Parte I File - e

GENE THERAPY Corso di Ingegneria Gene6ca e Terapia Genica Ballarino Monica TERAPIA GENICA trasferimento di materiale gene6co allo scopo di prevenire o curare una mala>a per modiﬁca gene6ca delle cellule del paziente •  Overdosaggio genico •  Silenziamento genico •  Riparazione di sequenze mutate TERAPIA GENICA Il farmaco e’ il materiale gene8co • 
• 
• 
• 
In Phase 1 trials, researchers test an experimental drug or treatment in a small group of people (20–80) for the ﬁrst 6me to evaluate its safety, determine a safe dosage range, and iden6fy side eﬀects. In Phase 2 trials, the experimental treatment is given to a larger group of people (100–300) to see if it is eﬀec6ve and to further evaluate its safety. In Phase 3 trials, the treatment is given to large groups of people (1,000–3,000) to conﬁrm its eﬀec6veness, monitor side eﬀects, compare it to commonly used treatments, and collect informa6on that will allow it to be used safely. In Phase 4 trials, post-‐marke6ng studies delineate addi6onal informa6on, including the treatment's risks, beneﬁts, and op6mal use. Most gene-‐therapy clinical trials are designed to treat cancer. Retrovirus vectors and adenovirus vectors have, so far, been the most commonly used vectors in gene-‐transfer trials. TERAPIA GENICA VANTAGGI •  Correzione radicale dei dife> •  Azione su meccanismi molecolari per i quali risulta diﬃcile sviluppare farmaci speciﬁci •  Vantaggi economici (se permanente evita la necessità di traYamen6 ripetu6) LIMITAZIONI •  Poca necessità (disponibili terapie alterna;ve) •  Grandi problemi tecnici •  Problemi tecnici della terapia genica ed eﬀe> indesidera6 :  
 
 
 
 
Eﬃcienza di trasferimento (veYori virali migliori di non virali) Sele=vità del sistema di trasferimento Espressione non regolata Reazioni del sistema immunitario Problemi e6ci Necessità della Terapia genica Comprendere meccanismi ﬁsiopatologici della mala>a bersaglio Iden6ﬁcare bersaglio cellulare ideale per il rilascio genico Iden6ﬁcare il metodo e la strategia per il trasferimento genico Deﬁnire il livello terapeu;co e la durata d’espressione del gene introdoYo Deﬁnire il numero di cellule da u6lizzare nel trasferimento Deﬁnire l’età o>male del paziente da arruolare per il traYamento ciascuna patologia richiede quindi una diﬀerente metodica e presenta delle problema8che tecniche peculiari Tappe fondamentali 1866 1868 1933 1944 1951 1953
1956
1957
1963  1963
1965  1972 1973 1981
1984-‐2004 1985 1990
1995
1995
1999
2002
FaYori ereditabili (Mendel) Iden6ﬁcazione acidi nucleici I geni sono contenu6 nei cromosomi (Morgan) DNA portatore dell’informazione gene8ca (Avery) Scoperta dei trasposoni (McClintock) Doppia elica (Watson e Crick) DNApolI (Kornberg) Dogma centrale (Crick) Metodo sequenziamento DNA (Sanger) Enzimi di restrizione Decifrato Codice gene6co I molecola di DNA ricombinante (Berg ) Tecnologia del clonaggio genico (Boyer) Topo transgenico ProgeYo Genoma (Collins) PCR (Mullis) Primo traPamento di terapia genica realizzato con successo su una bambina aﬀePa da SCID (W. F. Anderson) Test del DNA per casi giuridici Inizio trials clinici per la SCID Primo morto per reazione inﬁammatoria per terapia terapia genica (OTC) Cure SCID Adverse events in gene therapy: 1999: adenovirus vector causes pa8ent death In September 1999, 18-‐year-‐old Jesse Gelsinger took part in a gene-‐
therapy clinical trial at the University of Pennsylvania. Gelsinger suﬀered from a par6al deﬁciency of ornithine transcarbamylase (OTC), a liver enzyme that is required for the safe removal of excessive nitrogen from aminoacids and proteins. By the morning aher his treatment (3.8 × 1013 par6cles), he was displaying symptoms of liver injury and DISSEMINATED INTRAVASCULAR COAGULATION. Within four days of treatment, Gelsinger died from mul6-‐organ failure. Although the vector had been infused directly into the liver through the hepa6c artery, substan6al amounts of the vector had disseminated into the circula6on and had triggered a massive inﬂammatory response 2002–2003: retrovirus vector induces a lymphoprolifera8ve disorder In April 2000, three young children suﬀering from the SCID-‐XI syndrome had developed func6onal immune systems aher the reinfusion of haematopoie6c stem cells TRANSDUCED with an MLV vector. Two of the three pa6ents developed a leukaemia-‐like disorder: the cancerous T cells are thought to be derived from single transduced cells in which the retrovirus genome had inserted near, or in, the LIM domain only 2 (LMO2) oncogene, ac6va6ng LMO2 expression. La scoperta del DNA: alcuni cenni storici •  1928 F. Griffith scoprì che i caratteri della forma “liscia” di Pneumococcus
potevano essere trasferiti alla forma “rugosa”, miscelando i batteri “lisci”
morti con batteri “rugosi” vivi. Questo sistema, pur non fornendo nessuna
evidenza su quale fosse la sostanza che determinava il cambiamento,
mostrava che qualcosa potesse trasportare l'informazione genetica dai
resti dei batteri morti a quelli vivi. Si parlò quindi di un principio
trasformante in grado di modificare i batteri vivi.
•  1943 O.Theodore Avery dimostrò che il DNA è il principio trasformante
alla base di questo fenomeno.
