Biol. Mar. Medit. (2006), 13 (1): 1006-1010
A. Karuza, P. Del Negro*
Istituto Nazionale di Oceanografia e di Geofisica Sperimentale - O.G.S.,
Via A. Piccard, 54 - 34010 Trieste, Italia
[email protected]
VIRIOPLANCTON NEL GOLFO DI TRIESTE
VIRIOPLANKTON IN THE GULF OF TRIESTE
Abstract
Viruses represent the smallest and the most abundant biological entities in the marine environments. In
the present study we reported the temporal (2000-2004) variability of VLP abundances along the water
column in a coastal station (C1) of the Gulf of Trieste (Northern Adriatic Sea). The viral abundance
variations ranged by over three orders of magnitude in the 4 depth sampled reaching the maximum value of
3.5×108 mL-1. Virus-to-Bacterium Ratio (VBR) over this five years survey have also been evaluated. The
highest VBR index resulted in the period preceding mucilage event occurred in June 2000. Although this
study concerns only the static picture of virioplankton abundance and its numerical relationship with bacterial one, it represents the first continuous long time data series in the Adriatic Sea and could be used as the
basic knowledge of seasonal fluctuations and virus-host densities for pianification of further researches.
Key-words: viruses, bacteria, Northern Adriatic Sea, mucilage.
Introduzione
I virus sono le entità biologiche più rappresentate nell’ambiente planctonico
(Bergh et al., 1989; Noble e Fuhrman, 2000; Steward et al., 1996; Wommack e
Colwell, 2000) con abbondanze solitamente più elevate in superficie e decrescenti
con la profondità (Weinbauer, 2004). La loro densità, soggetta a variazioni stagionali di circa 2 ordini di grandezza, risulta significativamente influenzata dalla
presenza dei batteri (Wommack e Colwell, 2000), loro ospiti preferenziali. Diversi
studi hanno dimostrato, infatti, la prevalenza numerica dei batteriofagi all’interno
del virioplancton (Cochlan et al., 1993; Hara et al., 1996; Jiang e Paul, 1994;
Weinbauer et al., 1995).
In Adriatico, bacino caratterizzato da una serie storica di dati relativi alla componente planctonica, lo studio dei virus è stato eseguito in modo sporadico e puntiforme
(Stopar et al., 2003; Weinbauer et al., 1993), o comunque su scale temporali molto
limitate (Bensi et al., 2003; Corinaldesi et al., 2003; Weinbauer e Peduzzi, 1994, 1995).
Il presente studio, seppur non fornendo informazioni sull’infettività, dà una
descrizione delle abbondanze virali lungo il profilo verticale di una stazione
costiera del Golfo di Trieste per 5 anni consecutivi. Insieme ai dati relativi alle
abbondanze batteriche, può costituire la base per gli studi volti all’acquisizione
delle conoscenze più approfondite relative alle interazioni tra le componenti del
comparto microbico dell’Alto Adriatico, sistema in cui è stata già ipotizzata l’importanza del ruolo che i virus potrebbero svolgere a seconda delle diverse condizioni di trofia (Corinaldesi et al., 2003; Weinbauer et al., 1993).
Materiali e metodi
I campioni d’acqua sono stati raccolti in superficie (~0.5 m), a 5 m, a 10 m ed al
Virioplankton nel Golfo di Trieste
1007
fondo in una stazione costiera del Golfo di Trieste (C1, 45°42’03’’N, 13°42’,36’’ E),
caratterizzata da una profondità media di 17 m, utilizzando una rosetta equipaggiata con bottiglie Niskin da 5 l. Immediatamente dopo la raccolta, i campioni
sono stati riposti in contenitori termostatati alla temperatura in situ ±3 °C ed al
buio e trasportati in laboratorio nel minor tempo possibile e comunque non oltre
2 ore dal campionamento. La frequenza di campionamento, mensile da gennaio
2000 a giugno 2002, è stata intensificata a partire da luglio 2002 divenendo quindicinale fino a dicembre 2004. Contemporaneamente sono stati rileevati i principali parametri idrologici utilizzando le sonde multiparametriche Idronaut Ocean
Seven mod. 316 (gennaio 2000 - settembre 2003) e Seabird 19plus (ottobre 2003
- dicembre 2004).
