Biologia molecolare 2/ed
Robert F. Weaver
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Capitolo 6 Il Meccanismo della Trascrizione in Procarioti
Per il ripasso
1. Il core dell’RNA polimerasi di E. coli è capace di legare i
promotori debolmente e non specificamente. Legherà il
DNA del fago T4 senza specificità e lo trascriverà solo
debolmente. L’aggiunta della subunità darà la specificità
e porterà la RNA polimerasi a legare fortemente il DNA
del fago T4, che è riconosciuto dalla polimerasi di E. coli.
E’ interessante notare che il core della RNA polimerasi
trascrive il DNA superavvolto con alta efficienza, ma
questo è un artefatto e non è specifico. Dal momento che
la RNA polimerasi di E. coli non riconosce il DNA di timo
di vitello, l’aggiunta della subunità non causerà un
legame forte della polimerasi e l’efficienza di trascrizione
non cambierà.
2. Bautz ed altri utilizzarono l’ibridazione per competizione
per dimostrare che l’oloenzima di E. coli è specifico per i
geni precoci immediati del fago T4, lì dove il core è nonspecifico. In questo esperimento, il DNA del fago è stato
immobilizato su di un filtro ed ibridizzato con un RNA
marcato trascritto utilizzando o il core dell’enzima o
l’oloenzima. Se l’RNA marcato trascritto da ciascun
enzima originasse dai geni precoci immediati, o da tutti i
geni fagici, è stato determinato testando l’abilità dell’RNA
competitore non marcato a competere per il legame al
DNA marcato. Il legame dell’RNA trascritto
dall’oloenzima ha competuto in grande maggioranza
dall’RNA trascritto dai geni precoci immediati ed in
misura minore da altri RNA fagici. L’RNA trascritto dal
core dell’enzima ha competuto con circa la stessa intensità
con gli RNA precoci tardivi, precoci ritardati e tardivi di
T4 indicando che l’RNA trascritto dal core dell’enzima
rappresenta tutte le tre classi di geni.
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3. Utilizzando il fago T4, Bautz ed altri determinarono che il
core della RNA polimerasi di E. coli non discrimina quale
filamento di DNA deve essere trascritto. Il primo passo è
l’isolamento dell’RNA del fago in vivo. Dal momento che
l’RNA autentico del fago è prodotto asimmetricamente,
solo un filamento di una data regione è rappresentato in
questo campione. Questo RNA ha ibridato con un RNA
trascritto marcato del fago in vitro usando sia il core che
l’oloenzima della polimerasi. L’RNA a filamento singolo
non ibridato è stato digerito con RNasi e la quantità degli
ibridi radiomarcata è stata quantizzata. Essi hanno
dimostrato che, se un particolare enzima trascrive l’RNA
in vitro, in maniera simile alla sua trascrizione in vivo, i
filamenti saranno tutti dello stesso filamento e non
ibridizzeranno tra loro. Se invece un enzima trascrive il
DNA del fago T4 indiscriminatamente in vitro, qualche
sequenza sarà antisenso all’RNA vero e proprio del fago,
e, si formeranno ibridi resistenti all’RNasi a doppio
filamento. Essi osservarono ibridi a doppio filamento
resistenti all’RNasi solo utilizzando il core dell’enzima
per trascrivere in vitro il prodotto dell’RNA. Questo
conferma l’ipotesi che il core dell’RNA polimerasi di E.
coli non discrimina quale filamento di DNA è stato
trascritto.
4. Il tasso di dissociazione del complesso più forte tra una
proteina ed una molecola di DNA può essere misurato
usando studi di binding su filtro di nitrocellulosa. Questi
studi si basano sul fatto che il DNA a doppio filamento
non legherà un filtro di nitrocellulosa a meno che questo
sia associato con una proteina. Il DNA è marcato e
combinato con una proteina con cui forma un complesso
forte. Possiamo misurare la quantità del complesso DNAproteina che si forma misurando la radioattività legata al
filtro. Possiamo determinare quanto forte la proteina è
legata testando l’abilità del DNA bersaglio non marcato a
competere con il DNA marcato per il legame alla proteina.
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Questo è possible consentendo alla proteina purificata di
legare il DNA marcato, aggiungendo successivamente
DNA non marcato, e filtrando le miscele attraverso la
nitrocellulosa a tempi differenti. La figura sottostante
illustra un esempio di legame debole e di legame forte.
Legame-forte
DNA marcato
trattenuto su
filtro
Legame-debole
debdedededed
edebbdebbole
Tempo(min)
(min)
Questo esperimento è stato svolto da Hinkle e Chamberlin
usando il DNA del fago T7 e la RNA polimerasi di E. coli (vedi
contenuti online 6.3). Questo lavoro dimostra che c’è un legame
più forte tra l’oloenzima ed il promotore che tra il core della
polimerasi ed il promotore.
5.
6.
Il tasso di dissociazione dei complessi promotore –
polimerasi è più elevato a temperature elevate. Questo
suggerisce che la formazione di un complesso del
promotore più stabile coinvolge la fusione localizzata del
DNA. Questa fusione è favorita alle alte temperature.
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Complesso chiuso del promotore
Complesso aperto del promotore
7
-35
box
-10
box
-35
box
-10
box
Inizio della trscrizione
start
Tipico
promotore
procariotico
Inizio della trscrizione
-60
-40
elemento UP
8. Fai riferimento ai contenuti online 6.4. La formazione di
trascritti abortivi dell’RNA polimerasi di E. coli può
essere dimostrata come segue. Per visualizzare la
trascrizione, si può utilizzare un saggio di trascrizione in
vitro usando un DNA stampo che contenga un promotore
di E. coli, una RNA polimerasi ed un nucleotide marcato
con [32P] ATP . L’elettroforesi su gel e l’autoradiografia
consentono la determinazione della grandezza dei trascritti
da tale saggio. L’eparina è un polisaccaride carico
negativamente che compete per il DNA per il legame alla
Promotore
procariotic
o con
l’elemento
UP
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RNA polimerasi. In un saggio in vitro, questo impedirà
qualunque riassociazione della polimerasi ad un promotore
una volta che esso è stato rilasciato. L’elettroforesi su gel e
l’autoradiografia dei prodotti di quest’esperimento
mostreranno la sintesi di molti oligonucleotidi corti
marcati tramite la RNA polimerasi. Da questo noi
riteniamo che la RNA polimerasi crea molti brevi trascritti
abortivi prima di raggiungere finalmente l’equilibrio del
promotore ed entrare nella fase di allungamento della
trascrizione.
