SNOM - Siapec
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Università degli studi di Trieste L’utilizzo della microscopia a sonda in ambito biomedico: dallo studio cellulare a quello tissutale. 5 marzo 2010 Michele Carraro e Cristina Zennaro Università degli Studi di Trieste 1986 Binnig e Rohrer vincono il Premio Nobel per la Fisica per l’invenzione del microscopio Tunnel a Scansione (STM, 1981) 1986 Binnig inventa il microscopio a Scansione a Forza Atomica (AFM) 1991 Betzig e coll. introducono l’uso delle fibre ottiche come sonda nella microscopia a campo prossimo (SNOM) I diversi limiti di risoluzione delle Microscopie ANIMALS 1m ANIMAL CELLS 10 -3 m MAGNIFICATIONS OPTICAL MICROSCOPY SEM TEM SPM SNOM AFM STM PROTEINS 1 m 1 mm 10 0 m VIRUS 1 nm 10 -6 m 40x 400x 10 -9 m 4.000x 40.000x 400.000x ATOMS 1Å 10 -12 m Peculiarità delle microscopia a sonda • Con la microscopia a sonda si ottengono immagini con una risoluzione migliore di quella raggiungibile con i microscopi tradizionali; • Non è necessario un pre-trattamento pesante per i campioni (sostanze fluorescenti, metallizzazione); • Permette misure in aria, gas o liquido e non necessita di ambiente controllato (come il vuoto). SPM: Principio di funzionamento • Una sonda viene mossa sulla superificie di un campione misurando, punto per punto una determinata quantità fisica dovuta all’interazione fra sonda e campione (ad es forze interatomiche o la corrente emessa • Un sistema a feedback controlla la distanza fra punta e campione • Un sistema computerizzato , utilizzando le informazioni derivate dall’interazione sonda e campione crea una mappa tridimensionale del campione stesso • Diversamente dalla microscopia tradizionale (che fornisce un’immagine di un piano del campione -2D) i microscopi a sonda acquisiscono una misura puntiforme ben localizzata nello spazio permettendo una ricostruzione 3D del campione Microscopia a Sonda (SPM) Sistema per misurare la posizione verticale della sonda Sistema di feedback per controllare la posizione verticale della sonda Uno scanner piezoelettrico per muovere il campione facendogli eseguire una scansione Sonda (sente una interazione con il campione) Un sistema computerizzato che guida lo scanner, misura i dati e li converte in immagini Scanning Probe Microscopes Gli Scanning Probe Microscopy (SPM) sono gli strumenti base per le nanotecnologie Tre classi di strumenti SPM: STM (Scanning Tunneling Microscope): misura la corrente di tunneling che si forma fra la sonda metallica ed il campione: il suo impiego è limitato a misure su campioni conduttori. Ha utilizzo limitato su campioni biologici A100-AFM pA-STM AFM (Atomic Force Microscope) SNOM (Scanning Near-field Optical Microscope) TriA-SNOM By A.P.E. Research AFM-Microscopio a Forza Atomica • Microscopio a Forza Atomica misura la forza d’interazione tra sonda e campione, ricreando la topografia della superficie del campione. • La sua risoluzione è di circa 0.1 nm • Permette di ottenere non solo immagini topografiche ma anche di misurare quantitativamente questa forza di interazione. Punta AFM interazione Ag-Ab Punta AFM vista al SEM AFM-Microscopio a Forza Atomica AFM – la punta e il supporto elastico Materiale del supporto: silicio, o stesso materiale della punta. Materiali maggiormente utilizzati per la realizzazione della punta sono: ■Nitruro di silicio (Si3N4) ■ Diamante Lunghezza del supporto: 100 ~ 400 m Lunghezza della punta: 2 ~ 10 m Principio di funzionamento di SNOM • La sonda è una fibra ottica • Acquisisce un’immagine topografica simil AFM • Grazie all’uso della fibra ottica è un microscopio ottico la cui capacità di risoluzione va oltre il limite della diffrazione della luce (limite di Abbe l/2), che è il limite della microscopia ottica tradizionale, poiché sfrutta la componente di near-field della luce riuscendo così a superare il limite di Abbe • Le immagine ottiche possono essere acquisite in tre differenti modalità: riflessione, trasmissione e retroriflessione • La topografia e le immagini ottiche vengono acquisiste simultaneamente SNOM Microscopio a scansione in Campo Prossimo a . b. Lo SNOM permette di acquisire due differenti e simultanei segnali ottici contemporaneamente alla topografia del campione: luce riflessa (riflessione), luce trasmessa (trasmissione) e topografia. La punta è una fibra ottica “metallizzata” con, all’estremità, un’apertura di d <<λ: la metalizzazione è essenziale per creare una “sub-wavelength aperture”. Risoluzione ottica 50-100 nm ASPETTI DI APPLICAZIONE SULLO STUDIO CELLULARE: AFM Ottica di visione montata sul microscopio AFM per il posizionamento della sonda AFM (cantilever) e la scelta della zona di scansione 0,00m 0,98m 0,00m 0,75m Line Profile 1 0,00m 0,98m 0,00m 0,75m ASPETTI DI APPLICAZIONE SULLO STUDIO CELLULARE: SNOM PODOCITI marcati con falloidina Topografia Trasmissione AREA DI SCANSIONE PRECEDENTE BLEACHING Topografia PODOCITI marcati con falloidina Riflessione Trasmissione PODOCITI marcati con falloidina Topografia Microscopio a fluorescenza Vetrino montato Trasmissione ASPETTI DI APPLICAZIONE SULLO STUDIO DEL GLOMERULO RENALE: AFM/SNOM AFM – Conventional Optical Microscope 16.8 x 16.8 m2 Z-range 127 nm Conventional Optical Microscopy 10 x 10 m2 Z-range 173 nm SNOM study of glomerular filtration barrier SNOM Optical Transmission Images SNOM Topography 10 µm 10 µm Bengt Rippe: Nephrol Dial Transplant (2004) 19: 1–5 Hjalmarsson C et al. Microvascular Research 2004 SNOM Topography SNOM Optical Reflection SNOM Optical Transmission 40 µm SNOM Images of ultra thin sections (thickness 100nm) of renal glomerulus. Conventional Optical Micorscopy LO SVILUPPO DELLA MICROSCOPIA A SONDA QUALE NUOVA TECNOLOGIA IN CAMPO BIOMEDICO. Fondi Progetto Regionale Friuli Venezia Giulia 2005. ”Per la concessione di contributi per la realizzazione di progetti di ricerca scientifica e applicata e di iniziative di trasferimento e di diffusione dei risultati della ricerca” Università degli studi di Trieste Dipartimento Universitario Clinico di Biomedicina UNITA’ CLINICA OPERATIVA DI CLINICA ODONTOSTOMATOLOGICA Dipartimento di Fisiologia e Patologia Dipartimento Clinico Universitario di Scienze Biomediche, Tecnologiche e Traslazionali Sez. Immunologia DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA ELETTROTECNICA, ELETTRONICA E INFORMATICA DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA MECCANICA In particolare ringraziamo Dipartimento Universitario Clinico di Biomedicina Prof.ssa Marina Zweyer Dott.ssa Elisa Trevisan Ape Research S.r.l AREA SCIENCE PARK Dott.ssa Barbara Troian Dott. Stefano Prato Consorzio per l’AREA di ricerca AREA SCIENCE PARK Dott.ssa Laura Ramacci ….. .. e tutti voi per l’attenzione
