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Casistica
Recenti Prog Med 2010; 101: 349-354
Granulomatosi di Wegener in fase acuta iniziale:
aspetti clinici e sierologici
Caterina Defendenti1, Giacinto Guercilena2, Angela Freschi1, Anna Maria Croce3, Federica Servida4,
Silvia Russo5, Silvia Grosso1, Margherita Longo1, Maria Francesca Spina6, Antonio Miadonna6,
Fabiola Atzeni7, Piercarlo Sarzi-Puttini7
Riassunto. Sono state analizzate le caratteristiche cliniche
e biochimiche di un caso di granulomatosi di Wegener in
fase acuta iniziale in una giovane donna. I risultati evidenziano multifattorialità. È presente flogosi cronica della mucosa delle vie aeree superiori in cui viene isolato Staphylococcus aureus e si rileva una componente oligoclonale prevalentemente costituita da autoanticorpi anti PR3, indice di
probabile attivazione di un clone B cellulare autoreattivo.
Si ha legame cronologico con il postpartum: la nostra indagine ha escluso la presenza di microchimerismo fetale. Si
suppone che l’ambiente ormonale possa agire da trigger. Il
dosaggio di IL-17 nel siero è risultato negativo.
Summary. Serological and clinical aspects in initial
Wegener’s disease. A case report.
The clinical and biochemical features of an acute and initial
Wegener’s granulomatosis case were analysed in a young
woman. A multifactorial aspects are evident. A chronic inflammation of the superior respiratory tract has been observed. Staphylococcus aureus has been isolated. An oligoclonal component constituted of high levels of anti-PR3 autoantibodies was detected: initial autoreactive B cell clone
activation is probable. The chronological link with postpartum is present: our study excluded foetal microchimerism;
the hormonal state can be a trigger factor. Serical IL-17 was
negative.
Parole chiave. Autoanticorpi anti PR3, cANCA, gammopatia monoclonale, granulomatosi di Wegener, interleuchina 17, vasculite sistemica.
Key words. Wegener’s granulomatosis, cANCA, PR3 autoantibodies, IL-17, systemic vasculitis, oligoclonal gammopathy.
Introduzione
Attualmente, a distanza di cinque anni, la paziente è asintomatica ma non è ancora possibile (se
si escludono le pause previste dal protocollo) la sospensione del trattamento.
Le caratteristiche di questo caso sembrano indicare che l’interessamento della immunità acquisita sia un passo successivo nel corso di una situazione flogostica cronica conseguente al raggiungimento di un livello critico di eccesso di antigene2
e/o di citochine.
In effetti, secondo ipotesi recenti, è probabile
che in seguito ad un fattore attivante venga selezionato un clone cellulare in grado di sfuggire al
controllo fisiologico, con conseguente insorgenza di
malattia autoimmune sistemica. Durante le infezioni3, numerosi autoanticorpi sono prodotti come
risultato di attivazione non specifica di cellule B
autoreattive a bassa affinità. È stato dimostrato
che flogosi croniche possono creare le condizioni
che portano alla differenziazione di cellule B autoreattive e all’innesco di autoimmunità in individui
predisposti. Le lesioni granulomatose4 possono
rappresentare potenziali sedi di produzioni autoanticorpali.
Un caso di granulomatosi di Wegener è stato
diagnosticato in accordo con i criteri di European
Vasculitis Study Group1. I sintomi generali sono insorti in modo improvviso, a tre mesi di distanza dal
parto e in concomitanza della comparsa nel siero di
una componente oligoclonale di tipo G/K. Essi erano costituiti da dolore e tumefazione articolare con
impotenza funzionale e da riacutizzazione di una
flogosi granulomatosa cronica localizzata della mucosa nasale, causa di epistassi ripetute. In questa
fase della malattia non era presente compromissione polmonare o renale. Il livello di autoanticorpi anti-PR3 era molto elevato, pari a 217 UI/ml
(v.n.<7 UI/ml). Anamnesticamente, indagini microbiologiche su tampone nasale avevano portato all’isolamento di Staphylococcus aureus. La terapia,
secondo schemi ormai consolidati, è stata condotta
con metotrexate 12 mg/sett. associato a steroide
partendo da 1 mg/kg. Essa ha comportato una drastica scomparsa della sintomatologia con abbassamento del titolo autoanticorpale in ELISA e negativizzazione della componente oligoclonale.