9.
1.
2.
3.
4.
Formazione del complesso chiuso del promotore
Formazione del complesso aperto del promotore
Incorporazione dei primi pochi nucleotidi
Equilibrio del promotore
10.Vedi figura 6.7. Il primo nucleotide della trascrizione è
particolare in quanto contiene tutti e tre I suoi gruppi
fosfato, , e . Tutti gli altri nucleotidi contengono solo
il fosfato . In una reazione di trascrizione in vitro
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possiamo usare l’incorporazione di [-32P] ATP o di [-32P]
GTP (la trascrizione generalmente comincia con una
purina che il più delle volte è una A piuttosto che una G)
per misurare con esattezza il tasso di inizio. I nucleotidi 14
C aggiunti alla reazione saranno incorporati tutti nella
catena per misurare i tassi di inizio e di allungamento. Per
misurare gli effetti di sul tasso di inizio della
trascrizione possiamo mettere su il seguente esperimento.
A due gruppi di reazioni di trascrizione, una marcata con
[-32P] ATP ed una con il nuclotide 14 C, aggiungeremo il
core della RNA polimerasi, uno stampo di DNA e quantità
crescenti della proteina purificata. Possiamo poi
misurare gli effetti di sull’inizio della trascrizione
contando il [-32P] nell’RNA sintetizzato. Possiamo
misurare l’effetto di sigma nell’accumulo totale dei
trascritti (inizio ed allungamneto insieme) misurando
l’incorporazione del nucleotide marcato 14 C. I risultati
attesi sono illustrati nel grafico sottostante. Questi dati
indicano che l’aumento delle quantità di provoca un
aumento nell’inizio ed anche un aumento nell’accumulo
netto dei trascritti.
Isotopi incorporati
Quantità di aggiunto
11.Nell’esperimento descritto sopra, l’effetto stimolante di
sull’inizio della trascrizione è incontrovertibile ma non è
chiaro se la stimolazione osservata sull’allungamento sia
un risultato diretto dell’aggiunta del fattore o se dovuto
all’aumento del numero di trascritti iniziati. L’inizio è la
fase limitante della trascrizione, ogni aumento dell’inizio
risulterà nell’accumulo di trascritti allungati. Possiamo
dimostrare che l’effetto di è limitato alla fase iniziale
usando l’antibiotico rifampicina che inibisce l’inizio in
maniera specifica. Per dimostrare questo possiamo
allestire un esperimento di trascrizione in vitro e
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consentirne la durata per il periodo limitato per far
avvenire l’inizio della trascrizione. La rifampicina sarà poi
aggiunta per impedire ulteriori inizi e l’effetto di quantità
crescenti di fattore solo sull’allungamento potrà essere
determinato misurando I trascritti di RNA appena
sintetizzato per elettroforesi o ultra centrifugazione.
Questi esperimenti dimostrano che non accelera la
quantità dei trascritti allungati, ma agisce esclusivamente
sull’inizio
della
trascrizione.
La
stimolazione
dell’allungamento è una conseguenza della stimolazione
dell’inizio: con più catene iniziate da allungare, la RNA
polimerasi può naturalmente effettuare più reazioni di
allungamento.
12.Gli esperimenti dei primi due quesiti ci consentono di
concludere che stimola l’inizio della trascrizione ma non
l’allungamento.
13.Vedi figura 6.8. Il seguente esperimento può essere
utilizzato per dimostrare il riciclo di . Allestiremo una
reazione di trascrizione, a bassa forza ionica, utilizzando
l’oloenzima della RNA polimerasi ed una purina marcata
con [-32P]. Questo ci consente di misurare l’inizio di
trascrizione monitorando l’accumulo di 32P nei trascritti.
La bassa forza ionica impedirà al core di dissociarsi dallo
stampo di DNA alla fine del gene e la trascrizione si
avvierà inevitabilmente verso la fine in quanto il core
risulterà limitante per l’oloenzima. Da qui sorge una
domanda, se riforniamo del core endogeno, possiamo
riciclare dall’oloenzima originale? Per dimostrare
questo possiamo aggiungere nuovo core dell’enzima dopo
10 minuti e vedere se si riverifica l’inizio. Il ri-inizio della
trascrizione ci dice che il fattore rilasciato
dall’oloenzima è ora asoociato con il nuovo core
dell’enzima. Così il fattore è riutilizzato. Possiamo
anche usare quest’esperimento per dimostrare che il core
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della polimerasi conferisce resistenza alla rifampicina. La
RNA polimerasi della maggior parte dei ceppi di E. coli è
rifampicina sensibile. Nell’esperimento descritto sopra,
l’oloenzima a cui si fa riferimento inizialmente è
rifampicina sensibile. Se la resistenza alla rifampicina
risiedesse in , l’aggiunta di un nuovo core dalle cellule
rifampicina resistenti non risulterebbe in un reinizio della
trascrizione sia in presenza che in assenza di rifampicina. I
dati di quest’esperimento sono riassunti nel grafico
sottostante e questo ci indica che la sensibilità alla
rifampicina si trova nel core dell’enzima piuttosto che nel
fattore .
+ rifampicin
- rifampicin
14.
core
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15.Fai riferimento ai contenuti online 6.5. La FRET
(Fluorescenza con trasferimento di energia di risonanza) è
una tecnica che ci consente di determinare che non si
dissocia dal core della polimerasi durante l’allungamento.
