre i composti con peso molecolare compreso tra 300 e 500 si ripartiscono tra bile ed urine. Il trasporto nella bile è mediato da carriers aspecifici. Essi sono poi escreti con le feci o riassorbiti dall’ intestino (in tal caso si instaura un
circolo enteroepatico). L’ escrezione polmonare è importante esclusivamente per le sostanze gassose o altamente volatili. Infine, i farmaci possono essere eliminati anche con il latte materno o il
sudore.
Metabolismo
I farmaci subiscono nell’ organismo in misura differente una serie di modificazioni, prevalentemente enzimatiche, con formazione di uno o (generalmente) più prodotti di biotrasformazione
(metaboliti). Solo in pochi casi, il farmaco viene eliminato completamente inalterato. Già nel tratto
gastrointestinale, i farmaci possono essere modificati per l’ azione idrolitica dell’ ambiente acido
dello stomaco. Di gran lunga più importanti sono però i processi di trasformazione enzimatica in
vari organi e tessuti.
Il metabolismo di un farmaco può essere influenzato da vari fattori fra cui: fattori genetici,
fattori fisiologici (età, sesso, razza), fattori farmacodinamici (dose, frequenza e via di somministrazione) e fattori ambientali (interazioni con altri farmaci ed altre sostanze in genere).
La sede principale del metabolismo dei farmaci è il fegato. Sistemi enzimatici farmacometabolizzanti sono presenti anche nell’ intestino, nei reni, nei polmoni, nel tessuto nervoso e nel
plasma.
I prodotti di biotrasformazione sono generalmente più polari e meno lipofili dei loro progenitori e ciò ne favorisce l’ eliminazione. Il metabolismo inoltre porta di solito ad una attenuazione o
ad una perdita completa di attività. Meno frequentemente, può tuttavia verificarsi la formazione di
metaboliti attivi, alcune volte con lo stesso tipo di attività del farmaco di orgine, altre volte invece
con una attività diversa, potenzialmente utile oppure fonte di effetti indesiderati.
Le reazioni metaboliche sono suddivise in due categorie principali: reazioni della fase I e
reazioni della fase II. Nella pagina seguente è mostrato lo schema generale del metabolismo dei
farmaci e la localizzazione subcellulare degli enzimi coinvolti.
Le reazioni di fase I comprendono reazioni di ossidazione, riduzione ed idrolisi ed
introducono nella molecola di farmaco nuovi gruppi funzionali oppure modificano quelli esistenti
con il risultato di convertire il farmaco in un metabolita più polare che può essere più o meno attivo
del progenitore, possedere un’ attività diversa, oppure essere completamente inattivo. Le reazioni
della fase II sono invece reazioni in cui il farmaco di origine (o un suo metabolita della fase I) è
condensato con un substrato endogeno (coniugante) di natura glicidica, lipidica o aminoacidica per
dare i cosiddetti coniugati. Essi sono, con qualche eccezione, meno attivi rispetto ai loro precursori,
oppure, più spesso, completamente inattivi. Anche le reazioni della fase II normalmente portano ad
una diminuzione della liposolubilità. Le reazioni della fase I introducono spesso nel farmaco gruppi
funzionali che servono come punti di attacco per i sistemi coniuganti della fase II. Perciò, la
maggior parte dei farmaci viene coinvolta sequenzialmente nelle due fasi.
Reazioni della Fase I
Reazioni di Ossidazione
Ve ne sono di due tipi principali: quelle microsomiali e quelle non microsomiali. Le prime
sono catalizzate da sistemi enzimatici presenti nel reticolo endoplasmatico liscio, soprattutto, ma
18
non esclusivamente degli epatociti. Sono indicati come enzimi microsomiali in quanto, a seguito di
omogeneizzazione, il reticolo endoplasmatico liscio viene demolito in piccoli frammenti che si
richiudono in vescicole chiamate microsomi che possono poi essere isolati per centrifugazione
differenziale dell’ omogenato tissutale nella frazione microsomiale.
Schema Generale del Metabolismo dei Farmaci e Localizzazione degli Enzimi Coinvolti
Reazioni Metaboliche
Localizzazione Enzimi
Reazioni della Fase I
Ossidazioni
Microsomi
Microsomi
Microsomi
Microsomi, Mitocondri
Microsomi, Citosol
Citosol
C-Ossidazione
N, S-Ossidazione
N, O, S-Dealchilazione
Deaminazione
Ossidazione di Alcoli
Ossidazione di Aldeidi
Riduzioni
Microsomi, Citosol
Microsomi
Citosol
Nitroriduzione
Azoriduzione
Riduzione di Aldeidi
Idrolisi
Microsomi, Citosol
Microsomi, Citosol
Idrolisi di Esteri
Idrolisi di Ammidi
Reazioni della Fase II (Coniugazioni)
Microsomi
Citosol
Microsomi, Mitocondri
Citosol
Mitocondri, Citosol
Citosol
Glicuronazione
Solfoconiugazione
Coniugazione ippurica
Mercapturazione
Acetilazione
Metilazione
CH 3
H 3C
N
N
Fe
N
N
CH 3
CH 3
-O 2CH 2CH 2C
CH 2CH 2CO 2-
Ferroprotoporfirina IX
Gli enzimi microsomiali sono delle monoossigenasi, enzimi che catalizzano l’ inserzione di uno dei due atomi dell’ O2
nella molecola del farmaco AH che viene ossidato ad AOH
mentre l’ altro atomo di ossigeno viene ridotto ad H2O. La principale monoossigenasi farmaco-metabolizzante è il citocromo
P-450 (CYP450). I citocromi sono una ampia categoria di proteine enzimatiche coinvolte in reazioni ossidoriduttive che possiedono come cofattore l’ eme, cioè il sistema ferro-protoporfirinico. Sono quindi eme proteine. Ne esistono di tre classi
principali: a, b, c individuate in base alla natura delle catene
laterali dell’ eme. Il citocromo P-450 appartiene alla classe b,
come la mioglobina e l’ emoglobina ed il suo sistema eme è la
19
ferroprotoporfirina IX. Il ferro oscilla tra gli stati di ossidazione +2 e +3. Delle sei posizioni di
coordinazione del ferro(II) quattro sono impegnate con l’ anello porfirinico, il quinto ligando è un
residuo di cisteina dell’ apoenzima, mentre il sesto è un ligando facilmente scambiabile (probabilmente H2O). Il nome del’ enzima deriva dal fatto che il complesso della forma ferrosa con l’ ossido
di carbonio forma un composto rosa (pink) che presenta un massimo di assorbimento a ~ 450 nm. Il
sistema P-450 comprende un’ ampia famiglia (superfamiglia) di enzimi con diverse specificità, divisa in famiglie ed in sottofamiglie. Questi enzimi vengono descritti con la sigla CYP seguita da un
numero arabo (famiglia), da una lettera (sottofamiglia) e da un altro numero arabo (gene individuale). Le famiglie coinvolte nel metabolismo dei farmaci sono CYP1-4.
L’ ossidazione ad opera del citocromo P-450 richiede ossigeno molecolare, NADPH che
trasferisce due elettroni all’ ossigeno ed una flavoproteina (NADPH-P-450 reduttasi) che assicura la
cessione al P-450 di un elettrone per volta. Il ciclo catalitico del citocromo P-450 è illustrato nella
figura seguente.
Il substrato AH si
combina con la forma osP-450-AH
+
sidata del citocromo P2H
H2O
O2Fe3+.O22450 (Fe3+) che viene successivamente ridotta alla
NADPH
FAD
forma Fe2+ dalla flavoP-450-AH
proteina. Il complesso riFe2+.O2P-450
dotto lega O2 per dare un
1e(Fe=O)3+.AH
complesso ternario. Un
P-450-AH
secondo elettrone converFe2+.O2
te l' ossigeno in radicale
-2eAOH
O2
O2-. Il risultante complesFADH.
so attivato ed altamente
P-450-AH
instabile si dissocia con
Fe2+
P-450
1eformazione di H2O e di
3+
Fe
un complesso ossene ferAH
P-450-AH
ro
perferrile–farmaco
V
Fe3+
(Fe =O)3+.AH. Quest’ ulFADH2
NADP+
timo astrae un atomo di
idrogeno dal substrato
.
per formare una coppia di radicali liberi A ·(FeIVOH)3+. La loro ricombinazione produce il farmaco
ossidato AOH con rigenerazione del citocromo nello stato iniziale. Il donatore finale di elettroni è
NADPH.
AH+ NADPH + H+ + O2 → AOH + NADP + H2O
+
Sito
reattivo
CONH 2
O
-
+
N
O P O
O
NH 2
N
O
H
CONH 2
NADP +
NADPH
H 3C
H 3C
N
N
N
O P O
H
N
R
O
HO OH
H + , 2e-
O
-
N
O
NH
N N O
H H
H OH
H OH
NH 2
H OH
N
N
H H
O O
N N
O PO P O O
O- O-
FAD
HO OPO 3 2-
NICOTINAMIDE ADENIN
DINUCLEOTIDE FOSFATO
2H + , 2e-
HO OH
H 3C
H 3C
H O
N
N N
H
R
NH
O
FADH 2
H 3C
H 3C
. O
N
NH
N N O
H
R
FADH .
FLAVIN ADENIN DINUCLEOTIDE
20
Le principali reazioni di ossidazione catalizzate dal citocromo P-450 sono riassunte nella
tabella seguente.
OSSIDAZIONI MICROSOMIALI
Ossidrilazione Aromatica
R
R
OH
Ossidrilazione Alifatica
RCH 2OH
RCH 3
N-Ossidazione (di Ammine Terziarie)
+
R 3N
R 3N
_
O
+
R 3N
OH
N-Ossidrilazione (di Ammine Primarie e Secondarie)
RNH 2
RNO
RNHOH
RR'NOH
RR'NH
Deaminazione (di Ammine Primarie a-Sostituite)
R
RCHNH 2
R
OH
R'
R'
NH 2
O
R'
N-Dealchilazione (di Ammine Terziarie e Secondarie)
RNMe2
RN
RNHMe
CH 2OH
RNHMe
Me
RNH 2
RNHCH 2OH
O- ed S-Dealchilazione
RXMe
RXH
RXCH 2 OH
(X = O o S)
S-Ossidazione
+
RSR'
RSR'
OH
+
RSR'
_
O
Desolforazione (di Esteri Organotiofosforici)
P
S
P
O
L’ ossidazione di atomi di carbonio aromatici produce fenoli. Per i benzeni monosostituiti,
predomina di solito la para-ossidrilazione. La posizione della ossidrilazione può essere influenzata
21
dalla natura dei sostituenti sull’ anello in accordo con le regole di orientamento della sostituzione
elettrofila aromatica. Vanno considerati anche i fattori sterici, poiché la ossidazione avviene
comunemente sulle posizioni meno impedite.
L’ ossidrilazione dei composti aromatici ad opera del citocromo P-450 procede attraverso la
formazione di intermedi arene ossidi (epossidi). Tali specie piuttosto instabili possono: a)
riarrangiarsi non enzimaticamente a fenoli; b) trasformarsi enzimaticamente per idratazione in 1,2diidrodioli a configurazione trans i quali vengono deidrogenati a 1,2-difenoli, c) coniugarsi
enzimaticamente con il glutatione per dare acidi premercapturici (schema seguente). Il glutatione è
un tripeptide presente in tutte le cellule con funzioni protettive, agente come riducente nei confronti
di perossidi tossici: 2GSH + H2O2 → GSSG + 2H2O e come coniugante nei confronti di specie
elettrofile: GSH + E+ → GSE + H+.
R
R
+
H
H
R
Spontanea
R
R
O-
OH
R
"NIH Shift"
+
H
H
H
H 2O
O Epossido
H
Idrasi
Glutatione
S-Transferasi GSH
H
O-
H
O
R
R
[O]
OH
R
OH
OH
OH
SH
OH
O
GSH = H 2 N
N
H
SG
CO 2 H
H
N
CO 2H
O
Glutatione
L’ importanza relativa delle tre vie è influenzata dalle proprietà elettroniche dell’ arene ossido: sostituenti elettronattrattori stabilizzano l’ arene ossido, mentre sostituenti elettrondonatori lo
destabilizzano e quindi ne indirizzano la decomposizione verso il riarrangiamento spontaneo. Lo
‘NIH shift’ [messo in evidenza presso il National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA)]
consiste nella migrazione di uno ione idruro.
Oltre al glutatione, possono reagire con gli arene ossidi anche altri nucleofili biologici. La
formazione di legami covalenti tra epossidi bioattivi e componenti macromolecolari cellulari è alla
base dei possibili gravi effetti tossici di tali intermedi quali mutagenesi, cancerogenesi, necrosi
tissutale.
Le catene alifatiche sono ossidrilate più frequentemente sull’ ultimo o sul penultimo atomo
di carbonio. I sistemi alifatici ciclici sono di solito ossidrilati sugli atomi di carbonio meno impediti
stericamente oppure su quelli attivati (ad esempio in α ad un C=O). Analogamente, sono ossidrilati
preferenzialmente i carboni sp3 attivati nelle posizioni alliliche, benziliche, propargiliche ed in α ad
eteroatomi quali N, O, S (figura successiva).
22
R
CH 2
R
CH 3OH CH 3
R
CH 2
OH
CH 3
R
CH 2OH
OH
R
R
R
OH
O
OH
R
X
R
R
X
XH + H
X = O, NR', S
Per quanto riguarda la N-dealchilazione, i gruppi alchilici vengono rimossi ossidativamente
uno alla volta ad iniziare dal gruppo più piccolo. In genere, le ammine terziarie sono dealchilate a
secondarie più rapidamente delle secondarie a primarie; si verifica pertanto un sensibile accumulo
di ammine secondarie e primarie come metaboliti e spesso esse contribuiscono all’ azione farmacologica della sostanza progenitrice.
Anche nel caso delle O- ed S-dealchilazioni, la velocità della reazione è funzione della
lunghezza della catena alifatica che viene rimossa: un aumento della lunghezza diminusce la
velocità.
La maggior parte dei
prodotti di N-ossidazione è
O
H+
bioinattivata a prodotti pola+
NH
NH 2
NHOH
-H 2 O
ri che sono facilmente escreti con le urine. In alcuni casi,
tuttavia, la N-ossidazione
H
può generare metaboliti reatNu+
Nu
NH 2
NH
NH
tivi e tossici. Ad esempio, le
Nu
idrossilammine derivanti da
eccetera
ammine aromatiche possono
evolvere in urine acide a ioni nitrenio i quali reagiscono covalentemente con nucleofili biologici,
comportandosi quindi da cancerogeni.
Nelle frazioni mitocondriali e
OSSIDAZIONI NON MICROSOMIALI
citosoliche sono presenti altre ossidasi che
catalizzano le reazioni indicate a fianco.
Ossidazione di Alcoli
L’ alcool deidrogenasi è un enzima
localizzato nella frazione solubile degli
RCHO
RCH 2OH
omogenati tissutali (citosol) che ossida la
RR'CHOH
RR'CO
maggior parte degli alcoli primari ad aldeidi;
Ossidazione di Aldeidi
solo alcuni alcoli secondari sono convertiti a
chetoni, mentre altri alcoli secondari e tutti
RCO 2H
RCHO
quelli terziari sono escreti inalterati oppure
Deaminazione Ossidativa
come metaboliti coniugati.
RCH 2NH 2
RCH=NH
RCHO
Le aldeidi, sia quelle prodotte per ossidazione
degli alcoli primari che quelle otOssidazione di Purine
tenute per deamminazione ossidativa delle
SH
SH
ammine (vedi successivamente), sono ossiN
N
N
N
date ad acidi da una serie di enzimi quali alOH
deide deidrogenasi, aldeide ossidasi, xantina
N
N
N
N
OH
H
H
ossidasi.