1Laboratorio Analisi, Ospedale Fatebenefratelli, Milano; 2BSN; 3Servizio di Anatomia Patologica, Ospedale Fatebenefratelli, Milano; 4Fondazione Mattarelli per lo studio delle patologie ematiche, Milano; 5Laboratorio di Biologia molecolare, Istituto Auxologico Italiano, Cusano Milanino; 6Unità di Pneumologia, Ospedale Fatebenefratelli, Milano; 7Unità di Reumatologia, Ospedale
Universitario L. Sacco, Milano.
Pervenuto il 2 ottobre 2009.
350
Recenti Progressi in Medicina, 101 (9), settembre 2010
La correlazione cronologica tra parto e insorgenza acuta dei sintomi è indubbiamente suggestiva in quanto il brusco calo di ormoni, che inizia
in questo periodo, e la produzione di prolattina, sono associati in letteratura ad una recrudescenza di
malattie autoimmuni sistemiche. Molti lavori hanno hanno confermato l’influenza esercitata dall’ambiente ormonale nel corso di malattie come
LES o SS, in cui le modificazioni legate all’età fertile sono in grado di condizionare l’orientamento
Th. In questo articolo sono stati approfonditi alcuni aspetti, come le caratteristiche della componente monoclonale, la possibilità di microchimerismo
fetale con ricerca di cromosoma y su cellule CD34+
isolate (essendo il feto di sesso maschile) e l’eventuale rilievo sierologico di IL-17.
ASPETTI ISTOLOGICI
Le biopsie della mucosa del setto nasale e del turbinato inferiore mostrano vasculite cronica attiva, necrotizzante con reazione istiocitaria prevalentemente a carico dei capillari intramucosi. La valutazione immunoistochimica evidenzia prevalente positività per CD68
(Kp1), marker di derivazione istiocitaria (circa il 75%
della popolazione cellulare) e marcato coinvolgimento
vascolare. Le cellule dell’immunità acquisita sono scarsamente rappresentate in quanto i linfociti CD3+ sono il
15% , i CD20+ il 3% e i CD57 il 5%.
Il quadro osservato è compatibile con la diagnosi di
granulomatosi di Wegener (figura1).
Materiali e metodi
Gli anticorpi Anti- PR3 sono stati identificati in IFI
(Granulocytes Mosaic; Euroimmun,Lubecca) e con due
metodi ELISA (EUROIMMUN, Lubecca) ed ELIA
(PHARMACIA, Svezia). Le catene leggere kappa e lambda degli anticorpi anti PR3 sono state rilevate in ELISA con tecnica quantitativa sandwich (Dako). Per l’immunofissazione è stato utilizzato il kit Sebia (Cedex
Francia). Il test di inibizione è stato condotto incubando
i campioni di siero in esame over night, a temperature
ambiente con quantità scalari di antigene (EPC, Elastin
Products Company, Inc). La purificazione della componente monoclonale è stato fatta utilizzando “ cartridge
system PURE-A Kit ( SIGMA)”. Per la determinazione
quantitativa della interleuchina umana IL17 è stato utilizzato test ELISA con metodica sandwich (Quantikine,
RD systems, Minneapolis).
La separazione di cellule CD34+ nel sangue periferico è stata condotta su gradiente Ficoll-Paque (specific
gravity 1.077 g/ml; Nycomed Pharma AS; Oslo, Norway).
Il campione è stato poi incubato per 30 min. a 4°C con
anticorpi monoclonali diretti contro l’antigene CD34 legati a biglie magnetiche (Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germany) e quindi eluito.
Il metodo PCR utilizza primers AMXY fw:6-FAM 5’ ccc
tgg gct ctg taa aga ata gtg-3’ and AMXY rev 5’-ATC AGA
GCT TAA ACT GGG AAG CTG-3’ con protocollo standard.
2 µl del prodotto PCR sono state immessi in ABI 310 Automated Sequencer e separati con elettroforesi capillare:
il picco a 109 bp riconosce la presenza dell’allele Y.