•  1953 Alfred Hershey e Martha Chase dimostrarono che il materiale
genetico del fago T2 è effettivamente il DNA: ruolo del DNA nell'ereditarietà
Trasferimento del DNA in cellule bersaglio Il gene sano viene dapprima clonato nel veYore appropriato e poi inserito nelle cellule mutate per produrre cellule gene;camente modiﬁcate. 1.  in vivo: trasferimento di DNA direPamente nelle cellule del paziente (“direct delivery”). Il gene terapeu6co è impaccheYato in un veicolo di rilascio (come un retrovirus) usato per infeYare il paziente nel tessuto nell’organo target. 2.  ex vivo: il DNA prima trasferito in cellule bersaglio isolate dall’organismo e faYe crescere in laboratorio (“cell-‐based delivery”). Cellule ES gene6camente modiﬁcate, cellule ES dalla banca HLA, soma6c-‐cell nuclear transfer (SCNT) faYe diﬀerenziare in vitro, oppure cellule staminali prelevate dall’adulto vengono messe in coltura e traYate in modo da ricevere il gene terapeu6co mediante veYore. Dopo la crescita e la selezione delle cellule che hanno eﬀe>vamente ricevuto il gene terapeu6co (ora gene;camente modiﬁcate) vengono reintrodoYe nel paziente. 1 2 La Terapia genica in vivo Viene aYuata in tu> quei casi in cui le cellule non possono essere messe in coltura, o prelevate e reimpiantate, come quelle del cervello o del cuore e della maggior parte degli organi interni. In questo caso il gene d'interesse viene inserito nell'organismo direYamente, tramite un opportuno veYore, per via locale o sistemica. La Terapia genica ex vivo Severe combined immunodeﬁciency treatment Consiste nel prelievo delle cellule s o m a 6 c h e d a l l ’ i n d i v i d u o c h e successivamente, vengono messe in coltura. Le cellule vengono poi transfe2ate con il gene d'interesse, clonato all’interno di un apposito veYore (spesso virale), e successivamente vengono re-‐infuse o re-‐impiantate nel corpo del soggeYo. Tale procedura è sicuramente la più lunga e la più costosa delle due ma permeYe di selezionare ed ampliﬁcare le cellule d'interesse ed inoltre gode d'una maggior eﬃcienza. Healty adenosine deaminase (ADA) gene E’ la modalità più u;lizzata ma è riservata solamente a quei casi in cui sia possibile prelevare, meYere le cellule in cultura e reinserirle nell'organismo… Strategie terapeutiche
Esistono essenzialmente due approcci in terapia genica: 1) Terapia genica indire2a • 
consiste nel controllo della crescita tumorale e della morte cellulare mediante inserimento di sequenze geniche che agiscono come intermedi. Esempi: •  S6molazione delle risposte immunitarie •  Alterazioni della angiogenesi tumorale •  Inserimento di enzimi per la trasformazione di "pro-‐drug” 2) Terapia genica dire2a • 
consiste nell'alterazione direYa della sequenza di DNA responsabile della trasformazione maligna o del suo mantenimento. Esempi: •  ablazione di oncogeni •  aggiunta di geni oncosoppressori (perchè assen6 o muta6) 1) INDIRETTA: uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario Es:1 Introduzione di un gene che codiﬁca un an6gene estraneo in cellule malate per farlo esprimere sulla loro membrana. Le cellule malate vengono cosi uccise tramite la risposta immunitaria. Nella terapia genica dei tumori, si sfruOa l’a=vità di geni che codiﬁcano faOori che a=vano le cellule del sistema immunitario, con lo scopo di aumentare la loro a=vità vs le cellule tumorali. I geni inseri6 possono anche codiﬁcare faYori di crescita o citochine che vengono secre6 dalla cellula, esercitando vari eﬀe> su altre cellule vicine o distan6, o agendo nell’ambiente extracellulare. 1) INDIRETTA: uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario (Terapia suicida) Es:2 Introduzione di gene che codiﬁca una tossina, che una volta espresso in cellule malate provoca la loro morte Uso di un gene che codiﬁca un pro-‐farmaco, una molecola biologicamente ina=va che, una volta introdoOa nelle cellule, subisce delle trasformazioni chimiche (ad opera di enzimi) che “maturano” il farmaco a=vo contro le cellule malate. Introduzione in cellule bersaglio di un gene che codiﬁca per un enzima (es. HSV-‐TK metabolizzante un farmaco (DME) Successivo traYamento con un pro-‐farmaco non tossico (es. Gangiclovir) che viene conver6to sele>vamente nella forma tossica (Gangiclovir-‐P) dal DME 1) INDIRETTA: Inibizione mirata dell’espressione genica Es:3 Strategia u6le per le patologie causate dalla presenza di mutazioni ad eﬀeYo dominante o dominante nega6vo Oligonucleo;di an;-‐senso, an;sense oligonucleo;des (ODN) o triplex forming oligonucleo;des (TFO) o ribozyme vectors vengono introdo= in cellule malate contenen; gene mutante per bloccarne l’espressione Post-‐transcrip8onal inhibi8on! Transcrip8onal inhibi8on! Es4: Ribozyme strategy Gene Delivery Come veicolare il DNA esogeno all'interno delle cellule Cos6tuiscono un impedimento al passaggio dal punto d’ingresso alla cellula bersaglio • 
• 
• 
barriera ematoencefalica il sistema immunitario ﬂuidi corporei ? Cos6tuiscono un impedimento al trasferimento all’interno della cellula • 
• 
• 
membrane citoplasma6che e nucleari lisosomi endonucleasi Gene Delivery ? Come veicolare il DNA esogeno all'interno delle cellule E’ necessario che il DNA raggiunga solo quelle cellule che richiedono un intervento terapeu6co. L’introduzione e l’espressione di un gene all’interno della cellula ospite avviene per mezzo di VETTORI (virali o non virali) Biologici Adenovirus Virus adenoassocia6 Retrovirus Len6virus VIRALI Chimici Plasmidi nudi Liposomi ca6onici Complessi di polilisina NON VIRALI Fisici
EleYroporazione Nucleofezione Microiniezione 4 2 e poco tossico 1 VETTORE IDEALE: E poi… • 
3 Tropismo di espressione: opportuna localizzazione del transgene sia a livello trasduzionale (il veOore infeOa cellule speciﬁche) che a livello trascrizionale (il gene viene espresso solo in alcune cellule). • 
Livello di espressione: possibilmente regolabile. • 
Eﬃcacia clinica: test funzionali su modelli animali. • 
Durata della trasduzione: per far sì che la terapia duri nel tempo Durata della Trasduzione La trasduzione puo’ essere: stabile o transiente 1.  Espressioni stabili sono preferibili per mala>e metaboliche. Richiede che il gene sia integrato nel genoma della cellula ospite 2.  Espressioni transien; sono preferibili per vaccini e tumori strumento u8le per valutare l’avvenuta trasduzione è il GENE REPORTER: •  codiﬁca per una proteina che non ha analoghi funzionali nella cellula trasfeYata •  è rivelato con sistemi semplici e sensibili •  non deve interferire con il normale metabolismo cellulare Durata della Trasduzione Gene Delivery: metodi ﬁsico-‐chimici Biologici Adenovirus Virus adenoassocia6 Retrovirus Len6virus VIRALI Chimici Plasmidi/LNA nudi Liposomi ca6onici Complessi di polilisina Fisici
