Cap. 6 - Ateneonline
annuncio pubblicitario
Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl Capitolo 6 Il Meccanismo della Trascrizione in Procarioti Per il ripasso 1. Il core dell’RNA polimerasi di E. coli è capace di legare i promotori debolmente e non specificamente. Legherà il DNA del fago T4 senza specificità e lo trascriverà solo debolmente. L’aggiunta della subunità darà la specificità e porterà la RNA polimerasi a legare fortemente il DNA del fago T4, che è riconosciuto dalla polimerasi di E. coli. E’ interessante notare che il core della RNA polimerasi trascrive il DNA superavvolto con alta efficienza, ma questo è un artefatto e non è specifico. Dal momento che la RNA polimerasi di E. coli non riconosce il DNA di timo di vitello, l’aggiunta della subunità non causerà un legame forte della polimerasi e l’efficienza di trascrizione non cambierà. 2. Bautz ed altri utilizzarono l’ibridazione per competizione per dimostrare che l’oloenzima di E. coli è specifico per i geni precoci immediati del fago T4, lì dove il core è nonspecifico. In questo esperimento, il DNA del fago è stato immobilizato su di un filtro ed ibridizzato con un RNA marcato trascritto utilizzando o il core dell’enzima o l’oloenzima. Se l’RNA marcato trascritto da ciascun enzima originasse dai geni precoci immediati, o da tutti i geni fagici, è stato determinato testando l’abilità dell’RNA competitore non marcato a competere per il legame al DNA marcato. Il legame dell’RNA trascritto dall’oloenzima ha competuto in grande maggioranza dall’RNA trascritto dai geni precoci immediati ed in misura minore da altri RNA fagici. L’RNA trascritto dal core dell’enzima ha competuto con circa la stessa intensità con gli RNA precoci tardivi, precoci ritardati e tardivi di T4 indicando che l’RNA trascritto dal core dell’enzima rappresenta tutte le tre classi di geni. Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl 3. Utilizzando il fago T4, Bautz ed altri determinarono che il core della RNA polimerasi di E. coli non discrimina quale filamento di DNA deve essere trascritto. Il primo passo è l’isolamento dell’RNA del fago in vivo. Dal momento che l’RNA autentico del fago è prodotto asimmetricamente, solo un filamento di una data regione è rappresentato in questo campione. Questo RNA ha ibridato con un RNA trascritto marcato del fago in vitro usando sia il core che l’oloenzima della polimerasi. L’RNA a filamento singolo non ibridato è stato digerito con RNasi e la quantità degli ibridi radiomarcata è stata quantizzata. Essi hanno dimostrato che, se un particolare enzima trascrive l’RNA in vitro, in maniera simile alla sua trascrizione in vivo, i filamenti saranno tutti dello stesso filamento e non ibridizzeranno tra loro. Se invece un enzima trascrive il DNA del fago T4 indiscriminatamente in vitro, qualche sequenza sarà antisenso all’RNA vero e proprio del fago, e, si formeranno ibridi resistenti all’RNasi a doppio filamento. Essi osservarono ibridi a doppio filamento resistenti all’RNasi solo utilizzando il core dell’enzima per trascrivere in vitro il prodotto dell’RNA. Questo conferma l’ipotesi che il core dell’RNA polimerasi di E. coli non discrimina quale filamento di DNA è stato trascritto. 4. Il tasso di dissociazione del complesso più forte tra una proteina ed una molecola di DNA può essere misurato usando studi di binding su filtro di nitrocellulosa. Questi studi si basano sul fatto che il DNA a doppio filamento non legherà un filtro di nitrocellulosa a meno che questo sia associato con una proteina. Il DNA è marcato e combinato con una proteina con cui forma un complesso forte. Possiamo misurare la quantità del complesso DNAproteina che si forma misurando la radioattività legata al filtro. Possiamo determinare quanto forte la proteina è legata testando l’abilità del DNA bersaglio non marcato a competere con il DNA marcato per il legame alla proteina. Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl Questo è possible consentendo alla proteina purificata di legare il DNA marcato, aggiungendo successivamente DNA non marcato, e filtrando le miscele attraverso la nitrocellulosa a tempi differenti. La figura sottostante illustra un esempio di legame debole e di legame forte. Legame-forte DNA marcato trattenuto su filtro Legame-debole debdedededed edebbdebbole Tempo(min) (min) Questo esperimento è stato svolto da Hinkle e Chamberlin usando il DNA del fago T7 e la RNA polimerasi di E. coli (vedi contenuti online 6.3). Questo lavoro dimostra che c’è un legame più forte tra l’oloenzima ed il promotore che tra il core della polimerasi ed il promotore. 5. 6. Il tasso di dissociazione dei complessi promotore – polimerasi è più elevato a temperature elevate. Questo suggerisce che la formazione di un complesso del promotore più stabile coinvolge la fusione localizzata del DNA. Questa fusione è favorita alle alte temperature. Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl Complesso chiuso del promotore Complesso aperto del promotore 7 -35 box -10 box -35 box -10 box Inizio della trscrizione start Tipico promotore procariotico Inizio della trscrizione -60 -40 elemento UP 8. Fai riferimento ai contenuti online 6.4. La formazione di trascritti abortivi dell’RNA polimerasi di E. coli può essere dimostrata come segue. Per visualizzare la trascrizione, si può utilizzare un saggio di trascrizione in vitro usando un DNA stampo che contenga un promotore di E. coli, una RNA polimerasi ed un nucleotide marcato con [32P] ATP . L’elettroforesi su gel e l’autoradiografia consentono la determinazione della grandezza dei trascritti da tale saggio. L’eparina è un polisaccaride carico negativamente che compete per il DNA per il legame alla Promotore procariotic o con l’elemento UP Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl RNA polimerasi. In un saggio in vitro, questo impedirà qualunque riassociazione della polimerasi ad un promotore una volta che esso è stato rilasciato. L’elettroforesi su gel e l’autoradiografia dei prodotti di quest’esperimento mostreranno la sintesi di molti oligonucleotidi corti marcati tramite la RNA polimerasi. Da questo noi riteniamo che la RNA polimerasi crea molti brevi trascritti abortivi prima di raggiungere finalmente l’equilibrio del promotore ed entrare nella fase di allungamento della trascrizione. 