Molecole e cellule a colori

Molecole e cellule a colori
22-24 Settembre 2010 - Milano
Image courtesy of Julien Colombelli
ELLS LearningLab
ELLS LearningLab
Molecole e cellule a colori
22-24 Settembre 2010 - Milano
Indice
Introduzione all‘ELLS ................................................................................................................................. 3
Introduzione al CusMiBio ................................................................................................................
4
Participanti e Programma ........................................................................................................................... 5-8
Seminario 1
La citofluorimetria a flusso.......................................................................................................................... 9
Paolo Plevani, Università degli Studi di Milano
Attività 1
16-18
Proteggere un cuore malato........................................................................................................................
10-12
abc
Tommaso Nastasi e Rossana De Lorenzi , EMBL Monterotondo
Seminario 2
....................................................................................................................................................................... 13
Sara Buonomo, EMBL Monterotondo
Attività 2
16-18
Alla ricerca del tempo perduto.................................................................................................................... 14-15
Paolo Plevani, Università degli Studi di Milano
Seminario 3
Il cervello in technicolor............................................................................................................................... 16-17
Silvia De Biasi, Università degli Studi di Milano
Attività 3
16-18
Il cervello in technicolor...............................................................................................................................
18-19
Silvia De Biasi, Università degli Studi di Milano
Seminario 4
Microscopia in fluorescenza e confocale.................................................................................................. 20-21
Umberto Fascio e Silvia De Biasi, Università degli Studi di Milano
Seminario 5
....................................................................................................................................................................... 22
Martin Kater e Lucia Colombo, Università degli Studi di Milano
Attività 4
16-18
Come produrre un fiore...............................................................................................................................
23
Lucia Colombo, Monica Colombo e Martin Kater Università degli Studi di Milano
Legende
abc
in classe
e-learning
laboratorio
Composizione e Layout: Rossana De Lorenzi I Tommaso Nastasi
protocollo dettagliato
età
3
Introduzione all‘ ELLS
ELLS – European Learning Laboratory for the Life Sciences
l
’European Learning Laboratory for the Life Sciences (ELLS) è una struttura educativa creata allo
scopo di avvicinare insegnanti e studenti delle scuole superiori al mondo della ricerca attraverso
entusiasmanti attività pratiche basate sulle più sofisticate tecniche di biologia molecolare. La
struttura è situata nell’esclusivo contesto di uno dei più rinomati istituti di ricerca al mondo,
il Laboratorio Europeo di Biologia Molecolare (EMBL), che vanta uno staff internazionale di
scienziati giovani e dinamici.
Gruppi composti da 15-30 insegnanti raggiungono l’EMBL per partecipare ad attività pratiche
chiamate LearningLABs, che affrontano temi attuali di biologia molecolare associati a semplici
esperimenti facilmente riproducibili nelle classi. Nel corso di tre giorni gli insegnanti hanno
l’opportunità di affiancare autorevoli ricercatori in attività sperimentali, seminari, visite alle strutture
dell’EMBL, corsi di bioinformatica, giochi educativi e forum di discussione su scienza e società.
Il materiale didattico sviluppato durante i LearningLABs è disponibile sul sito dell’ELLS nella
sezione TeachingBASE.
L’ELLS invita anche ricercatori europei esterni a visitare la struttura ed a lavorare con lo staff
ELLS al fine di elaborare materiale didattico e di esplorare la possibilità di applicare analoghi
programmi educativi ai rispettivi istituti di provenienza.
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Introduzione al CusMiBio
CusMiBio - Centro Universita‘ di Milano - Scuola per le Bioscienze e le Biotecnologie
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Partecipanti
Insegnanti
Albanese Nicola
Caiazzo (CE)
Antonietti Franca
Bolzano
Barone Antonina
Avola (SR)
Bifulco Laura
Cagliari
Caronia Daniela
Milano
De Meo Raffaella
Imperia
Di Battista Emilia
Roma
Forgelli Antonella
Roma
Gazzoldi Maria
Verolanuova (BS)
Lucchetti Paola
Latina
Mantegazza Rosalia
Limbiate (MB)
Marinoni Silvia
Rovetta (BG)
Menesini Monica
Lucca
Oliveira Maria Teresa
Lecco
Paolini Maria Paola
Sassari
Parisi Elisabetta
Milano
Pettolino Piarosa
Maddaloni (CE)
Silvaggio Giovanna
Assisi
Torri Maria Cecilia
Bergamo
Vannini Maria Gabriella
Sassari
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Organizzatori
Tommaso Nastasi
ELLS - EMBL Monterotondo
Rossana De Lorenzi
ELLS - EMBL Monterotondo Paolo Plevani
Università degli Studi di Milano, Cus-Mi-Bio
Giovanna Viale
Università degli Studi di Milano, Cus-Mi-Bio
Cristina Gritti
Cus-Mi-Bio
Cinzia Grazioli
Cus-Mi-Bio
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Relatori e collaboratori