La FRET si basa sull’utilizzo di una molecola donatore
fluorescente e di una molecola accettore che, in prossimità
della molecola donatore, silenzia il segnale. Non appena il
donatore e l’accettore entrano in contatto, il silenziamento
è più forte in proporzione alla distanza tra loro e la FRET
aumenta. Un approccio sperimentale definito come FRET
leading-edge può essere usato per dimostrare che non si
dissocia dal core della polimerasi durante l’allungamento.
Se localizziamo un tag donatore di fluorescenza su ed
un tag accettore di fluorescenza sul 3’ della molecola di
DNA che si stà trascrivendo, possiamo seguire il
movimento della subunità dell’RNA polimerasi così
come questa si muove attraverso il 3’ dello stampo
durante l’allungamneto. Se si dissociasse dalla polimersi
durante l’allungamneto ci aspettermo un aumento della
fluorescenza mentre la trascrizione procede e la FRET
diminuisce. Se dall’altro canto rimanesse associato alla
polimerasi durante l’allungamneto, l’aumento in
prossimità delle sonde, mentre la trascrizione procede,
risulterà in un aumento della FRET. Per effettuare un tale
esperimento potremo formare in soluzione complessi
aperti del promotore, e aggiungere eparina per legare la
polimerasi non complessata. I complessi di promotore
aperti potrebbero essere purificati tramire elettroforesi e
letti in un fluorometro con un buffer di trascizione. Senza
nucleotidi, non ci sarà l’allungamento ed i livelli basali
della FRET potrebbero essere registrati. Questo è indicato
da To nell’istogramma sottostanre. L’aggiunta dei tre
nucleotidi darà origine ad un breve allungamernto dopo il
quale il livello di FRET può essere registrato dopo, per
esempio. 10 minuti (T10). I risultati sono riportati
nell’istogramma sottostante. Gli aumenti della FRET
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mentre l’allungamento procede indicano che è rimasto
associato alla RNA polimerasi.
Efficienza
della
FRET
T0
T10
16.Il modello del ciclo di descritto precedentemente è stato
in parte sviluppato usando l’evidenza sperimentale di
Traves e Burgess indicando che può essere riutilizzato.
Comunque, I dati presentati nell’esperimento descritto
nella domanda precedente sembrerebbero contraddire il
modello del ciclo di . Potremmo sostenere per questo
apparente enigma che si associa strettamnte con la RNA
polimerasi durante la fase di inizio e debolmente durante
l’allungamento. è perciò disponibile ad associarsi con
altri core dell’RNA polimerasi se la trascrizioine in
qualche modo rallentasse durante al fase di allungamento.
Uno studio condotto da Bar-Nahum e Nuddler (contenuti
online 6.5) durante l’allungamento illustra l’associazione
blanda di con il core. Questi ricercatori purificarono
catene nascenti di RNA, insieme alle RNA polimerasi ad
esse associate, usando un oligonucleotide complementare
al 5’ della molecola di RNA, immobilizzato su di una
resina. I complessi RNA/polimerasi associati alle biglie
sono stati centrifugati e le proteine analizzate per SDSPAGE. Solo una piccola porzione delle RNA polimenrasi
ha un ad esse associato. Questo suggerisce un legame
debole tra il core e nel conplesso di allungamento.
17.Il seguente approccio sperimentale può essere utilizzato
per individuare quali coppie di basi sono denaturate
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quando la RNA polimerasi lega un promotore. Un
promotore verrà marcato terminalmente e si formerà un
complesso aperto con la RNA polimerasi. Il DNA
denaturato estruderà l’N1 dell’adenina rendendolo
disponibile per la metilazione da parte del dimetilsolfato
(DMS). La polimerasi può essere rimaossa ed i gruppi
metilici sul residuo di A impediranno il riappaiamento tra
le A e le T nel DNA stampo. Le posizioni dei nucleotidi
dove non c’è l’appaiamento di basi sono suscettibili
all’attacco da parte della nucleasi S1. Se la reazione di
metilazione si verificasse in condizioni limitanti, ci
aspetteremo un insieme di molecole tagliate ad ogni
residuo di adenina e di timina nella regione dello stampo a
cui la polimerasi lega. Una autoradiografia esplicativa è
rappresentata qui di fianco. Questo ci dice che alle
posizioni corrispondenti a 5, 9 e 10 coppie di basi dalla
marcatura terminale della molecola c’è una coppia di basi
AT a cui la polimerasi lega e che queste coppie di basi si
trovano in una regione di DNA denaturato. Dal momento
che la polimerasi può legare basi GC fiancheggianti che
non sono metilate in questo saggio e, quindi non sensibili
al taglio, questa non può essere considerata una
rappresentazione accurata per l’esatto appaiamento di basi
denaturate quando la polimersi le lega. Per un altro
esempio della procedura con risultati sperimentali fai
riferimento ai contenuti online 6.6.
INSERIRE SCHEMA RISPOSTA 17
18.Vedi Figura 6.10. Possiamo usare il saggio di seguito
riportato per determinare accuratamente il numero di basi
denaturate durante la trascrizione. Un numero noto di
RNA polimerasi sono legate ad uno stampo circolare di
DNA ad esempio SV40. E’ noto il numero esatto di
molecole coinvolte nella formazione del complesso
ternario nel saggio, così come è noto il numero di
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molecole di DNA del saggio. Le condizioni di reazione
sono tali che ogni polimerasi inizia una sola volta e rimane
sottoforma di complesso ternario per l’intera durata del
saggio. Dopo la formazione del complesso ternario, i
superavvolgimenti sono rilassati da un taglio, e
successivamente la polimerasi è rimossa dal DNA. Dal
monento che la polimerasi ha svolto la doppia elica in una
regione del DNA a cui era legata, la molecola è svolta. I
superavvolgimenti risolvono un DNA a doppia elica
chiuso circolare che ha una regione svolta. Il grado di
superavvolgimento richiesto per risolvere lo svolgimento è
proporzionale al numero di paia di basi svolte o sciolte
mentre la polimerasi è complessata al DNA. Il grado di
svolgimento è misurato da un cambiamento nella mobilità
durante
l’elettroforesi
ed
il
cambiamneto
dell’avvolgimento può essere plottatto come una funzione
del numero di polimerasi per duplex di DNA nel saggio
originale. Possiamo misurare che ci sono 1.6 giri di
superelica per RNA polimerasi. Un giro dell’elica del
DNA contiene 10.5 paia di basi, 1,6 giri corrisponde a
16.8 paia di basi, e questa corrisponde al numero di coppie
di basi separate durante la trascrizione.