9. 1. 2. 3. 4. Formazione del complesso chiuso del promotore Formazione del complesso aperto del promotore Incorporazione dei primi pochi nucleotidi Equilibrio del promotore 10.Vedi figura 6.7. Il primo nucleotide della trascrizione è particolare in quanto contiene tutti e tre I suoi gruppi fosfato, , e . Tutti gli altri nucleotidi contengono solo il fosfato . In una reazione di trascrizione in vitro Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl possiamo usare l’incorporazione di [-32P] ATP o di [-32P] GTP (la trascrizione generalmente comincia con una purina che il più delle volte è una A piuttosto che una G) per misurare con esattezza il tasso di inizio. I nucleotidi 14 C aggiunti alla reazione saranno incorporati tutti nella catena per misurare i tassi di inizio e di allungamento. Per misurare gli effetti di sul tasso di inizio della trascrizione possiamo mettere su il seguente esperimento. A due gruppi di reazioni di trascrizione, una marcata con [-32P] ATP ed una con il nuclotide 14 C, aggiungeremo il core della RNA polimerasi, uno stampo di DNA e quantità crescenti della proteina purificata. Possiamo poi misurare gli effetti di sull’inizio della trascrizione contando il [-32P] nell’RNA sintetizzato. Possiamo misurare l’effetto di sigma nell’accumulo totale dei trascritti (inizio ed allungamneto insieme) misurando l’incorporazione del nucleotide marcato 14 C. I risultati attesi sono illustrati nel grafico sottostante. Questi dati indicano che l’aumento delle quantità di provoca un aumento nell’inizio ed anche un aumento nell’accumulo netto dei trascritti. Isotopi incorporati Quantità di aggiunto 11.Nell’esperimento descritto sopra, l’effetto stimolante di sull’inizio della trascrizione è incontrovertibile ma non è chiaro se la stimolazione osservata sull’allungamento sia un risultato diretto dell’aggiunta del fattore o se dovuto all’aumento del numero di trascritti iniziati. L’inizio è la fase limitante della trascrizione, ogni aumento dell’inizio risulterà nell’accumulo di trascritti allungati. Possiamo dimostrare che l’effetto di è limitato alla fase iniziale usando l’antibiotico rifampicina che inibisce l’inizio in maniera specifica. Per dimostrare questo possiamo allestire un esperimento di trascrizione in vitro e Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl consentirne la durata per il periodo limitato per far avvenire l’inizio della trascrizione. La rifampicina sarà poi aggiunta per impedire ulteriori inizi e l’effetto di quantità crescenti di fattore solo sull’allungamento potrà essere determinato misurando I trascritti di RNA appena sintetizzato per elettroforesi o ultra centrifugazione. Questi esperimenti dimostrano che non accelera la quantità dei trascritti allungati, ma agisce esclusivamente sull’inizio della trascrizione. La stimolazione dell’allungamento è una conseguenza della stimolazione dell’inizio: con più catene iniziate da allungare, la RNA polimerasi può naturalmente effettuare più reazioni di allungamento. 12.Gli esperimenti dei primi due quesiti ci consentono di concludere che stimola l’inizio della trascrizione ma non l’allungamento. 13.Vedi figura 6.8. Il seguente esperimento può essere utilizzato per dimostrare il riciclo di . Allestiremo una reazione di trascrizione, a bassa forza ionica, utilizzando l’oloenzima della RNA polimerasi ed una purina marcata con [-32P]. Questo ci consente di misurare l’inizio di trascrizione monitorando l’accumulo di 32P nei trascritti. La bassa forza ionica impedirà al core di dissociarsi dallo stampo di DNA alla fine del gene e la trascrizione si avvierà inevitabilmente verso la fine in quanto il core risulterà limitante per l’oloenzima. Da qui sorge una domanda, se riforniamo del core endogeno, possiamo riciclare dall’oloenzima originale? Per dimostrare questo possiamo aggiungere nuovo core dell’enzima dopo 10 minuti e vedere se si riverifica l’inizio. Il ri-inizio della trascrizione ci dice che il fattore rilasciato dall’oloenzima è ora asoociato con il nuovo core dell’enzima. Così il fattore è riutilizzato. Possiamo anche usare quest’esperimento per dimostrare che il core Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl della polimerasi conferisce resistenza alla rifampicina. La RNA polimerasi della maggior parte dei ceppi di E. coli è rifampicina sensibile. Nell’esperimento descritto sopra, l’oloenzima a cui si fa riferimento inizialmente è rifampicina sensibile. Se la resistenza alla rifampicina risiedesse in , l’aggiunta di un nuovo core dalle cellule rifampicina resistenti non risulterebbe in un reinizio della trascrizione sia in presenza che in assenza di rifampicina. I dati di quest’esperimento sono riassunti nel grafico sottostante e questo ci indica che la sensibilità alla rifampicina si trova nel core dell’enzima piuttosto che nel fattore . + rifampicin - rifampicin 14. core Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl 15.Fai riferimento ai contenuti online 6.5. La FRET (Fluorescenza con trasferimento di energia di risonanza) è una tecnica che ci consente di determinare che non si dissocia dal core della polimerasi durante l’allungamento. La FRET si basa