Risultati
ASPETTI SIEROLOGICI
La paziente presenta reattività autoanticorpale
esclusivamente nei confronti dell’antigene PR3. Il fatto che la malattia fosse in fase iniziale e la presenza di
granulocitosi ha suggerito il dosaggio di IL-17 che però
è risultato al di sotto dei limiti di rilevabilità. Questa
citochina sembra mediare la comunicazione tra il sistema immune e il sistema ematopoietico5,6. L’assenza
di IL17 nel siero della paziente conferma le conclusioni di Lamprecht secondo il quale l’antigene PR3 induce maturazione di cellule dendritiche7 evocando una intensa risposta Th1. Una vigorosa risposta Th1 è stata
vista nella granulomatosi di Wegener8 e nella poliangioite microscopica, mentre la risposta Th2 predomina
nella sindrome di Churg-Strauss.
Figura 1. Infiltrato infiammatorio nella sezione di mucosa nasale
della paziente in esame.
CARATTERISTICHE DELLA FRAZIONE OLIGOCLONALE
a) Comparazione tra elettroforesi basale ed elettroforesi in corso di terapia con prednisone e metotrexate
Si assiste alla progressiva riduzione della componente oligoclonale nell’arco di cinque mesi in seguito a
trattamento immunosoppressore. Essa è concomitante
alla progressiva riduzione dei livelli di autoanticorpi anti PR3 nel siero (figure 2, 3, 4).
Successivamente, la componente non si è più ripresentata, nemmeno in fase di pausa terapeutica accompagnata da rialzo del titolo di autoanticorpi anti PR3.
b) Test di inibizione
b1) Dosaggio Elisa degli autoanticorpi dopo incubazione del siero in esame con quantità scalari di antigene
PR3 . Il comportamento del campione è stato confrontato con quello di altri tre campioni con varia combinazione riguardo l’associazione tra componente oligoclonale e
anticorpi anti PR3. In particolare, oltre al siero della paziente (cm+ e PR3+) si è testato il siero di un paziente
con G-W, privo di componente monoclonale (cm- e PR3+),
quello di un soggetto portatore di mieloma multiplo ma
negativo per autoanticorpi anti PR3(cm+ e PR3-) e , infine, quello di un soggetto sano.
C. Defendenti et al.: Granulomatosi di Wegener in fase acuta iniziale: aspetti clinici e sierologici
Figura 2. Settembre 2004; PR3= 213 U/ml; cm G/K= 0,46 mg/ml
Figura 5. Progressiva riduzione dei livelli di anticorpi anti PR3 nel
siero dopo incubazione con quantità scalari di antigene.
L’aggiunta di antigene PR3 nel siero della paziente
in esame, positivo per anticorpi anti PR3 e portatore di
componente monoclonale, comporta elettroforeticamente una accentuazione ed uno spostamento della componente G/K visibili sul tracciato (figure 6 e 7 alla pagina
seguente). Anche in immunofissazione si ha una intensificazione della banda G/K verosimilmente riferibile alla formazione di un complesso con diversa carica e peso
molecolare rispetto alla componente monoclonale presente nel siero non addizionato con antigene PR3. I campioni di controllo non hanno subìto modificazioni del
tracciato elettroforetico e delle bande di immunofissazione dopo aggiunta di una stessa quantità di antigene
PR3.
Figura 3. Ottobre 2004; PR3= 80 U/ml; cm G/K= 0,23 mg/ml
Figura 4. febbraio 2005; PR3= 7,5 U/ml; cm assente
Aggiungendo quantità scalari di antigene PR3 si assiste, dopo 12 ore di incubazione a 37 °C, alla progressiva riduzione di ab anti PR3 presenti nei due sieri positivi in seguito alla precipitazione di immunocomplessi
(figura 5).
b2) Corsa su gel dopo aggiunta di antigene PR3 nel
siero della paziente in esame (cm+PR3+)
c) Valutazione componente G/K con metodo ELISA
Si è valutata, con metodo ELISA, l’oligoclonalità G/K
degli autoanticorpi anti PR3 presenti nel siero: quelli
eventualmente presenti vengono fissati sul fondo di un
pozzetto contenente l’antigene specifico e vengono poi cimentati con anticorpi di coniglio rispettivamente anti
catene k e anti catene λ coniugati con perossidasi.
