UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI VERONA Corso di Laurea in Biotecnologie Agro-Industriali Dispense di TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI Modulo 1 Prof. Massimo Delledonne Tel. 045-8027962; Email: [email protected] http://www.sci.univr.it/~delledon 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne PLASMIDI, COSMIDI, BACTERIOFAGI, YAC E BAC Vectors derived from plasmids ....................................................................................................................................... 5 Cosmidi......................................................................................................................................................................... 12 Fosmidi ......................................................................................................................................................................... 14 Vettori fagici ................................................................................................................................................................. 16 Fagi filamentosi ........................................................................................................................................................ 17 Fagi di tipo λ............................................................................................................................................................. 18 YAC.............................................................................................................................................................................. 31 BAC e PAC .................................................................................................................................................................. 35 ENZIMI DNA Polimerasi DNA dipendenti ................................................................................................................................ 39 DNA polimerasi I di Escherichia coli ...................................................................................................................... 41 Frammento di Klenow della DNA polimerasi I ........................................................................................................ 41 Taq DNA polimerasi................................................................................................................................................. 42 DNA polimerasi templato indipendenti ........................................................................................................................ 42 Deossinucleotidiltransferasi terminale ...................................................................................................................... 42 DNA polimerasi RNA dipendenti................................................................................................................................. 43 Trascrittasi inversa .................................................................................................................................................... 43 RNA polimerasi DNA dipendenti................................................................................................................................. 44 RNA polimerasi di Escherichia coli ......................................................................................................................... 44 RNA polimerasi dei fagi SP6, T7, T3 ....................................................................................................................... 44 DNA LIGASI ............................................................................................................................................................... 45 DNA ligasi T4 .......................................................................................................................................................... 46 DNA ligasi di Escherichia coli ................................................................................................................................. 46 RNA ligasi .................................................................................................................................................................... 47 RNA ligasi T4 ........................................................................................................................................................... 47 RNA Polimerasi DNA indipendenti ............................................................................................................................. 48 Polimerasi poly(A).................................................................................................................................................... 48 Fosfatasi e chinasi ......................................................................................................................................................... 48 Fosfatasi alcalina ...................................................................................................................................................... 48 T4 polinucleotide chinasi .......................................................................................................................................... 49 Esonucleasi ................................................................................................................................................................... 51 Esonucleasi VII (exo VII) ......................................................................................................................................... 51 Esonucleasi III (exo III) ........................................................................................................................................... 51 Endonucleasi ................................................................................................................................................................. 52 Nucleasi BAL 31 ...................................................................................................................................................... 52 Nucleasi S1 ............................................................................................................................................................... 53 Nucleasi Mung Bean................................................................................................................................................. 53 Deossiribonucleasi I (DNasi I).................................................................................................................................. 54 Ribonucleasi ................................................................................................................................................................. 54 Ribonucleasi A.......................................................................................................................................................... 54 Ribonucleasi H.......................................................................................................................................................... 55 Enzimi di restrizione ..................................................................................................................................................... 55 RESTRIZIONE DEL DNA Reazione di taglio ......................................................................................................................................................... 56 QUANTIFICAZIONE DEL DNA Quantificazione spettrofotometrica del DNA ............................................................................................................... 60 ELETTROFORESI Elettroforesi su gel di agarosio ..................................................................................................................................... 62 Preparazione del gel di agarosio (0.8%) ................................................................................................................... 63 Caricamento e corsa .................................................................................................................................................. 64 Visualizzazione delle bande...................................................................................................................................... 64 Elettroforesi pulsata ...................................................................................................................................................... 65 Escherichia coli Inoculo e crescita dei batteri ......................................................................................................................................... 67 Semina batterica in piastra ............................................................................................................................................ 68 Preparazione delle piastre ......................................................................................................................................... 68 Piastratura (plating) .................................................................................................................................................. 69 Antibiotici ................................................................................................................................................................. 70 MINIPREPARAZIONE DI DNA PLASMIDICO Preparazione di DNA plasmidico tramite lisi alcalina .................................................................................................. 72 2 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne QIAprep Spin Miniprep Kit .......................................................................................................................................... 75 Magic miniprep............................................................................................................................................................. 77 ISOLAMENTO DI DNA GENOMICO DA TESSUTI VEGETALI DNeasy Plant Mini Kit ................................................................................................................................................. 80 Metodo microprep Dellaporta ....................................................................................................................................... 82 Arabidopsis Genomic DNA Microprep Extraction Protocol ........................................................................................ 83 Minipreparazione di DNA da pianta ............................................................................................................................. 84 Estrazione del DNA con CTAB 2X .............................................................................................................................. 85 CTAB Invertito ............................................................................................................................................................. 88 PURIFICAZIONE DEL DNA DA GEL QIAEXII Agarose Gel Extraction................................................................................................................................. 91 Geneclean ..................................................................................................................................................................... 93 PURIFICAZIONE DEL DNA IN SOLUZIONE QIAEXII Protocol for Desalting and Concentrating DNA Solutions ........................................................................... 95 Geneclean for DNA solutions ....................................................................................................................................... 97 Trattamento con CTAB di DNA in soluzione .............................................................................................................. 98 Trattamento con fenolo:cloroformio ............................................................................................................................. 99 Precipitazione del DNA .............................................................................................................................................. 100 Trattamento con RNAsi .............................................................................................................................................. 100 CLONAGGIO Descrizione ................................................................................................................................................................. 101 Fasi del clonaggio ....................................................................................................................................................... 102 Preparazione del frammento ................................................................................................................................... 104 Preparazione del plasmide ricevente ....................................................................................................................... 104 Ligatura................................................................................................................................................................... 107 Esempi di clonaggio ............................................................................................................................................... 110 Preparazione e trasformazione delle cellule competenti ......................................................................................... 115 Screening colorimetrico e controllo cellule ricombinanti ....................................................................................... 118 Protocolli clonaggio .................................................................................................................................................... 119 Purificazione dei plasmidi e quantificazione del DNA ........................................................................................... 119 Taglio con enzimi di restrizione ............................................................................................................................. 119 Preparazione del frammento ................................................................................................................................... 120 Preparazione del plasmide ricevente ....................................................................................................................... 120 Quantificazione del DNA su gel ............................................................................................................................. 121 Ligatura................................................................................................................................................................... 121 Preparazione delle cellule competenti con CaCl2 ................................................................................................... 122 Preparazione di cellule elettrocompetenti ............................................................................................................... 124 Trasformazione mediante shock termico di cellule rese competenti con CaCl2 ..................................................... 125 Trasformazione mediante elettroporazione di cellule elettrocompetenti ................................................................ 127 IBRIDAZIONE MOLECOLARE Southern Blot .............................................................................................................................................................. 129 DOT AND SLOT BLOT ............................................................................................................................................ 132 Northern Blot .............................................................................................................................................................. 133 Marcatura sonde radioattive........................................................................................................................................ 135 Random Priming ..................................................................................................................................................... 136 Ibridazione .................................................................................................................................................................. 136 Ibridazione classica ................................................................................................................................................. 138 Ibridazione con il metodo di Church ...................................................................................................................... 139 Stripping (rimozione della sonda dalla membrana) ................................................................................................ 140 Nucleic Acid Labelling and detection......................................................................................................................... 141 Non-radioactive labelling methods ......................................................................................................................... 141 Choosing a radioactive labelling system................................................................................................................. 153 COMMONLY USED REAGENTS AND EQUIPMENT 3 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne DISCLAIMER Nonostante la continua attività di revisione, questo documento contiene ancora numerosi errori. Esso è stato concepito solamente come supporto all’attività formativa del Modulo I del corso di Tecnologie biomolecolari, e non intende sostituire i testi di riferimento del corso che sono: • Molecular Cloning – a laboratory manual, 3° edizione Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (ISBN 0-87969-577-3) • Ingegneria Genetica – principi e tecniche. Primrose, Twyman e Old, Zanichelli (ISBN 88-0807581-8 • Current Protocols in Molecular Biology (http://meneghetti.univr.it/banche.php) 4 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne PLASMIDI, COSMIDI, BACTERIOFAGI, YAC E BAC Vectors derived from plasmids Plasmids are self-replicating, extrachromosomal DNA molecules found in virtually all bacterial species. In nature, plasmids occur in exuberant profusion, varying in structure, size, mode of replication, number of copies per bacterial cell, ability to propagate in different bacteria, transferability between bacterial species, and perhaps most important, in the traits they carry. Most prokaryotic plasmids are double-stranded circular DNA molecules; however, linear plasmids have been identified in both gram-positive and gram-negative bacteria. The size of plasmids varies widely, from several kilobases to hundreds of kilobases. Replication of plasmids depends on host-cell proteins but also may require plasmid-encoded functions. Plasmid replication may be synchronized with the bacterial cell cycle, resulting in a low number of plasmid molecules per bacterial cell, or independent of the host cell cycle, allowing for the proliferation of hundreds of plasmid copies per cell. Some plasmids freely transfer their DNA across bacterial species, some only transfer their DNA into bacteria of the same species, and some do not transfer their DNA at all. Plasmids carry genes that specify a wide variety of functions including: resistance to antibiotics, resistance to heavy metals, sensitivity to mutagens, sensitivity or resistance to bacteriophages, production of restriction enzymes, production of rare amino acids, production of toxins, determination of virulence, catabolism of complicated organic molecules, ability to form symbiotic relationships, and ability to transfer DNA across kingdoms. Starting in the 1970s, vectors for propagation, manipulation, and delivery of specific DNA sequences were constructed with fragments from naturally occurring plasmids, primarily Escherichia coli plasmids. All plasmid vectors contain three common features: a replicator, a selectable marker, and a cloning site. The replicator is a stretch of DNA that contains the site at which DNA replication begins (the origin of replication or ori), and that also includes genes encoding whatever plasmid-encoded RNAs and proteins are necessary for replication. The selectable marker, necessary for following and maintaining the presence of the plasmid in cells, is usually dominant and is usually a gene encoding resistance to some antibiotic. The cloning site is a restriction endonuclease cleavage site into which foreign DNA can be inserted without interfering with the plasmid's ability to replicate or to confer the selectable phenotype on its host. Over the years, plasmid vectors have increased in sophistication; in addition to these three basic elements many vectors now include features that make them particularly suitable for specific types of experiments. REPLICATORS One of the ways that replicators are classified is based on the number of plasmid molecules maintained per bacterial cell under some set of standard growth conditions, the so-called copy number of the plasmid. This book defines high-copynumber plasmids as those which exist in ≥20 copies per bacterial cell grown in liquid LB medium, and low-copynumber plasmids as those which exist in <20 copies per cell. High-copy-number-plasmids tend to be smaller than lowcopy-number plasmids. They are more commonly used in molecular biological techniques since it is easier to prepare large quantities of pure plasmid DNA from cells that bear them. Low-copy-number plasmids are utilized when it is important to control the gene dosage of a cloned sequence, for example when the DNA sequence or the protein it encodes makes the host organism sick (see Table 1.1). High-copy-number plasmids tend to be under relaxed control of replication. These relaxed plasmids initiate DNA replication in a process controlled by plasmid-encoded functions (see Mechanism of Replication and Copy-Number Control), and replication does not depend on the unstable host replication initiation proteins synthesized at the start of the bacterial cell cycle. Because their replication depends only on the stable host enzymatic replication machinery, the copy number of these plasmids can be greatly increased, or amplified, by treatment of the plasmid-containing cells with protein synthesis inhibitors such as chloramphenicol or spectinomycin. These protein synthesis inhibitors prevent synthesis of the replication-initiation proteins required for chromosomal replication, allowing the replication enzymes to be commandeered for plasmid replication. High-copy-number plasmids usually do not have any mechanism to ensure correct segregation of the plasmids to the daughter cells; they rely on random assortment to partition at least one copy of the plasmid to each daughter. Plasmids carrying the ColE1 and pMB1 replicons are incompatible with one another, but they are fully compatible with those carrying pSC101 and p15A replicons 5 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Table 1.1 Characteristics of Commonly Used Plasmid Replicators Prototype Markers on Replicator plasmid Size (bp) prototype pBR322 4,362 pMB1 pUC vectors ColE1 pMK16 ~4,500 p15A pSC101 F R6K R1 (R1drd-17) RK2 pACYC184 pLG338 pDF41 pRK353 pBEU50 pRK2501 ~4,000 ~7,300 ~12,800 ~11,100 ~10,000 ~11,100 ⎯c Apr, Tetr Apr Kanr, Tetr, ColE1imm Emlr, Tetr Kanr, Tetr TrpE TrpE Apr, Tetr Kanr, Tetr Gal Massimo Delledonne Copya number Low; 15-20 References Bolivar et al., 1977 High ; 500-700 High; >15 Kahn et al., 1979 High; ~15 Low; ~6 Low; 1 to 2 Low; <15 Low at 30°C; high above 35°Cb Low; 2 to 4 Chang et al., 1978 Stoker et al., 1982 Kahn et al., 1979 Kahn et al., 1979 Uhlin et al., 1983 Kahn et al., 1979 Jackson et al., 1972 λ dv λ dvgal ⎯ a Copy numbers are for the prototype plasmid. Plasmid vectors that contain replicators derived from these plasmids may have different copy numbers due to introduction of mutations into the replicator. For example, pUC series (pmB1-derived) has copy numbers of 1000-3000. b Temperature sensitive. c Not known. Low-copy-number plasmids are usually under stringent control. Initiation of replication of these plasmids depends on unstable proteins synthesized at the start of the bacterial cell cycle and thus is synchronized with the replication of the bacterial chromosome. As copy number decreases, random segregation of plasmid copies is not sufficient to ensure that each daughter cell acquires a copy of the plasmid. However, most low-copy-number plasmids carry genes that guarantee their maintenance in the bacterial population. Stabilizing loci that encode a mechanism for postsegregational killing of plasmid-free daughter cells and a system for efficiently resolving plasmid multimers so that they can be appropriately partitioned have been identified. In addition, cis- and trans-acting partitioning loci (par) that are thought to constitute an active mechanism for distribution of plasmid copies to daughter cells have also been identified. MECHANISM OF REPLICATION AND COPY-NUMBER CONTROL While there are many different replicators, the majority of plasmid vectors used in routine recombinant DNA work contain one of the functionally similar replicators derived from plasmids ColE1 or pMB1 (for example, the popular pBluescript series contain a ColE1 origin, and the pUC plasmids are derived from pMB1). The ColE1 replicator is a 600-nucleotide DNA fragment that contains the origin of replication (ori), encodes an RNA primer, and encodes two negative regulators of replication initiation. All enzymatic functions for replication of the plasmid are provided by the bacterial host. Plasmid replication begins with transcription of an RNA primer upstream of the ori (RNAII; see Fig. 1.1) by the host RNA polymerase. RNAII is elongated through and terminated downstream of the ori. Interaction of a specific secondary structure in the nascent RNAII transcript with the DNA template results in formation of a persistent hybrid between RNAII and the DNA template such that RNAII remains paired with the DNA template at the ori. The RNAII transcript is cleaved by RNAseH at the ori sequence. This processed RNAII primer is extended by DNA polymerase I to initiate plasmid replication. Regulation of the proper RNAII secondary structure controls initiation of DNA replication and is responsible for determining the number of plasmid molecules per cell. Both ColE1 and pMB1 plasmids are high-copy-number plasmids, maintained at between 15 and 25 copies per bacterial cell, respectively. The copy number of these plasmids is regulated by an antisense RNA transcript, RNAI, and the protein ROP, the product of the rop gene. RNAI and the ROP protein act in concert to intercept formation of the proper RNAII secondary structure. RNAI is exactly complementary to the 5′ end of the RNAII transcript. RNAI base pairs with the 5′ end of RNAII, preventing the formation of the specific secondary structure necessary for establishment of a persistent hybrid between RNAII and the DNA template that is a prerequisite for maturation of the RNAII primer. ROP protein stabilizes the interaction between the antisense RNAI and the primer RNAII. Mutations that disrupt or destabilize the RNAI/RNAII interaction result in a higher plasmid copy number. For example, the pUC plasmid series have pMB1 replicators that do not contain an intact rop gene, which accounts for a 26 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne fold increase in copy number over plasmids with intact pMB1 replicons. Interestingly, additional mutation(s) in the origin are the main factor in the ultra-high-copy number (1000 to 3000) of this plasmid series (K. Struhl, unpub. observ.) Fig. 1.1 PLASMID INCOMPATIBILITY For experiments that require that more than one plasmid vector be maintained in a bacterial cell at the same time, another critical feature of plasmid replicators is whether or not two plasmid replicators are compatible. Two plasmids are said to be incompatible with one another, and hence belong to the same incompatibility group, if they cannot stably co-exist. Plasmids are generally incompatible if they share any function required for the regulation of plasmid replication. For example, ColE1- and pMB1-derived plasmids are incompatible with one another but are compatible with p15A plasmids. The incompatibility of ColE1 and pMB1 plasmids is a consequence of two facts: first, that plasmid DNA replication of these plasmids is negatively controlled by RNAI which acts in trans on other plasmids with the same primer RNA, and second, that these plasmids lack a mechanism to ensure that each plasmid in a cell replicates once per cell cycle. Therefore, if a cell that contains a pMBI-derived plasmid is subsequently transformed with a ColE1derived plasmid, cells selected to contain the ColE1 plasmid will usually have lost the pMBI plasmid. SELECTABLE MARKERS In order to guarantee that a plasmid vector is taken up by and maintained in bacterial cells, there must be a way to select for plasmid-containing cells. Genes encoding resistance to antibiotics such as ampicillin, tetracycline, kanamycin and chloramphenicol are the most common bacterial selectable markers for plasmid vectors. Typically, cells are transformed with plasmid DNA and then plated out on LB plates that contain the proper antibiotic. Only the bacterial cells containing the plasmid will grow on the selective medium; the antibiotic-resistance phenotype conferred is dominant to the antibiotic-sensitive phenotype of cells that do not possess the plasmid vector. Another dominant selectable marker that is occasionally used is the immunity to infection by phage lambda (lambda repressor). For experiments that involve introduction of plasmid vectors into systems other than bacteria, such as yeast or mammalian cells, it is usually necessary to select for the presence of plasmid DNA in these hosts. Selectable markers for yeast and mammalian systems are generally distinct from those used in E. coli (see Plasmid Vectors for Yeast and 7 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Plasmid Vectors for Expression in Cultured Mammalian Cells). In cases where a vector is needed that will be used in both E. coli and another host, it is necessary for the plasmid vector to carry selectable markers for both hosts. ANTIBIOTICO Tetraciclina Ampicillina Cloramfenicolo Kanamicina neomicina MODALITA’ D’AZIONE RESISTENZA Si lega ad una proteina della subunità 30S Il gene per la resistenza codifica per una proteina del ribosoma inibendone la traslocazione. di 399 aminoacidi associata alla membrana che impedisce l'entrata dell'antibiotico nella cellula. Il blocco all'ingresso richiede tempi brevi e non è influenzato dalla quantità di antibiotico presente. Si lega e inibisce enzimi della membrana Il gene per la resistenza codifica per un enzima batterica coinvolti nella sintesi della parete che è secreto nello spazio periplasmico del cellulare. batterio, dove detossifica la droga idrolizzando l'anello β lattame. È molto usato e sta creando problemi per la comparsa di antibiotico resistenze. Si lega alla subunità ribosomale 50S e Il gene codifica per una proteina citosolica inibisce la sintesi proteica. tetramerica che, in presenza di acetil coenzima A, catalizza la formazione di derivati idrossil acetossi del cloramfenicolo che sono incapaci di legarsi ai ribosomi. L'espressione dell'acetiltrasferasi è sensibile ai cataboliti ed aumenta quando i batteri crescono su una fonte di carbonio diversa dal glucosio. e Sono aminoglicosidi deossistreptamine che Entrambi gli antibiotici sono inattivati da una si legano ai componenti ribosomali e aminoglicoside fosfotrasferasi localizzata nello inibiscono la sintesi proteica. spazio periplasmico. Si ritiene che la fosforilazione interferisca con il trasporto attivo degli antibiotici nella cellula. Le resistenze che si basano sulla degradazione dell’antibiotico (ampicillina, cloramfenicolo, kanamicina, neomicina) richiedono l'accumulo di una quantità sufficiente di proteina e il range di concentrazione di antibiotico consigliato si basa su considerazioni relative al numero di plasmidi presenti e al tempo di incubazione. CLONING SITE Today's plasmid vectors contain a multiple cloning site (MCS) or polylinker cloning region that can include >20 tandemly arranged restriction endonuclease sites. The sites in the polylinker are almost always designed to be unique within the vector sequence so that cutting the vector with a restriction endonuclease in the polylinker and cloning foreign DNA into this site does not disrupt other critical features of the vector. The plethora of sites in the polylinker ensures that the appropriate enzyme sites will be available for cloning most DNA fragments, provides unique reference restriction sites for rapid restriction mapping of the insert, and generally allows for a great deal of flexibility when manipulating the cloned DNA. The sequences that directly flank the polylinker site are often useful for manipulation or analysis of insert DNA. Many polylinker sites are flanked by sequences for which there are commercially available complementary oligonucleotides, for example the M13 reverse, −20, and −40 primers, that can be used for priming polymerase chain reactions (PCR) or DNA sequencing reactions. Such primers are useful tools for amplification or sequencing of any DNA fragment inserted into the polylinker. Some polylinkers are bordered by 8-bp-cutter restriction sites, like Not1. These sites occur infrequently in DNA and thus allow for the easy excision of an intact insert fragment from the plasmid vector. Many plasmid vectors have been developed with bacteriophage⎯SP6, T7, or T3⎯promoters flanking the polylinker cloning sites. These promoters can be used in vitro or in vivo, if the bacteriophage RNA polymerase is also present, to produce large quantities of RNA transcripts from DNA inserted into the polylinker. In order to make it easier to identify plasmids that contain insert DNA, the polylinkers of some vectors have been engineered so that introduction of DNA into the polylinker results in a scorable phenotype. The most common example of this is insertion of the polylinker of many basic cloning vectors, the pUC series for example, into the lacZ gene α fragment. In the appropriate genetic background, production of the lacZ α fragment allows for formation of an active βgalactosidase enzyme which results in the formation of blue colonies on Xgal/IPTG indicator plates. Cloning into these polylinkers prevents production of a functional lacZ α fragment, allowing for rapid identification of plasmids 8 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne containing inserts as white colonies on Xgal/IPTG indicator plates. Vectors have also been developed that allow for direct selection of plasmids containing inserts by location of the polylinker in the ccdB (control of cell death) gene which causes cell death in E. coli. Disruption of the ccdB gene by introduction of an insert into the polylinker allows the cells to survive, and thus only recombinants will grow under conditions where the ccdB gene is expressed. SCELTA DEL PLASMIDE VETTORE Quando si seleziona un vettore plasmidico si considerano le dimensioni, il numero di copie, il polylinker e l'abililità a selezionare i cloni ricombinanti. I differenti tipi di vettori vengono utilizzati in relazione alla funzione desiderata: produrre grandi quantità di DNA, esprimere una proteina di fusione in un batterio, ottenere un ibrido in lievito. pBR322 è un vettore di prima generazione; contiene un replicatore pMB1 e geni codificanti la resistenza all'ampicillina e alla tetracicilina. Il DNA esogeno viene inserito in un sito di restrizione all’interno della sequenza del gene codificante per la resistenza all’ ampicillina, inattivandola. Questa procedura consente alle colonie che portano i plasmidi trasformati di essere identificate: non sono in grado di crescere su un mezzo con l'antibiotico. • • Selezione iniziale con tetraciclina (vengono eliminate tutte le cellule senza plasmide) Si riportano le colonie su una seconda piastra contenente ampicillina (sopravvivono le colonie non ricombinanti: è necessario risalire alla colonia prelevata dalla prima piastra) Risulta tuttavia più pratico e efficace eseguire un doppio passaggio riportando le stesse colonie su un primo terreno contenente ampicillina e su un secondo con tetraciclina. L’ordine con cui disporre i terreni con gli antibiotici va rispettato: si evitano così errori di interpretazione eventualmente dovuti al prelevamento di batteri insufficienti alla crescita dei microrganismi in entrambe le piastre. • in tetraciclina crescono tutte le cellule con plasmide • le colonie che non crescono in ampicillina contengono un plasmide ricombinante 9 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne pUC19 -pUC18 appartengono alla famiglia di plasmidi vettori che esprimono il frammento N-terminale del prodotto genico del gene lacZ e mostrano una α-complementazione in particolari ospiti: le subunità della β galattosidasi, una codificata dal plasmide,una dall’ospite (E. coli), complementano e diventano funzionali. L'enzima agisce su Xgal, molecola incolore che se rotta dalla β galattosidasi rende blu la colonia. L'operone lac è attivato se viene fornito galattosio ma, una volta esaurito il substrato attivante, il gene si spegne non consentendo la colorazione delle colonie dove la β galattosidasi è comunque funzionale: ciò potrebbe portare ad interpretazioni erronee. Si preferisce quindi utilizzare IPTG che attiva l'operone come il galattosio, ma non è degradato dall'attività enzimatica. PUC19-PUC18 contengono un polylinker nella regione α del gene lacZ (si tratta della stessa sequenza ma con orientamento opposto). Se un frammento viene inserito nel polylinker la β galattosidasi risulta non essere più funzionale: le colonie trasformate formano colonie bianche anziché blu. I plasmidi pUC mancano del gene rop che normalmente si trova nell’origine di replicazione e che è implicato nel controllo del numero di copie: pertanto pUC19 e pUC18 sono a alto numero di copie. 10 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne pBluescript M13+,M13- contiene, in aggiunta ad ori, un origine di replicazione f1 di un fago filamentoso inserita in un vettore derivato da un plasmide pUC. Esso contiene inoltre i promotori T7 e T3 (o SP6) del batteriofago ai due lati del polylinker. Questi vettori ibridi, chiamati anche FAGEMIDI, possono essere usati per generare DNA a singolo filamento in vivo, o RNA in vitro, complementare a uno dei due filamenti del DNA estraneo inserito nel polylinker ( + o - a seconda dell' orientamento) I fagemidi si moltiplicano in E. coli come normali plasmidi a doppio filamento finché non viene fornito un fago helper. Dopo l'aggiunta di quest'ultimo, essi ne utilizzano il meccanismo di replicazione ed impacchettano i singoli filamenti di DNA in particelle fagiche. Il fago helper è un mutante che replica in modo poco efficiente il proprio DNA ma fornisce enzimi di replicazione virali e proteine strutturali per la produzione di molecole di DNa da impacchettare negli involucri di rivestimento fagico. Il DNA a singolo filamento purificato da queste particelle può essere utilizzato come stampo per determinare la sequenza nucleotidica di un segmento di DNA per mutagenesi dirette verso nucleotidi, per la sintesi di sonde. 11 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Cosmidi I cosmidi sono plasmidi che portano il sito cos dei batteriofagi λ. Sono stati concepiti per superare il limite dimensionale durante la trasformazione di E. coli mediante shock termico. Si è pensato infatti che plasmidi di grandi dimensioni potevano essere ‘inseriti’ in cellule di E. coli sfruttando il fago λ come vettore. I concatenameri delle molecole cosmidiche funzionano infatti da substrati per l’impaccamento in vitro: hanno la stessa infettività dei fagi λ. Tuttavia, una volta all’interno della cellula, il cosmide non può dirigere la sintesi di nuove particelle fagiche (manca dell’intero corredo genico del fago) e pertanto si replica come un plasmide. I cosmidi sono costituiti da: • un marcatore molecolare (di solito la resistenza all’ampicillina amp) • un’origine di replicazione plasmidica (di solito ColE1) • uno o più siti di restizione unici per il clonaggio • una regione cos (cohesive site): si tratta di estremità complementari a singolo filamento di 12 bp presenti nel cromosoma del batteriofago λ maturo, che sono indispensabili affinchè il DNA venga impaccato all’interno della testa del fago. All’interno della testa dei fagi λ non possono essere impaccate molecole con dimensioni minori del 78% o maggiori del 105% della lunghezza del DNA del fago wild-type, che è di 48 kb. Pertanto la dimensione finale del cosmide deve essere compresa fra 36-51 kb. Il fago contenente il cosmide è in grado di infettare una cellula di E. coli, iniettando il filamento di DNA all’interno del batterio. Una volta inserito, le due estremità coesive e complementari cos vengono legate covalentemente da una ligasi batterica che circolarizza. La molecola circolare risultante contiene una copia completa del vettore cosmide, è in grado di replicare come un plasmide e conferisce resistenza al batterio, consentendo la selezione delle cellule trasformate.Il DNA ricombinante si estrae quindi dalle colonie e non dalle placche. 12 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne VANTAGGI • Capacità di accogliere frammenti di DNA estraneo di dimensioni (31-45 kb) maggiori rispetto a un plasmide. Se si inseriscono cloni minori di 30 kb, non può essere sfruttata la caratteristica cos e il cosmide viene utilizzato come un plasmide. • Capacità del cosmide di replicare in modo autonomo in cellule di E.coli. • Capacità del cromosoma del fago λ di impaccare in vitro. SVANTAGGI Spesso i cosmidi riarrangiano il DNA inserito al loro interno, forse perché il tempo di replicazione (di pBR322) è lungo quasi quanto il tempo di generazione di E. coli. Per ovviare a questo problema si preferisce propagare i cosmidi in cellule meno inclini a riarrangiare il DNA e si usano ori λ e le proteine O e P in modo che la replicazione impieghi solo pochi minuti rendendo le inserzioni di DNA più stabili. Un altro problema molto grave è rappresentato da eventi di ricombinazione omologa fra copie di cosmide presenti nella setssa cellula. Per questo (come nei BAC e negli YAC) si prediligono sistemi di mantenimento di una singola copia per cellula. Cosmidi a singola copia sono i FOSMIDI (vedi sotto). Mentre i fosmidi sono ancora largamente utilizzati, i cosmidi non si usano particamente più. 13 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Fosmidi I geni Par servono a controllare in modo stringente la replicazione (vedi descrizione in BAC). Sia per BAC sia per fosmidi, la singola copia crea problemi in fase di estrazione del DNA a causa della scarsa resa. Per questo oggi sono stati messi a punto sistemi di amplificazione del numero di copie, basati sull’attivazione di una seconda origine di replicazione, impiegata solo per l’estrazione di grandi quantità di DNA. This system uses a cosmid vector that contains two different replication origins. The E. coli F factor partitioning and single copy replication origin (ori), ori2, is responsible for maintaining the cosmid clones as single copy plasmids under noninduced conditions, thereby providing replicational stability of the constructs and avoiding toxicity because of high levels of protein expression. The ori2 of the vector readily replicates the large DNA inserts required for packaging into phage particles. The second origin is the high copy oriV, the function of which depends on the TrfA protein. A trfA gene under the control of a pBAD promoter is integrated on the chromosome of a special host strain (34) and encodes a mutant TrfA that gives higher copy numbers than does wild type TrfA. Therefore, upon addition of arabinose, the mutant TrfA is expressed allowing utilization of oriV and a 40-80-fold increase in cosmid clone copy number thereby facilitating detection of cloned gene products and subsequent DNA manipulations. The phage cos site of the vector allows plasmids with inserts of sufficient size ( 40 kb) to be readily packaged into phage particles either in vitro or in vivo, and thus the cosmids can be very efficiently moved among host strains The CopyControl™ Fosmid Library Production Kit provides an efficient and improved method for constructing a library of cosmid-sized (approximately 40 kb) clones. The CopyControl™ pCC1FOS™ Vector (Figure 1) provided in the kit contains both the E. coli F-factor single-copy origin of replication and the inducible high-copy oriV. CopyControl Fosmid clones are grown at single copy to ensure insert stability and successful cloning of encoded and expressed toxic protein. The CopyControl Fosmid clones can then be induced up to 50 copies per cell. TransforMax™ EPI300™ E. coli, required for induction of the CopyControl Fosmid clones up to 50 copies per cell, are included with the CopyControl Fosmid Library Production Kit. Learn more about the CopyControl cloning process. Figure 1. CopyControl™ Vector map. The CopyControl™ pCC1FOS™ cloning vector for CopyControl Fosmid library production is supplied linearized at its Eco72 I (blunt) site and then dephosphorylated and is ready for cloning end-repaired (blunt end) genomic DNA of approximately 40 kb. The kit utilizes a strategy of cloning blunt-ended DNA fragments generated by random shearing of the DNA, to produce more complete and unbiased genomic libraries than can be obtained by partial restriction endonuclease digests. Genomic DNA is first sheared into approximately 40-kb fragments. The sheared DNA is end-repaired to generate blunt, 5'-phosphorylated ends and then size-selected by and recovered from a low melting-point agarose (LMP agarose) gel. Finally, the size-selected DNA is ligated into the cloning-ready CopyControl pCC1FOS Vector, packaged using ultra-high efficiency MaxPlax™ Lambda Packaging Extracts (>109 pfu/µg DNA), included in the kit, and plated on the supplied TransforMax™ EPI300™ E. coli. 14 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Figure 2. Overview of the process for preparing a fosmid library using the CopyControl™ Fosmid Library Production Kit. Once the library has been prepared, individual clones can be cultured in small volume and induced to multiple-copy number for high yields of high purity DNA for fingerprinting, sequencing, etc. Benefits • Make complete and unbiased CopyControl Fosmid libraries. • CopyControl pCC1FOS Vector is supplied Cloning-Ready—linearized, dephosphorylated, purified, and ready for ligation. • CopyControl Fosmid clones can be induced from single copy up to 50 copies per cell. • Fosmid cloning utilizes high efficiency lambda packaging that eliminates background and false positives. • Construction of a complete fosmid library is much faster and easier than BAC cloning. • No need for partial restriction endonuclease digests or pulse-field gel electrophoresis (PFGE) to prepare the genomic DNA for cloning. Figure 3. CopyControl™ Fosmid clones can be induced up to 50 copies per cell to greatly increase DNA yield. Five randomly chosen CopyControl Fosmid clones were grown in culture in duplicate. One sample of each was induced (+) to multiple-copy number by addition of CopyControl™ Induction Solution. The other sample was an uninduced control (-). DNA was isolated from an equal number of cells of each and analyzed by agarose gel electrophoresis. 15 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Vettori fagici I vettori fagici assumono diverse caratteristiche in relazione al tipo di batteriofago cui appartengono. Si possono distinguere due tipi di fagi • Fagi filamentosi: DNA a singolo filamento impaccato in proteine di rivestimento • Fagi tipo λ: fago del tipo testa-coda Se le cellule infette sono piastrate su un mezzo di agar solido immediatamente dopo l’infezione col fago, la lisi delle cellule può essere visualizzata come placche sullo strato batterico. L’utilizzo del substrato agarizzato (in questo caso chiamato “soft agar” perché la concentrazione di agar è ridotta e la consistenza dell’agar è limitata) serve a limitare la diffusione delle particelle fagiche che altrimenti si sposterebbero su tutta la superficie della piastra mescolandosi fra di loro. Nel caso di un fago litico tipo λ, le placche sono traslucide perché contengono cellule morte (lisate) e particelle fagiche; le placche di un fago filamentoso, tipo M13, sono opache e formate da cellule batteriche che crescono più lentamente perché la replicazione del fago richiede energia e quindi rallenta il meccanismo di divisione cellulare. 