1 giro/10.5 bp = 1.6 giri/X bps
X = 10.6 X 1.5 = 16.8 giri
Polimerasi attiva per genoma
Cambio in superelicità
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19.La regione 2.4 del fattore è coinvolta nel riconoscimento
della box -10 del promotore. L’evidenza genetica è a
supporto di quest’ipotesi. Un batterio con una mutazione
nella box -10 del promotore può avere la sua funzione
ripristinata da una mutazione di soppressione nella regione
2.4 del fattore . Questo significa che un cambiamento
nella sequenza dell’elemento del promotore può essere
compensato
da
un’alterazione
nella
sequenza
amminoacidica nella regione della proteina che lega
quest’elemento. Questo suggerisce che la regione 2.4 del
fattore interagisce con la box-10. Dal momento che, in
modo simile, osserviamo la soppressione della muatzione
nella box -35 con mutazioni nella regione 4.2 del fattore
sappiamo che questa regione del fattore interagisce con
la box-35.
20.Fai riferimento ai contenuti online 6.7. Il seguente saggio
di binding può essere usato per dimostrare l’interazione tra
la regione 4.2 di e la regione -35 del promotore. Una
proteina di fusione glutathione-S-transferasi (GST)
contenente la regione 4.2 di può essere usata per un
saggio di binding su filtro di nitrocellulose insieme ad un
frammento di DNA marcato contenete la regione -35. La
proteina di fusione ed il DNA marcato possono legare e
poi passare attraverso un filtro di nitrocellulose che
tratterrà il complesso DNA-proteina. La specificità
dell’interazione tra la regione -35 e la regione 4.2 di può
essere dimostrata testando l’abilità di sequenze non
marcate di DNA a competere per il binding. In questi
esperimenti, un competitore non specifico di DNA o un
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DNA che contenga la regione -10 non può competere per
il legame alla proteina. In ogni modo, il legame del DNA
non marcato contenente la regione -35 può competere per
il legame alla proteina alla regione marcata -35. Questo
dimostra l’interazione tra la regione 4.2 di e la regione 35 del promotore.
21.Fai riferimento ai contenuti online 6.8. L’evidenza
sperimentale di Gourse ed altri convalida l’ipotesi che è la
subunità della RNA polimerasi responsabile del legame
all’elemento UP presente in alcuni promotori di E. coli.
Questi studiosi provarono la trascrizione da un promotore
con un elemento UP, il promotore P1 di rrnB, usando la
RNA polimerasi di tipo selvatico e due differenti RNA
polimerasi con mutazioni nella subunità . Quando il
saggio veniva effettuato con una subunità mancante di
94 aminoacidi al C-terminale, essi osservarono una
significativa diminuzione nella trascrizione che
normalmente avviene ad alta intensità dall’elemento UP.
Essi osservarono, allo stesso modo, una bassa trascrizione
dall’elemento UP usando una polimerasi con una subunità
che aveva una arginina sostituita da una cisteina in
posizione 265. Per validare ulteriormente questa ipotesi,
esperimenti di DNAsi footprinting mostrarono che il
mutante della polimerasi senza il C-terminale falliva nel
dare l’impronta nella regione dell’elemento UP, lì dove,
invece, ci riesce una polimerasi selvatica. Inoltre, la
subunità purificata era da sola capace di dare l’impronta
nella regione UP.
22.La proteolisi limitata può darci l’informazione circa i
domini, o indipendentemente sul ripiegamento di una
proteina. Gli aminoacidi della struttura del complesso
ternario di domini ripiegati non sono accessibili alle
proteasi. I gruppi di aminoacidi meno strutturati che
connettono tra loro i singoli domini sono più suscettibili
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alla digestione. La proteolisi limitata taglierà tra i domini
ripiegati della proteina, lasciandoli intatti così che la
misura di questi domini può essere determinata. Un tale
approccio è stato usato per definire i domini della subunità
della RNA polimarasi e mostrano che questa è compresa
da un largo dominio N-terminale e da un più piccolo
dominio C- terminale uniti tra loro da 13 aminoacidi.
23.Vedi Figura 6.17. I saggi di trascrizione, in cui le subunità
della RNA polimerasi sono ricostruite da differenti fonti,
possono essere usate per determinare quale delle subunità
della RNA polimerasi conferisce resistenza o sensibilità
alla rifampicina o alla streptolidigina. Potremo mettere su
un esperimento nel modo seguente: Potremo ricostruire
una polimersi in cui la -subunità viene da un ceppo
resistente alla rifampicina e la rimanente parte delle
subunità da un ceppo sensibile alla rifampicina. Potremo
poi misurare la trascrizione in presenza di rifampicina.
Possiamo anche prevedere che se la sensibilità alla
rifampicina è conferita dalla subunità (come è
attualmente), la polimerasi ricostruita sarà rifampicina
resistente ed i trascritti saranno prodotti. Se, invece, il
controllo della resistenza o della sensibilità si trova altrove
(non nella subunità ) l’enzima ricostruito non produrrà
trascritti in presenza di rifampicina. Un simile esperimento
può essere usato per determinare quale subunità è
responsabile della sensibilità alla streptoglidina. In questo
caso se combiniamo una subunità da un ceppo
streptoglidina resistente con le rimanenti subunità tutte
provenienti da un ceppo streptoglidina sensibile, un saggio
di trascrizione ci consentirà di determinare se la subunità
sia capace di conferire resistenza all’enzima ricostruito.