Relatori:
Paolo Plevani
Università degli Studi di Milano
Sara Buonomo
EMBL Monterotondo
Silvia De Biasi
Università degli Studi di Milano
Umberto Fascio
Università degli Studi di Milano
Martin Kater
Università degli Studi di Milano
Lucia Colombo
Università degli Studi di Milano
Collaboratori per le attività pratiche:
Fabio Puddu
Mariarosa Gioria
Laura Cornaghi
Monica Colombo
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Programma
22 settembre
Stanza
9:00-9:30
Presentazione del corso CusMiBio-EMBL
Aula seminari
9:30-10:30
SEMINARIO 1: Paolo Plevani
Aula seminari
10:30-10:45
Coffee break
Aula seminari
10:45-12:15
ATTIVITÀ I: Proteggere un cuore malato – parte I
12:15-13:15
SEMINARIO 2: Sara Buonomo
13:15-14:30
Pausa pranzo
14:30-15:30
ATTIVITÀ I: Proteggere un cuore malato – parte II
15:30-15:45
Coffee break
15:45-18:00
ATTIVITÀ II: Alla ricerca del tempo perduto
Laboratorio
Aula seminari
Mensa
Laboratorio
Aula seminari
Laboratorio
23 settembre
9:00-10:00
SEMINARIO 3: Silvia De Biasi
10:00-11:30
ATTIVITÀ III: Il cervello in technicolor – parte I
11:30-11:45
Coffee break
Aula seminari
11:45-12:45
SEMINARIO 4: Umberto Fascio e Silvia De Biasi
Aula seminari
12:45-14:00
Pausa Pranzo
14:00-15:00
ATTIVITÀ III: Il cervello in technicolor – parte II
Laboratorio
15:00-16.00
Gruppo 1: microscopio confocale
Gruppo 2: osservazione e commento dei preparati realizzati (ATTIVITÀ III)
Gruppo 3: analisi citofluorimetrica (ATTIVITÀ II)
Laboratorio
16:00-17:00
Gruppo 1: analisi citofluorimetrica (ATTIVITÀ II)
Gruppo 2: microscopio confocale
Gruppo 3: osservazione e commento dei preparati realizzati (ATTIVITÀ III)
Laboratorio
17:00-18:00
Gruppo 1: osservazione e commento dei preparati realizzati (ATTIVITÀ III)
Gruppo 2: analisi citofluorimetrica (ATTIVITÀ II)
Gruppo 3: microscopio confocale
Laboratorio
Aula seminari
Laboratorio
Mensa
24 settembre
9:00-10:00
SEMINARIO 5: Martin Kater – Lucia Colombo
10:00-11:15
ATTIVITÀ IV: Come produrre un fiore – Analisi morfologica
11:15-11:30
Coffee break
11:30-12:15
DEMO: Gruppo 1: microdissezione
Gruppo 2: ibridazione in situ
Laboratorio
12:15-13:00
DEMO: Gruppo 1: ibridazione in situ
Gruppo 2: microdissezione
Laboratorio
13:00-14:00
Pausa pranzo
14:00-16:30
ATTIVITÀ IV: Come produrre un fiore
16:30-17:00
QUESTIONARIO: Valutazione del Corso
Aula seminari
Laboratorio
Aula seminari
Mensa
Laboratorio
Aula seminari
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Seminario 1 La citofluorimetria a flusso
La citofluorimetria a flusso:
principi ed applicazioni
Paolo Plevani
Universita‘ degli Studi di Milano
La citofluorimetria a flusso (CFM) è una
tecnica che permette la caratterizzazione
ed, eventualmente, raccolta di cellule
sospese in un mezzo liquido in base alle loro
dimensioni, forma, quantità di particolari
proteine o acidi nucleici. Rende possibile la
misurazione rapida di proprietà multiple di
singole cellule permettendo una dettagliata
analisi qualitativa e quantitativa.
Inizialmente la CFM era limitata alla
misura di 1 o 2 parametri, uno che valutava
le proprietà fisiche delle cellule e l’altro
la fluorescenza emessa da molecole (DNA o proteine) coniugate con una sostanza
fluorescente. L’utilizzo di svariati fluorocromi e la possibilità di utilizzare laser con spettri
d’emissione diversi ha permesso lo sviluppo di analisi multiparametriche che si basano
sull’utilizzo e visualizzazione di numerosi colori.
Le applicazioni sono multiple:
•
•
•
•
studio della ploidia e della proliferazione cellulare;
analisi immunofenotipica multiparametrica;
analisi del sistema immunitario;
valutazione dell’apoptosi cellulare
Verranno discussi i principi di funzionamento del citofluirimetro e verranno portati
alcuni esempi, soprattutto riguardanti lo studio ed il controllo del ciclo cellulare.
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abc
15-18
Attività 1 Proteggere un cuore malato
Riparare un cuore infranto
Tommaso Nastasi, Rossana De Lorenzi
Introduzione
Architettura e funzione del muscolo cardiaco
Il cuore gioca un ruolo fondamentale pre il
funzionamento del nostro organismo:
•Fa circolare il sangue attraverso il sistema
polmonare, consentendo in esso lo scambio di
anidride carbonica con l‘ossigeno
•Trasporta il sangue ossigenato a tutti i
distretti periferici del corpo, permettendone la
sopravvivenza rendendo possibile la produzione di
energia metabolica
•Distribuendo il sangue a tutti i distretti tissutali,
permette a nutrienti, ormoni e altre molecole
segnale, nonchè a cellule del sistema immunitario e
di difesa, di raggiungere tutte le cellule della periferia
del corpo
La funzione di „pompa“ del cuore, che garantisce
una efficiente ossigenazione e alimentazione di
tutte le cellule, ha un‘origine evolutiva antica.
Non è quindi affatto una sorpresa trovare organi
con funzione cardiaca nella maggior parte degli
organismi multicellulari.
Il cuore esercita le sue fiunzione grazie ad
un tessuto specializzato, composto da cellule
Excitation propagation in a model of the heart of the Visible
Man: 3D views of the excitation process at different times for mononucleate
(dette cardiomiociti) accoppiate
the ventricles.
elettricamente grazie alla presenza di canali
intramembrana (gap-junctions) giustapposti tra
cellule adiacenti. Questa organizzazione permette ai cardiomiociti di attuare contrazioni
rimiche e coordinate, attraverso un complesso sistema che regola il rilascio di Ca2+ dai
compartimenti intracellulari dove esso è contenuto.