Aliquote pari a 10 ml di campione sono state fissate con formaldeide (conc.
finale 1%), precedentemente filtrata su filtri di porosità pari a 0,02 um (Whatman
Anotop), e conservate a 4 °C ed al buio per non più di 7 giorni. Al momento
della preparazione del campione per l’analisi microscopica del virioplancton, condotta in microscopia ad epifluorescenza (Olympus BX 60, HBO 100 W), aliquote
di campione sono state diluite 1:10 in acqua di mare, prefiltrata su membrane di
porosità pari a 0,02 um (Whatman Anotop), e filtrate su membrane in allumina
di porosità pari a 0.02 um (Whatman). Le membrane sono state quindi appoggiate su una goccia di SYBR Green I (Noble e Fuhrman, 1998) (conc. finale 50×)
e riposte al buio per 15 min. Terminata la colorazione i filtri sono stati montati
su vetrino utilizzando una soluzione di montaggio (50% glicerolo, 49% PBS, 0,5%
acido ascorbico). I vetrini sono stati conservati a –20 °C fino al momento della
lettura avvenuta entro 2 settimane dal campionamento. Per l’analisi della componente batterica è stato seguito il protocollo di Porter e Feig (1980). La stima delle
abbondanze virali, espresse come Virus Like Particles (VLP), e batteriche è stata
effettuata analizzando 20 campi scelti casualmente ed osservando tre repliche per
ogni campione.
Il rapporto tra virus e batteri (Virus to Bacterium Ratio – VBR) è stato calcolato utilizzando i valori di abbondanza integrati lungo la colonna d’acqua.
I dati relativi alle abbondanze virali sono stati corretti per evitare la sottostima
dovuta alla conservazione del campione in formaldeide (Wen et al., 2004). È stato
utilizzato un fattore di conversione pari a 1.34 derivato da una sperimentazione
effettuata su campioni dell’alto Adriatico fissati con formalina (conc. finale 1%)
ed analizzati dopo 7 giorni dal campionamento.
Risultati
Le abbondanze virali sono risultate comprese tra 1.0×105 e 3.5×108 VLP ml-1
mentre il valore medio ed il valore mediano hanno raggiunto 7.5×106 e 5.9×106
VLP ml-1 (n = 227). Il massimo è stato registrato all’inizio di settembre 2003 alla
profondità di 5m mentre il minimo in dicembre 2002 in superficie. La distribuzione lungo la colonna risulta piuttosto omogenea e non sono state evidenziate
differenze significative tra le profondità rilevate (CV%=6.4).
Dall’analisi delle distribuzioni annuali, espresse come valore integrato lungo
la colonna d’acqua, si evidenzia come il 2000 sia stato caratterizzato da abbondanze relativamente elevate (media = 12.3±0.9×106 VLP ml-1; mediana 12.0×106
VLP ml-1; n=11) mentre durante il 2002 il virioplancton è risultato poco rappresentato (media = 4.7±0.5×106 VLP ml-1; mediana 3.4×106 VLP ml-1; n=15). Nel
A. Karuza, P. Del Negro
1008
2001 (media = 7.3±0.7×106 VLP ml-1; mediana 4.8×106 VLP ml-1; n=12), nel 2003
(media = 6.5±0.5×106 VLP ml-1; mediana 4.9×106 VLP ml-1; n=23) e nel 2004
(media = 7.6+0.4×106 VLP ml-1; mediana 6.5×106 VLP ml-1; n=23) le abbondanze
sono risultate tra loro confrontabili (Fig. 1).
25
VLP (x 106 L-1)
20
15
10
5
ge
n0
ap 0
r-0
lu 0
g0
no 0
v00
fe
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ag
-0
ag 1
o0
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v01
fe
bm 02
ag
-0
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g0
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t-0
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v0
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-0
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-0
m 4
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-0
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u0
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o0
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t-0
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v04
0
Fig. 1 - Distribuzione temporale delle abbondanze di VLP nel Golfo di Trieste da gennaio 2000 a dicembre 2004.
Fig. 1 - Distribuzione temporale delle abbondanze di VLP nel Golfo di Trieste da gennaio 2000
Temporal distribution of VLP abundances in the Gulf of Trieste from January 2000 to December 2004.
a dicembre
2004.
