Presentazione di PowerPoint

Borsa di Studio “Filas”
Identificazione di parametri predittivi di
risposta individuale al trattamento
radioterapico in pazienti oncologici.
Analisi di polimorfismi genetici
potenzialmente responsabili della
radiosensibilità individuale
Candidato: Tommaso Poggioli
Tutor: Dr.ssa Antonella Testa
ENEA Sezione BIOTEC-MED
C.R. Casaccia
Radiosensibilità individuale
Ricerca delle varianti
genetiche che modulano la
radiosensibilità individuale
Radioprotezione
Radioterapia
oncologica
“RT Adverse effects”
“Radiogenomics”
Terapia personalizzata
Studio
delle
varianti
genetiche
associate
a
differenze
interindividuali
nella radiosensibilità
(precoci o tardivi) nei
tessuti sani
Radiosensibilità individuale
Radiosensibilità individuale
Gene
malattia
Gene di
suscettibilità
• Geni ad alta penetranza
• Geni a bassa penetranza
• Interazione di più geni
• Indipendenti dai fattori
ambientali
• Interazione con fattori ambientali
SNP = Polimorfismo a singolo nucleotide
……..G G T A A C T T G …...
……..G G C A A C T T G …...
“ un gene è polimorfico se ha varianti alleliche stabili
all’interno di una popolazione con una frequenza > 1%
e una o più di queste varianti presentano differenze
nell’attività della proteina rispetto alla sua relativa
forma wild-type”
Incidenza: 1 per 1000 - 2000bp
-
Raggi X
Radicali dell’ossigeno
Agenti alchilanti
Reazioni spontanee
- Raggi UV
- PAH
- Raggi X
- Agenti
antitumorali
(cis-Pt, MMC)
- Errori di
replicazione
LESIONI AL DNA
- deaminazione spontanea
citosine(uracile)
- Siti abasici
- 8-IdrossiG
-Rotture a singola elica
- (6-4)Fotoprodotti
- Dimeri di pirimidina
- Addotti
- Legami
inter-elica
- Rotture a
doppia elica
- Appaiamenti
errati A-G e T-C
- Inserzioni e
delezioni
SISTEMI DI RIPARAZIONE
BER
NER
HRR
NHEJ
MMR
Schema sperimentale
Isolamento del
DNA dai
leucociti
50 soggetti sani
1 ml di sangue
Esposizione RX (2 Gy)
0’
RFLP-PCR:
30’ a 37 °C
XPC exon 15 (A939C)
60’ a 37 °C
XRCC1 exon 10 (G399A)
XRCC3 exon 7 (C241T)
Comet Assay
OGG1 exon 7 (C326G)
Lettura bande
ed assegnazione
genotipo
Misura del danno indotto: Tail Moment (TM);
Tail DNA (TD); Residual DNA Damage (RD)
Analisi statistica
Polimorfismo
XRCC1(G Æ A)
OGG1(C Æ G)
XPC(A Æ C)
XRCC3(C Æ T)
Sequenza primer
F GCC CCT CAG ATC ACA CCT AAC
R CAT TGC CCA GCA CAG GAT AA
F CCC AAC CCC AGT GGA TTC TCATTG C
R GGT GCC CCA TCT AGC CTT GCGGCC CTT
F GAT GCA GGA GGT GGA CTC TCT
R GTA GTG GGG CAG CAG CAA CT
F GCT CGC CTG GTG GTC ATC
R CTT CCG CAT CCT GGC TAA AAA
T di annealing Enzima di restrizione Distribuzione genotipi Freq. allelica
61
MspI/ HpaII
60
Fnu4HI /ItaI
61
PvuII
63
Hsp92II/NiaIII
GG
23
CC
28
AA
10
CC
22
GA
22
CG
16
AC
24
CT
24
AA
5
GG
6
CC
16
TT
4
qA = 0,32
qG = 0,28
qC = 0,56
qT = 0,32
I geni XRCC
I geni X-Ray Cross Complementing(XRCC)
• Associazione con diverse forme tumorali
• Differente sensibilità alle radiazioni e
capacità riparativa(linee cellulari)
Gene
XRCC1
XRCC3
Biological Role
Involved in Base Excision
Repair. Scaffold protein, that
interacts with important
enzymes involved in BER
(DNA Pol β, DNA Lig 3,
PARP, etc.)
Involved in Homologous
Recombinational Repair. It is
a member of an emerging
family of RAD-51-related
proteins.