Infatti la subunità è responsabile del conferimento della
resistenza ad entrambi gli antibiotici.
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24.Vedi Figure 6.18 e 6.19. La marcatura per affinità è una
tecnica che può essere usata per identificare quale
subunità di un enzima contenga il suo sito attivo. Per
determinare quale subunità della RNA polimerasi sia
associata al sito attivo o, in altre parole, quale subunità
catalizzi la formazione dei legami fosfodiesterici, si può
ipotizzare un esperimento di questo tipo. Si può usare per
un saggio di trascrizione un analogo dell’ATP, che può
essere legato covalentemente al sito attivo dell’enzima. In
teoria possiamo marcare l’analogo, frazionare le subunità
dell’enzima e così identificare le subunità associate
all’analogo. In ogni modo quest’approccio è una
potenziale trappola. L’analogo può potenzialmente
associarsi con aminoacidi al di fuori del sito attivo
dell’enzima e così co-purificare con una subunità non
coinvolta direttamente nella catalisi. Un trucco furbo che
permette una più facile determinazione della
localizzazione del sito attivo dell’enzima è il seguente:
Piuttosto che marcare solo l’analogo, possiamo marcare il
nucleotide con cui ha formato un legame fosfodiesterico
includendo un [-32P] UTP o un CTP nel saggio di
trascrizione. La subunità associata con il nucleotide
marcato è quella che contiene il sito attivo dell’enzima.
Riassumendo, questo esperimento ci consente di legare
covalentemente i primi due nucleotidi al sito dove si trova
il primo legame fosfodiesterico, mantenendoli associati
con la subunità recante il sito attivo.
25.Vedi Figura 6.20, e fai riferimento ai contenuti online 6.9
e 6.10. Un esperimento illustra il fenomeno del
trasferimento dello stampo che coinvolge le seguenti tappe
con i seguenti risultati. Una polimerasi è ingegnerizzata
con una coda di 6 istidine immobilizzata su di una resina
di nickel. Questo stampo è tipizzato, ad esempio, la sua
sequenza è nota così come è nota la grandezza del
trascritto prodotto dallo stampo stesso. Questa
informazione ci consente di dare inizio alla trascrizione e
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di camminare lungo la polimerasi per trascrivere lo
stampo con un numero preciso di nucleotidi, di saltarne
uno causando la terminazione della trascrizione. Possiamo
poi aggiungere tutti i nucleotidi e creare trascritti
completi; questa fase è detta chase. Se dopo che la
polimerasi ha terminato la trascrizione del primo stampo,
aggiungiamo un secondo stampo per un chase, possiamo
avere trascritti completi da entrambi gli stampi.
L’elettroforesi e l’autoradiografia confermeranno che
entrambi I trascritti sono della giusta misura. Dal
momento che l’unica fonte di polimerasi necessaria per
trascrivere il secondo stampo è quella ancora legata al
primo stampo, possiamo concludere che la polimerasi
salta da uno stampo ad un altro. In un esperimento come
questo, possiamo manipolare lo stampo per determinare
quello che è necessario al trasferimento dello stampo. Due
siti di legame saranno individuati trasferendo la RNA
polimerasi a stampi secondari e testando la stabilità dei
complessi formati trattandoli con i sali (Figura 6.20). Il
primo è sensibile al sale e quindi stabilizzato da deboli
interazioni elettrostatiche, un secondo è resistente al sale
ed è stabilizzato da interazioni idrofobiche. Al fine di
individuare quali subunità della RNA polimerasi
immobilizzata legano I siti forti e deboli sullo stampo di
DNA si esegue il seguente esperimento. Vorremmo
avviare la trascrizione di uno stampo radioattivo in
presenza di un analogo di timidina fotoreattiva e tramite
irradiazione con i raggi UV avremo il cross-link della
polimerasi allo stampo. Vorremmo farlo in due
esperimenti paralleli: uno con una sequenza che sappiamo
essere coinvolta nel legame forte ed un secondo con una
sequenza che sappiamo essere coinvolta in un legame
debole. Avendo essenzialmente "incollato" la subunità
della polimerasi che in ogni caso lega il DNA stampo,
siamo in grado di separare le subunità della polimerasi
tramite SDS-PAGE ed autoradiografia. Possiamo
aspettarci di osservare l’associazione della β-subunità con
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il sito di legame debole sullo stampo e l’associazione di
entrambe le subunità β 'e β- con lo stampo contenente il
sito di legame forte.
26.Fai riferimento ai contenuti online 6.11. Un esperimento
di cross-linking effettuato da Nudler ed altri ha dimostrato
che all’interno del complesso di allungamento della
trascrizione esiste un ibrido di RNA-DNA lungo almeno 8
pb. Questi esperimenti, come quello descritto in
precedenza, fanno affidamento su di un sistema
trascrizionale in cui la RNA polimerasi è immobilizzata su
di una matrice solida e dirige la sintesi di trascritti marcati
da un DNA sampo. In questi saggi, la polimerasi può
"camminare" lungo lo stampo includendo solo alcuni dei
quattro nucleotidi. In altre parole, siamo in grado di
fermare la trascrizione in una posizione nota e manipolare
sperimentalmente
il
complesso
(per
esempio
l'introduzione di una base modificata) di sapere
esattamente in quale parte del processo di allungamento
della catena si trova la polimerasi. Si può quindi
continuare la trascrizione fino alla fine dello stampo.
Questo è esattamente ciò che è stato fatto in questo
esperimento. Un UMP (U •) derivato che è stato
incorporato in una catena di RNA può essere in grado di
cross-linkare al suo DNA stampo a condizione che sia
appaiato ad una A. Se la U • derivata non è appaiata alla A
nel suo stampo, il cross-linking non si verificherà. L’RNA
che è stato cross-linkato al DNA può essere rilevato
tramite elettroforesi ed autoradiografia dal momento che
lo stampo della molecola di DNA solo se è legata al suo
trascritto di RNA marcato. In questo esperimento, una
serie di trascritti sono stati generati come segue: Si è
formato un complesso di allungamento della trascrizione e
la polimerasi ha camminato lungo il trascritto e le U •
sono state inserite in posizioni ben precise nei trascritti.