6-Mercaptopurina
Acido 6-tiourico
23
L’ ossidazione ad opera dell’ alcool deidrogenasi è la principale via di metabolizzazione dell’ etanolo ad acetaldeide (~ 2/3), che viene poi a sua volta ossidata ad acido acetico dall’ aldeide deidrogenasi; il rimanente ~ 1/3 viene invece ossidato da un sistema enzimatico microsomiale (MEOS,
microsomal ethanol oxidizing system). Il metanolo viene ossidato piuttosto lentamente a formaldeide dall’ alcool deidrogenasi (velocità ~ 1/6 rispetto a quella dell’ EtOH) e ciò costituisce la base
dell’ impiego dell’ EtOH nel trattamento delle intossicazioni acute da MeOH. L’ EtOH deprime ulteriormente la velocità della ossidazione dell’ MeOH a CH2O (metabolita tossico, così come l’ acido formico che si forma per successiva ossidazione della formaldeide), agendo come substrato competitivo per l’ enzima.
Le monoammino ossidasi (MAO) e le diammino ossidasi (DAO) catalizzano la deamminazione ossidativa delle ammine ad aldeidi. Le MAO sono enzimi mitocondriali esistenti in due forme,
A e B, ed i loro substrati sono le monoammine primarie prive di sostituenti sul carbonio in α
RCH2NH2. Le ammine secondarie vengono ossidate dalle MAO a patto che il sostituente sia un
gruppo metilico RCH2NHMe. Fisiologicamente, esse intervengono nella regolazione della degradazione metabolica nei tessuti neurali delle catecolammine e della serotonina, ammine biogene con
funzione di neurotrasmettitori; inoltre svolgono un ruolo cruciale nella inattivazione delle monoammine circolanti e di quelle presenti negli alimenti (tiramina) o prodotte da essi nel tratto gastointestinale.
OH
NH 2
HO
HO
NH 2
Norepinefrina o
Noradrenalina
Tiramina
HO
OH
HO
NHMe
HO
HO
Epinefrina o
Adrenalina
NH 2
CATECOLAMMINE
Triptamina
N
H
NH 2
NH 2
HO
Serotonina
Dopamina
N
H
HO
Le diammine del tipo H2N(CH2)nNH2 con n < 6 non sono attaccate dalle MAO. Se la
distanza intramolecolare tra i due gruppi NH2 cresce, la velocità di ossidazione da parte delle MAO
aumenta. Le DAO (enzimi citosolici presenti nei reni,
NH 2
nell’ intestino, nel fegato, nei polmoni e nel tessuto nerN
N
CHO
voso) attaccano tutte le diammine e l’ istamina, formanN
N
do, come le MAO, aldeidi. Esse svolgono un importante
H
H
ruolo di regolazione degli effetti biologici dell’ istamina
Istamina
e delle poliamine biogene quali putrescina
H2N(CH2)4NH2, spermina H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2 e spermidina H2N(CH2)3NH
(CH2)4NH2.
Numerosi derivati purinici vengono ossidati ad analoghi dell’ acido urico ad opera della xantina ossidasi, un enzima citosolico che interviene fisiologicamente negli stadi finali del catabolismo
dei nucleotidi derivanti dalla degradazione degli acidi nucleici. Se le basi puriniche libere che si formano per idrolisi dai nucleotidi non vengono recuperate e riutilizzate, esse sono trasformate in acido urico che viene escreto nelle urine (schema pagina successiva).
Reazioni di Riduzione
Oltre a sistemi ossidativi, i microsomi epatici contengono sistemi enzimatici che catalizzano
la riduzione di azo- e nitrocomposti ad ammine primarie: RN=NR’ → RNH2 + R’NH2 e RNO2 →
24
RNH2. Sono reazioni quantitativamente meno importanti di quelle di ossidazione, ma possono
essere di notevole significato farmacologico quando producono metaboliti attivi o tossici. Nella
riduzione di azo- e nitrocomposti intervengono anche enzimi della flora batterica nell’ ambiente
anaerobico dell’ intestino.
NH 2
O
N
N
N
HN
N
N
N
H
N
Ipoxantina
Nucleotidi Adeninici
O
O
HN
H 2N
HN
N
N
N
Xantina Ossidasi
O
N
N
H
N
H
Xantina Ossidasi
Xantina
Nucleotidi Guaninici
O
HN
NUCEOTIDI PURINICI
O
NH
N
N
H
H
Acido urico
O
Reazioni di Idrolisi
Le principali rezioni di idrolisi ad opera di idrolasi riguardano esteri ed ammidi. Nella
maggior parte dei casi la reazione porta a metaboliti inattivi ed idrofili che sono escreti rapidamente.
Una importante esterasi presente nel plasma e nei tessuti nervosi è l’ acetilcolinOCOCH 3
OH
+
+
Acetilcolinesterasi
Me 3N
Me3N
esterasi che idrolizza l’ acetilcolina e deAcetilcolina
Colina
termina così la cessazione della sua azione neurotrasmettitrice.
Gli esteri stericamente impediti sono idrolizzati più lentamente e possono comparire inalterati nelle urine. Così avviene, ad esempio, per circa il 50% di atropina, mentre il rimanente è costituito da prodotti di biotrasformazioni non idrolitiche.
Di regola, le ammidi sono
più
stabili
all’ idrolisi degli esteri.
H 3C N
H 2N
CONHCH 2 CH 2NEt2
Questo fatto è stato ad esempio
sfruttato nello sviluppo dell’ antiProcainamide
aritmico procainamide. La procaina,
OH
l’ estere corrispondente, utilizzato
O
H 2N
CO 2 CH 2CH 2 NEt2
come anestetico locale, non si presta invece all’ impiego come antiO
Procaina
aritmico a causa della sua rapida
Atropina
idrolisi.
Reazioni della Fase II
Come già accennato in precedenza, le reazioni di coniugazione legano una molecola
endogena (coniugante) o al farmaco originale (se esso già contiene funzioni polari), oppure ad un
suo metabolita della fase I. I coniugati sono di solito privi di attività farmacologica, pur con alcune
25
notevoli eccezioni. Inoltre, essi sono spesso più polari ed idrosolubili della molecola di partenza e
sono escreti facilmente per via renale. Tuttavia, certe coniugazioni quali l’ acetilazione e la
metilazione portano a metaboliti più lipofili. Le reazioni di coniugazione sono catalizzate da
transferasi, presenti in numerosi tessuti (fegato, reni, polmoni, cute, tratto gastrointestinale e tessuto
nervoso) e localizzate nei microsomi e nel citosol. Esse possono competere per la stessa funzione
polare di un farmaco e quindi originare coniugati chimicamente distinti.
Coniugazione Glicuronica (o Glucuronica) o Glicuronazione (o Glucuronazione)
Consiste nel trasferimento
di una molecola di acido glicuronico al farmaco dall’ acido
O
uridin-5’-difosfo-α-D-glicuronico
CO 2H
H
N
(UDPGA), la forma attivata del
O
OH
O
O
coniugante. La reazione è catalizO
N
HO
O P O P O
zata da una UDP-glicuronosil
O
OH
O
transferasi, un enzima microsoO
miale presente soprattutto nel feUDPGA
OH
OH
gato. Interessa farmaci con gruppi
(Acido uridindifosfoglicuronico)
funzionali quali ossidrili, carbossili, ammine, ammidi, tioli. I gliROH
RCO 2H
RNH 2
RSH
curonidi risultanti hanno configurazione β. E’ la coniugazione più
frequente, sia per l’ ampia varietà
CO 2 H
CO 2H
CO 2H
CO 2H
di gruppi funzionali che possono
O OCOR
O SR
O OR
O NHR
OH
OH
essere coniugati che per l’ abbonOH
OH
dante disponibilità nell’ organiHO
HO
HO
HO
OH
OH
smo di UDPGA. Non tutti i gliOH
OH
curonidi sono escreti per via renale. Alcuni vengono secreti con la bile nell’ intestino; gli enzimi β-glicuronidasi qui presenti possono
idrolizzare i coniugati e ridare il farmaco libero che può essere riassorbito e rientrare in circolo.
Generalmente i glicuronidi sono biologicamente inattivi e sono pronHO 3
tamente eliminati senza interazioni con sostanze intracellulari. Una eccezione importante è rappresentata dalla morfina, la quale forma nel fegato e nell’ intestino due O-glicuronidi, uno a carico dell’ OH fenolico in
O
Me
posizione 3 e l’ altro su quello alcolico in posizione 6. Quest’ ultimo è
N
presente in circolo a concentrazioni doppie di quelle della morfina ed ha
attività analgesica superiore ad essa.
HO 6
Morfina
GLICURONAZIONE
Solfoconiugazione
SOLFOCONIUGAZIONE
O
-
O
S
O
O
O
P
O
N
O
O
-
P
O
NH 2
O
-
O
N
N
PAPS
=
(3'-fosfoadenosin-5'-fosfosolfato) O 3PO OH
RO H
ROSO 3 -
N
La solfoconiugazione consiste nel trasferimento del gruppo SO3- dal coniugante attivato 3’fosfoadenosin-5’-fosfosolfato (PAPS) ad un accettore (comunemente un alcool oppure un fenolo) con
formazione di solfati ROSO3-. Il gruppo SO3- può
essere anche trasferito come processo secondario ad
ammine o tioli con formazione di solfamati
RR’NSO3- e di tiosolfati RSSO3-, rispettivamente.
La reazione è catalizzata da solfotransferasi citosoliche ed è spesso in competizione con la O-glicuronazione. Il pool di PAPS è in genere limitato e a
26
basse dosi di farmaco prevale la formazione di solfati mentre a dosi più elevate predomina la Oglicuronazione.
Coniugazione con Glicina e Glutamina (Coniugazione Ippurica)
Gli acidi aromatici, eteroaromatici ed arilalchilici sono i substrati più comuni per la
formazione di coniugati con la glicina o, meno frequentemente, con la glutamina. La sequenza
metabolica è mostrata nello schema seguente ed è catalizzata da enzimi mitocondriali.
CONIUGAZIONE IPPURICA
Acil CoA sintetasi
RCO 2H
RCO-S-CoA
RCO-AMP
ATP
PPi
CoA-SH AMP
transacilasi
RCONHCHCO 2H
H 2NCHCO 2H
R'
R'
R'= H: glicina
R'= CH 2CH 2CONH 2: glutamina
RCO-S-CoA
O
RC
-O
-O P
O
O
-O
-O
P O
P
O
O
N
O
ATP
HSCH 2CH 2 NHCOCH 2CH 2 NH
NH 2
OH
O
N
N
N
HO OH
NH 2
H
CH 3
C
C
C
O
OH CH 3
CH 2
O
P
O
N
-O
-O
O
R C
RCO-AMP
O
P
O
O
O
N
N
N
CoA-SH
O OH
AMP
-O
RCO-S-CoA
P
O-
O
L’ acido carbossilico RCO2H viene attivato in due stadi dall’ acil CoA sintetasi: dapprima si
forma una anidride mista RCO-AMP (acil adenilato) che viene poi convertita in RCO-S-CoA (acil
coenzima A). Il coenzima A, CoA-SH, è un trasportatore biologico universale di gruppi acilici RCO,
in particolare acetilici CH3CO, attivati (da cui il nome, A sta per acetilazione) ed è una molecola
fondamentale per il metabolismo.
Il tioestere formatosi reagisce con glicina o glutamina ad opera di una N-acil transferasi (o
transacilasi) per dare il coniugato ammidico. Il nome
CO 2H
CONHCH 2CO 2 H
coniugazione ippurica deriva dal fatto che l’ acido benzoico subisce tale coniugazione per dare con la glicina acido
acido ippurico
ippurico, cioè la N-benzoilglicina.
27
Coniugazione con il Glutatione (Mercapturazione)
Il glutatione (γ-L-glutamil-L-cisteinilglicina, GSH) è un tripeptide di importanza fondamentale nei processi di detossicazione dei
farmaci e di altre sostanze estranee all’ organismo (xenobiotici). Le
HS
N
CO 2H
H
proprietà nucleofile del suo gruppo tiolico lo rendono un efficace agente
HN
NH 2
coniugante (vedi anche pag. 22). Inoltre esso può intervenire anche in
O
reazioni di ossidoriduzione in dipendenza del suo stato redox (GSH o
Glutatione
GSSG). Le reazioni del GSH possono essere enzimatiche oppure non
enzimatiche.
Nella mercapturazione si formano i cosiddetti acidi mercapturici (S-derivati della N-acetil-Lcisteina) da specie elettrofile che subiscono una coniugazione iniziale con il GSH, catalizzata da
una glutatione transferasi (GST), un enzima citosolico presente in particolare nel fegato e nei reni
(schema seguente).
O
CO 2H
MERCAPTURAZIONE
CO 2 H
O
HS
N
H
HN
CO 2 H
Glutatione (GSH)
NH 2
O
E+
(specie elettrofila)
glutatione S-transferasi
O
E-S
CO 2 H
N
H
HN
CO 2 H
NH 2
O
γ-glutamil transferasi
O
CO 2 H
cisteinil glicinasi
E-S
NH 2
N
H
E-S
CO 2 H
NH 2
N-acetiltransferasi
Acido mercapturico
E-S
CO 2 H
NHCOCH 3
Una volta formatisi, i coniugati con il glutatione GS-E non vengono generalmente escreti
come tali, ma subiscono ulteriori trasformazioni da parte di una serie di enzimi microsomiali: la
scissione consecutiva dei due legami peptidici del glutatione ad opera di una glutamil transferasi e
di una cisteinil glicinasi (queste reazioni avvengono prevalentemente a livello renale) e la
28
R CH 2
X
R CH 2
SG
(X = Cl, Br...)
SG
X
Z
Z
Acetilazione
(Z = gruppo
elettroattrattore)
R
R''
R R'
R'
R''
R'''
O
R'''
HO
R'
R
acetilazione finale del gruppo amminico della cisteina
ad opera di una acetil transferasi nel fegato conducono
appunto agli acidi mercapturici.
Alcune delle principali reazioni di mercapturazione
sono mostrate nella figura a fianco.
SG
Le più frequenti reazioni di questo tipo
coinvolgono gruppi amminici. Il coniugante endogeno è
l’ acetil coenzima A, CH3CO-S-CoA e la reazione è
catalizzata da una varietà di N-acetiltransferasi.
R R'
R''
Z
GS
R''
(Z = gruppo
elettroattrattore)
CH 3 CO-S-CoA
CoA-SH
Z
R NHCOCH 3
R NH 2
H
N-acetil transferasi
Le ammine aromatiche primarie sono acetilate
in misura notevole; altri substrati sono ammine alifatiche primarie, idrazine RNHNH2, idrazidi,
RCONHNH2, solfonammidi RSO2NH2.
Metilazione
METILAZIONE
H2N
N
CH 3
HO 2 CCHCH 2 CH 2
NH 2
S
+
O
N
N
N
SAM
(S-adenosilmetionina)
OH OH
ArOH, RNH 2, RNHR', RR'R''N
Metiltransferasi
ArOMe, RNHMe, RR'NMe, RR'R''N + Me
La metilazione è di maggior significato per le
sostanze endogene che per i farmaci. Differisce dalle
altre reazioni di coniugazione per il fatto che i prodotti formati possono in certi casi avere una attività
simile o superiore a quella dei progenitori. L’ agente
metilante è la S-adenosilmetionina (SAM) ed i substrati di metiltransferasi più o meno specifiche sono
ammine alifatiche (primarie, secondarie e terziarie),
eterocicli azotati, fenoli e tiofenoli.
Nello schema successivo è infine mostrato il
coinvolgimento del SAM nella biosintesi e nella inattivazione metabolica di alcune catecolammine.
OH
NH 2
MeO
HO
SAM
Normetanefrina
(inattiva)
COMT
OH
HO
HO
SAM
PNMT
HO
Norepinefrina
(Noradrenalina)
OH
OH
NH 2
HO
NHMe
Epinefrina
(Adrenalina)
COMT= Catecolo O-Metil Transferasi
PNMT= Feniletanolamina N-Metil Transferasi
29
MeO
SAM
COMT
HO
NHMe
Metanefrina
(inattiva)
Fase Farmacodinamica
Introduzione
La fase farmacodinamica descrive il comportamento del farmaco al sito d’ azione (o biofase),
quel distretto dell’ organismo cioè in cui il farmaco interagisce con un bersaglio biologico specifico
e da tale interazione scaturisce una variazione di un qualche processo o di una qualche funzione
fisiologica ed in ciò consiste l’ effetto farmacologico del farmaco. I farmaci quindi agiscono
influenzando (potenziando o deprimendo a seconda dei casi) funzioni normali e preesistenti dei
tessuti e degli organi, non generando nuove funzioni. L’ effetto di un farmaco è sempre espresso in
termini relativi, in relazione alle condizioni fisiologiche al momento della somministrazione. Le
macromolecole biologiche bersaglio dei farmaci sono principalmente proteine, di cinque tipi:
● enzimi;
● canali ionici;
● sistemi trasportatori;
● proteine strutturali;
● recettori.