sull’utilizzo di una molecola donatore fluorescente e di una molecola accettore che, in prossimità della molecola donatore, silenzia il segnale. Non appena il donatore e l’accettore entrano in contatto, il silenziamento è più forte in proporzione alla distanza tra loro e la FRET aumenta. Un approccio sperimentale definito come FRET leading-edge può essere usato per dimostrare che non si dissocia dal core della polimerasi durante l’allungamento. Se localizziamo un tag donatore di fluorescenza su ed un tag accettore di fluorescenza sul 3’ della molecola di DNA che si stà trascrivendo, possiamo seguire il movimento della subunità dell’RNA polimerasi così come questa si muove attraverso il 3’ dello stampo durante l’allungamneto. Se si dissociasse dalla polimersi durante l’allungamneto ci aspettermo un aumento della fluorescenza mentre la trascrizione procede e la FRET diminuisce. Se dall’altro canto rimanesse associato alla polimerasi durante l’allungamneto, l’aumento in prossimità delle sonde, mentre la trascrizione procede, risulterà in un aumento della FRET. Per effettuare un tale esperimento potremo formare in soluzione complessi aperti del promotore, e aggiungere eparina per legare la polimerasi non complessata. I complessi di promotore aperti potrebbero essere purificati tramire elettroforesi e letti in un fluorometro con un buffer di trascizione. Senza nucleotidi, non ci sarà l’allungamento ed i livelli basali della FRET potrebbero essere registrati. Questo è indicato da To nell’istogramma sottostanre. L’aggiunta dei tre nucleotidi darà origine ad un breve allungamernto dopo il quale il livello di FRET può essere registrato dopo, per esempio. 10 minuti (T10). I risultati sono riportati nell’istogramma sottostante. Gli aumenti della FRET Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl mentre l’allungamento procede indicano che è rimasto associato alla RNA polimerasi. Efficienza della FRET T0 T10 16.Il modello del ciclo di descritto precedentemente è stato in parte sviluppato usando l’evidenza sperimentale di Traves e Burgess indicando che può essere riutilizzato. Comunque, I dati presentati nell’esperimento descritto nella domanda precedente sembrerebbero contraddire il modello del ciclo di . Potremmo sostenere per questo apparente enigma che si associa strettamnte con la RNA polimerasi durante la fase di inizio e debolmente durante l’allungamento. è perciò disponibile ad associarsi con altri core dell’RNA polimerasi se la trascrizioine in qualche modo rallentasse durante al fase di allungamento. Uno studio condotto da Bar-Nahum e Nuddler (contenuti online 6.5) durante l’allungamento illustra l’associazione blanda di con il core. Questi ricercatori purificarono catene nascenti di RNA, insieme alle RNA polimerasi ad esse associate, usando un oligonucleotide complementare al 5’ della molecola di RNA, immobilizzato su di una resina. I complessi RNA/polimerasi associati alle biglie sono stati centrifugati e le proteine analizzate per SDSPAGE. Solo una piccola porzione delle RNA polimenrasi ha un ad esse associato. Questo suggerisce un legame debole tra il core e nel conplesso di allungamento. 17.Il seguente approccio sperimentale può essere utilizzato per individuare quali coppie di basi sono denaturate Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl quando la RNA polimerasi lega un promotore. Un promotore verrà marcato terminalmente e si formerà un complesso aperto con la RNA polimerasi. Il DNA denaturato estruderà l’N1 dell’adenina rendendolo disponibile per la metilazione da parte del dimetilsolfato (DMS). La polimerasi può essere rimaossa ed i gruppi metilici sul residuo di A impediranno il riappaiamento tra le A e le T nel DNA stampo. Le posizioni dei nucleotidi dove non c’è l’appaiamento di basi sono suscettibili all’attacco da parte della nucleasi S1. Se la reazione di metilazione si verificasse in condizioni limitanti, ci aspetteremo un insieme di molecole tagliate ad ogni residuo di adenina e di timina nella regione dello stampo a cui la polimerasi lega. Una autoradiografia esplicativa è rappresentata qui di fianco. Questo ci dice che alle posizioni corrispondenti a 5, 9 e 10 coppie di basi dalla marcatura terminale della molecola c’è una coppia di basi AT a cui la polimerasi lega e che queste coppie di basi si trovano in una regione di DNA denaturato. Dal momento che la polimerasi può legare basi GC fiancheggianti che non sono metilate in questo saggio e, quindi non sensibili al taglio, questa non può essere considerata una rappresentazione accurata per l’esatto appaiamento di basi denaturate quando la polimersi le lega. Per un altro esempio della procedura con risultati sperimentali fai riferimento ai contenuti online 6.6. INSERIRE SCHEMA RISPOSTA 17 18.Vedi Figura 6.10. Possiamo usare il saggio di seguito riportato per determinare accuratamente il numero di basi denaturate durante la trascrizione. Un numero noto di RNA polimerasi sono legate ad uno stampo circolare di DNA ad esempio SV40. E’ noto il numero esatto di molecole coinvolte nella formazione del complesso ternario nel saggio, così come è noto il numero di Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl molecole di DNA del saggio. Le condizioni di reazione sono tali che ogni polimerasi inizia una sola volta e rimane sottoforma di complesso ternario per l’intera durata del saggio. Dopo la formazione del complesso ternario, i superavvolgimenti sono rilassati da un taglio, e successivamente la polimerasi è rimossa dal DNA. Dal monento che la polimerasi ha svolto la doppia elica in una regione del DNA a cui era legata, la molecola è svolta. I superavvolgimenti risolvono un DNA a doppia elica chiuso circolare che ha una regione svolta. Il grado di superavvolgimento richiesto per risolvere lo svolgimento è proporzionale al numero di paia di basi svolte o sciolte mentre la polimerasi è complessata al DNA. Il grado di svolgimento è misurato da un cambiamento nella mobilità durante l’elettroforesi ed il cambiamneto dell’avvolgimento può essere plottatto come una funzione del numero di polimerasi per duplex di DNA nel saggio originale. Possiamo misurare che ci sono 1.6 giri di superelica per RNA polimerasi. Un giro dell’elica del DNA contiene 10.5 paia di basi, 1,6 giri corrisponde a 16.8 paia di basi, e questa corrisponde al numero di coppie di basi separate durante la trascrizione. 