Questo ha creato una serie di complessi di allungamento
tutti della stessa lunghezza, ma contenenti ciascuno un U •
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incorporato in posizioni diverse lungo la catena. Ciascuno
di questi trascritti è stato poi utilizzato in una reazione di
cross-linking. Il cross-linking è stato osservato solo
quando la U • è presente in posizioni da -2 a -8
corrispondenti a due ed otto nucleotidi rispettivamente al
3' del trascritto. Con la U • in posizione -10 l’efficienza
del cross-linking è diminuita in maniera significativa
suggerendo che non vi erano coppie di basi UA in questa
regione. Questo esperimento conferma l'ipotesi che vi sia
una regione ibrida di 8-9 coppie di basi all'interno del
complesso di allungamento della trascrizione.
SITO DI LEGAME DELLA RIFAMPICINA
CENTRO CATALITICO
27. Il disegno di cui sopra illustra la struttura del nucleo
dell’enzima della RNA polimerasi. Il sito di legame della
rifampicina è parte della β-subunità (vedi Figura 6.22 per
un quadro più dettagliato del sito di legame della
rifampicina). Un possible meccanismo d'azione
dell’antibiotico è che questo impedisce ad una piccola
catena di nuova sintesi di uscire dal canale. Pertanto, essa
non pregiudica l'assemblaggio dei primi pochi nucleotidi,
ma dopo che si è formato un breve oligonucleotide, la
rifampicina impedisce che questo esca dal canale in cui si
trova il sito catalitico. Tuttavia, dopo che la catena
raggiunge una certa lunghezza, l'aggiunta di rifampicina
non ha alcun effetto sull’allungamento. Questo può
significare che una catena di RNA di una certa lunghezza
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non consenta l'accesso dell’antibiotico al sito all'interno
del canale.
28.
Vedi anche la Figura 6.23.
DOMINIO 4 di
DOMINIO 2 di
DOMINIO 3 di
29.Vedi la Figura 6.24. È stato proposto che la regione 1.1
di σ lega, nel canale principale dell’enzima, il complesso
chiuso del promotore. Di seguito vi sono due evidenze a
sostegno di questa ipotesi. In primo luogo, la regione 1.1
di σ è formata da molti residui di aminoacidi acidi,
inoltre, il canale principale dell’enzima è basico. In
secondo luogo, l’N-terminale tronco di σ, da cui la
struttura è stata determinata, si trova al termine di un αelica che punta al centro catalitico. In questo modo è
facile immaginare che la regione 1.1 di σ risiede nel
centro catalitico. Nel complesso aperto del promotore si
suppone che la regione 1.1 di è al di fuori del centro
catalitico e che questo è stato espulso durante la
formazione del complesso aperto del promotore. Due
prove a sostegno di questa ipotesi sono le seguenti: In
primo luogo, nella struttura cristallina dell’oloenzima di
T. aquaticus legato al DNA, la regione 1.1 di σ è
disordinata suggerendo che è stata espulsa dal canale. In
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secondo luogo, il footprinting della proteina σ70 di E.
coli ha dimostrato che la regione 1.1 di σ è protetta
nell’oloenzima senza DNA, ma esposta nel complesso
aperto del promotore. Prova diretta di questo
cambiamento della posizione della regione 1.1, dopo la
formazione del complesso aperto del promotore,
provengono da studi sulla FRET in cui si può misurare
direttamente la vicinanza di due molecole marcate.
Questo verifica l'associazione della regione 1.1 di σ con
il canale principale prima della formazione del
complesso aperto del promotore e dopo la sua successiva
espulsione.
30.Un modello che spieghi la formazione di abbondanti
trascritti abortivi da parte della RNA polimerasi propone
un link tra I domini 3 e 4 di (Figura 6.25) che
impedisce l'uscita di nuovi RNA attraverso il suo canale
di uscita. Tuttavia, quando la molecola di RNA
raggiunge 12 nt in lunghezza, il linker è ostacolato dal
sito di uscita e la subunità σ modifica o perde la sua
associazione con il nucleo dell’enzima e la trascrizione
può continuare senza ostacoli. L'apparente debole
stuttura del linker di σ che di fatto impedisce la
trascrizione, è una conseguenza della stretta associazione
di σ con il sito attivo dell’enzima.
31.
DNA STAMPO
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Nel fumetto è rappresentata la struttura cristallografica
raffigurante il complesso DNA-oloenzima con il promotore nel
complesso aperto, è evidente che la subunità σ svolge il ruolo
più importante nel legame al DNA. Vedi anche Figura 6.27.
32.La struttura cristallografica ottenuta del complesso
DNA-oloenzima con il promotore nel complesso aperto
(Figura 6.28), avvalora fortemente i dati genetici e
biochimici che dimostrano una interazione tra la regione
2.4 di σ e la zona -10 dei promotori di E. coli. Ad
esempio, due aminoacidi, Gln 437 e Thr 440, che studi
genetici hanno determinato che interagiscono con il
DNA alla base -12, hanno dimostrato di essere in una
posizione ottimale per l'interazione di questa posizione
con il DNA. Allo stesso modo, i residui aromatici
fondamentali coinvolti nella fusione sono posizionati in
maniera tale da interagire con il filamento a singolo
strand non-stampo nella struttura del promotore a
complesso aperto. I residui basici nel legame al DNA
sono anche posizionati per legare il DNA mediante
interazioni elettrostatiche. Al contrario, i residui specifici
nella regione 4.2 di σ coinvolti nel legame alla regione 35, non sono confermati dalla struttura cristallografica.
