CAPITOLO 7. IL CONGELAMENTO
Subcoltivazioni possono modificare le nostre linee cellulari, portando spesso ad
aberrazioni genetiche e, specialmente nel caso di cellule normali, non trasformate, ad
un invecchiamento della coltura, che puo' rispondere diversamente ai trattamenti e alle
indagini degli studiosi. Inoltre, portare avanti delle colture non necessarie e' un inutile
spreco di tempo e di materiale, cioe' di denaro. Infine e' possibile che le colture si
inquinino, ed e' bene quindi avere degli stock conservati. Il sistema migliore di
conservazione e' rappresentato dal congelamento. Per le cellule eucariote, il sistema
preferito e' il congelamento in azoto liquido, basato sul principio che le sole reazioni
che avvengono a -176 (temperatura dell'azoto liquido) sono le ionizzazioni dovute alla
radiazione di fondo, reazioni che peraltro sono piuttosto rare. Le reazioni enzimatiche
cessano a -136C circa.
NORME DI SICUREZZA : Prima di lavorare con l'azoto liquido, e' bene chiedere
l'assistenza di personale esperto. L'azoto liquido infatti causa bruciature dovute alla
sua temperatura estremamente bassa. ll materiale congelato e l'azoto liquido vanno
manipolati indossando i cosiddetti dispositivi di protezione individuali o (dpi) i e cioe’ i
guanti appositi il grembiule e gli occhiali o la maschera di protezione, anche perche'
l'azoto puo' entrare nelle ampolle congelate, e con il riscaldamento passa allo stato di
vapore e puo' quindi causare l'esplosione delle ampolle stesse.
7.1 I crioprotettivi
Il congelamento deve mantenere elevata la vitalita' cellulare per tutto il periodo
di congelamento. E' molto importante sia la velocita' di congelamento che di
scongelamento. Per quanto riguarda il congelamento bisogna ricordare che il
congelamento rapido porta alla formazione di cristalli di ghiaccio all'interno della
cellula, cristalli che, al momento dello scongelamento, portano alla rottura della
membrana plasmatica. Basse velocita' di congelamento portano invece
alla
deposizione di ghiaccio nell'ambiente extracellulare, a condizione pero' che la
concentrazione interna di soluti sia sufficientemente alta da rendere la concentrazione
dell'acqua intracellulare minore di quella extracellulare. Questo processo viene di
solito controllato aggiungendo al terreno di congelamento un agente crioprotettivo
permeabile come il dimetilsolfossido (DMSO) o il glicerolo. Quando poi si formano i
cristalli di ghiaccio nel mezzo extracellulare, l'acqua viene sottratta alle cellule perche'
la tensione di vapore del ghiaccio e' piu' bassa di quella del citoplasma,
prevalentemente acquoso. L'acqua esce dalle cellule finche' le tensioni di vapore sono
all'equilibrio. Durante questo processo il volume cellulare diminuisce e le cellule
vegetali o microbiche possono lisarsi. Per questi tipi di celule si possono utilizzare
come crioprotettivi sostanze come il glicole polietilenico (PEG) o il
polivinilpirrolidone (PVP) che non penetrano nella cellula e permettono che il
processo di disidratazione avvenga gradualmente.
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Nelle soluzioni di congelamento di solito si aggiunge una elevata quantita' di
siero (fino al 50%): questa alta concentrazione serve a mantenere l’ integrita' cellulare
mantenendo alta la concentrazione intracellulare delle proteine, dato che il DMSO
rende permeabili le membrane cellulari.
7.2 La soluzione di congelamento.
Vi sono diverse ricette per la soluzione di congelamento, di solito sempre
caratterizzate da un’elevata percentuale di siero. Ad es. si puo’ preparare un terreno
con FCS al 50% e DMSO al 10%. Le cellule da congelare vengono contate,
centrifugate e il pellet risospeso in un volume sufficiente da ottenere la concentrazione
ottimale per il congelamento di quella linea, di solito tra 0,8 x 106 e 3 x 106 cellule/mL.
Circa 1 mL di sospensione cellulare viene posta nelle provette da congelamento
(criotubes) e congelata. Per trovare le migliori condizioni di congelamento
(composizione del terreno e concentrazione cellulare) si puo’ fare riferimento alle
schede che si possono reperire o nei manuali di molte banche di cellule o nel sito
dell’ATCC (www.ATCC.com) .
7.3 Il congelamento.
Le cellule devono essere congelate solo quando sono nella fase esponenziale
di crescita e quando sono in buona salute. Le cellule confluenti o iperconfluenti non
danno delle buone rese dopo il congelamento (e lo scongelamento). E' inoltre
importante controllare attentamente che non vi siano contaminazioni.
Le cellule devono essere ovviamente tripsinizzate se sono adese, contate e
centrifugate a 150-200 g per 5 minuti. Se e' possibile, e' meglio centrifugare a 4C. Il
sopranatante viene eliminato senza ovviamente disturbare il pellet.
Il protocollo di Morgan e Darling a questo punto prevede che le cellule vengano
risospese o nell'eventuale residuo di terreno rimasto nella provetta o in un piccolo
volume di terreno completo normale: la risospensione puo' essere fatta anche solo
dando dei colpetti alla provetta (la prima risospensione e' meglio SEMPRE farla in
piccoli volumi di liquido, perche' cosi' le cellule si sospendono meglio, senza formare
aggregati, cosa che invece succede SEMPRE quando risospendiamo in volumi
maggiori). Infine le cellule sono risospese con del terreno completo a 4C (SENZA
ANTIBIOTICI) in modo da ottenere una concentrazione cellulare doppia rispetto a
quella finale. Come regola generale, possiamo dire che le cellule aderenti vengono di
solito congelate ad una concentrazione di circa 1 x 106 cell/ml, mentre le cellule in
sospensione verranno congelate ad una concentrazione di circa 5 x 106 cell/ml.