La sola eccezione importante alle proteine come bersagli sono gli acidi nucleici (DNA). Tra
i componenti del sistema biologico ed i farmaci possono avere luogo numerose altre interazioni che
sono state esaminate nel capitolo Farmacocinetica, ad esempio il legame con l’ albumina plasmatica.
Queste interazioni hanno conseguenze secondarie per l’ azione del farmaco, quali la durata e la velocità dell’ azione.
Una minoranza di farmaci agisce extracellularmente su componenti non cellulari dell’ organismo. In questo caso non sono coinvolte interazioni con biopolimeri. Esempi al riguardo sono gli
antiacidi che neutralizzano gli ioni H+ del succo gastrico, gli agenti chelanti che legano metalli pesanti tossici ed i diuretici e purganti osmotici che agiscono in virtù delle loro proprietà colligative,
inducendo per osmosi appropriate modificazioni nella distribuzione di acqua.
Enzimi
Numerosi farmaci agiscono su sistemi enzimatici, attivandoli o, più spesso, inibendoli. Frequentemente il farmaco si comporta da analogo del substrato enzimatico ed agisce come inibitore
competitivo, o reversibilmente o irreversibilmente. Rimandando al corso di Biochimica per una discussione completa dell’ argomento, gli schemi cinetici relativi alle interazioni substrato-enzima ed
inibitore-enzima sono i seguenti:
a) un enzima E si combina con il substrato S per dare il
complesso reversibile S.E il quale può evolvere nel
S+E
S .E
P+E
prodotto P, rigenerando l’ enzima libero;
b) nel caso di un inibitore reversibile e competitivo
I+E
I.E
(cioè in grado di competere con il substrato per il sito
attivo dell’ enzima) si ha la formazione di un complesso
S
non produttivo I.E;
E
S .E
c) se l’ inibizione è non competitiva (se cioè l’ inibitore
si lega ad un sito enzimatico diverso da quello del
I
I
substrato) si ha la formazione dei complessi inattivi I.E
S
e I.S.E, poiché I è in grado di legarsi sia all’ enzima
I.S .E
I. E
libero che al complesso S.E;
d) un inibitore che si lega soltanto al complesso S.E è un
inibitore acompetitivo (o incompetitivo);
I E
I+E
I .E
e) nel caso, infine, di inibizione irreversibile di tipo
competitivo, alla formazione del complesso I.E fa se30
guito generalmente quella di un addotto covalente tra enzima ed inibitore. Una serie di esempi di
enzimi bersaglio di farmaci correnti è la seguente:
Enzima bersaglio
Impiego clinico
Anidrasi carbonica
DNA polimerasi virale
3C proteasi del Rhinovirus
Xantina ossidasi
Trombina
Cicloossigenasi
PBP
ACE
Dopa decarbossilasi
β-lattamasi
Na+/K+ ATPasi
Trascrittasi inversa dell’ HIV
Testosterone 5α-reduttasi
Timidilato sintasi
HMG-CoA reduttasi
Diidrofolato reduttasi
DNA girasi
H+/K+ ATPasi
Glaucoma
Herpes
Raffreddore
Gotta
Malattie cardiovascolari
Infiammazione
Infezioni batteriche
Ipertensione
Morbo di Parkinson
Resistenza batterica
Malattie cardiovascolari
AIDS
Iperplasia prostatica
Cancro
Ipercolesterolemia
Cancro, infezioni batteriche
Infezioni batteriche
Ulcera
Canali ionici
Alcuni tipi di canali ionici sono collegati ad un recettore e si aprono solo quando viene
attivato il recettore. Altri tipi invece possono essere bersagli diretti di farmaci. L’ argomento verrà
precisato successivamente, nel paragrafo sui recettori accoppiati a canali ionici.
Sistemi trasportatori
Esempi di molecole carrier e di loro inibitori sono:
Carrier
Inibitore
Antidepressivi triciclici, Cocaina
Diuretici dell’ ansa
Glicosidi cardiaci
Sistema di ricaptazione 1 della noradrenalina
Cotrasportatore di Na+/K+/2ClNa+/K+ATPasi
Proteine strutturali
Un esempio importante è la tubulina, costituente dei microtubuli, in particolare del fuso
mitotico, con cui interagiscono gli Alcaloidi della Vinca ed i Taxani.
Recettori
I recettori sono elementi sensoriali di natura proteica, localizzati sulla membrana cellulare o
all' interno della cellula, facenti parte del sistema di comunicazione che coordina le funzioni di tutte
le differenti cellule dell' organismo. I messaggeri chimici che assicurano le comunicazioni tra le
cellule sono ormoni, neurotrasmettitori, fattori di crescita, citochine. Alcuni di essi attraversano la
membrana cellulare e portano il messaggio direttamente all’ interno della cellula, interagendo con
recettori intracellulari; altri invece interagiscono con recettori localizzati sulla membrana cellulare
ed il segnale che essi contengono viene trasferito all’ interno della cellula mediante vari meccanismi.
31
I recettori sono in altri termini proteine in grado di attivare determinate funzioni biochimiche all’ interno di una cellula a seguito dell’ interazione con molecole endogene di varia natura con funzione
di messaggeri chimici (mediatori fisiologici) ed, eventualmente, con farmaci (mediatori esogeni); il
termine ligando recettoriale viene impiegato per indicare sia i mediatori endogeni che quelli esogeni.
Quasi tutti i farmaci agiscono su recettori per i quali sono noti i ligandi endogeni (ad esempio i
recettori dell’ acetilcolina, della noradrenalina, dell’ istamina, della serotonina, della dopamina,
dell’ insulina, degli ormoni steroidici). Vi sono però anche esempi di recettori per farmaci per i
quali non sono stati ancora identificati i mediatori endogeni (recettori orfani).
Il termine recettore viene talvolta impiegato in senso estensivo per indicare qualsiasi
biopolimero bersaglio di un farmaco, per cui sono considerati ‘recettori’ anche gli acidi nucleici, gli
enzimi e le proteine trasportatrici e strutturali. Tuttavia, è preferibile riservare il termine recettore
alle proteine regolatrici che trasmettono informazioni alle cellule a seguito di interazione con
messaggeri chimici.
Famiglie Recettoriali
Sulla base della struttura molecolare e della natura dei meccanismi di trasduzione
(meccanismi di segnalazione transmembrana coinvolgenti il legame del ligando con il recettore e la
trasmissione del segnale all’ interno della cellula ad opera di una o più proteine ‘effettori’) si
possono distinguere quattro tipi o superfamiglie di recettori:
● Recettori accoppiati ad un canale ionico (ionotropi);
● Recettori accoppiati alle proteine G (metabotropi);
● Recettori accoppiati ad una chinasi (recettori con attività enzimatica intrinseca);
● Recettori intracellulari (attivatori della trascrizione).
I recettori delle prime tre categorie sono tutti proteine di membrana, mentre quelli del quarto
tipo sono proteine citosoliche o intranucleari.
Recettori Ionotropi
I recettori accoppiati ad un canale ionico rappresentano i recettori di diversi neurotrasmettitori (recettori nicotinici dell’ acetilcolina, di aminoacidi eccitatori come aspartato e glutamato e di aminoacidi inibitori come il γ-aminobutirrato e la glicina). Il sito di legame del ligando ed
il canale ionico fanno parte di uno stesso complesso proteico e l’ apertura del canale avviene come
risposta diretta al legame ligando-recettore. L’ azione del neurotrasmettitore si svolge in una
frazione di millisecondi e decade entro pochi millisecondi.
RECETTORI ACCOPPIATI AD UN CANALE IONICO (IONOTROPI)
Membrana
cellulare
CANALE IONICO
LIGANDO
IONI
Esterno cellula
Interno cellula
RECETTORE
IPERPOLARIZZAZIONE
O
DEPOLARIZZAZIONE
EFFETTI CELLULARI
32
I neurotrasmettitori eccitatori come l’ acetilcolina inducono l’ apertura di canali cationici, in
particolare del sodio e del potassio. Il risultato immediato è l’ afflusso di ioni Na+ nella cellula con
conseguente depolarizzazione e generazione di un potenziale d’ azione. L’ attivazione dei recettori
di neurotrasmettitori inibitori invece induce l’ apertura di canali anionici (Cl-) con iperpolarizzazione della cellula.
I canali ionici collegati direttamente (come nel caso appena esaminato) oppure indirettamente (come nel caso di certi tipi di recettori accoppiati alle proteine G, vedi successivamente) ad
un recettore e che si aprono solo in presenza di un ligando sono indicati come canali ionici regolati
da un ligando (ligand-gated ion channels). Altri canali ionici sono invece regolati da differenze di
potenziale (voltage-gated ion channels). Il più semplice tipo di interazione di questi canali con i
farmaci consiste nel blocco fisico del canale (ad esempio, nel caso degli anestetici locali).
Recettori Metabotropi
Questa famiglia di recettori comprende recettori di vari ormoni e trasmettitori lenti quali i
recettori muscarinici dell’ acetilcolina, i recettori adrenergici, dopaminergici ed oppiacei. L' attivazione del recettore da parte di un ligando produce la attivazione di un ‘trasduttore’ il quale, a sua
volta, provoca l’ attivazione (o l’ inattivazione) di un enzima (oppure l’ apertura, o la chiusura, di
un canale ionico). L’ attivazione dell’ enzima si concretizza nella produzione di un ‘secondo
messaggero’ (il primo messaggero è il ligando recettoriale) il quale interviene nella regolazione di
specifiche funzioni cellulari (figura successiva). La scala dei tempi è dell' ordine dei secondi.
Meccanismi di questo genere danno luogo ad una amplificazione del segnale iniziale, poiché un
singolo complesso ligando-recettore può attivare numerose molecole di proteine G, ognuna delle
quali, a sua volta, può rimanere associata all’ enzima abbastanza a lungo da provocare la
produzione di numerosissime molecole di secondo messaggero.
RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G (METABOTROPI)
Membrana
cellulare
LIGANDO
ENZIMA
(AMPLIFICATORE)
es. Adenilato Ciclasi
RECETTORE
Esterno cellula
Interno cellula
PROTEINA G
(TRASDUTTORE)
SECONDO MESSAGGERO
(es. cAMP)
RILASCIO DI Ca
FOSFORILAZIONE
DI PROTEINE
ALTRO
EFFETTI CELLULARI
Il trasduttore è comunemente rappresentato dalle proteine G. Le proteine G (così chiamate
per la loro interazione con i nucleotidi guaninici GTP e GDP) consistono di tre subunità ancorate
alla membrana plasmatica, α, β e γ. I nucleotidi guaninici sono legati alla subunità α.
33
O
O
NH
O
O N
N NH2 -O P O P OON
O- O-
N
O
O N
O
O P O P O P OON
O
OO
-
L = Ligando
R = Recettore
AC = Adenilato Ciclasi
NH
NH2
HO OH
HO OH
GTP
GDP
L
ESTERNO
α
R
β
γ
GDP
AC
INTERNO
Proteina G
L
R
GTP
α
β
γ
AC
β
γ
AC
β
γ
GDP
L
R
α
GTP
R
AC
α
GTP
R
γ
β
α
AC
ATP
cAMP
GTP
R
γ
β
α
AC
GDP
R
α
β
γ
AC
GDP
Nello stato a riposo, la proteina G
esiste come trimero indissociato con GDP
che occupa il sito sulla subunità α. Quando
il recettore viene attivato da un ligando,
avviene un cambiamento conformazionale
nel recettore che lo porta ad associarsi alla
proteina G. L’ associazione recettoreproteina G provoca la sostituzione di GDP
con GTP che, a sua volta, induce la
dissociazione del trimero con rilascio delle
subunità α-GTP e β,γ. La subunità α (ma
anche il dimero β,γ) può diffondere lungo
la membrana ed associarsi con vari enzimi,
ad es. adenilato ciclasi, ma anche canali
ionici, causandone la attivazione o l’
inattivazione (o la apertura o la chiusura).
Si conoscono proteine G stimolatrici e
proteine G inibitrici. L’ attivazione dell’
adenilato ciclasi stimola la formazione di
AMP ci-clico. Il processo termina con l'
idrolisi del GTP a GDP ad opera della
subunità α dotata di attività GTPasica. La
risultante subunità α-GDP si dissocia dall’
enzima bersaglio e si riunisce al dimero β,γ,
ripristinando il trimero e completando così
il ciclo.
Oltre
al
sistema
adenilato
ciclasi/cAMP, altri effettori accoppiati alle
proteine G sono il sistema fosfolipasi
C/inositolo fosfato e certi canali ionici (in
quest’ ultimo caso non sono coinvolti
secondi messageri e la proteina G
interagisce direttamente con il canale).
Recettori Accoppiati Ad Una Chinasi
RECETTORI ACCOPPIATI AD UNA CHINASI
Membrana
cellulare
LIGANDO
Esterno cellula
RECETTORE
Interno cellula
ENZIMA (CHINASI)
FOSFORILAZIONE
DI PROTEINE
EFFETTI CELLULARI
34
I recettori con attività
enzimatica intrinseca incorporano un
dominio intracellulare con attività di
proteina chinasi (in genere una
tirosina chinasi). Comprendono i
recettori dell’ insulina e di varie
citochine e fattori di crescita. Sono
coinvolti principalmente in eventi di
controllo della crescita e della
differenziazione
cellulari
ed,
indirettamente, di regolazione della
trascrizione genica.
In dettaglio, il legame del
ligando porta alla dimerizzazione di
una coppia di recettori. L’ associazione dei due domini proteici
con attività enzimatica determina l’ autofosforilazione dei residui di tirosina delle chinasi. I residui
autofosforilati si legano al dominio SH2 di varie proteine che poi attivano altre proteine, ad esempio
le proteine Ras che funzionano come le proteine G. L’ attivazione delle proteine Ras attiva a sua
volta una serie di chinasi a cascata, l’ ultima delle quali fosforila un fattore di trascrizione che dà
inizio all’ espressione genica.
Recettori intracellulari (attivatori della trascrizione)
La regolazione recettore-mediata della trascrizione del DNA è caratteristica degli ormoni
steroidei e tiroidei. Alcuni di tali recettori sono localizzati nel citoplasma, altri nel nucleo ed i loro
ligandi sono tutti composti lipofili in grado di attraversare facilmente la membrana cellulare. A seguito del legame, ad esempio di una molecola di steroide, il recettore dimerizza. Il dimero si lega a
sequenze specifiche del DNA note come elementi di risposta all’ormone (HRE, hormone-responsive elements) che sono localizzate circa 200 coppie di basi a monte dei geni la cui espressione viene
regolata dall’ ormone. Altre molecole che agiscono in maniera simile sono la vitamina D e l’ acido
retinoico.
RECETTORI INTRACELLULARI ATTIVATORI DELLA TRASCRIZIONE
Membrana
cellulare
LIGANDO
Esterno cellula
Interno cellula
Nucleo
RECETTORE
SINTESI
DI PROTEINE
SINTESI
DI mRNA
DNA
EFFETTI CELLULARI
35
Agonisti ed Antagonisti
Un agonista recettoriale è un ligando in grado di attivare un recettore inducendo una risposta
biologica intrinseca. Un farmaco che si comporta da agonista simula l’ azione del mediatore naturale (ligando endogeno, agonista fisiologico) e ne riproduce gli effetti.
Un antagonista recettoriale è invece un ligando che si lega ad un recettore senza attivarlo.
Quindi un antagonista può bloccare la capacità di un agonista di indurre una risposta.