Un fattore critico per il funzionamento cardiaco è ovviamente che il suo stesso tessuto
sia efficacemente alimentato/ossigenato, una funzione espletata dal sistema circolatorio
coronoarico. La contrazione del cuore è controllata dall‘attività pacemaker di strutture
nervose specializzate (le cellule del Purkinje), che sono componenti essenziali di quello
che viene definito sistema di conduzione cardiaco.
Nel tessuto cardiaco i cardiomiociti, componenti il miocardio, sono associati ad
altri tipi cellulari, responsabili di funzioni accessorie quali la protezione da patogeni, la
riparazione tissutale e lo smaltimento di sostanze di rifiuto.
Infarto al Miocardio
Una porzione di tessuto cardiaco che dovesse mancare di apporto sanguigno va
inevitabilmente incontro ad un processo degenerativo comunemente noto con il termine
di Infarto del Miocardio (IM). L‘IM è talvolta anche l‘evento terminale della sindrome
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abc
15-18
Attività 1 Proteggere un cuore malato
Insufficienza Cardiaca Cronica (ICC), uno stato patologico
caratterizzato dall‘incapacità del cuore a mantenere le sue
funzioni vitali.
L‘IM costituisce in tutti i suoi aspetti e fasi una lesione
del tessuto, e nei diversi organismi si sono evolute strategie
per garantire protezione e guarigione dai danni associati
all‘IM.
Nella fase acuta dell‘IM, le cellule dell‘area infartuata
vanno incontro a stress e morte, rilasciando nel tessuto
calcio e altre sostanze tossiche. La produzione di citochine
(piccole molecole seganle) pro-infiammatorie facilita il
reclutamento di cellule che partecipano al processo di
riparazione del danno.
Idealmente, la gaurigione dovrebbe portare ad una Changes in ECG tracks during Myocardial infarction. Adapted from 3DScience.com
completa ricostituzione di tessuto cardiaco funzionale.
In questo senso, la possibilità che esistano cellule staminali nel cuore, in grado, se
opportunamente attivate, di riconstitutire integralmente il tessuto danneggiato suscita
grande interesse nella comunità scientifica.
I pesci, per esempio, sembrano mantenere, anche in età adulta, un certo numero
di cellule staminali cardiache che rispondon al danno tissutale migrando nell‘area
infartuata dove differenziano ricostituendo le cellule cardiache perse. Tuttavia, non tutti
gli organismi hanno mantenuto questa formidabile capacità rigenerativa, e le diverse
teorie sui meccanismi che sottostanno la guarigione di un IM sono ancora oggetto di
intenso dibattito fra gli scienziati. Sono presenti cellule staminali cardiache nel cuore
umano? Sono esse in grado di riattivarsi e riparare il tessuto danneggiato da un IM?
L‘obiettivo di questa attività è quello di esplorare il processo dell‘IM nei mammiferi
e riflettere sulle strategie naturali di guarigione dall‘IM e sulle loro implicazioni
potenzialmente rilevanti per la terapia medica.
L‘approccio istologico
L‘uso di sostanze chimiche per colorare specifiche strutture tissutali e cellulari occupa
una posizione consolidata nella tradizione della microscopia. Questi protocoli tradizionali
hanno ancora oggi un‘importanza
fondamentale per la valutazione iniziale
di anormalità e danni dlle cellule e
dei tessuti, e forniscono indicazioni
importanti
per
l‘approfondimento
diasgnostico.
Molto spesso, questo approccio
consente agli scienziati di formulare
ipotesi specificatamente a difetti
funzionali.
L‘approccio
istochimico
trae
vantaggio dall‘abilità di certe molecole
(d‘ora in poi chiamate coloranti) di
legare componenti cellulari o presenti
nel compartimento extra-cellulare del
tessuto, dando. grazie alle loro proprietà
Rabbit Aorta, PicroSirius Red (polarized) specifiche, contrasto a tali strutture.
Alcune di queste molecole esibiscono
particolari proprietà metacromatiche, sono cioè in grado di cambiare colore a secondo
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abc
Attività 1 Proteggere un cuore malato
15-18
del loro stato chimico influenzato dall‘ambiente circostante.
Informazioni più dettagliate possono essere acquisite anche tramite l‘esecuzione
di protocolo immuno-enzimatici, ossia di quei protocolli che misurano la presenza ed
abbondanza di certi enzimi o substrati presenti nei compartimenti intracellulari.
Attività
abc
15-18
I partecipanti avranno la possibilità di analizzare diversi campioni di tessuto cardiaco
fissati su vetrino (tessuto di controllo, tessuto a diversi stadi successivi a IM, e tessuto
a diversi stadi dopo IM associato a terapia). Basandosi su quali aspetti dell‘IM si vuole
osservare, i partecipanti dovranno:
- determinare quali campioni sono necessari per l‘analisi
- identificare lo stadio specifico idoneo a fornire le risposte richieste
- selezionare i controlli appropriati da includere nell‘analisi per una corretta
intepretazione dei risultati
- scegliere quale tecnica di colorazione applicare per svelare i meccanismi cellulari
oggetto dell‘ipotesi
- eseguire la tecnica di colorazione scelta
- confrontare e discutere i risultati che emergono dall‘analisi delle strategie adottate
dai diversi gruppi
Lo scopo principale di questa attività è quello di incoraggiare i partecipanti a sviluppare
strategie sperimentali basate sull‘inchiesta e di formulare teorie sulla base dei risultati
ottenuti. Inoltre, le evidenze emergenti dall‘approccio sperimentale, serviranno da base
ad una fase generale di discussione sule capacità rigenerative dei diversi organismi,
cercando di rompere il luogo comune che il processo rigenerativo in natura è sempre
operato nel miglior modo possibile.