EleYroporazione Nucleofezione Microiniezione NON VIRALI vantaggi: •  Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni •  Riduzione del rischio di reazione immunitaria •  Possibilità di trasferire 6pi diversi di molecole e di trasdurre molecole di DNA molto grandi •  Possibilità di produzione in grandi quan6tà a basso costo svantaggi: •  Scarsa eﬃcienza sia di trasduzione che di integrazione (eﬀe> non duraturi) •  Se integra6 possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale Molecole che possono entrare nelle cellule con vePori non virali: • 
• 
• 
• 
• 
Plasmidi DNA lineare a doppio ﬁlamento Oligonucleo;di DNA/RNA (es: LNA gapmers) Ribozimi Polipep;di Gene Delivery: metodi ﬁsici Bombardamento con micropar8celle The Biolis6c gene gun, developed by the Cornell group but recently acquired by Du Pont, accelerates par6cles in a manner similar to the way a standard gun propels a bullet. The device uses a small gunpowder charge and a macroscopic projec6le about the size of a .22-‐caliber bullet to accelerate DNA-‐laden tungsten par6cles. The par6cles are located on the front, ﬂat surface of the plas6c cartridge. When the gunpowder explodes, the “bullet” carrying the par6cles travels down a smooth, six-‐inch barrel and hits a plas6c stopping plate. On impact, the bullet fuses with the plate, but the small tungsten par6cles pass through to the target 6ssue via a hole in the center of the plate. Gene Delivery: metodi ﬁsici Microiniezione: consiste nell’iniezione di una miscela di DNA tramite una micro-‐pipeYa di vetro so>le posta su un micro-‐manipolatore. La tecnica è aYualmente impiegata per inserire DNA esogeno negli embrioni di animali (es. preparazione di topi transgenici). •  Il metodo è laborioso e lento, poichè si può inieYare • 
materiale in una sola cellula alla volta. L’uso di microinieYori computerizza6 ha ridoYo questo inconveniente. Problema di dimensioni: alcuni 6pi di cellule non sono suﬃcientemente grandi per essere micro-‐inieYate. EleProporazione: consiste nel soYoporre una cellula ad un campo eleYrico in modo tale da creare pori idroﬁli n el l a membrana cellulare. La scarica è operata in un piccolissimo contenitore che racchiude cellule e molecole di DNA in una sospensione liquida. Gene gun: permeYe di inviare nella cellula par6celle microscopiche d'oro o di tungsteno ricoperte di DNA Gene Delivery: metodi chimici necessità: 1.  ImpaccheOamento del DNA 2.  Ingresso nelle cellule 3.  Rilascio dalle vescicole lisosomiali 4.  Trasporto nel nucleo 5.  Espressione del gene Gene Delivery: metodi chimici In base alla carica, i lipidi possono essere anionici, ca;onici o neutri. Per i ca?onici l’acido nucleico si troverà sulla superﬁce, al contrario per gli anionici si troverà all’interno delle vescicole. Il trasferimento del gene avviene aYraverso meccanismo di fusione di membrane e rilasciato all’interno della cellula potrà raggiungere il nucleo Gene Delivery: metodi chimici Ca8onic lipids oﬀer posi6vely charged interfaces for eﬀec6ve complexa6on with DNA (lipoplex f o r m a 6 o n ) v i a e l e c t r o s t a 6 c interac6ons. At the same 6me, due to the m e m b r a n o u s n a t u r e o f t h e lipoplexes, they interact with nega6vely charged natural cell surfaces favourably and assist delivery of DNA inside the cells. The ca6onic liposomes also protect DNA from aYack by the DNases. Advances in gene delivery through molecular design of ca8onic lipids Santanu BhaPacharya and Avinash Bajaja Chem. Commun., 2009, 4632-‐4656 Various parameters aﬀec6ng: •  liposomes aggrega;on •  liposomes complexa;on with DNA •  liposomes applica;on toward gene delivery have been op6mized by diﬀerent research groups to increase eﬃciency and make the liposomes more compa6ble in the blood stream. However lipid architecture composi6on, lipid/DNA charge ra6os, diﬀerent cell types, ionic strength, and lipoplex structures need to be op6mized for the successful applica6on of gene delivery in clinical trials. Various systema6c modiﬁca;ons had been performed at the hydrophobic parts, linkage regions and the head groups to op6mize the DNA delivery to various mammalian cells. s y s t e m a 6 c m o d i ﬁ c a ; o n s ( g l y c o s i l a 6 o n ) c a n b e a l s o performed at the head groups as for targeted drug delivery via speciﬁc cellular receptors Gene Delivery: metodi biologici Biologici Adenovirus Virus adenoassocia6 Retrovirus Len6virus VIRALI Chimici Plasmidi nudi Liposomi ca6onici Complessi di polilisina NON VIRALI Fisici
EleYroporazione Nucleofezione Microiniezione I vettori virali
La semplice trasfezione potrebbe non essere sufficiente per trasferire materiale genetico nelle
cellule. Alcuni tipi cellulari sono particolarmente refrattari, rendendo l’efficienza di trasfezione
estremamente bassa. Per superare questo ostacolo si e’ pensato di sfruttare la proprieta’ dei
virus di trasdurre il proprio materiale genetico all’interno della cellula (infezione), capacita’ resa
efficientissima da milioni di anni di evoluzione.
Che cos’e’ un virus?
E’ un parassita che necessita di un ospite cellulare per potersi replicare. I virus sono
costituiti da:
•  un genoma (doppio o singolo filamento di DNA o RNA)
•  un capside, l’involucro che contiene il genoma e permette l’infezione della cellula
ospite.
I Virus si sono specializzati nel corso dell’evoluzione sviluppando
specifici meccanismi per trasferire in modo efficiente il proprio
genoma all’interno delle cellule ospiti.
In generale questi meccanismi comprendono:
• 
interazione con le cellule mediante legame ai recettori di membrana.
• 
internalizzazione per endocitosi recettore-mediata.
• 
fuoriuscita dall’endosoma e integrazione nel genoma ospite grazie a specifiche
sequenze (solo alcuni virus)
I vettori virali
vantaggi: •  Alta eﬃcienza di trasduzione (ﬁno al 100% delle cellule) svantaggi: •  Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presen6 nell’ospite •  Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) •  Molecole di DNA di dimensioni limitate •  Reazioni immunitarie •  Cos6 eleva6 Le particelle virali ricombinanti devono:
• 
essere difettive rispetto alla replicazione ovvero devono essere privati di
quei geni coinvolti nella replicazione e nell’assemblaggio del virione.
• 
non devono produrre composti tossici o attivare il sistema immunitario
dell’ospite.
• 
devono avere dimensioni sufficienti per inserire al suo interno il gene
terapeutico.