Ad esempio, il neurotrasmettitore acetilcolina
CH3COOCH2CH2N(CH3)3+ agisce su due sottotipi di reH
+
H3C
NMe
cettori indicati come recettore muscarinico e recettore
N
OH
ni-cotinico poiché i due gruppi di risposte che l’
CH3
O
N
acetilcolina produce attivandoli possono essere
(-)-S-nicotina
(+)-2S,4R,5S-muscarina
riprodotti da due al-caloidi: muscarina e nicotina,
rispettivamente. L’ attiva-zione dei recettori muscarinici
da parte dell’ acetilcolina o della muscarina provoca diminuzione della frequenza e della forza
contrattile cardiache, vasodi-latazione periferica, restringimento della pupilla (miosi), aumento delle
secrezioni ghiandolari, con-trazione dei tratti gastrointestinale ed urinario. Un antagonista
muscarinico produce effetti opposti: diminuzione della secrezione salivare e del succo gastrico,
diminuzione della peristalsi intestinale, dilatazione della pupilla. Farmaci con quest’ ultimo tipo di
attività sono di potenziale utilità nel trat-tamento dell’ ulcera, in oftalmologia, come antispastici.
Indipendentemente dalla natura specifica del recettore R, l’ interazione di un ligando L con
esso può essere descritta dallo schema seguente:
L+R
L .R
Effetto
Alla formazione reversibile di un complesso ligando-recettore fa seguito, nel caso di un
agonista, l’attivazione di un meccanismo di trasduzione (apertura di un canale ionico, formazione di
un secondo messaggero, eccetera) che si traduce in una risposta biologica. Nel caso di un
antagonista, i meccanismi di trasduzione non si attivano e l’ effetto osservato è la conseguenza del
blocco recettoriale.
Gli antagonisti possono essere classificati in base alle loro cinetiche di interazione con il
recettore in antagonisti reversibili ed irreversibili. L’ antagonismo irreversibile si verifica non solo
con antagonisti che formano legami covalenti con il recettore (evento piuttosto occasionale nelle
interazioni farmaco-recettore, mentre è più frequente in quelle farmaco-enzima e farmaco-DNA) ma
anche con antagonisti che formano legami non covalenti, ma che si dissociano molto lentamente dal
recettore).
In base invece al sito di legame, gli antagonisti si suddividono in antagonisti competitivi e
non competitivi. I primi interagiscono con lo stesso sito di legame dell’ agonista e competono con
esso nel processo di interazione. I secondi interagiscono con un sito distinto da quello di legame
dell’ agonista, ma attraverso determinati meccanismi prevengono egualmente l’ attivazione del
recettore da parte dell’ agonista.
Le varie categorie di antagonisti hanno effetti diversi
sulle
curve
dose-risposta di un agonista.
E
Emax
Se l’effetto di un agonista, espresso come percentuale della
risposta massima, viene riportato in funzione della sua
concentrazione, la curva asume la forma di una sigmoide su
scala semilogaritmica. Nel caso di antagonisti competitivi e
reversibili, la loro aggiunta provoca uno spostamento
parallelo verso destra delle curve dose-risposta dell’ agonista.
Si parla in questo caso di antagonismo sormontabile. Se invece si ha una diminuzione della risposta massima dell’ agonista con o senza spostamento delle curve verso destra, l’ anlg A
36
tagonismo è detto insormontabile ed è caratteristico degli antagonisti reversibili non competitivi e di
quelli irreversibili competitivi (ad alte concentrazioni) e non competitivi.
E
Emax
E
E max
lg A
lg A
Antagonismo sormontabile
Antagonismo insormontabile
Legami Farmaco-Macromolecole bersaglio
La natura del legame che si stabilisce tra un farmaco ed il suo bersaglio macromolecolare e
le implicazioni stereochimiche relative influenzano fortemente il carattere e l' entità dell' interazione
ed in ultima analisi la risposta finale. I legami coinvolti nell' interazione farmaco-bersaglio
biologico sono gli stessi operanti per qualsiasi molecola organica e cioè legami covalenti, ione-ione,
ione-dipolo, dipolo-dipolo, idrogeno, dipolo-dipolo indotto, dipolo indotto-dipolo indotto (forze di
van der Waals), idrofobico ed a trasferimento di carica. Nella tabella seguente sono riassunti i vari
tipi di legame che si possono formare tra farmaci e macromolecole biologiche e le energie relative.
Tipo di legame
Energia di interazione
(kcal/mole)
legame covalente
40-110
R OR'
legame ionico
5
R 4N + I-
Esempio
R
+
H N H
legame ionico rinforzato
10
legame ione-dipolo
1-7
R 4N+
legame dipolo-dipolo
1-7
δ− δ+
O C
legame idrogeno
1-7
OH
legame di van der Waals
0.5-1
O
-
H
R'
O
NR 3
NR 3
O
C
C
R
legame idrofobico
1
R'
trasferimento di carica
1-7
NR 3
X (X = elettronattrattore)
37
Legami Covalenti
I legami covalenti che derivano dalla compartecipazione di elettroni tra due atomi e si
realizzano attraverso la sovrapposizione di orbitali atomici sono meno frequenti in chimica
farmaceutica di quelli non covalenti; riguardano in massima parte enzimi ed acidi nucleici, mentre
sono presenti raramente nelle interazioni con i recettori; la loro formazione comporta modificazioni
permanenti nella macromolecola bersaglio che non sempre sono auspicabili. In generale, è
preferibile l' uso di farmaci che producono interazioni non covalenti poiché i loro effetti possono
essere efficacemente controllati sospendendone la somministrazione. Un settore in cui la
formazione di legami covalenti può essere desiderabile è la chemioterapia, laddove il bersaglio
biologico appartiene all' organismo invasore o alla cellula neoplastica (ovviamente presupponendo
una selettività d' azione).
Alcuni esempi importanti di legami covalenti sono i seguenti.
Acilazione
Gli antibiotici β-lattamici (penicilline, cefalosporine) si comportano da acilanti particolarmente efficaci nei confronti di una famiglia di
H
H
enzimi batterici, le proteine leganti le penicilline
N
N
R
R
S
S
(PBP), in particolare delle classi implicate in uno
O
O
N
N
R' stadio chiave della biosintesi del peptidoglicano,
O
O
costituente basilare e caratteristico della parete
CO2H
CO2H
cellulare batterica. Il peptidoglicano, chiamato
anche mureina, è la macromolecola responsabile
Penicillina
Cefalosporina
della rigidità, forza tensile, protettività e forma
caratteristica della parete cellulare e, indirettamente, dell' intera cellula batterica e si contrappone
all' elevata pressione osmotica presente all' interno della cellula.
AG = N-Acetilglucosamina
AMA = Acido N-acetilmuramico
CH 2OH
O
O
CH 2OH
OH
O
AMA
PEPTIDOGLICANO
O
NHCOCH 3
NHCOCH 3
AG
AG
CH 3 CH C O
L-Ala
D-Glu
AMA
L-Lys
D-Ala
AG
AMA
L-Ala
L-Ala
AG
Gly
Gly
AG
D-Glu
L-Lys
D-Ala
Gly
Gly
Gly
Gly
D-Glu
L-Lys
Gly
D-Ala
Gly
Gly
AMA
AMA
L-Ala
D-Glu
L-Ala
Gly
Gly
D-Glu
L-Lys
D-Ala
Gly
Gly
Gly
Gly
38
GlyNH 2
L-Lys
D-Ala
D-Ala
Gly
Gly
Il peptidoglicano (figura precedente) è un complesso eteropolimero costituito da una parte
glicidica e da una peptidica. La componente glicidica è una catena lineare di n unità di un
disaccaride costituito da N-acetilglucosamina ed acido N-acetilmuramico uniti tra loro mediante
legame glicosidico tra il carbonio 1 della N-acetilglucosamina ed il carbonio 4 dell' acido Nacetilmuramico. Questa componente è sostanzialmente identica in tutti i batteri. La componente
peptidica della mureina è formata da un tetrapeptide (la composizione più comune è L-Ala-D-GluL-Lys-D-Ala) unito alla porzione glicidica da un legame ammidico tra il carbossile dell' acido Nacetilmuramico e l' aminogruppo del primo aminoacido del tetrapeptide. Nel loro insieme, queste
due componenti costituiscono l' unità strutturale fondamentale del peptidoglicano.
Esso tuttavia non sarebbe un polimero molto robusto e non conferirebbe resistenza alla
parete cellulare se non si avessero anche dei legami crociati tra il tetrapeptide di una unità e quello
di una unità adiacente. Esiste un' alta variabilità nella natura del ponte tra le unità. Nello S. aureus il
ponte è formato da cinque glicine. Nella formazione del legame crociato, il gruppo amminico
terminale ad una estremità della catena pentaglicinica attacca il legame peptidico tra due residui di
D-alanina terminali di un' altra unità peptidica.
Il processo è catalizzato dalle PBP con attività transpeptidasica che agiscono formando un
legame covalente con la penultima D-alanina del peptide per attacco nucleofilo di un residuo
serinico presente al sito attivo dell' enzima sul carbonile ammidico tra le due D-Ala. L' intermedio
acil enzima reagisce poi con il gruppo amminico della glicina terminale formando il legame
trasversale e rigenerando l' enzima (Figura successiva).
D-Ala
D-Ala
Enzima
CH 2OH
C
C
Enzima
O
NH
H 2N
O
CH 2O
D-Ala
D-Ala
CO 2D-Ala
Enzima
Gly
CH 2OH
H
O
Me
H
N
H
O
CO 2H
N
Residuo D-Ala-D-Ala
Me
H
Peptidoglicano
O
H
H
H
N
O
R
CO 2H
Me
S
N
NH
Penicillina
Me
H
Analogia strutturale tra una penicillina ed
il residuo D-Ala-D-Ala del pentapeptide
39
C
O
Gly
La penicillina viene scambiata dalla transpeptidasi per il suo substrato in quanto la sua
struttura è molto simile a quella dell' acil-D-Ala-D-Ala. Inoltre, l' anello β-lattamico a quattro
termini della penicillina è tensionato e ciò lo rende particolarmente reattivo. Si forma quindi un
legame covalente tra l' enzima e l' antibiotico e l' addotto risultante non procede oltre, in quanto non
viene idrolizzato e non subisce reazioni di transamidazione per ragioni steriche ed a causa di
variazioni conformazionali dell' enzima.
R
Enzima
S
O
O
CH 2OH
S
RCONH
H
N
HN
N
CO 2-
O
O
CO 2-
CH 2
Enzima
Alchilazione
Tipici agenti alchilanti sono le mostarde azotate RN(CH2CH2Cl)2, impiegate come
antitumorali, che agiscono alchilando le basi azotate del DNA, in particolare l' azoto in posizione 7
della guanina. Le conseguenze del processo di alchilazione sono varie e sono schematizzate nella
figura seguente. L' evento responsabile della letalità cellulare è la formazione di legami crociati tra
due residui guaninici presenti sui due filamenti appaiati del DNA.
Cl
R N
+
R N
R N
Cl
Cl
R
N
N
+
R N
H2N
N
Cl
DNA
Tautomero Chetonico
Favorito
N
+
N
N
Cl
N
N
Scissione
dell' anello
N
H2N
N
DNA
Tautomero Enolico
Favorito
Depurinazione
CH3
N
N
H2N
N
+
N
N
DNA
N
+
N
N
DNA
N
H
N
N
N
H
DNA
40
R
H O
N H
O
NH2
N
N
Scissione catena DNA
O
N
R
+
H2N
N
N
H
+ Catena DNA depurinata
Coppia di basi anormale
con la Timina
OH
CHO
NH
OH
Legame crociato con
una seconda Guanina
OH
N
Cl
DNA
N
R
R
OH
N
N
R N
Nu2-
Nu2
OH
HN
Nu1
Cl
O
H2N
Nu1
Nu1
Nu1-
+
R N
+
N
N
DNA
Cl
Cl
Fosforilazione
I composti organofosforici sono inibitori dell' acetilcolinesterasi, dell' enzima deputato alla
idrolisi e quindi all' inattivazione dell' acetilcolina.
R'Y
RY
P
R'Y
HOH 2C
O
RY
P
O
OH 2C
X
Acetilcolinesterasi
R, R' = Alchile o Arile
Y, Y' = O, talvolta S
X = Gruppo uscente
Due dei tre esempi riportati si riferiscono a farmaci le cui azioni farmacologiche sono
dovute alla loro capacità di inibire irreversibilmente un enzima, modificando covalentemente un
gruppo funzionale enzimatico essenziale per la sua attività catalitica. Inibitori irreversibili di questo
tipo sono indicati con il termine di marcatori per affinità (affinity labels). Un marcatore per affinità
è quindi un reagente diretto al sito attivo dell' enzima e che possiede un gruppo chimico reattivo di
natura elettrofila in grado di formare un addotto irreversibile con l' enzima bersaglio. Lo schema
cinetico è quello già visto per una inbizione irreversibile competitiva.
I+E
I E
I
E
Un meccanismo inibitorio diverso dal precedente, anche se comunemente di tipo
irreversibile anch' esso, è l' inibizione basata sul meccanismo o inibizione suicida. Un inibitore
suicida è una sostanza che non possiede inizialmente le caratteristiche di inibitore, viene trattata
dall' enzima come un substrato e, una volta legatasi al sito attivo dell' enzima, viene trasformata
dall' enzima stesso in una specie reattiva (inibitore) che si lega fortemente all' enzima prima del
rilascio dal sito attivo. L' enzima quindi produce il proprio inbitore a partire da un composto inattivo
e commette con ciò suicidio. I tipi di inibizione che si possono verificare sono di vario tipo. La
varietà 'classica' e più frequente di inibitori suicidi comprende intermedi reattivi con proprietà
elettrofile che si combinano covalentemente con l' enzima e producono una inibizione irreversibile.
Lo schema cinetico di tali inibitori è il seguente, dove S' = pseudosubstrato, IR = intermedio reattivo
e P = prodotto della reazione enzimatica.
S' + E
k1
S' E
k2
IR E
k-1
k3
k4
inattivaz.
IR
E
normale
P+E
Mentre i marcatori per affinità possono, a causa della loro reattività intrinseca reagire con
enzimi (o altre biomolecole) diversi da quello bersaglio, gli inibitori suicidi sono in linea di
principio attivati solamente dall' enzima bersaglio, con il conseguente vantaggio di minori effetti
indesiderati.
La strategia più seguita nella progettazione degli inibitori suicidi consiste nella generazione,
catalizzata dall' enzima, di specie elettrofile che reagiscono poi covalentemente con gruppi nucleofili presenti al sito attivo dell' enzima.Gli schemi seguenti illustrano alcuni dei principali tipi di reazione che hanno luogo nell' attivazione del substrato e nella successiva inattivazione dell' enzima.
41
Attivazione
OH
Inattivazione
R
Enz-Nu
F
O
Isomeriz.
O
R
O
Enz-Nu
O
R
Enz-Nu
O
Enz-Nu
R
Eliminaz.
R
R
O
Ossidaz.
R
O
R
Enz-Nu
OH
Enz-Nu
O
Ossidaz.
R
O
C
R
O
R
Enz-Nu
R
Enz-Nu
XH
Ossidaz.
X = NH, O
XH
X
Nu-Enz
Enz-Nu
Sebbene vi siano attualmente in uso solo pochi farmaci progettati razionalmente come
inibitori suicidi, ne esistono diversi che sono stati riconosciuti agire come tali a posteriori. Un
elenco di farmaci inibitori suicidi è il seguente.
Tranilcipromina (antidepressivo)
Pargilina (antiipertensivo)
L-Deprenil (antiparkinson)
5-Fluorouracile (antitumorale)
Trifluridina (antivirale)
Allopurinolo (antiiperuricemico)
Acido clavulanico (antibatterico)
Sulbactam (antibatterico)
Vigabatrin (anticonvulsivante)
Exemestan (antineoplastico)
Come esempio di funzionamento di un inibitore suicida, vediamo in dettaglio gli inibitori
delle β-lattamasi. Le β-lattamasi sono enzimi batterici responsabili della inattivazione degli
antibiotici β-lattamici e costituiscono uno dei principali meccanismi di resistenza nei confronti di
tali antibiotici. Agiscono sull' anello β-lattamico allo stesso modo delle PBP, ma la rigenerazione
dell' enzima nel caso delle β-lattamasi è un processo veloce. Gli inibitori in uso sono tre: acido
clavulanico (in associazione con amoxicillina e ticarcillina), sulbactam (in associazione con la
ampicillina) ed il tazobactam (in associazione con la piperacillina).