16 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Fagi filamentosi CICLO VITALE L’informazione genica del virus è contenuta nel DNA a singolo filamento impaccato in un lungo e sottile virone. Il virus infetta la cellula ospite penetrando attraverso il pilo F; perciò questi fagi infettano solo cellule F+ o Hfr, non cellule F-. Dopo che le proteine del rivestimento sono state rimosse, il ssDNA di infezione, denominato filamento +, è convertito in un doppio filamento circolare detto forma replicativa (RF) o intermedio di replicazione del DNA. Il filamento + viene replicato con il meccanismo del circolo rotante (rolling circle). La progenie a singolo filamento di DNA è impaccata in nuovi rivestimenti e i vironi sono estrusi attraverso l’involucro cellulare , senza uccidere la cellula ospite. Un esempio di fago filamentoso è M13. FAGEMIDI Il DNA a singolo filamento forniva fino a pochi anni fa il substrato ottimale per il sequenziamento del DNA (oggi eseguito mediante impiego della PCR che rende pertanto inutile l’impiego di templato a singolo filamento) ed è necessario per alcuni protocolli di mutagenesi in vitro. Dato che l’impaccamento dei singoli filamenti del DNA nella particella fagica garantisce una accurata purificazione del ssDNA, sono stati costruiti vari vettori di cui i più utili sono i vettori ibridi, chiamati anche fagemidi, che integrano nel DNA plasmidico alcune componenti del genoma fagico (vedi origine di replicazione del fago filamentoso F1 nel plasmide pBluescript). Questi vettori si moltiplicano in E. coli come normali plasmidi a doppio filamento finchè non è fornito un fago helper, un mutante che replica in maniera poco efficiente il proprio DNA, ma fornisce enzimi di replicazione: i fagemidi ne utilizzano il meccanismo di replicazione ed impaccano i singoli filamenti di DNA in nuove particelle fagiche. Le cellule infettate continuano a crescere ed espellono, nel mezzo di coltura, migliaia di particelle di origine virale, ognuna contenente un genoma a ssDNA. Poichè le particelle dei virus sono molto più piccole delle cellule ospiti, i batteri possono essere rimossi per centrifugazione a bassa velocità e le particelle virali possono poi essere raccolte dalla sospensione supernatante con centrifugazione ad alta velocità e, alla fine, le loro molecole di ssDNA possono essere isolate con estrazioni in fenolo-cloroformio. Vantaggi: • La cellula infettata non è portata alla morte dalla liberazione dei fagi: rallenta il metabolismo per soddisfare il bisogno di replicazione del virus ed è comunque in grado di moltiplicarsi consentendo l’amplificazione dell’infezione. 17 3 ottobre 2008 • • Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Il ssDNA purificato da queste particelle può essere utilizzato come templato per determinare la sequenza nucleotidica di un filamento di DNA estraneo, per nucleotide-mutagenesi diretta o per la sintesi di sonde specifiche di DNA. Dato che il genoma virale non è inserito in una struttura preformata, non esistono vincoli per le dimensioni del singolo filamento di DNA che può essere impaccato. Fagi di tipo λ Lambda è un fago temperato. Quando infetta un batterio può seguire due vie alternative di sviluppo: • • Ciclo litico, durante il quale si riproduce e provoca la lisi della cellula ospite, proprio come un fago virulento. Ciclo lisogenico, durante la quale il suo DNA si inserisce nel cromosoma dell’ospite e quindi viene replicato come ogni altro segmento di quel cromosoma. Una volta integrato nella cellula ospite, il cromosoma del fago temperato viene chiamato profago. Nello stadio di lisogenia i geni del profago che codificano i prodotti coinvolti nella via litica, quali gli enzimi coinvolti nella replicazione del DNA del fago, le proteine strutturali richieste per la morfogenesi ed il lisozima che catalizza la lisi cellulare, devono rimanere spenti: il genoma di λ integrato è geneticamente inattivo, tranne per un singolo gene cI che codifica un repressore in grado di mantenere tutti gli altri suoi geni in uno stato silente. Tuttavia, se la repressione viene interrotta, il DNA di λ si può excidere dal cromosoma batterico e dare inizio ad una infezione litica. 18 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne SELECTIONS FOR INSERTED DNA Some phage vectors exploit the fact that λ has a minimum genome size requirement for packaging, so that vector phages that do not contain inserts above a minimum size are never detected. Other phage vectors utilize some genetic means to distinguish between phages that still retain the block of nonessential genes and recombinant phages in which the block of genes has been replaced with foreign DNA. Since the selection for the insert does not depend on the size of the inserted fragment, many of these vectors allow small fragments to be cloned. Size selection. Lambda cannot be packaged into phage heads if its genome is less than 78% or more than 105% of the length of wild-type λ DNA. When a vector is chosen on the basis of size selection, the region dispensable for growth is cut out; the left and right arms of the phage are then purified and ligated to cut foreign DNA under conditions that favor concatemer formation. Those phages whose left and right arms have not been joined to an insert will have cos sites too close together to be packaged into viable phage. The existence of the size requirement for efficient phage packaging makes it impossible to use a single phage vector to clone fragments of all sizes: phages that can accommodate large inserts cannot be packaged if they contain small inserts, and vice versa. spi− selection. red+ gam+ phages do not form plaques on a host lysogenic for the unrelated bacteriophage P2. These phages are said to be spi+ (sensitive to P2 interference). red− gam− phages do form plaques on P2 lysogens, and so are said to be spi− (Zissler et al., 1971). P2 inhibition of red+ gam+ phage growth only occurs if the P2 is wild-type for a gene called old. Commonly used vectors like λ2001 (Karn et al., 1984) and λEMBL3 (Frischauf et al., 1983) contain a fragment with the red+ and gam+ genes. These vectors will not form plaques on a P2 lysogen unless the red+ gam+ fragment is deleted and replaced with a piece of foreign DNA. hfl− selection. The product of the λ cII gene is necessary for infecting phages to synthesize repressor efficiently. The E. coli hflA and hflB genes encode products whose effect is to decrease the stability of the cII gene product (Banuett et al., 1986; Hoyt et al., 1982). When wild-type λ infects an hfl− strain, so much repressor is made that the phage almost always lysogenizes the infected cell, causing it to form either no plaque or an extremely turbid plaque. Vectors like λgt10 contain a restriction site in the cI gene. Insertion of foreign DNA into this site inactivates the cI gene. The vector phage does not form plaques on the hfl− strain, but phages containing inserts instead of the cI gene form clear, normalsized plaques. VETTORI FAGICI La maggior parte dei vettori fagici di clonaggio è stata costruita a partire dal cromosoma del fago λ, di cui è nota la sequenza completa delle 48.502 coppie di nucleotidi del genoma selvatico e la funzione di tutti i suoi geni. Circa due terzi del genoma di λ sono indispensabili per il ciclo litico e il terzo centrale contiene geni che sono richiesti per la lisogenia: la parte centrale può così essere excisa con enzimi di restrizione (DNA facoltativo) e sostituita con DNA estraneo senza alterare la capacità del fago di infettare i batteri e dirigere la sintesi di nuove particelle λ tramite ciclo litico. Le molecole di DNA derivanti possono essere impaccate in vitro nelle teste del fago e le particelle virali possono quindi introdurre le molecole ricombinanti in cellule di E. coli, dove si replicheranno e produrranno cloni delle molecole di DNA ricombinante. Perché avvenga l’infezione è necessaria la presenza di maltosio nel mezzo di coltura: il recettore attraverso cui viene adsorbito il DNA fagico è normalmente usato per il trasporto di maltosio ed è indotto dalla presenza di tale zucchero, mentre viene inibito dal glucosio. 19 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Sono stati sviluppati due tipi di vettori: • • I VETTORI DI SOSTITUZIONE, in cui il DNA facoltativo è contenuto in un frammento di riempimento (stuffer region), fiancheggiato da una coppia di siti di restrizione, che viene rimpiazzato quando il DNA da clonare è legato al vettore. All’interno della testa dei fagi λ non possono essere impaccate molecole con dimensioni minori del 78 % o maggiori del 105% della lunghezza del DNA del fago wild-type. Solitamente la lunghezza media della sequenza è di 48 kb ed è quindi possibile inserire frammenti di DNA fino a raggiungere una dimensione finale compresa fra 36-51 Kb. Sono simpiegati per la preparazione di librerie genomice (DNA) I VETTORI DI INSERZIONE, in cui una parte o tutto il DNA facoltativo è stato rimosso ed è stato introdotto in un sito di restrizione unico per l’inserimento di massimo 9-10 Kb (non esiste limite minimo). Sono impiegato per la preparazione di librerie cDNA. 20 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne FAGI DI SOSTITUZIONE FAGO EMBL 3A E’ un fago di sostituzione: il frammento di DNA estraneo, con estremità compatibili con il braccio destro e sinistro, viene inserito al posto della stuffer region, sequenza non indispensabile per il ciclo litico del virus e che può essere rimossa. In tale regione sono presenti gli stessi tipi di siti di restrizione. La lunghezza del braccio sinistro è di 19.9 Kb mentre il destro è di 8.8 Kb. Affinchè il filamento possa essere impaccato nella testa fagica è necessario inserire una sequenza le cui dimensioni possono variare da 9 Kb a 23 Kb. Se il braccio sinistro e quello destro fossero fusi insieme, senza un frammento centrale, il genoma virale risulterebbe troppo corto per essere impaccato (circa 29 kb): l’utilizzo di tale vettore permette una selezione dei ricombinanti. FAGI DI INSERZIONE FAGO λgt10 È un vettore di inserzione che contiene un singolo sito di restrizione all’interno del gene cI . Il braccio sinistro è lungo 32.7 Kb mentre il braccio destro 10.6 Kb. Il frammento di DNA che è possibile inserire ha una lunghezza massima teorica di 7 Kb ma non presenta un limite minimo in quanto la circolarizzazione di un vettore privo di inserzione produrrebbe comunque un filamento (di circa 43 Kb) con dimensioni sufficienti per essere impaccato. 21 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne La selezione dei vettori ricombinati si basa sulla funzionalità del repressore cI. È opportuno considerare alcune caratteristiche del meccanismo di repressione. L’evoluzione ha portato a favorire l’infezione lisogenica: il fago ha la possibilità di replicarsi all’interno dell’ospite e quindi di propagarsi, la cellula riesce a sopravvivere e moltiplicarsi evitando la lisi. Affinchè la cellula segua la via lisogenica, il prodotto del gene fagico cI, una proteina ben caratterizzata con un peso molecolare di 27 kD, si lega come dimero alle due regioni operatore che controllano la trascrizione dei geni λ coinvolti nel ciclo litico, reprimendone la trascrizione. La cellula ospite favorisce solitamente l’accumulo del repressore. In ceppi di E.coli hfl (high frequency of lysogenization) il prodotto del gene cII del batteriofago λ si accumula in quantità elevata; cII è un regolatore positivo del gene cI: il risultato netto è un incremento nella cellula infetta del repressore codificato da cI. I vettori λgt10 portano il gene cI e pertanto determinano lisogenia con alta efficienza in ceppi di E.coli hfl. Se il gene cI viene inattivato dall’inserzione di DNA estraneo, il batteriofago attiva il ciclo litico. Questo perché nel mutante hfl il prodotto del gene cII del fago λ si accumula a livelli più alti del normale. CII è un regolatore positivo del gene cI, così che l’effetto netto della mutazioen hfl è l’aumento del repressore cI nella cellula infetta. In questo modo, se è presente cI il ciclo litico è bloccato e viene potenziata la crescita lisogenica. A ogni fago vengono sempre associati due ceppi di batteri: • • un ceppo permissivo cioe’ wild type: il fago può attivare il ciclo litico, pertanto questo ceppo viene impiegato per moltiplicare il fago wild type un ceppo non permissivo hfl: il fago wild type non può crescere perché il repressore si accumula. Questo ceppo viene pertanto impiegato nella selezione dei fagi ricombinanti in cui cI e’ interrotto 22 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne FAGO λgt11 Vettori come λgt11 sono stati costruiti non solo per permettere la propagazioni delle sequenze estranee ma anche per consentire la loro espressione in cellule batteriche. λgt11 porta una porzione del gene della β-galattosidasi di E. coli, inclusi gli elementi a monte necessari per la sua espressione. All’interno della porzione codificante carbossi-terminale del gene è presente un sito di restrizione EcoRI, in cui è possibile inserire il DNA estraneo. In appropriati ospiti, il gene chimerico può essere indotto: ne risulta la sintesi di una proteina di fusione, consistente nella porzione ammino-terminale della β-galattosidasi fusa con la sequenza codificata dall’open reading frame a valle. E’ importante quindi che la sequenza codificante per la proteina di interesse sia in frame con la porzione dell’enzima a cui viene unita. Il sistema di identificazione delle cellule trasformate si basa sullo screening bianco-blu dei batteri cresciuti in presenza di X-gal e IPTG. Se il vettore porta il DNA estraneo inserito nella regione che complementa per la β galattosidasi l’enzima risulta non essere più funzionale: le colonie trasformate sono bianche anziché blu. La lunghezza del braccio sinistro è di 19.5 Kb mentre il destro è di 24.2 Kb; la sequenza di DNA che è possibile inserire ha una dimensione massima di 7.2 Kb. Questo vettore viene impiegato per la costruzione di librerie di cDNA poi analizzate mediante screening con anticorpi. In questo modo è possibile identificare geni di cui non si possiedono informazioni ma di cui si ha la proteina corrispondente. Tale metodo è risultato efficace per l’isolamento di molti geni codificanti per proteine di cui non era disponibile alcuna sonda ma di cui si possedeva un anticorpo. È possibile ibridare con un solo anticorpo la libreria a cDNA protando alla localizzazione della proteina antigenica espressa. FAGO λZAP λZAP è un vettore di inserzione fornito di siti multipli di clonaggio all’interno di una sequenza plasmidica, che può essere excisa in vivo e convertita in un vettore plasmidico, pBluescript SK(M13-) mantenuto nelle cellule batteriche e più comodo da maneggiare. Il polycloning site è collocato nella porzione amino-terminale di lacZ. Se il frammento inserito è in-frame con la sequenza di lacZ la proteina di fusione espressa può essere localizzata con l’utilizzo di anticorpi. 23 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Il plasmide vettore è costruito in modo da facilitare il sequenziamento di DNA e RNA e la sintesi di sonde di RNA, utilizzando i promotori fagici T7 e T3 accanto alla regione da clonare. La regione estranea di DNA inserita nel plasmide pBluescript SK(M13-) è excisa in presenza dei fagi helper f1 o M13. La lunghezza del braccio sinistro è di 21.8 Kb mentre il destro è di 18.1 Kb; la sequenza di DNA che è possibile inserire ha una dimensione massima di 10 Kb. Questo fago viene impiegato nella costruzione di librerie di cDNA. LIBRERIE DI DNA GENOMICO E DI cDNA Il primo passo per clonare un gene da un organismo di solito implica la costruzione di una genoteca di DNA, un gruppo di cloni di DNA contenente, nell’insieme, l’intero genoma. Talvolta, singoli cromosomi di un organismo sono isolati con una procedura che li seleziona in base alla dimensione ed al contenuto di DNA. Il DNA dei cromosomi isolati è poi usato per costruire genoteche di DNA di un cromosoma specifico. La diponibilità di tali genoteche rende molto più facile la ricerca di un gene che è noto trovarsi su un particolare cromosoma, in special modo per organismi con genomi grandi, come quello dell’uomo. Oltre al genoma, è possibile rappresentare in librerie il trascrittoma di un organismo, ossia l’insieme delle sequenze di DNA che vengono trascritte in mRNA. Mediante una trascrittasi inversa (enzima codificato da retrovirus a RNA), si sintetizzano molecole di cDNA, cioè di DNA complementare all’RNA. I cDNA possono essere inseriti in vettori plasmidici o del fago λ. Partendo dall’RNA messaggero, i genetisti sono capaci di costruire una libreria di cDNA che contiene solo le regioni codificanti dei geni espressi in un organismo. La disponibilità della sequenza genica priva di introni costituisce un codice di lettura universale, indipendente dai meccanismi specie-specifici di splicing e cioè di maturazione dell’RNA. Fagi di inserzione come EMBL 3A che permettono l’introduzione di frammenti di DNA anche di 10-15 Kb possono essere impiegati nella costruzione di librerie genomiche. Nei vettori di inserzione la dimensione massima della sequenza che è possibile introdurre è circa 7 Kb, ciò rende ancora oggi fagi di inserzione (tipo λgt 10) i sistemi ideali per la costruzione di librerie di cDNA che rappresentano il trascrittoma di un organismo, dato che l’mRNA maturo non supera mediamente le 5-6 Kb. 24 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne What is a We know what a "library" is in real life - a room or building filled with a collection of books. In molecular library? biology we use the term in a slightly different way, to mean a collection of recombinant vectors containing different inserted sequences. You might, for example, clone random genomic DNA or cDNA fragments into a vector, with the hope of identifying a gene you are trying to clone through screening of the library. When random fragments are cloned, the library is sometimes called a "shotgun" approach, because one doesn't really need to aim too carefully to hit the target with a pellet. When a library is designed to contain many possible versions of a sequence, often by synthesis using degenerate oligonucleotides, it is often called a "combinatorial" library. First let us Before we get too involved in discussing the DNA insertions in a library, let us discuss the vectors that hold discuss the the foreign DNA. You could think of this as being the "bindings" and "covers" for the books in a real library vectors that - they carry the information by holding together the pages. can be used - Almost any recombinant vector can be used to make a library, but some are easier to work with than others. for example Phage lambda derivatives are easy to use for genomic and cDNA libraries, because the plaques are a stable lambda reference stock for your clones. When you lift a membrane from the collection of plaques, you always leave some plaques behind that can be picked out and propagated. We have discussed this already for lambda gt11 - the idea that you can grow a "lawn" of bacteria with plaques in it, induce expression of the fusion protein with IPTG, and collect an imprint of the plaques on a circle of nitrocellulose. You could detect your specific phage using an antibody probe (if an expression system) or a DNA probe (by hybridization). For gt11 we'll assume that we've got an antibody probe. Here's how it works. First, you mix the E. coli host and the lambda gt11 library in a tube, wait about 30 minutes for the phage to adsorb to the bacteria, then mix in some molten agar-containing medium (cooled to 45 C), and "plate" the mixture onto a bacterial plate that already has a layer of solidified agar-containing medium. This first layer of agar may contain X-gal and IPTG (although it is usually the case that the IPTG is soaked into the nitrocellulose filter - we'll forget about that so it is easier to show you what happens) After overnight growth the plate might look like this when you hold it up to the light. Plaques are visible, and some of the plaques are blue. As you recall, the blue plaques represent bacteriophage that do not have insertions, so the lacZ gene is uninterrupted. The colorless plaques have insertions into the lacZ gene. If this is a cDNA library, then we expect that each colorless plaque might represent a different inserted cDNA. If we apply a nitrocellulose membrane to this plate, allowing it to soak up the proteins that have been expressed and released from the dying cells, then probe the nitrocellulose with an antibody and detect the antibody binding with a secondary antibody and enzyme-linked detection system, we might see results as shown on the right. Note that it is important to align the nitrocellulose membrane with the plate so you know which end is up! If you have marked the nitrocellulose so that you know its orientation, you can go back to the plate and cut out (punch out) the plaque that generated the positive signal by antibody binding. There will still be some phage in the plaque that can be regrown, although some of the phage are stuck to the nitrocellulose (and lost) and others will have diffused out of the plaque. 25 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Now you have a phage stock that is partially purified. Since the phage diffuse in the plate, you can only expect that your specific phage will be enriched in the population that you cut out. You need to repeat the plating experiment and detection system several times to enrich for the phage that is the right one. Your first attempt at replating might go something like this: Note that a fraction of the plaques on the plate are positive with the antibody, but most are still other things. You then need to pick an isolated "positive" plaque from this second generation plate and try again with a third (and probably fourth) generation plate to increase the level of purity. This is what you eventually hope to see. In this case, every plaque in the sample is detected as a "positive" with the antibody probe. That means that the phage you have picked is now "plaque purified", and all of the phage in the stock are of one kind. It is now a clone. A lambda clone can be grown in large quantities and stored as a purified bacteriophage stock, at a concentration of 109 to 1011 phage per ml. You may add chloroform to the stock to preserve it. You may also preserve the lambda clone as purified lambda DNA, but to infect cells you would need to "package" the DNA into capsids again. What next? You now have a gt11 clone that expresses a fusion protein that reacts or cross-reacts with your antibody probe. It could be a good result, but then again it might not be the protein you are really looking for. You will need to sequence the inserted DNA to see what you've got, and it is often the case that you want to move the inserted DNA to a plasmid vector. If the EcoRI sites are still intact in the gt11 vector, you could isolate the insertion by digesting the purified lambda DNA with EcoRI and isolating the foreign DNA insert on a gel. You could also use the polymerase chain reaction to isolate the insertion, but this might be difficult if the insertion is large (remember that gt11 can clone up to 9 kbp). 26 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne lambda ZAP Lambda gt11 has been around for quite a while now, and there are more elaborate versions called lambda ZAP vectors: Lambda ZAP II vector http://www.stratagene.com/figures/Lambda_ZAPII.gif Note that a polylinker has now been inserted into the lacZ gene - you now have a choice of 10 cloning enzymes! There are also T7 and T3 RNA polymerase promoters surrounding the polylinker, an ampicillin resistance gene, a ColE1 origin, an f1 phage origin of DNA replication and terminator of replication (not shown in map). You can "subclone" the middle of the phage automatically! From what we've discussed so far, you might consider using enzymes that cut the polylinker to release your insert, then use a compatible pair of enzymes to prepare a plasmid vector to receive the fragment. Now there's a way to do it automatically! If you infect male bacteria with both your lambda ZAP II clone and also a filamentous helper phage, the trans-acting proteins in the filamentous phage will cause replication of the central portion of the lambda clone, yielding a single-stranded DNA product that is packaged and secreted in a filamentous phage coat. The plaques therefore have TWO count 'em TWO types of phage: 1. The original lambda ZAP II clone 2. A single-stranded copy of the central region, in a filamentous phage capsid How does this work? Having an f1 origin of replication in a vector makes it sensitive to the replication machinery of bacteriophage f1. You can cause packaging of single-stranded DNAs amplified from the f1 origin, even though there are no other elements of the phage present on the DNA strand. What next? You take the plaque containing these two types of phage and plate them on a bacterial strain that is resistant to phage lambda but sensitive to filamentous phage (i.e. use male bacteria), and don't forget to add ampicillin to the medium. The bacteria will take up the filamentous phage carrying your favorite DNA (the single-stranded central portion of the lambda ZAP II clone), convert it from a single-stranded to a doublestranded molecule, and treat it just like any other plasmid. Since this new plasmid contains the ampicillin resistance gene, the cells maintaining it will survive on the selective medium. This is a case of phage transduction, but it does not lead to further generation of infectious particles. The introduced plasmid contains the f1 origin of replication but no other part of the filamentous phage. There are no longer helper phage around, so the sequence is not packaged and secreted as it was before. It is now simply a stable plasmid, that looks something like this: 27 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne pBluescript II KS plasmid vector http://www.stratagene.com/vectors/cloning/pbluescript2.htm Is there a term that describes this interchange between double-stranded plasmid and packaged singlestranded filamentous phage particles? How about "complete and utter confusion"? Actually there's a better word than that. We call a plasmid that can be turned into a transducing phage (and vice versa) a "phagemid" to indicate that it is a sort of hybrid. Plasmid Plasmids are a bit more problematic, because lifting a membrane from a collection of colonies may strip vectors away the entire colony, leaving you nothing to grow later. One solution is to make an imprint of the live colonies on a piece of autoclaved velvet, then print the colony pattern onto a reference plate, a process called "replica plating," but this is an unpleasant task. Plasmids vectors are generally not used for "expression systems" like gt11, and are typically used for DNA detection only (i.e. using DNA probes to detect a specific clone rather than antibodies). In the diagram below, the plate at left contains a collection of bacterial colonies that are first replicated to velvet and printed on a clean reference plate (starting with step 1, going horizontally to the right). After the plate is replicated, the remaining cells in the colony are adsorbed to a piece of nitrocellulose (step 2), and the colonies are lysed directly onto the nitrocellulose (or nylon). This imprint can then be probed with a DNA probe, just as you might handle a Southern blot, and you may find that one of the colonies corresponds to a positive hybridization result. 28 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Lucky thing that you remembered to replicate the plate before adsorbing the colonies to nitrocellulose - now you have a reference colony you can pick and grow! A second problem with standard laboratory plasmids is that it is difficult to clone large insertions into them, and this is particularly a problem if the library consists of genomic DNA fragments rather than cDNAs. Most plasmids do not grow well if they have large (10 kbp) insertions. While that is similar to the limit for gt10 and gt11, we'll be discussing later, lambda phage that can handle up to 23 kbp of DNA. The problem of "insertion size" and representation in the library may become more clear from the next example. How many different Since a library contains random fragments, you can never be 100% certain that it contains a clone you recombinants desire. must a library have? Here's an example of the problem. Suppose you have a genome of 100 kbp, and you break it into random fragments of about 10 kbp for cloning (of course a real genome would be much larger). If you obtain a library with ten phage in it, would the entire genome be represented? The answer is no! Some of the clones would overlap. Let's try the same problem, substituting umbrellas for DNA clones: Suppose we want to protect a group of movie stars from the rain, while they're walking from their limos to the doors of the Dorothy Chandler Pavillion ( a journey of 100 killibradpitts (kbp) - a new measure of distance). We have 10 umbrellas on hand, each able to cover 1/10th of the distance from the street to the door. If we distribute them randomly, will they cover the entire path and keep the stars dry? 29 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Of course, if we are thinking that umbrellas = clones and sidewalk = genome, then some sequences in the genome will not have been cloned, and will not be represented in your library. That's fine, so long as the sequences that you want to clone are not left out, but we are not always so fortunate. What would happen if we made the library twice as big? Let's go back to the Academy Awards, and see how we fare with twice the coverage: As you can see, we got closer to complete coverage, but still have some unprotected areas. To be precise, only 86 killibradpitts of sidewalk are covered and 14 are uncovered. With our analogy of clones, the uncovered regions represent uncloned sequences in the genome. The way we can calculate what's missing is pretty easy -- it's based on the Poisson distribution. If we have one "covering" of the genome (as in the ten clone example) the chance of a sequence being cloned is (11/exp(1)) or about 0.63 (or 63%), where exp(x) = the base of the natural logarithm e to the x power, . If we have two "coverings" of the genome (as in the twenty clone example) the chance of a sequence being cloned is (1- 1/exp(2)) or about 0.86 (or 86%), where exp(2) means the square of e. The pattern continues as your library contains more independent clones. With ten "coverings", the chances reach 0.99995 (or 99.995%), but you can see that you never reach absolute certainty of cloning any particular sequence. 30 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne YAC La dimensione degli inserti genomici che sono portati in vettori tradizionali è limitata a 20-25 Kb per il fago λ e 40-45 Kb per i cosmidi. Questi vettori sono quindi di scarsa utilità per la preparazione di llibrerie genomiche. Il cromosoma artificiale di lievito, yeast artificial chromosome (YAC), è portato come cromosoma sovrannumerario in Saccharomyces cerevisiae, può contenere fino a 2 megabasi. I primi YAC sono stati costruiti dopo che lo studio dei cromosomi naturali aveva mostrato che, oltre a contenere geni, ognuno di essi presenta tre componenti importanti: • centromero: consente una corretta distribuzione dei cromosomi tra le cellule figlie durante la divisione cellulare • telomeri: strutture alla fine del cromosoma necessarie per una corretta replicazione e per impedire la perdita di basi alle estremità. • ARS (sequenze replicantesi autonomamente): origini di replicazione da dove inizia la sintesi di nuovo DNA quando il cromosoma si divide. In uno YAC, le sequenze di DNA che rappresentano queste componenti del cromosoma sono associate ad uno o più marcatori di selezione ed almeno un sito di restrizione nel quale è inserito il nuovo DNA. I vettori usati contengono tutte le informazioni necessarie in un plasmide che può replicarsi in Escherichia coli: • ARS • CEN4: sequenza di DNA della regione del centromero del cromosoma 4 • TEL: sequenze responsabili della formazione in vivo dei telomeri. • URA3, TRP1: marcatori di selezione • SUP4: marcatore di selezione in cui il DNA esogeno è inserito durante l'esperimento di clonaggio. 31 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Il vettore è tagliato da enzimi di restrizione (BamHI e SnaBI) in 3 frammenti: il braccio sinistro che include il centromero e un marcatore di selezione (TRP1), il braccio destro con l'altro marcatore (URA3) e la regione tra le due sequenze TEL, che viene rimossa in un plasmide circolare. Le due braccia sono trattate con fosfatasi alcalina, per impedire il riassemblaggio, e fra di loro è inserito il DNA esogeno. La trasformazione con i protoplasti permette l'inserimento del vettore in S. cerevisiae. Il ceppo di lievito che viene usato è un doppio mutante auxotrofo, trp-ura- (richiede triptofano e uracile come nutrienti), che sarà convertito a trp+ura+ dai due marker sul cromosoma artificiale. I trasformanti sono quindi selezionati piastrandoli su un terreno minimo, su cui solo le cellule contenenti cromosomi artificiali correttamente costruiti sono in grado di crescere. Ogni cellula trasformata con un cromosoma anomalo, contenente 2 braccia destre o 2 braccia sinistre, non è vitale perché uno dei marcatori è assente. La presenza del DNA inserito nel vettore può essere controllata dall'inattivazione di SUP4 ,dovuta ad inserzione, tramite un semplice test: nei ceppi ade2-ochre, le cellule che esprimono il soppressore SUP4 formano colonie bianche. Pertanto, le colonie rosse sono ricombinanti, le colonie bianche no.La presenza di URA3 e TRP1 fa si che il lievito selezionato porti un cromosoma artificiale dotato di entrambe le braccia, evitando cosi’ l’analisi di lieviti dotati di strutture instabili che potrebbero formarsi per esempio in presenza di uno YAC costituito da 2 o nessun centromero (2 braccia destre oppure sinistre) APPLICAZIONI I vettori YAC vengono utilizzati per il clonaggio posizionale (isolamento di un clone di un gene o di un'altra sequenza di DNA sulla base della sua posizione di mappa nel genoma) tramite chromosome walking. 32 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Il chromosome walking consiste nell’individuazione del gene di interesse mediante il percorso della distanza che separa il gene da uno o piu’ marcatori molecolari associati: -scelta di un marcatore molecolare prossimo al gene di interesse (è necessario conoscere la distanza in basi tra i due siti) -digestione parziale con endonucleasi di restrizione per ottenere frammenti di DNA parzialmente sovrapposti - costituzione della libreria (i cloni sono legati a vettori YAC e trasferiti a cellule riceventi per creare una libreria di DNA genomico) -ibridazione (un'estremità del clone prossimo al marcatore viene usata per preparare una sonda di DNA, che è poi utilizzata in esperimenti d'ibridazione per trovare un clone sovrapposto Il DNA di questo secondo clone viene purificato e la sua estremità più lontana è usata per preparare una seconda sonda di DNA, a sua volta impiegata per trovare un clone sovrapposto e così via) -ripetizione della procedura Ripetendo queste fasi diverse volte ed isolando una serie di cloni genomici sovrapposti, si percorre la distanza necessaria fino al gene d'interesse. 33 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne SVANTAGGI DEGLI YAC • • non contiguità: un frammento con un sito di restrizione non tagliato può derivare da una digestione incompleta o dall’unione casuale di due frammenti di DNA lontani fra di loro o addirittura appartenenti a cromosomi diversi. Questo fenomeno potrebbe portare ad oltrepassare il punto d'arrivo, a camminare nella direzione opposta o addirittura a camminare su un altro cromosoma. Il metodo più affidabile per verificare la mancanza di contiguità consiste nell'isolare un piccolo frammento da ognuna delle estremità dell'inserto, determinare il cromosoma d'origine e se condivide sequenze con YAC sovrapposti derivati dalla stessa regione cromosomica. Difficoltà di manipolazione dei cromosomi 34 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne BAC e PAC I sistemi BAC (cromosomi batterici artificiali) e PAC (cromosomi batterici derivati da P1) sono basati su Escherichia coli e sul fattore F plasmidico che mantiene pari a 1 il numero di copie del BAC nella cellula, in modo da massimizzare la stabilità della molecola (no ricombinazioni che sarebbero possibili se ci fossero più copie dello stesso BAC). Questi vettori sono capaci di mantenere frammenti di DNA maggiori di 300 kb con un elevato grado di stabilità anche dopo cento generazioni di crescita. Grazie all'efficienza di clonaggio, alla facilità di manipolazione e al mantenimento stabile del DNA clonato, il sistema BAC rappresenta oggi il sistema più utilizzato per la costruzione di librerie di genomi complessi. Il vettore BAC è costituito da: • geni oriS e repE (Mediano le replicazione unidirezionale del fattore F) • geni parA e parB (Mantengono il numero di copie del fattore ad un basso livello (1 copia) .Un alto numero di copie potrebbe causare problemi di instabilità degli inserti per delezioni e riarrangiamenti del DNA clonato a causa di eventi di ricombinazione omologa) • gene per la resistenza ad un antibiotico • sito di clonaggio: È fiancheggiato dai promotori T7 e SP6 che generano sonde di DNA per il chromosome walking e per il sequenziamento d'inserti di DNA. cosN e loxP sono siti di taglio specifici per terminasi del batteriofago λ e consentono la formazione di estremità che possono essere usate, nelle mappe di restrizione, per riarrangiare i cloni. I cloni ricombinanti sono selezionati mediante colorazione bianco/blu. pBACe3,6 e i vettori PAC (cromosomi artificiali derivati dal fago P1) possiedono un altro sistema di selezione. Essi portano il replicone del fattore F, il gene per la resistenza ad antibiotici (cloramfenicolo per pBACe3,6, kanamicina per PAC) e un pUC link, fiancheggiato da siti di clonaggio, all'interno del gene sacB. Il pUC link, rimosso da enzimi di restrizione per inserire il DNA esogeno, è utilizzato per selezionare le cellule trasformate. Il prodotto genico di sacB, una levansaccarasi, produce metaboliti tossici da saccarosio. I cloni ricombinanti, in cui il DNA inserito sostituisce le sequenze pUC link, possono crescere in piastre di agar con antibiotico e saccarosio perché il gene sacB non può essere espresso. I BAC vengono trasferiti a E. coli mediante elettroporazione 35 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Vettori BAC disponibili Name Cloning sites Recombinant selection pBAC108L (6.7 kb) HindIII, BamHI no pBeloBAC11 (7.4 kb) HindIII, BamHI, SphI lacZ pECSBAC4 (9.3 kb) EcoRI, HindIII, BamHI lacZ BIBAC2 (23.5 kb) BamHI sacBII Plant Transformation via Agrobacterium pBACwich (11 kb) HindIII, BamHI, SphI lacZ Plant Transformation via Site-Specific Recombination pBACe3.6 (11.5 kb) BamHI, SacI, SacII, MluI, EcoRI, AvaIII sacBII High copy number is available pClasper (9.7 kb) homologous recombination in yeast LEU2 Yeast and bacteria shuttle vector Features The Number of Clones Required for a 99% Probability of Having any DNA Sequence Represented in a Genomic Library. Common name Scientific name Genome size Mb/1C Insert size 100 kb Insert size 150 kb Apple Malus x domestica 769 3.5 X 10^4 2.4 X 10^4 Arabidopsis Arabidopsis thaliana 100 4.6 X 10^3 3.1 X 10^3 Banana Musa sp. 873 4.0 X 10^4 2.7 X 10^4 Barley Hordeum vulgare 4873 2.2 X 10^5 1.5 X 10^5 Canola Brassica napus 1182 5.4 X 10^4 3.2 X 10^4 Cassava Manihot esculenta 760 3.5 X 10^4 2.3 X 10^4 Common bean Phaseolus vulgaris 637 2.9 X 10^4 2.0 X 10^4 Cotton Gossypium hirsutum 2246 1.0 X 10^5 6.9 X 10^4 Lettuce Lactuca sativa 2639 1.2 X 10^5 8.1 X 10^4 36 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Maize Zea mays 2504 1.2 X 10^5 7.7 X 10^4 Oat Avena sativa 11,315 5.2 X 10^5 3.5 X 10^5 Onion Allium cepa 15,290 7.0 X 10^5 4.7 X 10^5 Orange Citrus sinensis 382 1.8 X 10^4 1.2 X 10^4 Pepper Capsicum annuum 2702 1.2 X 10^5 9.4 X 10^4 Rice Oriyza sativa ssp. indica & japonica 431 2.0 X 10^4 1.3 X 10^4 Sorghum Sorghum bicolor 760 3.5 X 10^4 2.3 X 10^4 Soybean Glycine max 1115 5.1 X 10^4 3.4 X 10^4 Sugarbeet Beta vulgaris ssp. esculenta 758 3.5 X 10^4 2.3 X 10^4 Sugarcane Saccharum sp. 3000 1.4 X 10^5 9.2 X 10^4 Tobacco Nicotiana tabacum 4434 2.0 X 10^5 1.4 X 10^5 Tomato Lycopersicon esculentum 953 4.4 X 10^4 2.9 X 10^4 Wheat Triticum aestivum 15,966 7.4 X 10^5 4.9 X 10^5 Comparazione fra YAC and BAC Cloning System Features YAC BAC Configuration Linear Circular Host Yeast Bacteria Copy Number / Cell 1 1-2 Cloning Capacity Unlimited up-to 350 kb Transformation Spheroplast (10^7 T/ug) Electroporation (10^10 T/ug) Chimerism up to 40% None to low DNA Isolation Pulsed-field-gel-electrophoresis Gel Isolation Standard Plasmid Miniprep Insert Stability Unstable Stable 37 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne CONFRONTO TRA VETTORI Per illustrare le potenzialità di un chromosome walking con BAC, YAC e cosmidi , è mostrato il numero di cloni richiesti per percorrere 1000 Kb, assumendo il 50 % di sovrapposizione per ogni frammento: Se si usasse una libreria cosmidica con inserti di 50 Kb, sarebbero richiesti 39 step e la probabilità di completare il clonaggio sarebbe nulla. Le librerie BAC, con inserti di 150 Kb, richiederebbero 13 step con una probabilità del 90%. La libreria YAC avrebbe bisogno di soli 3 step con il 99 % di possibilità di successo. Tuttavia il sistema BAC presenta alcuni vantaggi rispetto a YAC: • l'elettroporazione, con cui i cromosomi artificiali vengono trasferiti in E. coli, è 10-100 volte più efficiente della trasformazione con sferoplasti di lievito e riduce le quantità di DNA necessarie per la costruzione di una libreria. • mentre gli inserti YAC sono lineari, quelli BAC sono plasmidi circolari superavvolti che possono essere facilmente manipolati e isolati con rotture minime. • sono più stabili. 38 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne ENZIMI DNA Polimerasi DNA dipendenti Tutte le DNA polimerasi aggiungono deossiribonucleotidi al terminale 3’ di una molecola primer di DNA a doppia elica. La sintesi avanza esclusivamente in direzione 5’Æ 3’ rispetto al filamento sintetizzato. Ogni nucleotide che viene incorporato durante la polimerizzazione è complementare al suo opposto sul templato (dA con dT, dC con dG). La reazione di sintesi richiede i quattro deossiribonucleosidi trifosfato (dNTPs) e ioni magnesio. Molte DNA polimerasi hanno una esonucleasi 3’Æ5’ inerentemente associata con l’attività polimerasica. L’attività esonucleasica 3’ Æ 5’ rimuove un singolo nucleotide alla volta rilasciando un nucleoside 5’ monofosfato. In assenza di dNTPs, questa attività di degradazione sarà catalizzata a partire da un idrossile terminale 3’ libero sia di un singolo che di un doppio filamento di DNA. In presenza di dNTPs, l’attività esonucleasica su un filamento a doppia elica di DNA è inibita dall’attività polimerasica. Durante la sintesi del DNA, l’attività esonucleasica realizza la correzione rimuovendo i nucleotidi incorporati errati. Oltre all’azione esonucleasica 3’ Æ 5’, molte DNA polimerasi (per esempio E. coli DNA polimerasi I) hanno anche un’attività esonucleasica 5’ Æ 3’. Questa attività esonucleasica degrada la doppia elica di DNA a partire da un terminale idrossile 5’ libero. 39 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne L’attività esonucleasica 5’Æ3’ rimuove da uno a svariati nucleotidi alla volta, liberando prevalentemente nucleosidi fosfato 5’, ma anche oligonucleotidi composti anche da più di 10 nucleotidi. L’attività esonucleasica 5’Æ 3’ della DNA polimerasi I di E. coli permette di iniziare la sintesi da nick nella doppia elica del DNA. L’attività esonucleasica 5’Æ 3’ degrada il DNA davanti alla sintesi della polimerasi, ed ha come risultato lo spostamento del nick sul DNA. Questa reazione, conosciuta come nick translation, è importante per uniformare la marcatura della doppia elica del DNA. L’attività esonucleasica 5’ Æ 3’ della DNA polimerasi I di E. coli, che è localizzata all’N-terminale della molecola, può essere rimossa sia da un trattamento con proteasi o per delezione della parte del gene interessato. La risultante DNA polimerasi, che mantiene l’attività esonucleasica 3’ Æ 5’, è conosciuta come il frammento grande della DNA polimerasi I di E. coli, o come il frammento di Klenow. Un’importante proprietà delle DNA polimerasi è la loro processività, cioè l’abilità di una polimerasi di incorporare nucleotidi continuamente su un primer donatore senza dissociarsi dal primer templato . La maggior parte delle DNA polimerasi (es. DNA polimerasi I di E. coli, il frammento Klenow, la DNA polimerasi T4) hanno bassa processività; si dissociano dal primer templato dopo aver incorporato meno di 10 nucleotidi. In contrapposizione, la DNA polimerasi 40 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne T7 è altamente processiva; può incorporare centinaia di nucleotidi da un primer donatore senza dissociarsi dal primer templato. Questa è una proprietà utile se si stanno sintetizzando lunghi tratti di DNA. Proprietà delle DNA Polimerasi: Enzimi Esonucleasi 3’Æ 5’ DNA Polimerasi di Bassa E. coli Frammento Klenow di Esonucleasi 5’ Æ 3’ Velocità di Processività polimerizzazione Presente Intermedia Bassa Intermedia Bassa Bassa Intermedia Assente Bassa Assente Trascrittasi inversa Assente DNA T4 polimerasi Alta Assente Intermedia Bassa DNA polimerasi T7 nativa Alta Assente Veloce Alta Assente Veloce Alta Assente Veloce Alta Presente Veloce Alta DNA Polimerasi T7 geneticamente Bassa modificata DNA polimerasi T7 geneticamente Assente modificata Taq DNA Assente polimerasi DNA polimerasi I di Escherichia coli L’enzima è il prodotto del gene polA di E. coli. Il gene polA è stato clonato nel batteriofago lambda, e l’enzima è sovraprodotto dopo trattamento termico che attiva il ciclo litico del fago, mantenuto fino a quel momento nello stadio lisogenico. La DNA polimerasi I è un singolo polipeptide con peso molecolare di 109,000. Oltre a questa attività polimerasica DNA dipendente, essa ha anche un’attività esonucleasica 3’Æ 5’ e un’attività esonucleasica 5’Æ 3’. L’attività esonucleasica è molto meno attiva rispetto a quella della DNA polimerasi T4 o T7. Altre applicazioni della DNA polimerasi I di E. coli. 1. Marcare i terminali 3’ delle molecole di DNA. Questa procedura è generalmente realizzata con il frammento di Klenow della DNA polimerasi I di E. coli. 2. Riparare i terminali 3’ o 5’ sporgenti (protuberanze) per creare terminali piatti. Questa procedura è generalmente realizzata con il frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli. Per riparare i terminali 3’ sporgenti è usata preferibilmente la DNA polimerasi T4 perché la sua attività esonucleasica 3’Æ 5’ è più attiva. Frammento di Klenow della DNA polimerasi I Il frammento di Klenow, con peso molecolare di 76,000 , è rappresentato dal 70% del C-terminale della DNA polimerasi I di I. Esso conserva l’attività esonucleasica 3’Æ 5’ e l’attività polimerasica della DNA polimerasi I, ma manca dell’attività esonucleasica 5’Æ 3’. 41 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Originariamente il frammento di Klenow fu generato da digestione proteolitica della DNA polimerasi I di E. coli. Oggi esso è prodotto, tramite cloni, direttamente dal gene per la DNA polimerasi I modificato per cancellare i 323 residui amminoacidici che compongono l’N-terminale della polimerasi. Altre applicazioni del frammento di Klenow 1. Sequenziamento del DNA con il metodo dei dideossi. 2. Sintesi del secondo filamento per il clonaggio del cDNA 3. Estensione dei primer oligonucleotidici sul templato a singolo filamento. Alcune specifiche applicazioni includono il sequenziamento del DNA con il metodo dei dideossi, sintesi di sonde per l’ibridazione, e mutagenesi in vitro. 4. Convertire oligonucleotidi a singolo filamento in DNA a doppio filamento Taq DNA polimerasi La Taq DNA polimerasi nativa fu isolata da un microrganismo termofilo, il Thermus aquaticus. L’enzima ha una massa molecolare di 94 kDa. Ha una temperatura ottimale di polimerizzazione di 75-80°C e non sembra che abbia nessuna attività esonucleasica 3’Æ 5’. L’enzima è costitutito da una singola catena polipeptidica con elevato numero di turnover ed elevata processività. Applicazioni 1. La Taq polimerasi è attiva in un largo range di temperature e ha una elevata temperatura ottimale di polimerizzazione che la rende ideale per essere utilizzata nelle reazioni a catena della polimerasi o PCR. Le elevate temperature permettono più specifici appaiamenti dei primer oligonucleotidici, questo incrementa l’efficienza e la specificità e quindi la sensibilità della PCR. Il fatto che i primer oligonucleotidici resistano a ripetuti cicli, dalla temperatura di annealing usata per la PCR fino alla temperatura richiesta per separare i filamenti, presenta il vantaggio di aggiungere l’enzima una sola volta al campione precedentemente all’avvio dei cicli di amplificazione. La Taq polimerasi ha un elevato numero di turn over, alta processività, e la capacità di usare analoghi dei dNTP ( deossinucleosidi trifosfato) quali inosina, la rendono un enzima eccellente per il sequenziamento del DNA. Queste qualità associate con la sua elevata temperatura d’esercizio permettono il sequenziamento di modelli che presentano strutture forti strutture secondarie a basse temperature ovviando all’uso dei convenzionali enzimi per il sequenziamento. DNA polimerasi templato indipendenti Deossinucleotidiltransferasi terminale La terminal transferasi, purificata la prima volta dal timo di vitello, catalizza l’incorporazione di deossinucleotidi al terminale idrossilico 3’ del DNA accompagnato dal rilascio di fosfato inorganico. 