Virus can be categorized in groups according to their genomes There are at present ﬁve main classes of clinically applicable viral vector viral vector can be categorized in two groups according to whether their genomes: integrate into host cellular chroma6n persist in the cell nucleus as extrachromosomal EPISOMES This dis6nc6on is one important determinant of the suitability of each vector for par6cular applica6ons: integra;ng vectors are, at present, the tools of choice if stable gene6c altera6on needs to be maintained in dividing cells. Vettori Retrovirali e Lentivirali
Sono sta6 i primi virus ad essere studia6 nella terapia genica, di cui il capos6pite è il virus della leucemia murina che nell'uomo non è associato ad alcuna mala>a. Un retrovirus presenta due ﬁlamen6 di RNA complessa6 con varie proteine, un capside ed un involucro lipidico, derivato dalla cellula ospite infeYata. Esso si lega a speciﬁci receYori situa6 sulla membrana cellulare, il che innesca un meccanismo che porta alla fusione dell'involucro lipidico virale con quello della cellula. In questo modo il virus viene rilasciato nel citoplasma e successivamente l'RNA viene liberato dall'involucro capsidico e può così fungere da stampo per una DNA polimerasi RNA dipendente (la trascriPasi inversa) che sinte6zza, così, un ﬁlamento di DNA che, ad opera d'una integrasi virale, viene integrato nel genoma dell'ospite. Vettori Retrovirali e Lentivirali
ψ
gag pol LTR env LTR Circa 10 kb LTR: Long Terminal Repeats, con a>vita’ di promotori ψ: sequenza di incapsidamento
gag, pol, env: geni struOurali che producono faYori necessari per la retrotrascrizione del genoma (copiatura del RNA in DNA) e produzione delle proteine del capside. •  gag: codiﬁca per le proteine del core •  pol: codiﬁca per la trascriOasi inversa •  env: codiﬁca per le proteine dell’envelope Nei veYori retrovirali le sequenze dei geni struPurali (circa 8 kb) vengono sos6tuite con i geni di interesse. •  vePori retrovirali REPLICAZIONE COMPETENTI Sono virus integri nei geni che ne consentono la replicazione, ma vengono priva6 di sequenze indesiderabili (es src del RSV). •  vePori retrovirali REPLICAZIONE DEFICIENTI La maggior parte delle applicazioni dei veYori retrovirali richiedono che non vi sia replicazione del virus dopo l'infezione iniziale. Si possono sos6tuire parte o tuYe le sequenze codiﬁcan; del retrovirus con quelle che si desidera trasferire: in questo modo il veYore stesso è incapace di produrre le proteine necessarie alla propria replicazione: I geni virali gag, pol ed env sono sos;tui; con il cDNA del gene di interesse. Viene mantenuta la regione essenziale che comprende i due LTR e la sequenza di packaging (elemen6-‐cis). Il veYore che si o>ene NON è in grado di produrre le proteine virali necessarie per un altro ciclo di infezione (veYore dife>vo nella replicazione). LTR LTR ψ
ψ
gag pol env LTR Marker di selezione (es. neomicina o β-‐ Promotore galaYosidasi). virale o eucario6co NEO PROMOTER transgene LTR cDNA Le funzioni richieste per l'infezione iniziale del veYore sono generalmente fornite da una linea cellulare deYa "packaging", che consente la produzione di virus infeYante ma incapace di Produzione dei vettori in cellule packaging
Le proteine virali necessarie per l’infezione iniziale vengono fornite in trans da : 1) CELLULE DI PACKAGING (es: NIH3T3) 2) VIRUS HELPER La prima linea fu oYenuta trasfeYando permanentemente cellule NIH3T3 (ﬁbroblas; embrionici murini immortalizza6) con un retrovirus MLV privato di ψ. La linea cellulare oYenuta complementa costru> privi di gag, pol e env, ma i 6toli oYenu6 sono bassi e la frequenza di ricombinazione con produzione di revertan6 replicazione competen6 (RCR) è troppo elevata!!!!! Strategia “split genome” Per ridurre ulteriormente le possibilità di ricombinazione le proteine gag e pol sono state espresse su un plasmide diverso da quello esprimente env (), e non più soYo il controllo di LTR. Produzione dei vettori in cellule packaging
Gene X ψ
LTR gag/pol/env LTR Co-trasfezione
AmpR Ori AmpR Ori cellule packaging
Raccolta del virus
Particella retrovirale contenente il
Gene X (fiancheggiato dalle LTR)
e la trascrittasi inversa ma
incapace di replicazione
Infezione
cellule bersaglio
Vettori Retrovirali: limitazioni A limita6on to the usefulness of C-‐type retrovirus vectors is that they can only gain access to the cell nucleus if the nuclear membrane breaks down. Therefore they can only transduce dividing cells Recently, a nuclear localiza;on signal was engineered in the matrix protein of an avian C-‐type retrovirus — spleen necrosis virus (SNV) — to enable an SNV vector to transduce non-‐prolifera6ng cells. Lentivirus
Lentiviruses are members of the retrovirus family that have been derived
from human immunodeficiency virus (HIV) and other non-human
lentiviruses. Vectors that are based on HIV retain <5% of the parental
genome, and <25% of the genome is incorporated into packaging
constructs, which minimize the possibility of the generation of revertant
replication-competent.
Unlike C-type retroviruses, the lentiviral cDNA complexed with other viral
factors — known as the pre-integration complex (PIC) — is able to
translocate across the nuclear membrane and transduce non-dividing cells.
This characteris6c enables len6virus vectors to transduce haematopoie8c stem cells ex vivo without ﬁrst inducing them to proliferate with cytokine s6mula6on. Proven to be eﬀec6ve tools for gene delivery to the central nervous system (CNS), genera6ng long-‐term gene expression in the absence of inﬂamma6on. Lentivirus
Therapeu8c eﬃcacy has been shown in animal models of: •  mucopolysaccharidosis type VII •  metachroma6c leukodystrophy •  Parkinson disease La Terapia genica che si avvale dell'u6lizzo del len6virus, è stata u6lizzata per la prima volta nella cura del deﬁcit dell’enzima Adenosina deaminasi (ADA) •  Questo enzima interviene nel catabolismo delle Purine e catalizza la deaminazione di Adenosina e Desossiadenosina (in Inosina e Desossiinosina). •  L’accumulo di Adenosina, Deossiadenosina e desossi-‐ATP blocca i sistemi di sintesi, regolazione e riparo del DNA in par6colare dei linfoci; B e T che non riescono a duplicarsi allorché vengono s6mola6 durante le risposte immunitarie •  Mutazioni nel gene ADA causano immunodeﬁcienza (SCID, Severe Combined Immunodeﬁciency) SCID, Severe Combined Immunodeﬁciency Il deﬁcit dell’enzima adenosina deaminasi (ADA-‐SCID) fa parte del gruppo delle immunodeﬁcienze combinate gravi, di cui cos6tuisce il 20-‐30%, ed è causata da una serie di mutazioni trasmesse con modalità autosomica recessiva. In tali patologie il sistema immunitario è gravemente compromesso, al punto che l'organismo è incapace di difendersi da qualsiasi agente infe>vo. Si manifesta già nelle prime se>mane di vita con estrema susce=bilità a tu> i 6pi di infezioni, anche da parte dei baYeri e dei virus più innocui per sogge> sani. In assenza di traYamento, compaiono ben presto infezioni ricorren6, sopraYuYo alle vie respiratorie, che possono risultare letali per i bambini aﬀe> entro i primi anni di vita SCID, Severe Combined Immunodeﬁciency: le terapie 1) La migliore terapia consiste nel trapianto di midollo al ﬁne di restaurare il sistema immunitario del soggeYo (diﬃcoltà di reperire un donatore perfeYamente compa6bile). Sono sta6 anche tenta6 protocolli che u6lizzassero midollo di donatori semi-‐compa6bili (genitori). 2) In alterna6va si può fornire al bambino l'enzima ADA puriﬁcato, di origine bovina, coniugato con polie6lenglicole (terapia Peg-‐Ada), che blocca la degradazione dell'enzima dalle proteasi dell'organismo consentendo così un aumento della sua emivita. Tale terapia tende a normalizzare i parametri immunologici ed a diminuire i metaboli6 tossici ma non funziona con tu> gli individui. Oltre a quella bovina, si può anche u6lizzare ADA umana.. 3) Terapia genica 3) La Terapia genica nella cura della SCID •  estrazione dei linfoci6 T (ADA-‐) dal paziente •  crescita dei linfoci6 T in coltura e successiva infezione con retrovirus ricombinante ADA+ . •  Selezione delle cellule in cui ADA+ si è integrato nel genoma. •  Trasfusione delle cellule ADA+ n e l p a z i e n t e m a l a t o . L’espressione dei geni ADA introdo> sopperisce al deﬁcit della deaminasi. Il Protocollo: Prossime lezioni… We have u6lized induced pluripotent stem cell (iPSC) technology and genome edi;ng mediated by TALENs to generate isogenic subject-‐speciﬁc mutant and gene-‐corrected iPSC lines. While the subject-‐derived mutant iPSCs have the capacity to generate hematopoie6c precursors and myeloid cells, only wild-‐type and gene-‐corrected iPSCs can addi8onally generate mature NK cells and T cell precursors expressing the correctly spliced IL-‐2Rg. This study highlights the poten6al for the development of autologous cell therapy for SCID-‐X1 subjects. Vettori Adenovirali (Adenovirus)
La piu’ efficiente classe di vettori in termini di capacita’ di cargo che puo’ raggiungere le 35 kb
nei vettori di ultima generazione (GUTLESS).