Questo tema ha implicazioni importanti sulla nostra, sempre maggiore, capacità di
osservare e comprendere i fenomeni biologici. Da un lato, la nostra conoscenza dei
processi patologici e la nostra bilità di sviluppare strategie terapeutiche ha visto formidabili
progressi; dall‘altro però, la consapevolezza che certi processi naturali non sono sempre
perfetti da legittimità ad tentativi di interferire con quegli stessi processi, sottoponendo
la comunità medico-scientifica e la società stessa a dilemmi più profondi rispetto quali
scelte responsabili possiamo o vogliamo fare.
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Seminario 2 Punti di Controllo del ciclo cellulare e loro funzione nel prevenire la trasformazione cellulare
Punti di controllo del ciclo cellulare
e loro funzione nel prevenire la trasformazione
cellulare
Sara Buonomo
EMBL Monterotondo
Le cellule, affinché possano sopravvivere e gli organismi a cui appartengono si possano sviluppare, devono proliferare, dando vita a nuove cellule che abbiano il loro
stesso corredo genetico.
Il processo che permette la duplicazione del corredo genetico di una cellula, consentendo la trasmissione ad ogni nuova cellula dello stesso set cromosomico della
cellula parentale, è chiamato replicazione del DNA. Questo processo avviene durante
la cosiddetta fase di Sintesi (fase S) del ciclo cellulare.
Il secondo passaggio findamentale è quello che consente la corretta distribuzione
delle due copie di genoma ta le due cellule figlie. Questo processo avviene durante
la Mitosi. Questi passaggi sono particolarmente delicati e dalla loro affidabilità dipende la sopravvivenza stessa delle cellule.
Per garantire che eventuali errori nel corredo genetico non vengano trasmessi tra le
varie generazioni, le cellule possiedono dei punti di controllo (checkpoints) del ciclo
cellulare durante i quali il ciclo può essere sospeso per permettere la correzione degli
errori.
Alternativamente, qualora gli errori siano non riparabili, la cellula attiva un programma
di auto-eliminazione (cosidetta apoptosi, o morte cellulare programmata).
La transizione da cellula normale a cancerosa è spesso associata con alterazioni nella
funzione di componenti dei checkpoints e/o errori generati durante la replicazione del
DNA. I checkpoints controllano tutte le transizioni da una fase del ciclo cellulare alla
successiva.
Il checkpoint G1-S
Prima che le cellule si impegnino a duplicare il genoma, il checkpoint G1-S garantisce
che non siano presenti interruzioni nel filamento di DNA e che la cellula abbia sufficienti risorse per completare un processo ad costo energetico molto elevato come
quello della replicazione del DNA.
In presenza di qualunque anomalia, l‘inizio della replicazione viene ritardata fino a
quando il problema non è risolto. In questa fase solo un processo di replicazione a
„bassa fedeltà“, chiamato Non-Homologous End Joining (NHEJ), è in grado di riparare il DNA. Infatti, prima che il DNA si replichi, ogni cromosoma è presente in singola
copia e, pertanto, non sono disponibili altre copie stampo per la correzione di errori.
Il checkpoint della replicazione del DNA
Problemi che avvengono durante la replicazione del DNA costituiscono la principale
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Seminario 2 Punti di Controllo del ciclo cellulare e loro funzione nel prevenire la trasformazione cellulare
sorgente endogena di danno al DNA. Il checkpoint della replicazione del DNA si attiva
ogni qualvolta il complesso di replicazione incontra un ostacolo. La sua funzione primaria è sostanzialmente quella di attivare l‘apparato necessario a rimuovere o oltrepassare quell‘ostacolo.
L‘obiettivo finale di questo checkpoint è quello di garantire che l‘intero genoma sia
duplicato (preferibilmente senza errori) prima che esso sia effettivamente distribuito
alle due cellule figlie.
Il checkpoint intra fase S
Se le cellule che si trovano nella fase S sono soggette ad una fonte esogena di danno
al DNA, come per esempio raggi g, le conseguenti rotture a doppio filamento del DNA
(double stranded break, DSB) vengono registrate da questo checkpoint che blocca
la progressione del ciclo cellulare ed l‘innesco della replicazione del DNA, ancora in
fase di attesa, e attiva i meccanismi di riparazione del danno. Dato che questo tipo di
danno è diverso da quello associato al blocco delle forche di replicazione, il complesso molecolare che avverte la presenza del danno e la cascata di segnali coinvolta
nella risposta ad esso sono distinti da quelli coinvolti nel checkpoint della replicazione
del DNA.
Il checkpoint G2-M
Il checkpoint G2-M costituisce l‘ultimo guardiano che assicuri l‘integrità del DNA prima che la cellula entri in mitosi.
Dopo che la replicazione del DNA si è completata, le cellule acquisiscono la capacità
di riparare il danno del DNA attraverso un processo ad alta fedeltà, detto di ricombinazione omologa (Homologous Recombination, HR). A questo stadio infatti ogni
cromosoma è costituito da due copie identiche, dette cromatidi fratelli, che offrono
vicendevolmente uno stampo da cui trarre informazione per la riparazione di eventuali
errori.
Il checkpoint del fuso
I cromatidi fratelli rimangono legati l‘uno all‘altro fino al momento in cui la cellula è
pronta a dividersi, per garantire che entrambe le cellule figlie ricevano esattamente
una delle due copie di ogni cromosoma. Questo meccanismo fa sì che i due cromatidi
possano poi orientarsi in maniera coordinata verso i due poli opposti dell‘apparato del
fuso, che si distribuiranno nelle due cellule figlie. Pertanto, solo un corretto e ordinato attracco bipolare di ognuno dei cromatidi fratelli può assicurare una distribuzione
corretta del materiale genetico duplicato nelle due cellule figlie.