42 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Il templato non è richiesto e non verrà perciò copiato. Sono necessari cationi bivalenti, il tipo di nucleotide che verrà incorporato dipenderà dal tipo di ione bivalente utilizzato.Come primer si è soliti usare un DNA a singolo filamento, rispetto ad uno a doppio filamento, questo perché l’estensione è più efficiente quando il terminale 3’ è sporgente. Tuttavia, in presenza di Co2+, la transferasi terminale processerà qualsiasi terminale 3’(sporgente, piatto o accorciato) e quindi si avrà un’efficienza non uniforme. La presenza di Co2+ può anche permettere alla transferasi terminale di catalizzare la limitata polimerizzazione di RNA DNA polimerasi RNA dipendenti Trascrittasi inversa Le “trascrittasi inverse” sono enzimi che derivano dai retrovirus come l’AMV (avian myeloblastosis virus) o il MMLV (Moloney murine leukemia virus) che le utilizzano per sintetizzare copie di DNA a partire dai loro genomi a Rna. L’enzima AMV viene purificato a partire dai virus AMV isolati, mentre l’enzima MMLV viene purificato grazie alla produzione in E.coli che contiene il gene clonato. Le trascrittasi inverse di AMV e MMLV sono enzimi multifunzionali, ma esse sono principalmente utilizzate come “DNA polimerasi dipendenti da RNA”. In particolare dei deossioligonucleotidi (una sequenza specifica oppure una collezione di sequenze random di DNA) vengono impegati come primer sui templati di RNA (di solito mRNA) per l’ allungamento. Il DNA sintetizzato a partire dal templato-RNA viene chiamato cDNA. La trascrittasi inversa possiede anche un’attività di “DNA polimerasi DNA dipendente”. L’incorporazione dei dNTPs è molto lenta (all’ incirca vengono incorporati 5 nucleotidi al secondo) quasi 100 volte più lenta della DNA polimerasi del batteriofago T7. La DNA polimerasi della trascrittasi inversa manca dell’attività esonucleasica in direzione 3’ → 5’. Una terza attività della trascrittasi inversa degrada RNA in un ibrido RNA:DNA Questa cosiddetta “attività RNasi H” è un’ esonucleasi che agisce processualmente da entrambe le estremità 5’ e 3’. Questa attività è utile per distruggere in modo selettivo parti di una molecola di RNA alla quale molecole di DNA (normalmente sequenze specifiche di oligonucleotidi) sono state ibridizzate. 43 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne RNA polimerasi DNA dipendenti Ci sono due tipi di “RNA polimerasi dipendenti da DNA” comunemente usate per lo studio degli acidi nucleici. Una classe è rappresentata dall’ RNA polimerasi di E. coli. Questo è un enzima grande e con molte subunità che riconosce due sequenze di DNA, gli elementi –10 e –35, all’ interno di una grande regione-promotore (circa 40 bp). L’ RNA polimerasi di E .coli è stata l’RNA polimerasi DNA dipendente utilizzata in origine per la sintesi dei trascritti in vitro. Tuttavia il suo impiego comporta diversi problemi. In vitro essa termina prematuramente e di conseguenza sono difficili da ottenere trascritti sopra le 500 basi. Inoltre essa possiede una specificità per la sequenza promotore relativamente bassa; i trascritti di frequente iniziano da sequenze diverse, come le estremità 5’ dei templati. Più recentemente è divenuta disponibile un’altra classe di RNA polimerasi DNA dipendenti: quella composta dalle RNA polimerasi dei Batteriofagi T7, T3 e SP6, che sono codificate dai membri delle relative famiglie di batteriofagi. Ciascun enzima è formato da una singola subunità che riconosce specifiche sequenze-promotore (20 bp). Ciascuno comincia la trascrizione specificamente ed in modo esclusivo dalla propria sequenza-promotore. L’ RNA polimerasi fagica possiede un maggior numero di vantaggi rispetto alla RNA polimerasi di E. coli per la sintesi di specifici trascritti ad alto livello. Innanzitutto essi sono enzimi estremamente processivi; trascritti di migliaia di basi in lunghezza sono prontamente ottenuti senza che l’ enzima si dissoci dal templato. In secondo luogo la trascrizione è sia rapida che estesa; da 2 μg di DNA templato possono essere generati in trenta minuti 60 μg di trascritti specifici. Inoltre l’inizio è estremamente specifico nei confronti della sola sequenza promotore. Questo permette la produzione di sonde radioattive a RNA che sono filamento specifiche. Infine le RNA polimerasi dei fagi T7 e T3 sono state purificate da cellule che hanno sovraespresso i relativi geni. Ciò ha come risultato preparazioni che contengono l’ enzima omogeneo le quali sono poco costose ed hanno attività estremamente specifiche RNA polimerasi di Escherichia coli L’oloenzima di E. coli possiede 5 subunità (struttura α2ββ’o) ed un totale peso molecolare di circa 450,000. Esso trascrive un DNA templato (in forma denaturata o nativa) in un RNA copia utilizzando ribonucleosidi trifosfati come precursori. La trascrizione viene avviata preferenzialmente su promotori che contengono sequenze conservate localizzate 10 e 35 bp a monte dell’inizio della trascrizione e, in vivo, di solito cessa all’altezza di sequenze chiamate terminatori. La specificità e l’estensione della trascrizione dipende fortemente dalla qualità della preparazione del DNA, dalla forza della sequenza promotore e terminatore e dal tipo e dalla concentrazione dei cationi mono e bivalenti nella miscela di reazione. Il core dell’enzima, che manca della subunità “o”, non riconosce le sequenze-promotore e di conseguenza comincia la trascrizione in modo casuale sul templato RNA polimerasi dei fagi SP6, T7, T3 Le Rna polimerasi dei fagi T7 e T3, prodotte dai rispettivi fagi (dal gene 1), furono in origine purificate individui infetti di E. coli. Al giorno d’ oggi entrambe le polimerasi vengono purificate da ceppi di E. coli che sovraesprimono i geni clonati. L’ RNA polimerasi del fago SP6 viene ottenuta da Salmonella typhimurium infettata dal batteriofago SP6. 44 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Queste tre omologhe RNA polimerasi fagiche sono tutte costituite da singoli polipeptidi con un peso molecolare compreso tra 90,000 e 100,000. Ciascuna ha un’ elevata specificià per il suo promotore, il quale consiste in una sequenza specifica di 20 bp. La trascrizione è sia molto rapida (10 volte la velocità della RNA polimerasi di E. coli in vitro) e sia estremamente processuale. DNA LIGASI Le DNA ligasi catalizzano la formazione dei legami fosfodiesterici tra i termini 5’-fosfato e 3’-idrossile giustapposti lungo i filamenti del DNA a doppia elica. Questa attività permette: • di riparare eventuali incisioni in un singolo filamento del DNA. • di legare dei frammenti di restrizione che hanno entrambe le estremità piatte 45 3 ottobre 2008 • Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne di legare sequenze terminali omologhe e coesive Per la ricerca sugli acidi nucleici vengono utilizzate due ligasi: la E. coli ligasi e la T4 DNA ligasi. Questi due enzimi differiscono sopprattutto in due proprietà. La prima è la fonte di energia: infatti T4 ligasi utilizza ATP, mentre E. coli ligasi utilizza il NAD. Un’ altra importante differenza è la loro capacità di legare le estremità piatte; in condizioni normali, solo la T4 ligasi è in grado di legare le estremità piatte. DNA ligasi T4 La T4 DNA ligasi, il prodotto del gene 30 del fago T4, fu originalmente purificata da cellule fago-infettate di E. coli. Il gene 30 del fago T4 è stato clonato, e l’enzima è ora preparato da ceppi sovraespressori. Utilizzando ATP come cofattore, la T4 DNAligasi catalizza il riparo delle incisioni nel singolo filamento del dna e lega i frammenti di restrizione che hanno sia estremità piatte che sequenze terminali coesive. E’ l’unica ligasi che lega efficientemente le estremità piatte in condizioni di reazione normali: infatti sembra che la attività della T4 DNAligasi sia stimolata dalla T4 RNA ligasi. Applicazioni La T4 DNA ligasi è di gran lunga la DNA ligasi più utilizzata. Essa può essere utilizzata virtualmente per ogni applicazione che richieda una DNA ligasi. Molto importante è la sua efficienza nel legare le estremità piatte, una reazione che altre ligasi non riescono ad eseguire. DNA ligasi di Escherichia coli La DNA ligasi di E. coli è il prodotto del gene lig. Il gene lig è stato clonato e l’enzima ottenuto da ceppi che lo sovraesprimonoi. La DNA ligasi di E. coli catalizza la riparazione di nick a singolo filamento sul DNA a doppia elica e unisce i filamenti che hanno estremità omologhe e coesive. La DNA ligasi di E. coli non può unire estremità piatte nelle normali condizioni di reazione. A differenza delle altre ligasi essa utilizza il NAD come cofattore. Applicazioni La DNA ligasi di E. coli può essere usata in alternativa alla DNA ligasi T4 quando non sono richieste le estremità piatte. La trasformazione effettuata usando DNA ligato con la DNA ligasi di E. coli ha un basso background da ligature errate se comparato alla DNA ligasi T4; quest’ ultima ha ancora minorespecificità per la struttura dell’estremità (blunt, sticky etc). 46 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne RNA ligasi RNA ligasi T4 L’RNA ligasi, prodotta da un gene virale (gene 63), è purificato dalle cellule infettate dal virus. Essa catalizza l’unione covalente ATP dipendente dei singoli filamenti con terminale 5’-fosfato del DNA o dell’RNA a singoli filamenti con terminale 3’ idrossile di molecole di DNA o RNA. Applicazioni 1. Marcatore radioattivo delle estremità 3’ dell’RNA. La miscela di reazione contiene le molecole di RNA e l’accettore, un nucleotide [5’ 32P] 3’, 5’bifosfato. (es: 5’32P-Cp) come donatore, e ATP come fonte di energia. Il prodotto di questa reazione è una molecola di RNA contenente un nucleotide aggiuntivo al terminale 3’ e un 32 P nell’ultimo collegamento tra i nucleotidi. 2. Circolarizza deossi- e ribo-oligonucleotidi. 3. Lega gli oligomeri per la sintesi degli oligonucleotidi. È utilizzato per produrre oligomeri che contengono al loro interno oligomeri marcati su specifici residui. 4. Stimola l’attività di ligatura piatta sulle estremità dei filamenti della T4 DNA ligasi. 47 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne RNA Polimerasi DNA indipendenti Polimerasi poly(A) L'enzima purificato da E. coli catalizza l'incorporazione di residui di AMP all'estremita' libera 3'-OH dell'RNA, utilizzando ATP come precursore. Condizioni di reazione Incubazione a 37°C per 30 minuti. La reazione viene bloccata aggiungendo EDTA o riscaldando a 75°C per 10 minuti. Il volume delle reazioni e le concentrazioni di ATP variano a seconda delle applicazioni individuali. Applicazioni 1. Marcatura dell'estremita' 3' dell'RNA utilizzando ATP con l'isotopo 32P. L'RNA cosi' marcato è usato per le sonde di ibridazione. Per i geni clonati ,tuttavia, la sintesi di sonde di RNA usando l'RNA polimerasi di fagi è molto più efficiente e produce RNA con un'attività a più' alta specificità. Per la marcatura dell'RNA cellulare si preferisce il metodo della sintesi di cDNA usando la reverse trascrittasi. 2. Clonaggio di RNA che manca della coda di poli(A). La coda di poli(A) viene sintetizzata grazie alla poli(A) polimerasi e successivamente viene fatta una copia di cDNA utilizzando come primer oligo(dT). Fosfatasi e chinasi Fosfatasi alcalina Fosfatasi alcalina batterica (BAP) da E. coli e fosfatasi dell'intestino di vitello (CIP) sono state usate comunemente nella ricerca di acidi nucleici. Entrambi gli enzimi catalizzano l'idrolisi di residui di 5'-P da DNA, RNA e ribo- e deossiribonucleoside trifosfati. I prodotti defosforilati hanno un'estremita' 5'-OH che può essere successivamente marcata radioattivamente usando [γ-32P]ATP e chinasi polinucleotide T4. 48 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Entrambe le fosfatasi richiedono Zn2+ per la loro attività. La differenza pricipale tra i due enzimi è la stabilità: CIP è facilmente inattivato dal riscaldamento a 70°C per 10 minuti e/o dall'estrazione con il fenolo, la BAP invece è molto più resistente a questi trattamenti. Così, per più' ragioni, CIP è l'enzima scelto. Inoltre CIP ha un'attività specifica più alta che BAP. Condizioni di reazione per la BAP Inoculare a 60°C per 30 minuti. La reazione viene bloccata con SDS e proteinasi K incubando a 37°C per 30 minuti. Poi si estrae due volte con fenolo e si precipita il DNA con etanolo. Condizioni di reazione per la CIP Incubare a 37°C per 30 minuti. La reazione si blocca riscaldando a 75°C per 10 minuti (la CIP è labile al calore), oppure estraendo con fenolo e precipitando con etanolo. Applicazioni 1. Defosforilazione all'estremità 5' degli acidi nucleici per marcare con [γ-32P]ATP e T4 polinucleotide chinasi. La marcatura del DNA al 5' con 32P era usata per il sequenziamento con la procedura di Maxam-Gilbert 2. Defosforilazioni all'estremita' 5' di un vettore di DNA per evitare che che si leghi con se stesso. T4 polinucleotide chinasi La T4 polinucleotide chinasi, prodotto del gene pseT del fago T4, fu originariamente purificata da cellule di E.coli infettato dal fago T4. Recentemente, il gene pseT e' stato clonato in E. coli e l'enzima è stato sovraespresso da questo ceppo. La reazione in avanti della T4 polinucleotide chinasi catalizza il trasferimento del fosfato terminale dell'ATP al terminale 5'-OH di DNA e RNA. Questa reazione è molto efficiente e quindi rappersenta il metodo solitamente usato per marcare l'estremita' 5' o per fosforilare gli oligonucleotidi. 49 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne La reazione di scambio della stessa chinasi catalizza lo scambio dei fosfati all'estremità 5'. In questa reazione, che richiede un eccesso di ADP, il fosfato all'estremità 5' è trasferito all'ADP e successivamente rifosforilato grazie al 32P di una molecola di ATP. La reazione di scambio è meno efficente della reazione in avanti, quindi è usata raramente. Infine la polinucleotide chinasi è una 3' fosfatasi. Alcune preparazioni commerciali di polinucleotide chinasi sono preparate a partire dal filamento del fago T4 con il gene pseT mutato. Applicazioni 1. Sequenziamento di DNA tramite la tecnica Maxam-Gilbert. 2. Mappatura dei siti di restrizione con una parziale digestione di frammenti di DNA marcati all'estremità 5'. 3. Mappatura dell'estremità dei trascritti di RNA. 4. Mappatura delle posizioni degli introni sul DNA. 5. Sintesi di substrati per le ligasi di DNA e RNA. 6. Marcatura di oligonucleotidi per la purificazione tramite elettroforesi su gel. 7. Ligatura di oligonucleotidi su vettori di RNA; quando gli oligonucleotidi sono sintetizzati chimicamente hanno un'estremità 5'-OH; nel caso in cui vengano utilizzati per il clonaggio è preferibile molte volte fosforilarli. 50 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Esonucleasi Esonucleasi VII (exo VII) L'esonucleasi VII proveniente da E. coli consiste in due subunità, i prodotti dei geni xseA e xseB. E' un'esonucleasi che lavora su singolo filamento e che agisce su entrambe le estremità del DNA. I prodotti dell'exo VII sono piccoli oligonucleotidi. Exo VII è l'unica tra le nucleasi qui discusse che non ha bisogno di Mg2+. Ha attività massima in presenza di EDTA 10 mM. Applicazioni 1. Mappatura delle posizioni degli introni nel DNA genomico. 2. Escissione di segmenti di DNA che sono stati inseriti nei vettori plasmide tramite il metodo di tailing di poli(dAdT). Esonucleasi III (exo III) E' il prodotto del gene xthA di E.coli. E' sintetizzata dalle cellule di E. coli che sovraproducono la proteina. E' un enzima polifunzionale che catalizza l'idrolisi di diversi tipi di legami fosfodiesterici nel DNA a doppio filamento. La principale applicazione della exoIII è come specifica esonucleasi 3'-5' su doppio filamento che catalizza il rilascio di nucleotidi 5' dall'estremità 3'-OH del DNA a doppio filamento. 51 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne L'attività di esonucleasi è non-processiva, quindi è ideale per generare regioni uniformi a singolo filamento in DNA a doppio filamento. La sua velocità di degradazione dipende dalle basi che compongono il DNA: C>>A~T>>G. Come risultato estremità differenti saranno degradate a velocità differenti. Oltre all'attività esonucleasica 3'-5', exo III ha altre tre attività: • fosfatasica 3' • RNAsi H • endonucleasica specifica per siti apurinici o apirimidinici Applicazioni 1. Preparazione di sonde radioattive filamento specifiche. 2. Preparazione di templati a singolo filamento di DNA per sequenziamento. 3. Costruzione di delezioni unidirezionali, poichè exo III è specifica per il DNA a doppio filamento essa degraderà preferibilmente DNA duplex aventi 3'-recessed end as opposed to one with a 5'-recessed end. Questa proprietà è utile per la costruzione di un set di delezioni unidirezionali da una data posizione nel DNA clonato, che sono usate per il sequenziamento di DNA senza siti di restrizione precedentemente mappati. Endonucleasi Nucleasi BAL 31 La nucleasi BAL31 da Alteromonas espejiana è una endodeossiribonucleasi specifica per il singolo filamento. Sul DNA circolare a doppia elica degrada a livello di nick o nelle regioni prominenti a singolo filamento create tramite superavvolgimento. Sul DNA lineare a doppia elica degrada da entrambe le estremità ed ha come risultato un accorciamento controllato del DNA. 52 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne BAL 31 agisce anche come una ribonucleasi catalizzando l'idrolisi di RNA ribosomale e transfer. Richiede sia Ca2+ che Mg2+. Le digestioni possono essere terminate con EGTA, uno specifico chelante del calcio, senza influire sulla concentrazione di Mg2+. E' attiva in SDS e urea. Applicazioni 1. Nel clonaggio per creare delezioni di diverse dimensioni in modo controllato. Il DNA clonato è tagliato in siti specifici con un enzima di restrizione e il DNA lineare risultante è digerito con la nucleasi BAL31 per vari intervalli di tempo. 2. Indagini sulla struttura secondaria di DNA superavvolto o alterazioni nella struttura a doppia elica di DNA causate da trattamenti con agenti mutageni. Nucleasi S1 La nucleasi S1 da Aspergillus oryzae è una endonucleasi a singolo filamento altamente specifica. La velocità di digestione di DNA a singolo filamento è 75000 volte più veloce di quella di DNA a doppio filamento. Il pH ottimale va da 4.0 a 4.3 e la velocità diminuisce del 50% a pH 4.9. Le reazioni vengono fatte correre normalmente a pH 4.6 per evitare la depurinazione del DNA. L'enzima richiede bassi livelli di Zn2+ e non è influenzato da NaCl presente in concentrazioni tra 10 e 300 mM. L'enzima è stabile in urea.SDS e formamide. Applicazioni La maggior pate delle applicazioni della nucleasi S1 fa uso della sua abilità di orientare le estremità sporgenti di DNA e RNA senza significativa erosione delle estremità piatte. 1. Mappatura delle estremità 5' e 3' di trascritti di RNA con l'analisi di ibridi RNA-DNA S1 resistenti. 2. Mappatura della locazione degli introni grazie alla digestione di un ibrido di un mRNA maturo con DNA genomico marcato con 32P. 3. Digestione delle strutture a forcina formate durante la sintesi di cDNA da parte delle trascrittasi inverse. 4. Rimozione delle estremità a singolo filamento da filamenti di DNA per produrre estremita' piatte per la ligatura. 5. Creazione di piccole delezioni ai siti di restrizione 6. Rendere le estremità piatte dopo successive delezioni con exo III Nucleasi Mung Bean E' un'endonucleasi a singolo filamento altamente specifica, con proprietà simili a quelle della nucleasi S1. Le reazioni sono normalmente portate avanti a pH 5 che è ottimale per la degradazione del DNA a singolo filamento. L'attività contro il DNA a doppio filamento è essenzialmente trascurabile a pH 5 ma aumenta a pH inferiori. La sua attivazione diminuisce significativamente a concentrazioni di NaCl maggiori di 200 mM. Una unità è definita come la quantita' di enzima che produce 1 ng di materiale solubile in acido in 1 minuto a 37°C usando come substrato DNA a singolo filamento estratto da sperma di salmone. Applicazioni E' usata per quasi tutti gli stessi scopi descritti per la nucleasi S1. Tuttavia non è più precisa di questa nel tagliare subito dopo l'ultima coppia di basi ibridate senza rimuovere alcun nucleotide appaiato. Per questa ragione genera normalmente bande singole, mentre S1 spesso da bande multiple. Inoltre è preferita a S1 per la precisa eliminazione di basi che 53 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne sporgono (protuberanza dell’estremità) come risultato del taglio di endonucleasi di restrizione. A differenza di S1, la nucleasi Mung Bean non taglia il filamento opposto ad un nick nel doppio filamento di DNA. Deossiribonucleasi I (DNasi I) Deriva dal pancreas bovino, è un'endonucleasi che degrada il DNA a doppio filamento producendo oligonucleotidi 3'OH. L'enzima richiede cationi bivalenti. La specificità della reazione varia a seconda del tipo di catione presente. In presenza di Mg2+ la DNasi I produce nick non corrispondenti nei due filamenti di DNA mentre in presenza di Mn2+ l'enzima produce rotture corrispondenti su entrambi i filamenti. Applicazioni 1. Nick translation (vedi marcatura sonde). Introduce nick su entrambi i filamenti di DNA che possono fungere da primer per iniziare la sintesi di DNA da parte della DNA polimerasi I di E. coli. 2. Clonaggio random di frammenti di DNA catalizzando il taglio su doppio filamento in presenza di Mn2+. Ribonucleasi Ribonucleasi (RNAsi) con differenti specificità di sequenza sono usate per una molteplicità di scopi analitici inclusi il sequenziamento, la mappatura e la quantificazione dell'RNA. Un'applicazione comune dell'RNasi A è l'idrolisi dell'RNA che contamina le preparazioni di DNA. Un'altra RNAsi usata comunemente e' l'RNasi H. Molte RNasi disponibili sono endoribonucleasi sequenza specifiche. Questa proprietà è stata sfruttata per il sequenziamento enzimatico dell'RNA. Ad esempio una combinazione di tre diverse RNAsi e la nucleasi di Staphilococcus aureus può essere usata nella determinazione della sequenza di RNA. Ribonucleasi A Proviene dal pancreas bovino, è un'endoribonucleasi che idrolizza specificatamente l'RNA dopo residui C e U. Il taglio avviene tra il gruppo 3-fosfato di una pirimidina del ribonucleotide e il 5'-OH dell'adiacente nucleotide. La reazione genera un fosfato ciclico 2'-3' che viene poi idrolizzato ai corrispondenti 3'-nucleosidi fosfati. L'attivita' dell'RNasi A può essere specificamente inibita da un inibitore di RNAsi, una proteina isolata dalla placenta umana. Applicazioni 1. Mappatura e quantificazione di vari RNA usando il saggio di protezione da ribonucleasi. E' usata in combinazione con l'RNasi T1. 2. Idrolisi dell'RNA che contamina preparazioni di DNA. 3. Sequenziamento di RNA. 54 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Ribonucleasi H Isolata da E. coli. E' una endoribonucleasi che idrolizza specificamente i legami fosfodiesterici dell'RNA negli ibridi RNA-DNA generando prodotti con estremità 3'-OH e 5'-P. Non degrada DNA o RNA a singolo o doppio filamento. Il taglio dell'RNasi H può essere diretto verso siti specifici tramite ibridazioni di corti deossi-oligonucleotidi con l'RNA. Una unità è definita come la quantità di enzima che produce una nmole di ribonucleotidi solubili in acido da poly(A)poly(T) in 20 minuti a 37°C. Applicazioni 1. Sintesi di cDNA a doppio filamento rimuovendo il filamento di mRNA dall'ibrido RNA-DNA prodotto durante la sintesi del primo filamento di cDNA. E' anche usata nel protocollo per degradare RNA residui insieme all'RNasi A. 2. Creazione di tagli specifici in molecole di RNA usando deossioligonucleotidi sintetici per creare regioni a doppio filamento RNA-DNA. Enzimi di restrizione Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi che tagliano le molecole di DNA a doppio filamento in siti specifici che si trovano all’interno o adiacenti a particolari sequenze di nucleotidi chiamate siti di riconoscimento. Gli enzimi di restrizione comunemente riconoscono sequenze di DNA palindromiche. Gli enzimi di restrizione producono due diversi tipi di estremità: i. gli enzimi che tagliano entrambi i filamenti esattamente all’asse di simmetria della sequenza palindromica generano frammenti di DNA con estremità piatte (blunt ends) ii. gli enzimi che tagliano ogni filamento in posizione similare ai lati opposti dell’asse di simmetria creano frammenti di DNA con estremità protruding (overhangs) a singolo filamento (sticky ends) 55 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne RESTRIZIONE DEL DNA Reazione di taglio Per il taglio con enzimi di restrizione è importante non usare concentrazioni di DNA superiori a 0.1μg/μl (es.: 1μg di DNA in 10μl di volume finale di reazione). Se si deve caricare su gel grandi quantità di DNA, digerire in un volume adeguato e poi precipitare con alcool e risospendere nel volume di caricamento. Aggiungere 1/10 del volume finale di tampone 10x per l’enzima di restrizione da utilizzare. 1. Il tampone ricrea un ambiente adatto all’azione dell’enzima di restrizione: quest’ultimo è un’endonucleasi e quindi necessita di ioni Mg++. Poiché generalmente il DNA è risospeso in TE (contenente EDTA, un chelante di ioni bivalenti) i tamponi contengono un eccesso di ioni Mg++ in modo da usare l’EDTA e da lasciare in soluzione una quantità di ioni sufficiente all’enzima. 1mM di EDTA è sufficiente a complessare il Mg++ in soluzione ma non tanto da complessare anche il Mg++ che serve quando dobbiamo usare degli enzimi di restrizione. Il tampone è composto di Tris, Mg++ e stabilizzatori dell’attività enzimatica che permettono di evitare tagli aspecifici. Usare il tampone appropriato per l’enzima di restrizione (anche se magari il tampone è di una ditta e l’enzima di un’altra: l’importante è che i due corrispondano): l’utilizzo di un tampone non specifico può comportare attività enzimatica aspecifica (per questo è importante testare i tamponi universali prima di prove importanti). In caso di taglio con due enzimi di restrizione diversi, utilizzare un tampone che assicuri almeno 50% di efficienza per entrambi gli enzimi (cfr tabelle dei cataloghi delle ditte di produzione dei tamponi). Se l’efficienza è minore, è preferibile utilizzare il primo enzima in un tampone appropriato, precipitare il DNA, lavarlo, risospenderlo e procedere al taglio con il secondo enzima nel nuovo tampone. Come la maggiorparte delle aziende che oggi operano sul mercato, New England Biolab (www.neb.com) fornisce 4 tamponi con caratteristiche leggermente diverse. Ogni enzima funziona bene con almeno uno di essi ed è generalmente possibile trovare un tampone che permetta l’attività dei due enzimi che si impiegano nel gaso di digestioni moltiple. 2. Aggiungere 1 μl di enzima di restrizione. L’enzima viene aggiunto per ultimo nella soluzione perché funziona solo se sono già presenti DNA, TE (o H2O) e tampone. Gli enzimi si misurano come unità di attività. 1 o 2 unità sono la quantità necessaria per tagliare 1 μg di DNA di Fago λ in 30 minuti (bastano poche unità perché è DNA lineare e corto, quindi è facile da tagliare e il numero di siti riconosciuti dall’enzima sono pochi ). Nel DNA plasmidico (superavvolto) o genomico i siti di restrizione sono di più e possono essere nascosti per cui di solito si usano 5-8 unità di enzima per ogni μg di DNA da tagliare e servono tempi più lunghi, fino a 3 ore. E’ da notare che, nei plasmidi superavvolti, l’enzima fatica a tagliare i siti di restrizione mascherati dai superavvolgimenti. Dopo i primi tagli la struttura si rilassa esponendo così tutti i siti di restrizione del DNA. Si considera che in 10 μl può essere tagliato al massimo 1 μg di DNA. Quando taglio DNA plasmidico (circolare) che ha un solo sito di restrizione per l’enzima utilizzato, sul gel di agarosio trovo una sola banda. Se taglio invece DNA genomico che ha molti siti di taglio per lo stesso enzima, sul gel risulta una strisciata con gradiente crescente dal basso verso l’alto poiché dal taglio si formano in maggioranza lunghi frammenti di DNA. La visualizzazione su gel di agarosio di un frammento di DNA richiede almeno 20 picogrammi. Per la visualizzazione di DNA genomico tagliato con un enzima di restrizione sono invece necessari di almeno 2 μg, che posso ottenere precipitando con isopropanolo e NaOAc 3M, seguito da un lavaggio in etanolo e alla fine risospendo in 10-15 μl di TE. Gli enzimi di restrizione sono forniti di glicerolo (crioprotettore) e conservati a –20°C. Durante la procedura devono essere tenuti in ghiaccio. Per diluirli - se necessario - si utilizza il tampone di reazione ad una concentrazione 1X; una volta diluiti non è possibile conservarli per più di qualche ora. Di solito le case fornisco gli enzimi a circa 12-20 unità per μl. 3. Incubare per 1h a 37°C (3h per DNA genomico). 56 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Se dopo questo tempo il DNA non risulta tagliato completamente, conviene ripetere l’estrazione, non la digestione, perché il DNA contiene evidentemenet impurità. Alcuni enzimi hanno bisogno di temperature più basse di 37°C (es. Sma1 taglia a temperature inferiori a 25°C) per cui prima di usare ogni enzima, assicurarsi sempre di quali sono le sue condizioni ottimali di utilizzo. Gli enzimi di restrizione posso avere la cosiddetta “star activity”, un fenomeno che si presenta se l’enzima è in attività per un tempo prolungato (es. over-night). Quando l’enzima perde le sue capacità funzionali o è in condizioni non idonee, comincia a tagliare in modo aspecifico. Per questo motivo gli enzimi vengono usati con il tampone appropriato e mai oltre le 3 ore. Esempio: Avendo a disposizione il Tampone4 a una concentrazione 10X, l’enzima Sac1, H2O, DNA plasmidico da tagliare e volendo arrivare ad un volume finale di 15μl totali, quanti μl di ogni componente devo prendere? Se volessimo caricare 200 ng di DNA contenuti in 3μl della nostra soluzione, preparo la soluzione di taglio enzimatico nel seguente modo: • 3μl di DNA; • 1μl di enzima Sac1 corrispondente a 5-8 unità; • 1..5μl di Tampone4 diluendo su un volume di 15μl lo stock 10X a 1X; • 9..5μl di H2O per portare a volume. Cleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector) Linearized vectors were incubated with the indicated enzymes (10 units/µg) for 60 minutes at the recommended incubation temperature and NEBuffer for each enzyme. Following ligation and transformation, cleavage efficiencies were determined by dividing the number of transformants from the digestion reaction by the number obtained from religation of the linearized DNA (typically 100500 colonies) and subtracting from 100%. "Base Pairs from End" refers to the number of double-stranded base pairs between the recognition site and the terminus of the fragment; this number does not include the single-stranded overhang from the initial cut. Since it has not been demonstrated whether these single-stranded nucleotides contribute to cleavage efficiency, 4 bases should be added to the indicated numbers when designing PCR primers. Average efficiencies were rounded to the nearest whole number; experimental variation was typically within 10%. The numbers in parentheses refer to the number of independent trials for each enzyme tested (from Moreira, R. and Noren, C. (1995), Biotechniques, 19, 56-59). Note: As a general rule, enzymes not listed below require 6 bases pairs on either side of their recognition site to cleave efficiently. |A|B|E|H|K|M|N|P|S|X| Base pairs from End %Cleavage Efficiency Vector Initial Cut Aat II 3 2 1 88 (2) 100 (2) 95 (2) LITMUS 29 LITMUS 28 LITMUS 29 Nco I Nco I PinA I Acc65 I 2 1 99 (2) 75 (3) LITMUS 29 pNEB193 Spe I Sac I Afl II 1 13 (2) LITMUS 29 Stu I Age I 1 1 100 (1) 100 (2) LITMUS 29 LITMUS 29 Xba I Aat II Apa I 2 100 (1) LITMUS 38 Spe I Asc I 1 97 (2) pNEB193 BamH I Avr II 1 100 (2) LITMUS 29 Sac I BamH I 1 97 (2) LITMUS 29 Hind III Bgl II 3 100 (2) LITMUS 29 Nsi I BsiW I 2 100 (2) LITMUS 29 BssH II BspE I 2 1 100 (1) 8 (2) LITMUS 39 LITMUS 38 BsrG I BsrG I BsrG I 2 1 99 (2) 88 (2) LITMUS 39 LITMUS 38 Sph I BspE I BssH II 2 100 (2) LITMUS 29 BsiW I Eag I 2 100 (2) LITMUS 39 Nhe I EcoR I 1 1 1 100 (1) 88 (1) 100 (1) LITMUS 29 LITMUS 29 LITMUS 39 Xho I Pst I Nhe I Enzyme 57 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne EcoR V 1 100 (2) LITMUS 29 Pst I Hind III 3 2 1 90 (2) 91 (2) 0 (2) LITMUS 29 LITMUS 28 LITMUS 29 Nco I Nco I BamH I Kas I 2 1 97 (1) 93 (1) LITMUS 38 LITMUS 38 NgoM IV Hind III Kpn I 2 2 1 100 (2) 100 (2) 99 (2) LITMUS 29 LITMUS 29 pNEB193 Spe I Sac I Sac I Mlu I 2 99 (2) LITMUS 39 Eag I Mun I 2 100 (1) LITMUS 39 NgoM IV Nco I 2 100 (1) LITMUS 28 Hind III NgoM IV 2 100 (1) LITMUS 39 Mun I Nhe I 1 2 100 (1) 82 (1) LITMUS 39 LITMUS 39 EcoR I Eag I Not I 7 4 1 100 (2) 100 (1) 98 (2) Bluescript SKBluescript SKBluescript SK- Spe I Ksp I Xba I Nsi I 3 3 2 100 (2) 77 (4) 95 (2) LITMUS 29 LITMUS 29 LITMUS 28 BssH II Bgl II BssH II Pac I 1 76 (3) pNEB193 BamH I Pme I 1 94 (2) pNEB193 Pst I Pst I 3 2 1 98 (1) 50 (5) 37 (3) LITMUS 29 LITMUS 39 LITMUS 29 EcoR V Hind III EcoR I Sac I 1 99 (2) LITMUS 29 Avr II Sal I 3 2 1 89 (2) 23 (2) 61 (3) LITMUS 39 LITMUS 39 LITMUS 38 Spe I Sph I Sph I Sfi I 9 4 1 81 (2) 97 (2) 93 (2) LITMUS 38 LITMUS 38 LITMUS 38 BamH I Mlu I EcoR I Spe I 2 2 100 (2) 100 (2) LITMUS 29 LITMUS 29 Acc65 I Kpn I Sph I 2 2 1 99 (1) 97 (1) 92 (2) LITMUS 39 LITMUS 39 LITMUS 38 Sal I BsrG I Sal I Xba I 1 1 99 (2) 94 (1) LITMUS 29 LITMUS 29 Age I PinA I Xho I 1 97 (2) LITMUS 29 EcoR I Xma I 2 2 98 (1) 92 (1) pNEB193 pNEB193 Asc I BssH II Activity of Thermophiles at 37°C Listed below is the percentage activity exhibited at 37°C for enzymes that have an optimal incubation temperature higher (thermophiles) or lower (25°C) than 37°C. Optimal Temperature % Activity at 37°C Apa I 25°C 100* ApeK I 75°C <10 Apo I 50°C 50 Bae I 25°C 20 Enzyme 58 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Bcl I 50°C 50 BfuA I 50°C 50 BpuE I 25°C 20 Bsa I 50°C 10 BsaB I 60°C 20 BsaJ I 60°C 20 BsaW I 60°C 20 BsiE I 60°C 30 BsiHKA I 65°C <10 BsiW I 55°C 50 Bsl I 55°C 30 Bsm I 65°C 20 BsmA I 55°C 30 BsmB I 55°C 20 BsmF I 65°C 50 BspCN I 25°C 30 Bsr I 65°C 20 BsrD I 65°C 30 BssH II 50°C 75 BssK I 60°C 10 BstAP I 60°C 50 BstB I 65°C 10 BstE II 60°C 50 BstF5 I 65°C 20 BstN I 60°C 30 BstU I 60°C 20 BstX I 55°C 50 BstY I 60°C 30 BtgZ I 60°C 75 CviA II 25°C 20 Fat I 55°C 20 Fau I 55°C 20 Mwo I 60°C 10 N.BstNB I 55°C <10 Nb.Bsm I 65°C - Pho I 75°C <10 PI-Psp I 65°C <10 PspG I 75°C 10 Sfi I 50°C 10 Sma I 25°C 50 Sml I 55°C <10 Swa I 25°C 50 Taq I 65°C 10 Tfi I 65°C 10 Tli I 75°C <10 Tse I 65°C 20 Tsp45 I 65°C 10 Tsp509 I 65°C <10 TspR I 65°C 10 Tth111 I 65°C 10 Massimo Delledonne * Apa I has 100% avtivity at 37°C, however the half-life of this enzyme at 37°C is only 30 minutes. 59 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne QUANTIFICAZIONE DEL DNA − − − Misura dell’OD260 allo spettrofotometro. Osservazione delle bande su gel: il limite minimo di rilevabilità è di 20-25ng (dipende dal sistema di rivelazione e dalla quantità di EtBr). Confronto della banda ottenuta con quella di una quantità nota di fago λ o di marker. Quantificazione spettrofotometrica del DNA Le letture vengono fatte a due lunghezze d’onda: • 280nm • 260nm assorbimento delle proteine assorbimento del DNA In una cuvetta di quarzo (trasparente agli UV) aggiungere 995μl di H2O. Azzerare lo strumento. Aggiungere 5μl di DNA. Leggere il valore (es. A260 = 0.124, A280 = 0.060). Dal rapporto dell’assorbimento a 260nm e quello a 280nm è possibile ricavare la purezza del campione di DNA: A260 0.124 = = 2.06 A280 0.060 Se il DNA è abbastanza puro si ottiene un rapporto di 1.8-1.9; un valore minore (cioè circa 1.6) indica che il DNA è contaminato da proteine; un rapporto invece di circa 2 o addirittura più alto significa che il DNA è contaminato da RNA, zuccheri o lipidi. A260 = 1 corrisponde approssimativamente a 50 μg nel caso di DNA a doppia elica; 40 μg nel caso di RNA e 30 μg nel caso di oligonucleotidi 1OD sono μg di acido nucleico in 1ml di volume con cuvetta di 1cm. Per esempio: - Per DNA OD260 = 1 = 50 µg/ml, cioè se metto 50mg di DNA in 1ml trovo OD260 = 1; - Per RNA OD260 = 1 = 40 µg/ml perché essendo a singola elica assorbe di più per cui una minore quantità mi dà sempre una OD260 pari a 1; - Per oligonucleotidi single-strand OD260 = 1 ≅ 33 µg/ml. Il metodo dello spettrofotometro è adatto nel caso in cui abbiamo DNA in quantità non troppo bassa per evitare di incorrere in valutazioni grossolanamente errate. E’ pertanto consigliabile eseguire la quantificazione confrontando la fluorescenza emessa dall’etidio bromuro (dopo corsa su gel di agarosio) con uno standard di concentrazione (DNA a quantità nota) nota. Quantificazione tramite confronto della fluorescenza emessa dall’etidio bromuro (EtBr) con uno standard a concentrazione nota (es. Fago λ o marker) Se per esempio abbiamo a disposizione come marker il Fago λ (ma potrebbe essere qualsiasi altro marker a concentrazione nota) con una concentrazione di 10ng/μl e sul gel carichiamo 5μl, la banda risultante dopo corsa su gel di agarosio conterrà 50ng di DNA: 10ng : 1μl = X : 5μl X= 10ng ⋅ 5μl = 50ng , che è la quantità di DNA contenuto nella banda. 1μl Sapendo quanto DNA è contenuto nella banda del marker, è possibile fare un confronto con l’intensità di altre bande a concentrazione ignota e farci così una stima approssimativa del contenuto in DNA di queste ultime. 60 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Notare che la quantità minima di DNA da caricare nel gel di agarosio deve essere 20-25ng altrimenti le bande non sono visualizzabili! 61 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne ELETTROFORESI L’elettroforesi su gel è costituita da un movimento di cariche in un campo elettrico. E’ il metodo più comune per separare molecole di DNA, RNA e proteine e trova numerose applicazioni in biologia molecolare. Vengono utilizzati due diversi tipi di gel: di agarosio e di poliacrilammide. L’agarosio è un polisaccaride che forma un gel con pori variabili tra 100 e 300 nm di diametro a seconda della sua concentrazione. E’ quindi la percentuale di agarosio che determina la gamma dei frammenti di DNA, RNA o proteine che vengono separati. Tuttavia il gel di agarosio non ha il potere risolutivo per separare molecole di DNA che differiscono soltanto per uno o pochi nucleotidi. Per questo scopo vengono utilizzati i gel di poliacrilammide i quali riescono a separare frammenti diversi anche di un solo nucleotide (range 1-1000 bp) grazie a pori di dimensioni minori rispetto a quelli di agarosio. Il gel è ottenuto per polimerizzazione di acrilammide monofunzionale tramite un cross-legante, l’N, N’-metilenebisacrilammide. A differenza di quelli dell’agarosio, i legami formati nella poliacrilammide sono irreversibili. La matrice è neutra e meccanicamente stabile. Inoltre i gel di poliacrilammide si possono fare a varie concentrazioni (minimo 3%). Elettroforesi su gel di agarosio Dopo la loro polimerizzazione, i gel vengono posti nelle apposite vaschette elettroforetiche riempite in seguito del tampone di corsa. Tale tampone è lo stesso e alla stessa concentrazione di quello usato per polimerizzare l’agarosio. I tamponi più usati sono: • il TAE (Tris-acetato + EDTA). Questo nel tempo perde capacità tamponante perché si ha la separazione di cariche agli elettrodi. Viene quasi sempre utilizzato a una concentrazione 1X; • il TBE (Tris-borato + EDTA) ha capacità tamponante superiore al TAE. E’ stabile e quindi viene usato in corse elettroforetiche molto lunghe. L’unico difetto è che col tempo tende a precipitare. Può essere utilizzato a “mezza forza”, cioè 0.5X, perché già a questa concentrazione ha un potere tamponante sufficiente; • il TPE (Tris-fosfato + EDTA). Il Tris contenuto nel tampone è un sale molto usato nei laboratori. Tampona tra pH 7 e pH 8, un range in cui il DNA si mantiene molto bene. L’EDTA, invece, è un chelante che sequestra ioni Mg2+ presenti in soluzione e che vengono utilizzati da enzimi che degradano il DNA (DNAsi). Il suo potere tamponante è nullo rispetto a quello del Tris. Prima di caricare il gel si aggiunge al campione un colorante con velocità di migrazione nota in modo da seguire istante per istante l’andamento dell’elettroforesi. Tale colorante è chiamato Loading buffer (LB) ed è costituito da: • 0.25% Blu bromofenolo, che migra come un frammento di 300 bp in TBE 0.5X; • 0.25% Xilene di cianolo, che migra come un frammento di 4000 bp in TBE 0.5X; • 40% (w/v) saccarosio in acqua. Spesso sul gel, durante il caricamento dei campioni, si riserva un pozzetto in cui verrà messo il marker. Questo è composto da una miscela di frammenti lineari di DNA i quali migrano nel gel in maniera nota. Ogni marker comprende un range di separazione. Per esempio l’1Kb contiene venti frammenti che si separato tra 0.1 e 10.0kb. In questo modo, confrontando il mio campione con il marker, posso dire più o meno che lunghezza ha il mio frammento. Il principio di funzionamento dell’elettroforesi consiste nel movimento di particelle cariche negativamente, DNA, RNA o proteine (saturate con Sodio-dodecilsolfato, SDS), in un campo elettrico verso il polo positivo (anodo). La separazione, come detto prima, avviene in base alle dimensioni e quindi alla massa della molecola. La distanza di migrazione è maggiore per molecole piccole le quali sono trattenute meno dalla maglia polisaccaridica formata dal gel. Nell’esecuzione della corsa elettroforetica, si deve applicare una differenza di potenziale proporzionale alla distanza tra gli elettrodi. In particolare si applica un voltaggio di 3-5V/cm (calcolato come distanza tra i due elettrodi). Solitamente si utilizza voltaggio costante per i gel di agarosio e un amperaggio costante per quelli di poliacrilammide. Il voltaggio applicato deve essere circa 5V/cm perché se fosse maggiore si rischierebbe di scaldare il tampone di corsa e quindi di danneggiare il DNA, l’RNA o le proteine, a seconda delle molecole con cui si sta lavorando. Per ovviare a questo vengono usate vaschette che contengono un’elevata quantità di tampone di corsa. Nel caso di voltaggio costante, l’amperaggio non deve essere un fattore limitante e quindi si posiziona il cursore dei mA (milli Ampére) al massimo. Nel caso invece di amperaggio costante avremo il cursore del voltaggio al massimo e quello dell’amperaggio settato sul valore desiderato. Importante è anche il tempo della corsa elettroforetica che è direttamente proporzionale alla risoluzione. Si può velocizzare il processo aumentando il voltaggio (o l’amperaggio) ma bisogna fare attenzione a non incorrere nei rischi detti precedentemente dovuti al calore prodotto per effetto Joule. 62 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Per visualizzare le bande elettroforetiche durante e dopo la corsa, viene aggiunta al gel una quantità di 2.5 μl Bromuro di etidio/100 ml agarosio (lo stock di EtBr e’ di norma 10 mg/ml di H2O). Ethidium bromide can be added to 0.2-0.5 ug/ml in the gel. L’EtBr è un intercalante del DNA e dell’RNA e se esposto a luce UV emette fluorescenza. In questo modo sono rese visibili le bande sul gel che hanno migrato. Per la visualizzazione delle proteine si preferisce fare un Western blotting in cui esse sono trasferite dal gel a una membrana di nylon o di nitrocellulosa e successivamente vengono fatte riconoscere da anticorpi specifici che portano legati enzimi che danno reazioni chimiche e colorimetriche. I tamponi per l’elettroforesi in genere sono preparati come soluzioni concentrate e conservati a temperatura ambiente. Tamponi più comuni: Tampone Stock concentrato (al litro) Soluzione finale Tris-acetato TAE 50x : 242 g Tris base 57.1 ml acido acetico glaciale 100 ml 0.5 M EDTA (pH8.0) 5x : 54 g Tris base 27.5 g acido borico 20 ml 0.5 M EDTA (pH8.0) 1x: 0.04 M Tris acetato 0.001 M EDTA Tris-borato TBE 0.5x : 0.045 M Tris borato 0.001 EDTA Note: Tris fornisce il potere tamponante. Acido acetico e acido borico sono gli ioni che permettono il passaggio della corrente elettrica. EDTA chela il Mg++ bloccando l’azione delle DNasi. TAE Perde capacità elettroforetica dopo qualche ora (l’anodo diviene alcalino e il catodo diviene acido). Bisogna quindi sostituire il tampone o ricircolare quello presente ai compartimenti elettrodici. TBE Non perde capacità elettroforetica, ma tende a precipitare nel tempo. In questo modo variano le concentrazioni saline. TBE può essere utilizzato a mezza forza (0.5x) in quanto il suo potere tamponante è sufficiente. Il vantaggio di questo tampone è che sopporta corse molto lunghe. Il tampone per l’elettroforesi viene utilizzato sia per preparare il gel d’agarosio (vedi di seguito anche per le quantità e le modalità di preparazione) sia per la corsa, riempendo la vaschetta d’elettroforesi stessa, dopo avervi sistemato la slitta con il gel. Il tampone di corsa elettroforetica deve essere lo stesso impiegato per la preparazione del gel di agarosio, altrimenti il gel potrebbe subire delle deformazioni, a causa delle diverse concentrazioni saline (richiama acqua dal tampone di corsa, espandendosi oppure si compatta espellendo acqua) ed si otterrebbero corse non affidabili (le bande migrano in modo anomalo). Preparazione del gel di agarosio (0.8%) - Sciogliere 0.8 g di agarosio in 100 ml di tampone di corsa • Pesare 0.8 g di agarosio direttamente in una beuta, aggiungere il tampone di corsa (100 ml). • Affinché l’agarosio si sciolga, porre la beuta nel forno a microonde a media potenza, di tanto in tanto estrarla e agitare fino ad ottenere una soluzione limpida • Raffreddare leggermente il gel continuando ad agitare la beuta, tenendola sotto un getto d’acqua fredda e, raggiunta una temperatura, tale che permetta di tenere in mano la beuta stessa senza scottarsi, aggiungere 2.5 μl di etidio bromuro (10 mg/ml) ogni 100 ml di gel. In alternativa, sciogliere il gel in 50 ml di tampone e poi aggiungere i rimanenti 50 ml. In questo modo il gel viene immediatamente portato alla giusta temperatura. La quantità da versare di gel nella vaschetta di elettroforesi deve dare uno spessore proporzionale alla quantità di DNA da caricare. 63 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Loading buffer (10x) 0.25% Blu di bromofenolo (migrazione simile a quella di un frammento di 300 bp in TBE 0.5x) 0.25% Xilene di cianolo FF (migrazione simile a quella di un frammento di 4000 bp in TBE 0.5x) 40% (w/v) saccarosio o glicerolo in acqua. Il loading buffer aumenta la densità del campione che così resta nel pozzetto, lo colora facilitando il caricamento, contiene coloranti che migrano a velocità note verso l’anodo. Il loading buffer è preparato ad una concentrazione 10x: deve essere diluito 10 volte per la concentrazione d’uso. Caricamento e corsa − Preparare il campione in modo tale da diluire il loading buffer 10 volte. Ad esempio 1μl LB + 9 μl DNA e TE (o acqua). Il volume di caricamento dipende dal tipo di pozzetto e dallo spessore del gel. − Caricare evitando di avere bolle nel puntale: queste uscendo spingerebbero il campione fuori dal pozzetto. − Applicare una differenza di potenziale proporzionale alla distanza tra gli elettrodi, in particolare si applica un voltaggio di 3-5 V/cm (calcolato come distanza fra i due elettrodi). Solitamente si utilizza voltaggio costante per il gel di agarosio e un amperaggio costante per i gel di poliacrilammide, in quanto le proteine non devono subire sbalzi di temperatura. Nel caso di voltaggio costante l’amperaggio non deve essere un fattore limitante e quindi si posiziona il cursore delle mA al massimo. Nel caso invece di amperaggio costante avremo il cursore del voltaggio al massimo e quello dell’amperaggio settato al valore desiderato. − La corsa termina quando il primo colorante (blu di bromofenolo) ha percorso i ¾ della lunghezza del gel Visualizzazione delle bande L’etidio bromuro è una molecola fluorescente ai raggi UV che, intercalandosi agli acidi nucleici, ne permette l’evidenziazione su gel. E’ una molecola potenzialmente cancerogena, come TUTTE le molecole che si intercalano fra le eliche del DNA, ed è dunque necessario maneggiarla con prudenza Æ in caso entrasse in contatto con la pelle, lavare abbondantemente con acqua, ma non insaponare, per evitare di solubilizzare la molecola e farla penetrare negli strati inferiori dell’epitelio. Gli strati più superficiali sono infatto formati da cellule morte che non possono quindi essere danneggiate da parte di questa molecola. L’etidio bromuro potrebbe anche esser aggiunto dopo la corsa , ma è molto più pratico aggiungerlo direttamente al gel. Il limite di rivelabilità: è in genere attorno ai 15-20 ng di DNA Lo strumento utilizzato per visualizzare le bande è il transilluminatore a UV che permette anche di fotografare il gel: 64 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne NOTE Gli acidi nucleici sono carichi negativamente, quindi se sono posti in un campo elettrico migrano verso il polo positivo. Un’aliquota di campione di DNA viene caricato su un gel di agarosio immerso in un tampone di corsa (una soluzione conduttiva) e viene applicato un campo elettrico longitudinale al gel. Il campo elettrico fa migrare le molecole di DNA all’interno del gel, che essendo poroso, rallenta la corsa in base alle loro dimensioni. Dopo l’estrazione il DNA plasmidico può presentarsi in tre forme (superavvolto, circolare aperto e lineare) a seconda di come è avvenuta l’estrazione. In generale si osservano solo due bande: superavvolto e circolare aperto. Se è più evidente la banda della forma superavvolta significa che il protocollo di estrazione del plasmide è delicato e non danneggia il DNA. La forma circolare aperta prevale se l’estrazione si basa su metodi poco delicati (es. utilizzo di resine). La mobilità elettroforetica in un gel di agarosio dipende dal peso molecolare e dalla forma del DNA: nella corsa di un plasmide si possono trovare perciò tre bande (anche se in realtà la forma lineare è meno probabile). La mobilità relativa delle tre forme dipende dalla concentrazione di agarosio, dal voltaggio applicato, dal tampone e dalla concentrazione di etidio bromuro. In generale, la forma superavvolta migra più velocemente delle altre. Per verificare se le tre bande sono tre forme diverse dello stesso DNA: - corsa elettroforetica del plasmide - esposizione agli UV per 5 minuti o all’acido cloridrico 0.1 N (Il DNA viene così rotto e anche la forma superavvolta diviene circolare aperta) - corsa elettroforetica dello stesso gel in posizione ortogonale a quella in cui è stata effettuata la prima corsa elettroforetica. L’etidio bromuro è una molecola fluorescente ai raggi UV che, intercalandosi agli acidi nucleici, ne permette l’evidenziazione su gel. E’ una molecola potenzialmente cancerogena, come TUTTE le molecole che si intercalano fra le eliche del DNA, ed è dunque necessario maneggiarla con prudenza (Æ in caso entrasse in contatto con la pelle, lavare abbondantemente con acqua, ma non insaponare, per evitare di solubilizzare la molecola e farla penetrare negli strati inferiori dell’epitelio. Gli strati più superficiali sono infatto formati da cellule morte che non possono quindi essere danneggiate da parte di questa molecola. L’etidio bromuro potrebbe anche esser aggiunto dopo la corsa , ma è molto più pratico aggiungerlo direttamente al gel. Il limite di rivelabilità: è in genere attorno ai 15-20 ng di DNA. La migrazione su gel di agarosio è inversamente proporzionale al Log10 bp. Per separare il DNA in un range di 0.5 – 10.0 Kbp si utilizza agarosio 0.8 % (= 0.8g/100ml). Se si è interessati ad un particolare range di pesi molecolari è possibile variare la percentuale di agarosio, tenendo conto del fatto che percentuali ≤ 0.3 risultano non maneggiabili e ≥ 3% non permettono neppure l’ingresso del DNA nel gel. Un altro modo per separare le bande più pesanti o quelle che bandeggiano ad una altezza simile consiste nel far correre più a lungo il gel, anche se così facendo si perdono le bande a minor peso molecolare. Elettroforesi pulsata Una normale elettroforesi in gel di agarosio non permette di separare molecole di DNA più lunghe di 25 Kb, quindi per separare molecole fra 10 e 2000 Kb si può usare l’ elettroforesi pulsata. I frammenti da separare, anche interi cromosomi, possono essere inseriti nel pozzetto inclusi in blocchetti di agarosio, dato che una normale estrazione non permette l’isolamento di frammenti di DNA più lunghi di 20-40 Kb. La strumentazione per questo tipo di tecnica comprende una vaschetta per l’ elettroforesi dotata normalmente di sei elettrodi che, lavorando accoppiati, si alternano nel creare il campo elettrico. La periodica variazione di direzione del campo elettrico fa si che le lunghe molecole di DNA cambino continuamente conformazione, allungandosi e contraendosi, e riescano cosi’ ad entrare nel gel e a muoversi attraverso i pori. Equilibrando in modo corretto gli impulsi è possibile far procedere diritte le bande sul gel, anche se le singole molecole si muovono a zig-zag. Più grande è la molecola, maggiore è il tempo impiegato per cambiare conformazione. Questi diversi tempi sono sfruttati per separare le bande. 