H
O
OH
CO 2H
Acido clavulanico
O
O
H
O
S
N
N
O
O
H
CH 3
CH 3
CO 2H
Sulbactam
42
N
O
O
S
N
N
CH 3
CO 2 H
Tazobactam
N
Uno schema generale per il meccanismo inibitorio è indicato qui appresso.
OH
Prodotti
di idrolisi
+
Normale
deacilazione
P+E
lento
X-
X-
X
R
HN
O
N
O
N
CO 2 -
O
CO 2 -
O
O
R
R
Inibizione
transitoria
CO 2-
OH
IR E
NH 2
Transiminazione
S' + E
R
OH
=
N
N
O
N
O
X = O, SO 2
HN
O
O
Inattivazione
irreversibile
IR E
N
S' + E
k1
S' E
k2
k -1
IR E
k3
k4
inattivaz.
IR E
normale
P+E
Un ossidrile serinico presente al sito attivo della β-lattamasi attacca il carbonile β-lattamico;
si ha una contemporanea reazione di β-eliminazione in cui il gruppo uscente è un enolato (nel caso
dell' acido clavulanico) o un sulfinato (nel caso di sulbactam e tazobactam). L' acil enzima
formatosi può: a) seguire il normale corso di deacilazione, rigenerando così l' enzima; b) produrre
un inibitore transitorio dell' enzima in cui il legame acilico viene stabilizzato nei confronti della
idrolisi dalla presenza del doppio legame coniugato; c) dare una reazione di transiminazione con un
residuo lisinico dell' enzima. Qust' ultima reazione porta all' inattivazione irreversibile dell'enzima.
Legami non Covalenti
I legami non covalenti che si incontrano nelle interazioni farmaco-bersaglio biologico sono:
ione-ione, ione-dipolo, dipolo-dipolo, idrogeno, dipolo-dipolo indotto, dipolo indotto-dipolo indotto
(forze di van der Waals), idrofobico ed a trasferimento di carica. Sono caratterizzati da energie di
legame modeste se paragonate a quelle dei legami covalenti e da un limitato raggio d' azione. Le
interazioni dovute a legami non covalenti sono di breve durata. La loro importanza non deve essere
tuttavia sottovalutata in quanto spesso si ha la formazione progressiva (cioè a man mano che il
farmaco si avvicina alla macromolecola bersaglio) di legami multipli di vario genere.
Un gran numero di farmaci è costituito da molecole ionizzabili ai vari pH fisiologici. D' altra
parte le biomolecole bersaglio, essendo più spesso di natura proteica, a loro volta possiedono centri
ionizzabili quali ad esempio i gruppi CO2H degli aminoacidi acidi (aspartico, glutammico) ed i
gruppi NH2 degli aminoacidi basici (arginina, istidina, lisina). Altri centri ionizzabili presenti nelle
43
macromolecole biologiche sono i residui fosforici degli acidi nucleici, i centri carichi dei fosfolipidi
e dei polisaccaridi. Pertanto le interazioni tra ioni di segno opposto sono molto frequenti.
Anche le molecole neutre possono avere gruppi in cui si hanno separazioni di cariche
parziali con formazione di dipoli permanenti, come risultato della differenza di elettronegatività in
particolare tra il carbonio ed atomi quali azoto, ossigeno, alogeni. Chetoni, esteri, eteri, ammidi,
nitrili sono tutti gruppi contenenti dipoli responsabili potenzialmente di interazioni dipolari con il
bersaglio biologico.
Il legame idrogeno, caso particolare di interazione dipolo-dipolo, consiste in una interazione
elettrostatica tra una coppia di elettroni non condivisi legati ad un eteroatomo (N, O, S) ed un
idrogeno elettron-deficiente di gruppi quali NH, OH, SH e rappresenta il meccanismo fondamentale
per accrescere la solubilità di un farmaco polare non elettrolita.
Le forze di van der Waals sono le forme di attrazione tra gli atomi più universale. Esse intervengono ogni qualvolta due atomi di molecole diverse si avvicinano sufficientemente. Sono anche
indicate come forze di dispersione di London e sono basate sulla induzione di asimmetria nella nube
elettronica di un atomo da parte del nucleo di un atomo vicino. Si verifica una mutua polarizzazione
delle nuvole elettroniche con formazione di dipoli momentanei complementari. La energia in gioco
è piuttosto debole e decresce molto rapidamente con la distanza tra le molecole; ad esempio per una
coppia di gruppi CH2 assomma a ~ 0.7 Kcal/mole. Tuttavia, quando le porzioni non polari
interagenti sono sufficientemente estese e di appropriata configurazione, le forze di van der Waals
possono contribuire significativamente alla stabilizzazione del complesso farmaco-biomolecola. Gli
anelli aromatici e le catene alifatiche lineari o poco ramificate soddisfano a questi requisiti.
Il legame idrofobico rappresenta una delle più importanti interazioni implicate nella
conservazione della struttura terziaria delle proteine. Il termine legame non è in realtà appropriato,
dal momento che l' interazione è sempre del tipo van der Waals, ma deriva da un guadagno di
entropia del solvente acquoso ed più corretto perciò parlare di effetto idrofobico.
Le porzioni apolari di una molecola presente in soluzione acquosa sono circondate da un
mantello idratante estremamente ordinato (strutture a gabbia) a bassa entropia che non è
compensata a sufficienza dall' energia (fattore entalpico) associata alle deboli interazioni di tipo
dipolo-dipolo indotto tra l' acqua e le porzioni apolari (si ricordi che la variazione di energia libera
per un processo è data da ∆G = ∆H – T ∆S, dove ∆H è la variazione di entalpia, ∆S è la variazione
di entropia e T è la temperatura assoluta. Per un processo spontaneo ∆G < 0). Di conseguenza, le
parti apolari di due molecole diverse
tendono ad aggregarsi spontaneamente tra
Catena apolare
loro in modo da diminuire il numero delle
del farmaco
strutture a gabbia attorno ad esse ed
accrescere quindi lo stato di disordine del
sistema con aumento del fattore entropico
(l' aumento di entropia del solvente è
maggiore in valore assoluto della
Catena apolare
molecola
diminuzione di entropia del soluto) che
del biopolimero
d' acqua
compensa ampiamente la variazione
sfavorevole di entalpia. La forza motrice
che determina quindi l' instaurarsi delle
interazioni di van der Waals tra due
porzioni apolari di due molecole (in
particolare di un farmaco e di una
biomolecola) in soluzione acquosa è l' aumento di entropia del solvente.
I complessi a trasferimeno di carica
si originano tra molecole elettron-ricche
che agiscono da donatrici (D) e molecole
elettron-povere che si comportano da accettrici (A). Il termine 'trasferimento di carica' si riferisce ad
44
una successione di eventi tra una molecola D ed una molecola A che può andare dalle deboli
interazioni di van der Waals fino alla formazione di una coppia ionica. In altri termini, un
complesso a trasferimento di carica è un ibrido tra due strutture limiti, una in cui le molecole
interagiscono tramite le forze di dispersione e l' altra in cui D ed A sono legate da un legame ionico.
D+A
D δ+ A δ−
D .....A
D+ A-
Tipiche molecole donatrici sono gli eterociclici π elettron-ricchi pirrolo, furano e
tiofene (contengono 6 elettroni π distribuiti su 5 atomi), i composti aromatici con sostituenti
elettron-donatori ed i composti con doppietti elettronici non condivisi; molecole accettrici sono
invece ad esempio sistemi eterociclici π elettron-poveri quali gli anelli purinico e pirimidinico e
composti aromatici con sostituenti elettron-attrattori.
Stereochimica ed Attività
I processi che costituiscono la farmacocinetica e la farmacodinamica di un farmaco
comprendono una serie continua di interazioni con biopolimeri dotati spesso di grande specificità
strutturale. E' evidente quindi che gli aspetti stereochimici di tali interazioni rivestono un ruolo di
grande importanza ai fini delle caratteristiche farmacologiche di un farmaco. Vi è una chiara
tendenza negli ultimi 10-15 anni, stimolata da raccomandazioni al riguardo da parte degli enti
sanitari di controllo sui farmaci, verso lo sviluppo di agenti stereoisomericamente (in particolare
enantomericamente) puri.
Richiami di Stereochimica Organica
Stereoisomeri sono isomeri che differiscono soltanto per il modo con cui gli atomi che li
costituiscono sono disposti nello spazio. Essi possono essere classificati in base all' entità delle
barriere energetiche che ne limitano la interconversione ed in base a criteri di simmetria.
Sulla base di criteri di interconvertibilità, gli stereoisomeri possono essere distinti in isomeri
configurazionali, interconvertibili per rottura di un legame covalente, ed in isomeri conformazionali,
interconvertibili per rotazione attorno ad un legame singolo. La facilità di interconversione è caratteristica di quasi tutti gli isomeri conformazionali, mentre gli isomeri configurazionali l' interconversione implica la rottura di un legame covalente, per la quale rottura la barriera energetica è molto
alta.
Sulla base di criteri di simmetria gli stereoisomeri sono distinguibili in enantiomeri (isomeri
ottici) ed in diastereoisomeri, a seconda che le coppie di stereoisomeri siano o meno immagini
speculari (non sovrapponibili).
La non sovrapponibilità delle immagini speculari è definita chiralità e gli atomi della
molecola responsabili della chiralità sono indicati come centri chirali. Mentre due diastereoisomeri
hanno proprietà fisiche e chimiche differenti, due enantiomeri hanno identiche proprietà chimiche e
fisiche ad eccezione del comportamento verso reagenti chirali e del senso di rotazione del piano
della luce polarizzata, rispettivamente. Sebbene la maggior parte delle molecole che esistono come
coppie di enantiomeri contenga almeno un atomo di carbonio asimmetrico (cioè legato a quattro
sostituenti diversi), la presenza di atomi di carbonio asimmetrici non è condizione né necessaria né
sufficiente per l' esistenza di enantiomeri.
La diastereoisomeria si origina dall' esistenza in una molecola di due o più centri chirali,
oppure dalla ristretta rotazione attorno ad un legame (isomeria geometrica o cis-trans). Nel primo
caso, se n sono i centri chirali, il numero massimo di stereoisomeri è 2n. Le coppie di enantiomeri
sono 2n/2 ed ogni enantiomero di una coppia è in relazione di diastereoisomeria con tutti i
componenti delle altre coppie. Nel secondo caso, le due categorie più importanti sono quelle
derivanti dalla presenza di doppi legami e di cicli. L' isomeria geometrica può essere o meno
accompagnata da quella ottica.
45
Enantiomeria ed Attività
In linea generale ed indipendentemente dallo stadio (o da gli stadi) in cui è operante la
selettività, si verifica, come risultato più frequente, che due enantiomeri mostrano risposte
quantitativamente differenti, cioè uno dei due enantiomeri è più potente del' altro. L' enantiomero
più potente è denominato eutomero, quello meno potente distomero. Il rapporto tra la potenza dello
eutomero e quella del distomero è definito rapporto eudismico. Esso aumenta all' aumentare della
potenza dell' eutomero (regola di Pfeiffer).
Altre possibilità sono che uno solo dei due enantiomeri sia attivo (l' enantiomero inattivo
potrebbe tuttavia contribuire agli effetti collaterali), che i due enantiomeri posseggano
qualitativamente e quantitativamente la stessa attività e che i due enantiomeri mostrino attività di
tipo differente. Due enantiomeri possono perfino produrre effetti opposti, cioè comportarsi come
una coppia agonista-antgonista. In quest' ultimo caso però le potenze sono diverse.
Tornando al caso più spesso osservato, e cioè stesso tipo di attività ma diversa potenza per i
due enantiomeri, tale risultato è la conseguenza di processi selettivi che possono avvenire sia nel
corso della fase farmacocinetica che di quella farmacodinamica.
Per quanto concerne le possibilità di selezione di uno dei due enantiomeri durante la fase
farmacocinetica, si possono fare le seguenti generalizzazioni.
Selettività di membrana: in genere, i processi di difusione passiva non sono stereoselettivi,
mentre lo sono quelli che coinvolgono proteine trasportatrici;
Biopolimeri non specifici: le due principali proteine sieriche coinvolte in legami non
specifici con pressoché tutti i farmaci sono l' albumina e l' α1-glicoproteina acida. Entrambe
mostrano affinità diverse per gli enentiomeri di numerosi farmaci;
Captazioni stereoselettive: Sono state osservate captazioni selettive nei confronti di alcuni
farmaci da parte del tessuto adiposo e di alcuni organi quali cuore, cervello, polmoni;
Escrezione selettiva: La filtrazione glomerulare ed il riassorbimento tubulare (processi
passivi) non sono in grado di discriminare tra due enantiomeri. La selettività eventualmente
osservata durante l' escrezione renale può quindi essere la conseguenza o di un legame preferenziale
con le proteine plasmatiche, oppure di una secrezione tubulare stereoselettiva;
Metabolismo selettivo: Numerosi enzimi farmaco-metabolizzanti interagiscono preferenzialmente, anche se non esclusivamente, con uno dei due enantiomeri; inoltre essi possono anche
produrre preferibilmente uno dei due possibili enantiomeri a partire da un precursore non chirale.
Le reazioni metaboliche dal punto di vista stereochimico possono presentare:
- stereoselettività di substrato, quando gli enantiomeri di un substrato chirale sono metabolizzati con
velocità differenti;
- stereoselettività di prodotto, quando in un substrato non chirale viene creato un centro chirale ed
uno dei due enantiomeri è prodotto a preferenza;
- stereoselettività di substrato-prodotto in cui viene creato, preferibilmente a carico di uno dei due
enantiomeri, un ulteriore centro chirale in una molecola già chirale e uno dei due possibili
diastereoisomeri viene prodotto a preferenza.
p
C*
conf. R
C achir.
C*
conf. S
C achir.
en z.
r e fe r
C*
C*
conf. R conf. R
X
C*
C*
conf. R conf. S
X
no biotrasformaz.
46
Diastereoisomeri
possibili
L' area probabilmente più importante per l' enantioselettività è comunque il sito d' azione.
Nella figura successiva è illustrato il cosiddetto 'concetto di attacco a tre punti', sviluppato da
Easson e Stedman, per spiegare l' interazione enantioselettiva di un farmaco con il suo berasglio
biologico, in particolare con un recettore. A, B e C rappresentano i tre sostituenti di un carbonio
asimmetrico del farmaco in grado di formare un legame con tre aree complementari del recettore,
indicate con le stesse lettere. Si vede facilmente come uno solo dei due enantiomeri possiede la
corretta disposizione dei gruppi per una interazione a tre punti. L' altro enantiomero può esercitare
al massimo un contatto a due punti. Un recettore può dunque differenziare due enantiomeri se vi
sono almeno tre siti di legame con gruppi legati al carbonio chirale.
D
B
D
C
A
A
C
B
B
C
A
C
A
D
C
A
C
A
B
B
B
MODELLO A TRE PUNTI DI EASSON-STEDMAN
Un modello di questo tipo è stato proposto per spiegare la differenza di attività tra gli
enantiomeri dell' epinefrina (adrenalina). La (-) adrenalina ha una affinità circa 100 volte superiore
a quella dell' isomero (+). Solo nell' enantiomero (-) il gruppo OH è orientato in modo tale da
consentire il massimo di interazione.
Legame
idrogeno
Sito anionico
H + HO
H N
Me
Area piana
H
OH
H + H
H N
Me
OH
OH
OH
OH
R (-) ADRENALINA
+ attiva
S (+) ADRENALINA
- attiva
47
Diastereoisomeria ed Attività
I diastereoisomeri che si originano da molecole con due o più centri chirali sono
generalmente attivi in una sola configurazione. Un esempio al riguardo è il cloramfenicolo, un
antibiotico antibatterico. Dei quattro stereoisomeri, uno solo è attivo.