1 giro/10.5 bp = 1.6 giri/X bps X = 10.6 X 1.5 = 16.8 giri Polimerasi attiva per genoma Cambio in superelicità Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl 19.La regione 2.4 del fattore è coinvolta nel riconoscimento della box -10 del promotore. L’evidenza genetica è a supporto di quest’ipotesi. Un batterio con una mutazione nella box -10 del promotore può avere la sua funzione ripristinata da una mutazione di soppressione nella regione 2.4 del fattore . Questo significa che un cambiamento nella sequenza dell’elemento del promotore può essere compensato da un’alterazione nella sequenza amminoacidica nella regione della proteina che lega quest’elemento. Questo suggerisce che la regione 2.4 del fattore interagisce con la box-10. Dal momento che, in modo simile, osserviamo la soppressione della muatzione nella box -35 con mutazioni nella regione 4.2 del fattore sappiamo che questa regione del fattore interagisce con la box-35. 20.Fai riferimento ai contenuti online 6.7. Il seguente saggio di binding può essere usato per dimostrare l’interazione tra la regione 4.2 di e la regione -35 del promotore. Una proteina di fusione glutathione-S-transferasi (GST) contenente la regione 4.2 di può essere usata per un saggio di binding su filtro di nitrocellulose insieme ad un frammento di DNA marcato contenete la regione -35. La proteina di fusione ed il DNA marcato possono legare e poi passare attraverso un filtro di nitrocellulose che tratterrà il complesso DNA-proteina. La specificità dell’interazione tra la regione -35 e la regione 4.2 di può essere dimostrata testando l’abilità di sequenze non marcate di DNA a competere per il binding. In questi esperimenti, un competitore non specifico di DNA o un Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl DNA che contenga la regione -10 non può competere per il legame alla proteina. In ogni modo, il legame del DNA non marcato contenente la regione -35 può competere per il legame alla proteina alla regione marcata -35. Questo dimostra l’interazione tra la regione 4.2 di e la regione 35 del promotore. 21.Fai riferimento ai contenuti online 6.8. L’evidenza sperimentale di Gourse ed altri convalida l’ipotesi che è la subunità della RNA polimerasi responsabile del legame all’elemento UP presente in alcuni promotori di E. coli. Questi studiosi provarono la trascrizione da un promotore con un elemento UP, il promotore P1 di rrnB, usando la RNA polimerasi di tipo selvatico e due differenti RNA polimerasi con mutazioni nella subunità . Quando il saggio veniva effettuato con una subunità mancante di 94 aminoacidi al C-terminale, essi osservarono una significativa diminuzione nella trascrizione che normalmente avviene ad alta intensità dall’elemento UP. Essi osservarono, allo stesso modo, una bassa trascrizione dall’elemento UP usando una polimerasi con una subunità che aveva una arginina sostituita da una cisteina in posizione 265. Per validare ulteriormente questa ipotesi, esperimenti di DNAsi footprinting mostrarono che il mutante della polimerasi senza il C-terminale falliva nel dare l’impronta nella regione dell’elemento UP, lì dove, invece, ci riesce una polimerasi selvatica. Inoltre, la subunità purificata era da sola capace di dare l’impronta nella regione UP. 22.La proteolisi limitata può darci l’informazione circa i domini, o indipendentemente sul ripiegamento di una proteina. Gli aminoacidi della struttura del complesso ternario di domini ripiegati non sono accessibili alle proteasi. I gruppi di aminoacidi meno strutturati che connettono tra loro i singoli domini sono più suscettibili Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl alla digestione. La proteolisi limitata taglierà tra i domini ripiegati della proteina, lasciandoli intatti così che la misura di questi domini può essere determinata. Un tale approccio è stato usato per definire i domini della subunità della RNA polimarasi e mostrano che questa è compresa da un largo dominio N-terminale e da un più piccolo dominio C- terminale uniti tra loro da 13 aminoacidi. 23.Vedi Figura 6.17. I saggi di trascrizione, in cui le subunità della RNA polimerasi sono ricostruite da differenti fonti, possono essere usate per determinare quale delle subunità della RNA polimerasi conferisce resistenza o sensibilità alla rifampicina o alla streptolidigina. Potremo mettere su un esperimento nel modo seguente: Potremo ricostruire una polimersi in cui la -subunità viene da un ceppo resistente alla rifampicina e la rimanente parte delle subunità da un ceppo sensibile alla rifampicina. Potremo poi misurare la trascrizione in presenza di rifampicina. Possiamo anche prevedere che se la sensibilità alla rifampicina è conferita dalla subunità (come è attualmente), la polimerasi ricostruita sarà rifampicina resistente ed i trascritti saranno prodotti. Se, invece, il controllo della resistenza o della sensibilità si trova altrove (non nella subunità ) l’enzima ricostruito non produrrà trascritti in presenza di rifampicina. Un simile esperimento può essere usato per determinare quale subunità è responsabile della sensibilità alla streptoglidina. In questo caso se combiniamo una subunità da un ceppo streptoglidina resistente con le rimanenti subunità tutte provenienti da un ceppo streptoglidina sensibile, un saggio di trascrizione ci consentirà di determinare se la subunità sia capace di conferire resistenza all’enzima ricostruito. Infatti la subunità è responsabile del conferimento della resistenza ad entrambi gli antibiotici. Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl 24.Vedi Figure 6.18 e 6.19. La marcatura per affinità è una tecnica che può essere usata per identificare quale subunità di un enzima contenga il suo sito attivo. Per determinare quale subunità della RNA polimerasi sia associata al sito attivo o, in altre parole, quale subunità catalizzi la formazione dei legami fosfodiesterici, si può ipotizzare un esperimento di questo tipo. Si può usare per un saggio di trascrizione un analogo dell’ATP, che può essere legato covalentemente al sito attivo dell’enzima. In teoria possiamo marcare l’analogo, frazionare le subunità dell’enzima e così identificare le subunità associate all’analogo. In ogni modo quest’approccio è una potenziale trappola. L’analogo può potenzialmente associarsi con aminoacidi al di fuori del sito attivo dell’enzima e così co-purificare con una subunità non coinvolta direttamente nella catalisi. Un trucco furbo che permette una più facile determinazione della localizzazione del sito attivo dell’enzima è il seguente: Piuttosto che marcare solo l’analogo, possiamo marcare il nucleotide con cui ha formato un legame fosfodiesterico includendo un [-32P] UTP o un CTP nel saggio di trascrizione. La subunità associata con il nucleotide marcato è quella che contiene il sito attivo dell’enzima. Riassumendo, questo esperimento ci consente di legare covalentemente i primi due nucleotidi al sito dove si trova il primo legame fosfodiesterico, mantenendoli associati con la subunità recante il sito attivo. 25.Vedi Figura 6.20, e fai riferimento ai contenuti online 6.9 e 6.10. Un esperimento illustra il fenomeno del trasferimento dello stampo che coinvolge le seguenti tappe con i seguenti risultati. Una polimerasi è ingegnerizzata con una coda di 6 istidine immobilizzata su di una resina di nickel. Questo stampo è tipizzato, ad esempio, la sua sequenza è nota così come è nota la grandezza del trascritto prodotto dallo stampo stesso. Questa informazione ci consente di dare inizio alla trascrizione e Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl di camminare lungo la polimerasi per trascrivere lo stampo con un numero preciso di nucleotidi, di saltarne uno causando la terminazione della trascrizione. Possiamo poi aggiungere tutti i nucleotidi e creare trascritti completi; questa fase è detta chase. Se dopo che la polimerasi ha terminato la trascrizione del primo stampo, aggiungiamo un secondo stampo per un chase, possiamo avere trascritti completi da entrambi gli stampi. L’elettroforesi e l’autoradiografia confermeranno che entrambi I trascritti sono della giusta misura. Dal momento che l’unica fonte di polimerasi necessaria per trascrivere il secondo stampo è quella ancora legata al primo stampo, possiamo concludere che la polimerasi salta da uno stampo ad un altro. In un esperimento come questo, possiamo manipolare lo stampo per determinare quello che è necessario al trasferimento dello stampo. Due siti di legame saranno individuati trasferendo la RNA polimerasi a stampi secondari e testando la stabilità dei complessi formati trattandoli con i sali (Figura 6.20). Il primo è sensibile al sale e quindi stabilizzato da deboli interazioni elettrostatiche, un secondo è resistente al sale ed è stabilizzato da interazioni idrofobiche. Al fine di individuare quali subunità della RNA polimerasi immobilizzata legano I siti forti e deboli sullo stampo di DNA si esegue il seguente esperimento. Vorremmo avviare la trascrizione di uno stampo radioattivo in presenza di un analogo di timidina fotoreattiva e tramite irradiazione con i raggi UV avremo il cross-link della polimerasi allo stampo. Vorremmo farlo in due esperimenti paralleli: uno con una sequenza che sappiamo essere coinvolta nel legame forte ed un secondo con una sequenza che sappiamo essere coinvolta in un legame debole. Avendo essenzialmente "incollato" la subunità della polimerasi che in ogni caso lega il DNA stampo, siamo in grado di separare le subunità della polimerasi tramite SDS-PAGE ed autoradiografia. Possiamo aspettarci di osservare l’associazione della β-subunità con Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl il sito di legame debole sullo stampo e l’associazione di entrambe le subunità β 'e β- con lo stampo contenente il sito di legame forte. 26.Fai riferimento ai contenuti online 6.11. Un esperimento di cross-linking effettuato da Nudler ed altri ha dimostrato che all’interno del complesso di allungamento della trascrizione esiste un ibrido di RNA-DNA lungo almeno 8 pb. Questi esperimenti, come quello descritto in precedenza, fanno affidamento su di un sistema trascrizionale in cui la RNA polimerasi è immobilizzata su di una matrice solida e dirige la sintesi di trascritti marcati da un DNA sampo. In questi saggi, la polimerasi può "camminare" lungo lo stampo includendo solo alcuni dei quattro nucleotidi. In altre parole, siamo in grado di fermare la trascrizione in una posizione nota e manipolare sperimentalmente il complesso (per esempio l'introduzione di una base modificata) di sapere esattamente in quale parte del processo di allungamento della catena si trova la polimerasi. Si può quindi continuare la trascrizione fino alla fine dello stampo. Questo è esattamente ciò che è stato fatto in questo esperimento. Un UMP (U •) derivato che è stato