Le cellule possiedono sensori molecolari che sono in grado di attivarsi qualora uno
dei cromosomi sia orientato in maniera anomala o non correttamente localizzato nella
cellula. La loro funzione è quella di inibire il processo di distribuzione finchè ogni singolo cromosoma sia pronto a muoversi nella direzione corretta.
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15-18
Attività 2 Alla ricerca del tempo perduto
“Alla ricerca del tempo perduto”:
la citofluorometria nell’analisi del
ciclo cellulare
Paolo Plevani, Fabio Puddu
Premesse teoriche
Durante il ciclo di divisione cellulare la cellula duplica il suo patrimonio genetico (fase
S) e lo divide fra le due cellule figlie (fase M). In questo processo la quantità totale di
DNA presente nella cellula aploide (1C) cresce costantemente durante tutta la fase S
(replicazione) fino a raggiungere, al termine della stessa il valore 2C. Durante la fase M
(mitosi) si osserva invece il rapido dimezzamento della quantità di DNA presente nella
cellula. Lo stesso processo si può osservare in cellule diploidi, dove la quantità di DNA
oscilla fra 2C e 4C.
Per facilitare lo studio del ciclo cellulare sono state adottate diverse tecniche che
permettono di ottenere colture cellulari sincronizzate, in cui tutte le cellule in coltura si
trovano nella stessa fase del ciclo cellulare. Utilizzando come sistema modello il lievito
Saccharomyces cerevisiae è possibile sincronizzare le cellule in diverse fasi del ciclo
cellulare. Le cellule aploidi di lievito possono essere sincronizzate in G1 attraverso l‘uso
di un feromone sessuale, in fase S con un inibitore della replicazione e in M mediante un
agente che depolimerizza il fuso mitotico.
Il processo di replicazione del DNA e di
divisione cellulare può essere seguito con l‘analisi
citofluorimetrica. Questa tecnica permette di misurare
indirettamente la quantità di DNA presente in ogni
singola cellula attraverso una misura della fluorescenza
emessa da un fluoroforo che si intercala nella molecola
di DNA. Misurando il contenuto totale di DNA, questa
tecnica permette inoltre di avere informazioni sulla
ploidia della popolazione in esame.
Obiettivi
Ai partecipanti verranno distribuite colture di
S. cerevisiae asincrone o sincronizzate, aploidi
oppure diploidi senza però che il partecipante
sappia quale coltura gli è stata assegnata (da qui
il titolo dell’esperienza di laboratorio!). Attraverso
Misura del contenuto di DNA in una popolal‘analisi citofluorimetrica ogni partecipante misurerà
zione di cellule proliferanti
il contenuto di DNA in un campione rappresentativo
attraverso l‘analisi citofluorimetrica.
Fonte: Molecular Biology of the Cell
della popolazione da esaminare.
Una volta stabilito se la popolazione esaminata è
sincronizzata o asincrona e qual è la distribuzione del suo contenuto di DNA, i partecipanti
completeranno l‘analisi della coltura osservando al microscopio la morfologia cellulare
della popolazione esaminata. Le cellule di S. cerevisiae, infatti, assumono una morfologia
caratteristica nelle diversi fasi del ciclo cellulare.
Attraverso le informazioni ottenute ogni partecipante sarà in grado di identificare il
tipo di coltura da cui proviene il suo campione.
ELLS LearningLab
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15-18
Attività 2 Alla ricerca del tempo perduto
Step principali
Dopo aver prelevato una aliquota di coltura per l‘osservazione al microscopio, le
cellule restanti vengono fissate per almeno 30 minuti in etanolo 70%. Si procede quindi
alla preparazione dei campioni per l‘analisi citofluorimetrica (FACS). I campioni vengono
trattati con RNasi per un‘ora a 37°C, in modo da eliminare dalle cellule tutto l‘RNA che
potrebbe influenzare l’analisi FACS; le cellule vengono quindi risospese in FACS buffer
e conservate a 4°C.
Il giorno successivo i campioni vengono colorati con un fluoroforo che si intercala nel
DNA, sonicati per separare eventuali aggregati cellulari ed analizzati al citofluorimetro.
Verranno quindi discussi i risultati.
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Seminario 3 Il cervello in technicolor
Il cervello in technicolor:
Colorazioni classiche e nuove tecniche
per visualizzare l’architettura e l’organizzazione
sinaptica del cervello.
Silvia De Biasi
Silvia De Biasi
Universita‘ degli Studi di Milano
Il cervello costituisce, assieme al midollo spinale, il nostro sistema nervoso centrale
che è formato da un tessuto nervoso riccamente vascolarizzato e composto da due
grandi categorie di cellule: i neuroni (specializzati per condurre segnali elettrici su
lunghe distanze) e le cellule gliali (che non conducono segnali elettrici ma sono dotate di
molteplici funzioni vitali per il corretto funzionamento dei neuroni stessi).
La caratteristica peculiare del tessuto nervoso è che i neuroni (e anche le cellule
gliali) sono presenti in un’enorme varietà di tipi cellulari, distinti tra loro per morfologia,
specificità molecolare, attività fisiologica. I nostri processi sensoriali, la percezione, il
comportamento, la memoria e, in generale, tutte le attività svolte dal nostro cervello,
dipendono strettamente da questa ricca diversità strutturale e funzionale e dalle specifiche
interconessioni dei neuroni, realizzate mediante contatti altamente specializzati (le
sinapsi) a formare insiemi intricati chiamati circuiti sinaptici.