65 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Non molto usato è il sistema dell’ elettroforesi a campi elettrici invertiti, in cui il campo elettrico non cambia periodicamente solo la direzione, ma anche la polarità. Parametri critici: I parametri critici di cui tener conto nell’ elettroforesi pulsata sono il voltaggio, la temperatura, la lunghezza degli impulsi e la concentrazione di agarosio (in genere 1%). Variando questi parametri è possibile migliorare la risoluzione delle bande e scegliere il range di peso molecolare da separare. Sarebbe meglio non aggiungere bromuro di etidio, in quanto può rallentare il processo di rorientamento delle molecole. Il tampone migliore da usare è il TBE 0,5X, anche se il TAE permette una maggiore mobilità del DNA, perché gli alti voltaggi usati porterebbero ad un eccessivo riscaldamento del gel. Dosando opportunamente voltaggio e temperatura è possibile fare in modo che frammenti di una certa lunghezza non entrino nel gel (trapping). Questo metodo può servire per isolare i frammenti desiderati recuperandoli direttamente dal pozzetto. 66 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Escherichia coli Inoculo e crescita dei batteri Materiale - Terreno di coltura LB liquido: bacto triptone 10 g estratto di lievito 5 g NaCl 10 g Correggere il pH a 7.2 con NaOH. Portare a volume la soluzione fino a 1 litro con acqua deionizzata. Autoclavare - Antibiotico per il quale i batteri inoculati possiedono la resistenza (Æ per una trattazione sugli antibiotici vedere la sezione “clonaggio”) 1. Versare 5 ml di LB contenente l’antibiotico adatto in un tubo da 12-15 ml. 2. Prelevare con un puntale (o stuzzicadenti) sterile una colonia batterica ed inocularla nel tubo con il terreno di coltura. Per inoculare la colonia batterica servono tubi e puntali sterili, accanto ad un ambiente privo di possibilità di contaminazioni, come possono essere una cappa sterile o, spesso più efficace, un “microambiente” nelle vicinanze (una decina di centimetri circa) della fiamma creata da un becco bunsen. La paradossale maggiore sterilità di un lavoro su bancone con un becco bunsen rispetto all’uso di una cappa sterile, si giustifica col fatto che troppo spesso queste non presentano filtri e ambienti in grado di creare un ambiente effettivamente privo di residui microbici (ad esempio i filtri non vengono cambiati). 3. Chiudere il tubo e fermare il tappo con un pezzo di nastro adesivo. Avvitare e poi svitare di circa mezzo giro se tappo a vite; far fare al tappo solo uno scatto se tappo con chiusura a due posizioni. In questo modo il tubo non è sigillato e consente il passaggio dell’aria, indispensabile per colture aerobie. 4. Incubare in camera di crescita o/n a 37°C in forte agitazione, per consentire un’adeguata aerazione. (dove o/n = overnight) RACCOLTA DEI BATTERI 1. Prelevare 1.5 ml di coltura e porli in un tubo tipo Eppendorf. Trascorso il tempo di incubazione della coltura, prendere il tubo dalla camera di crescita e risospendere i batteri che tendono a precipitare sul fondo.Per la risospensione si può semplicemente agitare il tubo (dopo averlo ben chiuso) 2. Centrifugare a 12000 x g per 30 sec. RT (dove RT = Room Temperature) Sulla centrifuga di solito sono indicate le rivoluzioni per minuto (rpm): per calcolare 12000 x g si dovrebbe considerare il raggio del rotore. In realtà, lo scopo di questo passaggio di centrifugazione è solo quello di separare le cellule batteriche dal mezzo di coltura, quindi è sufficiente centrifugare a massima velocità per circa 30 sec. Si ottiene così un pellet sufficientemente compatto da poter esser separato dal surnatante, ma senza del resto impaccare eccessivamente i batteri. 3. Versare il surnatante e capovolgere il tubo su carta. 67 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne E’ importante rimuovere completamente il mezzo di coltura per evitare di diluire le concentrazioni delle soluzioni successive (che quindi potrebbero diventare meno efficienti) e di lasciare sostanze che in seguito inibiscano gli enzimi utilizzati. Il risultato è un pellet compatto e biancastro di cellule batteriche. Semina batterica in piastra Preparazione delle piastre Nella preparazione delle piastre si deve considerare il vettore utilizzato: nel caso in esame la selezione delle colonie trasformate è data dalla resistenza all’ampicillina, mentre le colonie ricombinanti sono riconosciute dalla inattivazione del gene lacZ per saggio colorimetrico con IPTG e X-gal (substrato della β-galattosidasi). L’IPTG induce il promotore del gene lacZ il cui prodotto, degradando l’X-gal, rende possibile distinguere le colonie ricombinanti (bianche: gene lacZ inattivato) da quelle non ricombinanti (blu) Se necessario, si procede alla preparazione delle piastre con terreno LB selettivo aggiungendo al terreno di coltura LBagar non ancora solidificato, le definite quantità di antibiotico (es. ampicillina), IPTG e X-GAL riportate di seguito: TERRENO LB SELETTIVO Componente aggiuntivo Ampicillina IPTG X-GAL Concentrazione 100 γ (100 μg /ml) 0.5 mM 40 μg/ml L’antibiotico non può essere aggiunto al terreno prima della sterilizzazione in autoclave perché è termolabile, viene perciò direttamente versato nella piastra petri tramite per filtrazione. 1. In goccie separate porre sulla piastra 25 μl di antibiotico e 25 μl di IPTG 0.5M. È utile aggiungere in goccie separate per evitare interazioni tra i solventi ed errori dell’operatore. 2. Aggiungere terreno LB agarizzato. Il terreno ancora liquido non deve essere né troppo freddo (non permette il miscelamento di antibiotico, IPTG X-gal), né troppo caldo (rovina l’antibiotico). Come regola generale la temperatura corretta è quella a cui è appena possibile tenere in mano la bottiglia. Poiché per ricoprire la piastra servono circa 25 ml di terreno, l’antibiotico e l’IPTG aggiunti vengono diluiti 1000 volte (concentrazione finale: Amp = 100 γ; IPTG = 0.5 mM; X-gal = 80 γ). L’ampicillina è attiva a concentrazioni pari a 50 –150 γ Nota: 1 γ = 1 μg/ml. 3. Aggiungere 50 μl di X-gal (20mg/ml) al terreno ancora liquido. X-GAL non deve mai essere aggiunto direttamente nelle piastre di interesse per non sciogliere la plastica della piastra, dato che il substrato è sciolto in dimetilformammide (per cui non è necessaria la filtrazione sterile). L’ordine di riempimento per le piastre e’: - IPTG - AP 100 γ - LB 25 ml - X-Gal Note: si deve mantenere il suddetto ordine per rispettare le diverse caratteristiche delle varie sostanze in modo che non vengano alterate interagendo tra loro, e soprattutto per poter così utilizzarle in differenti 68 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne concentrazioni nelle varie occasioni d’uso. Si versano quindi IPTG e Amp in due distinte parti della piastra, si aggiunge poi il terreno e solo da ultimo l’X-GAL. Calcolo quantità da aggiungere per piastra per n volume finale di 25 ml: IPTG : stock 0.5 M, conc. finale 0.5 mM Æ 25 μl Amp : stock 100 mg/ml, conc. finale 100 μg/ml Æ 25 μl X-GAL : stock da 20 mg/ml , conc. finale 40μg/ml Æ 50 μl 4. Ruotare immediatamente la piastra in modo da distribuire uniformemente i tre composti. Impilare le piastre e ruotarle attentamente seguendo la rosa dei venti (due rotazioni in senso orario, due in senso antiorario, su, giù, diagonalmente e infine due rotazioni di assestamento). 5. Lasciare solidificare la piastra aperta sotto cappa. Le piastre devono perder umidità prima di esser utilizzate, per cui si devono tener sotto cappa sterile o sul bancone vicino al bunsen (raggio d’azione 10 cm) parzialmente aperte per almeno mezzora; bisogna infatti attendere che il terreno solidifichi e si raffreddi. Piastratura (plating) 1. Piastrare su LB agarizzato contenente antibiotico, distribuendo omogeneamente le cellule. Il volume di sospensione da piastrare va calibrato in funzione del grado di disidratazione del terreno,per evitare che l’agar assorba troppa acqua. Quando si esegue la selezione con ampicillina non si piastra tutta la sospensione a disposizione poiché con alta densità di colonie c‘è inibizione della crescita, a causa delle sostanze rilasciate dalle cellule uccise dall’antibiotico; inoltre si rischia un aumento del numero di colonie satelliti. NOTA: Se si piastra il contenuto di una trasformazione è buona norma usare tre piastre: 2 per diluizioni differenti (concentrata e diluita) e una di controllo per valutare l’efficienza di trasformazione delle cellule. Piastrare 100 μl di campione (piastra diluita), centrifugare per 30" la sospensione batterica rimanente (1,1 ml), versare il surnatante, risospendere in circa l00 μl e piastrare tutto (piastra concentrata circa 10 volte rispetto alla diluita). 2. Distribuire omogeneamente le cellule sulla superficie del terreno spatolando con movimento ellittico oppure aggiungendo sfere di vetro e ruotando le piastre fino a quando il liquido sul terreno risulta assorbito. 3. Incubare o/n a 37 °C (capovolgendo le piastre per evitare la condensa). 69 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Antibiotici Filtrare antibiotici: gli antibiotici si sciolgono in acqua o in alcol etilico in genere (Amp Æ acqua) e vanno sterilizzati tramite filtrazione : ¾ 0.28 μm Æ filtro per virus ¾ 0.45 μm Æ filtro per batteri In condizioni normali non si lavora con virus quindi, sono sufficienti i filtri per batteri, meno costosi e lo stesso efficaci. La sterilizzazione in autoclave non è adeguata perché provoca denaturazione del principio attivo dell’antibiotico. L’ampicillina e’ un inibitore degli enzimi deputati alla sintesi della parete cellulare; e’ disattivata tramite degradazione all’esterno della cellula (che catalizza idrolisi del β-lattame con concomitante detossificazione dell’antibiotico stesso). I meccanismi che determinano l’antibiotico resistenza sono differenti in base all’antibiotico stesso, di conseguenza per rendere delle colonie resistenti si devono attendere tempi diversi durante l’incubazione a 37 °C. Per l’ampicillina si deve attendere un’ora affinché le cellule si dividano e aumentino la produzione e il livello di espressione della proteina (β-lattamasi) atta a detossificare all’esterno della cellula l’antibiotico stesso. L’ampicillina essendo continuamente degradata cala di concentrazione con il tempo, e ciò va a vantaggio delle colonie non resistenti che si possono sviluppare intorno alla colonia resistente: le colonie satelliti. Il fenomeno diventa tanto più evidente quanto più lungo è il tempo di incubazione a 37°C (attendere al massimo 12-18 ore dall’inoculazione). Tanto minore è la concentrazione dell’antibiotico nella piastra e tanto più è probabile la sua degradazione, quindi, la formazione di colonie satellite o comunque non realmente resistenti (e quindi non trasformate). La concentrazione ottimale per l’ampicillina è 100-150 γ, ovvero partendo da uno stock di Amp 100 = 100 mg/ml, si usi una concentrazione di lavoro pari a 100 γ = 100 μg/ml. Il problema della degradazione dell’ampicillina può essere risolto con l’uso di un altro antibiotico meno sensibile alla βlattasi e quindi più difficilmente degradabile: la carbenicillina. La concentrazione ottimale d’utilizzo è compresa tra 50 e 100 μg/ml. Antibioticb Ampicillinc Stock conc. (mg/ml) Final conc. (µg/ml) 4 50 10 20 D-Cycloserine,d in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 8 10 200 Gentamycin 10 15 Kanamycin 10 30 Kasugamycin 10 1000 5 15 Rifampicin,e in methanol 34 150 Spectinomycin 10 100 Chloramphenicol sciogliere in metanolo oppure in etanolo Nalidixic acid, pH to 11 with NaOH Mode of action Mode of resistance Bacteriocidal; only kills growing E. coli; inhibits cell wall synthesis by inhibiting formation of the peptidoglycan cross-link Bacteriostatic; inhibits protein synthesis by interacting with the 50S ribosomal subunit and inhibiting the peptidyltransferase reaction Bacteriocidal; only kills growing E. coli; inhibits cell wall synthesis by preventing formation of Dalanine from L-alanine and formation of peptide bonds involving D-alanine Bacteriocidal; inhibits protein synthesis by binding to the L6 protein of the 50S ribosomal subunit Bacteriocidal; inhibits protein synthesis; inhibits translocation and elicits miscoding β-lactamase hydrolyzes ampicillin before it enters the cell Bacteriocidal; inhibits protein synthesis by altering the methylation of the 16S RNA and thus an altered 30S ribosomal subunit Bacteriostatic; inhibits DNA synthesis by inhibiting DNA gyrase Bacteriostatic; inhibits RNA synthesis by binding to and inhibiting the β subunit of RNA polymerase; rifampicin sensitivity is dominant. Bacteriostatic; inhibits 70 Chloramphenicol acetyltransferase inactivates chloramphenicol Mutations destroy the D-alanine transport system Aminoglycoside acetyltransferase and aminoglycosidenucleotidyltransferase inactivate gentamycin; mutations in rplF (encodes the L6 protein) prevent the gentamycin from binding Aminoglycoside phosphotransferase, also known as neomycin phosphotransferase, aminoglycoside acetyltransferase, and aminoglycoside nucleotidyltransferase; inactivates kanamycin Mutations prevent kasugamycin from binding to the ribosome; mutations decrease uptake of kasugamycin Mutations in the host DNA gyrase prevent nalidixic acid from binding Mutation in the β subunit of RNA polymerase prevents rifampicin from complexing; rifampicin resistance is recessive Mutations in rpsE (encodes the S5 protein) prevent 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Streptomycin 50 30 Tetracycline,e in 70% ethanol 12 12 translocation of peptidyl tRNA from the A site to the P site Bacteriocidal; inhibits protein synthesis by binding to the S12 protein of the 30S ribosomal subunit and inhibiting proper translation; streptomycin sensitivity is dominant Bacteriostatic; inhibits protein synthesis by preventing binding of aminoacyl tRNA to the ribosome A site Massimo Delledonne spectinomycin from binding; spectinomycin sensitivity is dominant and resistance is recessive Aminoglycoside phosphotransferase inactivates streptomycin; mutations in rpsL (encodes the S12 protein) prevent streptomycin from binding; streptomycin resistance is recessive Active efflux of drug from cell a Data assembled from Foster (1983), Gottlieb and Shaw (1967), and Moazed and Noller (1987). b All antibiotics should be stored at 4°C, except tetracycline, which should be stored at –20°C. All antibiotics should be dissolved in sterile distilled H O unless 2 c Carbenicillin, at the same concentration, can be used in place of ampicillin. Carbenicillin can be stored in 50% ethanol/50% water at -20 C. d D-cycloserine solutions are unstable. They should be made immediately before use. e Light-sensitive; store stock solutions and plates in the dark. 71 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne MINIPREPARAZIONE DI DNA PLASMIDICO Preparazione di DNA plasmidico tramite lisi alcalina (MINIPREP MANIATIS) - Prelevare 1.5 ml di coltura batterica cresciuta o/n L’estrazione del DNA plasmidico deve esser effettuata a partire da colture fresche, in quanto l’utilizzo di colture vecchie potrebbe influenzare negativamente la corretta purificazione del DNA a causa dell’accumulo di metaboliti secondari. La quantità esatta di coltura batterica prelevata non è importante: si tende tuttavia a riempire l’eppendorf per massimizzare la quantità di DNA estratto. Non è indispensabile l’utilizzo di una cappa sterile: l’eventuale presenza di DNasi esogene viene contrastata con l’utilizzo, nelle fasi successive, di EDTA. - Centrifugare per 30’’ a 12000 rpm e eliminare il supernatante. L’operazione può essere effettuata a 4°C o a temperatura ambiente indipendentemente: una volta si operava con microcentrifughe refrigerate per rallentare il metabolismo cellulare e quindi ridurre l’azione delle nucleasi. Oggi si ritiene superflua questa operazione e si preferisce operare a temperatura ambiente(23-25°C).Il tempo e la velocità della centrifugazione devono essere tali da consentire la formazione di un pellet più o meno compatto(quelli riportati sono valori di centrifugazione indicativi: se il pellet è instabile procedere con un’ulteriore centrifugazione). Per eliminare il surnatante è sufficiente versare il contenuto del tubo capovolgendolo e picchiettarlo leggermente, con tappo aperto, su carta cercando di allontanare le eventuali goccioline di terreno residue: tale operazione consente di non modificare le concentrazioni delle tre soluzioni in seguito utilizzate. 1. Risospendere il pellet batterico in 100 µl di Soluzione I. Per la risospensione si può utilizzare il vortex o il puntale di una pipetta, in quanto le cellule sono ancora integre ed il DNA è protetto. 2. Aggiungere 200 µl di Soluzione II. Mescolare capovolgendo il tubo due o tre volte. In questa fase la soluzione alcalina provoca la lisi delle cellule e la denaturazione e precipitazione delle molecole di DNA genomico e plasmidico. Quindi, le molecole di DNA diventano estremamente fragili, per questo si deve mescolare adeguatamente ma evitando azioni troppo energiche (vortex) per non rompere meccanicamente il DNA stesso. Si ottiene un lisato cellulare viscoso e biancastro. 3. Aggiungere 150 µl di soluzione III entro 2-3 minuti dall’aggiunta della Soluzione II e mescolare capovolgendo il tubo due o tre volte Anche in questo caso non vortexare per non di rompere il DNA. Con l’aggiunta della soluzione III si riporta il lisato cellulare a pH che consentono la rinaturazione del DNA plasmidico. Il tempo di attesa che precede l’aggiunta della soluzione III è fondamentale per la separazione del DNA plasmidico dal genomico: il DNA plasmidico, proprio perché superavvolto e di piccole dimensioni, se mantenuto in condizioni di lisi per un tempo non superiore ai 3-4 minuti riesce a rinaturare, mentre il DNA genomico e le proteine rimangono intrappolate irreversibilmente nel complesso formato da potassio e SDS. Nel caso la soluzione II venisse lasciata agire per periodi più lunghi, il DNA plasmidico sarebbe comunque in grado di rinaturare ma assumerebbe una conformazione tale da risultare inattaccabile dagli enzimi di restrizione. 4. Centrifugare a massima velocità per 5 min. e recuperare il supernatante in un nuovo tubo Questo tempo deve essere rispettato per permettere la sedimentazione dei residui cellulari. Si consiglia di prelevare una quantità di surnatante non superiore a 500μl in vista dall’aggiunta di un volume doppio di etanolo nelle fasi successive. 72 3 ottobre 2008 5. Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne OPZIONALE : Trattamento con fenolo-cloroformio per eliminare le proteine rimanenti. Questo trattamento è spiegato in dettaglio più avanti 6. Precipitare il DNA con due vol. di etanolo (100% v/v) oppure con 0.6 vol. di isopropanolo. L'etanolo è aggiunto al 100% per ottenere una soluzione finale al 70%. Per esempio: a 100 µl di DNA si aggiungono 200 µl di etanolo assoluto oppure 60 µl di isopropanolo. In questa fase è necessario capovolgere il tubo delicatamente: il DNA deve venire a contatto con l’alcol per precipitare. 7. Centrifugare a 12000 g per 5 min. Se il DNA è sporco è possibile vedere il pellet bianco sul fondo del tubo. Se è presente una grande quantità di polisaccaridi il pellet è mucillaginoso. 8. Rimuovere il supernatante e lavare con etanolo 70% v/v. Per eliminare l’etanolo capovolgere la provetta aperta e scuoterla leggermente su un pezzo di carta, oppure effettuare un breve passaggio in centrifuga (30” a massima velocità) per far scendere eventuali goccioline sul fondo del tubo e quindi aspirarle con una micropipetta. Il lavaggio con EtOH 70% serve a eliminare i sali rimasti. Versare nel tubo circa 500 μl di EtOH 70%. 9. Rimuovere completamente l’etanolo e lasciare seccare all’aria per 10 minuti. Per eliminare l’etanolo aspirarlo con una micropipetta senza rompere il pellet, eventualmente ripetere una breve centrifugazione come spiegato al punto 8. E’ importante che il pellet sia completamente asciutto perché la presenza di tracce di etanolo determina una scarsa risospensione del DNA e, soprattutto, ne provoca la fuoriuscita dal pozzetto quando si effettua il caricamento su gel di agarosio per un’elettroforesi. Questo passaggio può esser velocizzato ponendo la provetta in un luogo ben aerato, per esempio in una cappa a flusso laminare. 10. Risospendere il DNA plasmidico in 50 µl di TE pH 8.0. Si risospende in TE per evitare il pericolo di degradazione del DNA da parte delle DNAsi, infatti, la presenza di EDTA nel TE garantisce protezione dalle DNAsi 11. Conservare a 4°C. Se si risospende in acqua si deve conservare a –20°C (la bassa temperatura blocca le DNAsi) MATERIALI - Soluzione I: 50 mM glucosio 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM EDTA (pH 8.0) Alla Sol. 1 è possibile aggiungere RNasi (10 mg/ml) per eliminare l’RNA, in quantità di 1 μl per ml di soluzione. - Soluzione II 0.2 N NaOH 1% SDS 73 3 ottobre 2008 - Soluzione III 5M potassio acetato acido acetico glaciale acqua Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne 60 ml 11.5 ml 28.5 ml Per ottenere tale soluzione è necessario partire da 29.44 g di potassio acetato in 60 ml di acqua (il che dà una diluizione 5 M) quindi, aggiungere 11.5 ml di acido acetico glaciale e i rimanenti 28.5 ml di acqua, per giungere ad un volume di 100 ml di soluzione III. La soluzione finale conterrà potassio 3M e acetato 5M. NOTE Secondo la procedura della lisi alcalina, il DNA plasmidico è preparato piccole quantità di diverse colture (1-24) di batteri contenenti plasmidi. I batteri sono lisati da un trattamento con una soluzione contenente sodio dodecil solfato SDS ( denatura le proteine batteriche) e NAOH (denatura il DNA plasmidico e cromosomale). La miscela è neutralizzata con potassio acetato che permette la rinaturazione del DNA plasmidico a differenza di quello genomico. La maggior parte del DNA cromosomale e le proteine batteriche precipitano-così come l'SDS che forma un complesso con il potassio- e sono rimosse da una centrifugazione. Il DNA plasmidico rinaturato, che rimane nel supernatante, viene concentrato per precipitazione in etanolo. Si possono distinguere tre fasi operative cui riferirsi anche per la descrizione di altri protocolli di estrazione del DNA: Lisi alcalina: lisi delle cellule batteriche mediante l’uso di una soluzione alcalina che provoca la denaturazione e la precipitazione di tutte le componenti cellulari, ad eccezione del DNA plasmidico che rimane in soluzione. 2. Trattamento Fenolo:Cloroformio: purificazione del DNA plasmidico estratto mediante un passaggio che prevede l’uso del fenolo:cloroformio. 3. Precipitazione e risospensione del DNA: operazione che prevede la precipitazione ed il lavaggio del DNA, seguito da risospensione in TE 1. L’estrazione del DNA plasmidico deve esser effettuata a partire da colture fresche, in quanto l’utilizzo di colture vecchie potrebbe influenzare negativamente la corretta purificazione del DNA a causa dell’accumulo di metaboliti secondari. La Soluzione I è necessaria per risospendere le cellule e porle nelle condizioni adatte alla successiva lisi. Il glucosio: rende la soluzione isoosmotica; la sua presenza impone la sterilizzazione in autoclave della soluzione per evitare lo sviluppo di muffe. Il tampone Tris-Cl (pH 8.0) : fornisce potere tamponante, viene equilibrato con HCl a valori prossimi ad 8.0 , che è il pH ideale per mantenere in soluzione il DNA nella sua forma a doppio filamento. L’ EDTA (pH 8.0): è necessario per sequestrare (chelare) gli ioni bivalenti, in particolare impedisce agli ioni Mg2+ di agire da coenzimi per DNasi, rendendole inattive. Questo garantisce l’estrazione e la conservazione di DNA integro in qualsiasi condizione di lavoro, tranne nel caso in cui operino enzimi di restrizione. L’EDTA, inoltre, chela gli ioni Ca2+ indebolendo la parete cellulare, evitando l’utilizzo di lisozima (se non in presenza di microrganismi recalcitranti) che ha lo svantaggio di ricoprire il DNA di impurezze se usato per più di 2 minuti. FACOLTATIVO: alla Sol. 1 è possibile aggiungere RNasi (10 mg/ml) per eliminare l’RNA, in quantità di 1 μl per ml di soluzione. Se non si aggiunge RNAsi alla soluzione I e non si tratta con fenolo-cloroformio restano residui di RNA e proteine. Nella corsa elettroforetica l’RNA tende a trascinare il DNA che così non darà bande nette. La Soluzione II provoca la lisi alcalina delle cellule. La soluzione fresca ha maggior capacità alcalinizzante, che viene persa col passare del tempo. L’NaOH permette la lisi alcalina con la quale il DNA genomico e plasmidico denaturano e precipitano. L’SDS è un detergente che in ghiaccio precipita perdendo di efficacia, quindi, la soluzione II non va mantenuta in ghiaccio. L’SDS è di difficile preparazione: a temperature elevate si impacca mentre a basse temperature non si scioglie completamente. Risulta necessario utilizzare acqua calda a 70°C in cui versarlo mantenendo in agitazione l miscela. Precipitazione con 0.6 vol di isopropanolo: L’utilizzo di isopropanolo presenta alcuni vantaggi: vengono aggiunti solo 0.6 vol, permette di ottenere la precipitazione di volumi maggiori di soluzione e può essere utilizzato a temperatura ambiente. Di contro però non evapora rapidamente e rende comunque necessario un lavaggio con etanolo per la sua rimozione. 74 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne QIAprep Spin Miniprep Kit - Prelevare 1.5 ml di coltura batterica cresciuta o/n - Centrifugare per 30’’ a 12000 rpm ed eliminare il supernatante. E’ sufficiente versare il contenuto del tubo e picchiettarlo leggermente, con tappo aperto, su carta. 1. Risospendere il pellet batterico in 250 µl di Buffer P1. Assicurarsi che sia stata aggiunta l’Rnasi al Buffer P1 (altrimenti l’RNA, trattenuto dalla silice, satura la resina). 2. Aggiungere 250 µl di Buffer P2. Non lasciar agire per più di 2-3 minuti (la soluzione P2 è la soluzione di lisi alcalina: se fatta agire per tempo prolungato, il DNA plasmidico rinaturerebbe male e sarebbe inattaccabile dagli enzimi di restrizione. 3. Aggiungere 350 µl di Buffer N3e. E’ importante mescolare finché la soluzione non diviene torbida, per permettere un’omogenea distribuzione del tampone di neutralizzazione. 4. Centrifugare per 10 min. a 12000 rpm. Nel frattempo porre la colonna in un tubo da 2 ml. 5. Effettuare il primo trattamento su colonna di silice, trasferendo il supernatante ottenuto sulla colonna stessa, fornita dal kit. Questo trattamento sostituisce il trattamento con fenolo:cloroformio e si effettua trasferendo con una micropipetta, il surnatante ottenuto dalla centrifugazione del punto 4. 6. Centrifugare per 30-60’’. Staccare quindi la colonnina, eliminare il liquido ottenuto e rimettere a posto la colonnina nel tubo da 2 ml. Per alcuni ceppi batterici è necessario a questo punto effettuare un lavaggio con 0.5 ml di tampone PB e poi centrifugare per 30-60 secondi. Questo step è necessario per rimuovere tracce di attività nucleasica quando si lavora con ceppi come la serie JM, HB101 e derivati, o con qualsiasi filamento wild-tipe che hanno alti livelli di attività nucleasica o un alto contenuto in carboidrati. Con ceppi come XL-1 Blue e DH5α non è necessario. 7. Lavare la colonna con 0.75 ml di Buffer PE e centrifugare per 30-60’’. Il Buffer PE è una soluzione di lavaggio che contiene etanolo. 8. Eliminare il Buffer PE e ricentrifugare 1 min. per rimuovere eventuali tracce di etanolo. È importante rimuovere completamente l’etanolo per diversi motivi: - il DNA non si stacca dalla resina, - potrebbe inibire successive reazioni enzimatiche, - impedirebbe al campione di esser poi utilizzato per un’eventuale elettroforesi, perché nel caricamento le tracce di etanolo lo farebbero uscire dai pozzetti. 9. Porre la colonnina in un nuovo tubo da 1.5 ml pulito aggiungere 50 µl di TE, direttamente nella colonna e attendere 5-10 min; centrifugare 1 min. 75 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Il kit suggerisce di risospendere in tampone EB che contiene Tris HCl 10 mM, pH 8.5, ma non EDTA. Di conseguenza non è in grado di proteggere il DNA dalle nucleasi, mentre la miscela Tris ed EDTA del TE garantisce la conservazione del materiale estratto a 4°C per lungo periodo. Il volume di risospensione può variare dai 30 ai 50 µl; l’importante è tenere conto delle dimensioni della colonna e assicurarsi che la resina venga interamente bagnata. NOTE Il protocollo permette di purificare fino ad un massimo di 20 μg di DNA plasmidico , partendo da 1.5 ml di coltura fresca in LB, di ceppi di E.coli caratterizzati dalla capacità di mantenere un elevato numero di copie. La quantità di coltura non è assoluta: dipende dal numero di copie plasmidiche e dalla velocità di crescita batterica. Per ottimizzare la quantità di batteri da trattare, si può fare l’estrazione con una quantità doppia di batteri ed osservare qual è il limite massimo della colonna utilizzata (in questo modo è possibile stimare il numero di plasmidi per batterio conoscendo la concentrazione batterica). Questo protocollo si distingue dal Maniatis Miniprep perché il DNA viene purificato tramite il passaggio in una colonnina contenente silice. Si distinguono due fasi operative: 1. Lisi alcalina: il principio è analogo a quello utilizzato dalla Magnatis Miniprep, ovvero la lisi cellulare avviene in condizioni alcaline, tutte le componenti cellulari sono denaturate e fatte precipitare, ad eccezione del DNA plasmidico che rimane in soluzione. 2. Purificazione del DNA su colonnina di silice: il DNA plasmidico viene purificato facendo passare la soluzione ottenuta nella prima parte attraverso una colonnina piena di silice, in grado di trattenere gli acidi nucleici. Come funziona questo kit: Le colonnine contengono silice impaccata. La soluzione contenente il DNA, un’alta concentrazione di sali e 30-50% etanolo è fatta passare per centrifugazione attraverso la resina. In questo modo si ha il binding del DNA (dato che a queste condizioni è semidenaturato, esponendo così le cariche negative responsabili del legame). Il distacco dalla resina è dato dal passaggio di una soluzione a basse concentrazioni di sali e priva di etanolo. Attivazione della resina con guanidina isotiocianato. - Oggi i Kit sono ottimizzati per utilizzare volumi uguali delle varie soluzioni. - Conoscendo la composizione delle soluzioni I, II e III è possibile confrontare il primo protocollo con il secondo ed eventualmente rifare le soluzioni del kit o creare varianti. Buffer P1 = Soluzione I miniprep Buffer P2 = Soluzione II miniprep Buffer N3 = Soluzione III miniprep (previa aggiunta di guanidina isotiocianato?) Le soluzioni dei kit sono fornite infatti senza informazioni allegate, ma dall’esperienza di miniprep per estrazione di DNA e dal protocollo stesso si può inferire senza troppe approssimazioni la loro composizione. Soluzione P1 Soluzione isosmotica per stabilizzare il DNA conterrà: * Tris-HCl a pH 8.0, ideale per il DNA * EDTA: chelante del magnesio * RNasi: eliminano l’eventuale RNA presente, così che non si saturi subito la resina e si recuperi di conseguenza meno DNA. Soluzione P2 Dato il tempo ridotto (max 5’) con cui il tampone può stare a contatto col DNA, si comprende che questa sia la soluzione per lisi alcalina, contenente NaOH che aumenta il pH fino a 12, e SDS che denatura proteine e DNA. Ricordiamo infatti che la denaturazione del DNA plasmidico è reversibile solo se non si fa agire troppo a lungo la soluzione. Soluzione N3 Già la diversa dicitura fornita dal Kit: “N” invece di “P”, fa intendere come questa sia una soluzione di Neutralizzazione, ovvero necessaria per ripristinare il pH intorno alla neutralità, salificando il mezzo. 76 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Magic miniprep 1. Centrifugare 1-1.5 ml di coltura batterica per 30 sec a 12000 rpm e successivamente scartare il surnatante. E’ sufficiente versare il contenuto del tubo e picchiettarlo leggermente, con tappo aperto, su carta. 2. Risospendere in 200 μl di Sol. 1 Rnasi devono essere contenute nella soluzione 1 per evitare la saturazione della resina con RNA. 3. Aggiungere 200 µl di Sol. 2 Agitare capovolgendo l’eppendorf. Non lasciar agire per più di 2-3 minuti (la soluzione 2 è la soluzione di lisi alcalina: se fatta agire per tempo prolungato, il DNA plasmidico rinaturerebbe male e sarebbe inattaccabile dagli enzimi di restrizione. 4. Aggiungere 200 μl di Sol. 3 Con l’aggiunta della soluzione 3 si riporta il lisato cellulare a pH che consentono la rinaturazione del DNA plasmidico. 5. Agitare e centrifugare per 5 min. 6. Recuperare il surnatante (circa 500 μl) e versarlo in una nuova eppendorf. 7. Aggiungere 1 ml di resina attivata Agitare bene perché la resina tende a sedimentare. La quantità di resina influisce sulla quantità di DNA trattenuto 8. Attaccare alla colonnina una siringa da 3 ml senza stantuffo 9. Versare il campione nella siringa, inserire delicatamente lo stantuffo tenendo la colonnina ben salda alla siringa. 9. Spingere delicatamente lo stantuffo versando il liquido nei rifiuti. Attenzione ad evitare schizzi e usare i guanti poiché il liquido contiene guanidina tiocianato. 10. Staccare la colonnina dalla siringa e solo successivamente estrarre lo stantuffo. L’estrazione dello stantuffo quando la colonnina è ancora attaccata alla siringa determina lo spostamento della resina e del filtro che sta alla base della colonnina con conseguente forte rischio di perdita del campione. 11. Riattaccare la siringa alla colonnina 12. Versare nella siringa 2 ml di Wash Magic e reinserire appena lo stantuffo. 13. Spingere delicatamente lo stantuffo versando il liquido nei rifiuti. 14. Disporre la colonnina su un tubo eppendorf e centrifugare per 30 sec a massima velocità. 77 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Scopo: rimuovere ogni traccia della soluzione di lavaggio. 15. Disporre la colonnina su un nuovo tubo eppendorf. Aggiungere direttamente nella colonna 50 μl di TE (sulla resina, ma senza toccarla) e attendere 3-4 min. 16. Centrifugare 30 sec a massima velocità. Questo passaggio permette di staccare il DNA dalla resina e di recuperarlo nell’eppendorf sospeso in 50 μl di TE. Se il plasmide fosse di dimensioni maggiori di 10 kb o se si usasse DNA genomico, per la solubilizzazione finale usare TE preriscaldato a 65° C circa. 17. Conservare a 4°C. Soluzione 1 50 mM Tris-HCl pH 7.5 (importante che sia 7.5 e NON 8.0) 10 mM EDTA pH 8.0 100 μg/ml RNasi A Soluzione 2 0.2 N NaOH 1 % SDS Soluzione 3 1.32 M Potassio acetato pH 4.8 Wash Magic 200 mM NaCl 20 mM Tris-HCl pH 7.5 5 mM EDTA pH 8.0 Diluire 1:1 con EtOH 95% RIGENERAZIONE DELLA COLONNA Liberare le colonnine (Promega A7211) dalla resina ponendole in acqua calda in agitazione per 15 min. (agitazione troppo lenta non fa uscire la resina dalel colonnine, agitazione troppo violenta o troppo prolungata determina il distacco del filtro interno) Ripetere 3-4 volte rimettendo ogni volta acqua pulita. L’ultimo lavaggio deve essere eseguito con acqua demineralizzata o deionizzata. Asciugare le colonne che sono pronte ad un nuovo uso. Il recupero delle siringhe prevede un semplice lavaggio in acqua corrente. PREPARAZIONE DELLA RESINA Agitare 25 g di terra di diatomeee (Sigma D5384) in 500 ml di acqua e lasciare sedimentare per 3 ore. Rimuovere il surnatante contenente le particelle più fini che rimangono in sospensione. Aggiungere acqua a 100 ml e agitare per risospendere la matrice. La concentrazione finale della resina è 250 mg/ml. Conservare la soluzione con la resina a temperatura ambiente (stabile per diversi anni). Risospendere accuratamente la soluzione con la resina ogni qualvolta debba essere utilizzata. Aggiungere 1 ml della soluzione contenente la resina (250 mg/ml) a 25 ml di 4 M guanidina tiocianato, 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 20 mM EDTA. La guanidina tiocianato ha la funzione di attivare la resina, conferendole carica positiva. In tal modo la resina può legare il DNA carico negativamente per attrazione elettrostatica. Conservare la resina attivata a temperatura ambiente per non più di 6 mesi, dopo i quali perde le capacità di legame. 78 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne ISOLAMENTO DI DNA GENOMICO DA TESSUTI VEGETALI Per l’estrazione di DNA genomico da tessuti vegetali non esiste un protocollo universale a causa delle considerevoli variazioni riscontrabili in specie diverse. Generalmente però le procedure di estrazione del DNA da tessuti vegetali devono comprendere i seguenti punti: 1- Rottura della parete cellulare per permettere il rilascio dei costituenti cellulari. Questo viene di solito effettuato meccanicamente congelando il tessuto con azoto liquido e macinandolo con pestello nel mortaio. Congelando il tessuto infatti lo si rende duro e quindi più fragile. Esistono anche sistemi enzimatici per digerire la parete ma non sono efficienti; 2- Distruzione delle membrane cellulari per permettere il rilascio del DNA nel tampone di estrazione, e precipitazione selettiva delel componenti indesiderate (proteine, polisaccaridi etc). Per questo si utilizza SDS o CTAB; 3- Protezione del DNA dalle nucleasi endogene, che nei tessuti vegetali sono abbondanti, utilizzando EDTA. La miscela tessuto più tampone può anche essere emulsionata con cloroformio o fenolo per denaturare e separare le proteine dal DNA; 4- Trasferimento del campione ancora congelato, ma senza azoto liquido, nella eppendorf e aggiunta immediata del tampone di estrazione. Il DNA infatti, una volta rotta la cellula non deve venire a contatto con quei componenti (es. polisaccaridi) che si legherebbero ad esso compromettendone così la purezza. Il campione deve quindi scongelarsi in presenza del tampone che impedisce il legame con altre molecole. Il tampone di estrazione in genere contiene: - Tris-HCl pH 8.0 - NaCl - EDTA - SDS - ß- mercaptoetanolo - Rnasi Il ß-mercaptoetanolo è un agente riducente utilizzato come antiossidante. Rompe i ponti disolfuro contribuendo alla denaturazione delle proteine; deve essere aggiunto al momento dell’utilizzo della soluzione perché è volatile. E’ consigliabile usare come campioni tessuti giovani. Nel caso della foglia prelevare nella parte centrale evitando le nervature. L’apice fogliare deve essere eliminato perché costituito da cellule vecchie che sono grandi (quindi a parità di peso in una foglia giovane c’è più DNA), con vacuoli estesi e ricche di sostanze quali polisaccaridi e polifenoli che creerebbero problemi durante l’estrazione. Per quanto riguarda i kit commerciali, per esempio i prodotti Qiagen, si ricorda che l’assenza della composizione delle singole soluzioni rende non verificabile per queste metodiche quanto scritto sopra. 79 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne DNeasy Plant Mini Kit 1. Pesare 100 mg circa di tessuto vegetale. Il protocollo prevede l’utilizzo di 100 mg di tessuto. Si consiglia però di utilizzarne un eccesso (150-200 mg circa) perchè con la macinazione si perde molto materiale. Prelevare tessuti giovani (la parte della foglia più giovane è quella centrale) in cui le cellule devono ancora crescere per distensione e devono ancora formare la parete cellulare, quindi sono prive di polisaccaridi, polifenoli… e altre sostanze che creerebbero problemi durante l’estrazione; evitare di prendere la nervatura centrale. 2. Macinare il tessuto in un mortaio con l’aiuto dell’azoto liquido. Preraffreddare mortaio e pestello in azoto liquido.Aggiungere il campione. Macinarlo fino a ridurlo ad una polvere finissima mantenendo sempre un po’ di azoto nel mortaio. Questa fase serve per rompere la parete cellulare. Durante questo passaggio si rischia di perdere fino al 50% del campione. Quest’ultimo e il mortaio devono essere completamente asciutti, altrimenti l’acqua crea un velo che fa scivolare il pestello sulla superficie del campione senza che questo si frantumi. E’ importante evitare l’evaporazione completa dell’azoto liquido: il campione non deve scongelare durante questa fase (evento evidenziato dal cambiamento di colore), altrimenti il DNA, non più protetto dal nucleo si lega a polisaccaridi in modo irreversibile. Trasferire il campione prima che scongeli in una eppendorf preraffreddata. Porre i campioni a –20°C per qualche min per lasciare evaporare l’azoto e fare in modo che il tampone seguente non congeli. 3. Aggiungere 400 μl di Buffer AP1 e 40 μl di RNasi A 10 mg/ml al campione ancora congelato. Non si devono formare degli agglomerati di tessuto perché ostacolano l’azione dei tamponi; qualora si formassero vanno rimossi o rotti con il puntale della pipetta o vortexando. 4. Incubare il campione per 10 min a 65 °C, invertendo il tubo 2-3 volte durante l’incubazione. In questa fase avviene la lisi cellulare. Le RNasi presenti degradano le molecole di RNA rilasciate. 5. Aggiungere 130 μl di Buffer AP2, mescolare e incubare per 5 min in ghiaccio. Durante questo passaggio precipitano le proteine, i polisaccaridi e il detergente.Se il campione risulta particolarmente viscoso, centrifugare 5 min alla massima velocità e recuperare il supernatante. 6. Applicare il lisato alla colonna setaccio QIAshredder posta su un tubo di raccolta da 2 ml e centrifugare 2 min alla massima velocità In questo modo si rompono i grumi. 7. Trasferire l’eluato in un nuovo tubo tipo eppendorf, evitando di trasferire anche il pellet. Annotare il volume esatto che viene raccolto per determinare la quantità di tampone da utilizzare in seguito. Normalmente vengono recuperati circa 450 μl di campione. 8. Aggiungere 1.5 volumi di Buffer AP3 (a cui è stato aggiunto l’ etanolo) e mescolare. 80 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne La concentrazione finale di etanolo deve essere sempre inferiore al 50 %. Dopo l’aggiunta dell’etanolo potrebbe formarsi un precipitato che in ogni modo non influenza le seguenti procedure. È possibile che alcune soluzioni siano costituite solo da buffer AP3 e l’etanolo venga fornito separatamente. Questo per ragioni di convenienza durante il trasporto dato che l’etanolo è considerato facilmente infiammabile. In questo caso aggiungere 0.5 volumi di Buffer AP3 e 1 volume di etanolo (96%-100%) rispetto al volume iniziale e mescolare. 9. Trasferire 650 μl di campione (compreso l’eventuale precipitato) su una colonna DNeasy mini posta su di un tubo eppendorf di raccolta. Non caricare più di 650 μl altrimenti in centrifuga il liquido può uscire. 10. Centrifugare per 1 min ad una velocità ≥ a 8000 rpm ed eliminare l’eluato. Non si deve centrifugare a 4°C altrimenti aumenta la viscosità della soluzione e l'estrazione viene compromessa 11. Riposizionare il tubo di raccolta svuotato del liquido sotto la colonna e ricentrifugare se è rimasto del liquido. 12. Porre la colonna DNeasy in un tubo di raccolta nuovo e aggiungere 500 μl di Buffer AW. Centrifugare per 1 min a 12000 g. Eliminare l’eluato. Riposizionare la colonna sul tubo. Questo passaggio serve per lavare il DNA legato alla resina. 13. Aggiungere 500 μl di Buffer AW e centrifugare 2 min. alla massima velocità. Posizionare la colonna su un tubo tipo eppendorf sterile. Centrifugare per 20 sec. Questa centrifugazione permette di asciugare la resina e di eliminare completamente l’etanolo. 14. Aggiungere 100 μl di TE, precedentemente riscaldato a 65 °C e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare per 1 min a 12000 g per eluire il DNA dalla colonna. Se si desidera ottenere DNA più concentrato é necessario eluire la resina con 50 μl di TE; in questo modo però la resa è minore. Non eluire con più di 200 μl altrimenti la colonna tocca la soluzione nella eppendorf. Si utilizza TE a 65°C quando si lavora con DNA genomico o DNA plasmidico ad alto peso molecolare per favorire il distacco dalla resina. Per bassi pesi molecolari invece si può utilizzare TE a temperatura ambiente. 15. Conservare il campione a 4°C. NOTE Gli stock di AP1 e AP3 potrebbero nel tempo precipitare; in questo caso basta ridissolverli ponendo le soluzioni in un bagnetto a 65°C. AP1 potrebbe diventare giallo durante la conservazione; questo non cambia le sue proprietà. AW è fornito concentrato: aggiungere etanolo al primo utilizzo. L’estrazione da matrici vegetali di DNA genomico pulito è particolarmente difficoltosa per la presenza di numerosi contaminanti (in particolare polisaccaridi) presenti in grandi quantità soprattutto in cellule adulte con vacuoli molto estesi. DNeasy Plant Mini Kit consente un’agevole estrazione e purificazione di DNA genomico vegetale grazie all’utilizzo di resine specifiche, che però consentono solo rese standardizzate (limite fisico delle resine). Inoltre, l’uso di resine non fornisce mai cromosomi integri; perciò il prodotto dell’estrazione va bene per amplificazioni di DNA tramite PCR, dove utilizzo frammenti non più grandi di 10-15 Kb. Questo protocollo però non va bene per la costruzione di librerie genomiche dove si utilizzano come vettori fagi di sostituzione, BAC o YAC. 81 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Metodo microprep Dellaporta 1. Macinare 100 mg circa di campione in mortaio, con azoto liquido Considerando una certa perdita di materiale nella fase di macinazione, si consiglia di impiegare una quantità di tessuto superiore, circa 150-200 mg 2. Trasferire il campione in un tubo eppendorf Conservare i campioni a –20°C che non devono mai scongelare prima dell’aggiunta del tampone EB. Attenzione a lasciare i tappi dei tubi leggermente aperti in modo che evapori l’azoto liquido rimasto a contatto dei tessuti. 3. Aggiungere 750 µl di EB, 0.5 μl di β-mercaptoetanolo e mescolare bene. È possibile aggiungere RNasi (2 µl di sol. 10 mg/ml per ogni campione) alla soluzione EB Il β-mercaptoetanolo è un agente riducente, utilizzato come antiossidante; rompe i ponti disolfuro contribuendo alla denaturazione delle proteine; deve essere aggiunto al momento dell’utilizzo della soluzione EB in quanto volatile. Quando si estrae da specie “difficili” si può aggiungere alla soluzione EB anche cisteina 30 mM o PVP 2% (come concentrazioni finali) per eliminare polifenoli e polisaccaridi. 4. Incubare 10 min. a 65°C. 5. Aggiungere 150 µl di K-acetato 5 M, agitare bene e porre in ghiaccio per 20 min. Il sale permette la precipitazione delle proteine. 6. Centrifugare a 12000 g per 10 min (mai oltre i 30 min). Prelevare il supernatante (fino a un massimo di 750 µl) Se è necessario bilanciare i tubi, impiegare K-acetato. 7. FACOLTATIVO: Aggiungere 1 volume di fenolo:cloroformio:isoamilico (25:24:1), mescolare bene, centrifugare 5 min. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo Eppendorf 8. Aggiungere 1 vol. di isopropanolo e mescolare capovolgendo 9. Centrifugare 1 min., versare il supernatante 10. Lavare il pellet con Etanolo 70% freddo, centrifugare 5 min. 11. Seccare il pellet e risospendere il DNA in 50 µl TE La fase di risospensione può essere accelerata ricorrendo all’uso di puntali per smuovere il pellet. Per favorire la risospensione si può porre l’eppendorf a 65°C. NOTE Questo protocollo è stato messo a punto per l’estrazione di DNA genomico da tessuti animali. Può essere utilizzato anche per l’estrazione di DNA da numerose specie vegetali. Il DNA estratto con il metodo Dellaporta rimane integro come dimensioni, ma trattiene parecchie impurità che ne diminuiscono la qualità. MATERIALI 82 3 ottobre 2008 - Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne EB 50 mM TRIS pH 8.0 10 mM EDTA pH 8.0 100 mM NaCl 1% SDS Aggiungere β-mercaptoetanolo (10 mM finale) al tampone utilizzato in giornata (circa 700 μl/l) Arabidopsis Genomic DNA Microprep Extraction Protocol (adapted from Dellaporta et.al Plant Mol. Biol Rep 1, 19-21 (1983)) 1. Turn H2O bath to 65ºC. 2. Use ~2 floral clusters for each extraction. Grind with a Kontes style pellet pestle (VWR catalog # KT749521-1590) and high speed drill in 750-800 µL EB in a 1.5 mL eppendorf tube. Grinding can also be done under liquid N2 but is not necessary. 