CLORAMFENICOLO
Attività Antibatterica
Relativa
H
NO 2
100
<0.4
R
NO 2
1.2
R
OH
H
OH
H
S
NO 2
<0.4
NHCOCHCl2
S
D(-)Treo
CH 2OH
L(+)Treo
H
NHCOCHCl2
H
H
R
NO 2
CH 2OH
S
OH
NHCOCHCl2
OH
NHCOCHCl2
S
H
R
L(+)Eritro
H
D(-)Eritro
CH 2OH
H
Analogo comportamento presentano gli isomeri geometrici. Le differenze di attività tra essi
possono essere interpretate a livello recettoriale mediante modelli simili a quello di Easson-Stedman.
Nella figura seguente sono illustrati due esempi al riguardo che si riferiscono ad un' olefina e
ad un cicloalcano. Soltanto negli isomeri cis i sostituenti A, B e C hanno disposizione
complementare rispetto ai corrispondenti siti recettoriali, per cui risulteranno attivi.
C
A
C
A B
A B
C
C
A
B
A
C
B
A
A
B
C
A
48
A
B
B
C
C
A
XA
A X
B
Conformazione ed Attività
La conformazione di una molecola denota i differenti possibili arrangiamenti che gli atomi
costituenti la molecola possono assumere per rotazione attorno ad uno o più legami semplici.
La conformazione con la quale un farmaco interagisce con il proprio bersaglio biologico
(conformazione attiva) spesso non coincide con la conformazione più stabile in assoluto. E'
generalmente accettato che ognuna delle conformazioni più stabili può essere quella che interagisce
con il biopolimero. E' ragionevole ritenere comunque che tutte le conformazioni al di sopra di una
certa energia debbano pagare un prezzo energetico troppo alto per adattare la loro conformazione al
biopolimero.
Informazioni sulle caratteristiche conformazionali di una molecola possono essere ottenute
mediante principalmente tre metodologie:
(a) la cristallografia ai raggi X permette di individuare la conformazione di una sostanza allo stato
solido con precisione. Tale conformazione può tuttavia essere anche molto diversa da quella
preferita a livello di interazione biologica;
(b) la risonanza magnetica nucleare (NMR) permette di studiare la conformazione di un composto
in soluzione; questo è un vantaggio rispetto alla difrattometria ai raggi X, specie se il solvente
utilizzato ha caratteristiche che si avvicinano all' ambiente fisiologico;
(c) i metodi teorici coinvolgono calcoli nei quali sono presi in considerazione vari parametri
molecolari quali angoli e lunghezze di legame e distribuzione elettronica.
In ogni caso tutti questi metodi di analisi conformazionale forniscono informazioni sulle
conformazioni preferite di una molecola in assenza di bersaglio biologico il quale può in una certa
misura imporre una conformazione di legame alla sostanza.
E' chiaro che il metodo definitivo per risolvere il problema della caratterizzazione della
conformazione attiva sarebbe quello di studiare la conformazione all' atto dell' interazione. Tuttavia,
ciò è attualmente possibile solo per quei bersagli biologici per i quali è nota la struttura del sito
attivo e nei quali è possibile studiare direttamente il complesso con il ligando: in pratica enzimi ed
acidi nucleici.
Un metodo indiretto, adottato da diversi decenni, consiste nella progettazione di analoghi a
flessibilità molecolare ridotta che rappresentano un congelamento di possibili conformeri della molecola originale. Per ridurre la libertà conformazionale di una molecola è necessario introdurre in
essa degli elementi strutturali aggiuntivi che da una parte la irrigidiscono ma dall' altra possono modificare le sue caratteristiche farmacocinetiche e farmacodinamiche. Per questo motivo, è opportuno
che la riduzione di flessibilità venga effettuata con le minime variazioni strutturali possibili.
Un esempio ormai classico di applicazione di tale procedura riguarda l' identificazione della
conformazione attiva dell' acetilcolina. Allo
stato solido, in soluzione ed allo stato gasso+NMe
+NMe
3
3
so la conformazione più stabile, dettata non
H
OCOCH3
H
H
dall' ingombro sterico tra i due sostituenti ma
dalla interazione ione-dipolo tra il gruppo
H
H
H
H
ammonico quaternario ed il carbonile estereo,
H
OCOCH3
appare quella sinclinale (gauche). I calcoli
sinclinale
antiperiplanare
teorici indicano anche che la differenza enerMe3N+ IOCOCH3
Me3N+ IH
getica tra le varie conformazioni possibili è
piccola. Molte evidenze, accumulate nel corso dei numerosissimi studi dedicati a questo
H
H
H
OCOCH3
neurotrasmettitore, indicavano che la confor(+)cis-2-acetossiciclopropil(+) trans-2-acetossiciclopropilmazione attiva a livello del recettore muscatrimetilammonio ioduro
trimetilammonio ioduro
rinico era, probabilmente, quella trans (antiperiplanare). Il problema è stato risolto con
la applicazione della metodologia della restrizione conformazionale. Sono stati sintetizzati e saggiati gli isomeri (+)-cis e -trans dell' analogo ciclopropanico 2-acetossiciclopropiltrimetilammonio
49
ioduro. Dei due isomeri, solamente quello trans, corrispondente alla conformaziona antiperiplanare
è equipotente con l' acetilcolina, mentre l' isomero cis è del tutto inattivo.
Relazioni Struttura-Attività
Con il termine relazioni struttura-attività (SAR) si intendono le relazioni tra la struttura
chimica e la attività farmacologica di una serie di composti. Esse vengono costruite nel corso del
processo di ottimizzazione di un composto guida attraverso modificazioni molecolari del prototipo e
sono a loro volta utilizzate per la progettazione di nuovi analoghi e per una comprensione
dettagliata del meccanismo d' azione e della topografia della biomolecola bersaglio.
Possono essere di carattere qualitativo e di carattere quantitativo (QSAR). In quest' ultimo
caso, si utilizzano per la loro costruzione parametri chimico-fisici e trattazioni matematiche.
Un passaggio fondamentale negli studi SAR è rappresentato dalla individuazione del
farmacoforo. Per farmacoforo si intende l' insieme delle caratteristiche strutturali di una molecola
biologicamente attiva che sono necessarie per l' interazione con il biopolimero bersaglio e quindi
per l' attività. Il bersaglio biologico riconosce l' arrangiamento di certi gruppi della molecola nello
spazio tridimensionale e le loro caratteristiche chimico-fisiche.
Alcune modificazioni vengono realizzate al fine di esplorare gli effetti secondari della
molecola (vedi Farmacocinetica, pg. 4).
Dopo anni di studi SAR si sono messe in evidenza come produttive alcune strategie standard
di modificazione molecolare utilizzabili per l' esplorazione primaria delle relazioni SAR a partire da
un nuovo lead compound con una attività di qualsiasi tipo.
Tali strategie comprendono:
-dissociazione (o semplificazione) molecolare;
-associazione (o complicazione) molecolare;
-processi speciali: preparazione di profarmaci, costruzione di serie omologhe, sostituzioni
bioisosteriche.
Me
Me
O
O
Cl
O
N
N
N
Cl
N
R1
Me
R2
N
O
N
Cl
Me
N
N
Cl
Me
Me
Me
O
O
O
N
N
N
S
N
Cl
N
Cl
N
Y
Me
Me
O
N
N
O
Cl
Cl
Me
N
Me
N
O
O
N
N
O
S
O
N
NMe 2
O
Cl
N
N
Me
ESPLORAZIONE PRIMARIA DELLE SAR SUL DIAZEPAM
50
Cl
Il cosiddetto approccio globale consiste nell' applicare in maniera sistematica tutte le
strategie suddette, individuando così sulla carta un numero molto alto di variazioni strutturali. La
ricchezza di questa procedura è illustrata nella figura precedente, laddove essa è applicata al noto
ansiolitico diazepam.
Alcune regole possono aiutare a codificare con precisione l' uso delle varie strategie e ad
aumentarne l' efficacia:
-regola 1: dare priorità ad analoghi che derivano dal prototipo attraverso piccole variazioni;
-regola 2: utilizzare prima possibile i dati biochimici;
-regola 3: utilizzare i dati strutturali;
-regola4: scegliere opportunamente i sostituenti sugli anelli aromatici;
-regola 5: dare la preferenza ad analoghi la cui sintesi sia più semplice e meno costosa;
-regola 6: eliminare i centri chirali;
Dissociazione (o Semplificazione) molecolare
Consiste nella sintesi di analoghi più semplici del prototipo. Il fatto che il farmacoforo sia in
genere limitato ad alcuni elementi strutturali di una molecola che può essere più o meno complessa
fa sì che si possa procedere spesso ad una semplificazione della molecola, sfrondandola degli
elementi che non appartengono al farmacoforo (molecular pruning).
Uno degli esempi più noti di semplificazione molecolare che, partendo da un prodotto
naturale complesso, arriva via via alla creazione di molecole sempre più semplici ma ancora
farmacologicamente attive è rappresentato dalla morfina e suoi congeneri.
HO
HO
HO
A
O
D
B
E
Me
Me
N
N
Me
N
C
Me
HO
Fenazocina
(Benzomorfano)
Levorfanolo
(Morfinano)
Morfina
Me
Me
Me
EtO 2 C
N
COEt
N
Me
Meperidina
Metadone
SEMPLIFICAZIONE MOLECOLARE
La morfina è un analgesico narcotico, riduce cioè la sensibilità al dolore e produce sedazione,
diminuzione dell' attività mentale ed induzione al sonno. Possiede i seguenti effetti collaterali:
depressione respiratoria, costipazione, nausea, vomito, euforia. Per l' azione euforizzante la morfina
è uno stupefacente; già dopo breve tempo produce dipendenza fisica e psichica ed assuefazione.
Partendo dalla morfina, viene inizialmente rimosso l' anello furanico D con ottenimento dei
morfinani (ad es. levorfanolo). Per eliminazione anche dell' anello C si ha la serie dei benzomorfani
(ad es. fenazocina). La più semplice modificazione della morfina può essere osservata nella meperidina. Infine, perfino nella molecola del metadone si riconoscono i resti dell' anello piperidinico (E).
51
Associazione (o Complicazione) Molecolare
Consiste nella sintesi di analoghi più complessi del composto guida. I processi di
complicazione molecolare si possono distinguere in processi di:
- replicazione molecolare;
- ibridazione molecolare;
- addizione molecolare.
La replicazione molecolare consiste nell' associazione di unità identiche mediante
formazione di legami covalenti (raddoppiamento molecolare, triplicazione molecolare, etc.):
A
nA
n-1
A
A
A
es: 2A
3A
A
A
A
Il caso di gran lunga più frequente è rappresentato dal raddoppiamento molecolare.
L' ibridazione molecolare consiste invece nella associazione di unità diverse, sempre
mediante formazione di legami covalenti:
A+B
A
B
L' addizione molecolare consiste infine nell' associazione tra due unità differenti mediante
interazioni non covalenti:
A+B
A
B
Il raddoppiamento e l' ibridazione molecolari riguardano la costruzione dei cosidetti "twin
drugs", farmaci che derivano appunto dalla combinazione covalente di due porzioni farmacofore
identiche o diverse.
Essi possono essere legati direttamente fra loro, separati da uno spaziatore oppure addirittura
sovrapposti parzialmente.
A
A
A
+
A
o
B
A
A
A
A
o
A
o
o
A
B
A
B
B
I twin drugs possono rigenerare in vivo i costituenti (questo si verifica soprattutto per gli
ibridi molecolari) oppure no (questo invece vale per entrambi i tipi di twin drugs). Nel primo caso si
tratta di profarmaci reciproci (i due principi attivi si rendono profarmaci a vicenda); il twin drug è di
per sé inattivo, si scinde in vivo (in genere attraverso un processo di idrolisi) e rigenera i due
componenti attivi. Lo scopo del twin drug è quello di migliorare le proprietà farmaceutiche e
farmacocinetiche. Un profarmaco reciproco avrà un' alta probabilità di successo a patto che esso
venga ben assorbito, entrambi i componenti siano rilasciati contemporaneamente e quantitativamente dopo assorbimento ed ingresso in circolo, l' effetto massimo si verifichi con un rapporto tra
essi di ~ 1:1 (in altre parole non ci deve essere una differenza troppo grande tra le concentrazioni
attive dei due componenti).
52
Un esempio è fornito dalla sultamicillina, un ibrido molecolare tra l' ampicillina, un
antibiotico β-lattamico ad ampio spettro sensibile alle β-lattamasi ed il sulbactam, un inibitore
suicida delle β-lattamasi. Mentre il sulbactam è scarsamente assorbito per via orale, una volta
combinato sotto forma di doppio estere con l' ampicillina fornisce un ibrido assorbito rapidamente e
completamente, con liberazione quantitativa e contemporanea dei due componenti. L' associazione
presenta massima attività proprio nel rapporto 1:1 dei due componenti che, oltretutto, vengono
distribuiti ed eliminati in maniera analoga.
NH 2
O
H
O
H
N
H
S
O
N
O
CH 3
H 3C
CH 3
O
H 3C
O
S
N
O
O
O
Sultamicillina
Idrolisi in vivo
NH 2
H
N
O
O
H
H
S
N
O
CH 3
CH 3
CO 2H
Ampicillina
+
N
O
O
S
CH 3
CH 3
CO 2H
Sulbactam
Anche nel caso di ibridi molecolari che non vengono scissi in vivo il principale vantaggio
rispetto alla somministrazione dei due principi attivi separati è di carattere farmacocinetico, poiché
l' ibrido ha un unico profilo farmacocinetico. Nel caso di somministrazione dei due componenti
separati invece, ciascuna attività dipenderà dai profili individuali di assorbimento, metabolismo ed
ecrezione. Una molecola di ibrido che non si scinde in vivo non è generalmente in grado di
interagire simultaneamente con i due differenti bersagli biologici delle due porzioni dell' ibrido.
Un esempio di ibrido che non
viene scisso in vivo è l' antiipertensivo
Cl
a fianco che combina nella sua struttura una porzione con proprietà β-blocH
N
canti ed una con proprietà diuretiche.
O
N
S
SO2NH2
H
Da sottolineare che l' associazione di
O
O
OH
un β-bloccante e di un diuretico è larPorzione diuretica
gamente impiegata come terapia di
prima scelta nel trattamento dell' iperPorzione β-boccante
tensione essenziale.
53
Per quanto riguarda i prodotti di raddoppiamento molecolare, la loro base razionale non è
sempre evidente e si fonda in genere sull' esistenza di una struttura simmetrica della macromolecola
bersaglio (ad esempio una proteina oligomerica) e sulla conseguente possibilità per il dimero di
adattarsi contemporaneamente a due siti di legame simmetrici e contigui della proteina. Esempi di
recettori simmetrici sono i recettori muscarinici, adrenergici, oppiacei, dell' insulina, del fattore di
aggregazione piastrinica; esempi di enzimi simmetrici sono la trascrittasi inversa e la proteasi dello
HIV, diverse protein chinasi, la prolil idrolasi.
farmacoforo
raddoppiato
Proteina dimerica
Profarmaci
Con il termine di profarmaco si intende una sostanza inattiva che viene attivata in vivo
attraverso una biotrasformazione metabolica. Un profarmaco può anche essere attivato mediante un
processo non enzimatico, ma in questo caso il composto è in genere intrinsecamente instabile e può
dare problemi di stabilità. I profarmaci possono essere suddivisi in due categorie: profarmaci
propriamente detti (indicati in inglese come carrier-prodrugs, cioè profarmaci basati sull' impiego di
un trasportatore) e bioprecursori.
I profarmaci propriamente detti sono derivati inattivi dei farmaci; il farmaco cioè viene
trasformato chimicamente in un derivato inattivo il quale poi nell' organismo rigenera il farmaco
originale secondo lo schema seguente:
FARMACO
UNITA'
TRASPORTATRICE
TEMPORANEA
+
ATTIVO
SINTESI CHIMICA
RIGENERAZIONE
IN VIVO
UNITA'
TRASPORTATRICE
TEMPORANEA
FARMACO
'CARRIER PRODRUG'
INATTIVO
I bioprecursori non implicano un legame temporaneo tra il farmaco ed un gruppo
trasportatore ma consistono in precursori strutturali di farmaci. Si comportano da substrati di enzimi
54
delle categorie ossidasi, reduttasi, chinasi, soprattutto e generano in vivo il metabolita attivo.