Anche in questo caso, come confronto, sono stati valutati contemporaneamente altri tre sieri con combinazioni diverse riguardo la componente monoclonale e gli
autoanticorpi anti PR3 [siero della paziente (cm+ e
PR3+), siero di un paziente affetto da G-W ma privo di
componente monoclonale (cm- e PR3+), siero di un soggetto portatore di mieloma multiplo ma negativo per autoanticorpi anti PR3(cm+ e PR3-) e , infine, siero di un
soggetto sano]. Gli autoanticorpi anti PR3 presenti nel
siero della paziente erano costituiti per l’80% da catene
k (tabella 1 a pagina 353).
d) Purificazione frazionata IgG
Le IgG presenti nel siero sono state purificate tramite passaggio su colonna Pure A. L’eluato finale è stato raccolto in modo frazionato. Il contenuto delle provette è stato testato in Elisa per la determinazione
quantitativa delle IgG anti-PR3. Sugli eluati è stata
contemporaneamente effettuata immunofissazione (figura 8). Le provette di raccolta risultate positive in Elisa per anticorpi anti PR3 presentavano una chiara componente oligoclonale di tipo G/K in immunofissazione.
Il siero delle provette risultate negative per autoanticorpi anti PR3 non avevano componente oligoclonale (figura 9).
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Recenti Progressi in Medicina, 101 (9), settembre 2010
Esclusione
di microchimerismo fetale
Figura 6. Componente monoclonale (cm).
Figura 7. Cm dopo incubazione del siero con
antigene PR3
Concentrazione IgG anti-PR3 nelle provette di raccolta
N°9
N°10
N°11
Provetta 1
Provetta 2
Provetta 3
Provetta 4
Provetta 5
cm G/K
0,0 U/ml
0,0 U/ml
0,0 U/ml
0,0 U/ml
0,0 U/ml
Provetta 6 0,0 U/ml
Provetta 7 0,5 U/ml
Provetta 8 9,9 U/ml cm G/K positiva
Provetta 9 40,2 U/ml cm G/K positiva
Provetta 10 4 4,4U/ml cm G/K positiva
Provetta 11 38,7 U/ml cm G/K positiva
cm G/K
N°6
N°7
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
L’insorgenza dei sintomi
acuti dopo tre mesi dal parto ha indotto ad ipotizzare
che il microchimerismo possa essere coinvolto nella patogenesi di questa malattia
autoimmune9. In effetti,
molti studi confermano che
le cellule fetali possono persistere in circolazione dopo
il parto ed essere causa di
malattie autoimmuni tramite graft-versus-host (GVH)like response10. Per questo
motivo le cellule CD34+ presenti nel sangue della paziente sono state purificate
su colonna11,12 e su di esse è
stata valutata la presenza
di cromosoma y (feto di sesso maschile) con metodo
PCR13. La stampa dell’amplificazione AMXY (figura
10) mostra la presenza del
solo allele femminile nel
sangue materno. Nessun
picco rilevabile si è evidenziato a 109 bp escludendo la
presenza di cellule maschili.
Discussione
N°8
Figura 8. Immunofissazione su purificato IgG raccolto in modo frazionato.
Concentrazione PR3 UI/ml
352
12
N° provetta
Figura 9. Concentrazione di IgG anti PR3 nelle diverse provette della raccolta frazionata.
Si rileva che la componente oligoclonale presente
nel siero della paziente all’esordio della malattia è costituita in buona parte da
autoanticorpi anti PR3 G/K.
Questo dato non è trascurabile se si considerano gli attuali orientamenti sul ruolo
e sul meccanismo delle cellule B nelle malattie autoimmuni14, secondo cui la
combinazione di fattori esogeni ed endogeni possono
alterare i meccanismi di tolleranza del self ed indurre
una attivazione incontrollata del sistema immune con
sviluppo di forme patologiche autoimmuni15. Uno dei
primi autori interessato all’argomento fu Esnault16
che già nel 1990 concludeva
che la positività ANCA è
un’autoreattività
spesso
presente in sieri con frazioni monoclonali IgG.