3. Add 150 µL5M K-acetate, vortex, and incubate on ice for 20 min. Spin at 14K RPM in a microfuge for 5-10 min. 3b. (optional) Phenol:Chloroform:IAA / Chloroform Extract. 4. Transfer 750-800 µL of supernatant to a new 1.5 mL eppendorf tube and add an equal volume of isopropanol. Mix well by inverting and immediately spin down nucleic acids by centrifugation at 14K RPM for 2 min. 4b. (optional) RNase treat for 4-5 min with 1:20 dilution RNAse (10 mg/ml). 4c. Phenol:Choloroform:IAA / Chloroform extract and IPA precipitate. 5. Wash pellet w/ 1mL 80% EtOH. Let pellet air dry for ~10 min. Resuspend pellet in 40-200 µL 1xTE The DNA is ready for PCR at this point. Steps 6-10 are optional. 6. (optional) Add 3M Na-Acetate to 10%. Mix and add 2.5 volumes 100% EtOH. Incubate at 20C for >10 min. Recover nucleic acids by centrifuging at 14K RPM for 10 min (this step removes residual chlorophyll and debris that can carry over from step 4. 7. Wash pellet w/ 1mL 80% EtOH. Let pellet air dry for 10 min. Resuspend in 500 µL 1xTE pH 7.5. 8. Extract with Phenol:Chloroform:IAA (2x) and Chloroform (2x) and EtOH precipitate. 9. Wash w/ 1 mL 80% EtOH. Let pellet air dry for 10 min. 10. Resuspend pellet in 40-200 µL 1xTE. 83 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Minipreparazione di DNA da pianta E’ un protocollo non adatto ai tessuti vegetali ricchi in polisaccaridi. Fornisce un DNA di scarsa qualità ma permette il processamento di numerosi campioni contemporaneamente perché è un sistema veloce. Impiegare se si deve solamente estrarre DNA da amplificare mediante PCR 1. Prelevare 50-100 mg di tessuto vegetale e porlo in tubo eppendorf da 1.5 ml. Si può prelevare forando la foglia, usando come stampo il tappo dell’eppendorf stessa. 2. Aggiungere 100 μl di tampone di estrazione e omogeneizzare con l’apposito pestello. Aggiungere altri 300 μl di tampone. Se il tampone di estrazione non contiene β-mercaptoetanolo aggiungerne 1 μl. Prima di procedere con il successivo campione lavare il pestello con etanolo al 100% per evitare contaminazioni. Si porta a volume solo in seguito alla rimozione del pestello per evitare la fuoriuscita del campione dal tubo. 3. Centrifugare a 12000 rpm per 10 min. 3a. (FACOLTATIVO) Passaggio in fenolo-cloroformio. E’ possibile a questo punto effettuare un trattamento fenolo-cloroformio per aumentare la purezza del DNA. Valutare tuttavia attentamente la necessità di questo passaggio, che se effettuato prolunga sensibilmente il tempo richiesto per l’esecuzione di questo protocollo di estrazione 4. Prelevare 300 μl del supernatante aggiungere volume uguale di isopropanolo Prelevando 300 μl si ha una quantità sufficiente di materiale e si standardizza il procedimento: è possibile lavorare con più campioni. 5. Incubare per non più di 15 min a temperatura ambiente invertendo periodicamente i tubi. L’incubazione può avvenire anche in ghiaccio poiché, essendo presente isopropanolo, il raffreddamento favorisce la precipitazione del DNA. 6. Centrifugare per 15 min alla massima velocità. 7. Eliminare il supernatante e lavare il pellet con 100 μl di etanolo 75% (o 70%) freddo. 8. Centrifugare per 30 sec, eliminare l’etanolo e asciugare il pellet. 9. Risospendere in 100 μl di RNasi-TE L’RNasi si aggiunge solo se non era presente nel tampone di estrazione. Tampone di estrazione 200 mM tris-HCl pH 8.0 250 mM NaCl 25 mM EDTA pH 8.0 1% SDS 10 mM β-mercaptoetanolo OPZIONALE: 2 μg di RNasi 84 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Estrazione del DNA con CTAB 2X 1. Prelevare 0.3 g di tessuto fresco e macinare in un mortaio con azoto liquido. 2. Trasferire tutto in una provetta di tipo eppendorf e aggiungere 2 volumi di soluzione CTAB 2X. Ad ogni campione aggiungiamo CTAB 2X in modo tale da rispettare il rapporto:1g di tessuto:2ml di 2X CTAB. Avendo in ogni eppendorf 300 mg di foglie, dobbiamo aggiungere 600 μl di tampone. Assicurarsi che il β-mercaptoetanolo sia stato aggiunto alla soluzione CTAB! Se assente, aggiungerlo al volume di soluzione richiesto.La quantità di mercaptoetanolo da usare è diversa nei vari protocolli ,ma tale che la sua concentrazione finale sia sempre compresa tra lo 0.2% e il 2% (v/v). Variante Questa variante e` particolarmente indicata per ottenere lisati cellulari a partire da cellule animali in cui non e` richiesta la rottura della parete cellulare, ma solo della membrana citoplasmatica. • Prelevare 300 mg di tessuto, aggiungere 2 vol. di soluzione CTAB 2x e omogenizzare con l’aiuto di un pestello. Per ottenere una migliore e più facile omogeneizzazione possiamo procedere nel modo seguente: ♦ Aggiungere un’aliquota di CTAB 2X (per es. 200 µl). ♦ Omogeneizzare velocemente utilizzando il pestellino direttamente nel tubo Eppendorf. Porre in ghiaccio per qualche secondo e aggiungere il volume rimanente di CTAB 2X (400 µl). Se il tessuto contiene elevate quantità di composti fenolici può essere aggiunto del polivinilpirrolidone all'1% (MW = 40,000; Sigma) per il loro assorbimento. 3. Incubare a 65°C per 30 min invertendo il tubo ogni 10 min per evitare la formazione di aggregati. Questo passaggio serve per la rottura completa delle cellule e per la denaturazione delle proteine. Il tempo di incubazione può essere prolungato fino a 60 min in quanto risulta una maggiore produzione di DNA ma se la produzione massima non è importante, 10 min possono essere sufficienti. 4. Lasciare raffreddare il campione per circa 30 sec in ghiaccio. Il raffreddamento serve per evitare che il cloroformio (tossico), che si aggiunge al passaggio successivo, volatilizzi. 5. Aggiungere un volume di cloroformio isoamilico (24:1) e agitare vigorosamente. Il cloroformio isoamilico (24:1) viene usato per rimuovere il CTAB che ha legato i polisaccaridi. Può essere sostituito dal cloroformio ottanolo,un alcool che solubilizza le membrane e facilita l’allontanamento dei lipidi di membrana. 6. Centrifugare 5 min alla massima velocità, prelevare la fase superiore. I polisaccaridi e il CTAB rimangono nell’interfaccia. 7. Precipitare il DNA con 0.6 volumi di isopropanolo. Mescolare ed attendere 10-15 min a T° ambiente o in ghiaccio. A questo punto si può osservare la presenza della medusa. 85 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne 8. Centrifugare 5 min alla massima velocità, versare il supernatante. 9. Lavare il pellet con Etanolo 75%, centrifugare 5 min. 10. Seccare il pellet e risospendere il DNA in 500 µl TE / g di tessuto di partenza. Se il pellet non si risospende porre qualche minuto a 65°C. Eventualmente aggiunge Rnasi (1 µl di soluzione 10 mg/ml) Nel campione dovrebbero esserci circa 100-500 µg DNA / g tessuto. Porre qualche min a 60 °C nel caso in cui il pellet non si risospendesse. 11. Conservare a 4 °C. VARIANTE AL PROTOCOLLO (dopo il punto 7 precendente) Questa variante viene utilizzata soprattutto quando si hanno molti campioni da analizzare perché permette di procedere in serie. 8. Prelevare il DNA (medusa) con un uncino di vetro e trasferirlo in un nuovo tubo eppendorf contente 1 ml di CTAB wash #1: etanolo 76% 0.2M NaOAc pH 4.8-5.2 9. Lasciare l'uncino con attaccato il precipitato all'interno della soluzione per 20 min Il tempo di permanenza all'interno della soluzione può essere anche più lungo (questo ci permette di trattare anche molti campioni contemporaneamente) Durante questo lavaggio i residui che potrebbero essere complessati col precipitato vengono dispersi all'interno della soluzione 10. Trasferire l'uncino con attaccato il precipitato in un nuovo tubo eppendorf contenente 1 etanolo 76% ml di CTAB wash #2 : 10mM NH4OAc L' NH4OAc viene considerato superiore al NaOAc nel purificare il DNA. 11. Lasciare l'uncino con attaccato il precipitato all'interno della soluzione per 10 min 12. Asciugare la medusa con un pezzo di carta in modo da far assorbire l'etanolo presente in eccesso; trasferire poi il DNA in un nuovo tubo eppendorf contenente 500 µl TE / g di tessuto di partenza (il DNA dovrebbe staccarsi subito dall'uncino) 12. Conservare a 4°C In questo periodo il DNA viene disciolto nella soluzione e le eventuali impurezze possono essere eliminate tramite una centrifugazione. Le rese attese sono nell’ordine dei 100-500μg di DNA per grammo di tessuto vegetale fresco 86 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne MATERIALI - Tampone CTAB 2X (100 ml) • • • • • • Tris-HCl pH 8.0 EDTA pH 8.0 NaCl CTAB acqua β-mercaptoetanolo 100 mM 20 mM 1.4 M 2% a volume 0.2% 10 ml 4 ml 35 ml 2g 1M 0.5 M pH 8.0 4M 20 μl in 10 ml di tampone (leggi note). La percentuale di CTAB da impiegare dipende dalla quantità di polisaccaridi presenti nel campione. NOTE Il detergente anionico CTAB (cetiltrimetilammonio bromuro) e` usato per liberare gli acidi nucleici totali dai polisaccaridi. Questa procedura generale e` stata usata in una grande varieta` di generi vegetali e tipologia di tessuti. I vantaggi di questo protocollo sono i seguenti: relativa semplicita` di esecuzione, velocita`, versatilita` di applicazione per quantita` di campione che vanno da milligrammi a grammi di tessuto;inoltre tale procedura non richiede la centrifugazione in gradiente di cloruro di cesio. Il protocollo che prevede l'uso del CTAB fu inizialmente usato per i batteri,e solo successivamente venne modificato in modo tale da ottenere DNA da piante. Il tampone CTAB è un detergente, irritante e corrosivo, in grado di legare i polisaccaridi e di sottrarli alla soluzione evitando il legame con il DNA. Rimane in soluzione solo se la concentrazione di NaCl è maggiore di 0.7 M Il protocollo può essere applicato a numerosi tessuti vegetali quali semi, foglie ed embrioni. Prevede la macinazione del tessuto e l’aggiunta del tampone CTAB,che permette di raggiungere una concentrazione di NaCl > 0.7 M. Il CTAB si lega così ai polisaccaridi, evitando il loro legame al DNA. E’ importante aggiungere il tampone prima che il DNA scongeli e possa venire a contatto con i polisaccaridi.Il successivo trattamento con cloroformio rimuove il CTAB e i polisaccaridi,ad esso legati. Si dovrebbe ottenere un DNA dell’ordine dei 50 Kb in lunghezza,che è accettabile per la maggior parte delle applicazioni. Il tampone è concentrato 2 volte perché operando con tessuti freschi le cellule del campione contengono acqua che diluisce il tampone stesso. In caso di tessuti secchi (disidratati) si deve pertanto dimezzare la concentrazione della soluzione CTAB (utilizzare CTAB 1X oppure reidratare il campione prima di aggiungere il tampone). La soluzione CTAB è stabile per lungo tempo a temperatura ambiente. La concentrazione di lavoro di CTAB dipende dalla quantità (presunta) di polisaccaridi presenti: in una matrice semplice può andar bene l’1%, mentre per matrici complesse si può arrivare al 5%. Il β-mercaptoetanolo non deve mai essere aggiunto alla soluzione da conservare ma solo allo stock di utilizzo in quanto volatile. 87 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne CTAB Invertito E’ impiegato per l’estrazione e purificazione di DNA da matrici complesse Il tampone CTAB è stato già illustrato precedentemente nei metodi di estrazione del DNA genomico. Si differenzia dal metodo prima utilizzato per due motivi: 1. la concentrazione del CTAB inferiore 1X anziché 2X. Questo protocollo è infatti preferibilmente impiegato per campioni secchi, ma è necessario aggiungere un sufficiente volume d’acqua per diluire il tampone stesso; 2. diverso principio di purificazione del DNA. Qui il CTAB porta alla precipitazione del DNA. Infatti, la ridotta concentrazione di NaCl (0.04 M) nella soluzione di precipitazione fa si che il CTAB leghi il DNA e precipiti con esso, lasciando in soluzione un surnatante che contiene solamente residui da eliminare. Con il metodo CTAB 2X, avveniva l’evento opposto: il detergente serviva per precipitare le impurezze da eliminare, e lasciava in soluzione il DNA. NOTE GENERALI: • la concentrazione di lavoro di CTAB dipende dalla quantità (presunta) di polisaccaridi presenti: in una matrice semplice può andar bene l’1%, mentre per matrici complesse si può arrivare al 5%; • per i tessuti freschi e ricchi d’acqua è maggiormente adottato il protocollo per l’estrazione del DNA con CTAB 2X. MATERIALI - Tampone CTAB (non porre in ghiaccio perché precipita) 20 g/litro di CTAB NaCl 1.4 M Tris-HCl 0.1 M EDTA 20 mM + aggiunta di ß-mercaptoetanolo 0.2% - NaCl 1.2 M - Cloroformio isoamilico 24:1 - Soluzione di precipitazione CTAB: 5 g/litro di CTAB NaCl 0.04 M - Isopropanolo a temperatura ambiente - Etanolo al 70% v/v - TE pH 8.0 10 mM Tris-Cl 1mM EDTA - Microcentrifuga - Bagnetto a 65°C PROTOCOLLO 1. Pesare 100 mg di materiale omogeneo, macinarlo e trasferirlo in un tubo di tipo eppendorf. In caso di tessuti vegetali, si prediliga la scelta di materiale giovane che a parità di peso possiede un maggior contenuto di acidi nucleici. Se il materiale è particolarmente resistente, prima del trasferimento nel tubo e dell’aggiunta del tampone CTAB, macinarlo con l’ausilio di N liquido in un mortaio preraffreddato. 2. Aggiungere 500 μl di tampone CTAB (2X) e mescolare. Assicurarsi che la soluzione di ß-mercaptoetanolo sia stata aggiunta alla soluzione di CTAB. 88 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Dato che la concentrazione finale di CTAB deve essere 1X, se si lavora con un campione secco è necessario aggiungere un ugual volume di acqua. Se si lavora invece con un campione umido questa operazione non è necessaria, è l’acqua stessa del campione che diluisce il CTAB. Mescolare vigorosamente, invertendo ripetutamente il tubo, fino ad ottenere una soluzione viscosa. 3. Incubare a 65 °C per 30 min. 4. Centrifugare a 12000 rpm per 10 min. 5. Prelevare il supernatante e porlo in un nuovo tubo contenente 200 μl di cloroformio isoamilico. Mescolare vigorosamente per 30 sec e poi centrifugare a massima velocità per 10 min. L’aggiunta del cloroformio isoamilico è necessaria per rimuovere il CTAB. Dopo la centrifugazione, gli oli ed il DNA si trovano nella fase superiore ed il CTAB precipita. 6. Recuperare il supernatante in un nuovo tubo, annotando il volume. Il volume dev’esser annotato per effettuare con maggior precisione il passaggio successivo (aggiunta della soluzione di precipitazione), per cui al fine di misurare il volume, si recuperi il surnatante con una micropipetta. 7. Aggiungere 2 volumi di soluzione di precipitazione CTAB, mescolare e incubare a temperatura ambiente per 1h. Per questo passaggio non sono necessarie particolari precauzioni. 8. Centrifugare per 5 minuti a 12000 rpm ed eliminare poi il supernatante. Durante questo passaggio il DNA, legandosi con il CTAB, forma un pellet. Nell’eliminare il surnatante, quindi, fare attenzione a non staccarlo dal tubo. 9. Disciogliere il pellet in un tubo con 350 μl di NaCl 1.2 M. L’aggiunta di NaCl determina la rottura del legame tra DNA e CTAB. 10. Aggiungere 350 μl di cloroformio e mescolare bene. 11. Centrifugare a massima velocità per 10 min. Si è ora verificata una separazione di fase: il DNA da recuperare è nella fase superiore acquosa. 12. Raccogliere la fase superiore, annotandone il volume, trasferirla in un nuovo tubo. Nel recuperare la fase superiore, aiutarsi utilizzando una micropipetta p200 e inclinare leggermente il tubo, senza comunque toccare l’interfaccia, che inquinerebbe i passaggi successivi. 13. Aggiungere 0.6 volumi di isopropanolo. 0.6 volumi di alcool da aggiungere sono da riferire al volume di DNA annotato. Questo passaggio serve per precipitare il DNA. Non vengono aggiunti sali dato il precedente utilizzo di NaCl. 14. Centrifugare per 10 minuti a massima velocità. 89 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne 15. Eliminare il supernatante e aggiungere nel tubo 500 μl di etanolo 70 % v/v. Mescolare delicatamente e centrifugare per 10 min a massima velocità. Questo passaggio è un lavaggio del DNA, per cui in questa fase porre attenzione durante il mescolamento, per non rovinarne la struttura. 16. Eliminare il supernatante e asciugare il pellet quanto più possibile. Dopo aver eliminato la maggior parte di surnatante, eliminare eventuali gocce sulle pareti con l’ausilio di una pipetta dopo aver centrifugato nuovamente il tubo (anche aperto) per 30 sec a massima velocità. Quindi, attendere che il pellet assuma un colore biancastro, indice che si è seccato. 17. Risospendere il DNA in 50 μl di TE. 90 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne PURIFICAZIONE DEL DNA DA GEL QIAEXII Agarose Gel Extraction 1. Pesare una eppendorf vuota. 2. Pesare la stessa eppendorf con la porzione di gel tagliato e dalla differenza di peso ottenuta calcolare il peso della banda tenendo presente la relazione per cui 1μl=1mg Quindi aggiungere 3 volumi di Tampone QX1 per ogni volume di campione (per frammenti di DNA compresi tra 100 e 4000 bp). Considerare che per ogni mg di agarosio va aggiunto 1 μl di Tampone QX1. Se il DNA < 100 basi Se il DNA > 4000 basi Æ aggiungere 6 volumi di Tampone QX1. Æ aggiungere 3volumi di Tampone QX1 Se il gel risulta maggiore del 2% Æ aggiungere 6 volumi di Tampone QX1. e 2 volumi di H2O. 3. Risospendere la resina QIAEX II vortexando 30 sec. La resina tende a precipitare perciò bisogna sospenderla bene in modo da riuscire a prelevarla con una pipetta. Se non é ben mescolata si rischia di prelevarne troppa oppure troppo poca. 4. Aggiungere 10 μl di QIAEX II e agitare delicatamente per non rompere il DNA, Se il DNA >10 Kb é meglio mescolare con colpetti sul tubo per limitare le rotture. La quantità di resina da utilizzare dipende dalla quantità di DNA: - ≤ 2 μg di DNA Æ 10 μl di QIAEX II Æ 30 μl di QIAEX II - 2-10 μg di DNA Æ 10 μl di QIAEX II - per ogni ulteriore 10 μg di DNA 5. Incubare 10 min a 50° per solubilizzare l’agarosio e far legare il DNA alla resina. Mescolare ogni 2 minuti per risospendere la resina. Il tampone QXI ha lo scopo di facilitare la solubilizzazione del gel e del DNA (in acqua non avviene altrettanto bene) e di portare il pH a valori ottimali per il binding della resina. Controllare che il campione sia di colore giallo. Il tampone QX1 è un indicatore di pH. Esso rende giallo il campione se questo è a pH ≤ 7.5 o arancio-porpora se il pH risulta > 7.5. Poiché le particelle della resina QIAEX II sono efficienti solo se il pH del campione risulta ≤ 7.5 il campione DEVE risultare di colore giallo, altrimenti é necessario aggiungere 10 μl di NaOAc 3 M pH tra 4.8 e 5.2 e mescolare: il colore dovrebbe tornare giallo. Incubare per altri 5 minuti. 6. Centrifugare 30 sec e rimuovere il surnatante delicatamente con una pipetta. La resina si impacca sul fondo con legato il DNA. Anche se l’agarosio si raffredda, la sua concentrazione ora è talmente bassa rispetto al totale da non permettere una risolidificazione. 91 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne 7. Risospendere il pellet con 500 μl di Buffer QX1, quindi centrifugare 30 sec e rimuovere il surnatante. Il buffer QX1 è un tampone di lavaggio.Infatti questo passaggio serve per rimuovere le tracce di agarosio presenti. nel TBE che non permetterebbero la successiva azione della ligasi. Non è necessario in TAE, anche se permette di eliminare i residui d’agarosio. Se i frammenti sono di grandi dimensioni una risospensione può essere uno stress eccessivo che può degradare il DNA, sottoposto ad esempio a trazione da parte di particelle di resina.Il bromuro di etidio presente nel gel dovrebbe essere rimosso con questi lavaggi.Comunque quello rimasto che si intercala nel DNA non ha effetto. 8. Lavare il pellet 2 volte con 500 μl di Buffer PE seguendo la seguente procedura: Aggiungere il tampone PE e risospendere il DNA con il puntale; centrifugare 30 secondi e togliere il Tampone PE. Ripetere. Questo step serve per rimuovere i residui di sali. L’alcool é necessario per impedire il distacco del DNA dalla resina. 9. Lasciare asciugare il DNA all’aria per 10 – 15 min finché il pellet diventa bianco(la resina da grigia diventa bianca), ovvero evapora tutto l’etanolo. Si deve essere sicuri che nel DNA non sia più presente l’etanolo; infatti, è questo che tende a far fuoriuscire il campione dai pozzetti del gel di agarosio mentre si tenta di caricarlo. È sconsigliabile asciugare creando il vuoto perché si riduce l’efficienza di eluizione. Se si lavora con 30 μl di QIAEX II é necessario lasciare asciugare all’aria per 30 minuti. 10. Risospendere il DNA con 10 μl di TE senza vortexare, utilizzando un puntale. È importante che il volume sia ridotto perché il DNA necessita di esser altamente concentrato per ligare frammento e vettore. Si ottiene la miglior eluizione quando il pH è compreso tra 7.0 e 8.5. 11. Incubare il campione secondo la tabella sotto riportata: frammenti di DNA ≤ 4Kb frammenti di DNA 4-10 Kb frammenti di DNA > 10 Kb fortemente legato alla resina). Æ incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Æ incubare a 50° per 5 minuti. Æ incubare a 50° per 10 minuti (per staccare DNA di grosse dimensioni 12. Centrifugare per 30 sec e trasferire con attenzione il surnatante, contenente il DNA, in un nuovo tubo (almeno 8 μl). È necessario non trasferire la resina.Conservare il campione a 4°C. 92 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Geneclean 1. Tagliare la banda di DNA dal gel di agarosio con un bisturi pulito e affilato 2. Porre il blocchetto di gel in un tubo eppendorf e pesare la porzione di gel per poter calcolare il volume di DNA presente sulla base della relazione per cui 1 μl = 1 mg . pesare la eppendorf contenente il blocchetto di agarosio e sottrarre il peso di una eppendorf vuota 4. Per gel in TAE, aggiungere 3 volumi di NaI Per gel in TBE, aggiungere 0.5 volumi di TBE modifier e 3 volumi di NaI I volumi da aggiungere vanno calcolati sulla base dell’ ultimo volume presente nella eppendorf. Il TBE modifier può essere sostituito da tampone fosfato (vedi composizione soluzione NAI). 5. Porre l’ eppendorf a 55°C per 5 min, invertendo il tubo ogni 2 min per facilitare lo scioglimento dell’agarosio. 6. Aggiungere 5 ul di Resina per campioni contenenti fino a 5 ug di DNA, altrimenti addizionare ai 5 ul 1 ul di resina per ogni 0.5 ug di DNA in più. Se il volume della soluzione è di 0.5 ml usare un volume minimo di resina di 10 ul, per 1 ml usare come minimo 20 ul. Prima di prelevare il volume di resina, vortexare il suo contenitore per almeno 1 min. La resina contiene 1μg di DNA per ogni μl.Utilizzare almeno 5 μl di soluzione 1. Incubare a temperatura ambiente per 5 min, agitando ogni tanto il tubo per mantenere sospesa la resina 2. Centrifugare 5 sec alla massima velocità ed eliminare il surnatante decantando La silice precipita subito 3. Lavare per tre volte il pellet risospendendolo in 500 ul di Wash Solution La quantità di Wash non è così rigorosa. Seccare il pellet con qualche secondo di centrifuga 4. Eluire il DNA dalla resina risospendendo il pellet in 10 ul di TE, incubare a 55° C per 2-3 min e centrifugare alla massima velocità per 30 sec 5. Trasferire il surnatante in una nuova eppendorf e conservare a +4°C Se si vede il DNA insieme a contaminanti(ad esempio la resina)centrifugare di nuovo per pochi secondi e trasferire il surnatante in una nuova eppendorf NOTE: nel caso si applichi questa metodica a DNA già in soluzione (per esempio eliminazione CIP da vettore di clonaggio) aggiungere 3 volumi di NaI al DNA e procedere dal punto 4 del protocollo 93 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne MATERIALE Soluzione NaI 90.8 g NaI 0.5 g Na2SO3 acqua a 100 ml (per gel con TBE aggiungere 100 mM NaH2PO4 pH 6.0 alla soluzione NaI, oppure impiegare il TBE modifier come descritto sopra) Glassmilk 12.5 g Silice (Sigma cod. 5631) in 25 ml di acqua Soluzione Wash 50 ml etanolo assoluto 2 ml NaCl 5M 2 ml Tris 0.5 M pH 7.5 0.4 ml EDTA pH 8.0 acqua a 100 ml Commenti su Geneclean e Qiaex II Il tampone QX1 contiene Sali caotropici che distruggono i ponti idrogeno fra molecole di zucchero nel polimero di agarosio, permettendo la solubilizzazione del cubetto. Inoltre, l’alta concentrazione salina dissocia le proteine legate al DNA dal DNA stesso. Con il tampone QX1 il DNA può essere estratto da gel in TBE senza l’aggiunta di TBE modifier (vedi Geneclean). Gel in TBE infatti non solubilizzano bene come i gel in TAE a causa della formazione di complessi fra il borato e i gruppi cis-diol dei monomeri e polimeri di zucchero. I Sali caotropici non possono solubilizzare questi gel senza l’aggiunta di monomeri di zucchero quali il sorbitolo e il mannitolo per chelare il boro libero. Queste resine funzionano come leganti del DNA quando questo eè in una soluzione altamente elettrolitica contenente grandi anioni (per esempio derivanti dai Sali caotropici) che causano una modificazione nella struttura dell’H2O forzando il DNA ad essere adsorbito dalle particelle di resina (silice). L’adsorbimento di frammenti di DNA piccoli (< 100 bp) è incrementata aumentando la concentrazione salina, mentre l’adsorbimento di frammenti grandi (> 4 kb) è aumentata a concentrazioni saline più basse. La resina di silice è efficiente solo se il pH del campione risulta ≤ 7.5. A valori superiori l’adsorbimento del DNA è drasticamente ridotto. 94 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne PURIFICAZIONE DEL DNA IN SOLUZIONE QIAEXII Protocol for Desalting and Concentrating DNA Solutions 1. Trasferire il DNA defosforilato (con un numero di basi compreso tra 100 e 4000) in un tubo non colorato e aggiungere 3 volumi di Buffer QX1 per ogni volume di campione. Se il DNA < 100 basi Æ aggiungere 6 volumi di Buffer QX1 Se il DNA > 4000 basi Æ aggiungere 3 volumi di Buffer QX1 e 2 volumi di H2O 2. Controllare che il campione sia di colore giallo dopo l’aggiunta del Buffer QX1. Buffer QX1 è un indicatore di pH. Esso rende giallo il campione se questo è a pH ≤ 7.5 o arancio-porpora se il pH risulta > 7.5. Poiché le particelle della resina QIAEX II sono efficienti solo se il pH del campione risulta ≤ 7.5 il campione DEVE risultare di colore giallo, altrimenti risulta necessario aggiungere 10 μl do sodioacetato 3M a pH 5.0 e mescolare: il colore dovrebbe tornare giallo. 3. Risospendere la resina QIAEX II vortexando per 30 sec. La resina tende a precipitare per il suo alto PM perciò bisogna risospenderla bene in modo da riuscire a prelevarla con una pipetta. Se non risulta ben mescolata si rischia di prelevarne troppa e di diminuirne la concentrazione nel tubo. 4. Aggiungere 10 μl di QIAEX II per quantità di DNA < 5 μg, e mescolare dolcemente per non danneggiare eccessivamente il DNA. In questa fase è preferibile eccedere con la resina per essere sicuri di legare tutto il DNA. Per frammenti di DNA > 10 Kb risulta necessario agitare il tubo con il dito. 5. Incubare a temperatura ambiente per 10 min mescolando ogni 2 min per far rimanere in sospensione la resina. 6. Centrifugare per 30 sec e rimuovere il supernatante, capovolgendo l’eppendorf. La resina si impacca sul fondo con legato il DNA a cui conferisce un colore grigio. 7. Lavare il pellet 2 volte con 500 μl di Tampone PE (dopo essersi assicurati di aver aggiunto l’etanolo a 96 – 100%) seguendo la seguente procedura: Aggiungere il tampone PE e risospendere il DNA con il puntale; centrifugare 30 secondi e togliere il tampone PE. Ripetere. 8. Lasciare asciugare il Tampone PE rimasto all’aria per 10 – 15 min. finché il pellet risulta bianco. È necessario che non ci sia più traccia di etanolo, perché nell’atto di caricamento del DNA nei pozzetti di gel di agarosio tende a far fuoriuscire il campione. Non asciugare troppo perché diventa difficile la risospensione; ciò potrebbe causare una diminuzione dell’efficienza di eluizione. 9. Eluire il DNA con 10 μl di TE e mescolare senza vortexare, utilizzando un puntale. 95 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne L’efficienza di eluizione dipende dal pH. La massima efficienza di eluizione si ha a pH compreso tra 7.0 e 8.5. 10. Incubare il campione secondo quanto segue frammenti di DNA ≤ 4Kb frammenti di DNA 4-10 Kb frammenti di DNA > 10 Kb Æ incubare a temperatura ambiente per 5 min Æ incubare a 50° per 5 min Æ incubare a 50° per 10 min (per staccare DNA di grosse dimensioni fortemente legato alla resina). 11. Centrifugare per 30 sec e trasferire con attenzione il surnatante, contenente il DNA puro, in un nuovo tubo. 12. Optional: ripetere punto 11 per aumentare la resa di DNA. 13. Conservare il vettore rimasto a 4 °C. NOTE: Utilizzabile per la purificazione di frammenti di DNA compresi tra 100 bp e 12 Kb in soluzione acquosa senza eseguire la procedura con fenolocloroformio o etanolo. Questo kit elimina enzimi come la fosfatasi, polimerasi, endonucleasi, i sali e i singoli nucleotidi. 96 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Geneclean for DNA solutions 1. Aggiungere 3 volumi di NaI alla soluzione contenente il DNA. I volumi da aggiungere vanno calcolati sulla base del volume presente nella eppendorf. 2. Aggiungere 5 ul di Resina per campioni contenenti fino a 5 ug di DNA, altrimenti addizionare ai 5 ul 1 ul di resina per ogni 0.5 ug di DNA in più. Se il volume della soluzione è di 0.5 ml usare un volume minimo di resina di 10 ul, per 1 ml usare come minimo 20 ul. Prima di prelevare il volume di resina, vortexare il suo contenitore per almeno 1 min in modo tale che sia ben risospesa; se la resina è secca aggiungere acqua.a resina contiene 1μg di DNA per ogni μl.Lavorare almeno con 5 μl di soluzione( 5μg di DNA). 3. Incubare a temperatura ambiente per 5 min, agitando ogni tanto il tubo per mantenere sospesa la resina 4. Centrifugare 5 sec alla massima velocità ed eliminare il surnatante versando il tubo La silice precipita subito 5. Lavare per tre volte il pellet risospendendolo in 500 ul di Wash Solution La quantità di Wash non è così rigorosa. Seccare il pellet con qualche secondo di centrifuga 6. Eluire il DNA dalla resina risospendendo il pellet in 10 ul di TE, incubare a 55° C per 2-3 min e centrifugare alla massima velocità per 30 sec 7. Trasferire il surnatante in una nuova eppendorf e conservare a +4°C Se si vede il DNA insieme a contaminanti(ad esempio la resina)centrifugare di nuovo per pochi secondi e trasferire il surnatante in una nuova eppendorf MATERIALE Soluzione NaI 90.8 g NaI 0.5 g Na2SO3 acqua a 100 ml Glassmilk 12.5 g Silice (Sigma cod. 5631) in 25 ml di acqua Soluzione Wash 50 ml etanolo assoluto 2 ml NaCl 5M 2 ml Tris 0.5 M pH 7.5 0.4 ml EDTA pH 8.0 acqua a 100 ml 97 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Trattamento con CTAB di DNA in soluzione E’ possibile procedere alla rimozione dei polisaccaridi anche su DNA precedentemente estratto, mediante trattamento con CTAB 2X Portare la soluzione contenente il DNA (già estratto con altri metodi, per cui conservato in TE) ad un volume di lavoro adeguato (almeno 200 μl), dato che con questo metodo (come già illustrato a proposito del trattamento con fenolo:cloroformio) si rischia di perdere parte del materiale di partenza. 14. Aggiungere alla soluzione di DNA un egual volume di soluzione CTAB 2x. 15. Incubare per 10 min a 65°C. 16. Aggiungere 1 volume di cloroformio isoamilico (24:1) e miscelare le fasi. Lo scopo è rimuovere il CTAB e indirettamente i polisaccaridi ad esso legati. Mescolare molto energicamente. 17. Centrifugare per 5 min alla massima velocità. Così si ottengono due fasi: DNA pulito da una parte e polisaccaridi più proteine denaturate dall’altra. 18. Prelevare il supernatante e precipitare il DNA con 0.6 volumi di isopropanolo e lavaggio con etanolo 70%. Non aggiungere il sale (1/10 vol NaOAc 3M pH 4.8) per la precipitazione perché la soluzione di CTAB ha già apportato sufficienti quantità di sale. 19. Risospendere in 50 μl di RNasi-TE. Porre qualche min a 60 °C nel caso in cui il pellet non si risospenda bene. 7. Conservare a 4°C. Tampone CTAB 2X (100 ml) − Tris-HCl pH 8.0 100mM − EDTA pH 8.0 20 mM − NaCl 1.4 M − CTAB 2% − acqua (Non porre in ghiaccio perché precipita) − β-mercaptoetanolo 0.2% 10 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0 4 ml 0.5 M pH 8.0 35 ml 4M 2g a volume 20 μl in 10 ml di tampone Il β-mercaptoetanolo non deve mai essere aggiunto alla soluzione da conservare ma solo allo stock di utilizzo in quanto volatile 98 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Trattamento con fenolo:cloroformio 1. Aggiungere alla soluzione contenente il DNA 1 vol. di fenolo:cloroformio:isoamilico (25:24:1) La presenza dell’isoamilico serve per semisaturare il cloroformio che altrimenti puro avrebbe la tendenza a disidratare il campione. 2. Miscelare le due fasi (non vortexare) Agitare vigorosamente fintanto che il campione non si presenta lattiginoso 3. Centrifugare almeno 3 minuti. Si formano due fasi distinte: quella inferiore di fenolo-cloroformio e quella superiore con il DNA in soluzione. L’interfaccia bianca è data dalle proteine denaturate. 4. Recuperare la fase superiore, contenente DNA. È importante evitare di creare vortici che smuovano lo strato inferiore: tenere la punta della pipetta appena sotto la superficie dello strato superiore (Fig.1). Ad un certo punto si forma una bolla di soluzione contenente il DNA. Può essere utile tenere inclinato il tubo in modo da prevedere dove si formerà la bolla (Fig.2). Con il puntale posizionarsi al centro della bolla e cercare di prelevare il più possibile. È importante evitare di trasportare nel nuovo tubo tracce di fenolo-cloroformio (visibili in controluce come “sferette” vetrose), perché queste degraderebbero gli enzimi utilizzati in seguito (polimerasi, enzimi di restrizione…). Fig.1 Fig.2 5. Precipitare il DNA con etanolo o isopropanolo Se inizialmente il DNA era in TE, è necessario aggiungere 1/10 vol. NaOAc 3M pH 4.8 prima di aggiungere i 2 vol. di etanolo assoluto oppure gli 0.6 vol. isopropanolo. Qualora questo trattamento venga condotto durante la Miniprep (punto 5), la presenza massiccia di sali forniti con la Sol. 3 rende inutile (se non dannosa) l’aggiunta di 1/10 vol. NaOAc 3M pH 4.8 prima dell’alcool. In questo caso la precipitazione deve essere condotta come da punto 6 del protocollo Miniprep NOTE Il fenolo cloroformio è una soluzione sinergica altamente deproteinizzante che serve per eliminare i possibili contaminanti del DNA per evitare che interferiscano con i successivi trattamenti, specialmente nel caso in cui si lavori con enzimi di restrizione. Questo trattamento può essere fatto anche su DNA genomico o comunque su DNA plasmidico già risospeso in TE. Il passaggio in fenolo:cloroformio deve sempre esser seguito da precipitazione in etanolo assoluto (o isopropanolo) e successiva risolubilizzazione in TE. Precauzioni 99 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Il fenolo:cloroformio è altamente tossico per cui è necessario lavorare sotto cappa chimica. Bisogna inoltre assicurarsi che i tubi utilizzati siano resistenti alla corrosione da parte del fenolo:cloroformio stesso. Questa miscela è tossica e deve essere maneggiata con cura sotto cappa chimica. Precipitazione del DNA 1. Aggiungere al campione di DNA 1/10 vol. di acetato di sodio 3 M pH 4.8-5.2 Se nella soluzione è già presente una simile concentrazione di sale, l’acetato di sodio non va aggiunto 2. Aggiungere 2 vol. di etanolo assoluto freddo oppure 0.6 volumi di isopropanolo (quando i volumi sono elevati). 1. Centrifugare 10-15 min a 12000 g ed eliminare il surnatante. 2. Lavare il pellet con etanolo 70% v/v ( per eliminare i sali). Per effettuare questo passaggio è sufficiente versare nel tubo 500 μl circa di etanolo 70 % (non isopropanolo perché evapora meno facilmente) quindi eliminarli con una micropipetta, eventualmente centrifugare a massima velocità per 30’’ per riuscire a togliere anche possibili gocce depositate sulle pareti (che, cadendo sul fondo del tubo, si potranno recuperare tramite ulteriore aspirazione con la pipetta). 5. Seccare il pellet all’aria e risospende il DNA nel volume desiderato di TE NOTE: Il volume di etanolo o isopropanolo necessario deve esser calcolato sul volume risultante dopo l’aggiunta della soluzione salina, e non sul volume iniziale. L’etanolo assoluto viene conservato a –20°C. Se il DNA è presente ad alte concentrazioni, può precipitare anche se non viene aggiunta la soluzione salina, tuttavia la presenza dell’acetato di sodio è indispensabile per consentire la precipitazione nei casi di basse concentrazioni di DNA. E’ quindi buona norma aggiungerlo sempre, con la sola eccezione del caso in cui sia già presente del sale proveniente da reagenti aggiunti precedentemente (come per esempio nel caso dell’utilizzo delle soluzioni II e III del protocollo di lisi alcalina). In quest’ultimo caso si aggiunge solo etanolo o isopropanolo. È importante aggiungere per primo il sale che interagisce con le cariche del DNA permettendo la precipitazione in alcool. Se il volume di partenza è grande, utilizzare l’isopropanolo che agisce in quantità minori rispetto all’etanolo. Acetato di Sodio 3M pH 4.8 408.1 g di acetato di sodio · 3 H2O in 800 ml di H2O equilibrare il pH a 4.8 con acido acetico glaciale portare a 1 l con H2O Trattamento con RNAsi Il trattamento con RNAsi DNAsi freeè impiegato per la rimozione dell’RNA nelle preparazioni di DNA Dissolvere RNAsi pancreatica (RNAsi A) ad una concentrazione di 10mg/ml in 10mM di Tris-HCl (pH 7.5) e 15mM di NaCl . Riscaldare a 100°C per 15 min e raffreddare a RT (Room Temperature). L’RNAsi si conserva a -20°C Aggiungere 1 µl di RNAsi al campione e incubare 30’ a 37° oppure a temp. ambiente. Nel caso l’RNAsi venga impiegata durante l’estrazione del DNA, utilizzare le dosi indicate (vedi protocolli estrazione DNA) 100 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne CLONAGGIO Il clonaggio implica l’inserzione di un frammento di DNA in una molecola autoreplicante di DNA e la duplicazione della molecola di DNA ricombinante ottenuta in un’appropriata cellula ospite. Il modo più semplice per costruire una molecola di DNA ricombinante consiste nell’inserire sequenze di DNA all’interno di un plasmide o nel cromosoma di un batteriofago (vettori di clonaggio). La sequenza di DNA che viene inserita nel vettore può provenire da qualsiasi organismo e può essere isolata direttamente dal genoma, da mRNA oppure da frammenti di DNA precedentemente clonati. Inoltre può essere inserito nel vettore DNA di sintesi. Descrizione Parametri critici Prima di iniziare la manipolazione del DNA bisogna prendere in considerazione numerosi fattori. Questi includono il numero, il tipo, la concentrazione, la preparazione e la purificazione dei frammenti di DNA, la selezione e lo screening dei sistemi che possono essere necessari per identificare le molecole di DNA di interesse. Un altro parametro da tenere in considerazione è il numero di molecole ibride che si desidera ottenere per ogni particolare esperimento. Ad esempio, quando si vuole generare librerie genomiche o di cDNA è importante ottenere il massimo numero di ricombinanti. Invece, quando si desidera costruire una o relativamente poche specifiche molecole di DNA non è così importante massimizzare l’efficienza del clonaggio. Anche se è ovvio che le condizioni sperimentali devono essere tali da favorire gli eventi di ligatura desiderati, il fattore cruciale per ottimizzare la frequenza di molecole corrette è quello di ridurre il “background” di eventi indesiderati che potranno poi diventare molecole trasformabili. Una delle maggiori cause di background coinvolge errori nella preparazione dei componenti a DNA iniziali (es. digestione incompleta con enzimi di restrizione). Alcuni errori possono essere ridotti, ma mai saranno eliminati. L’altra maggiore causa di background è la ligatura indesiderata tra molecole nel mix di reazione. Questo problema è superato considerando tutte le possibili vie in cui i componenti di partenza (e probabili contaminanti) possono unirsi per produrre molecole di DNA che possono trasformare E.coli. Con appropriati “trucchi”, le principali reazioni secondarie possono spesso essere minimizzate. Preparazione del DNA e purificazione dei frammenti specifici L’efficienza nell’ottenere le molecole di DNA ricombinanti desiderate viene notevolmente aumentata con la purificazione dei singoli componenti attraverso l’elttroforesi su gel di agarosio. I frammenti di DNA purificati sono relativamente liberi da contaminanti minori che possono causare problemi maggiori di background. Per esempio, se un vettore plasmidico circolare viene tagliato con un’efficienza del 99% con un solo enzima di restrizione, le molecole non tagliate (1%) sono molte anche se non possono essere visualizzate con etidio bromuro. Questo background, che è inaccetabilmente elevato per molti esperimenti, può essere notevolmente ridotto attraverso la purificazione su gel del DNA linearizzato. La purificazione su gel è estremamente utile nelle situazioni in cui solo uno dei molti frammenti è necessario o quando i frammenti sono generati da digestioni parziali. Ciò inoltre è utile per rimovere piccoli linker o altri contaminanti a basso peso molecolare. I frammenti di DNA separati elettroforeticamente devono essere isolati in un blocco di gel di volume il più possibile ridotto per poter essere estratti dal gel di agarosio (o acrilammide) mediante le metodiche Geneclean o Qiaex. Queste due metodiche presentano elevatissimi gradi di purificazione del DNA e fanno si che non sia più così importante usare agarosio di alta qualità come SeaKem o SeaPlaque che, a differenza di altre preparazioni, contengono pochi inibitori della DNA ligasi. Il DNA purificato da gel di acrilammide di solito non contiene questi inibitori. Quantità di DNA Generalmente non è necessario molto DNA. Per la costruzione di ibridi semplici, circa l’1-10% delle molecole vettore vengono trasformate nei ricombinanti di interesse. Con un’efficienza normale di trasformazione (106 colonie per microgrammo di vettore puro), i prodotti della ligatura contenenti circa 1 ng di DNA vettore possono generare da 10 a 100 trasformanti. Questo è più che sufficiente se il background non è un problema. In termini pratici, se i frammenti iniziali di DNA sono visualizzabili con bromuro di etidio, c’è abbastanza DNA (~ 20 ng) per la maggior parte degli esperimenti. Questo è vero anche quando si effettua la ligatura direttamente nel blocco di gel (protocollo alternativo) dove viene usata solo una parte del DNA separato eletroforeticamente. Le costruzioni di molecole ibride difficoltose, come quelle che coinvolgono estremità piatte (blunt) oppure a tre (1 vettore + 2 frammenti) solitamente richedono più DNA. In generale, da 15 a100 ng di ogni componente (in una reazione standard di 20 μl) sono solitamente sufficienti per ottenere i ricombinanti desiderati. L’efficienza del clonaggio può però essere incrementata attraverso l’uso di più alte concentrazioni dei componenti. Se si prova che ciò è necessario, il DNA può essere concentrato facilmente dopo averlo estratto dal gel di agarosio. 101 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Fasi del clonaggio 1) Purificazione del plasmide donatore e del plasmide ricevente (nel caso in cui il frammento debba essere subclonato in un altro plasmide) e quantificazione del DNA su gel di agarosio 2) Taglio con enzimi di restrizione dei plasmidi 3) Preparazione del frammento da clonare 4) Preparazione del plasmide ricevente (vettore) 5) Quantificazione del frammento purificato e del plasmide ricevente linearizzato 6) Ligatura 7) Trasformazione cellule E. coli: sono utilizzabili due tecniche di trasformazione per inserire il costrutto all’interno di E.coli: a. Shock termico: i. Preparazione cellule competenti mediante trattamento con CaCl2 ii. Shock termico, crescita delle cellule e piastramento b. Elettroporazione: i. Preparazione delle cellule ii. Elettroporazione, crescita delle cellule e piastramento 8) Screening colorimetrico e controllo cellule ricombinanti Purificazione dei plasmidi e quantificazione del DNA Il plasmide donatore e il plasmide ricevente sono estratti da E. coli attraverso una delle metodiche descritte precedentemente. Per plasmide donatore intendiamo un plasmide che porta un frammento di DNAche ora deve essere spostato (subclonato) in un altro plasmide. In molti casi il frammento da clonare viene ottenuto in modo diverso (per esempio mediante PCR) e pertanto la sua purificazione per il clonaggio deve essere considerata a partire dalla sua separazione mediante gel elettroforesi (da separazione elettroforetica e recupero banda da gel in poi) I plasmidi vengono poi quantificati tramite una corsa su gel di agarosio in modo da determinare le quantità di plasmidi da tagliare con gli enzimi di restrizione. Su gel vengono caricati i plasmidi estratti e un marcatore di peso molecolare. Poiché a noi interessa determinare la quantità di plasmide si confronta l’intensità delle bande ottenute con l’intensità della banda del marcatore corrispondente per esempio 100 ng (noto questo la stima risulta facilitata). L’utilità del marker in casi come questo, infatti, è differente: non ha senso confrontare la corsa di frammenti lineari e plasmidi non tagliati che migrano come molecole superavvolte. Per poter fare ciò i plasmidi devono essere presenti in quantità tale da permetterne la visualizzazione su gel (limite di rivelabilità ~ 20 ng). In ogni pozzetto si potrebbero caricare, ad esempio: 9 5 µl di DNA 9 1 µl di LB 9 4 µl di TE NOTA: Il TE è stato aggiunto allo scopo di raggiungere il volume di caricamento desiderato, ovvero 10 µl. Poteva altresì esser aggiunta acqua. 