Esempi di bioprecursori che subiscono una attivazione ossidativa sono il proguanile, la
ciclofosfamide e la procarbazina; esempi di bioprecursori che subiscono invece una attivazione
riduttiva sono la sulfasalazina e la mitomicina; esempi infine di bioprecursori che subiscono una
attivazione fosforilativa sono tutti gli analoghi nucleosidici ad attività antivirale e antineoplastica.
Un esempio storico di bioprecursore è rappresentato dal Prontosil rosso, un colorante azoico
che viene convertito in vivo a sulfanilamide, l' effettivo responsabile dell' attività antibatterica; tale
scoperta aprì la strada nella seconda metà degli anni trenta allo sviluppo dei sulfamidici.
H 2N
SO 2 NH 2
Sulfanilamide
H 2N
N N
SO 2NH 2
NH 2
H 2N
Prontosil rosso
NH 2
NH 2
Nel quadro seguente sono riassunti le principali finalità dei profarmaci.
a) miglioramento delle caratteristiche farmacocinetiche
(assorbimento e distribuzione)
Aumento sitospecificità
Aumento biodisponibilità
Aumento durata d' azione
b) miglioramento della stabilità metabolica
c) miglioramento dell' accettabilità
d) mascheramento degli effetti collaterali e della tossicità
Vediamo alcuni esempi di realizzazioni di profarmaci.
La trasformazione di un farmaco in un suo derivato più lipofilo può avere come obiettivi un
miglioramento dell' assorbimento (con conseguente aumento della biodisponibilità) ed un aumento
della durata d' azione. L' ampicillina che possiede sia una funzione amminica che una funzione
carbossilica è zwitterionica e quindi viene assorbita incompletamente nel tratto gastrointestinale. Il
suo ampio spettro d' azione associato ad una quota non trascurabile del farmaco non assorbito nel
tratto intestinale è responsabile dell' elevata incidenza di diarrea (8-10%). La bacampicillina, un
doppio estere inattivo dell' ampicillina è invece bene assorbita e, una volta entrata in circolo, viene
rapidamente e quantitativamente idrolizzata per ridare l' ampicillina. L' utilizzo di un doppio estere
è dettato dal fatto che nelle penicilline l' intorno del gruppo carbossilico è altamente ingombrato e
quindi esteri alifatici semplici non sono sufficientemente labili.
55
NH 2
H
N
O
O
H
S
N
CH 3
H 2O
CH 3
O
O
O
O
Bacampicillina
(estere etossicarbonil-1-ossietilico)
CH 2 CH 3
CH 3 O
doppio estere
NH 2
H
N
H
O
N
O
S
CH 3
+
CH 3
CH 3 CHO + CH 3CH 2 OH + CO 2
CO 2H
Ampicillina
Gruppi esterei altamente lipofili sono impiegati nella preparazione di profarmaci a lento
rilascio in circolo. Tali profarmaci vengono disciolti in un veicolo oleoso e somministrati per via
intamuscolare. A causa del loro elevato coefficiente di ripartizione, il rilascio dal sito di iniezione è
lento. Una volta entrato in circolo, l' estere viene poi rapidamente idrolizzato. I vantaggi di un
rilascio lento e prolungato sono: riduzione del numero delle dosi, minimizzazione dei problemi di
accettabilità, eliminazione dei picchi di concentrazione e diminuzione degli effetti tossici. Esempi al
riguardo sono gli esteri del testosterone e l' aloperidolo decanoato. Il testosterone, ormone
androgeno naturale, quando viene somministrato come tale per via parenterale, ha una breve
emivita. I suoi derivati esterei danno risposte della durata di 2-4 settimane. Analogamente, l' azione
antipsicotica dell' aloperidolo decanoato ha una durata di ~ 1 mese.
O
OR
N
OR
F
O
Cl
R = H; testosterone
R = COCH 2CH 3 ; testosterone propionato
R = CO(CH 2)5 CH 3; testosterone enantato
R = CO(CH 2)9 CH 3; testosterone undecanoato
R = H; aloperidolo
R = CO(CH 2)8CH 3 ; aloperidolo decanoato
Il miglioramento della idrofilicità può costituire una condizione essenziale per la
somministrazione di un farmaco per via endovenosa o anche per assicurare una sufficiente
idrosolubilità nei fluidi gastrointestinali nel caso di somministrazione orale. L' aciclovir, uno tra i
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più noti antivirali, ha una biodisponibilità modesta (10-30%) a causa della sua scarsa idrosolubilità.
Il valaciclovir è l' estere con la L-valina dell' aciclovir. Si tratta di un profarmaco idrosolubile che
viene convertito rapidamente e pressoché completamente in aciclovir nel corso del primo passaggio
nel fegato. La biodisponibilità dell' aciclovir aumenta da tre a cinque volte in seguito a
somministrazione di valaciclovir.
O
O
HN
H2N
HN
N
N
N
O
OH
H 2N
Aciclovir
N
N
N
O
O
O
NH 2
Valaciclovir
Il ricorso a profarmaci consente in alcuni casi di prevenire il metabolismo presistemico. Il
propranololo (un cardiovascolare adrenergico β-bloccante),
sebbene significativamente ionizzato a pH fisiologico, è
altamente lipofilo ed accede facilmente all' ambiente
O
N
microsomiale epatico dove subisce vari processi di
H2+
inattivazione. Il suo emisuccinato invece è uno ione bipolare e
OR
non entra in contatto con gli enzimi microsomiali. Una volta
entrato nella circolazione sistemica, l' emisuccinato viene
idrolizzato ad opera di esterasi non specifiche per dare il
R = H; propranololo
propranololo, con ottenimento di livelli plasmatici superiori di
R = COCH2CH2CO2-; emisuccinato
otto volte rispetto all' impiego diretto del propranololo.
I profarmaci sono talvolta impiegati allo scopo di
minimizzare l'odore o il sapore sgradevoli di certi farmaci o di
CH3
eliminare il dolore al sito di iniezione. Un esempio di miN
glioramento dell' accettabilità di un farmaco mediante l' uso di
CH
3
C3H7
un suo profarmaco è rappresentato dalla clindamicina fosfato.
H
Cl
Mentra la clindamicina, un antibiotico della categoria delle
NH
H
O
lincosamidi,
causa dolore quanto viene iniettata, il fosfato è
HO
O
ben tollerato; l' idrolisi del profarmaco avviene con un t1/2 di ~
OH
10 minuti.
SCH3
Il mascheramento degli effetti collaterali e della tosOR
sicità
è
spesso una conseguenza del miglioramento dell' asR = H; clindamicina
sorbimento, della sito-specificità e di un rilascio prolungato.
R = PO3H2; fosfato
Così, ad esempio, l' epinefrina, usata nel trattamento del
glaucoma, presenta una serie di effetti collaterali oculari e siOH
stemici. Il suo profarmaco dipivaloilepinefrina (dipivefrina), in
RO
NHCH3
grado di penetrare la cornea più efficacemente dell' epinefrina,
ha un profilo di tossicità significativamente migliore.
Un' altro esempio dell' utilità dell' impiego dei
RO
profarmaci per diminuire la tossicità di un farmaco è dato dagli
R = H; epinefrina
esteri dell' aspirina. Gli effetti collaterali associati alla aspirina
R = COCMe3; dipivefrina
sono irritazione gastrica e lesioni emorragiche. L' esterificazione dell' aspirina sopprime grandemente il potenziale ulcerogenico del farmaco. Tuttavia, l' esterificazione rende anche il gruppo acetilossi estremamente suscettibile all' idrolisi enzimatica. Da
ricordare che l' aspirina agisce come tale da inibitore irreversibile nei confronti degli enzimi
cicloossigenasi (COX) , mentre sotto forma del suo metabolita acido salicilico si comporta da
inibitore reversibile degli stessi enzimi.
57
Omologia Lineare e Ciclica
Consiste nell' esplorazione di una serie omologa, cioè una serie di composti che differiscono
tra loro per una unità costante, generalmente un gruppo CH2. I casi più frequenti in chimica
farmaceutica sono quelli dei derivati monoalchilati, dei composti ciclometilenici e dei composti
bifunzionalizzati polimetilenici.
R X
R CH2X
R CH2CH2X , eccetera
Il risultato che si osserva più
frequentemente in una serie omolga
derivati monoalchilati
è un aumento, regolare o irregolare
dell' attività con l' aumentare del numero di gruppi CH2 fino ad un massimo, seguito poi da una diminuzione. Questo andamento è interpreX
X
(CH2)n
(CH2)n+1
tato comunemente come conseguenza di un coefficiente di ripartizione
ottimale associato alla massima facomposti ciclometilenici
cilità di attraversamento delle membrane biologiche. Il successivo calo
di attività è attribuito alla insuffiX (CH2)n+1 Y
X (CH2)n Y
ciente idrosolubiltà che rende problematico il trasporto del farmaco.
composti bifunzionali polimetilenici
Un esempio al riguardo è
costituito da composti anticolinergici a struttura di sali d' ammonio quaternari di dialchilammino etil esteri dell' acido benzilico.
Attività
+
CO 2 CH 2CH 2 N
R1
R2
R3
OH
R 1 = R 2 = Me
(Anticolinergici)
H
Me Et
nPr nBu
R3
L' attività cresce con il crescere della lunghezza della catena alifatica R3, riducendosi già
dopo C2.
Oltre ad influenzare la farmacocinetica di un farmaco, la lunghezza di una catena alifatica è
in grado di influenzarne la farmacodinamica nel caso in cui la catena sia coinvolta nell' interazione
con la macromolecola bersaglio.
Un caso interessante che illustra come allungamenti progressiAttività
Attività
ganglioplegica
curarizzante
vi di catene alifatiche possano portare a variazioni nel meccanismo di
azione è quello dei derivati polimetilene-bisammonici con struttura
Me3N+-(CH2)n-+NMe3 ad azione
ganglioplegica (blocco della trasmissione nervosa mediata dai recettori nicotinici a livello gangliare) e
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
curarizzante (blocco a livello invece
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
58
13
CO 2Et
CO 2 Et
N
N
Et
Meperidina
Et
Etoeptazina
della placca motrice). A partire da n = 1 si ha un incremento del primo tipo di attività che raggiunge il massimo per n = 6 (esametonio bromuro). L' attività ganglioplegica quindi diminuisce fino a scomparire mentre
compare l' attività curarizzante che raggiunge l' apice
per n = 10 (decametonio ioduro).
Un esempio infine di cicloomologia è fornito
dalla copia meperidina-etoeptazina (analgesici morfinosimili).
Sostituzioni Bioisosteriche
Le sostituzioni bioisosteriche sono modificazioni in cui un atomo o un gruppo di atomi della
molecola prototipo sono sostituiti con atomi o gruppi con caratteristiche steriche ed elettroniche
approssimativamente simili con il risultato di ottenere analoghi in grado di interagire con lo stesso
sistema biologico del prototipo , comportandosi da agonisti o da antagonisti. Il termine bioisosteri si
applica sia agli atomi o gruppi con caratteristiche simili che alle molecole ottenute mediante
sostituzioni bioisosteriche. Esso costituisce un' estensione al campo dei composti biologicamente
attivi del concetto di isosteria.
Il concetto di isosteria è stato originariamente introdotto da Langmuir nel 1919 per spiegare
perché alcune specie chimiche presentassero proprietà chimico-fisiche simili tra loro. Tale fatto
venne da Langmuir attribuito alla identità nel numero complessivo degli elettroni di tali specie che
furono indicate col termine di isosteri.
Coppie di isosteri vennero considerate ad esempio N2 e CO (14 elettroni), CO2 ed N2O (22
elettroni), N3- e NCO- (21 elettroni) e CH2N2 e CH2CO (22 elettroni). Il confronto delle proprietà
chimico-fisiche di CO2 ed N2O è una evidente dimostrazione delle similitudini tra isosteri.
Proprietà
CO2
N2O
Carica elettronica complessiva
Peso molecolare
Viscosità (20°, 1 atm)
Pressione critica (atm)
Temperatura critica (°C)
Conducibilità termica a 100 °C
Indice di rifrazione del liquido (0 °C)
Costante dielettrica del liquido (0 °C)
Solubilità in acqua (0 °C)
Solubilità in alcool (15 °C)
22
44,01
148x10-6
77
31,9
0,0506
1,190
1,582
1,780
3,13
22
44,02
148x10-6
75
35,4
0,0506
1,193
1,598
1,305
3,25
Il concetto di isosteria è stato successivamente elaborato da Grimm (1924) con la sua regola
dello spostamento degli idruri con cui costruire serie di isosteri. Colonne di isosteri si ottengono
agiungendo un atomo di idrogeno ad un elemento di una riga del sistema periodico e scalando di un
posto verso destra l' aggruppamento così ottenuto ed indicato con il termine di pseudoatomo. La
tabella seguente è limitata agli elementi biologicamente interessanti.
59
Regola dello Spostamento degli Idruri di Grimm
Elettroni
totali
6
7
8
9
10
C
N
CH
O
NH
CH2
F
OH
NH2
CH3
Ne
HF
H2O
NH3
CH4
A partire dal 1932 infine Erlenmeyer pubblicò una serie di studi sul concetto di isosteria,
proponendo una propria definizione di isosteri come elementi, molecole o ioni in cui gli strati
eletronici periferici sono identici. Secondo la definizione di Erlenmeyer sono quindi isosteri gli
elementi di uno stesso gruppo del sistema periodico.
Atomi e Gruppi con Identico Numero di Elettroni Periferici (Erlenmeyer)
Elettroni
periferici
4
5
6
7
8
C
N
O
F
HF
N+
P
S
Cl
HCl
P+
S+
PH
Br
BrH
I
HI
OH
H2O
SH
H2S
PH2
PH3
L' estensione del concetto di isosteria al campo dei prodotti biologicamente attivi ha portato,
come accennato all' inizio, all' introduzione del termine bioisosteria da parte di Friedman (1951).
Secondo Friedman sono bioisosteri atomi o raggruppamenti di atomi per lo più (ma non
esclusivamente) isosteri secondo le definizioni o di Grimm o di Erlenmeyer, la cui reciproca
sostituzione in una molecola farmacologicamente attiva produce composti con lo stesso tipo di
attività, anche antagonista.
Una definizione più elastica di bioisostere che riflette la constatazione che le similitudini
biologiche compaiono più spesso di quanto lascino prevedere le regole di isosteria è quella proposta
da Thornber nel 1979 e che è stata anticipata all' inizio del paragrafo: bioisosteri sono molecole che
derivano dalla sostituzione di un atomo o di un gruppo con atomi o con gruppi con caratteristiche
steriche ed elettroniche approssimativamente simili con il risultato di ottenere analoghi in grado di
interagire con lo stesso sistema biologico del prototipo , comportandosi da agonisti o da antagonisti.
In diversi casi gli atomi o i gruppi interscambiabili rientrano nelle definizioni di isosteri
secondo Grimm o Erlenmeyer. Esistono cioè per essi delle corrispondenze in termini di numero
totale di elettroni o di numero di elettroni periferici. Questi sono i cosiddetti bioisosteri classici che
possono essere suddivisi in 5 categorie come mostrato nell' elenco seguente.
60
BIOISOSTERI CLASSICI
1. Atomi e Gruppi Monovalenti
4. Atomi Tetrasostituiti
-F, -OH, -NH2, -CH3
-Cl, -SH, -PH2, -SiH3
-Cl, -Br, -I
=N+=, =P+=, =C=
2. Atomi e Gruppi Bivalenti
-CH=CH-, -S-, -O-, -NH-N=, -CH=
5. Equivalenti anulari
-O-, -S-, -NH-, -CH23. Atomi e Gruppi Trivalenti
-N=, -P=, -CH=
Il significato della quinta categoria è illustrato dalla seguente serie di sistemi anulari
O
N
H
S
N N
S
N
N
N
N
N
N
N
Essi possono essere scambiati reciprocamente in una molecola con mantenimento probabile
del tipo di attività.
I bioisosteri non classici invece sono serie di gruppi che non rientrano nelle definizioni di
isosteri di Grimm o di Erlenmeyer. Le somiglianze tra essi sono più vaghe e spesso il loro
accostamento deriva dalla constatazione che in vari tipi di molecole il loro interscambio ha prodotto
serie di composti con lo stesso tipo di attività.