Sezioni di cervelletto colorate con Tionina (A), reazione nera di Golgi (B) e con marcatura immunocitochimica multipla (C) per evidenziare i
Storicamente l’identificazione di tipi cellulari diversi nel sistema nervoso si deve a
studi istologici del XIX secolo, realizzati con metodiche di colorazione che prendono il
nome dai ricercatori che le hanno messe a punto: Nissl, Cajal, Golgi e altri. Tali metodiche
hanno portato uno straordinario contributo sperimentale in campo neuro-anatomico e
anatomo-patologico e si sono rivelate fondamentali per gli studi sullo sviluppo del sistema
nervoso. E’ tuttavia importante ricordare che le colorazioni “classiche” continuano ancora
oggi ad essere utilizzate, combinandole con approcci più moderni.
ELLS LearningLab
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Seminario 3 Il cervello in technicolor
Nuove tecnologie, rese possibili dai progressi della biologia cellulare e molecolare,
forniscono ora ai ricercatori gli strumenti per distinguere varie proprietà dei neuroni, non
rilevabili con le metodiche convenzionali di colorazione.
I nuovi approcci sperimentali comprendono: a) l’utilizzo di anticorpi o sonde a mRNA,
con cui è possibile apprezzare caratteristiche specifiche di neuroni e cellule gliali in
diverse regioni del sistema nervoso, come pure la diversità dei tipi cellulari all’interno
di queste regioni; b) nuovi metodi di marcatura con sostanze traccianti trasportate
lungo i prolungamenti delle cellule nervose, che consentono di esaminare più a fondo
le connessioni tra neuroni; c) le metodiche per determinare l’identità molecolare e la
morfologia delle cellule nervose che possono essere combinate con misure della loro
attività fisiologica, chiarendo quindi le relazioni tra struttura e funzione; d) la scoperta
di geni che codificano per proteine fluorescenti in invertebrati marini, che ha permesso
l’espressione di tali molecole in neuroni del cervello di mammiferi.
Il seminario fornirà una serie di esempi dell’ applicazione di metodiche classiche e
più recenti utilizzate per cercare di chiarire la complessa organizzazione del sistema
nervoso.
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Attività 3 Il cervello in technicolor
15-18
Il cervello in technicolor
Silvia De Biasi, Mariarosa Gioria, Laura Cornaghi
Strumento essenziale per visualizzare le cellule del tessuto nervoso (e di tutti i tessuti
in generale) è il microscopio ottico. Affinché tale osservazione sia possibile, il tessuto
deve essere preliminarmente trattato con opportune metodiche.
Verranno, quindi, illustrate le procedure classiche di fissazione, inclusione, taglio
e colorazione di campioni di tessuto nervoso che permettono di ottenere preparati
permanenti osservabili al microscopio ottico.
Ai partecipanti saranno distribuiti campioni di encefalo di animali da laboratorio,
opportunamente preparati in precedenza secondo le modalità spiegate nella introduzione,
che verranno sezionati, colorati e osservati al microscopio.
Materiale distribuito
- campioni di encefalo fissati ed inclusi in paraffina, per il taglio al microtomo;
- campioni di encefalo fissati ma non inclusi in paraffina, per il taglio al vibratomo;
- sezioni al vibratomo o in paraffina già montate su vetrini per poterle colorare.
TAGLIO. I partecipanti avranno modo di utilizzare di persona due strumenti, microtomo
e vibratomo, che consentono di ottenere sezioni con diverse caratteristiche.
COLORAZIONE. Alcune sezioni, raccolte su vetrini gelatinati, verranno colorate con
a) Tionina e b) Ematossilina ed Eosina, due colorazioni classiche comunemente utilizzate
in neuroanatomia.
Il protocollo prevede per entrambe i seguenti trattamenti:
immersione in Xilolo, reidratazione in scala alcolica, immersione nel colorante,
differenziamento, disidratazione e montaggio delle sezioni con coprioggetto.
Su altre sezioni verrà iniziato il trattamento con una Lectina vegetale che consente,
mediante una reazione citochimica, di visualizzare l’endotelio vascolare e la microglia
(una particolare classe di cellule gliali).
Immagini a piccolo (A) e medio (B) ingrandimento di sezioni di corteccia cerebrale colorate con tionina (blu)
per evidenziare la disposizione dei neuroni in strati sovrapposti.
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15-18
Attività 3 Il cervello in technicolor
L’ identificazione di componenti specifiche del tessuto nervoso (e di tutti i tessuti
in generale) richiede tecniche di “colorazione” capaci di rendere selettivamente visibili
singole molecole.
L’esperimento prevede l’impiego della lectina biotinilata LEA che consentirà, mediante
una reazione citochimica, di visualizzare l’endotelio dei vasi sanguigni presenti nel
tessuto nervoso e la microglia.
Le lectine sono proteine o glicoproteine di origine non immune, derivate da piante,
animali o microrganismi, che riconoscono e legano specificamente carboidrati terminali
o subterminali. Le lectine sono molto sensibili e stabili e rappresentano, quindi, uno
strumento di facile impiego per rivelare, mediante metodiche citochimiche, l’espressione
di specifici carboidrati in una grande varietà di tessuti e cellule sia animali che vegetali.
Tra le lectine impiegate per lo studio del tessuto nervoso la lectina di pomodoro
LEA (Lycopersicon esculentum Agglutinin) viene ampiamente utilizzata per studiare la
vascolarizzazione, sia in condizioni normali che patologiche, in quanto marca i residui
di N-acetil-D-glucosammina presenti nel glicocalice dell’endotelio vascolare e per
evidenziare la microglia, soprattutto in condizioni patologiche.
Sezioni di corteccia cerebrale sottoposte a reazione citochimica con b-LEA.