Temporal distribution of VLP abundances in the Gulf of Trieste from January 2000 to December
2004.
Nonostante la prevalenza numerica dei batteriofagi all’interno del virioplancton,
non è stata osservata alcuna correlazione significativa tra le abbondanze batteriche
e quelle virali (r di Spearman = –0.06; n=227). Il VBR (Virus to Bacterium Ratio),
indice delle relazioni tra virioplancton e batterioplancton, è risultato estremamente
variabile essendo compreso (Fig. 2) tra 0.1 e 64.2, valore registrato nel giugno
2000, periodo antecedente la comparsa delle mucillagini. Fatta eccezione per questo
massimo assoluto e per un massimo relativo in maggio 2001, precedente ad un
70
60
50
VBR
40
30
20
10
ge
n0
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0
Fig. 2 - Distribuzione temporale del rapporto virus-batteri (VBR) nel Golfo di Trieste da gennaio 2000 a dicembre 2004.
Fig. 2 - Distribuzione
temporale del rapporto virus-batteri (VBR) nel Golfo di Trieste da gendistribution 2004.
of VBR index in the Gulf of Trieste from January 2000 to December 2004.
naio 2000Temporal
a dicembre
Temporal distribution of VBR index in the Gulf of Trieste from January 2000 to December 2004.
Virioplankton nel Golfo di Trieste
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ulteriore comparsa di mucillagini, il VBR non supera il valore di 20 come solitamente rilevato in ambiente marino (Weinbauer, 2004; Wommack e Colwell, 2000).
Nel periodo di studio la temperatura è variata tra 7.0 e 26.4 °C con un valore
medio di 16.1±0.7 ed un valore mediano di 16.1. Anche la salinità ha seguito una
distribuzione omogenea attorno a valori medi di 37.3±0.45 e di una mediana pari
a 37.4.
Conclusioni
I 5 anni di studio hanno confermato l’importanza del virioplancton nelle
acque del Golfo di Trieste. I valori di abbondanza si sono attestati su ordini di
grandezza analoghi a quanto riportato da Bergh et al. (1989), Fuhrman e Suttle
(1993), Proctor e Fuhrman (1990) e Steward et al. (1996) per altri ecosistemi
marini e da Corinaldesi et al. (2003) Stopar et al. (2003), Weinbauer e Peduzzi
(1993) e Weinbauer et al. (1993, 2002) per l’Adriatico.
La distribuzione evidenzia una più o meno costante variabilità stagionale che,
peraltro, non giustifica l’anomalia rilevata nel 2000 e riconducibile alla comparsa
del fenomeno delle mucillagini. In quel periodo è ipotizzabile che una modificazione del circuito microbico (Corinaldesi et al., 2003) abbia favorito una veloce
proliferazione di virus a ciclo litico.
In questo bacino studi condotti su scale temporali brevi avevano messo in evidenza una correlazione significativa tra virus e batteri (Bensi et al., 2004; Stopar
et al., 2003, Wommack e Colwell, 2000) mentre l’analisi su una più lunga serie
di dati dimostra l’assenza di relazioni stabili tra queste due componenti planctoniche.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano P. Ramani, M. Lupieri Marcolin ed A. Bensi per aver contribuito alla realizzazione del presente lavoro e S. Fonda Umani per il continuo supporto scientifico.
Bibliografia
BENSI A., DEL NEGRO P. (2003) - Abbondanze virali nel Golfo di Trieste. Biol. Mar. Medit.,
10 (2): 980-982.
BENSI A., KARUZA A., DEL NEGRO P., FONDA UMANI S. (2004) - Variazioni delle
abbondanze batteriche e virali in relazione alla formazione di mucillagini nel Golfo di Trieste
(Alto Adriatico). Biol. Mar. Medit., 11 (2): 486-489.
BERGH Ǿ., BǾRSHEIM K.Y., BRATBAK G., HELDAL M. (1989) - High abundance of
viruses found in aquatic environments. Nature, 340: 467-468.
COHLAN W.P., WIKNER J., STEWARD G.F., SMITH D.C., AZAM F. (1993) - Spatial distribution of viruses, bacteria, and chlorophyll a in neritic, oceanic and estuarine environments.