• virus senza envelope, struYura icosaedrica regolare • genoma di 36 Kb cos6tuito da una molecola di DNAds • il genoma è ﬁancheggiato da sequenze ITR (Inverted Terminal Repeats) che servono come origine di replicazione • dopo l’infezione il virus entra nel nucleo della cellula ospite e viene replicato • non si integra nel genoma dell’ospite (resta episomale) • infeYa anche cellule non proliferan6 • dotato di ampio tropismo* * TROPISM: The range of cell types or 6ssues in which a virus can sustain a produc6ve infec6on. Vettori Adenovirali (Adenovirus)
Genoma virale complesso contenente vari geni Early (E) e Late (L) per l’infezione: E1a: coinvolto nell’a>vazione della trascrizione e nella promozione dell’entrata della cellula ospite in fase S (lega Rb -‐ proteina del re6noblastoma che induce la produzione di proteine necessarie alla progressione da G1 a S) E1b: blocca l’azione di p53 arrestando l’entrata della cellula in apoptosi E2: codiﬁca per 3 proteine coinvolte nella replicazione del DNA e nella modulazione della trascrizione (DNA-‐pol; proteina Terminale e DNA-‐binding protein) E3: modula la risposta immunitaria E4: regola la trascrizione, la transizione dell’espressione da early a late gene, la replicazione virale e l’assemblaggio dei virioni L1-‐5: coinvol6 nella produzione e nell’assemblaggio delle proteine del capside Vettori Adenovirali (Adenovirus)
Adenovirus vectors have been extensively engineered to reduce their potent immunogenicity. •  First-‐genera6on adenovirus vectors were deleted for only one or two viral EARLY GENES (E1 and E3). Cells that were transduced with these vectors expressed other adenoviral genes at low levels, inducing strong cytotoxic T-‐cell responses that rapidly eliminated transgene expression. •  Second-‐ and third-‐genera6on vectors that contain addi8onal dele8ons in other early genes (E2 and/or E4) have shown reduced toxicity in animal models The development of helper-‐dependent adenoviruses that are deleted for all viral genes has been the most important advance to decrease immunogenicity VeYori adenovirali helper-‐dipenden6 di III generazione o GUTLESS: sono veYori ad alta capacità. Le uniche sequenze essenziali in cis sono le ITRs e la sequenza ψ. TUTTE le proteine adenovirali p o s s o n o e s s e r e complementate in trans, quindi quasi tuYa la sequenza c o d i ﬁ c a n t e p u ò e s s e r e sos6tuita dal transgene che può avere dimensioni ﬁno alle 36 Kb. Vettori Adenovirali: GUTLESS
3. 1. PRODUZIONE DI VETTORI GUTLESS 1. VeYore virale: con6ene solo sequenze ITRs e ψ + la casseYa di espressione del trangene 2. Cellule di packaging (293): esprimono E1 3. Virus Helper: E1-‐deleto, privo di sequenza ψ. Fornisce gli elemen6 struOurali 2. Oggi, l’adenovirus GUTLESS viene somministrato in diversi organi, come il muscolo , il fegato, o il sistema nervoso centrale raggiungendo una espressione del transgene ad alto livello e a lungo termine in roditori e prima6. (AMD) Age-‐related macular degenera8on E’ una patologia mul6faYoriale che colpisce la zona piu’ centrale e sensibile della re6na, deYa macula, quella più ricca di cellule nervose deputate alla visione. Una delle cause di cecità più comuni nelle persone di età superiore ai 50 anni caraYerizzata da una angiogenesi estesa soYo la macula. VeYori adenovirali che esprimono il faYore an6-‐angiogenico PEDF (pigment epithelium-‐derived factor) sono sta6 inocula6 localmente in 28 pazien6 (fase I): ben tollerato. PRODUZIONE DI VETTORI VIRALI
Diversi fattori determinano l’efficienza di produzione di un vettore virale:
1.  La natura del vettore
2.  La linea cellulare di packaging: modificazioni del ciclo cellulare al fine di
favorire le fasi di replicazione virale e inibizione dell apoptosi (es. alcuni virus,
quali SV40 e Epstein-Barr hanno evoluto sistemi anti-apoptotici)
3.  Le condizioni di coltura:
•  temperatura di crescita
•  concentrazione del siero
•  tempo di infezione
•  confluenza cellulare al momento dell’ infezione
Es. retrovirus: emivita aumentata di 4 volte e titolo virale aumentato di 5-10 volte
portando la temperatura di crescita da 37° C a 32° C.
Es. PRODUZIONE DI VETTORI ADENOVIRALI
1)  Vettore adenovirale:
• 
• 
• 
2)  Cellule di packaging:
vettore commerciale deleto in E1 e E3
gene di interesse posto sotto il controllo di un
promotore forte (es. CMV)
sequenze necessarie per il packaging (ITRs,
sequenza ψ, late gene)
linea cellulare 293A (cellule embrionali renali
umane), che contiene una copia dei geni E1
integrata stabilmente (complementazione in
trans)
1.  INSERZIONE DEL TRANSGENE NEL VETTORE
Clonaggio del DNA di interesse
mediante taglio enzimatico del vettore,
dell inserto (estremità coesive) e
successiva ligazione
2.  TRASFEZIONE DELLA LINEA 293A CON IL VETTORE
1. The day before transfection, trypsinize and count the 293A cells, plating
them at 5 x 105 cells per well in a 6-well plate. Plate cells in 2 ml of normal
growth medium containing serum.