C. Defendenti et al.: Granulomatosi di Wegener in fase acuta iniziale: aspetti clinici e sierologici
Tabella 1. Valutazione ELISA delle catene K/ λ delle IgG anti PR3
Campione
Quantificazione
ELIA
D.O. IgG totali
ELISA
D.O. anti k
ELISA
D.O. anti lambda
ELISA
Isotipo
elettroforetico
Sintomatologia
cm+ PR3+
213 U/ml
1,379
0,976
0,279
G/K
Granulomatosi
Wegener
cm- PR3+
80 U/ml
2,220
0,852
0,881
-
Granulomatosi
Wegener
cm+ PR3-
0,3 U/ml
0,070
0,043
0,054
G/K
cm- PR3-
0,1 U/ml
0,042
0,026
0,044
-
Mieloma
Asintomatico
realizza un fisiologico stato
iperprolattinemico. Elevate
concentrazioni sieriche di
PRL20 spesso correlano con
anomalie delle risposte immunitarie. Alcuni dati suggeriscono che la PRL promuova risposte immunitarie pro-infiammatorie, con
avvio di processi patofisiologici in stati iperprolattinemici fisiologici.
Conclusioni
In questo studio i dati
più indicativi derivano dalle valutazioni sulla componente proteica. La componente oligoclonale si presenta costituita in massima
parte da autoanticorpi anti
PR3 ed esprime quindi l’attivazione di un clone di celFigura 10. Amplificazione AMXY del caso in esame. Nel grafico sottostante viene riportato lo standard
di controllo positivo per cromosoma Y.
lule B indotta da un antigene molto rappresentato
nelle lesioni granulomatose. Anamnesticamente viene inoltre riferita un’infezione sostenuta da StafiIn corso di terapia immunosoppressiva, la comlococco aureo. Secondo alcuni autori, in seguito a
ponente oligoclonale si è ridotta progressivamenmimetismo molecolare, i peptidi di questo germe
te, fino a non essere più rilevabile. Le pause terapossono indurre autoanticorpi contro la proteinapeutiche erano accompagnate da un immediato
si 3. È stata studiata soprattutto la somiglianza
rialzo del livello di autoanticorpi anti PR3 che avestrutturale che i peptidi dello stafilococco auvano però assunto caratteristiche di policlonalità.
reo21,22 mostrano con proteinasi 3 (PR3) compleLa correlazione temporale con il parto è inoltre
molto stretta. Molte malattie autoimmuni migliomentare: un peptide tradotto da una catena antisenso di DNA codificante per la proteinasi 3.
rano durante la gravidanza per poi subire una riaL’intensa componente granulomatosa del tratto
cutizzazione 2-11 mesi dopo il parto. Lo stato di
respiratorio superiore è espressione di un ruolo non
gravidanza17,18 nelle malattie autoimmuni è caratmarginale della immunità naturale della paziente
terizzato da un incremento della percentuale di
che sembra interagire in modo patologico nei concellule NK (CD56), mentre i livelli di citochine –
fronti di comuni stimoli esterni. La flogosi locale si
ad eccezione di TGF-beta, stimolatore Treg – sono
accompagna allo stimolo policlonale e aspecifico di
estremamente bassi19. Il livello di citochine semcellule B che possono produrre autoanticorpi a basbra essere inversamente proporzionale al livello orsa specificità e affinità, probabilmente diretti conmonale: gli ormoni femminili sierici, molto elevati
tro antigeni diversi molto rappresentati nella sede
durante la gravidanza, drasticamente si riducono
della lesione.
nel post partum. In aggiunta, in questo periodo, si
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354
Recenti Progressi in Medicina, 101 (9), settembre 2010
Secondo le più recenti ipotesi, è possibile che un
fattore trigger sia in grado di indurre la selezione di
cloni cellulari verso la produzione di autoanticorpi
specifici, in grado di sostenere una forma autoimmune sistemica.
Il tentativo di ricercare questo fattore non ha
portato a risultati definitivi. È stato escluso il microchimerismo fetale, una delle ipotesi più suggestive che hanno caratterizzato la ricerca nel campo dell’autoimmunità. Più realistica è l’ipotesi della variazione ormonale dovuta alla condizione di
postparto, ampiamente riportata in letteratura, e
che trova in questo caso un riscontro cronologico.
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Indirizzo per la corrispondenza:
Dott. Caterina Defendenti
Ospedale Fatebenefratelli
Laboratorio Analisi
Servizio di Sierologia e Autoimmunità
Corso di Porta Nuova 23
20133 Milano
E-mail: [email protected]
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