102 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Taglio con enzimi di restrizione Il plasmide donatore che porta il frammento di DNA da trasferire nel plasmide ricevente viene tagliato con un enzima di restrizione (es. EcoRI) in modo da liberare il frammento di DNA che, dopo corsa elettroforetica, verrà purificata dal gel. Il plasmide che deve ricevere il costrutto viene linearizzato con un enzima di restrizione. PLASMIDE RICEVENTE (es. pBluescript II SK): enzima di restrizione plasmide plasmide ricevente linearizzato PLASMIDE DONATORE (es. pGEM GAD65): enzima di restrizione frammento plasmide L’excisione di un frammento, con uno o due enzimi di restrizione, presenta in entrambi i casi vantaggi e svantaggi. Nel caso di impiego di 1 enzima di restrizione : • • • Svantaggio: il frammento, una volta exciso, presentando ad entrambe le estremità la medesima sequenza, può inserirsi nel vettore di clonaggio in un senso o nell’altro (clonaggio non direzionale); Svantaggio: la linearizzazione del plasmide ricevente con un solo enzima di restrizione rende coesive le estremità libere che tendono a risaldarsi fra di loro (plasmide si richiude su se stesso); Vantaggio: nell’aver un solo enzima di restrizione attivo sta nella scelta del tampone specifico, che ovviamente sarà unico e sicuramente efficace. Nel caso di impiego di 2 enzimi di restrizione: • • Svantaggio: E’ necessario trovare un unico tampone compatibile con entrambi gli enzimi di restrizione, tale cioè per cui le attività di entrambi risultino adeguate e possano essere contemporanee. A questo scopo si possono consultare le interessanti tabelle di compatibilità della NewEnglandBioLab. (www.neb.com). Lavorare con tamponi non adatti può portare alla formazione di tagli casuali (star activity) è allora consigliato utilizzare un tampone che dia almeno 50% di efficienza per entrambi gli enzimi; se si è costretti ad utilizzare un tampone che riduce l’efficienza di un enzima aumentare le unità di quest’ultimo (cfr. tabelle dei cataloghi delle ditte di produzione dei tamponi). In realtà però questo normalmente non lo si fa, sapendo che un’unità d’enzima taglia 1 μg di DNA di fago λ in 30’ e che l’enzima è generalmente fornito concentrato 10-20 unità / μl, poiché normalmente se ne usa almeno 1 μl e questa è già una quantità eccessiva d’enzima per la quantità di DNA che dobbiamo tagliare. Se non c’è possibilità di utilizzare un tampone che permetta almeno il 50% di attività per ognuno dei due enzimi (o per necessità operative si vuole utilizzare gli enzimi nei loro tamponi più adatti) si può prima tagliare il DNA con un solo enzima in presenza del suo tampone idoneo, poi fare un trattamento fenolo:cloroformio per togliere l’enzima, precipitare con etanolo per togliere il tampone e poi risospendere in TE. In seguito effettuare il secondo taglio con il secondo enzima (digestioni separate) Svantaggio: nelle tabelle sopra citate è riportato inoltre il numero di nucleotidi d’"appoggio" minimo affinché l’enzima sia in grado di agire (nucleotidi fiancheggianti il sito di restrizione che favoriscono il taglio da parte 103 3 ottobre 2008 • • Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne dell’enzima); sono dati utili soprattutto nel caso di polilinker in cui la troppa vicinanza tra i siti di restrizione a volte può rendere inutilizzabile un sito di taglio: nonostante il tampone sia corretto per i due enzimi, uno dei due non può agire, perché deficiente dell’opportuno “appoggio” perduto dopo il taglio del primo enzima. Unico sistema per risolvere un simile caso è l’incubazione del plasmide alternativamente prima con l’enzima che richiede il più basso numero di nucleotidi d’appoggio e poi con l’altro enzima. Queste tabelle risultano molto utili da consultare, sebbene un valido consiglio è quello di provarne realmente la validità in base alle proprie condizioni di lavoro e al proprio materiale (studiando la sequenza nucleotidica e le distanze dai vari siti di taglio). Vantaggio: le due zone di taglio non essendo compatibili, non manifestano la tendenza a richiudersi; Vantaggio: è possibile controllare il mantenimento della giusta direzione di clonaggio; infatti in questo caso il clonaggio può essere direzionale, per cui il frammento si inserisce solo in una certa maniera prevista e voluta considerando le altre zone del plasmide (es promotore e altre regioni consenso) che possono determinarne l’attività. Nota: esistono enzimi che sono isoschizomeri, sono cioè enzimi diversi che riconoscono e tagliano sequenze uguali. Si possono trovare in commercio enzimi isolati da organismi diversi che però hanno struttura e funzione simile. Preparazione del frammento Nonostante in molti casi il frammento da clonare sia ottenuto in modo diverso (per esempio mediante PCR) è frequente il caso in cui il frammento da clonare si trova già inserito in un vettore plasmidico. In questo caso si parla di sublconaggio, oppure di mobilizzazione del frammento. Nell’ambito delle esercitazioni del corso di Tecnologie Biomolecolari è previsto un subclonaggio, per cui la procedura dettagliata in seguito è relativa alla purificazione di un frammento precedentemente clonato. In questa esercitazione, a partire dalla digestione del plasmide donatore (che cioè contiene il frammento da mobilizzare in un altro plasmide) viene effettuata una corsa elettroforetica, la quale separa i due frammenti ottenuti (vettore + frammento da clonare) di diverso peso molecolare. Viene pertanto caricato su gel tutto il plasmide donatore dato che bisogna recuperare la massima quantità di frammento da utilizzare in seguito. E’ necessario valutare attentamente il rapporto di dimensione tra il frammento exciso e il vettore che lo conteneva. E’ importante infatti essere sicuri che ciò che si recupera da gel corrisponda al frammento di nostro interesse. Questo non è problematico se il frammento ha delle dimensioni molto più piccole del corrispondente vettore, poiché correrà molto più velocemente tra le maglie del gel e sarà evidenziabile verso il fine corsa. Difficile invece è tale valutazione se le dimensioni dei 2 sono tali che si potrebbe confondere il frammento con il plasmide non digerito, che dà comunque due bande corrispondenti alle forme superavvolta e circolare aperta. In questo secondo caso è allora consigliabile far correre a fianco dei nostri digeriti anche il plasmide non digerito, in modo da avere un riferimento sull’avvenuta digestione. La durata della corsa elettroforetica deve essere tale da separare il frammento da clonare dal vettore. Dal gel viene poi estratta la banda corrispondente al frammento con uno dei protocolli descritti in seguito (Qiaex oppure Geneclean). Se necessario, si può concentrare il plasmide donatore (tagliato con gli opportuni enzimi) per precipitazione in un volume tale da poter essere tutto caricato su gel (vedi Precipitazione del DNA). Preparazione del plasmide ricevente La digestione del plasmide ricevente viene controllata caricando una minima aliquota di DNA digerito su gel d’agarosio. E’ importante che su gel appaia un’unica banda netta. Se su gel appaiono due bande, una dovuta alla digestione totale ed una a quella parziale, significa che il taglio del plasmide ricevente non è completo, conviene quindi ripetere la digestione oppure procedere con una nuova estrazione (prolungare il tempo di digestione non serve per ottenere una digestione totale). Questo perché un plasmide non linearizzato ha un’efficienza di trasformazione molto superiore a quella dei vettori contenenti il frammento clonato, in quanto i plasmidi ricombinanti conterranno dei nick nella zona di ligatura che porteranno il plasmide ad assumere una conformazione open-circular. Questo tipo di conformazione ha infatti un’efficienza di trasformazione inferiore rispetto ai plasmidi superavvolti (non digeriti). Il plasmide ricevente dovrà successivamente sopportare un ulteriore trattamento che consiste in una defosforilazione delle estremità per evitare che il vettore si richiuda su se stesso. 104 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Fosfatasi alcalina La fosfatasi alcalina catalizza la rimozione del gruppo fosfato al 5’ di molecole di DNA, RNA, ribo e deossiribonucleosidi trifosfati. In commercio si trovano duetipi di fosfatasi alcalina: - CIP fosfatasi alcalina di intestino di vitello - BAP fosfatasi alcalina batterica estratta da E. coli Entrambe le fosfatasi richiedono Zn2+ per la loro attività (a differenza della DNasi), oltre a Mg2+ e Tris come gli enzimi di restrizione. Il tampone CIP perciò, a differenza di quelli degli enzimi di restrizione, ha la peculiarità di contenere Zn2+. In base alle tabelle della New England BIO Lab, oltre al tampone proprio dell’enzima, i tamponi universali 2,3 e 4 (NEB) che possono essere impiegati per la linearizzazione del plasmide permettono anche l’azione di CIP. Questo è probabilmente possibile poiché la soluzione di conservazione della fosfatasi contiene una già una alta concentrazione di zinco. In passato la procedura seguita era quella di trattare con fenolo-cloroformio il DNA tagliato con gli enzimi di restrizione per eliminare gli enzimi stessi e precipitare il DNA per eliminare il tampone. Successivamente si proseguiva con il trattamento con fosfatasi alcalina dopo aver risospeso il DNA. Questa precipitazione aumentava però il rischio di perdere il DNA. Perciò oggi la fosfatasi viene aggiunta direttamente al campione trattato con gli enzimi di restrizione, che durante l’attività della CIP continuano (se necessario) la digestione del DNA. Con la defosforilazione si rimuovono le estremità 5’ fosforilate prodotte dagli enzimi di restrizione ed utilizzate dalle ligasi per la richiusura dei nick. Questo passaggio è fondamentale in quanto il vettore digerito con gli enzimi di restrizione presenta spesso delle estremità coesive, che successivamente potrebbero essere usate dalla ligasi per unire due plasmidi o richiudere il plasmide su se stesso dando luogo ad un vettore privo del frammento di interesse. Con esso in seguito si andrebbe a trasformare E. coli ottenendo colonie non ricombinanti. Defosforilando le estremità 5’ del vettore, la ligasi può agire solo unendo un vettore con un frammento che fornisce le estremità fosforilate. Il fosfato mancante su entrambi i filamenti al 5’ viene ripristinato da E. coli in seguito alla trasformazione, al momento della divisione cellulare (duplicazione del plasmide). Dopo la defosforilazione è necessaria la rimozione completa della fosfatasi per evitare la defosforilazione del frammento una volta che questo viene aggiunto al plasmide ricevente per la ligatura. CIP è sensibile al calore, per cui bastano 60 minuti a 65°C per degradarla, mentre per eliminare BAP si necessita di un trattamento deproteinizzante con fenolo/cloroformio, seguito da una precipitazione in etanolo per recuperare il DNA, puro, come serve alla ligasi. Oggi si preferisce ricorrere a purificazioni con resine che rendono questa procedura più semplice e soprattutto più riproducibile. 105 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Esempio in figura Quantificazione del DNA Il plasmide e il frammento vengono quantificati su gel di agarosio. Il frammento nella fase di ligatura deve essere presente in eccesso in modo tale da ridurre la formazione di vettori non ricombinanti (causati dall’unione di due vettori o dalla richiusura di un vettore su se stesso), che ridurrebbe la quantità di vettore disponibile per il frammento. Infatti, i due vettori appaiati non sarebbero soggetti all’azione della ligasi, in quanto defosforilati, e perciò non verrebbero trasferiti in E. coli. Quantificazione → Vettore : Frammento = 1 : 2 106 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Il rapporto si riferisce al numero di molecole e non alla quantità di DNA; si avrebbe corrispondenza tra i due rapporti solamente se il frammento ed il plasmide ricevente avessero le stesse dimensioni. Assumendo ad esempio di avere un frammento di 1.2 kbp e un vettore di 1 kbp, usare per esempio 240 ng di frammento e 100 ng di vettore. Ligatura Viene assemblata una reazione di ligatura del frammento e del vettore, utilizzando i corretti rapporti quantitativi precedentemente determinati. La ligatura viene effettuata mediante l’enzima DNA ligasi. DNA ligasi La ligasi catalizza la formazione di legami fosfodiesterici tra il terminale 5’ fosfato e il 3’ idrossiterminale in molecole di DNA a doppio filamento. Vi sono due tipi di ligasi: - ligasi di E.coli - ligasi del fago T4 (PM 68000) questi enzimi differiscono per due importanti proprietà: fonte di energia: - ligasi T4 usa ATP - ligasi di E.coli usa NAD+ estremità unite: - ligasi T4 unisce sia estremità piatte che estremità coesive - ligasi di E.coli unisce solo estremità coesive La ligasi agisce su tre tipi diversi di rotture: - riparazione della rottura di un filamento del DNA ds (double strand) - unione di frammenti di DNA a doppio filamento con estremità piatte 107 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne - unione di frammenti di DNA a doppio filamento con estremità coesive LIGATURA INTERMOLECOLARE ED INTRAMOLECOLARE Le concentrazioni assolute e relative dei frammenti di DNA di inserzione influenzano le frequenze degli eventi di ligatura. Ligatura intramolecolare: l’estremità di una molecola di DNA si unisce all’altra estremità della stessa molecola. Ligatura intermolecolare: l’estremità di una molecola di DNA si unisce ad un’altra molecola di DNA. La ligatura intermolecolare può verificarsi tra molecole delle stesso tipo (vettore-vettore, frammento-frammento) o tra molecole di diverso tipo (vettore-frammento). La costruzione di molecole ibride coinvolge nella maggior parte dei casi eventi di ligatura intermolecolare seguiti da un evento finale intramolecolare per generare una molecola di plasmide circolare. 108 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Eventi di ligatura intramolecolare Gli eventi intramolecolari sono la fonte principale di background negli esperimenti di clonaggio poiché la richiusura del vettore su se stesso genera molecole di DNA che producono cellule di E. coli trasformate ma senza frammento. Comunque, poiché la ligatura intramolecolare può avvenire solo se le estremità della molecola sono coesive o piatte, essa può essere completamente eliminata usando molecole con estremità eterologhe. Ciò è ottenuto tagliando il vettore con due enzimi di restrizione che producono estremità incompatibili. In situazioni in cui il vettore deve essere tagliato con una singola endonucleasi di restrizione l’unione intramolecolare può essere evitata rimovendo entrambi i 5’ fosfati di ogni molecola con la fosfatasi alcalina. Queste molecole di DNA defosforilate possono essere legate a frammenti di DNA fosforilati anche se a ciascuna estremità uno solo dei due filamenti sarà unito covalentemente in vitro. E. coli riparerà i nick a singolo filamento in vivo per generare la molecole di DNA desiderate. La ligatura intramolecolare dei frammenti di inserzione generalmente non influenza il background di colonie indesiderate; tuttavia essa influenza fortemente la frequenza di ottenimento delle colonie correte poiché frammenti di DNA richiusi su se stessi non possono essere uniti al vettore. Quindi in situazioni in cui i frammenti di DNA possono circolarizzare devono essere usate elevate concentrazioni di DNA per favorire eventi di ligatura intermolecolare. Questo è particolarmente vero per corti frammenti che sono più propensi a circolarizzare dei frammenti grandi. Eventi di ligatura intermolecolari Tutti gli esperimenti di clonaggio che usano plasmidi vettori richiedono l’unione di due o più molecole di DNA separate seguite da circolarizzazione del prodotto. Ovviamente, eventi di ligatura intermolecolare divengono sempre più favoriti rispetto agli eventi intramolecolari man mano che la concentrazione totale delle estremità aumenta. Perciò l’efficenza di clonaggio risulta ottimale quando le concentrazioni di DNA sono sufficientemente alte da permettere l’unione intermolecolare ma non così alte da ridurre la ligatura intramolecolare. Per avere un basso background si utilizzano concentrazioni di DNA tra 1 e 50 μg/ml. Se escludiamo gli eventi di richiusura della molecola su se stessa, la frequenza di unione di segmenti di DNA differenti è direttamente correlata alla molarità di ogni componente in termini di specifiche estremità da unire. Per esempio, se sono presenti quantità equimolari di vettore e frammento, il 50% dei prodotti bimolecolari sarà vettore-frammento, il 25% sarà vettore-vettore eil 25% sarà frammento-frammento. Comunque, poiché nella maggior parte dei casi solo le molecole contenenti il vettore genereranno E.coli trasformati, è preferibile usare concentrazioni molari più alte di frammento poiché questo favorirà i prodotti desiderati vettore-frammento rispetto al background vettore-vettore. Questa considerazione è meno importante se l’unione vettore-vettore è esclusa da un trattamento con la fosfatasi o se l’unione vettore-vettore non può generare molecole vitali. 109 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Esempi di clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA con estremità coesive ed omologhe Questo tipo di clonaggio prevede l’inserzione di un frammento di DNA, ottenuto usando l’enzima tipo EcoRI, in un vettore contenente un singolo sito EcoRI. La fonte principale di background (molecole indesiderate) è data dalla presenza di vettori di DNA non tagliati o richiusi senza frammento. Nella maggior parte dei casi la richiusura del plasmide su se stesso può essere ridotta trattando il vettore con la fosfatasi alcalina CIP. Anche se il trattamento con la fosfatasi abbassa l’efficienza assoluta di ottenimento delle molecole di DNA desiderate, la grande riduzione del background eleva significativamente la frequenza relativa di molecole ricombinanti. La concentrazione del frammento da clonare deve essere relativamente elevata per facilitare la ligatura nel vettore. Inoltre anche il frammento può contribuire al background legandosi a se stesso specialmente quando è difficile estrarlo dal vettore originale. Poiché tutte le estremità tagliate con EcoRI sono equivalenti, il frammento può inserirsi in entrambi gli orientamenti rispetto alla sequenza del vettore. Questi due risultati possono essere distinti solamente tramite una mappa di restrizione ottenuta usando un’enzima che taglia asimmetricamente all’interno del frammento, oppure mediante PCR utilizzando un primer sul vettore e un primer sul frammento. E’ possibile che più copie del frammento si inseriscano all’interno del vettore. Generalmente l’inserzione multipla non è tuttavia frequente a meno che le concentrazioni di DNA non siano molto elevate. Quando si verificano inserzioni multiple i frammenti sono solitamente orientati nella stessa direzione; le molecole contenenti coppie in tandem orientate in direzioni opposte sono incapaci di replicazione in E. coli a meno che il frammento inserito non sia molto corto (meno di 30 bp). 110 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Per tutte queste ragioni il clonaggio di frammenti con estremità coesive ed omologhe va possibilmente evitato. Il clonaggio direzionale è preferibile. Clonaggio direzionale di frammenti con estremità eterologhe Questo è il metodo di clonaggio più efficiente e deve essere usato ogni qualvolta sia possibile. Il frammento ed il vettore di clonaggio sono entrambi ottenuti mediante taglio con due diversi enzimi di restrizione. In questo modo entrambi i segmenti di DNA teoricamente non possono richiudersi su se stessi poiché le estremità non sono complementari. Quindi quasi tutte le cellule trasformate conterranno molecole ricombinanti nelle quali la copia del frammento di inserzione è orientata in una direzione definita rispetto la vettore. Molecole contenenti due copie di frammento non si possono formare e quelle con tre copie saranno molto rare. Il maggior problema associato al clonaggio direzionale deriva da errori nella generazione dei segmenti di DNA, in particolar modo dal taglio incompleto del vettore da parte di uno degli enzimi di restrizione. I vettori che sono tagliati in un solo punto possono richiudersi su se stessi e generare molecole indesiderate. Le molecole tagliate da entrambi gli enzimi possono essere separate da quelle tagliate in modo incompleto attraverso una corsa elettroforetica. Tuttavia questo non è possibile quando i siti di taglio dei due enzimi sono molto vicini. Inoltre se i due siti sono estremamente vicini può essere difficile il taglio delle molecole con entrambi gli enzimi di restrizione. La grande efficienza del clonaggio direzionale permette la creazione di molecole formate da tre o più segmenti: la tipica unione di tre segmenti si ottiene tagliando con tre diversi enzimi di restrizione (A, B, C); i tre frammenti sono generati rispettivamente dagli enzimi A e B, B e C, A e C. Il ricombinante composto dai tre frammenti si ottiene con minore efficienza rispetto all’unione di due frammenti. Comunque il basso livello di background permette di ottenere le molecola desiderate con una frequenza sufficiente da permettere l’analisi individuale delle colonie. 111 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Clonaggio di frammenti di DNA con estremità piatte L’unione di frammenti con estremità piatte si ottiene utilizzando la T4 DNA ligasi. L’efficienza di ligatura è molto ridotta confronto all’unione di segmento con estremità coesive. Il clonaggio di frammenti di DNA con estremità piatte viene facilitato dall’uso di elevate concentrazioni di DNA e da una quantità dieci volte superiore di ligasi. A differenza dell’unione di estremità coesive che richiede la compatibilità, i frammenti piatti sono ligabili indipendentemente dall’enzima usato per produrne le estremità. L’unione delle estremità piatte prodotte da diversi enzimi quasi sempre dà come risultato una molecola che non può più essere tagliata da entrambi gli enzimi. Le ligature più difficili sono quelle in cui tutte le estremità sono piatte (es. clonaggio di un frammento tagliato con SmaI in un vettore tagliato con SmaI). I problemi che ne derivano sono simili a quelli descritti per il clonaggio di frammenti con estremità coesive ed omologhe sommati al problema dell’inefficienza della ligatura. Il clonaggio che coinvolge estremità piatte è estremamente più facile se uno degli eventi di ligatura riguarda estremità coesive. Ad esempio due frammenti generati da SmaI e EcoRI sono uniti molto più facilmente che due segmenti generati da SmaI. Inoltre queste estremità eterologhe permettono il clonaggio direzionale e le molecole indesiderate sono poche. 112 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Clonaggio di frammenti di DNA con estremità incompatibili Per unire estremità incompatibili (ad esempio una 5’ protruding AATT ottenuta con EcoRI e una 3’ protruding AGTC ottenuta con SacI) è necessario convertirle in estremità piatte. Per le 5’ protruding la conversione in estremità piatte è ottenuta attraverso l’attività del frammento Klenow dalla DNA polimerasi I di E.coli in presenza dei quattro deossiribonucleotidi trifosfati (dNTP). Questa reazione deve avvenire in presenza di tutti e quattro i nucleotidi per prevenire una più estesa azione dell’esonucleasi. Per le 3’ protruding viene utilizzata la T4 DNA polimerasi con attività esonucleasica 3’→5’ o l’enzima S1. La T4 DNA polimerasi è preferibile poiché possiede una maggiore attività esonucleasica ma è più costosa dell’enzima di Klenow. Entrambe le polimerasi sono attive in tutti i tamponi degli enzimi di restrizione e quindi possono essere aggiunte (assieme ai quattro deossiribonucleotidi trifosfati) direttamente nella soluzione di reazione dopo il taglio. Diversi manuali suggeriscono l’impiego di esonucleasi che tagliano il DNA a singola elica (S1) in modo da rimuovere la protuberanza. Nessun sistema è comunque efficiente per l’appiattimento di estremità 3’. Si sconsiglia vivamente pertanto di appiattire questo tipo di estremità. Una volta che le estremità sono state rese piatte la procedura di ligatura è la stessa dell’esempio precedente. Tuttavia il passaggio addizionale per creare le estremità piatte solitamente causa una più bassa efficienza di ligatura; più estremità devono essere rese piatte più problematica risulta la procedura. Quando si devono unire estremità incompatibili è preferibile se alcune delle reazioni di ligatura coinvolgono estremità coesive: ad esempio l’unione di un frammento tagliato con BamHI e EcoRI con un frammento generato da BamHI e SacI. In molti casi l’unione di estremità incompatibili crea una molecola che non può più essere tagliata da entrambi gli enzimi di restrizione usati per produrre le estremità. In questi casi, la struttura della molecola nel punto di fusione può essere determinata solo attraverso sequenziamento del DNA. Alcune volte comunque uno dei siti di restrizione può essere rigenerato rendendo così possibile l’analisi della molecola risultante attraverso una mappa di restrizione. Ad esempio al 5’ protruding generato da EcoRI la polimerasi produce una sequenza terminale GAATT che unita al nucleotide C (es. sito SacI) dell’altro frammento rigenera un sito EcoRI. Se tuttavia le estremità prodotte da EcoRI e SacI vengono unite in modo aberrante non vi sarà rigenerazione del sito EcoRI. Ligatura di frammenti generati da taglio parziale A volte un dato frammento di DNA contiene siti interni di restrizione che sono gli stessi di quelli presenti ad una o ad entrambe le estremità. In questo caso, il frammento può essere ottenuto solo attraverso digestione parziale con endonucleasi di restrizione. Non è difficile ottenere molecole ibride di DNA quando uno o più dei componenti è generato da taglio parziale con endonucleasi di restrizione. Dopo aver ottenuto attraverso purificazione da gel i prodotti del taglio parziale desiderati, le reazioni di ligatura possono essere preparate nel modo normale, e saranno ugualmente efficienti. La principale difficoltà del taglio parziale, ossia ottenere una quantità sufficiente del frammento specifico, può solitamente essere superata impiegando più DNA (da 1 a 5 μg) prima dell’elettroforesi su gel. Per assicurare il 113 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne grado appropriato di digestione parziale, può essere usato il metodo della diluizione seriale dell’enzima (serie di digestioni effettuate con diluizioni crescenti dell’enzima). In alcuni casi può essere difficile purificare il prodotto del taglio parziale desiderato dai prodotti indesiderati, specialmente se la molecola di partenza contiene molti siti di taglio o se i siti di taglio sono ravvicinati. Comunque, se la reazione di ligatura presenta un basso background questi frammenti indesiderati sono un problema minore. Per esempio, se la banda che viene tagliata dal gel contiene quattro differenti frammenti clonabili, circa il 25 % dei trasformanti dovrebbe essere quello di interesse. Inoltre, se il frammento viene generato da taglio parziale a una estremità e da taglio completo da parte di un altro enzima all’altra estremità, molti dei frammenti contaminanti non possono venire clonati nel vettore e quindi non contribuiscono al background. Ligatura con linker oligonucleotidici I linker sintetici sono oligonucleotidi complementari a se stessi , tipicamente lunghi da 8 a 10 basi, che si appaiano per formare DNA a doppio filamento con estremità piatte, che contengono un sito di restrizione. Per esempio, GGAATTCC è un linker EcoRI di 8 bp ( i nucleotidi sottolineati rappresentano il sito di riconoscimento). I linker oligonucleotidici facilitano il clonaggio di frammenti di DNA con estremità piatte, e sono utilizzabili per introdurre nuovi siti di restrizione in posizioni desiderate. In commercio è disponibile una grande varietà di linker, ognuno contenente una specifica sequenza di riconoscimento. I linkers sono solitamente ottenuti in forma non fosforilata. Per la maggior parte delle applicazioni essi sono fosforilati usando ATP e T4 polinucleotide chinasi. Dopo la reazione della chinasi, i linker fosforilati possono essere aggiunti direttamente nella reazione di ligatura. La ligatura che coinvolge linker avviene in tre stadi. 1. 2. 3. Il DNA di interesse, che deve avere estremità piatte, è unito al linker come mostrato in figura. Questa reazione è ottenuta con una quantità da 0.1 a 1 μg di linker, che rappresenta un eccesso molare (da 100 a 1000 volte) di linker rispetto al frammento. L’elevata concentrazione di estremità rende questa ligatura con estremità piatte più efficiente del normale. Generalmente, il linker è fosforilato prima della ligatura. In questo caso, i prodotti della ligatura contengono tipicamente parecchi linker ad ogni estremità del frammento. Alcuni esperimenti coinvolgono ligature di linker non fosforilati: i prodotti conterranno solo un linker ad ogni estremità. Dopo trattamento termico per inattivare la ligasi, i prodotti di questa reazione sono tagliati con l’enzima di restrizione che riconosce il linker (come mostrato in figura). A causa dell’alta concentrazione di siti di restrizione dovuti al linker, questo stadio richiede una incubazione di parecchie ore con una grande quantità di enzima di restrizione (da 20 a 50 U) . E’ importante che il frammento non contenga un sito interno riconosciuto dall’enzima di restrizione (a meno che il frammento non sia stato preventivamente metilato dalla metilasi corrispondente all’enzima di restrizione ). Se è possibile, i prodotti della ligatura, vanno tagliati con un secondo enzima di restrizione per produrre un frammento con estremità eterologhe appropriate per il clonaggio. Il frammento viene purificato tramite elettroforesi su gel di agarosio e quindi legato con i metodi tradizionali. Lo stadio della purificazione su gel rimuove anche i linker non legati, che interferirebbero con questo secondo stadio di ligatura. I linker possono anche essere rimossi attraverso altri metodi (cromatografia su Sepharose CL-4B o Sephacril S-300), ma l’elettroforesi su gel è più efficiente e permette la purificazione del frammento desiderato da frammenti indesiderati. 114 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Clonaggio di oligonucleotidi sintetici Gli oligonucleotidi a doppio filamento utilizzabili per il clonaggio possono essere ottenuti attraverso l’appaiamento di due oligonucleotidi a singolo filamento sintetizzati chimicamente. Generalmente questi oligonucleotidi vengono fosforilati con la T4 chinasi prima dell’appaiamento. Gli oligonucleotidi a doppio filamento fosforilati possono anche essere generati tramite “mutually primed synthesis” di appropriati oligonucleotidi a singolo filmento. Esempio di mutually primed synthesis, i due oligo (riga intera) sono complementari per circa 10 basi in modo da formare una struttura che puo’ essere estesa con Klenow, oppure mediante PCR, per completare la doppia elica. Gli oligonucleotidi ottenuti attraverso entrambi i metodi possono venire clonati utilizzando le procedure standard di ligatura. Il principale problema associato al clonaggio degli oligonucleotidi è quello dell’inserzione multipla. Questo perché piccole quantità di oligonucleotidi rappresentano un grande eccesso molare. Questo problema è superato effettuando una serie di diluizioni dell’oligonucleotide e allestendo reazioni di ligatura in parallelo usando queste diverse concentrazioni. Se si desiderano inserzioni singole, i trasformanti devono essere recuperati da colonie che rappresentano la più bassa quantità di oligonucleotidi necessari per incrementare il numero di colonie significativamente sopra il background (es. assenza di oligonucleotidi). Generalmente la condizioni migliori per l’inserzione singola si hanno quando l’oligonucleotide è presente in eccesso molare (da 5 a 20 volte) rispetto agli altri frammenti nel mix di ligatura. Preparazione e trasformazione delle cellule competenti Perché la trasformazione risulti veramente efficiente i batteri devono essere opportunamente preparati, ovvero le cellule devono essere rese competenti, vale a dire suscettibili alla trasformazione. Questo è possibile trattando le cellule batteriche con CaCl2 oppure sottoponendole ad elettroporazione. Il trattamento con CaCl2 permette buone efficienze di trasformazione, è semplice e non necessita di specifiche apparecchiature. Le cellule competenti dopo questo trattamento possono essere conservate. L’elettroporazione è consigliata nel caso si necessiti di alte efficienze di trasformazione. Anche questa procedura è semplice, veloce e facilmente realizzabile. Richiede un elettroporatore. Come nel precedente protocollo, le cellule rese competenti possono essere conservate. 115 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Entrambe le tecniche si basano sul danneggiamento della membrana plasmatica dei batteri, rendendo così possibile l’ingresso di DNA plasmidico extracellulare. Preparazione cellule competenti con calcio cloruro Il metodo del CaCl2 è il più usato poiché è semplice, ripetibile e offre un’efficienza di trasformazione elevata: 5*106 ÷ 2*107 colonie trasformate per μg di DNA plasmidico superavvolto. Si specifica il fatto che deve essere superavvolto, in quanto la capacità di trasferimento è molto diversa rispetto al DNA “ricucito” in laboratorio. In questo caso l’efficienza varia molto in base alle capacità dell’operatore. L’inoculo deve essere realizzato in condizioni di sterilità perché eventuali contaminazioni proliferano nelle successive fasi di incubazione, dato che non sono presenti antibiotici (il batterio non porta ancora il plasmide con la resistenza). La difficoltà iniziale consiste proprio nel far crescere il ceppo in purezza senza la pressione selettiva data dall’antibiotico. Inoltre è necessario l’accorgimento di non utilizzare come ceppi per le cellule competenti quelli che portano già la resistenza all’antibiotico che ci servirà per verificare l’avvenuta trasformazione: ad esempio XL1blue che è Tcr porta un trasposone che conferisce resistenza alla tetraciclina. L’inoculo iniziale va calibrato in funzione della densità cellulare della sospensione di partenza. Infatti, normalmente l’inoculo corrisponde a 1 ml ma, con sospensioni cellulari concentrate, è necessario ridurne la quantità. Per avere uno sviluppo ottimale di cellule nei 100 ml di terreno si deve evitare di partire con un’elevata concentrazione cellulare perché altrimenti si raggiunge il limite di 108 cellule/ml troppo velocemente con poche cellule giovani allo stadio di crescita esponenziale e conseguente bassa percentuale di competenza alla trasformazione. Infatti, per ottenere la massima resa in cellule competenti è necessario trattare con CaCl2 una popolazione batterica in intensa attività di crescita, ossia cellule ad uno stadio prossimo al punto di flesso della crescita esponenziale. Normalmente l’incubazione dura circa tre ore, ma è necessario monitorare la concentrazione di cellule nella sospensione per arrestare la crescita al punto di flesso della fase logaritmica, che si stima essere in corrispondenza di una densità cellulare di circa 1 ÷ 4*108 cellule/ ml. L’analisi della crescita cellulare si esegue misurando la densità ottica del mezzo a 600 nm. Secondo il ceppo la densità ottica ottimale si aggira tra 0.2 ÷ 0.4. Si esegue la prima misura allo spettrofotometro dopo 1 ora di incubazione, e si realizzano le successive circa ogni 30 minuti. Naturalmente come bianco di riferimento si usa il terreno LB puro. È possibile calcolare il tempo che deve trascorrere tra una misura e la successiva conoscendo la velocità di divisione del batterio. Si considera che E.coli si divide ogni 20 minuti; perciò si stima che la densità ottica aumenti dell’80% ogni 30 minuti. Se già dopo 30 min di incubazione è raggiunta un’OD600=0.3, significa che l’inoculo iniziale era eccessivo. L’efficienza di trasformazione di cellule rese competenti con CaCl2 dipende da tre fattori importanti a cui è necessario prestare particolare attenzione: • Le cellule devono trovarsi nella fase logaritmica di crescita. • Mantenimento delle cellule in ghiaccio, nei passaggi in cui è specificato dal protocollo, per rallentarne il metabolismo. 116 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne • Esposizione prolungata a CaCl2 Questi tre punti sono particolarmente importanti e se eseguiti in modo scrupoloso, si avrà una buona efficienza di trasformazione. Le cellule una volta rese competenti con CaCl2 devono essere trasformate. Un buon metodo per farlo è quello di sottoporle ad uno shock termico, raffreddarle immediatamente dopo e farle crescere per un’ora a 37°C. In seguito si seminano in piastra in un terreno selettivo un antibiotico a cui le cellule trasformate dovrebbero sviluppare resistenza. Questo ci permette di isolare soltanto le cellule effettivamente trasformate. Generalmente solo il 3-10% delle cellule trattate con CaCl2 sono rese competenti e la trasformazione è tanto più difficile tanto più grosso è il plasmide da incorporare. Il numero di cellule trasformate aumenta linearmente con l’aumentare del numero di plasmidi fino ad un limite massimo di 10 ng di plasmide per 100 μl di cellule competenti. Raggiunto questo limite non si ha più un incremento lineare di trasformazione rispetto alla quantità di DNA fornito. Preparazione di cellule elettrocompetenti L’elettroporazione è molto più effieciente rispetto alla trasformazione con CaCl2. Dato che la preparazione dlle cellule elettrocompetenti consiste semplicemente in una serie di lavaggi che hanno lo scopo di rimuovere i sali, si possono accorciare i tempi di centrifugazione aumentando la velocità, non è necessario l’uso di glicerolo nei lavaggi se le cellule sono usate immediatamente, ed è possibile lavorare RT. L’ellettroporazione è una tecnica valida per trasferire DNA sia in cellule eucarioti che in quelle procarioti. Questo metodo è applicabile a diversi ceppi di E. coli e anche ad altri batteri sia gram positivi che gram negativi. In pratica viene applicato alle cellule un breve campo elettrico ad alto voltaggio, che produce dei buchi temporanei nella membrana plasmatica della cellula batterica attraverso i quali il DNA plasmidico può entrare. Per una trasformazione con buona efficienza, la forza del campo elettrico deve essere di circa 12.5 kV/cm. Il numero di cellule trasformate che riescono a sopravvivere dipende dall’intensità del campo elettrico e dalla durata dell’impulso. The field strength used for mammalian cell and plant protoplast electroporation is usually 0.5 to 1 kV/cm. The field strength needed for high-efficiency transformation of E. coli is much greater, usually ~2.5 kV/cm. Under these conditions up to 1010 transformants/ug plasmid DNA have been reported. Recently, field strength up to 8 kV/cm was also used successfully to electroporate both mammalian cells and plant protoplasts. L’elettroporatore crea nella celletta contenente il campione un impulso elettrico che ha un decadimento di tipo esponenziale. Il voltaggio attraversa i due elettrodi e cresce raggiungendo rapidamente un picco, che poi decade secondo l’equazione: Vt = V0 [e-t/T] dove Vt è il voltaggio ad un determinato tempo t V0 è il voltaggio iniziale t è il tempo in secondi T = pulse time constant = RC (R = resistenza del circuito in ohms e C = capacità del circuito in Faraday) Nel caso di cellule di E. coli, T deve essere di 5 – 10 msec. T troppo basse indicano una presenza eccessiva di sali che comporta una elettroporazione poco efficiente, in quanto il campo elettrico non attraversa la cellula. Il numero di cellule trasformate aumenta linearmente con l’aumentare della quantità di DNA disponibile per la trasformazione. Questa linearità è rispettata in un ampio range con contenuti di DNA che vanno dai 5 pg ai 500 ng. Tuttavia l’efficienza di trasformazione non è correlata alla quantità di DNA, anche se con quantità di DNA inferiori ai 5 pg diminuisce sensibilmente. Anche le dimensioni del DNA non hanno molta influenza sull’efficienza di trasformazione. Inoltre plasmidi superavvolti e costrutti creati in laboratorio vengono introdotti nella cellula allo stesso modo. Cellule fresche mostrano un’efficienza di trasformazione maggiore di cellule congelate. In genere si hanno efficienze di trasformazione dell’ordine di 10 9 -10 10 cellule trasformate/μg di DNA 117 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Screening colorimetrico e controllo cellule ricombinanti Le colonie trasformate con plasmidi ricombinanti sono spesso individuabili mediante screening bianco-blu, un riconoscimento che consiste nell’osservare il colore con cui appaiono le colonie dopo esser state piastrate su terreno LB selettivo in presenza degli appositi marcatori (IPTG e X-GAL). Lo screening si basa sulla colorazione determinata dall’interazione della β-galattosidasi con il substrato X-GAL, composto incolore che se attaccato alla β-galattosidasi diviene blu. Tutto ciò è possibile perchè nella regione del polilinker del plasmide è inserito l’operone del lattosio pLac: se il plasmide è ricombinante viene tagliata proprio questa regione interrompendo il gene che codifica per la βgalattosidasi e dunque il composto rimane incolore o bianco. LacZ danneggiato → colonie bianche (gene interrotto-inserito nel polilinker) LacZ integro → colonie blu (gene funzionale-non inserito nel polilinker) L’operone del lattosio comunque è un operone inducibile, quindi, necessita di lattosio per attivare la trascrizione della β-galattosidasi. Esiste però un problema: la β-galattosidasi attivata scinde il lattosio che, venendo degradato, interromperà la trascrizione dell’enzima stesso. Perciò si aggiunge alla piastra un suo analogo, l’IPTG, che pur attivando la trascrizione dell’operone non viene degradato dall’enzima (è un induttore costante). Nello screening colonie bianche-blu il colore non è sempre facilmente individuabile, si possono infatti ottenere anche colonie a varia gradazione di blu. Diversi possono essere gli eventi accaduti in relazione a varie situazioni: 1. il frammento viene inserito non in ORF, si genera un peptide che non corrisponde alla β-galattosidasi → colonia bianca. 2. il frammento viene inserito in ORF ma non è un multiplo di tre, questo fa sfalsare la fase di lettura → colonia bianca. 3. il frammento viene inserito in ORF ed è un multiplo di tre, genererà un polipeptide con qualche aminoacido in più rispetto alla β-galattosidasi, che può avere una parziale attività enzimatica → colonia azzurra. 4. il frammento viene inserito in ORF ed è un multiplo di tre, ma contiene un codone di stop, questo farà terminare la trascrizione → colonia bianca. 5. il frammento non viene inserito e il plasmide vettore anche se tagliato nel polilinker riesce a richiudersi (più facile con un solo enzima di restrizione) e dare una β-galattosidasi funzionante → colonia blu. 6. il frammento non viene inserito ma la fosfatasi degrada parzialmente il plasmide vettore alle sue estremità compromettendo la sintesi di β-galattosidasi → colonie bianche. 7. il frammento non viene inserito e la fosfatasi degrada le estremità del plasmide ricevente ma per un numero di nucleotidi multiplo di tre, si può ottenere allora una β-galattosidasi che anche se deficiente di alcuni aa riesce a svolgere parzialmente la sua funzione → colonie azzurre. 8. in un clonaggio non direzionale in cui il frammento ha due estremità uguali date dal taglio con lo stesso enzima di restrizione, il frammento viene inserito in ORF ma è un multiplo di tre e contiene al suo interno anche un sito di fine della trascrizione, così: • Il frammento è inserito nella direzione per cui il codone di stop è in ORF, questo determina il termine della trascrizione → colonia bianca. • Il frammento è inserito nella direzione opposta per cui non è più presente un segnale di fine della trascrizione → colonia azzurra. Lo screening colorimetrico fornisce delle informazioni indicative sull’avvenuta ricombinazione ma per avere la certezza dell’esito positivo del clonaggio è bene andare ad isolare dalle colonie scelte il presunto frammento inserito. Per fare questo si amplifica la colonia in terreno liquido, si estrae il plasmide e si digerisce con enzima/i di restrizione. La successiva separazione elettroforetica conferma o meno la presenza dell’inserto atteso per confronto con opportuno marker di peso molecolare. Un metodo alternativo alla digestione ma più grossolano (usato quando si devono testare un numero notevole di colonie) consiste nel confronto fra i patterns dati dai diversi plasmidi ricombinanti e non. E’ possibile usare questo sistema solo quando inserto e vettore sono ben diversi come massa molecolare e tale differenza è facilmente apprezzabile su gel di agarosio. Comunque tale analisi è ancora indicativa, anche in questo caso è consigliabile procedere con digestione enzimatica. 118 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Protocolli clonaggio Purificazione dei plasmidi e quantificazione del DNA 1. Estrarre il plasmide donatore e quello ricevente da E. coli con il metodo ritenuto più idoneo (vedi Minipreparazione di DNA plasmidico). 2. Controllare 5 µl di campione estratto su gel di agarosio (vedi Elettroforesi su gel di agarosio). 3. Quantificare il DNA estratto (vedi Metodi di quantificazione del DNA). Questo passaggio serve per valutare le quantità di plasmidi da tagliare con gli enzimi di restrizione. I plasmidi devono essere presenti in quantità tale da permetterne la visualizzazione su gel (limite di rivelabilità = 20-25 ng). In ogni pozzetto si potrebbero caricare, ad esempio: 9 5 µl di DNA 9 1 µl di LB 9 4 µl di TE NOTA: Il TE è stato aggiunto allo scopo di raggiungere il volume di caricamento desiderato, ovvero 10 µl. Poteva altresì esser aggiunta acqua. Taglio con enzimi di restrizione 1. Taglio del plasmide donatore e del plasmide ricevente con gli enzimi di restrizione appropriati. Si può ipotizzare un volume finale di 15 μl, meglio 20μl, (in base alle dimensioni del pozzetto che si ha a disposizione) da cui si ricavano le aliquote dei vari componenti, nel nostro esempio: X μl di DNA 2 μl di tampone 10X 1 μl di enzima Acqua a volume 20 μl volume totale dove posso sostituire ad X il volume della soluzione campione dove è presente il DNA quantificato in base alla concentrazione stimata dal gel di prova. Per quanto riguarda le componenti del volume entro cui avverrà la reazione di taglio, esse devono essere aggiunte seguendo un ordine preciso, o meglio evitando alcune azioni scorrette: l’enzima deve assolutamente essere aggiunto per ultimo, dopo l’acqua, il tampone e il campione col DNA (non necessariamente in quest’ordine!). Infatti è necessario preparare un ambiente ideale (con il tampone già diluito) affinché l’enzima non subisca stress che potrebbero diminuirne l’attività o comunque alterarne la funzionalità. Inoltre per semplicità lavorative spesso si aggiunge il DNA come penultimo componente. 2. Incubare per 1h e 30’ a 37°C. Gli enzimi di restrizione riescono a tagliare in meno di 30 min, ma di norma si lasciano procedere per più tempo per assicurarsi un taglio completo. Prima della ligatura è necessario purificare e concentrare sia il vettore che il frammento; quest’ultimo dovrà essere estratto dal gel, mentre il vettore deve subire un protocollo di de-salting. Le procedure sono sostanzialmente equivalenti, con la differenza di temperatura di incubazione: T ambiente per il vettore, 50°C per sciogliere il gel. 119 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Preparazione del frammento 1. Se necessario, concentrare il plasmide donatore (tagliato con gli opportuni enzimi) per precipitazione in un volume tale da poter essere caricato su gel (vedi Precipitazione del DNA). 2. Corsa elettroforetica su gel (vedi Elettroforesi su gel di agarosio). Caricare su gel tutto il campione tagliato insieme al marcatore, nostro scopo è infatti recuperare la massima quantità di frammento per poi costruire il clonaggio. Se è possibile caricare lasciando dei pozzetti vuoti tra i diversi caricamenti, in quanto la successiva operazione di prelievo della banda da gel potrebbe disturbare i pozzetti adiacenti la banda excisa. La durata della corsa elettroforetica deve essere tale da separare il frammento da clonare dal vettore. 3. Tagliare la banda corrispondente al gene d’interesse con un bisturi pulito, cercando di ottenere una fettina sottile, individuandola al transilluminatore. Porla in un’eppendorf da 1.5 ml precedentemente tarata. Conservare al buio. Controllare che la banda sia stata completamente rimossa analizzando al transilluminatore il gel rimasto. È necessario evitare un’esposizione prolungata del DNA al transilluminatore o alla luce solare perché i raggi UV attivano l’etidio bromuro che rompe il DNA. 4. Recuperare il frammento dal gel e risospendere in 10 µl TE Impiegare il metodo ritenuto più opportuno, QIAEXII Agarose Gel Extraction oppure Geneclean. Preparazione del plasmide ricevente 1. Controllare una aliquota (2 μl) di plasmide ricevente su gel. Il taglio con gli enzimi di restrizione deve essere completo. È importante controllare su gel una quantità minima di vettore per evidenziare la presenza di un’unica banda netta. Se il taglio del plasmide ricevente non risulta completo (ovvero sul gel si notano due bande, una dovuta alla digestione totale ed una a quella parziale) conviene ripeterlo o procedere con una nuova estrazione. 2. Defosforilare il plasmide ricevente con 1 μl di fosfatasi alcalina (CIP) e 1/10 di tampone CIP 10x. Soluzione di defosforilazione a partire dalla soluzione di incubazione con gli enzimi di restrizione: 18 μl di campione dalla restrizione* 8.2 μl di tampone per CIP o universale 72.8 μ l di acqua 1 μl di CIP ----------------------------------------100 μl volume totale * questa soluzione comprende DNA, enzimi di restrizione, tampone, acqua (vedi sopra) preparata a 20 prelevati per la corsa elettroforetica. l di cui 2 Nota: è abitudine aumentare il volume fino a 100 μl. Si sono utilizzati 8 μl di tampone in quanto il DNA (18 μl) contiene già il tampone utilizzato con gli enzimi di restrizione che funziona anche per la CIP. 120 3 ottobre 2008 3. Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Incubare per 30 minuti a 37°C. Non proseguire con la defosforilazione per più di 30 minuti!! (per tempi superiori si rischia di degradare le estremità). 4. Eliminazione della fosfatasi alcalina con il protocollo di desalificazione (QIAEXII Protocol for Desalting and Concentrating DNA Solutions oppure GeneClean). Quantificazione del DNA su gel 1. Corsa elettroforetica su gel di una aliquota (1-2 µl) di plasmide ricevente e di frammento (vedi Elettroforesi su gel di agarosio). Con questa corsa elettroforetica si vuole quantificare il plasmide e il frammento. Consigliabile utilizzare subito 2 µl di frammento se di piccole dimensioni, poiché potrebbe accadere che caricandone 1 µl non sia poi visibile, obbligandoci ad utilizzarne altri 2 µl. 2. Quantificazione Vettore : Frammento = 1 : 2 Il rapporto si riferisce al numero di molecole e non alla quantità di DNA, si avrebbe corrispondenza tra i due rapporti solamente se il frammento ed il plasmide ricevente avessero le stesse dimensioni. Assumendo ad esempio di avere un frammento di 1.2 kbp e un vettore di 1 kbp, usare 2.4 µg di frammento e 1 µg di vettore. Ligatura 1. Porre in un tubo di tipo eppendorf il vettore e il frammento secondo le quantità calcolate precedentemente (circa 100 ng in totale) Si utilizza normalmente un volume di 10 μl per far avvenire la ligatura in un volume ridotto. Sapendo che saranno poi aggiunti 1 μl di ligasi e 1 μl di tampone, allora il volume massimo dellamiscela vettore-frammento è di 8 μl. Enzima e corrispondente tampone (che contiene ATP) sono aggiunti successivamente perché il successivo trattamento a 65°C causerebbe la denaturazione degli stessi. 2. Incubare per 5 min a 65°C. In questo modo si rompono i legami H fra le estremità compatibili. 3. Raffreddare qualche secondo in ghiaccio. Centrifugare 10 sec per fare precipitare la condensa. Importante passare velocemente dai 65°C al ghiaccio per evitare la riformazione di interazioni tra estremità compatibili. La precipitazione della condensa viene fatta per evitare che la ligasi sia aggiunta in una soluzione troppo concentrata. 4. Per un volume finale di 10 µl, aggiungere alla soluzione vettore+frammento 1 µl di tampone ligasi 10x, portare (se necessario) a 9 µl con acqua e aggiungere 1 µl di enzima ligasi. Il tampone per la ligasi contiene ATP. Per evitarne la degradazione in seguito a ripetuti scongelamenti può essere utile preparare delle aliquote monouso. 121 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne 5. Incubare 18 h a 16 °C oppure 3h a RT. Se non è disponibile un refrigeratore porre in un bagnetto con un termometro e aggiungere ghiaccio quando necessario. La bassa temperatura rallenta l’attività della ligasi permettendo l’appaiamento vettore-frammento. Oggi in commercio esistono ligasi in grado di ligare in 5 minuti a temperatura ambiente, in presenza di opportuni tamponi. Preparazione delle cellule competenti con CaCl2 1. Preinoculo: Isolare una colonia da inoculare in LB liquido (5 ml) e incubare a 37°C per 16-20 h (overnight). Per procedere vedere il protocollo “inoculo e crescita dei batteri”. Quest’operazione va condotta in sterilità. Le colonie non devono essere più vecchie di 3-4 settimane (fino ad una settimana sono considerate fresche). Questo preinoculo serve per limitare lo sviluppo di eventuali contaminanti, che potrebbero prendere il sopravvento, in un volume maggiore di coltura e per favorire un rapido raggiungimento del plateau della curva di crescita. 