2. On the day of transfection, remove the culture medium from the 293A
cells and replace with 1.5 ml of normal growth medium containing serum. Do
not include antibiotics.
3. Prepare DNA-Lipofectamine complexes for each transfection sample.
4. Add the DNA-Lipofectamine complexes dropwise to each well. Mix gently
by rocking the plate back and forth. Incubate the cells overnight at 37°C in a
CO2 incubator.
5. The next day, remove the medium containing the DNA-Lipofectamine
complexes and replace with complete culture medium (i.e. D-MEM
containing 10% FBS, 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin/streptomycin).
2.  TRASFEZIONE DELLA LINEA 293A CON IL VETTORE
6. 48 hours post-transfection, trypsinize cells and transfer the contents
of each well to a sterile 10 cm tissue culture plate containing 10 ml of
complete culture medium.
Caution: Remember that you are working with infectious virus at this
stage and in all subsequent procedures.
7. Replace culture medium with fresh, complete culture medium every
2-3 days until visible regions of cytopathic effect (CPE) are observed
(typically 7-10 days post-transfection).
8. Replenish culture medium and allow infections to proceed until
approximately 80% CPE is observed (typically 10-13 days posttransfection).
9. Harvest adenovirus-containing cells by squirting cells off the plate
with a 10 ml tissue culture pipette. Transfer cells and media to a sterile,
15 ml, capped tube. Proceed to Preparing a Crude Viral Lysate.
Valutazione dell’effetto citopatico
Day 4-6 post-transfection
At this early stage, cells producing adenovirus first
appear as patches of rounding, dying cells.
Day 6-8 post-transfection
As the infection proceeds, cells containing viral
particles lyse and infect neighboring cells. A plaque
begins to form.
Day 8-10 post-transfection
At this late stage, infected neighboring cells lyse,
forming a plaque that is clearly visible.
3.  PREPARAZIONE DEL LISATO VIRALE
After you have harvested adenovirus-containing cells and media, you will use
several freeze/thaw cycles followed by centrifugation to prepare a crude viral
lysate. The freeze/thaw cycles cause the cells to lyse and allow release of
intracellular viral particles.
1. Place the tube containing harvested cells and media from Transfection
Procedure, Step 9, page 11 at -80°C for 30 minutes. Remove tube and place in
a 37°C water bath for 15 minutes to thaw. Repeat the freezing and thawing steps
twice.
Note: Do not incubate samples at 37°C for longer than 15 minutes.
2. Centrifuge the cell lysate in a table-top centrifuge at 3000 rpm for 15 minutes
at room temperature to pellet the cell debris.
3. Transfer the supernatant containing viral particles to cryovials in 1 ml aliquots.
Store the viral stocks at -80°C.
3.  PREPARAZIONE DEL LISATO VIRALE
Once you have prepared a crude viral stock, you may:
• Amplify the viral stock by infecting 293A cells (see the next section for
details). This procedure is recommended to obtain the highest viral titers and
optimal results in your transduction studies.
• Determine the titer
• Use this viral stock to transduce your mammalian cells of interest to verify the
functionality of your adenoviral construct in preliminary expression experiments.
4.  AMPLIFICAZIONE DELLO STOCK DI VETTORI ADENOVIRALI
The day before infection, trypsinize and count the 293A cells, plating them at 3 x 10 6 cells per 10 cm
plate. Plate cells in 10 ml of normal growth medium containing serum.
2. On the day of infection, verify that the cells are at 80-90% confluency before proceeding. Add the
desire amount of crude adenoviral stock to the cells.
3. Incubate the cells at 37°C in a CO2 incubator and allow infection to proceed until 80-90% of the cells
have rounded up and are floating or lightly attached to the tissue culture dish (typically 2-3 days postinfection). This indicates that cells are loaded with adenoviral particles.
4. Harvest adenovirus-containing cells by squirting cells off the plate with a 10 ml tissue culture pipette.
Transfer cells and media to a sterile, 15 ml, capped tube.
5. Place the tube containing harvested cells and at -80°C for 30 minutes. Remove tube and place in a
37°C water bath for 15 minutes to thaw. Repeat the freezing and thawing steps twice.
6. Centrifuge the cell lysate in a table-top centrifuge at 3000 rpm for 15 minutes at room temperature to
pellet the cell debris.
7. Transfer the supernatant containing viral particles to cryovials in 1 ml aliquots. Store the viral stocks
at -80°C. Proceed to Titering Your Adenoviral Stock
5.  TITOLAZIONE DELLO STOCK DI VETTORI ADENOVIRALI
Before proceeding to transduce the mammalian cell line of interest
To determine the titer of an adenoviral stock, you will:
1. 
Plate 293A cells in 6-well tissue culture plates.
3. 
Prepare 10-fold serial dilutions of your adenoviral stock.
5. 
Infect 293A cells overnight with serial dilutions of adenoviral stock.
7. 
Perform a plaque assay by overlaying the infected 293A cells with an agarose/plaquing media solution.
Allow 8-12 days for plaques to form.
5. Stain and count the number of plaques in each dilution
5.  TITOLAZIONE DELLO STOCK DI VETTORI ADENOVIRALI
Plaque assay
Serial dilutions of virus have been plated on confluent monolayer cultures of cells. The cells are stained after a
period of time in which a single virus infects a cell, produces new virus particles and infects surrounding cells.
The white areas show areas of the culture in which the cells have been killed. Each "plaque" is the result of the
presence of one original infectious virus particle.
10-4!
!
10-5!
!
10-6!
!
10-4 dilution: confluent; undeterminable
10-5 dilution: 59
10-6 dilution: 4.5
Quindi il ;tolo di questo stock virale è 5,2 x 106 PFU/ml (i.e. average of 59 x 105 and 4.5 x 106). Vettori Virali Adeno-Associati (AAV)
•  virus a DNA a singolo ﬁlamento (con polarità + o –) •  capside icosaedrico •  no envelope •  genoma ﬁancheggiato da sequenze ITRs, che contengono la sequenza di packaging rep cap ITR ITR ψ
Circa 5 kb ITR: Inverted terminal repeats.
ψ: sequenza di incapsidazione
rep: gene codificante per proteine della replicazione virale
cap: gene codificante per proteine del capside
solo due 6pi di geni Vettori Virali Adeno-Associati (AAV)
I virus AAV non sono in grado di replicarsi in modo autonomo, ma
necessitano di un adenovirus o di un herpes simplex virus (virus helper)
•  Il virus AAV wild-type e’ in grado di integrarsi in modo sito specifico nel
genoma ospite, in una regione del cromosoma 19. Questa integrazione
sembra non comportare conseguenze nella cellula bersaglio (ad esempio,
interferenza con geni dell’ospite o attivazione di oncogeni).