Il prodotto di reazione marrone evidenzia nelle immagini a piccolo (A) e medio (B) ingrandimento l’endotelio dei vasi sanguigni; a
forte ingrandimento si identificano anche cellule della microglia (C).
Nell’esperimento verrà utilizzata la lectina LEA “biotinilata”, cioè legata alla biotina,
che ne consentirà la visualizzazione al microscopio ottico.
La biotina è una vitamina idrosolubile particolarmente utile in citochimica per due
peculiari caratteristiche: a) le ridotte dimensioni consentono di coniugare molte
molecole di biotina ad una stessa molecola di lectina senza alterarne le caratteristiche
funzionali; b) ha un’elevata affinità per l’avidina, una glicoproteina contenuta nell’albume
dell’uovo, importante per la sua visualizzazione. La biotina legata alla lectina LEA verrà
infatti evidenziata con la miscela ABC (Avidin-Biotin Complex), costituito da avidina e da
un enzima (perossidasi) biotinilato. Il complesso viene preparato circa 30 minuti prima
dell’uso, miscelando i due componenti. La stechiometria della reazione di miscelazione è
calcolata in modo che l’enzima biotinilato si leghi alla avidina e che quest’ultima conservi
almeno un sito libero per legarsi, a sua volta, con la biotina presente sulla lectina.
Il protocollo prevede i seguenti passaggi:
Xilolo, reidratazione in scala alcolica, incubazione con detergente, incubazione con
lectina (90’), lavaggi, incubazione con complesso ABC (90’ = pausa pranzo).
Le sezioni vengono poi lavate in tampone ed incubate con la miscela di rivelazione
che contiene acqua ossigenata (substrato dell’enzima perossidasi) e diaminobenzidina
(cromogeno che permette la formazione di un prodotto di reazione colorato a seguito
della interazione enzima-substrato).
I partecipanti potranno seguire direttamente al microscopio la comparsa del prodotto
di reazione.
Seguirà l’osservazione al microscopio ottico a luce trasmessa con il commento dei
preparati realizzati nella giornata.
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Seminario 4 Microscopia in fluorescenza e confocale
Microscopia in fluorescenza e confocale:
Principi generali e applicazioni allo studio del
sistema nervoso
Umberto Fascio e Silvia De Biasi
Umberto Fascio
Universita‘ degli Studi di Milano
Silvia De Biasi
Universita‘ degli Studi di Milano
La fluorescenza è la proprietà che alcune molecole hanno di assorbire luce ad una
lunghezza d’onda e di emetterla ad un’altra più lunga. Le molecole fluorescenti si possono
quindi visualizzare mediante un microscopio ottico “a fluorescenza” dotato di: a) una
sorgente di luce (lampada a vapori di mercurio); b) un filtro di eccitazione (che seleziona
la lunghezza d’onda che colpisce il preparato); c) uno specchio dicroico e d) un filtro
di emissione (che seleziona la lunghezza d’onda emessa dal preparato), scelti in base
alle caratteristiche di eccitazione ed emissione della specifica molecola fluorescente
da rilevare. Il vantaggio di tale approccio è che se una molecola fluorescente viene
illuminata alla lunghezza d’onda di assorbimento ed osservata attraverso un filtro che
permette il passaggio della sola lunghezza d’onda di emissione, tale molecola si vede
risplendere nettamente contro uno sfondo scuro, anche se presente nel campione in
piccole quantità.
Dato che le molecole spontaneamente fluorescenti sono molto scarse nei tessuti,
per questo tipo d’indagine vengono comunemente utilizzati dei “coloranti fluorescenti”
(chiamati fluorocromi), capaci di evidenziare selettivamente specifici componenti
tissutali. L’esistenza di fluorocromi con caratteristiche diverse permette inoltre di
evidenziare contemporaneamente più molecole nello stesso campione. Uno svantaggio
del microscopio a fluorescenza è che la luce di eccitazione illumina tutto lo spessore del
campione, eccitando i fluorocromi presenti sul piano di fuoco ma anche quelli sopra e
sotto il piano di fuoco. Ciò può rendere l’immagine confusa e dotata di basso contrasto,
rendendone quindi difficile l’interpretazione.
Esempio di marcatura multipla ottenuta al microscopio confocale.
L’immagine mostra un neurone del midollo spinale dopo: A, colorazione con Neurotrace (blu) per evidenziare il corpo cellulare;
B, colorazione con Neurotrace (blu) e marcatura citochimica con la lectina WFA (verde) per evidenziare la rete perineuronale; C,
colorazione con Neurotrace (blu) e marcatura immunocitochimica con anticorpi anti-sinaptofisina (rosso) per evidenziare i bottoni
sinaptici. In D tutte le marcature sono state sovrapposte.
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Seminario 4 Microscopia in fluorescenza e confocale
Il microscopio confocale è uno strumento complesso che permette innanzitutto
di ovviare a questo problema. Infatti, utilizzando un laser come fonte luminosa, tale
microscopio consente di mettere a fuoco un singolo piano di spessore controllato (detto
“sezione ottica”), selezionato in un campione spesso, rigettando la luce che proviene
da regioni fuori fuoco sopra e sotto quel piano e creando quindi immagini molto
nitide. Con la microscopia confocale è inoltre possibile acquisire una serie di sezioni
ottiche nello spessore (asse “z”) del campione, assemblarle e farne una ricostruzione
tridimensionale. Nel seminario saranno illustrati i principi generali dei due tipi di microscopia e le
principali applicazioni in campo neuroanatomico quali: la tecnica di “fluorescenza indotta”,
messa a punto nella seconda metà del secolo scorso per evidenziare i neurotrasmettitori
dopamina e serotonina; l’uso di anticorpi e traccianti fluorescenti, introdotti artificialmente
nei tessuti; l’impiego di molecole reporter fluorescenti (quali la Green Fluorescent Protein,
GFP) per monitorare l’espressione genica in specifiche sottopopolazioni neurali.