2. Trasferire 200 µl – 1 ml del preinoculo in 100 ml di LB in beuta (capacità 1l). Incubare a 37 °C per 3h e controllare che la OD600 sia tra lo 0.2 e lo 0.3. Un’incubazione in continua agitazione permette una migliore ossigenazione e quindi una crescita più rapida del batterio. Il volume della beuta dovrebbe essere 5 volte maggiore del volume del terreno per assicurare un’adeguata aerazione del mezzo, ma agendo su altri fattori, è possibile ridurre questo rapporto. Le cellule devono essere prelevate nel punto di massima attività metabolica che corrisponde ad una OD di circa 0,1; in realtà si preleva ad una OD di 0,2-0,3 poiché, nonostante l’efficienza di trasformazione sia minore, si avrà una maggior quantità di cellule trasformate (è bene fare delle continue rilevazioni del valore della densità ottica lungo le tre ore tenendo presente che se partiamo da una soluzione con più materiale raggiungeremo prima il valore previsto). 3. Trasferire sterilmente 15 ml di sospensione cellulare in un tubo Falcon preraffreddato e mantenere in ghiaccio per 10 min. Questa fase non è fondamentale, infatti non è necessario preraffreddare per 10 minuti la sospensione prima della centrifugazione. È però indispensabile mantenere in ghiaccio le cellule se non è possibile eseguire immediatamente la centrifugazione prevista dopo il trasferimento in tubo Falcon, per bloccare la divisione attiva delle cellule così che non superino il flesso della curva di crescita. 4. Centrifugare a 4000 rpm (circa 2000 g) per 10 min a 4°C. Si precipitano le cellule per asportare il terreno di coltura, con l’accorgimento di non utilizzare la massima velocità per non stressare le cellule, ottenendo un pellet poco compatto: non impaccare troppo le cellule. 5. Eliminare il surnatante e porre immediatamente le cellule in ghiaccio. Da questo punto in poi tutte le operazioni devono essere eseguite in ghiaccio per non danneggiare le cellule: la permanenza in ambiente freddo rallenta il metabolismo evitando di sottoporre la cellula a stress che ne diminuirebbero l’attitudine ad essere successivamente trasformata. Si versa delicatamente il terreno di coltura prestando attenzione a non staccare il pellet dal fondo. Si deve operare velocemente per evitare il riscaldamento delle cellule e dunque la riattivazione del metabolismo. Quest’operazione, come le successive, può avvenire in ambiente non sterile perché: • i contaminanti sono in estrema minoranza rispetto alle cellule di E. coli (si stima 1 contaminante ogni 106 cellule batteriche); • il terreno viene eliminato e dunque essi non possono proliferare; 122 3 ottobre 2008 • 6. Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne il CaCl2 non li rende competenti per la trasformazione perciò verranno uccisi durante la selezione con antibiotico. Neanche i propaguli fungini resistenti all’antibiotico vanno considerati, per la loro lenta velocità di crescita. Risospendere agitando il pellet in 10 ml di CaCl2 100 mM raffreddato in ghiaccio e mantenere le cellule in ghiaccio per 10 min. Il calcio cloruro è conservato a 4°C dopo essere stato sterilizzato per filtrazione oppure autoclavato. La soluzione aggiunta deve essere preraffreddata e successivamente anche la sospensione va mantenuta in ghiaccio, per mantenere un metabolismo rallentato; solo così le cellule sono in grado di sopportare l’indebolimento della membrana citoplasmatica. Qualsiasi passaggio fuori dal ghiaccio determina una perdita di efficienza delle cellule. Per lo stesso motivo, la risospensione deve essere completa ma veloce. 7. Centrifugare a 4000 rpm (circa 2000 g) per 10 min. Eliminare il surnatante. Si fanno precipitare le cellule, operando come nella precedente centrifugazione. Si versa la soluzione di calcio cloruro senza disturbare il pellet che si presenta poco compatto. 8. Risospendere il pellet in 0.6 ml di CaCl2 100mM freddo per ogni 15 ml di coltura inizialmente usata. Nel caso le cellule competenti vengano conservate a -80°C (vedi sotto), risospendere il pellet in 0.6 ml di CaCl2 100 mM contenente 30% glicerolo (30 parti di glicerolo e 70 parti di CaCl2 100 mM) Questo è un passaggio fondamentale infatti si può “aumentare” la resa finale lavorando ad una bassa efficienza di trasformazione partendo da un numero maggiore di cellule (0.3 OD anziché 0.2) e risospendendo in un volume finale minore. Si risospende in circa 1/25 del volume iniziale. In questo caso si ottiene una concentrazione di cellule competenti pari a 3*109 cellule/ml (partendo da una OD pari a 0.2). In seguito verranno prelevate aliquote di 200 μl che conterranno ciascuna 5*108 cellule. In questo modo possiamo uniformare il numero di cellule per ogni eppendorf. 9. Conservare in ghiaccio per almeno 1 h. La durata di questa fase è determinante per l’efficienza di trasformazione. L’andamento dell’acquisizione della competenza alla trasformazione nel tempo aumenta da sei a quattro volte nelle prime 12-24 ore e poi decresce bruscamente fino a zero, come mostrato nel grafico. In realtà già dopo 1 h di trattamento le cellule raggiungono un discreto livello di efficienza di trasformazione. Tuttavia se non vengono utilizzate in tempi brevi, è necessario conservare le cellule competenti a –80°C in presenza di una sostanza antifreezer. Procedura per la conservazione delle cellule competenti 1. Aggiungere 30% (finale) di glicerolo, agitare e mantenere in ghiaccio. Quest’aggiunta va fatta chiaramenet se il glicerolo non era presente nella soluzione di risospensione (vedi punto 8) Il glicerolo riduce la formazione di cristalli di ghiaccio. Alternativamente, è possibile utilizzare dimetilsulfossido (DMSO 7% vol/vol) che svolge analoga funzione in dosi di 35 μl per millilitro di sospensione. L’unico vantaggio che il DMSO sembra avere rispetto al glicerolo (in stocks ghiacciati) è una minor viscosità, a cui corrisponde una maggior facilità nel maneggiarlo. 2. Dividere la sospensione in aliquote da 200 μl, mantenere in ghiaccio e congelare a –80°C immediatamente. 123 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Dopo aver omogeneizzato la sospensione si prelevano aliquote da 200 μl (120 μl di sospensione + 50% glicerolo), da versare in eppendorf contrassegnate e preraffreddate in ghiaccio. Successivamente si trasferiscono dal ghiaccio direttamente a –80°C per congelarle il più velocemente possibile. Nota: È necessario dividere la sospensione originale in aliquote prima del congelamento perché le cellule possono essere scongelate una sola volta. Cicli multipli di congelamento e scongelamento riducono drasticamente la competenza delle cellule e causano mortalità elevata abbattendo sensibilmente l’efficienza di trasformazione. Inoltre si suggerisce di testare da fresche le cellule competenti per valutare la loro effettiva efficienza di trasformazione, perciò sapendo che l’efficienza diminuisce nelle aliquote conservate a -80°C è preferibile aumentarne il volume in modo da avere una competenza paragonabile al test da fresco. 3. Scongelare mantenendo in ghiaccio. Lo scongelamento della sospensione è realizzato in ghiaccio senza miscelare per eseguire un lento e graduale scongelamento al fine di mantenere elevata la vitalità e la competenza delle cellule, evitando soprattutto di riattivare il metabolismo. È importante notare che il glicerolo aggiunto per la conservazione non influenza le fasi di trasformazione e può essere mantenuto nella sospensione. Preparazione di cellule elettrocompetenti 1. Preparare uno starter di coltura batterica e farlo crescere o/n (vedi Inoculo e crescita dei batteri). Un’incubazione con continua agitazione permette una migliore ossigenazione e quindi una crescita più rapida del batterio. Il volume della beuta dovrebbe essere 5 volte maggiore del volume del terreno per assicurare un’adeguata aerazione del mezzo, ma agendo su altri fattori, è possibile ridurre questo rapporto. 2. Diluire lo starter 1/100 in LB 3. Incubare la coltura a 37°C in agitazione fino ad una OD600 compresa fra 0.5 e 1.0 (l’optimum di competenza si ha fra 0.6 e 0.8) E’ bene fare delle continue rilevazioni per raggiungere ma non superare il valore di OD desiderato. Con OD = 1 si hanno 10 9 cellule batteriche (considerando 1ml di coltura batterica). 4. Porre la coltura in ghiaccio per 15 min per fermare la crescita Questa fase non è fondamentale, infatti non è necessario preraffreddare per 10 minuti la sospensione prima della centrifugazione. È però indispensabile mantenere in ghiaccio le cellule se non è possibile eseguire immediatamente la centrifugazione prevista dopo il trasferimento in tubo Falcon, per bloccare la divisione attiva delle cellule così che non superino il flesso della curva di crescita. 5. Prelevare aliquote da 1,5 ml e centrifugare per 10 min a 5000 rpm a 4°C Si precipitano le cellule per asportare il terreno di coltura, con l’accorgimento di non utilizzare la massima velocità per non stressare le cellule, ottenendo un pellet poco compatto: non impaccare troppo le cellule. 6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di acqua sterile fredda 124 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Da questo punto in poi tutte le operazioni devono essere eseguite in ghiaccio per non danneggiare le cellule: la permanenza in ambiente freddo rallenta il metabolismo evitando di sottoporre la cellula a stress che ne diminuirebbero l’attitudine ad essere successivamente trasformata. Si versa delicatamente il terreno di coltura prestando attenzione a non staccare il pellet dal fondo. Si deve operare velocemente per evitare il riscaldamento delle cellule e dunque la riattivazione del metabolismo. E’ fondamentale lavare le cellule dai sali presenti nel terreno. La loro presenza comporta che la scarica elettrica non passi all’interno della soluzione ma formi il cosiddetto arco voltaico fra il catodo e l’anodo della cuvetta. Le cellule non vengono sottoposte alla scarica e non sono adatte alla trasformazione. 7. Centrifugare 10 min a 5000 rpm a 4°C 8. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 μl di glicerolo 15% freddo Si può risospendere il pellet anche in acqua ma l’uso del glicerolo è imperativo se le cellule devono essere conservate. Inoltre nel caso di cellule particolarmente suscettibili il glicerolo crea un ambiente osmoticamente più stabile. 9. Centrifugare 10 min a 5000 rpm a 4°C 10. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 40 μl di glicerolo 15% freddo Nota: A questo punto le cellule possono essere trasformate per elettroporazione oppure congelate e conservate a 80°C per al massimo 6 mesi. (vedi conservazione in preparazione cellule competenti con CaCl2). Trasformazione mediante shock termico di cellule rese competenti con CaCl2 1. Prelevare due tubi contenenti 200 μl di cellule competenti conservati a –80°C, porli in ghiaccio e lasciare scongelare per 15 min. Nel caso in cui si abbiano a disposizione una sospensione di cellule competenti fresche, queste possono essere impiegate dopo almeno 1 h dalla loro preparazione. 2. Aggiungere ad una delle aliquote 5 μl della ligatura (~ 50 ng), mentre all’altra aggiungere quantità nota di un plasmide superavvolto di riferimento (in questo caso 1 μl), come controllo della trasformazione, per osservare l’efficienza delle cellule competenti. Per la quantificazione del DNA da aggiungere osservare il gel di prova in cui sono stati fatti correre il frammento e il vettore da ligare. NOTE: Il vettore non è superavvolto perché la ligasi ha potuto fissare il frammento solamente in due punti, dato che con la defosforilazione (CIP) sono stati eliminati i gruppi fosfati in 5'. Sarà poi la cellula ad impiegare i sistemi di riparo per cucire i nick e permettere il corretto funzionamento del plasmide. 3. Agitare gentilmente la sospensione evitando che il tubo subisca innalzamenti di temperatura. Riporre immediatamente in ghiaccio i tubi per 30 min. 4. Trasferire velocemente le eppendorf in un bagno termostatato a 42°C, mantenendole per 2 min e 45 sec. 125 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Lo shock termico dato da questo passaggio repentino da 0 a 42°C permette l’ingresso del plasmide nelle cellule competenti. E’ perciò importante andare al bagnetto con il campione ancora in ghiaccio, ed evitare così la permanenza a temperatura ambiente. La fase a 42°C in cui le cellule assorbono il DNA della soluzione in cui si trovano dura circa 2’ e 45” al massimo, difatti le cellule con plasmalemma indebolito dal CaCl2 non sopportano tale temperatura per un tempo superiore. E’ tassativo non superare il tempo indicato in quanto dopo 3 min le cellule competenti sono morte. La durata di questa fase è determinante per l’efficienza di trasformazione. 5. Trasferire immediatamente in ghiaccio e lasciare raffreddare per 1 o 2 min. Si accelera il processo di raffreddamento delle cellule posizionando le eppendorf in ghiaccio; si completa così lo shock termico riportando le cellule ad una condizione di metabolismo rallentato. D’altra parte è necessario fornire nutrienti alle cellule affinché possano soddisfare le loro esigenze metaboliche e cominciare così il processo di divisione. 6. Aggiungere 1 ml di LB privo di antibiotico in ogni eppendorf, agitare delicatamente e incubare a 37°C per 1 ora. Si aggiunge un ml di terreno fresco e si pone in camera di crescita. È molto utile che le cellule che hanno acquisito il plasmide si dividano, così che le cellule figlie ne portino una copia intatta. Non è possibile incubarle in terreno selettivo perché si deve attendere l’espressione del gene che codifica per la resistenza; si deve permettere alle cellule trasformate di produrre l’enzima β-lattamasi (nel caso dell’ampicillina) e di espellerlo all’esterno della cellula. Per questo motivo l’attivazione della resistenza all’ampicillina richiede 60’ di incubazione, superiore alle resistenze fornite dalla degradazione interna dell’antibiotico o dalla rimozione dei suoi recettori (30 min per tetraciclina, cloramfenicolo o kanamicina). Non superare 1 ora di incubazione perché potrebbe aumentare il numero di cellule duplicate e si potrebbe avere un falso successo. Infatti se le cellule hanno il tempo di dividersi ulteriormente, conteremmo successivamente in piastra un elevato numero di ricombinanti, ma tutti cloni delle cellule di partenza, in pratica non corrispondenti a reali eventi di trasformazione. 7. Piastrare le cellule e incubare 16 h a 37°C Concentrazione di componenti nelle piastre: IPTG 0.5 mM, Amp 100 μg/ml, X-GAL 40μg/ml E’ buona norma usare tre piastre: 2 per diluizioni differenti (concentrata e diluita) e una di controllo (E. coli in cui è stato inserito il plasmide donatore o il ricevente estratto) per valutare l’efficienza di trasformazione delle cellule. Piastrare 100 µl di campione (piastra diluita), centrifugare per 30" la sospensione batterica rimanente (1,1 ml), versare il surnatante in modo da lasciare nel tubo circa l00 µl di LB nei quali risospendere il pellet batterico, poi piastrare (piastra concentrata circa 10 volte rispetto alla diluita). I 100 µl rappresentano un valore approssimato. Quantità superiori (> 200 µl) possono essere difficili da far assorbire alla piastra, mentre quantità molto piccole (< 50 µl) vengono in genere assorbite dalla piastra prima di aver distribuito i batteri in modo uniforme. Nella terza piastra si semina solo la sospensione diluita in quanto contenente il plasmide superavvolto che ha una efficienza di trasformazione molto maggiore rispetto al nostro costrutto. Inoltre non è necessario l’aggiunta di IPTG e X-GAL nella piastra in quanto serve solo contrare il numero di colonie e il test colorimetrico è inutile. L’incubazione deve essere tale da permettere la crescita di colonie osservabili. Se troppo prolungata porta allo sviluppo di colonie satelliti. Questo è un problema tipico di resistenze date da fattori secreti nel mezzo, come la resistenza all’ampicillina: le colonie resistenti producono β-lattamasi che degrada l’ampicillina nel mezzo circostante. Si crea così un gradiente di antibiotico a partire dalle colonie in esame attorno alle quali possono crescere colonie satelliti di batteri non trasformati. È pertanto necessario adottare degli accorgimenti che riducano lo sviluppo di colonie satelliti: * ottimizzare i trattamenti per ottenere le cellule competenti; * preparare terreni contenenti [ampicillina]~ l00 γ; * incubare le piastre a 37°C per meno di 20 ore ed eseguire subito lo screening; * conservare le piastre a 4°C fino all’utilizzo per rallentare le divisioni cellulari. Le colonie satellite complicano lo screening perché sono bianche ma corrispondenti a cellule non trasformate; per contro sono abbastanza facili da riconoscere poiché si sviluppano attorno a colonie di cellule resistenti, e, se reinoculate su un terreno selettivo, non crescono. L’eventuale colorazione blu dovuta all’espressione di LacZ si manifesta successivamente alla proliferazione cellulare. Per potenziare la colorazione è sufficiente mantenere le piastre a 4°C per qualche ora. 126 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne 8. Conservare le piastre a 4°C Trasformazione mediante elettroporazione di cellule elettrocompetenti 1. Lasciar scongelare le cellule in ghiaccio Nel caso in cui si abbiano a disposizione una sospensione di cellule competenti fresche , queste possono essere impiegate immediatamente dopo la loro preparazione. Lo scongelamento della sospensione è realizzato in ghiaccio. 2. Aggiungere 1-2 μl di DNA Si usano solo 1 o 2 µl di DNA per impedire che siano presenti troppi sali. Una soluzione contenete sali compromette la trasformazione tramite elettroporazione in quanto la scarica elettrica non passa attraverso la cellula ma attraverso i sali. La durata dell’incubazione del DNA con le cellule prima dell’elettroporazione non influenza l’efficienza di trasformazione. Since the resistance of the sample should be high, make sure that addition of the DNA to the cells does not increase the total salt concentration in the cuvette by >1 mM. 3. Settare l’elettroporatore a 25 μF e 2.5 KV 4. Trasferire la soluzione di cellule e DNA nella cuvetta da elettroporazione fredda, inserirla nell’elettroporatore e dare l’impulso elettrico. Se in soluzione sono presenti troppi sali, può generarsi l’arco voltaico: la corrente passa attraverso i sali e forma un arco al di fuori della soluzione. L’arco voltaico è accompagnato da un rumore sordo. Se si verifica l’arco voltaico, è necessario ripetere tutto. 5. Immediatamente dopo l’impulso estrarre la cuvetta dall’elettroporatatore e aggiungervi 1 ml di terreno LB privo di antibiotico. Questo passaggio è molto importante. Il trasferimento delle cellule elettroporate al mezzo di coltura deve avvenire il più velocemente possibile per evitare dimunuizione dell’efficienza di trasformazione. 6. Controllare il valore della time constant: valori compresi fra 4 e 5 ms sono ottimali Valori inferiori a 4 richiedono di ripetere la trasformazione. 7. Recuperare tutto il contenuto della cuvetta e porlo in una eppendorf da 1.5 ml e incubare per 1 ora a 37°C. Le cellule che hanno subito elettroforesi sono danneggiate e non possono essere utilizzate. Per questo motivo vengono trasferite in LB: è molto utile che le cellule che hanno acquisito il plasmide si dividano, così che le cellule figlie ne portino una copia intatta. Non è possibile incubarle in terreno selettivo perché si deve attendere l’espressione del gene che codifica per la resistenza; si deve permettere alle cellule trasformate di produrre l’enzima β-lattamasi (nel caso dell’ampicillina) e di espellerlo all’esterno della cellula. Per questo motivo l’attivazione della resistenza all’ampicillina richiede 60’ di incubazione (tempo superiore rispetto alle resistenze fornite dalla degradazione interna dell’antibiotico o dalla rimozione dei suoi recettori: 30 min per tetraciclina, cloramfenicolo o kanamicina). In pratica il tempo di attesa dipende dall’antibiotico resistenza che abbiamo inserito. Importante non procedere all’incubazione oltre l’ora altrimenti non si può avere una stima attendibile nel successivo piastramento dell’efficienza di trasformazione; infatti con il passare del tempo si ottengono tante cellule ricombinanti ma tutte cloni di quelle di partenza. La sterilità non è importante in quanto successivamente andremo a lavorare con antibiotico, eliminando così eventuali contaminanti. 127 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne 8. Piastrare 100 μl di tal quale e concentrato circa 10x su terreno selettivo adatto (vedi semina batterica in piastra e nota su plating nella trasformazione con CaCl2). 9. Conservare le piastre a 4°C Lavaggio cuvette Il lavaggio delle cuvette è importante perché è necessario che non rimangano frammenti di DNA al loro interno. Lavare bene le cuvette con acqua milliQ ed alcool denaturato, lasciarle in agitazione o/n in etanolo assoluto e lasciarle poi asciugare rovesciate sotto cappa a flusso laminare. 128 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne IBRIDAZIONE MOLECOLARE Southern Blot Nel 1975, E. M. Southern pubblicò un’importante nuova procedura che permetteva ai ricercatori di identificare i frammenti di restrizione, separati per elettroforesi su gel, contenenti geni e altre sequenze di DNA oggetto di studio. Il Southern Transfer e le tecniche di ibridazione associate resero possibile per la prima volta di ottenere informazioni riguardanti l’organizzazione fisica delle sequenze singole o multicopie in un menoma complesso. Grazie al Southern si applicarono tecniche come il Fingerprinting genetico e la diagnosi prenatale di malattie genetiche. L’analisi Southern consiste nel trasferimento delle bande di DNA ottenute per corsa elettroforetica su gel di agarosio o acrilammide ad una membrana di nylon o nitrocellulosa, in modo che la membrana sia una riproduzione del bandeggio del gel. Trasferimento Per effettuare un Southern blot è necessario (come per il northern) sottoporre i campioni da trasferire sul filtro ad una gel-elettroforesi. Una volta terminata la corsa bisogna trattare il gel con una serie di soluzioni per migliorare l’efficienza del trasferimento del DNA dal gel alla membrana di nylon: • soluzione di depurinazione: HCl 0.25 M il DNA viene ulteriormente frammentato e ciò permette un miglior trasferimento. La depurinazione non pregiudica l’ibridazione della sonda e neppure la valutazione della lunghezza dei frammenti, in quanto già migrati. Questo passaggio comunque non viene più svolto se non con DNA genomico ad alto PM in cui si vogliono separare i cromosomi (ad esempio dopo un elettroforesi pulsata) perché comunque la procedura del Southern è stata ottimizzata a tal punto che non ci sono più problemi nel trasferimento. La soluzione di depurinazione, taglia parzialmente i filamenti a livello delle basi puriniche, accorciandone la lunghezza e aumentandone l’efficienza di trasferimento; questo passaggio non e’ necessario per frammenti minori di 4 Kb, o se non e’ richiesta un’ alta efficienza di trasferimento per i frammenti maggiori di 5 Kb; lo spessore del gel e la concentrazione influenzano la durata del trattamento. • soluzione di denaturazione: NaCl 1.5 M NaOH 0.5 M La soluzione di denaturazione separa i due filamenti complementari di DNA a dare molecole a singolo filamento, rendendole disponibili alla successiva ibridazione con la sonda. Si effettuano due lavaggi da 10-15 min: il primo ha solo lo scopo di allontanare il TBE, ha una ridotta capacità di denaturazione in quanto la soluzione è diluita e tamponata dal tampone di corsa presente tra le maglie del gel; durante il secondo lavaggio si ottiene invece la denaturazione grazie ad un pH alcalino e ad una concentrazione salina ottimale per la rottura dei legami idrogeno che tengono legate le due eliche di DNA; in questo modo il DNA, una volta fissato alla membrana, è in grado di ibridare con la sonda. • Soluzione di neutralizzazione: NaCl 1.5 M Tris 0.5 M pH 7.5 La soluzione di neutralizzazione serve per portare il pH del gel alla neutralità dopo il passaggio denaturante, dato che in condizioni basiche il DNA non viene trasferito sulla membrana di nitrocellulosa, o trasferito meno efficacemente su membrana di nylon. Si effettuano due lavaggi da 10-15 min:. è utile per riportare il gel ad un pH neutro ma è una operazione che può essere omessa senza conseguenze per la riuscita dell’esperimento Dopo ogni soluzione sarebbe opportuno sciacquare il gel in acqua bidistillata. Ora si può passare al trasferimento su filtro, che avviene per capillarità. Si può effettuare anche un trasferimento “veloce” in cui il filtro viene posto direttamente sul gel e questo non è posto su di un impianto contenente SSC ma direttamente sul bancone (trasferimento “a secco”). In questo caso l’SSC che trasferisce per capillarità è quello presente nel gel che è rimasto dopo i lavaggi. L’unica differenza rispetto ad un Northern sono i precedenti passaggi con le soluzioni denaturanti, in quanto nel Northern l’RNA è già denaturato dalla formaldeide e formammide presenti nel gel e quindi non necessita di passaggi di denaturazione. 129 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne La durata del trasferimento è difficile da valutare e dipende dalla quantità di DNA, dalla concentrazione di agarosio e dalla densità del gel. Il trasferimento capillare verso l’alto è lento, circa 18ore con tampone ad alta concentrazione di sale. Membrane Quando si assembla un Southern, la scelta può essere fatta tra differenti tipi di membrane: • Nitrocellulosa • Nylon • Nylon carico positivamente Le tre membrane hanno proprietà diverse, ma sono intercambiabili per molte applicazioni. La membrana di nylon lega il DNA covalentemente tramite fissaggio agli UV, può essere riutilizzata più di dieci volte, lega una quantità cinque volte maggiore di DNA per cm2 rispetto alla nitrocellulosa e il limite minimo di lunghezza dei frammenti per un’efficiente ritenzione del DNA è di 50 bp. La membrana di nitrocellulosa è fragile e non lega il DNA covalentemente; la “cottura” in forno del DNA (2 h a 80°C) ne permette l’immobilizzazione grazie alla formazione di legami idrofobici relativamente deboli ottenuti tramite l’esclusione dell’acqua. Il limite minimo di lunghezza dei frammenti per un’efficiente ritenzione del DNA è di 500 bp. Fissaggio del DNA: Nylon: è consigliato un UV cross-linking (tramite transilluminatore o stratalinker) per formare un legame covalente DNA-membrana. La membrana deve essere disidratata prima di questo passaggio. Taluni usano cuocere in forno per 30 min a 80°C prima del trattamento. Si usa un avvolgimento di plastica UV trasparente per proteggere la membrana (tipo Domopak pellicola). Il lato di membrana a cui è legato il DNA va rivolto verso la sorgente UV. Nitrocellulosa: queste membrane non devono essere irradiate con UV; il trattamento prevede cottura sotto vuoto per due ore a 80°C. La sottrazione di O2 impedisce alla membrana di incendiarsi. PROTOCOLLO - Soluzione di denaturazione NaCl NaOH 1.5 M 0.5 M - Soluzione di neutralizzazione NaCl Tris HCl (pH 7.5) 1.5 M 0.5 M - SSPE 20 X (soluzione di trasferimento) NaCl 3M 200 mM NaH2PO4-H2O EDTA 20 mM portare a pH 7.4 con soda concentrata 1. Tagliare il DNA con gli enzimi di restrizione scelti e caricare la reazione di restrizione su gel di agarosio 0.8%. Far avvenire la migrazione elettroforetica 2. Immergere il gel nella soluzione denaturante ( 2 x 15 min) In questa fase, da effettuare mantenendo il gel in agitazione nel liquido, il DNA viene denaturato 3. Immergere il gel nella soluzione neutralizzante ( 2 x 15 min) Neutralizzare il DNA lavando il gel per due volte nella soluzione di neutralizzazione per 15 min in agitazione 130 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne 4. Immergere il gel in SSPE 20X ( 2 x 15 min) Equilibrare il gel con la soluzione di trasferimento SSPE 20X per 30 min in agitazione. 5. Preparare l’apparato di trasferimento come illustrato in figura Preparare una vaschetta su cui sovrapporre una lastra di vetro/plastica: coprire la lastra con 2 fogli di carta 3MM in modo che i due lembi peschino nella vaschetta. Versare SSPE 20X nella vaschetta e bagnare completamente la carta 3MM. Disporre il gel sulla carta 3MM. Preparare la membrana (nylon o nitrocellulosa) tagliata sulle dimensioni del gel, bagnarla prima in acqua (appoggiandola e poi immergendola) e poi in SSPE 20X. Disporre la membrana sul gel facendo attenzione a non lasciare bolle d’aria fra gel e membrana. Sovrapporre 2 fogli di carta 3MM (stesse dimensioni del gel) bagnata in SSPE 20X e 2 fogli di carta 3MM asciutta. Con il Domopak pellicola isolare la superficie della carta 3MM non occupata dal gel per evitare risalite capillari non passanti attraverso il gel. Aggiungere 1-2 pacchi di fazzoletti, sovrapporre una lastra di vetro/plastica ed un peso in modo da comprimere la struttura 6. Lasciare avvenire il trasferimento durante tutta la notte. 7. Smontare con cautela l'apparato, lasciare asciugare la membrana su carta 3MM (fino a scomparsa delle goccie) avvolgerla nel Domopak pellicola ed esporla ai raggi UV del transilluminatore per 3 min. con il DNA rivolto verso le lampade: NON bisogna lasciare per più di tre minuti sotto i raggi UV perché altrimenti c’è il rischio che tutti i siti di riconoscimento per la sonda vengano impegnati nei legami con la maglia del filtro. 131 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne DOT AND SLOT BLOT Il Dot e lo Slot blotting sono semplici tecniche per l’immobilizzazione di DNA non frazionato su una membrana di nitrocellulosa o di nylon. L’analisi di ibridazione può essere condotta per determinare la quantità relativa di sequenze target nelle preparazioni di DNA blotted. Dot e Slot blot differiscono nella geometria del blot, una serie di spot danno un pattern di ibridazione che è soggetto all’analisi condotta per mezzo di una scansione densitometrica . I Dot blot sono preparati per semplice deposizione di una goccia contenente DNA su di un filtro. L’inconveniente di questo metodo è che la dimensione dello spot dipende dalla quantità di liquido depositato, perciò la scansione densitometrica per stabilire la dimensione dello spot e quindi risalire alla sua radioattività dopo l’ibridazione non può essere effettuata. Nel caso dello Slot blot, i campioni sono applicati su una membrana utilizzando un collettore attaccato a una pompa aspirante. Il protocollo di base descrive come una procedura per dot o slot blotting su una membrana di nylon non carica. Dot e slot blot sono tuttavia metodi più rapidi, perché non richiedono una corsa elettroforetica; vengono utilizzati nel caso in cui non è necessario determinare il peso molecolare dei frammenti. Apparato per slot blot: 132 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Northern Blot Le analisi northern sono estremamente utili negli studi dell’espressione genica. Esse possono essere usate per determinare se un particolare gene è trascritto in tutti i tessuti di un organismo o solo in alcuni di essi. Esse possono essere anche usate per studiare il quadro temporale dell’espressione di singoli geni durante la crescita e lo sviluppo oppure in determinati tessuti o condizioni. Sequenze specifiche di RNA possono essere rivelate con il blotting e con analisi di ibridazione usando tecniche molto simili a quelle sviluppate originariamente per il DNA. L’RNA frazionato è trasferito da un gel di agarosio a una membrana, mentre l’RNA non frazionato è immobilizzato attraverso slot o dot blotting, seguite da analisi di ibridazione con sonde di DNA o RNA marcate. Il Northern blotting differisce dal Southern nello step iniziale di frazionamento su gel. Molti RNA possono formare strutture secondarie per appaiamento intramolecolare, e quindi per un’ottimale corsa elettroforetica e’ necessario lavorare in condizioni denaturanti, utilizzando per la preparazione del gel della formaldeide, oppure aggiungendo alla soluzione contenente RNA gliossale e dimetilsolfossido (DMSO). Il protocollo è diviso in tre sezioni: 1. elettroforesi di RNA in condizioni denaturanti in un gel di agarosio-formaldeide 2. trasferimento di RNA dal gel a una membrana di nylon o nitrocellulosa per capillarità 3. ibridazione delle sequenze di interesse usando sonde. Prima del trasferimento il gel deve essere lavato con acqua deionizzata per eliminare la formaldeide che ridurrebbe la ritenzione della membrana di nitrocellulosa o ostacolerebbe il trasferimento alla membrana di nylon. La denaturazione e’ un passaggio opzionale, anzi molecole di RNA troppo frammentate non sono efficientemente ritenute dalla membrana. Il trasferimento e l’immobilizzazione avvengono con le stesse modalità del Southern (l’immobilizzazione su membrana di nylon carica positivamente in ambiente alcalino può causare la parziale degradazione idrolitica dell’RNA). Membrane e trasferimento La maggior parte dei trasferimenti viene condotta usando nylon al posto della nitrocellulosa per la sua elasticità e per il fatto che l’RNA può essere legato covalentemente tramite UV cross-linking. Inoltre il nylon ha il vantaggio di resistere a condizioni stringenti (50% formamide a 60°C) che possono essere richieste durante ibridazione con RNA. Una prima indicazione del successo del trasferimento è l’osservazione dell’aspetto del gel. Se tutto l’RNA è stato trasferito non si osservano macchie nella parte di gel vicina all’elettrodo positivo. Ulteriore indicazione è ottenuta colorando la membrana con blu di metilene, ma spesso un problema di trasferimento non è riconosciuto fino a che non è stata effettuata l’ibridazione. Anche l’RNA, come il DNA, può essere immobilizzato su nylon carico positivamente tramite trasferimento alcalino, ma la procedura è sconsigliata per il fatto che le condizioni alcaline portano ad una parziale degradazione idrolitica dell’RNA. Tale idrolisi è di difficile controllo e le piccole molecole sono facilmente rotte in frammenti troppo corti per una ritenzione efficiente della membrana. Ciò porta ad un abbassamento di segnale dopo ibridazione. Il trasferimento alcalino si effettua solo nei casi in cui il segnale che ci si aspetta è forte. Per inibire l’attività dell’RNasi tutte le soluzioni per il Northern devono essere preparate usando acqua deionizzata sterile che è stata trattata con dietilpirocarbonato (DEPC), e devono essere utilizzato guanti per evitare ulteriori contaminazioni. PROTOCOLLO Mops 10 X pH 7.0 400 mM MOPS 100 mM NaOAc 10 mM EDTA Portare a pH con acido acetico o NaOH Sample Buffer 150 µl MOPS 10X 225 µl formaldeide 37% 650 µl formammide 5 µl etidio bromuro (stock 10 mg/ml) (l’etidio va aggiunto qui; non è possibile metterlo nel gel di formaldeide) 100 µl loading buffer 10X Conservare a –80° C 133 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne SSC 20 X pH 7.2 NaCl 3 M Sodio citrato 0.3 M 1. Preparare un gel all’ 1.2% di agarosio, aggiungere formaldeide e MOPS 10X in quantità tali da ottenere una concentrazione finale rispettivamente di 2.2 M di formaldeide e 1X di MOPS e colare il gel nello stampo. Es.: 3 g Agarosio in 180 ml H2O, Sciogliere in microonde e aggiungere 25 ml 10 X MOPS Buffer. Mescolare e aggiungere 45 ml Formaldeide. Mescolare e versare. La formaldeide tende ad uscire nel gel ed entrare nel buffer; una delle possibilità per evitarlo è di mettere una lastra di plastica sotto il gel. N.B. la formaldeide è tossica e perciò va aggiunta sotto cappa chimica. Il gel deve essere fatto correre sotto cappa per le stesse ragioni 2. Mescolare ad 1 volume di RNA 1 volume di sample-buffer e incubare 10 min a 65°C. Porre in ghiaccio 30 sec e centrifugare brevemente per recuperare la condensa Es.: 5 μl di RNA totale + 5μl di Sample Buffer 3. Caricare il campione sul gel ed eseguire la corsa elettroforetica in tampone MOPS 1X far correre i campioni per i 2/3 del gel, impiegando un voltaggio elevato per minimizzare la durata della corsa. Con il passare del tempo infatti la formaldeide evapora dal gel alterando la corsa dell’RNA 4. Dopo la corsa elettroforetica lavare il gel in acqua per 5 min, cambiando l'acqua ogni minuto e mantenendo in agitazione (≤ 50 rpm) 5. Lavare il gel per 1 ora in SSC 10X in agitazione. 6. Assemblare l'apparato per il blotting usando come soluzione di trasferimento SSC 20X o 10X Come preparare l'apparato di trasferimento: Il ponte di carta Whatmann 3mm va imbevuto di soluzione di trasferimento SSC20X (o 10X) e fatto completamente aderire al supporto, per evitare la formazione di bolle. Appoggiare quindi il gel, sempre evitando di formare bolle; coprire la superficie del ponte e del supporto non occupata dal gel con pellicola trasparente, per impedire l'efflusso laterale della soluzione di trasferimento e forzarla quindi tra le maglie del gel. Distendere sopra il gel la membrana della stessa dimensione del gel (ricordarsi di tagliarne un angolo per segnare la posizione del DNA una volta trasferito), che può essere precedentemente imbevuta in tampone di trasferimento o applicata asciutta. Appoggiare sopra la membrana tre fogli di carta Whatmann 3 MM della stessa dimensione della membrana, eventualmente imbevuti in SSC 20X. Impilare un numero di fogli di carta assorbente asciutti ed infine applicare un peso. 7. Lasciare che il trasferimento avvenga per 12-16 h. Dopo il trasferimento si può eseguire un lavaggio del filtro in una soluzione salina a minore forza ionica (Es. 5× SSC) 8. Smontare l'apparato, avvolgere il filtro in pellicola trasparente e porlo agli UV per 2-3 min con l’RNA verso rivolto verso le lampade Per facilitare il legame degli acidi nucleici al filtro si può: • riscaldare 80° per 1h avendo cura di porre la membrana fra due fogli di carta assorbente 134 3 ottobre 2008 • Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne esporre ai raggi UV per 3 : ATTENZIONE ai tempi NON bisogna lasciare per più di tre minuti sotto i raggi UV perché altrimenti c’è il rischio che tutti i siti di riconoscimento per la sonda vengano impegnati nei legami con la maglia del filtro. Si preferisce l’esposizione ai raggi UV, piuttosto che il riscaldamento, perché oltre a risparmiare tempo è un metodo più efficiente soprattutto se si vuole usare il filtro per successive ibridazioni con altre sonde. Note Al contrario del gel d’ agarosio che si prepara di solito per la corsa del DNA, in questo caso non si possono preparare dosi in eccesso di gel con la previsione di usarlo in futuro, in quanto la formaldeide evapora molto più facilmente dell’acqua e perciò nel tempo la sua concentrazione nella soluzione diminuirebbe drasticamente; questo comporterebbe un rallentamento del RNA superiore rispetto a quello inferiore. Per lo stesso motivo, soprattutto per le corse lunghe, sarebbe opportuno coprire il gel durante la corsa con una pellicola di nylon in modo che si formi un’atmosfera satura sopra il gel di formaldeide e così non ci sia il problema della evaporazione. Quando si assembla il sistema di trasferimento dell’RNA dal gel alla membrana, è opportuno circondare con parafilm o altro materiale isolante la zona della carta 3MM che non è coperta dal gel, in modo da evitare corti circuiti, ovvero che la soluzione salina riesca a raggiungere il filtro per vie a minore resistenza, senza passare attraverso il gel (perciò non portando con sé gli acidi nucleici). Fino a pochi anni fa si utilizzavano filtri di nitrocellulosa, ma oggi si utilizzano filtri di nylon; tali filtri non hanno la stessa buona affinità di legame per gli acidi nulcleici che hanno i filtri di nitrocellulosa, ma sono più resistenti e possono essere perciò usati più volte in ripetuti cicli di ibridazione con notevole risparmio di materiale e di tempo. Marcatura sonde radioattive Marcatura uniforme del DNA con Nick Translation La Nick Translation è un metodo rapido, semplice e relativamente poco costoso per produrre DNA uniformemente radioattivo con un’alta attività specifica. E’ usato frequentemente per la preparazione di sonde sequenza-specifiche, per lo screening di librerie, per il blot di DNA genomico e per RNA blot. La reazione è condotta con un frammento di DNA purificato con gel elettroforesi. Il meccanismo di Nick Translation coinvolge l’attività combinata polimerasica 5’Æ 3’ e esonucleasica 5’Æ 3’ della DNA polimerasi I di E. coli. Fornendo una molecola nicked duplex DNA la polimerasi sposta il nick rimovendo i nucleotidi in avanti usando l’attività esonucleasica 5’Æ 3’, mentre simultaneamente sintetizza DNA all’estremità 3’. I nick nel templato sono generalmente prodotti aggiungendo DNasi I al mix di reazione. Con la Nick Translation il DNA potrebbe diventare tutto marcato. La Nick Translation può essere condotta su frammenti purificati con gel elettroforesi o su molecole intatte di DNA. Per la produzione di sonde ad attività altamente specifica è cruciale ottimizzare la quantità di DNasi I e il tempo di reazione. Se il tempo di reazione è troppo corto la quantità di DNasi I è troppo bassa, quindi la marcatura è insufficiente. Al contrario se il tempo di reazione è troppo lungo la quantità di DNasi I è troppo alta e quindi il DNA sarà degradato. Per la Nick Translation di frammenti di lunghezza inferiore a 500 bp è necessario aumentare la quantità di DNasi I per assicurasi che la maggior parte delle molecole abbiano almeno un nick. Inoltre, dato che è molto difficile mantenere sempre lo stesso rapporto DNA/Dnasi, questa procedura è difficile da eseguire correttamente (poco DNA: le DNasi degradano troopo il DNA. Troppo DNA: le Dnasi generano pochi nick, per cui se non ci sono nick verso il 5’ tutta questa regione non viene marcata). Per questo si preferisce utilizzare sistema Random Primer Marcatura del DNA tramite Random Primer La sintesi random priming è un’alternativa alla Nick Translation per la produzione di DNA uniformemente radioattivo con alta attività specifica. La procedura di marcatura prevede la rottura del DNA con una endonucleasi di restrizione e, se desiderato, la purificazione dei frammenti di DNA che contengono la sequenza di interesse con gel-elettroforesi. Segue denaturazione tramite bollitura del DNA lineare, l’appaiamento a oligonucleotidi random-sequence (esameri random); tali esameri fanno da primer per la polimerasi. Quindi si incuba con Klenow in presenza di dNTPs (99% α[32P]dCTP, o α [32P]dATP); Klenow è la DNA polimerasi I di E. coli priva dell’attività esonucleasica 5’Æ 3’. In questo modo gli esanucleotidi fanno da primer al DNA di interesse lungo varie posizioni del templato e vengono estesi generando DNA a doppio filamento che è uniformemente marcato su entrambi i filamenti. Il random priming è un metodo estremamente riproducibile ma solo il 50% della doppia elica risulta marcato radioattivamente. 135 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli Klenow, di PM 76.000, è costituito dalla parte C-terminale corrispondente al 70% della DNA polimerasi I di E. coli. Conserva ancora l’attività esonucleasica 3’Æ5’, ma ha perso l’attività esonucleasica 5’Æ 3’ della DNA polimerasi I di E: coli. Originariamente Klenow veniva prodotto dalla digestione proteolitica di DNA polimerasi I di E. coli. Oggi viene overprodotto direttamente dal gene clonato per la DNA polimerasi I modificato per eliminare i 323 residui aminoacidici della parte N-terminale della polimerasi. Random Priming Preparare la sonda marcata radioattivamente utilizzando il kit Ready-To-GO DNA Labelling Beads (-dCTP) (Amersham Pharmacia Biotech), che marca la sonda mediante random priming 1. Reidratare il kit con 25 µl di acqua sterile 2. Denaturare a 100° C per 2-3 min. circa 25 ng di DNA diluiti in 22 µl di acqua sterile. 3. Porre in ghiaccio per almeno 30 sec l’eppendorf con il DNA denaturato e aggiungerlo al kit reidratato. 4. Aggiungere 3 µl di α[32P]dCTP (equivalenti a 30 µCi), per un volume finale di 50 µl 5. Porre l’eppendorf a 37°C per 30 min in modo da far avvenire la reazione di marcatura. 6. Preparare la colonna Probe Quant G-50 Micro Columns (Amersham Pharmacia Biotech) per la purificazione della sonda dai nucleotidi radioattivi, centrifugandola a 735 x g a RT per 1 min. Purificare la sonda caricando i 50 µl nella colonnina e centrifugando per 2 min a 735 x g a RT. La sonda è utilizzata immediatamente per l’ibridazione oppure può essere conservata a –20° C per alcuni giorni. Ibridazione Un singolo filamento di DNA o RNA a sequenza nota (sonda) può appaiarsi ad un’altra molecola di sequenza complementare (target); la quantità di basi appaiate tra la sonda ed il target determina la stabilità dell’ibrido. Sperimentalmente, l'analisi è solitamente eseguita con una sonda marcata e una sequenza target di DNA che viene immobilizzata su di una membrana. L'ibridazione è una tecnica sensibile che permette il rilevamento di un singolo gene all'interno di un genoma complesso. Il primo passaggio nell'ibridazione è quello di immobilizzare acidi nucleici denaturati su un adeguato supporto solido. E’ ovviamente importante che la sonda non si fissi aspecificamente al filtro. Per evitare questo inconveniente si usa preincubare il filtro, prima dell’ibridazione vera e propria, in una soluzione contenente DNA di sperma di aringa (herring sperm DNA) denaturato, che formerà una patina protettiva su tutta la superficie della membrana, in questo modo tutti gli eventuali siti di legami non specifici saranno saturati dal DNA di aringa. Dopo un sufficiente tempo di incubazione, la membrana è lavata in modo da eliminare le sonde legate aspecificamente, lasciando quindi solo quelle che sono complementari alla sequenza target. Controllando la stringenza delle condizioni di lavaggio, è possibile ottenere un legame omologo al 100% o che contiene dei mismatch (appaiamenti eterologhi), in modo tale da rilevare sequenze con un basso grado di similarità. Originariamente l'ibridazione era eseguita con sonde di DNA marcata radioattivamente lunghe da 100 a 1000 bp, attualmente sono state introdotte altri tipi di sonde (RNA, oligonucleotidi). Dopo l’eliminazione della sonda in eccesso l’ibrido viene rivelato mediante autoradiografia, rilevazione della chemioluminescenza o della colorimetria, a seconda del tipo di sonda utilizzato (sonde radioattive, biotinilate, marcate con digossigenina). 136 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Particolari considerazioni vanno fatte a proposito di due parametri importanti: la temperatura e il tempo. Per quanto riguarda la scelta della temperatura alla quale effettuare l’ibridazione bisogna tener conto della temperatura di denaturazione del DNA legato alla sonda, tenendo conto di lavorare 20-25°C in meno, in modo che almeno la metà delle molecole sia denaturata. La durata dell’ibridazione deve essere sufficientemente lunga per permettere l’appaiamento tra la sonda ed il target, generalmente va effettuata overnight. La rilevazione avviene tramite lastra fotografica nei casi di sonde radioattive o chemioluminescenti e per la formazione di precipitati colorati in corrispondenza delle bande contenenti l’ibrido sonda-target. Il numero delle bande osservate corrisponde al numero di sequenze target presenti nel DNA analizzato. PARAMETRI CRITICI DELL’IBRIDAZIONE Affinché un’ibridazione abbia successo due sono i criteri importanti: • • Sensibilità: una quantità sufficiente di sonda deve appaiarsi al target producendo un segnale rilevabile con autoradiografia Specificità: dopo l’ultimo lavaggio la sonda deve essere attaccata solo alle sequenze target di interesse (o famiglie di sequenze nel caso di probing eterologo) FATTORI CHE INFLUENZANO LA SENSIBILITA’ La sensibilità dell’ibridazione è determinata dalla quantità di sonda che si attacca al DNA target. Maggiore è il numero di sonde che si appaiano, maggiore sarà l’intensità del segnale di ibridazione visto con l’autoradiografia. • • • Attività specifica della sonda: le moderne procedure di marcatura, sia Nick Translation, sia Random Priming, sia sintesi in vitro di RNA, forniscono sonde con un’attività specifica maggiore di 108 dpm/μg. Se la specificità fosse minore il segnale sarebbe troppo basso per essere rilevato. Se la sonda è marcata 108 - 109 dpm/ug, sarà in grado di rilevare fino a 0.5 pg di DNA target. Cosa questo significa dipende dalla dimensione del genoma oggetto di studio e dal numero di copie della sequenza target. Nel caso di DNA genomico umano, 0.5 pg di una seuqneza a singola copia lunga 500 bp corrisponde a 3.3 ug di DNA totale. Questa è perciò la quantità minima di DNA umano che dovrebbe essere impiegata in un dot blot oppure in un Southern blot se il gene oggetto di investigazione è a singola copia Quantità di DNA target: un fattore importante non è la quantità assoluta di DNA (che dipende dall’efficienza di immobilizzazione e da quante volte la membrana è stata marcata), ma la parte di DNA fatta di sequenze capaci di ibridarsi alla sonda. 10 μg di DNA sono sufficienti per la maggior parte dei genomi. Utilizzo di un polimero inerte: un miglioramento della sensibilità può essere ottenuto aggiungendo un polimero inerte (10% destrano solfato) alla soluzione di ibridazione. FATTORI CHE INFLUENZANO LA SPECIFICITA’ Forza ionica e temperatura della soluzione finale di lavaggio: la specificità non è influenzata dalla fase di incubazione, ma è funzione dei lavaggi di post-ibridazione. Parametri critici sono quindi la forza ionica della soluzione finale e la sua temperatura. Le stringenti condizioni di lavaggio destabilizzano tutti i mismatched heteroduplexes, in modo che i segnali di ibridazione siano ottenuti solo dalle sequenze perfettamente omologhe alla sonda. ALTRI PARAMETRI: • Durata dell’incubazione di preibridazione e ibridazione: il protocollo prevede una preibridazione di 3 h per nitrocellulosa e 15 min per membrane di nylon. Una inadeguata ibridazione può portare alti background: così questi tempi posso essere allungati ma non possono essere ridotti. • Tamponi di ibridazione: la formammide contenuta nel tampone destabilizza i duplex di acidi nucleici, riducendo la temperatura di melting. • Lunghezza della sonda: la sonda non dovrebbe essere più lunga di 1000-2000 bp. 137 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Ibridazione classica Soluzione di Ibridazione 0.2 g PVP (polyvinilpirrolidone) 0.2 g Ficoll 400 1 g SDS 300 ml SSPE 20x Portare a 1000 ml con H2O 10x MOPS buffer (250 ml) 400 mM MOPS (Morfolino propansulfonico; 83,72 g/l) 100 mM NaOAc 10 mM EDTA portare a pH 7 con NaOH idrato gocce Soluzione Wash 1 per il northern: SSC 2X SDS 0.1 % p/v; per il Southern: SSPE 2X, SDS 0.5 % p/v Soluzione Wash 2 per il northern: SSC 0.2X, SDS 0.1 % p/v; per il Southern: SDS 0.1% p/v, Tris-HCl 5 mM CT-DNA (calf thymus DNA) Dissolvere in H2O a 5 mg/ml Bollire 10-15 min per favorire la solubilizzazione Frantumare mediante passaggio (ripetuto piu’ volte) in siringa ad ago sottile (17 G) Suddividere in aliquote da 1 ml e conservare a –20°C 1) Preibridare la membrana a 65-68°C per almeno 30 min . in Soluzione di Ibridazione + CTDNA alla concentrazione finale di 50 µg/ml. Il CT-DNA deve essere bollito 5 min. e immediatamente raffreddato in ghiaccio prima di essere aggiunto alla soluzione. 