BIOISOSTERI NON CLASSICI
1. Gruppi Interscambiabili
2. Modelli Aperti - Modelli Chiusi
-Cl, -CF3
-CO-, -SO2-CO2H, -SO3H, -PO(OR)OH
-CO2H, -SO2NHR
-NO2, -SO2CH3, -COCH3
61
Relazioni Quantitative Struttura-Attività' (QSAR)
L' attività di un composto è, com' è noto, influenzata in maniera determinante dalle sue
proprietà chimico-fisiche. Lo scopo delle QSAR è di individuare delle relazioni con valore
predittivo tra le proprietà biologiche del composto ed una serie di parametri che esprimono
quantitativamente certe proprietà chimico-fisiche (ad es. parametri elettronici, di ripartizione,
sterici).
Nei metodi 2D QSAR l' attività è espressa in funzione di parametri chimico-fisici all' interno
di un set di composti strutturalmente omogenei, di composti cioè con una struttura base comune e
che differiscono tra loro per la natura, la posizione ed il numero dei sostituenti presenti. Le
variazioni di attività sono conseguenza delle variazioni dei parametri considerati, variazioni a loro
volta legate alle caratteristiche dei sostituenti.
Metodo di Hansch
L' approccio matematico più popolare è il metodo di Hansch.
Esso considera gli aspetti chimico-fisici sia del trasporto e della distribuzione del farmaco
che dell' interazione di esso con il recettore. Nella sua formulazione originale ipotizza che in un
dato gruppo di principi attivi con strutture analoghe ed agenti mediante lo stesso meccanismo
giochino un ruolo principale tre parametri chimico-fisici che quantificano le proprietà elettroniche,
di lipofilia e steriche dei sostituenti:
- la costante di sostituente di Hammett σ;
- la costante di sostituente di lipofilia π;
- il parametro sterico di Taft Es.
a) Effetti Elettronici
Sono espressi dalla costante di sostituente di Hammett σ. La costante σ è stata introdotta in
chimica organica negli anni '40 da Hammett per quantificare l' influenza sulla reattività chimica di
un composto aromatico dei sostituenti presenti sull' anello stesso. Compare nelle equazioni di
Hammett: lg(kx/ko) = ρσ, in cui k può essere sia una costante di velocità che una costante di
equilibrio; kx si riferisce al composto con il sostituente X, ko al composto senza sostituenti. Il
valore di σ dipende dalle proprietà elettroniche e dalla posizione del singolo sostituente ( così,
σmeta e σpara per lo stesso sostituente non sono generalmente uguali) e rappresenta una misura
della capacità del sostituente X di cedere o attrarre elettroni. Più elettronattrattore è un sostituente,
maggiormente positivo è il valore di σ (rispetto ad H che è posto pari a 0). La costante σ è additiva,
cioè sostituenti multipli esercitano un' influenza complessiva pari alla somma dei singoli sostituenti.
La seconda costante presente nelle equazioni di Hammett, costante ρ, chiamata costante di reazione,
dipende invece dal tipo di reazione ed indica la sensibilità della reazione agli effetti elettronici dei
sostituenti. Reazioni che sono favorite da una elevata densità elettronica nello stato di transizione
hanno valori negativi di ρ mentre, al contrario, posseggono valori positivi di ρ reazioni che sono
agevolate da una bassa densità elettronica.
b) Effetti di Lipofilia
Si è già detto dell' importanza del coefficiente di ripartizione P ai fini della attività (pg. 13).
Hansch, studiando il coefficiente di ripartizione tra n-ottanolo ed acqua di una serie di derivati, ha
evidenziato, in analogia con quanto fatto da Hammett per il parametro σ, un parametro π (costante
di sostituente di lipofilia) definito come:
π = lg PX - lg PH = lg (PX/PH)
62
dove PX è il coefficiente di ripartizione del composto con il sostituente X e PH è quello del
composto non sostituito. Come nel caso della costante di sostituente di Hammett, anche π può
essere positiva o negativa ed è additiva, cioè sostituenti multipli esercitano un' influenza
complessiva pari alla somma dei singoli sostituenti.
c) Effetti Sterici
Un altro importante parametro chimico-fisico è il parametro sterico di Taft. Taft ha definito
il parametro sterico Es allo stesso modo in cui Hammett ha quantizzato gli effetti elettronici dei
sostituenti e Hansch quelli di lipofilia:
Es = lg (kX/kH)
in cui kX e kH sono le costanti di velocità di idrolisi acida degli esteri metilici di a-cidi acetici
monosostituiti XCH2CO2Me e dell' acetato di metile CH3CO2Me, rispettivamente. Taft usò questa
reazione di riferimento dal momento che la sua velocità è controllata da soli fattori sterici. I valori
di Es sono tutti negativi.
I parametri elettronici, di lipofilia e sterici descritti sono stati inseriti da Hansch nella
seguente equazione:
lg(1/C) = -aπ2 + bπ + ρσ + cEs + d
dove C è la concentrazione molare di farmaco che provoca un ben definito effetto biologico mentre
a, b, c e d sono dei coefficienti che possono essere ricavati mediante metodi matematici (analisi di
regressione lineare multipla), misurando le concentrazioni C per una serie di sostanze
strutturalmente correlate. Una volta che tali coefficienti siano stati ottenuti, l' equazione può essere
utilizzata per predire i valori di C e quindi l' attività di composti non saggiati o non ancora
sintetizzati.
Il reciproco della concentrazione C riflette il fatto che una maggiore potenza è associata ad
una dose più bassa, mentre il segno negativo per il termine π2 riflette il fatto che esiste un valore
ottimale ai fini dell' attività del coefficiente di ripartizione P. La curva che descrive l' effetto del lg P
sulla risposta biologica, espressa come lg (1/C), è infatti una parabola e la sua espressione è:
lg (1/C) = - k (lg P)2 + k' lg P + k''
Nella scelta dei sostituenti da inserire possono essere utili, una volta stabiliti i segni e le
grandezze dei vari coefficienti, diagrammi quali quello di Craig (pagina seguente) che esprime
combinazioni di coppie π-σ. I sostituenti si distribuiscono in 4 quadranti identificati dalle coppie:
+σ, -π; +σ, +π; -σ, +π; -σ, -π.
L' equazione ρ-σ-π di Hansch è stata applicata con successo in centinaia di casi sia nella sua
forma completa che in versioni ridotte. Sono stati successivamente impiegati parametri diversi da π,
σ ed Es per descrivere le proprietà globali della molecola ed il contributo dei singoli sostituenti. La
forma più generale dell' equazione impiegata nell' analisi di Hansch è quindi:
lg (1/C) = a (parametro idrofobico) + b (parametro elettronico) + c (parametro sterico) + d (altro
parametro) + e
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Diagramma σ-π di Craig per sostituenti in para
Metodo di Free-Wilson
Non molto dopo che Hansch propose il suo approccio, Free e Wilson riportarono un metodo
matematico per l' ottimizzazione dei sostituenti di una struttura fondamentale basato sulla
assunzione che la risposta biologica è la somma dei contributi indipendenti dei sostituenti e della
struttura fondamentale. In tal modo, se si assegna ai possibili sostituenti un certo valore di
contributo all' attività biologica, si possono predire i composti con la massima attività. Naturalmente
ciò funziona solo se i contributi dei sostituenti sono additivi. Nel metodo di Free-Wilson si
prescinde dalle proprietà chimico-fisiche dei vari sostituenti e si attribuisce a ciascuno di essi un
certo contributo di attività che è indipendente dall' effetto dei sostituenti nelle altre posizioni.
Si potrà così scrivere che l' attività [espressa come lg (1/C)] del composto i-esimo di una
serie è:
lg (1/C) = Σ aiXi + µo
dove ai è il contributo del sostituente i-esimo, Xi è il sostituente i-esimo con un valore di 1 se
presente e di 0 se assente e µo è l' attività della struttura base. Anche in questo caso, l' analisi di
regressione è impiegata per determinare ai e µo.
Questo metodo ha trovato applicazione soprattutto nelle fasi iniziali della ricerca di relazioni
quantitative struttura-attività quando siano disponibili già diversi analoghi dei quali non si
conoscono i dati chimico-fisici.
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Metodo di Topliss
Topliss ha sviluppato nel 1972 una guida all' uso dei principi di Hansch non matematica,
non statistica e non computerizzata. Si tratta di un metodo empirico nel quale ciascun composto è
testato prima di pianificare un analogo successivo e confrontato in termini di proprietà chimicofisiche con analoghi già provati. Questo metodo è soprattutto utile quando la sintesi di un gran
numero di composti è difficoltosa. Costituisce un approccio manuale per l' efficiente ottimizzazione
di un composto guida, minimizzando il numero dei composti da sintetizzare. L' approccio è basato
soprattutto sui valori di σ e π. Vediamo un esempio riferito ad un ipotetico composto aromatico.
Sono disponibili anche schemi operativi per sistemi non-aromatici.
Supponiamo di avere un composto di natura aromatica e non sostituito sull' anello benzenico
con una attività interessante che giustifichi la ricerca di possibili derivati più attivi. Poichè molti
sistemi sono +π dipendenti, cioè la loro attività aumenta con l' aumentare della lipofilia, una buona
scelta per il primo analogo è rappresentata dal 4-Cl derivato poichè esso possiede un buon π (0.71)
ed una media capacità elettronattrattrice (σ = 0.23). Una volta preparato e testato il derivato, si
presenterà uno dei casi seguenti: il 4-Cl derivato è più attivo (P), egualmente attivo (E) oppure
meno attivo (M) del composto non sostituito. Se esso è più potente (P), ciò può esere attribuito ad
un effetto +π, ad un effetto +σ, oppure ad entrambi. Si può allora sintetizzare il 3,4-dicloro derivato
per il quale si ha un valore di π = 1.25 ed un valore di σ = 0.52 e testarlo. Nel caso di un ulteriore
aumento di attività, la determinazione dell' importanza relativa degli effetti +π e +σ può essere
effettuata selezionando successivamente il 4-PhS analogo (π = 2.32, σ = 0.18) oppure il 3-CF3, 4NO2 analogo (π = 0.60, σ = 1.21). A questo punto si può costruire uno schema e preparare altri
analoghi.
4-H
4-Cl
M
3-Cl
o 4-OMe
E
4-Me
o 4-NO2
M
P
3,4-Cl2
E
4-CF3
4-SPh
o 3-CF3 , 4-NO2
P
4-NO2
o 4-Et
P
M
E
P
Se invece il 3,4-dicloro derivato si fosse dimostrato meno potente del 4-Cl analogo, la causa
poteva essere attribuita o ad un superamento dei valori ottimali di π e σ oppure ad un effetto sterico
sfavorevole. Quest' ultima ipotesi può essere verificata provando il 4-CF3 analogo (π = 0.88; σ =
0.54), che non ha un sostituente in 3 ma possiede un alto valore di σ ed un valore intermedio di π.
Se questo analogo è più potente del 4-Cl, si possono sintetizzare il 4-NO2 (π = -0.28; σ = 0.78) oppure il 4-Et (π = 1.02; σ = -0.15) allo scopo di determinare l' importanza di π e σ, rispettivamente.
Se il 4-Cl analogo è meno potente del composto guida, si deve dedurre o che vi è un
problema sterico alla posizione 4 oppure che l' aumento di potenza dipende da valori -π o -σ. Si può
sintetizzare il 3-Cl analogo (π = 0.71, σ = 0.37) per verificare la prima ipotesi ed il 4-MeO derivato
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(π = -0.04; σ = -0.27) per valutare le conseguenze dell' introduzione di un sostituente -σ. Nel caso
di un aumento di attività, si possono provare altri sostituenti con valori di π e/o di σ più negativi.
Se infine il 4-Cl derivato è equipotente con il composto guida, ciò può essere la conseguenza
di un bilanciamento tra un favorevole effetto +π ed uno sfavorevole effetto -σ, o viceversa. Nel
primo caso, il 4-Me analogo (π = 0.56; σ = -0.17) dovrebbe mostrare una maggiore potenza, nel
secondo caso dovrebbe essere invece il 4-NO2 (π = -0.28; σ = 0.78) ad essere più attivo.
3D QSAR
Le QSAR tridimensionali si applicano in genere ad una serie di composti con maggiore
varietà strutturale rispetto alle QSAR bidimensionali. Ciò deriva dal fatto che le molecole sono
descritte da proprietà calcolate direttamente dalle loro strutture tridimensionali mentre nelle 2D
QSAR le proprietà vengono stimate da costanti di sostituente misurate su molecole strutturalmente
correlate tra loro. Quindi una 3D QSAR può essere più generale di una 2D QSAR.
Il metodo più usato nelle 3D QSAR è l' analisi comparativa del campo molecolare (CoMFA).
L' analisi CoMFA inizia con la scelta di un gruppo di molecole (training set), anche molto
diverse tra loro, per le quali si hanno a disposizione i dati biologici. Le molecole vengono quindi
allineate sulla base di studi di modellistica molecolare rivolti all' individuazione della
conformazione farmacofora e del farmacoforo per ciascuna molecola. Nella figura successiva è
mostrata la sovrapposizione di una serie di farmaci agenti come antagonisti sul recettore 5-HT1A
CH 3
N
F
N
N
N
O
SCH 3
N
H
O
S
R-Metitepina
Spiperone
O
O
OH
N
H
N
N
N
N
O
N
Metitepina (verde), Spiperone (celeste), Propranololo
(rosa), Buspirone (viola). Il contorno nero rappresenta
l' ipotetico volume della cavità recettoriale
CH3
N
N
SCH3
S
Propranololo
Buspirone
Una volta che le molecole siano state allineate sulla
base di caratteristiche molecolari comuni in modo da
occupare lo stesso volume di spazio, esse vengono
circondate da una griglia tridimensionale che si
estende per circa 4 Å attorno a tutte le molecole
(figura a lato). La spaziatura dei nodi della griglia è di
solito di 1-2 Å. In ogni punto della griglia vengono
quindi calcolati i valori delle intensità dei campi di
interazione intermolecolare che circondano ogni
molecola. Tali campi sono valutati mediante piccoli
gruppi o atomi sonda con proprietà steriche ed
elettrostatiche specifiche alle intersezioni di una
griglia 3D che racchiude le molecole. Vengono
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calcolati campi sterici ed elettrostatici mentre nel CoMFA standard non sono presi in considerazioni
quelli idrofobici. Come in tutti gli studi QSAR, anche nel CoMFA si costruisce una tavola di dati in
cui l' attività biologica di ciascun composto è contenuta nella prima colonna mentre in tutte le altre
sono contenuti i parametri strutturali e cioè le intensità delle interazioni steriche ed elettrostatiche
del composto con le sonde.
Composto
C1
C2
Cn
Attività
S001
S002...S998
E001...E998
Attività = a + b (S001) + c(S002) + ...m(S998) + n(E001) + ...z(E998)
Si tratta poi di trovare una equazione che correli l' attività biologica di ciascuna molecola
con i campi esercitati da essa su qualsiasi atomo che la circondi. La difficoltà matematica consiste
nel dovere risolvere una equazione con migliaia di coefficienti metre le misure biologiche sono
poche decine. La procedura impiegata è quella della regressione multivariata PLS.
L' equazione viene in genere visualizzata come mappa di contorno tridimensionale che
rappresenta regioni nello spazio attorno alla molecola in cui si verificano interazioni steriche o
elettrostatiche positive o negative con il recettore (Figura successiva). I contributi sterici ed
elettrostatici son espressi con contorni separati così come i contributi positivi e quelli negativi. I
contorni sterici positivi mostrano regioni dello spazio che, se occupate da gruppi del farmaco,
aumentano la potenza del composto; mentre i contorni negativi la diminuiscono. Per quanto
riguarda invece i contorni elettronici, vi saranno zone in cui i gruppi con carica parziale di un certo
segno determinano una interazione favorevole con il recettore, per cui in quella zona vanno evitati
gruppi con carica parziale opposta.
I poliedri verdi e gialli identificano zone in cui una maggiore interazione sterica aumenta e
diminuisce, rispettivamente, l' affinità per il recettore. I poliedri rossi identificano zone in cui un
potenziale elettrostatico più negativo migliora l' affinità; quelli blu individuano regioni in cui al
contrario l' affinità migliora con un potenziale più positivo.
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