•  Uno svantaggio nell’uso di vettori AAV e’ legato alla bassa capacita’ di
cargo, intorno alle 4 kb, che ne limita l’utilizzo a geni di piccole dimensioni
•  Tuttavia, la bassa immunogenicita’ e la persistenza per anni nelle cellule ospiti
senza integrazione rendono gli AAV strumenti molto promettenti nella terapia
genica.
• Il veYore: è costruito sos6tuendo il transgene a cap e rep, in quanto le sequenze ITRs contengono tuPe le informazioni necessarie per l’integrazione e per il packaging. rep cap ITR ITR ψ
promoter cDNA pA ITR ITR ψ
• Le cellule di packaging: linea cellulare 293 (cellule embrionali umane) trasfeYata con un plasmide contenente i geni cap e rep e successivamente infeYata con un adenovirus helper dife>vo per E1 e privo della sequenza ψ. Vettori Virali Adeno-Associati (AAV)
Vantaggi • Non sono patogeni per l’uomo • Sono stabili • Vengono oYenu6 con al; 6toli • Alta eﬃcienza di trasferimento genico • Ampio troﬁsmo • InfeYano sia cellule in divisione che non • Integrazione del transgene Svantaggi • Dimensioni ridoYe del transgene (4.7 Kb) • VeYore ricombinante non ha integrazione sito speciﬁca e talvolta resta episomale Applicazioni •  Malame della re8na (Amaurosi Congenita): il 10% e’ dovuto a dife> nel gene RPE65 (uno dei 120 individua6) trials in fase I/II con AAVII •  Fibrosi cis8ca: trials con AAVII nessun successo •  Deﬁcienza da α-‐1 an8-‐tripsina: proteina secreta nel plasma con molteplice funzioni come an6-‐proteasico, an6 inﬁammatorio e an6-‐apopto6co. Fase I con AAV2 e poi AAV1. •  Parkinson: perdita delle cellule che producono dopamina nella substan;a nigra. Fase II usando acido glutammico decarbossilasi GAD nel nucleo subtalamico e rendendolo da sistema eccitatorio a inibitorio L’ AMAUROSI congenita di Leber L’Amaurosi congenita di Leber è una mala>a gene;ca che colpisce la re6na, provocando cecità o grave danneggiamento della vista ﬁn dalla infanzia (in genere l’esordio è nei primi sei mesi di vita). È la causa più frequente di cecità infan6le ereditaria, con un'incidenza di 3 casi ogni 100.000 na6 vivi. Oltre alla marcata ipovisione, un altro sintomo 6pico è il nistagmo, cioè il movimento con6nuo e incontrollato degli occhi. Diagram of the adeno-‐associated virus showing the proteins that decorate its coat. Berkeley researchers changed 10 amino acids in one of the coat proteins (orange) to get it to pass through re;nal cells to the target photoreceptors. La terapia prevede la somministrazione del gene terapeu6co tramite un veYore v i r a l e i n o c u l a t o d i r e Y a m e n t e nell’occhio dei pazien6. La FIBROSI CISTICA E’ un disordine ereditario causato da una mutazione nel gene regolatore della conduYanza trasmembrana (CFTR). CaraYerizzata da un trasporto anormale di Cloro e Sodio aYraverso l’epitelio che determina la produzione di secrezioni mucose spesse. Il gene CFTR codiﬁca per una proteina canale del cloro localizzata a livello apicale della membrana delle cellule epiteliali. VeYori adenovirali umani E1-‐replicazione-‐deﬁcien6 che esprimono il gene CFTR. O>mi risulta6 o Y e n u 6 i n a n i m a l i (espressione per almeno 6 se>mane), scarsi risulta; nell’uomo (espressione per 2-‐4 se>mane). Possibili spiegazioni: •  muco presente nel traYo respiratorio ostacola l’infezione virale •  il receYore riconosciuto dall’adenovirus si trova sulla membrana basolaterale delle cellule epiteliali •  alta immunogenicità •  la terapia prevede una somministrazione reiterata del veYore (1-‐2 volte al mese). VETTORI Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)
Grazie alla loro naturale capacità di stabilire infezioni laten6 nei neuroni, vengono u6lizza6 per il trasporto di geni nel CNS. L’espressione a lungo termine del transgene viene oYenuta u6lizzando dei promotori neurone speciﬁci, a>va6 durante il periodo di latenza. Possono trasportare geni di grosse dimensioni (152Kb)!!!! VETTORI Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)
Esistono due 6pi di veYori HSV-‐1: 1.  Disabled HSV vectors 2.  Amplicon HSV vectors 1.  DISABLED HSV VECTORS
The glycoproteins H and L (gH and gL) of herpes simplex virus type 1 are essen;al for the cell-‐
to-‐cell spread of virions and for the penetra;on of virions into cells. I replica6on disabled vectors sono prodo> eliminando il gene che codiﬁca per la glicoproteina-‐H di HSV-‐1 e cresciu6 in una linea cellulare che complementa questa proteina. I virus oYenu6 sono infe>vi, ma possono eﬀeYuare un solo ciclo di infezione. The resul6ng progeny are gH nega6ve and noninfec6ous: the virus is self-‐limi8ng! Produc6on of vaccines 2.  AMPLICON HSV VECTORS
Si usa un amplicone, un plasmide contenente:
• 
un’origine di replicazione batterica (generalmente da Escherichia coli)
• 
un origine di replicazione di HSV-1 (OriS)
• 
la sequenza di packaging di HSV-1
• 
il transgene
Il tutto viene inserito in una
linea cellulare infettata da un
virus helper contenente i geni
regolatori e strutturali mancanti.