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Seminario 5 Come produrre un fiore
Come produrre un fiore
Lucia Colombo, Monica Colombo, Martin Kater
Lucia Colombo
Univ. di Milano
Monica Colombo
Univ. di Milano
Martin Kater
Univ. di Milano
Nelle piante, diversamente da quanto avviene nelle specie animali nelle quali la
gametogenesi inizia già durante la fase embrionale dell‘organismo, gli organi riproduttori
dai quali si origineranno i gameti si formano nella fase postembrionale, quando fattori ambientali quali la temperatura e la
durata del giorno e fattori endogeni quali la statura della pianta
sono favorevoli alla riproduzione. Nelle Angiosperme gli organi
riproduttori maschili e femminili si trovano riuniti nel fiore, una
struttura complessa composta da diversi organi, che sono foglie
modificate. Nel fiore ci sono anche organi colorati aventi funzione
vessillare, cioè in grado di attrarre gli insetti impollinatori. Il fiore
riveste un ruolo di importanza primaria in ambito agricolo. Dai fiori
si originano infatti, in seguito a fecondazione, i frutti e i semi, la cui
importanza e’ innegabile per l‘alimentazione umana e animale.
Fiore di Arabidopsis
Nel corso del seminario verrà fornita una visione d’insieme di quelli che sono i
principali meccanismi regolanti la formazione del fiore nella specie modello Arabidopsis
thaliana. Verranno successivamente presentate le tecniche utilizzate per lo studio di tali
meccanismi. Enfasi particolare verrà assegnata alle tecniche di microscopia.
Le moderne tecniche di microscopia, abbinate a colorazioni e marcature fluorescenti,
sono infatti di enorme aiuto agli scienziati per indagare ed elucidare i processi di sviluppo
delle piante.
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Attività 4 Come produrre un fiore
15-18
Come produrre un fiore
Lucia Colombo, Monica Colombo, Martin Kater
Lo sviluppo del fiore è stato molto studiato nella pianta modello Arabidopsis thaliana.
Il fiore si origina a partire da un gruppo di cellule meristematiche che prende il nome di
meristema fiorale. I differenti organi fiorali sono posizionati in verticilli concentrici, per cui
si avrà, dall’esterno verso l’interno, sepali, petali, stami e pistillo (o gineceo). Lo studio
di mutanti fiorali in Arabidopsis e in Antirrhinum majus (bocca di leone) ha portato alla
scoperta che l’identità degli organi fiorali è controllata da tre classi di geni omeotici
(classe A, B e C).
All’interno del pistillo,
l’organo
riproduttore
femminile, si sviluppano
gli ovuli, dai quali dopo
la
fecondazione
si
origineranno i semi. L’ovulo
contiene il megagametofito
o gametofito femminile,
che si origina a partire da
una cellula dell’ovulo che
va incontro a divisione
meiotica. La megaspora
funzionale così originatasi
effettua
tre
divisioni
mitotiche successive senza
Schema ABC adattato da Kanno, A., Nakada, M., Akita, Y., and Hirai, M. (2007). Class B gene
citodieresi e forma perciò
expression and the modified ABC model in nongrass monocots. ScientificWorldJournal 7, 268-279.
un
sacco
embrionale
cenocitico contenente otto
nuclei aploidi. In seguito a
migrazione dei nuclei aploidi
e successiva cellularizzazione si origina il gametofito femminile maturo che è costituito
da sette cellule: tre cellule antipodali, due cellule sinergidi, la cellula uovo (il gamete
femminile) e la cellula centrale, binucleata. La fusione tra gameti femminili e maschili
(fecondazione) porta alla formazione della successiva generazione sporofitica.
Il nostro laboratorio studia i processi molecolari che sono alla base della formazione
del meristema fiorale e della differenziazione degli organi fiorali nonché i processi che
portano alla formazione dell’ovulo e del sacco embrionale. Nei nostri studi ci avvaliamo
dell’utilizzo di mutanti che vengono caratterizzati morfologicamente
mediante tecniche sia di microscopia ottica sia di microscopia
elettronica a scansione (SEM), che consente una analisi molto più
dettagliata delle strutture.
Una domanda che si presenta di frequente è capire se le strutture
mutanti che osserviamo hanno modificato oppure mantenuto la
loro identità originaria. Per far questo ci avvaliamo di geni marcatori
che presentano una espressione specifica per una determinata
popolazione cellulare. L’espressione di questi geni può essere
monitorata o mediante tecniche di ibridazione in situ o mediante
geni reporter.
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15-18
Attività 4 Come produrre un fiore
Nella ibridazione in situ si utilizza una sonda specifica per
identificare il profilo di espressione di un gene in un tessuto.
I geni reporter sono invece geni la cui espressione nei tessuti
è facilmente monitorabile, ad esempio mediante microscopia
a fluorescenza (nel caso si usino proteine quali la GFP) o
mediante colorazioni istochimiche quali il saggio GUS (saggio
di attività beta-glucuronidasica).
Esempio di saggio GUS su un fiore
maturo di Arabidopsis
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Annex
da rivedere
1.
2.
3.
4. Detailed protocol of Activity 3: Tricks to protect a broken heart
5. Science in School Article: A bright future for light microscopy
6. CBE - Life Sciences Education Article: Using a Replica of Leeuwenhoek’s
Microscope to Teach the History of Science and to Motivate Students to
Discover the Vision and the Contributions of the First Microscopists
7. Selection of teaching resources