SNOM - Siapec

Università degli studi
di Trieste
L’utilizzo della microscopia a sonda in
ambito biomedico: dallo studio cellulare a
quello tissutale.
5 marzo 2010
Michele Carraro e Cristina Zennaro
Università degli Studi di Trieste
1986 Binnig e Rohrer vincono il Premio Nobel per la Fisica per
l’invenzione del microscopio Tunnel a Scansione (STM,
1981)
1986 Binnig inventa il microscopio a Scansione a Forza
Atomica (AFM)
1991 Betzig e coll. introducono l’uso delle fibre ottiche come
sonda nella microscopia a campo prossimo (SNOM)
I diversi limiti di risoluzione
delle Microscopie
ANIMALS
1m
ANIMAL CELLS
10 -3 m
MAGNIFICATIONS
OPTICAL
MICROSCOPY
SEM
TEM
SPM
SNOM
AFM
STM
PROTEINS
1 m
1 mm
10 0 m
VIRUS
1 nm
10 -6 m
40x
400x
10 -9 m
4.000x
40.000x
400.000x
ATOMS
1Å
10 -12 m
Peculiarità delle microscopia a sonda
• Con la microscopia a sonda si ottengono immagini
con una risoluzione migliore di quella raggiungibile
con i microscopi tradizionali;
• Non è necessario un pre-trattamento pesante per i
campioni (sostanze fluorescenti, metallizzazione);
• Permette misure in aria, gas o liquido e non necessita
di ambiente controllato (come il vuoto).
SPM: Principio di funzionamento
• Una sonda viene mossa sulla superificie di
un campione misurando, punto per punto
una determinata quantità fisica dovuta
all’interazione fra sonda e campione (ad es
forze interatomiche o la corrente emessa
• Un sistema a feedback controlla la distanza
fra punta e campione
• Un sistema computerizzato , utilizzando le
informazioni derivate dall’interazione
sonda e campione crea una mappa
tridimensionale del campione stesso
• Diversamente dalla microscopia
tradizionale (che fornisce un’immagine di
un piano del campione -2D) i microscopi a
sonda acquisiscono una misura puntiforme
ben localizzata nello spazio permettendo
una ricostruzione 3D del campione
Microscopia a Sonda (SPM)
Sistema per misurare la posizione
verticale della sonda
Sistema di feedback per
controllare la posizione
verticale della sonda
Uno scanner
piezoelettrico
per muovere il
campione
facendogli
eseguire una
scansione
Sonda
(sente
una
interazione
con
il
campione)
Un sistema computerizzato che guida lo
scanner, misura i dati e li converte in
immagini
Scanning Probe Microscopes
Gli Scanning Probe Microscopy (SPM) sono gli strumenti base
per le nanotecnologie
Tre classi di strumenti SPM:
STM (Scanning Tunneling Microscope): misura
la corrente di tunneling che si forma fra la sonda
metallica ed il campione: il suo impiego è
limitato a misure su campioni conduttori. Ha
utilizzo limitato su campioni biologici
A100-AFM
pA-STM
AFM (Atomic Force Microscope)
SNOM (Scanning Near-field Optical
Microscope)
TriA-SNOM
By A.P.E. Research
AFM-Microscopio a Forza Atomica
• Microscopio a Forza Atomica misura la forza d’interazione
tra sonda e campione, ricreando la topografia della
superficie del campione.
• La sua risoluzione è di circa 0.1 nm
• Permette di ottenere non solo immagini topografiche ma
anche di misurare quantitativamente questa forza di
interazione.
Punta AFM interazione Ag-Ab
Punta AFM vista al SEM
AFM-Microscopio a Forza Atomica
AFM – la punta e il supporto elastico
Materiale del supporto: silicio,
o stesso materiale della punta.