Si è concluso che questo è a causa di uno spostamento
del DNA dalla regione -35 che risulta essere un artefatto
durante la formazione del cristallo.
33. In figura 6.30 sono illustrati due modelli per spiegare
come l'RNA polimerasi può mantenere la bolla del DNA
svolta, mentre si muove lungo lo stampo. Nel primo
modello, lo stampo di DNA rimane statico e la RNA
polimerasi e l’RNA crescente seguono la naturale
torsione nella molecola di DNA. Nel secondo modello, il
DNA davanti alla bolla si snoda ed il DNA dietro la
bolla si riavvolge. Questo avrà l'effetto di introdurre
superavvolgimenti positivi davanti alla bolla di
trascrizione e negativi dietro la trascrizione. Le
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topoisomerasi sono enzimi
che rilassano
i
superavvolgimenti tagliando e rilegando i filamenti in
modo da alleviare la tensione della molecola. A sostegno
del secondo modello, topoisomerasi mutanti che
mancano della capacità svolgere i superavvolgimenti
negativi accumulano superavvolgimenti negativi durante
la trascrizione, mentre le topoisomerasi mutanti che sono
carenti nella capacità di svolgere superavvolgimenti
positivi accumulano superavvolgimenti positivi durante
la trascrizione.
34.Due elementi importanti per la terminazione intrinseca
sono, un’ansa a forcina stabilizzata da una regione ricca
in GC nel gambo della struttura a forcina, ed una serie di
residui di T nel filamento non-stampo che risulta in una
serie di coppie di basi AU meno stabili nel trascritto a
valle dell’ansa. Farnham e Platt determinarono
sperimentalmente che, la creazione di DNA stampo in
cui la serie di T nel filamento non-stampo è stata
sostituita con basi che hanno portato a trascritti con una
maggiore stabilità nelle coppie di basi GC dopo l’ansa,
causano una diminuzione nell’attenuazione. Questo
effetto può essere contrastato sostituendo la iodo-CTP
con la CTP ordinaria nella reazione di trascrizione. Le
coppie di basi G-iodo-C sono più forti delle coppie
ordinarie G-C, così che l’incorporazione di iodo-CMP
nell’ansa dovrebbe stabilizzarle ulteriormente. È stato
inoltre dimostrato che indebolire lo stelo dell’ansa ricca
in G-C riduce anche l'efficienza di attenuazione. Ciò è
stato fatto utilizzando ITP (inosina trifosfato), un
analogo del GTP, per introdurre coppie I-C più deboli
nello stelo dell’ansa per destabilizzare la struttura.
Questa destabilizzazione ha portato ad un indebolimento
dell’attenuazione.
35.L'idea che una forcina non è richiesta per il pausing nella
terminazione intrinseca è supportata dal fatto che in
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saggi di terminazione utilizzando stampi in cui la forcina
non si forma, la polimerasi rallenterà a livello di coppie
di basi rU-dA.
36. Fai riferimento ai contenuti online 6.14. Yarnell e
Roberts
presentarono
dati
dimostrando
che
l’appaiamento di basi (di qualcosa) con l'RNA a monte
di un sito di pausing è necessario per la terminazione
intrinseca. Questi studiosi analizzarono la terminazione
di stampi di DNA mutanto per produrre molecole di
RNA marcato. Essi legarono il DNA stampo a sfere
magnetiche che gli permisero di isolare facilmente i
trascritti rilasciati dallo stampo di DNA. Essi usarono
una serie di stampi di DNA per il test. Tra questi due
stampi che mancavano nella seconda metà dell’invertita
ripetuta, impedendo così la formazione della forcina.
Come poterono prevedere, la terminazione non si
verificava con l'utilizzo di questi filamenti mutanti.
Tuttavia, quando la parte mancante dell’invertita ripetuta
è stata introdotta sottoforma di oligonucleotide, si
verificava una terminazione efficiente. Inoltre,
interferendo con l’appaiamento di basi, introducendo di
una coppia di basi nella catena dell’oligonucleotide si
aveva una drastica riduzione della terminazione. Questo
potrebbe essere compensato con una mutazione
corrispondente nel DNA stampo che ha permesso il
completo appaiamento di basi tra gli oligonucleotidi
modificati e la catena di RNA.
37.Un terminatore rho-dipendente è caratterizzato da un sito
di legame per rho, che è una sequenza di 60-100 residui
nucleotidici, ricca in citosina, a monte di un invertita
ripetuta. L’invertita ripetuta forma una forcina nell’RNA
trascritto. Rho è un esamero, ogni subunità ha un’attività
ATPasica. Rho lega l'RNA, con conseguente attivazione
dell’attività ATPasica. Ciò fornisce energia per la
propulsione di rho lungo l’RNA dove "insegue" la
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polimerasi. Rho "cattura" la polimerasi, quando rallenta
sul terminatore, e svolge l’ibrido RNA-DNA all'interno
della bolla di trascrizione, rilasciando, in tal modo,
l’RNA e terminando la trascrizione.
38.Vedere la Figura 6.33. Mediante una reazione di
trascrizione in vitro in presenza di [γ-32P] GTP, siamo
in grado di dimostrare che rho causa una diminuzione
netta nella sintesi di RNA, ma non nella diminuzione
degli eventi di inizio. Questo misura il tasso di inizio di
trascrizione. Un'altra reazione in presenza di [3H] UTP
misurerà il tasso netto o totale di sintesi di RNA. Per
ciascuna di queste reazioni possiamo aggiungere
quantità sempre crescenti di rho e misurare l'accumulo di
trascritti marcati con [γ -32P] GTP e con [3H] UTP. I
dati ottenuti avranno un aspetto simile a quello
raffigurato nella figura sottostante.
Questi dati dimostrano che rho non pregiudica l'incorporazione
di [γ-32P] GTP in trascritti neo-sintetizzati, ma diminuisce
l'incorporazione di [3H] UTP nei trascritti. Ciò dimostra che rho
diminuisce la sintesi netta di RNA come misurato dall’accumulo
di [3H] UTP, ma non di causare una diminuzione nell’inizio,
misurato con l'accumulo di [γ-32P] GTP nei trascritti di nuova
sintesi.