Dovremo quindi arrivare a questo punto della procedura con 2 x 106 cell/ml e 10 x 106
cell /ml rispettivamente.
A questo punto le cellule vengono poste in bagno di ghiaccio e viene aggiunto
un volume uguale di soluzione di congelamento 2 X .
Il nostro protocollo prevede che le cellule siano centrifugate, venga scartato
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tutto il sopranatante e il pellet risospeso nel terreno da congelamento 1 X a 4C,
Qualunque protocollo si segua, a questo punto si mescola bene la sospensione
cellulare e aliquote da 1 ml della sospensione cellulare vengono poste in provette
apposite (dette criotubes) mantenuti in freddo e ovviamente sterili (di nuovo tutta la
procedura va fatta in sterilita'. I tappi dei criotubes non devono essere chiusi
stringendoli al massimo, dato che questo puo' causare una distorsione della
guarnizione e permettere l'entrata di azoto liquido nella provetta. Dobbiamo tra l'altro
ricordarci che l'azoto, anche se molto freddo, non e' sterile e l'entrata di azoto nella
provetta puo' essere molto pericolosa (vedi le norme di sicurezza).
Il congelamento ottimale viene effettuato a velocita' costante nei vapori di
azoto che si formano nel criocontenitore (detto volgarmente il bidone di azoto liquido):
la velocita' di raffreddamento dovrebbe essere di 1 C/min, e viene di solito ottenuta
con un "tappo speciale" che permette di abbassare a velocita' costante i campioni nei
vapori. La velocita' del raffreddamento dipende dal tipo di "tappo" e dal numero e
dalla posizione delle provette. Di solito le case produttrice dei criocontenitori e dei
"tappi" forniscono tutte le indicazioni necessarie.
Se non e' disponibile il "tappo" da congelamento, un'alternativa accettabile e'
rappresentata da una scatola di polistirolo espanso. Questa scatola deve avere delle
pareti di 5-10 cm e lo spazio interno riempito di carta tipo asciugamani o ovatta. Ogni
scatola dovrebbe alloggiare 10-20 criotubes che devono rimanere in piedi per evitare
che il materiale si congeli nel tappo (questo puo' essere pericoloso per le
contaminazioni). La scatola viene chiusa ermeticamente e messa in un congelatore a 80C. Le cellule in queste condizioni raggiungono la temperatura dei vapori dell'azoto
liquido (-80C) in circa 3 ore. A questo punto si mettono le cellule in azoto liquido.
Sarebbe bene non lasciare a lungo le cellule a -80 C.
7.4 Lo scongelamento.
Per scongelare le cellule bisogna preparare un bagno d'acqua a 37 C e
del terreno completo a temperatura ambiente. Le ampolle devono essere prelevate
dal contenitore di azoto con molta precauzione (vedi sotto). I criotubes possono
essere messi per precauzione in un sacchetto di plastica (tipo i sacchetti per il
congelamento degli alimenti o le dita di un guanto di lattice possibilmente senza talco)
e immersi nel bagno d'acqua. Lo scongelamento deve essere fatto molto
velocemente, quindi le ampolle vengono asciugate, passate con l'alcool al 70% e
messe sotto cappa. Il contenuto della ampolla (1 ml) deve ora essere diluito con 7 ml
di terreno completo e centrifugato per rimuovere il terreno di congelamento. La
diluizione puo' essere un punto critico della procedura, dato che si puo' causare un
forte shock osmotico al momento della diluizione con il terreno normale. Un "trucco"
per avere una diluizione graduale puo' essere quello di aspirare la sospensione
appena scongelata in una pipetta da 10 ml e di prelevare con la stessa pipetta i 7 ml di
terreno. Ovviamente, per non contaminare tutta la bottiglia di terreno, i 7 ml da
utilizzare verrano precedentementi messi in una provetta, eventualmente la stessa
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provetta in cui poi centrifugheremo le cellule. Se la pipetta da 10 non entra nel
criotube, si fara' l'operazione con quella da 5 ml, aggiungendo poi il terreno mancante.
Le cellule vengono centrifugate a 150-200 g per 5 minuti, il sopranatante eliminato e le
cellule risospese in 10 ml di terreno completo. Un campione viene prelevato per
contarlo e per valutarne la vitalita'. Le cellule vengono inoculate in fiasca ( o in altro
contenitore) e dopo 24 ore la coltura viene osservata al microscopio e se sono cellule
sospese possiamo ricontarle. Se sono cellule adese, dopo 24 ore devono essersi
attaccate al substrato. Se le cellule non si sono attaccate o sono tutte morte
ovviamente si scartano e si deve procedere al controllo di altri criovials per valutare se
l'intero batch e' morto, il che indica che la procedura di congelamento e' stata fatta in
modo sbagliato. Ovviamente si deve anche controllare di compiere lo scongelamento
in modo corretto. Per dare un po' di carica alle cellule appena scongelate si puo'
utilizzare un terreno addizionato del 20 % di siero, invece del solito al 10%.
Le diverse linee cellulari manifestano una diversa capacita' di ripresa dopo il
congelamento: in alcuni casi si ha un'altissima mortalita' e le cellule hanno bisogno
anche di 3-4 giorni per riprendersi completamente, altre cellule si riprendono
immediata mente.
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