Mar. Ecol. Prog. Ser., 92: 77-87.
CORINALDESI C., CREVATIN E., DEL NEGRO P., MARINI M., RUSSO A., FONDA
UMANI S., DANOVARO R. (2003) - Large-scale spatial distribution of virioplankton in
the Adriatic sea: testing the trophic state control hypothesis. Appl. Environ. Microbiol., 69:
2664-2673.
FUHRMAN J.A., SUTTLE C.A. (1993) - Viruses in marine planktonic systems. Oceanography,
6 (2): 51-63.
HARA S., KOIKE I., TERAUCHI K., KAMIYA H., TANOUE E. (1996) - Abundance of
viruses in deep oceanic waters. Mar. Ecol. Prog. Ser., 145: 269-277.
1010
A. Karuza, P. Del Negro
JIANG S.C., PAUL J.H. (1994) – Seasonal and diel abundance of viruses and occurrence of
lysogeny/bacteriocinogeny in the marine environment. Mar. Ecol. Prog. Ser., 104: 163-172.
NOBLE R.T., FUHRMAN J.A. (1998) - Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts
of marine viruses and bacteria. Aquat. Microb. Ecol., 14: 113-118.
NOBLE R., FUHRMAN J.A. (2000) - Rapid virus production and removal as measured with
fluorescently labeled viruses as tracers. Appl. Environ. Microbiol., 66 (9): 3790-3797.
PORTER K.G., FEIG Y.S. (1980) - The use of DAPI for identifying and counting aquatic
microflora. Limnol. Oceanography, 25: 943-948.
PROCTOR L.M., FUHRMAN J.A. (1990) – Viral mortality of marine bacteria and cyanobacteria. Nature, 343: 60-62.
STEWARD G.F., SMITH D.C., AZAM F. (1996) - Abundance and production of bacteria and
viruses in the Bering and Chukchi Seas. Mar. Ecol. Prog. Ser., 131: 287-300.
STOPAR D., ČERNE A., ŽIGMAN M., POLJŠAK-PRIJATELJ M., TURK V. (2004) - Viral
abundance and a high proportion of lysogens suggest that viruses are important members of
the microbial community in the Gulf of Trieste. Microb. Ecol., 47 (2): 1-8.
WEINBAUER M.G. (2004) - Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microb. Rev., 28: 127-181.
WEINBAUER M.G., FUKS D., PEDUZZI P. (1993) - Distribution of Viruses and Dissolved
DNA along a Coastal Trophic Gradient in the Northern Adriatic Sea. Appl. Environ. Microbiol., 59 (12): 4074-4082.
WEINBAUER M.G., FUKS D., PUŠKARIĆ S., PEDUZZI P. (1995) - Diel, seasonal and
depth-related variability of viruses and dissolved DNA in the Northern Adriatic Sea. Microb.
Ecol., 30: 25-41.
WEINBAUER M.G., PEDUZZI P. (1994) - Frequency, size and distribution of bacteriophages
in different marine bacterial morphotypes. Mar. Ecol. Prog. Ser., 108: 11-20.
WEINBAUER M.G., PEDUZZI P. (1995) – Significance of viruses versus heterotrophic nanoflagellates for controlling bacterial abundance in the Northern Adriatic Sea. J. Plankton Res.,
17 (9): 1851-1856.
WEINBAUER M.G., WINTER C., HÖFLE M.G. (2002) - Reconsidering transmission electron
microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors
derived from natural communities. Aquat. Microb. Ecol., 27: 103-110.
WEN K., ORTMANN A.C., SUTTLE C.A. (2004) - Accurate estimation of viral abundance by
epifluorescence microscopy. Appl. Environ. Microbiol., 70: 3862-3867.
WOMMACK K.E., COLWELL R.R. (2000) -Virioplankton: Viruses in aquatic ecosystems.
Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64: 69-114.
Il presente lavoro è stato svolto nell’ambito del programma di ricerca “Studio dello stato trofico e delle
anomalie del sistema Alto Adriatico”, finanziato dalla Comunità Europea e dalla Regione Friuli-Venezia
Giulia nell’ambito dei progetti INTERREG II e III Italia-Slovenia.