incorporato in una catena di RNA può essere in grado di cross-linkare al suo DNA stampo a condizione che sia appaiato ad una A. Se la U • derivata non è appaiata alla A nel suo stampo, il cross-linking non si verificherà. L’RNA che è stato cross-linkato al DNA può essere rilevato tramite elettroforesi ed autoradiografia dal momento che lo stampo della molecola di DNA solo se è legata al suo trascritto di RNA marcato. In questo esperimento, una serie di trascritti sono stati generati come segue: Si è formato un complesso di allungamento della trascrizione e la polimerasi ha camminato lungo il trascritto e le U • sono state inserite in posizioni ben precise nei trascritti. Questo ha creato una serie di complessi di allungamento tutti della stessa lunghezza, ma contenenti ciascuno un U • Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl incorporato in posizioni diverse lungo la catena. Ciascuno di questi trascritti è stato poi utilizzato in una reazione di cross-linking. Il cross-linking è stato osservato solo quando la U • è presente in posizioni da -2 a -8 corrispondenti a due ed otto nucleotidi rispettivamente al 3' del trascritto. Con la U • in posizione -10 l’efficienza del cross-linking è diminuita in maniera significativa suggerendo che non vi erano coppie di basi UA in questa regione. Questo esperimento conferma l'ipotesi che vi sia una regione ibrida di 8-9 coppie di basi all'interno del complesso di allungamento della trascrizione. SITO DI LEGAME DELLA RIFAMPICINA CENTRO CATALITICO 27. Il disegno di cui sopra illustra la struttura del nucleo dell’enzima della RNA polimerasi. Il sito di legame della rifampicina è parte della β-subunità (vedi Figura 6.22 per un quadro più dettagliato del sito di legame della rifampicina). Un possible meccanismo d'azione dell’antibiotico è che questo impedisce ad una piccola catena di nuova sintesi di uscire dal canale. Pertanto, essa non pregiudica l'assemblaggio dei primi pochi nucleotidi, ma dopo che si è formato un breve oligonucleotide, la rifampicina impedisce che questo esca dal canale in cui si trova il sito catalitico. Tuttavia, dopo che la catena raggiunge una certa lunghezza, l'aggiunta di rifampicina non ha alcun effetto sull’allungamento. Questo può significare che una catena di RNA di una certa lunghezza Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl non consenta l'accesso dell’antibiotico al sito all'interno del canale. 28. Vedi anche la Figura 6.23. DOMINIO 4 di DOMINIO 2 di DOMINIO 3 di 29.Vedi la Figura 6.24. È stato proposto che la regione 1.1 di σ lega, nel canale principale dell’enzima, il complesso chiuso del promotore. Di seguito vi sono due evidenze a sostegno di questa ipotesi. In primo luogo, la regione 1.1 di σ è formata da molti residui di aminoacidi acidi, inoltre, il canale principale dell’enzima è basico. In secondo luogo, l’N-terminale tronco di σ, da cui la struttura è stata determinata, si trova al termine di un αelica che punta al centro catalitico. In questo modo è facile immaginare che la regione 1.1 di σ risiede nel centro catalitico. Nel complesso aperto del promotore si suppone che la regione 1.1 di è al di fuori del centro catalitico e che questo è stato espulso durante la formazione del complesso aperto del promotore. Due prove a sostegno di questa ipotesi sono le seguenti: In primo luogo, nella struttura cristallina dell’oloenzima di T. aquaticus legato al DNA, la regione 1.1 di σ è disordinata suggerendo che è stata espulsa dal canale. In Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl secondo luogo, il footprinting della proteina σ70 di E. coli ha dimostrato che la regione 1.1 di σ è protetta nell’oloenzima senza DNA, ma esposta nel complesso aperto del promotore. Prova diretta di questo cambiamento della posizione della regione 1.1, dopo la formazione del complesso aperto del promotore, provengono da studi sulla FRET in cui si può misurare direttamente la vicinanza di due molecole marcate. Questo verifica l'associazione della regione 1.1 di σ con il canale principale prima della formazione del complesso aperto del promotore e dopo la sua successiva espulsione. 30.Un modello che spieghi la formazione di abbondanti trascritti abortivi da parte della RNA polimerasi propone un link tra I domini 3 e 4 di (Figura 6.25) che impedisce l'uscita di nuovi RNA attraverso il suo canale di uscita. Tuttavia, quando la molecola di RNA raggiunge 12 nt in lunghezza, il linker è ostacolato dal sito di uscita e la subunità σ modifica o perde la sua associazione con il nucleo dell’enzima e la trascrizione può continuare senza ostacoli. L'apparente debole stuttura del linker di σ che di fatto impedisce la trascrizione, è una conseguenza della stretta associazione di σ con il sito attivo dell’enzima. 31. DNA STAMPO Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl Nel fumetto è rappresentata la struttura cristallografica raffigurante il complesso DNA-oloenzima con il promotore nel complesso aperto, è evidente che la subunità σ svolge il ruolo più importante nel legame al DNA. Vedi anche Figura 6.27. 32.La struttura cristallografica ottenuta del complesso DNA-oloenzima con il promotore nel complesso aperto (Figura 6.28), avvalora fortemente i dati genetici e biochimici che dimostrano una interazione tra la regione 2.4 di σ e la zona -10 dei promotori di E. coli. Ad esempio, due aminoacidi, Gln 437 e Thr 440, che studi genetici hanno determinato che interagiscono con il DNA alla base -12, hanno dimostrato di essere in una posizione ottimale per l'interazione di questa posizione con il DNA. Allo stesso modo, i residui aromatici fondamentali coinvolti nella fusione sono posizionati in maniera tale da interagire con il filamento a singolo strand non-stampo nella struttura del promotore a complesso aperto. I residui basici nel legame al DNA sono anche posizionati per legare il DNA mediante interazioni elettrostatiche. Al contrario, i residui specifici nella regione 4.2 di σ coinvolti nel legame alla regione 35, non sono confermati dalla struttura cristallografica. Si è concluso che questo è a causa di uno spostamento del DNA dalla regione -35 che risulta essere un artefatto durante la formazione del cristallo. 