2) Aggiungere la sonda radioattiva e incubare o/n a 65-68°C . 3) Effettuare 2 x 15 min. lavaggi con Soluzione Wash 1 4) Effettuare 1 x 15 min. lavaggio con Soluzione Wash 2 Aumenta la stringenza perché ha una minor concentrazione di sale e quindi permette alla sonda di legarsi soltanto alle sequenze omologhe. 138 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Ibridazione con il metodo di Church (Church Method) Il metodo Church è facile da realizzare ed estremamente riproducibile, ma ha lo svantaggio di dare un segnale leggermente più debole del metodo precedentedebole. Prevede l’utilizzo di BSA (albumina) al posto di CT DNA (timo di vitello, ibridazione classica) per saturare i siti di legame aspecifico e non prevede il passaggio di preibridazione. Church Buffer BSA 1% p/v SDS 7% p/v Na2HPO4 0.5 M tamponato a pH 7.2 con H3PO4 85% v/v Soluzione Wash 1 per il northern: SSC 2X SDS 0.1 % p/v; per il Southern: SSPE 2X, SDS 0.5 % p/v Soluzione Wash 2 per il northern: SSC 0.2X, SDS 0.1 % p/v; per il Southern: SDS 0.1% p/v, Tris-HCl 5 mM PROTOCOLLO 1. Preibridare la membrana in 30-40 ml di tampone Church Buffer per almeno 30 min a 65° C Questo passaggio serve a saturare i siti aspecifici di legame presenti sulla membrana. In teoria si dovrebbero impiegare 100 μl tampone/cm2 di membrana, in pratica si usa tampone a volontà 2. Ridurre al minimo la quantità di tampone di ibridazione Versare via buona parte del liquido presente nel tubo mantenendo solamente 5-10 ml in modo da mantenere concentrata la sonda radioattiva che sarà aggiunta in seguito 3. Denaturare la sonda radioattiva a 100° C per 2-3 min, porre in ghiaccio 1 min, centrifugare brevemente per recuperare la condensa e aggiungere la sonda al liquido di preibridazione. 4. Condurre l’ibridazione a 65°C per tutta la notte; se condotta a 68°C l’appaiamento avviene con omologia dell’80%, mentre a 65°C si ha una minor stringenza e l’appaiamento avviene con omologia del 65%. 5. Rimuovere il tampone di ibridazione ed effettuare 2 lavaggi di 15 min ciascuno, a 65°C, con 50 ml di Soluzione Wash 1 La wash 1 può essere utilizzata fredda (non preriscaldata a 65°) senza alterare il risultato dell’ibridazione 6. Effettuare 2 lavaggi di 15 min. ciascuno, a 65°, con 50 ml di Soluzione Wash 2 139 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne La wash 2 deve essere utilizzata calda (preriscaldata a 65°) per non diminuire la stringenza dei lavaggi 7. Avvolgere la membrana con Domopak pellicola, aggiungere la lastra radiografica ed impressionare a –80°C, utilizzando una casetta radiografica dotata di schermo amplificatore. La durata dell’esposizione varia da poche ore a qualche giorno, in funzione dell’intensità del segnale misurato direttamente sul filtro con il contatore geiger. Stripping (rimozione della sonda dalla membrana) La sonda impiegata nell’ibridazione può essere rimossa dalla membrana la quale può quindi essere reibridata con una nuova sonda. Questa procedura, di uso comune, permette di riutilizzare la membrana più volte. Se il DNA è stato immobilizzato su una membrana con UV cross-linking (nel caso di membrane di nylon) o con trasferimento alcalino (nylon plus), l’interazione tra il DNA target e la matrice, di natura covalente, è più forte dell’interazione sonda-DNA target, che risulta da legami idrogeno. E’ quindi possibile rimuovere l’ibrido sonda-DNA senza rimuovere rimuovere il legame DNA target-membrana. In questo modo la membrana può essere utilizzata più volte. L’ibrido sonda-DNA può anche essere rimosso dalle membrane di nitrocellulosa, ma la debolezza delle interazioni idrofobiche che legano il DNA target alla matrice, oltrechè la fragilità della nitrocellulosa, limita il tempo di vita di queste a solo tre riutilizzi. Il protocollo descrive tre metodi di stripping; i trattamenti utilizzati dipendono dalla forza del legame sonda-DNA target, che a sua volta dipende dal contenuto in GC della sonda e il numero di coppie di basi che si formano. Fare attenzione alle differenti soluzioni impiegate per la rimozione della sonda da una membrana contenente DNA (Southern) oppure RNA (Northern). Lo stripping di un Southern è molto efficiente, dato che è basato sulla denaturazione dell’ibrido DNA/sonda mediante una soluzione alcalina. Tale soluzione alcalina però degrada completamente l’RNA, per cui nel caso dei Northern la procedura di stripping deve necessariamente essere diversa e risulta meno efficiente. Pertanto, è necessario verificare l’avvenuta rimozione della sonda esponendo il Northern con una lastra radiografica per valutare l’eventuale necessità di ripetere il trattamento. SOUTHERN (in agitazione) 1 lavaggio per 20 min. a RT con: 0.1 M NaOH 0.2% SDS 1 lavaggio per 20 min. a RT con: 0.1 X SSC 0.2% SDS 0.2 M Tris pH 7.5 NORTHERN (in agitazione) 1 lavaggio con 0.5% SDS bollente. Far bollire la soluzione di SDS, aggiungerla alla membrana e mantenere in agitazione per 15 min. Questo procedimento permette di avere un’alta stringenza anche in presenza di sale. Lo stripping funziona solo se la membrana non è seccata, altrimenti il legame è troppo forte. Eventualmente ripeter. L’ NaOH non può essere impiegato perché l’RNA. 140 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Nucleic Acid Labelling and detection (From Amersham Biosciences Guide to Nucleic acid Labelling and Detection) For many years the use of radiolabels was the method of choice for nucleic acid labelling and detection. More recently, however, considerable research has lead to the development of a comprehensive range of quality systems using both radioactive and non-radioactive technologies. This extensive range now provides you with an excellent choice of systems for use with DNA, RNA and oligonucleotides in a variety of applications. Significant developments in the area of non-radioactive labelling and detection include the use of light-based detection systems and direct labelling. The introduction of these techniques means that non-radioactive methods now present a viable alternative to the use of traditional radioactive techniques for many applications. This breadth of choice can in itself cause problems. Choosing the most appropriate system for a particular application can be a challenge for even the most experienced researchers. The choice is influenced by many factors, not all of which are directly related to the application. For example radioactive labelling has the advantage of high sensitivity and extremely robust protocols, however safety and longterm probe storage are serious considerations. The aim of this guide is to give an overall introduction to the different radioactive and non-radioactive methodologies available, highlighting their advantages and drawbacks. Individual products are then presented in more detail allowing you to choose the most appropriate system for your application. Factor Considerations Blotting system Southern, Northern, dot/slot, library screen. Amount of target nucleic acid present Label Radioactive or non-radioactive Direct or indirect Probe DNA, RNA, oligonucleotide Size and purity of probe Speed and convenience Multiple exposures Time constraints Probe storage Stability Results Autoradiography film Image analysis with scanners Membrane Charged or uncharged nylon Nitrocellulose Table 1 Factors affecting the choice of labelling and detection system Non-radioactive labelling methods In the past the use of non-radioactive labelling and detection technologies has been limited by the relatively low levels of detection sensitivity as compared with radioactive detection. However, the further development of non-radioactive labelling methods, coupled with light-based detection has 141 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne resulted in systems that now offer a real alternative to the use of radioisotopes in many applications where target levels are 50 fg and above. Non-radioactive systems offer the following benefits: • Speed Exposure times with nonradioactive systems range from minutes to hours. • Sensitivity Applications where target levels are 50 fg and above, e.g. single copy Southern and Northern blotting, colony/plaque blots. • Stable probes Non-radioactively labelled probes are stable for at least 6 months, removing the need to label probes immediately before use. • Ease of handling Eliminates handling and waste regulatory issues associated with the use of radioactivity. Making the correct choice of non-radioactive system requires consideration of both the labelling and detection procedures. Labelling Non-radioactive labelling methods are separated into two different approaches. Early non-radioactive systems utilized indirect labelling techniques, but these have now been largely superseded by the introduction of superior direct labelling methods, an example of which is AlkPhos Direct™. Direct labelling Direct labelling* using alkaline phosphatase is the most recent advance in the nonradioactive labelling of nucleic acids. It offers significant improvements in speed and convenience over indirect systems without compromising sensitivity. With direct labelling systems, the enzyme molecule (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase) is directly crosslinked to the nucleic acid probe in a simple 30-minute reaction. Detection is rapid because direct labelling methods eliminate the need for an antibody conjugate incubation and the associated blocking and multiple washing steps. Figure 1 Direct labelling Indirect labelling Indirect labelling involves the introduction into the probe of nucleotides tagged with a hapten or ‘ reporter’ molecule. Amersham Biosciences kits use fluorescein as the hapten molecule. The nucleotide analogues are readily incorporated into the probe by standard labelling methods and hybridization and stringency washing are carried out under standard conditions. Labelled probes are then detected with a 142 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne highly specific anti-fluorescein antibody conjugated to either alkaline phosphatase (AP) or horseradish peroxidase (HRP) enzyme. This is followed by enzyme catalysed detection, using the appropriate substrate. Figure 2 Indirect labelling Detection Choice of detection method will depend on the enzyme used in the labelling stage as well as the detection medium required. Horseradish peroxidase can only be detected using a chemiluminescent substrate, but alkaline phosphatase can be detected using chemiluminescent and chemifluorescent substrates. Chemiluminescent detection systems are designed for use with autoradiography film whereas fluorescence based detection systems require the use of suitable scanning equipment. ECL Based on the enhanced chemiluminescent reaction of luminol with horseradish peroxidase, ECL™ substrate can be used to detect probes which have been labelled either directly or indirectly with horseradish peroxidase. Rapid light output enables results to be achieved in 10 to 15 minutes. It is the substrate of choice for target amounts above 500 fg. CDP-Star Based on the chemiluminescent breakdown of the dioxetane CDP-Star™ by alkaline phosphatase*, this substrate can be used to detect probes which have been labelled either directly or indirectly with alkaline phosphatase. It is ideal for applications requiring high sensitivity detection such as genomic Southern and Northern blots. Light output is rapid and continues for up to five days allowing exposure optimization and multiple exposures to be taken. ECF Based on the breakdown of the ECF™ substrate by alkaline phosphatase*, resulting in a highly fluorescent product which is localized at the site of hybridization. This chemifluorescent signal is detected using a suitable fluorescence scanner such as the Amersham Biosciences ™ FluorImager™ or Storm™. ECF 143 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne detection can be used to detect probes which have been either directly or indirectly labelled with alkaline phosphatase and is particularly suitable for applications where quantification is important. Labelling and detection system Sensitivity Time from hybridization to detection Duration of light output Strip before reprobing Quantification Recommended application AlkPhos Direct 0.06 pg 1 hour 5 days yes no Single copy Southern and Northern ECL Direct 0.5 pg 1 hour 1-2 hours no no High target applications e.g. colony/plaques Gene Images 0.1 pg 3 hours 5 days yes no Random-Prime 0.1 pg 3 hours 5 days yes no High sensitivity Northerns Oligo screening Gene Images 3’ - with end control labelling with stringency CDP-Star Gene Images 3’ end labelling 120 pg 3 hours 1-2 days yes yes Quantification 0.5 pg 3 hours 1-2 hours yes no Medium target with ECF ECL Random-Prime Southern with DNA probes ECL 3’ -end 0.2 pg 3 hours 1-2 hours yes no labelling with oligo Medium to high target Southern probes ECF Random-Prime 0.25 pg 3 hours 1-2 days yes yes Quantification Table 2 Guide to the properties of non-radioactive labelling and detection systems AlkPhos Direct Labelling and Detection Systems AlkPhos Direct™ combines the convenience of direct enzyme labelling (no blocking or antibody stages) with those of alkaline phosphatase detection (long light output and high sensitivity). Labelling is complete within 30 minutes in a single tube protocol and the resulting probe is ready for use in hybridizations without further purification. Due to the thermostable nature of the enzyme, hybridization stringency can be controlled by adjusting temperature as well as salt concentration. The system can be used with either chemiluminescent or fluorescent detection reagents. The most sensitive result is achieved with CDP-Star, a chemiluminescent substrate with a fast light output. Alternatively, the use of ECF substrate generates a fluorescent signal suitable for use with fluorescence scanning devices such as Amersham Biosciences FluorImager or Storm instruments. Protocol Summary 144 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Probe labelling Denatured or single-stranded DNA or RNA probe is mixed with the labelling buffer and alkaline phosphatase. Formaldehyde is then added to covalently crosslink the enzyme to the probe. There is no need to purify the probe before hybridization. Hybridization and stringency The probe is hybridized to the blot using the specially formulated AlkPhos Direct hybridization buffer, which stabilizes the activity of the enzyme. After a 15 minute prehybridization step, hybridization with probe is performed overnight at the required temperature. For higher target amounts, a 2 to 4 hour hybridization may be sufficient. Detection 145 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Chemiluminescence with CDP-Star: Hybridized blots are detected with CDP-Star reagent. Following a two-minute incubation, blots are exposed to Hyperfilm™ MP for 1 to 2 hours or a light capture scanning device. Sensitivities as low as 60fg can be achieved using CDP-Star. or Chemifluorescence with ECF: Hybridized blots are detected with ECF substrate. Non-fluorescent substrate is catalysed by alkaline phosphatase to produce a fluorescent signal which accumulates over time; low sensitivity applications yield results after 1 hour, high sensitivity applications usually require overnight incubation. Recommended Applications AlkPhos Direct is a fast and easy-to-use system suitable for the majority of routine blotting applications using either DNA, RNA or oligonucleotide probes. The versatility of the system, combined with the fact that both DNA and RNA probes are labelled equally efficiently, makes it the ideal choice for a busy laboratory carrying out a variety of different blotting and hybridization techniques. For Southern and Northern blotting applications AlkPhos Direct, combined with CDP-Star detection, offers a highly sensitive system capable of detecting down to 60 fg of target DNA. Thus making it the ideal choice for the non-radioactive detection of single-copy genomic Southern blots. Re-probing can be difficult with non-radioactive systems due to the need to remove both probe and antibody layers in an indirect system. The simplicity of the AlkPhos Direct system means that there are less components to be removed during the stripping procedure. Probe removal is therefore more effective with less damage to the membrane. For labelling oligonucleotides, an optimized protocol has been developed which is capable of labelling probes down to 17 basepairs in length. Request TechTip number 174 for additional information. Quantification of dot and slot blots is possible by using ECF detection in conjunction with AlkPhos Direct. Analysing results on a fluorescence scanner such as Amersham Biosciences Storm or FluorImager allows accurate quantification and analysis of results. Speed Time savings of 3 to 4 hours over conventional indirect methods are achievable as a result of the rapid and simple labelling reaction, and the absence of antibody incubations. Consistency Quality control on each batch ensures consistent performance and provides confidence in probe labelling and concentration. Stringency control Due to the thermostable nature of the enzyme, hybridization stringency can be controlled by elevating temperatures up to 75癈 as well as by decreasing salt concentrations. Versatility Labelling of DNA, RNA and oligonucleotide probes with detection by chemiluminescence or chemifluorescence offers a high degree of versatility. Stability Probes are stable for up to six months if stored at – 20° in 50% glycerol. 146 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Efficiency Nucleic acid probes are labelled efficiently and uniformly with enzyme. Accuracy The crosslinking labelling reaction does not result in any net synthesis of probe and the amount of probe present before and after labelling does not change. Therefore probe concentrations during hybridization can be determined more accurately. 147 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Gene Images Random-Prime Labelling and Detection Gene Images™ Random-Prime is designed to generate fluorescein labelled DNA probes using a random prime labelling reaction. The reaction requires only 50 ng of template DNA as the strand displacement properties of the enzyme, coupled with non-limiting concentrations of nucleotide, result in net synthesis of probe. The use of fluorescein allows the efficiency of the reaction to be checked before hybridization by a fluorescence assay. Protocol Summary Probe labelling Fluorescein dUTP is incorporated into DNA in a random prime labelling reaction using Klenow DNA polymerase. Nonamer primers are used to ensure efficient hybridization to probe. Probes can be used without purification. Optional rapid labelling assay The efficiency of probe labelling can be checked by spotting a small aliquot of labelled probe onto Hybond™N+ membrane, washing to remove unincorporated fluorescein and visualizing on a UV transilluminator or fluorescent scanner. Hybridization For optimum performance use the recommended hybridization buffer. Sensitive detection is achieved by the use of a monoclonal antibody which is highly specific for alkaline phosphatase. 50 fg of target can be routinely detected in a human genomic Southern blot. Detection Chemiluminescence with CDP-Star: Hybridized blots are detected with CDP-Star reagent. Following a 2 minute incubation, blots are exposed to Hyperfilm MP for 1 to 2 hours. Sensitivities as low as 50 fg can be detected. or Chemifluorescence with ECF: Hybridized blots are detected with ECF substrate. Non-fluorescent substrate is catalysed by alkaline phosphatase to produce a fluorescent signal which accumulates over time; low sensitivity applications yield results after 1 hour, high sensitivity applications usually require overnight incubation. 148 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Recommended Applications Probes labelled with the Gene Images Random-Prime Labelling and Detection System can be used for most membrane applications especially in situations where there is insufficient probe for labelling by direct methods. Gene Images Random-Prime Labelling and Detection Systems may be used with either the detection reagent CDP-Star for high sensitivity applications, or with ECF substrate for quantification on fluorescence scanning instrumentation. Gene Images Random-Prime is especially recommended for high sensitivity Northern applications. Confidence The use of fluorescein-dUTP allows a simple and rapid (30 minute) probe labelling assay to be performed by monitoring the fluorescence of labelled probes on a UV transilluminator. This enables the efficiency of the labelling reaction to be checked before proceeding with the hybridization. Stability Probes are stable for at least 9 months under recommended conditions minimizing the requirement for continual labelling of frequently used probes. 149 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Gene Images 3’-Oligolabelling and Detection Gene Images™ 3’-Oligolabelling system is based on the labelling of standard unmodified oligonucleotide sequences with fluoresceindUTP in a reaction catalysed by terminal deoxynucleotidyl transferase. The optimized protocol results in a tail of 6-8 nucleotides, which provides good sensitivity with low background, and does not interfere with the specificity of hybridization. The use of fluorescein as the label allows the efficiency of the labelling reaction to be checked using a fluorescence assay before hybridization. Protocol Summary 150 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Probe labelling Standard oligonucleotides are tailed with fluorescein-dUTP using the enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase. There is no need to purify the probe before hybridization. Optional rapid labelling assay Labelling efficiency can be checked by spotting a small aliquot of labelled probe onto Hybond-N+ membrane, washing to remove unincorporated fluorescein and visualizing on a transilluminator or fluorescence scanner. Hybridization For optimum performance use the recommended hybridization buffer. Detection Chemiluminescence with CDP-Star: Hybridized blots are detected with CDP-Star reagent. Following a two minute incubation, blots are exposed to autoradiography film for 1 to 2 hours or detected using a light collection device. or Chemifluorescence with ECF: Hybridized blots are detected with ECF substrate. Non-fluorescent substrate is catalysed by alkaline phosphatase to produce a fluorescent signal which accumulates over time; low sensitivity applications yield results after 1 hour; high sensitivity applications usually require overnight incubation. Recommended Applications The 3’ -Oligolabelling system can be used to label probes for a wide variety of applications. The indirect labelling method and high sensitivity makes it especially suited to oligo screening applications requiring a high degree of stringency control. Ease of use Simple protocols, and ready-to-use reagents ensures first-time success. Confidence The use of fluorescein-dUTP allows a simple and rapid (30 minute) probe labelling assay to be performed by monitoring the fluorescence of labelled probes on a UV transilluminator. This enables the efficiency of the labelling reaction to be checked before proceeding with the hybridization. Use with any oligonucleotide, special synthesis is not required. Stability Labelled probes are stable for at least 9 months, under recommended conditions allowing batches of probe to be prepared and stored until needed. 151 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne ECL Direct Labelling and Detection System The ECL Direct™ nucleic acid labelling and detection system is based on the direct labelling of DNA or RNA probes with the enzyme horseradish peroxidase (HRP) in a simple chemical reaction. Labelling takes only 10 minutes in a single tube reaction, and the resulting probe can be used directly in hybridization experiments without further purification. Detection of hybridized probe is achieved by generation of light via HRP catalysed oxidation of luminol with the use of an enhancer maximizing light output. Protocol Summary Probe labelling The labelling solution is added to the unlabelled, denatured single-stranded DNA or RNA probe. The positively charged HRP complex is bound electrostatically to the negatively charged DNA. Glutaraldehyde is added to covalently cross-link the HRP to the probe. There is no need to purify the probe before hybridization. Labelled probes can be stores in 50% glycerol for several months at -15°C to -30°C. Hybridization The labelled probe is hybridized to the blot using the specially formulated ECL Gold Buffer, which stabilizes the activity of the enzyme. Following a 15 minute pre-hybridization, hybridization with probe is performed overnight. For colony or plaque screens a 2 to 4 hour hybridization is sufficient. 152 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Detection The hybridized blot is soaked in the detection reagent. Where the probe is bound there is peroxidase-catalysed oxidation of luminol and subsequent enhanced chemiluminescence. The resulting light signal is detected on autoradiography film. Recommended Applications ECL Direct™ is a fast and easy system for high to medium target amount applications such as colony/plaque screens, dot blots, genome mapping, and PCR* product analysis. It is particularly useful for applications which require a blot to be re-probed several times and screening applications requiring rapid throughput and results. Ease of use Simple protocol coupled with high initial signal output makes it the most rapid non-radioactive system available. Speed Less than 4 hours from probe labelling to detection in high target amount applications with no lengthy antibody steps. Ease of re-probing HRP is inactivated by the chemiluminescent reaction therefore no need to strip blots before reprobing. This saves time and avoids possible membrane damage. Consistency Consistent results combining strong signals with very low backgrounds on nylon membranes. Convenience Convenient, ready-to-use ECL Direct Gold hybridization buffer formulated with an exclusive rate enhancer*. Efficiency DNA or RNA probes are labelled equally efficiently. Stability Probes can be stored for at least 3 months in 50% glycerol, avoiding the need for frequent labelling. Choosing a radioactive labelling system Labelling with 32P-labelled nucleotides remains the most sensitive and robust technology available. Radiolabelled probes offer the following benefits: Sensitivity 32P-labelled probes offer the highest level of sensitivity, ideal for detection where there is a very low abundance of target. Prolonged emission Radioactively labelled blots continue to emit signal for several weeks enabling multiple exposures and long exposure times to be carried out as required. 153 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Reliability Radioactive labelling systems are very forgiving. Precise optimization of hybridization conditions is less critical, and hence less time is used determining ideal hybridization and stringency conditions. Flexibility Incorporation of radiolabelled nucleotides into a probe can be controlled by the labelling conditions. Therefore probes can be produced with differing specific activities and incorporation levels can be measured accurately, allowing exact probe concentrations to be determined. Choice of radiolabel The selection of radiolabel for a particular application depends on the level of sensitivity and resolution required. For most membrane hybridization techniques sensitivity is most important, so a high-emission energy label will provide sensitive results with shorter exposure times but resolution will be compromised. In applications where resolution is most important, such as microsatellite analysis and sequencing, a lower energyemitting isotope will give improved resolution, but longer exposure times will be required. The three most widely used isotopes in the life science field are: P For high-sensitivity membrane applications 32P is the label of choice due to its high ®-energy and the elevated specific 32 activity of P-labelled probes. Labelled nucleotides with a specific activity of >110 TBq/mmol, >3000 Ci/mMol are 32 available for these applications. P With the advantage of a lower emission energy, 33P offers increased resolution as compared to 32P. It may be used for 33 membrane hybridizations, but its lower energy emission means that longer exposure times are required. It is ideally suited to sequencing and in situ hybridization applications. S This label can be used for hybridizations but is not recommended because of its low emission energy. However, it 35 provides high resolution and is suited to sequencing and in situ hybridization applications. Choice of labelling method Random prime The most widely used method for the uniform labelling of DNA to provide high label density probes. Ready-To-Go™ DNA Labelling Beads, Rediprime™ II, Megaprime™ and Multiprime™ are all based on the random prime technique which uses random sequence hexamers or nonamers to prime DNA synthesis on a denatured DNA template at numerous sites along its length. The reaction uses the Klenow fragment of DNA polymerase I and leads to an efficient use of labelled nucleotides and net synthesis of probe. Therefore, very small amounts of input DNA are required, enabling high specific activity DNA probes to be produced with relatively small quantities of added label. Nick translation This method provides uniformly labelled DNA probes by the introduction of random nicks into the template by the action of DNase I and subsequent filling in by DNA polymerase I. The existing nucleotide sequence of the DNA probe is renewed without net synthesis occurring. Nick translation can be used for the production of large amounts of high-specific activity probes. NOT USED ANYMORE because unreliable (difficile bilanciare attività Dnasica) End labelling This is the method of choice for labelling oligonucleotide probes. Either the 3’ or 5’ end can be labelled by the use of different techniques. End-labelled oligonucleotide probes may be used for membrane hybridizations. Probes labelled with 35S and 33P are suitable for use with in situ hybridization. RNA labelling This technique produces radiolabelled RNA probes from inserts cloned into appropriate vectors. SP6 and T7 RNA polymerase may be used to produce asymmetric probes from the same or different vectors. Asymmetric probes are used in in situ hybridization applications to provide both positive results and negative controls. 154 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Rediprime II DNA Labelling System Amersham Biosciences ' premium radioactive labelling system consists of individually dispensed reaction mixes which are dried in the presence of a stabilizer and a dye to make labelling of probes easier. The system can be stored at 4°C or at room temperature ready for use. ACDB Rediprime II reaction mixes have been formulated using an improved exonuclease free Klenow to give probes with specific activities of 1.9 x 109 dpm/mg or greater after 10 minutes incubation at 37° with the majority of DNA substrates. When used with Redivue™ [32P]dCTP, Rediprime II reactions can be set up and completed to produce a DNA probe ready for hybridization in less than 15 minutes. Protocol Summary 155 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Recommended Applications Labelling of DNA from a variety of sources to a high specific activity for use in Southern and Northern blot hybridizations. The system is designed for use with Redivue [32P]dCTP with a specific activity of 110TBq/mmol, 3000 Ci/mmol. Speed Quick and convenient protocol requires the addition of template and labelled nucleotide only. Stability Ambient temperature stable, therefore can be stored at room temperature. Flexibility DNA can be labelled in the presence of Low Melting Point agarose or restriction enzyme buffers. Efficiency Each labelling mix can label up to 25 ng of DNA to a specific activity of >10 9 dpm/∝g. 5’-End Labelling Kit The 5’-End Labelling Kit exploits an optimized exchange buffer and T4 polynucleotide kinase to label oligonucleotides with or without a 5’-phosphate group. Labelling is complete within 30 minutes. Protocol Summary Recommended Applications 156 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Oligonucleotides labelled in this way are suitable for use in high target amount applications. For example as probes or primers to track PCR products, or in gel-shift and fragment analysis assays. Flexibility Very small fragments of both DNA and RNA can be labelled. Reliability Location of the labelled group is known. 3’-End Labelling Kit Terminal deoxynucleotidyl transferase adds deoxyribonucleotides onto the 3’-ends of DNA fragments. It can be used in conjunction with 32P-, 33P- 35S- or 3H labelled nucleotides to label DNA for a variety of applications. Protocol Summary Recommended Applications One of the major applications for the 3’ -End Labelling Kit is in the production of 32P end-labelled oligonucleotide probes for screening applications involving colony, plaque or PCR clones. 35S or 33P end-labelled probes are used for in situ hybridization applications. Flexibilty Template independent and all types of 3’ -Ends can be labelled. Reliability Location of the labelled group is known. Ready-To-Go PCR Beads Ready-To-Go™ PCR Beads are pre-mixed, pre-dispensed, individual reactions designed for performing PCR amplification. Each dried room-temperature stable bead contains Taq* DNA polymerase, nucleotides and buffer, all optimized for standard PCR. Results are typically comparable with, or superior to, those using pre-formulated, aqueous ‘master-mixes’. Protocol Summary Each pre-dispensed Ready-To-Go PCR Bead contains Taq DNA polymerase, nucleotides and buffer, all optimized for PCR. Ready-To-Go PCR Beads are designed for 25 µl reactions. Simply add DNA template and primers and begin temperature cycling. The beads are provided in either 0.5 ml or 0.2 ml tubes that are compatible with most thermocyclers. The 0.2 ml tubes come assembled in a convenient 96-well (8 x 12) plate format that allows individual strips of tubes to be easily removed. This flexibility allows the use of either the entire 96-well plate, strips of 8 or individual 0.2 ml tubes. Recommended Applications 157 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Ready-To-Go PCR Beads can be used with a variety of templates including genomic DNA, viral DNA, plasmid DNA and cDNA. They provide an excellent source of probe template for both radioactive and non-radioactive labelling techniques. In addition low levels of radioactivity may be directly incorporated for use in applications such as single stranded conformational polymorphism (SSCP) assays. Convienience PCR components are provided in preformulated, single dose beads, reducing risk of pipetting errors and introducing contaminants. Pre-dispensed, individually packed PCR reactions, ensures a fresh reaction that dissolves quickly in a PCR compatible tube. Consistency Application testing ensures each batch of beads delivers consistent results. Compatability Each reaction is provided in a thin-walled 0.5 ml or 0.2ml tube, which fit directly into most thermocyclers. RNA Labelling Kit The RNA Labelling Kit has been designed to give high-specific activity single-stranded RNA probes in vitro. This kit contains RNase-free DNase I for template removal and pre-prepared dithiothreitol (DTT) for added convenience. The kit comes with SP6 and T7 RNA polymerases and can also be used with T3 RNA polymerase, which must be purchased separately. Recommended Applications For the generation of high specific activity RNA probes for membrane hybridization and in situ applications. Also full length RNA probes for RNase protection studies. Sensitivity RNA probes show higher sensitivity than equivalent nick-translated probes in both Northern and in situ hybridizations. Stability RNA:RNA hybrids are more stable than DNA:DNA or DNA:RNA hybrids, due to avoidance of reannealing and stronger hydrogen bonding. Specificity Removal of non-specific bound probe by treatment with RNase A which is very specific for singlestranded RNA. Rapid-hyb Buffer Rapid-hyb™ Buffer is a rate enhancing hybridization buffer for rapid hybridization of radiolabelled nucleic acid probes to membrane-bound targets. In some Northern blotting experiments Rapid-hyb Buffer contributed to a five fold improvement in sensitivity. Recommended Applications 158 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Rapid-hyb Buffer is optimized for use in a wide range of applications, including Southern, Northern, dot/slot blots and colony/plaque lifts. Speed Single-copy gene detection is possible after only a 2 hour hybridization with 32P-labelled probes. High signal to noise ratio Inclusion of chemical blocking agents ensures low backgrounds. Stability Stores at room temperature – ready to use without addition of carrier DNA. Compatibility Compatible with DNA, RNA and oligonucleotide probes. Versatility A wide range of hybridization temperatures (42°C – 70°C) can be used for optimal results. 159 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne COMMONLY USED REAGENTS AND EQUIPMENT This collection describes the preparation of buffers and reagents used in the manipulation of nucleic acids and proteins (see Table 1). When preparing solutions, use deionized, distilled water and reagents of the highest grade available. Sterilization⎯by filtration through a 0.22-um filter or by autoclaving⎯is recommended for most applications. Recipes for the following can be found elsewhere in the manual: culture media, antibiotics (Table 5), lactose analogs (Table 4), and enzyme buffers. CAUTION: Handle strong acids and bases carefully. Acid precipitation solution 1 M HCl 0.1 M sodium pyrophosphate Nucleic acids can also be precipitated with a 10% (w/v) solution of trichloroacetic acid (TCA); however, this recipe is cheaper, easier to prepare, and just as efficient. Ammonium acetate, 10 M Dissolve 385.4 g ammonium acetate in 150 ml H2O Add H2O to 500 ml BBS (BES-buffered solution), 2× 50 mM N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES; Calbiochem) 280 mM NaCl 1.5 mM Na2HPO4, pH 6.95 800 ml H2O Adjust pH to 6.95 with room temperature 1 N NaOH H2O to 1 liter Filter sterilize through a 0.45-um nitrocellulose filter (Nalgene) Store in aliquots at −20°C (can be frozen and thawed repeatedly) The pH of this solution is critical (pH 6.95 to 6.98). When a new batch of 2× BES buffer is prepared, its pH should be checked against a reference stock prepared (and tested) earlier. CaCl2, 1 M 147 g CaCl2⋅2H2O H2O to 1 liter Denhardt solution, 100× 10 g Ficoll 400 10 g polyvinylpyrrolidone 10 g bovine serum albumin (Pentax Fraction V; Miles Laboratories) H2O to 500 ml Filter sterilize and store at −20°C in 25-ml aliquots Dithiothreitol (DTT), 1 M Dissolve 15.45 g DTT in 100 ml H2O Store at −20°C EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid), 0.5 M (pH 8.0) Dissolve 186.1 g Na2EDTA⋅2H2O in 700 ml H2O Adjust pH to 8.0 with 10 M NaOH (~50 ml) Add H2O to 1 liter Ethidium bromide, 10 mg/ml Dissolve 0.2 g ethidium bromide in 20 ml H2O Mix well and store at 4°C in dark 160 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne CAUTION: Ethidium bromide is a mutagen and must be handled carefully. HBSS (Hanks balanced salt solution) 5.4 mM KCl 0.3 mM Na2HPO4 0.4 mM KH2PO4 4.2 mM NaHCO3 1.3 mM CaCl2 0.5 mM MgCl2 0.6 mM MgSO4 137 mM NaCl 5.6 mM D-glucose 0.02% phenol red (optional) Add H2O to l liter and adjust pH to 7.4 HBSS can be purchased from Biofluids or Whittaker. HBSS may be made or purchased without CaCl2 and MgCl2. These are optional components that usually have no effect on an experiment. In some cases, however, their presence may be detrimental to a procedure. Consult the individual protocol to see if the presence or absence of these components is recommended in the materials list. HCl, 1 M Mix in the following order: 913.8 ml H2O 86.2 ml concentrated HCl HeBS (HEPES-buffered saline) solution, 2× 16.4 g NaCl 11.9 g HEPES acid 0.21 g Na2HPO4 800 ml H2O Titrate to pH 7.05 with 5 N NaOH Add H2O to 1 liter Filter sterilize through a 0.45-um nitrocellulose filter Test for transfection efficiency and store at −20°C in 50-ml aliquots An exact pH is extremely important for efficient transfection. The optimal pH range is 7.05 to 7.12. KCl, 1 M 74.6 g KCl H2O to 1 liter MgCl2, 1 M 20.3 g MgCl2⋅6 H2O H2O to 100 ml MgSO4, 1 M 24.6 g MgSO4⋅7 H2O H2O to 100 ml MOPS buffer 0.2 M MOPS [3-(N-morpholino)-propanesulfonic acid], pH 7.0 0.5 M sodium acetate 0.01 M EDTA Store in the dark and discard if it turns yellow NaCl, 5 M 292 g NaCl H2O to 1 liter NaOH, 10 M 161 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Dissolve 400 g NaOH in 450 ml H2O Add H2O to 1 liter PBS (phosphate-buffered saline) 10× stock solution, 1 liter: 80 g NaCl 2 g KCl 11.5 g Na2HPO4⋅7 H2O 2 g KH2PO4 Working solution, pH ~7.3: 137 mM NaCl 2.7 mM KCl 4.3 mM Na2HPO4⋅7 H2O 1.4 mM KH2PO4 Potassium acetate buffer, 0.1 M Solution A: 11.55 ml glacial acetic acid/liter (0.2 M). Solution B: 19.6 g potassium acetate (KC2H3O2)/liter (0.2 M). Referring to Table 2 for desired pH, mix the indicated volumes of solutions A and B, then dilute with H2O to 100 ml. This may be made as a 5- or 10-fold concentrate by scaling up the amount of potassium acetate in the same volume. Acetate buffers show concentration-dependent pH changes, so check concentrate pH by diluting an aliquot to the final concentration. To prepare buffers with pH intermediate between the points listed in Table2, prepare closest higher pH, then titrate with solution A. Potassium phosphate buffer, 0.1 M Solution A: 27.2 g KH2PO4 per liter (0.2 M). Solution B: 34.8 g K2HPO4 per liter (0.2 M). Referring to Table 3 for desired pH, mix the indicated volumes of solutions A and B, then dilute with H2O to 200 ml. This may be made as a 5- or 10-fold concentrate by scaling up the amount of potassium phosphate in the same volume. Phosphate buffers show concentration-dependent pH changes, so check concentrate pH by diluting an aliquot to the final concentration. SDS 10% 50 g Sodium dodecyl sulfate disodium salt H2O to 500 ml Scaldare 400 ml di H2O a circa 60-70°C, aggiungere SDS mantenendo la soluzione in agitazione Aggiungere H2O a 500 ml SDS electrophoresis buffer, 5× 15.1 g Tris base 72.0 g glycine 5.0 g SDS H2O to 1000 ml Dilute to 1× or 2× for working solution, as appropriate Store up to 1 month at 0° to 4°C Do not adjust the pH of the stock solution, as the solution is pH 8.3 when diluted. SED (standard enzyme diluent) 20 mM Tris⋅Cl, pH 7.5 500 ug/ml bovine serum albumin (Pentax Fraction V) 10 mM α-mercaptoethanol Store at 4°C for up to 1 month 162 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne Sodium acetate, 3 M Dissolve 408 g sodium acetate⋅3 H2O in 800 ml H2O Add H2O to 1 liter Adjust pH to 4.8 or 5.2 (as desired) with 3 M acetic acid Sodium acetate buffer, 0.1 M Solution A: 11.55 ml glacial acetic acid/liter (0.2 M). Solution B: 27.2 g sodium acetate (NaC2H3O2⋅3 H2O)/liter (0.2 M). Referring to Table 2 for desired pH, mix the indicated volumes of solutions A and B, then dilute with H2O to 100 ml. (See Potassium acetate buffer recipe for further details.) Sodium phosphate buffer, 0.1 M Solution A: 27.6 g NaH2PO4⋅ H2O per liter (0.2 M). Solution B: 53.65 g Na2HPO4⋅7 H2O per liter (0.2 M). Referring to Table A.2.3 for desired pH, mix the indicated volumes of solutions A and B, then dilute with H2O to 200 ml. (See Potassium phosphate buffer recipe for further details.) SSC (sodium chloride/sodium citrate), 20× 3 M NaCl (175 g/liter) 0.3 M Na3citrate⋅2 H2O (88 g/liter) Adjust pH to 7.0 with 1 M HCl STE buffer 10 mM Tris⋅Cl, pH 7.5 10 mM NaCl 1 mM EDTA, pH 8.0 TAE (Tris/acetate/EDTA) electrophoresis buffer 50× stock solution: 242 g Tris base 57.1 ml glacial acetic acid 37.2 g Na2EDTA⋅2 H2O H2O to 1 liter Working solution, pH ~8.5: 40 mM Tris⋅acetate 2 mM Na2EDTA⋅2 H2O TBE (Tris/borate/EDTA) electrophoresis buffer 10× stock solution, 1 liter: 108 g Tris base (890 mM) 55 g boric acid (890 mM) 40 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0 (see recipe; 20 mM) TE (Tris/EDTA) buffer 10 mM Tris⋅Cl, pH 7.4, 7.5, or 8.0 (or other pH; see recipe) 1 mM EDTA, pH 8.0 TEA (triethanolamine) solution 50 mM triethanolamine, pH ~11.5 0.1% Triton X-100 0.15 M NaCl Add Triton X-100 as a 10% stock sterilized by Millipore filtration and stored in the dark to prevent photooxidation (stock is stable 5 years at room temperature). TEN (Tris/EDTA/NaCl) solution 40 mM Tris⋅Cl, pH 7.5 163 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne 1 mM EDTA, pH 8.0 150 mM NaCl Store up to 6 months at room temperature TM buffer, 10× 100 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 100 mM MgCl2 Tris-buffered saline (TBS) 100 mM Tris⋅Cl, pH 7.5 0.9% (w/v) NaCl (150 mM) Store up to several months at 4°C Tris⋅Cl [tris(hydroxymethyl)aminomethane], 1 M Dissolve 121 g Tris base in 800 ml H2O Adjust to desired pH with concentrated HCl Mix and add H2O to 1 liter Approximately 70 ml of HCl is needed to achieve a pH 7.4 solution, and approximately 42 ml for a solution that is pH 8.0. NOTE: The pH of Tris buffers changes significantly with temperature, decreasing approximately 0.028 pH units per 1°C. Tris-buffered solutions should be adjusted to the desired pH at the temperature at which they will be used. Because the pKa of Tris is 8.08, Tris should not be used as a buffer below pH ~7.2 or above pH ~9.0. TTBS (Tween 20/TBS) 0.1% Tween 20 in Tris-buffered saline (TBS; see recipe) Store up to several months at 4°C Table 1 Molarities and Specific Gravities of Concentrated Acids and Bases Acid/base Molecular % by Molarity 1 M solution weight weight (approx.) (ml/liter) Acids Acetic acid (glacial) 60.05 99.6 17.4 57.5 Formic acid 46.03 90 23.6 42.4 98 25.9 38.5 Hydrochloric acid 36.46 36 11.6 85.9 Nitric acid 63.01 70 15.7 63.7 Perchloric acid 100.46 60 9.2 108.8 72 12.2 82.1 Phosphoric acid 98.00 85 14.7 67.8 Sulfuric acid 98.07 98 18.3 54.5 Bases Ammonium hydroxide 35.0 28 14.8 67.6 Potassium hydroxide 56.11 45 11.6 82.2 Potassium hydroxide 56.11 50 13.4 74.6 Sodium hydroxide 40.0 50 19.1 52.4 Table 2 Preparation of 0.1 M Sodium and Potassium Acetate Buffersa Desired Solution A Solution B pH (ml) (ml) 3.6 46.3 3.7 3.8 44.0 6.0 4.0 41.0 9.0 4.2 36.8 13.2 4.4 30.5 19.5 4.6 25.5 24.5 4.8 20.0 30.0 164 Specific gravity 1.05 1.205 1.22 1.18 1.42 1.54 1.70 1.70 1.835 0.90 1.447 1.51 1.53 3 ottobre 2008 5.0 5.2 5.4 5.6 Tecnologie biomolecolari 14.8 10.5 8.8 4.8 Massimo Delledonne 35.2 39.5 41.2 45.2 a Adapted by permission from CRC, 1975. Table 3 Preparation of 0.1 M Sodium and Potassium Phosphate Buffersa Desired Solution A (ml) Solution B (ml) Desired pH pH 5.7 93.5 6.5 6.9 5.8 92.0 8.0 7.0 5.9 90.0 10.0 7.1 6.0 87.7 12.3 7.2 6.1 85.0 15.0 7.3 6.2 81.5 18.5 7.4 6.3 77.5 22.5 7.5 6.4 73.5 26.5 7.6 6.5 68.5 31.5 7.7 6.6 62.5 37.5 7.8 6.7 56.5 43.5 7.9 6.8 51.0 49.0 8.0 a Adapted by permission from CRC, 1975. Solution A (ml) Solution B (ml) 45.0 39.0 33.0 28.0 23.0 19.0 16.0 13.0 10.5 8.5 7.0 5.3 55.0 61.0 67.0 72.0 77.0 81.0 84.0 87.0 90.5 91.5 93.0 94.7 Table 4 Lactose Analogs Used in DNA Cloning Technology Stock concentrationa 100 mM Use Characteristics Very effective inducer 20 mg/ml (dissolved in N,N dimethyl formamide) Identification of lacZ+ bacteria, especially useful for detecting βgalactosidase made by recombinant vectors 10 mM β-galactosidase assays Phenyl-β-D-galacto-side (Pgal) 2 mg/ml Selection for lac constitutive mutants Orthonitrophenyl-β-D-thiogalacto-side (TONPG) 10 mM Selection for lac- mutants Nonmetabolizable inducer Noninducing chromogenic substrate of β-galactosidase (cleavage of Xgal results in blue color); production of blue color independent of lacY gene product Chromogenic substrate of βgalactosidase (cleavage of ONPG results in yellow color) Inducer of the lactose operon in vivo; lactose is converted into allolactose by β-galactosidase Noninducing substrate of βgalactosidase; uptake partly dependent on lacY gene product Transported into cells by lac permease (the lacY gene product); inhibits cell growth at high concentration Galactoside Isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG) 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalactoside (Xgal) Orthonitrophenyl-β-D-galactoside (ONPG) 54-Ο-β-D-Galacto-pyranosyl D-glucose (allolactose) 165 3 ottobre 2008 Tecnologie biomolecolari Massimo Delledonne From The RED BOOK BULLETIN of Current Protocols in Molecular Biology: 166 28 settembre 2005 Tecnologie biomolecolari 167 Massimo Delledonne