2.  AMPLICON HSV VECTORS
Infec6on of neurons with HSV amplicon vector encoding GFP. A Sensory neurons in dissociated cultures of adult mouse. B cerebellar cortex of adult mice VIRUS ONCOLITICI: TRATTAMENTO DEL CANCRO
1)  TUMORE-‐SELETTIVITA’ INTRINSECA: Si u6lizzano dei virus che sele>vamente lisano cellule tumorali. Es: Newcastle-‐disease virus (NDV) Virus della stoma6te vescicolare (VSV) Virus a RNA sensibili all’interferone → non si riproducono nelle cellule normali. VIRUS ONCOLITICI: TRATTAMENTO DEL CANCRO
2) ATTENUAZIONE DEI VIRUS WT Vengono dele6 alcuni geni virali essenziali per la replicazione, che sono poi complementa6 in trans solo nelle cellule tumorali → la replicazione è ristreYa alle cellule tumorali Es: HSV privo del gene che codiﬁca per la 8midino chinasi e/o ribonucleo6de riduYasi. Ques6 enzimi non vengono espressi nelle cellule quiescen6, ma vengono up-‐regola6 in fase G1 e S (generano i dNTPs necessari per la sintesi del DNA) → virus replica solo nelle cellule in elevata proliferazione (tumorali). p53: Structure, Function and Therapeutic Applications
Human p53 is a nuclear phosphoprotein of MW 53 kDa, encoded by a 20-‐Kb gene containing 11 exons and 10 introns [16], which is located on the small arm of chromosome 17. By the early 1990s, data from the ﬁrst p53 knockout mice provided inarguable evidence in support of the potent tumor suppressor ac6on of wt p53. As a tumor suppressor, p53 is essen6al for preven;ng inappropriate cell prolifera6on and maintaining genome integrity following genotoxic stress. Following various intracellular and extracellular s6muli, such as DNA damage (by means including ionizing radia6on, UV radia6on, applica6on of cytotoxic drugs or chemotherapeu6c agents, and infec6ous virus), heat shock, hypoxia, and oncogene over-‐
expression, wt p53 is ac8vated a n d e m e r g e s a s a p i v o t a l regulatory protein which triggers diverse biological responses, both at the level of a single cell as well as in the whole organism. Under normal circumstances, wt p53 is maintained at very low concentra6ons within the cells and exists mainly in an inac6ve latent form. The regula6on of p53 level and ac6vity involves a complex network of a mul6tude of cellular proteins. MDM2 inhibits p53 ac;vity by blocking its transcrip;onal ac;vity, favoring its nuclear export and s;mula;ng its degrada;on. In normally growing cells, the half-‐life of p53 is limited to minutes, whereas cellular stress or exposure to DNA-‐ damaging agents prolongs it to hours. Diversi studi hanno dimostrato che, u6lizzando veYori virali (retrovirus e adenovirus), l’introduzione di p53 wt mediante il rilascio virus mediato, sopprime la crescita di linee tumorali umane sia in sistemi in vivo che in vitro VIRUS ONCOLITICI: TRATTAMENTO DEL CANCRO
2) ATTENUAZIONE DEI VIRUS WT Es. -‐  AV privo del gene che codiﬁca per E1b-‐55K: Onyx-‐015 (primo AV replicazione-‐sele>vo entrato in trials clinici). La proteina E1b 55-‐kDa protein, lega p53 e la degrada. In seguito all’infezione con il virus aYenuato, p53 viene stabilizzata portando ad arresto del ciclo cellulare (nelle cellule normali). In cellule tumorali dife>ve in p53 il virus con6nua a replicare portando alla lisi cellulare. Trials clinici in fase I e II per il traYamento del carcinoma delle cellule squamose della testa e del collo (SCCHN). Onyx-‐015 inieYato intratumoralmente: Eﬀe> collaterali: sintomi inﬂuenzali. 20% dei pazien6 posi6vi alla replicazione virale, 14% mostrano beneﬁci Onyx-‐015 inieYato intratumoralmente + chemioterapia: 27% dei pazien6 mostrano completa eliminazione della massa tumorale; 36% dei pazien6 mostra riduzione del 50% del volume della massa tumorale. In nessuno dei pazien6 che aveva mostrato risposta è ricomparso il tumore dopo 6 mesi, mentre in tu= i pazien; soOopos; alla sola chemioterapia si è osservata ricomparsa della massa tumorale VIRUS ONCOLITICI: TRATTAMENTO DEL CANCRO
3) TRASCRIPTIONAL TARGETING I geni virali essenziali per la replicazione vengono pos6 soYo il controllo di promotori e/o enhancers cellulo-‐speciﬁci Es. -‐AV replicazione-‐competen6 in cui E1A e E1B sono pos6 soYo il controllo di promotori prostata-‐speciﬁci (es. promotore per il PSA, an6gene prostata-‐speciﬁco, e/o per la probasina) sono usa6 per il traYamento del carcinoma prosta6co. -‐HSV con early genes pos6 soYo il controllo del promotore dell’albumina usa6 per il traYamento del carcinoma del fegato. VIRUS ONCOLITICI:
TRATTAMENTO DEL CANCRO
4) CELLULAR TARGETING Modiﬁcazione del troﬁsmo virale mediante ingegnerizzazione delle proteine del coat. Es. -‐HSV-‐1 modiﬁca6: eliminazione delle glicoproteine B e C di superﬁcie e inserimento dell’interleuchina 13 → virus che infeYano sele>vamente cellule che esprimono il receYore α2 dell interleuchina 13 (IL-‐13), come le cellule tumorali cerebrali. VIRUS ONCOLITICI: TRATTAMENTO DEL CANCRO VIRUS-DIRECTED ENZYME PRODRUG THERAPY (VDEPT)
o TERAPIA DEL GENE SUICIDA: TRATTAMENTO DEL CANCRO
Si basa sulla somministrazione di un agente chemioterapico in forma di pro-farmaco
(non tossico), combinata con l espressione cellula-tumorale specifica dell’enzima
capace di convertirlo nella forma tossica. L enzima viene veicolato mediante un
vettore virale.
N.B. la forma attiva dell agente chemioterapico deve avere una tossicità elevata, per ottenere un
EFFETTO BYSTANDER, e un emivita breve, per minimizzare la tossicità sistemica.
VIRUS-DIRECTED ENZYME PRODRUG THERAPY (VDEPT)
o TERAPIA DEL GENE SUICIDA: TRATTAMENTO DEL CANCRO
Es.
1) SISTEMA TIMIDINO CHINASI-GANCICLOVIR:
vettore retrovirale che esprime l enzima timidino chinasi di HSV somministrato
in situ in tumori cerebrali.
2) SISTEMA CITOSINA DEAMINASI-5-FLUOROCITOSINA
sperimentazione in corso per il trattamento del tumore al seno.
3) SISTEMA NITROTIROSINA-CB1954
3) SISTEMA NITROTIROSINA-CB1954 (5-(aziridin-1-yl)-2,4-dinitrobenzamide)
CB1954 viene convertito da una forma alchilica monofunzionale debolmente tossica ad una forma
alchilica bifunzionale molto tossica, per azione dell’enzima NITROREDUTTASI codificata dal gene
nfsB di Escherichia coli B.
Vettore adenovirale umano (sierotipo 5) replicazione deficiente (deleto in E1 e E3) che contiene il
gene nfsB sotto il controllo di un promotore specifico.
Vantaggi:
- la forma attiva di CB1954 diffonde attraverso la membrana sanza bisogno di gap junction →
maggiore effetto bystander;
- indipendenza dal ciclo cellulare;
- CB1954 può essere attivato solo all interno della cellula (necessita di un cofattore)
→ rischio ridotto di tossicità.
Situazione aPuale e prospemve future PROGRESS AND PROBLEMS WITH THE USE OF VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY Clare E. Thomas, Anja Ehrhardt and Mark A. Kay Nature reviews. Gene6cs 2003 Vol: 4(5):346-‐358. DOI: 10.1038/nrg1066