33. In figura 6.30 sono illustrati due modelli per spiegare come l'RNA polimerasi può mantenere la bolla del DNA svolta, mentre si muove lungo lo stampo. Nel primo modello, lo stampo di DNA rimane statico e la RNA polimerasi e l’RNA crescente seguono la naturale torsione nella molecola di DNA. Nel secondo modello, il DNA davanti alla bolla si snoda ed il DNA dietro la bolla si riavvolge. Questo avrà l'effetto di introdurre superavvolgimenti positivi davanti alla bolla di trascrizione e negativi dietro la trascrizione. Le Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl topoisomerasi sono enzimi che rilassano i superavvolgimenti tagliando e rilegando i filamenti in modo da alleviare la tensione della molecola. A sostegno del secondo modello, topoisomerasi mutanti che mancano della capacità svolgere i superavvolgimenti negativi accumulano superavvolgimenti negativi durante la trascrizione, mentre le topoisomerasi mutanti che sono carenti nella capacità di svolgere superavvolgimenti positivi accumulano superavvolgimenti positivi durante la trascrizione. 34.Due elementi importanti per la terminazione intrinseca sono, un’ansa a forcina stabilizzata da una regione ricca in GC nel gambo della struttura a forcina, ed una serie di residui di T nel filamento non-stampo che risulta in una serie di coppie di basi AU meno stabili nel trascritto a valle dell’ansa. Farnham e Platt determinarono sperimentalmente che, la creazione di DNA stampo in cui la serie di T nel filamento non-stampo è stata sostituita con basi che hanno portato a trascritti con una maggiore stabilità nelle coppie di basi GC dopo l’ansa, causano una diminuzione nell’attenuazione. Questo effetto può essere contrastato sostituendo la iodo-CTP con la CTP ordinaria nella reazione di trascrizione. Le coppie di basi G-iodo-C sono più forti delle coppie ordinarie G-C, così che l’incorporazione di iodo-CMP nell’ansa dovrebbe stabilizzarle ulteriormente. È stato inoltre dimostrato che indebolire lo stelo dell’ansa ricca in G-C riduce anche l'efficienza di attenuazione. Ciò è stato fatto utilizzando ITP (inosina trifosfato), un analogo del GTP, per introdurre coppie I-C più deboli nello stelo dell’ansa per destabilizzare la struttura. Questa destabilizzazione ha portato ad un indebolimento dell’attenuazione. 35.L'idea che una forcina non è richiesta per il pausing nella terminazione intrinseca è supportata dal fatto che in Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl saggi di terminazione utilizzando stampi in cui la forcina non si forma, la polimerasi rallenterà a livello di coppie di basi rU-dA. 36. Fai riferimento ai contenuti online 6.14. Yarnell e Roberts presentarono dati dimostrando che l’appaiamento di basi (di qualcosa) con l'RNA a monte di un sito di pausing è necessario per la terminazione intrinseca. Questi studiosi analizzarono la terminazione di stampi di DNA mutanto per produrre molecole di RNA marcato. Essi legarono il DNA stampo a sfere magnetiche che gli permisero di isolare facilmente i trascritti rilasciati dallo stampo di DNA. Essi usarono una serie di stampi di DNA per il test. Tra questi due stampi che mancavano nella seconda metà dell’invertita ripetuta, impedendo così la formazione della forcina. Come poterono prevedere, la terminazione non si verificava con l'utilizzo di questi filamenti mutanti. Tuttavia, quando la parte mancante dell’invertita ripetuta è stata introdotta sottoforma di oligonucleotide, si verificava una terminazione efficiente. Inoltre, interferendo con l’appaiamento di basi, introducendo di una coppia di basi nella catena dell’oligonucleotide si aveva una drastica riduzione della terminazione. Questo potrebbe essere compensato con una mutazione corrispondente nel DNA stampo che ha permesso il completo appaiamento di basi tra gli oligonucleotidi modificati e la catena di RNA. 37.Un terminatore rho-dipendente è caratterizzato da un sito di legame per rho, che è una sequenza di 60-100 residui nucleotidici, ricca in citosina, a monte di un invertita ripetuta. L’invertita ripetuta forma una forcina nell’RNA trascritto. Rho è un esamero, ogni subunità ha un’attività ATPasica. Rho lega l'RNA, con conseguente attivazione dell’attività ATPasica. Ciò fornisce energia per la propulsione di rho lungo l’RNA dove "insegue" la Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl polimerasi. Rho "cattura" la polimerasi, quando rallenta sul terminatore, e svolge l’ibrido RNA-DNA all'interno della bolla di trascrizione, rilasciando, in tal modo, l’RNA e terminando la trascrizione. 38.Vedere la Figura 6.33. Mediante una reazione di trascrizione in vitro in presenza di [γ-32P] GTP, siamo in grado di dimostrare che rho causa una diminuzione netta nella sintesi di RNA, ma non nella diminuzione degli eventi di inizio. Questo misura il tasso di inizio di trascrizione. Un'altra reazione in presenza di [3H] UTP misurerà il tasso netto o totale di sintesi di RNA. Per ciascuna di queste reazioni possiamo aggiungere quantità sempre crescenti di rho e misurare l'accumulo di trascritti marcati con [γ -32P] GTP e con [3H] UTP. I dati ottenuti avranno un aspetto simile a quello raffigurato nella figura sottostante. Questi dati dimostrano che rho non pregiudica l'incorporazione di [γ-32P] GTP in trascritti neo-sintetizzati, ma diminuisce l'incorporazione di [3H] UTP nei trascritti. Ciò dimostra che rho diminuisce la sintesi netta di RNA come misurato dall’accumulo di [3H] UTP, ma non di causare una diminuzione nell’inizio, misurato con l'accumulo di [γ-32P] GTP nei trascritti di nuova sintesi. Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl 39.Vedere la figura 6.34. Al fine di dimostrare che i trascritti più brevi sono prodotti in presenza di rho, allestiremo un saggio di trascrizione in vitro in presenza di rho, e marcheremo i trascritti con [14C] UTP. Vorremmo frazionare gli RNA trascritti mediante ultracentrifugazione. I trascritti più larghi sedimentano rapidamente verso il fondo del tubo, mentre I più piccoli sedimentano più lentamente e si trovano alla cima del tubo da centrifuga. In questo esperimento osserveremo una riduzione delle dimensioni dei trascritti marcati con [14C] in presenza di rho. Come controllo, per escludere la possibilità che rho agisca come una nucleasi, potremo far correre la reazione con trascritti pre-formati marcati con 3H effettuati in assenza di rho. Se rho semplicemente agisse come una nucleasi, I trascritti marcati con 3H dovrebbero essere ridotti di dimensioni come I trascritti marcati 14C. I risultati sono illustrati nel grafico sottostante, dove si vede un numero più elevato di trascritti più corti effettuati in presenza di rho, mentre I trascritti effettuati in assenza di rho sono molto più grandi. 40.Vedere la Figura 6.35. Il seguente esperimento mostrerà che rho rilascia I trascritti dallo stampo di DNA. Due reazioni di trascrizione in vitro sono state predisposte utilizzando [14C] UTP. Per una reazione si aggiunge rho Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl e, mediante ultracentrifugazione su gradiente di densità di solfato di cesio per determinare le proprietà di sedimentazione dei prodotti dell’RNA, siamo in grado di determinare se l'RNA è stato rilasciato dal suo stampo. Questo tipo di gradiente di ultracentrifugazione separa RNA e DNA per mezzo della loro diversa densità. In assenza di rho, ci aspettiamo che l’RNA sedimenti nella provetta da centrifuga alla stessa posizione del DNA. Ciò fa ritenere che essi sono associati. Al contrario, ci aspettiamo che l'aggiunta di rho alla reazione ci dia due distinti profili di sedimentazione dopo ultracentrifugazione, uno corrispondente al DNA ed uno corrispondente all’RNA trascritto marcato. I dati attesi sono mostrati nelle figure qui sotto. La separazione dei trascritti dal loro stampo di DNA dopo l'aggiunta di rho conferma l'ipotesi che rho rilascia I trascritti dal DNA. (unità arbitrarie) DNA libero Frazione Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl Per l’approfondimento 1. DNA GACTATGCGTCACGTACGCATAGTC filamento codificante CTGATACGCAGTGCATGCGTATCAG Trascritto GACUAUGCGUCACGUACGCAUAGUC G A C U A U G C G U C A C U G A U A C G C A U G C 2. AC → T Una mutazione dimostrata nel primo nucleotide della box -10 del promotore di E. coli, cambierà la sequenza della box -10 da CATAGT a TATAGT. Questo comporta che l’appaiamento della sequenza -10 è più simile alla sequenza consenso di TatAaT e, quindi, probabilmente ad una mutazione Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl up. A T→ A Una mutazione nell’ultimo nucleotide della box -10 di questo promotore di E. coli cambia la sequenza della box -10 da CATAGT a CATAGA. Questo diminuisce l’appaiamento della box -10 con la sequenza consenso di TatAaT e, quindi, probabilmente ad una mutazione down. 2. a) La molecola di RNA che risulterebbe dalla trascrizione della sequenza selvatica è : U UG A C G C C G C G G C C G G C A U CG A U UUUUU U b) Il gene selvatico mostra un’attenuazione del 100% sia in presenza, che in assenza di rho indicando la presenza di una sequenza di terminazione intrinseca altamente efficiente. Non si può solo da questi dati determinare se la terminazione rhodipendente si verifica in questo trascritto a causa della completa terminazione vista in assenza di rho. Il mutante A mostra una riduzione della terminazione del 40% sia in presenza che in assenza di rho. Ciò è dovuto alla notevole destabilizzazione della struttura a forcina nel mutante. Il mutante ha ora solo 5 paia di basi per stabilizzare la forcina e solo una di queste è stabile quanto una coppia di CG. Poiché la forcina è richiesta per entrambi I tipi di terminazione, rho Biologia molecolare 2/ed Robert F. Weaver Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl dipendente e rho indipendente, l’attenuazione della trascrizione in presenza ed in assenza di rho è influenzata in maniera significativa. Il mutante B si tradurrà in una struttura a forcina dell’RNA con un loop ridotto di dimensioni (3 coppie di basi, piuttosto che 5 coppie di basi). La dimensione del loop e l'identità del primo misappaiamento nel loop può influire sulla stabilità. Il primo misappaiamento nel loop è identico sia nel wild-type che nel mutante, quindi l'alterazione nelle dimensioni dell’ansa del trascritto da parte di questo mutante è risultato in una leggera diminuzione dell’efficienza della terminazione della trascrizione. Il trascritto di RNA da parte di una C mutata manca della stringa di residui di U a valle dell’ansa che è necessaria per I rhoindipendenti (terminazione intrinseca). Tuttavia, tale sequenza non è richiesta per la terminazione rho-dipendente e l'aggiunta di rho dà l'80% del tasso di terminazionedi tipo selvatico. Questo ci dice che vi è un sito per rho a monte della struttura a forcina. E ci dice anche che rho può contribuire all’80% nel "potere di terminazione" nel trascritto di questo gene wild-type e che la terminazione intrinseca è richiesta, inoltre, per una terminazione completa.