Materiali maggiormente
utilizzati per la realizzazione
della punta sono:
■Nitruro di silicio (Si3N4)
■ Diamante
Lunghezza del supporto: 100 ~
400 m
Lunghezza della punta: 2 ~ 10
m
Principio di funzionamento di SNOM
• La sonda è una fibra ottica
• Acquisisce un’immagine topografica simil AFM
• Grazie all’uso della fibra ottica è un microscopio ottico la cui
capacità di risoluzione va oltre il limite della diffrazione della
luce (limite di Abbe l/2), che è il limite della microscopia
ottica tradizionale, poiché sfrutta la componente di near-field
della luce riuscendo così a superare il limite di Abbe
• Le immagine ottiche possono essere acquisite in tre differenti
modalità: riflessione, trasmissione e retroriflessione
• La topografia e le immagini ottiche vengono acquisiste
simultaneamente
SNOM Microscopio a scansione in
Campo Prossimo
a
.
b.
Lo SNOM permette di acquisire
due differenti e simultanei
segnali ottici
contemporaneamente alla
topografia del campione: luce
riflessa (riflessione), luce
trasmessa (trasmissione) e
topografia.
La punta è una fibra ottica “metallizzata” con, all’estremità, un’apertura di d <<λ:
la metalizzazione è essenziale per creare una “sub-wavelength aperture”.
Risoluzione ottica 50-100 nm
ASPETTI DI APPLICAZIONE
SULLO STUDIO CELLULARE:
AFM
Ottica di visione montata sul microscopio AFM
per il posizionamento della sonda AFM (cantilever) e la scelta
della zona di scansione
0,00m
0,98m
0,00m
0,75m
Line Profile 1
0,00m
0,98m
0,00m
0,75m
ASPETTI DI APPLICAZIONE
SULLO STUDIO CELLULARE:
SNOM
PODOCITI marcati con falloidina
Topografia
Trasmissione
AREA DI SCANSIONE
PRECEDENTE
BLEACHING
Topografia
PODOCITI
marcati con falloidina
Riflessione
Trasmissione
PODOCITI marcati con falloidina
Topografia
Microscopio a fluorescenza
Vetrino montato
Trasmissione
ASPETTI DI APPLICAZIONE
SULLO STUDIO DEL
GLOMERULO RENALE:
AFM/SNOM
AFM – Conventional Optical Microscope
16.8 x 16.8 m2
Z-range 127 nm
Conventional
Optical Microscopy
10 x 10 m2
Z-range 173 nm
SNOM study of glomerular filtration barrier
SNOM
Optical
Transmission
Images
SNOM
Topography
10 µm
10 µm
Bengt Rippe: Nephrol Dial Transplant (2004) 19: 1–5
Hjalmarsson C et al. Microvascular Research 2004
SNOM
Topography
SNOM
Optical Reflection
SNOM
Optical Transmission
40 µm
SNOM Images of ultra thin sections (thickness
100nm) of renal glomerulus.
Conventional
Optical
Micorscopy
LO SVILUPPO DELLA MICROSCOPIA A SONDA
QUALE NUOVA TECNOLOGIA IN CAMPO
BIOMEDICO. Fondi Progetto Regionale Friuli Venezia Giulia 2005. ”Per la concessione di
contributi per la realizzazione di progetti di ricerca scientifica e applicata e di iniziative di trasferimento e di
diffusione dei risultati della ricerca”
Università degli studi
di Trieste
Dipartimento Universitario
Clinico di Biomedicina
UNITA’ CLINICA OPERATIVA
DI CLINICA
ODONTOSTOMATOLOGICA
Dipartimento di
Fisiologia e Patologia
Dipartimento Clinico
Universitario di Scienze
Biomediche, Tecnologiche e
Traslazionali
Sez. Immunologia
DIPARTIMENTO DI
INGEGNERIA
ELETTROTECNICA,
ELETTRONICA E
INFORMATICA
DIPARTIMENTO DI
INGEGNERIA
MECCANICA
In particolare ringraziamo
Dipartimento Universitario Clinico di Biomedicina
Prof.ssa Marina Zweyer
Dott.ssa Elisa Trevisan
Ape Research S.r.l AREA SCIENCE PARK
Dott.ssa Barbara Troian
Dott. Stefano Prato
Consorzio per l’AREA di ricerca AREA SCIENCE PARK
Dott.ssa Laura Ramacci
….. ..
e tutti voi per l’attenzione