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39.Vedere la figura 6.34. Al fine di dimostrare che i
trascritti più brevi sono prodotti in presenza di rho,
allestiremo un saggio di trascrizione in vitro in presenza
di rho, e marcheremo i trascritti con [14C] UTP.
Vorremmo frazionare gli RNA trascritti mediante
ultracentrifugazione. I trascritti più larghi sedimentano
rapidamente verso il fondo del tubo, mentre I più piccoli
sedimentano più lentamente e si trovano alla cima del
tubo da centrifuga. In questo esperimento osserveremo
una riduzione delle dimensioni dei trascritti marcati con
[14C] in presenza di rho. Come controllo, per escludere
la possibilità che rho agisca come una nucleasi, potremo
far correre la reazione con trascritti pre-formati marcati
con 3H effettuati in assenza di rho. Se rho
semplicemente agisse come una nucleasi, I trascritti
marcati con 3H dovrebbero essere ridotti di dimensioni
come I trascritti marcati 14C. I risultati sono illustrati nel
grafico sottostante, dove si vede un numero più elevato
di trascritti più corti effettuati in presenza di rho, mentre
I trascritti effettuati in assenza di rho sono molto più
grandi.
40.Vedere la Figura 6.35. Il seguente esperimento mostrerà
che rho rilascia I trascritti dallo stampo di DNA. Due
reazioni di trascrizione in vitro sono state predisposte
utilizzando [14C] UTP. Per una reazione si aggiunge rho
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e, mediante ultracentrifugazione su gradiente di densità
di solfato di cesio per determinare le proprietà di
sedimentazione dei prodotti dell’RNA, siamo in grado di
determinare se l'RNA è stato rilasciato dal suo stampo.
Questo tipo di gradiente di ultracentrifugazione separa
RNA e DNA per mezzo della loro diversa densità. In
assenza di rho, ci aspettiamo che l’RNA sedimenti nella
provetta da centrifuga alla stessa posizione del DNA.
Ciò fa ritenere che essi sono associati. Al contrario, ci
aspettiamo che l'aggiunta di rho alla reazione ci dia due
distinti
profili
di
sedimentazione
dopo
ultracentrifugazione, uno corrispondente al DNA ed uno
corrispondente all’RNA trascritto marcato. I dati attesi
sono mostrati nelle figure qui sotto. La separazione dei
trascritti dal loro stampo di DNA dopo l'aggiunta di rho
conferma l'ipotesi che rho rilascia I trascritti dal DNA.
(unità arbitrarie)
DNA libero
Frazione
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Per l’approfondimento
1.
DNA
GACTATGCGTCACGTACGCATAGTC filamento codificante
CTGATACGCAGTGCATGCGTATCAG
Trascritto
GACUAUGCGUCACGUACGCAUAGUC
G
A
C
U
A
U
G
C
G
U
C
A
C
U
G
A
U
A
C
G
C
A
U
G
C
2. AC → T Una mutazione dimostrata nel primo nucleotide
della box -10 del promotore di E. coli, cambierà la sequenza
della box -10 da CATAGT a TATAGT. Questo comporta che
l’appaiamento della sequenza -10 è più simile alla sequenza
consenso di TatAaT e, quindi, probabilmente ad una mutazione
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up.
A T→ A Una mutazione nell’ultimo nucleotide della box -10 di
questo promotore di E. coli cambia la sequenza della box -10 da
CATAGT a CATAGA. Questo diminuisce l’appaiamento della
box -10 con la sequenza consenso di TatAaT e, quindi,
probabilmente ad una mutazione down.
2. a) La molecola di RNA che risulterebbe dalla trascrizione
della sequenza selvatica è :
U UG
A
C
G C
C G
C G
G C
C G
G C
A U
CG A U UUUUU
U
b) Il gene selvatico mostra un’attenuazione del 100% sia in
presenza, che in assenza di rho indicando la presenza di una
sequenza di terminazione intrinseca altamente efficiente. Non si
può solo da questi dati determinare se la terminazione rhodipendente si verifica in questo trascritto a causa della completa
terminazione vista in assenza di rho.
Il mutante A mostra una riduzione della terminazione del 40%
sia in presenza che in assenza di rho. Ciò è dovuto alla notevole
destabilizzazione della struttura a forcina nel mutante. Il
mutante ha ora solo 5 paia di basi per stabilizzare la forcina e
solo una di queste è stabile quanto una coppia di CG. Poiché la
forcina è richiesta per entrambi I tipi di terminazione, rho
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dipendente e rho indipendente, l’attenuazione della trascrizione
in presenza ed in assenza di rho è influenzata in maniera
significativa.
Il mutante B si tradurrà in una struttura a forcina dell’RNA con
un loop ridotto di dimensioni (3 coppie di basi, piuttosto che 5
coppie di basi). La dimensione del loop e l'identità del primo
misappaiamento nel loop può influire sulla stabilità. Il primo
misappaiamento nel loop è identico sia nel wild-type che nel
mutante, quindi l'alterazione nelle dimensioni dell’ansa del
trascritto da parte di questo mutante è risultato in una leggera
diminuzione
dell’efficienza
della
terminazione
della
trascrizione.
Il trascritto di RNA da parte di una C mutata manca della stringa
di residui di U a valle dell’ansa che è necessaria per I rhoindipendenti (terminazione intrinseca). Tuttavia, tale sequenza
non è richiesta per la terminazione rho-dipendente e l'aggiunta
di rho dà l'80% del tasso di terminazionedi tipo selvatico.
Questo ci dice che vi è un sito per rho a monte della struttura a
forcina. E ci dice anche che rho può contribuire all’80% nel
"potere di terminazione" nel trascritto di questo gene wild-type e
che la terminazione intrinseca è richiesta, inoltre, per una
terminazione completa.