Polymorphism
Frequency
Arg399Gln
0.35
Arg280His
0.04
Arg194Trp
0.06
-77 T>C (5’-UTR)
0.40
Thr241Met
0.41
4541A>G (5’-UTR)
0.18
COMET ASSAY (SCGE) E RIPARAZIONE
COMET ASSAY (SCGE) E RIPARAZIONE
Classi di danno XRCC1 - wt
Classi di danno XRCC1 - het
Classi di danno XRCC1 - homo
DAL DANNO PRIMARIO AL DANNO
CROMOSOMICO: G0 e G2 assays
BER (BASE EXCISION REPAIR)
XRCC1 (chr.19q13.2)
Proteina scaffold che interagisce con gli enzimi del BER- Pol β, Lig 3, PARP1 -2
(Caldecott 2003)
Arg399Gln
SNP
(esone 10)
399 CGA (Arg)
399 CAG (Gln)
CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC[A/G]GAGGTAAGGCCTCACACGCCAACCC
35% popolazione caucasica
Approfondire lo studio del ruolo della
proteina
Produzione di linee cellulari polimorfiche per XRCC1
XRCC1 C>T [Arg194Trp] (esone 6) - rs1799782
XRCC1 G>A [Arg280His] (esone 9) - rs25489
XRCC1 G>A [Arg399Gln] (esone 10) - rs25487
Trasformazione di cellule difettive del gene XRCC1 (EM9)
EM9
AA8
EXV
Exm6X-1 Exm9X-1 Exm10X-1
(Morimoto, 2005)
….dal laboratorio alla ricerca pre-clinica
Collaborazione con:
Azienda sanitaria San Camillo-Forlanini (Prof. Donato)
Dipartimento Biologia-Università RomaTre (Prof. Cozzi)
“Radiosensibilità individuale: Ruolo di polimorfismi genetici nella
risposta ai trattamenti radianti in pazienti Breast Cancer ”
(A)
Valutazione di “RT Adverse
Effect” (acuti e/o tardivi) nei
tessuti sani in pazienti trattati
con radioterapia
Verificare la relazione tra
la risposta alla Radioterapia
e le varianti polimorfiche
Predittività di risposta?
….in corso
(B) Studio di radiosensibilità su pazienti non ancora trattati con
radioterapia
Analisi del danno PRIMARIO e della
cinetica di riparazione (30’-60’) dopo
irraggiamento
(Prof. Cozzi Università di RomaTre)
Analisi della radiosensibilità
cromosomica
Radiosensibilità cellulare
G2 assay (0.5 Gy)
G0 assay (2 Gy)
Radiosensibilità clinica
Scopo: ricerca di fenotipi intermedi “endofenotipi”
(anomalie biologiche misurabili) potenzialmente
associabili al fenotipo clinico
Semin Radiat Oncol 18:126-135 (2008)
CONCLUSIONI
•La naturale estensione di questi studi
sperimentali è la valutazione del profilo di
espressione di alcuni geni (tecnologia
microarrays)
•Il dato sperimentale deve servire come guida
per la scelta dei “gene sets”
• L’approccio integrato tra saggi di danno e
caratterizzazione molecolare può costituire la
strada da seguire per costruire un profilo di
rischio individuale
CONCLUSIONI
•La valutazione del profilo di espressione di
alcuni geni è una naturale estensione degli
studi sperimentali
•Il dato sperimentale deve servire come guida
per la scelta dei “gene sets”
• L’approccio integrato tra saggi di danno e
caratterizzazione molecolare può costituire la
strada da seguire per costruire un profilo di
rischio individuale
Genotipo-Fenotipo intermedio-Fenotipo clinico
“lo stesso medicamento dovrebbe avere
sempre la stessa azione, ma così non è
poiché essa varia molto nei vari casi. I
farmaci evacuanti ora purgano molto, ora
poco, ora giovano, ora nuocciono, secondo i
vari individui in cui sono adoperati”
“De locis in homine” Ippocrate
(IV-V a.C)
Individual polymorphic genes profile
grazie
Future directions
• valutazione degli aplotipi di ciascun gene
• verifica predittività degli “endofenotipi”: clonogenicità,
aberrazioni cromosomiche, pattern espressione RNA m…
• Progetti europei GENEPI 2 (banca di materiale biologico
collezione di tessuti) 15.000 pazienti
submitted…
DNA repair capacity, gene polymorphisms and acute radiotherapy adverse effects in Italian breast
cancer patients
Silvia Sterpone1§, Tommaso Cornetta1§,Valeria Mastellone1, Daniela Giammarino3, Antonella Testa2,
Donatella Tirindelli2, Renata Cozzi 1*, Vittorio Donato3
G2 radiosensitivity assay
Analisi del danno
Il G2 RADIOSENSITIVITY ASSAY
Colcemid
Inizio coltura
PHA, 37°C
0,4 Gray
t71:30
t0
1°giorno
200
metafasi/soggetto
100
Non trattato
100
Trattato
Fissaggio
X-ray
2°giorno
3°giorno
t72
t73
Chromosome radiosensitivity assays
G2 assay
G0 assay
*
3
1,8
*
1,6
2,5
1,4
1,2
2
CtA healthy subjects
CtA patients
CtA* healthy subjects
CtA* patients
1,5
1
0,8
0,6
1
0,4
0,5
0,2
0
0
* p>0,0001
CsA HS
CsA BC
CsA*HS
CsA* BC
Radiosensibilità individuale
“radiogenomica”
Studio delle varianti genetiche
associate a variabilità di risposta
ai trattamenti radianti
Radioterapia
oncologica
Terapia personalizzata
Radioprotezione
“RT Adverse effects”
(precoci o tardivi) nei
tessuti sani
Radiosensibilità individuale
Ricerca delle varianti
genetiche che modulano la
radiosensibilità individuale
Radioprotezione
Radioterapia
oncologica
“RT Adverse effects”
“Radiogenomics”
Terapia personalizzata
Studio
delle
varianti
genetiche
associate
a
differenze
interindividuali
nella radiosensibilità
(precoci o tardivi) nei
tessuti sani
Radiosensibilità individuale
“radiogenomica”
Studio delle varianti
genetiche associate a
variabilità di risposta ai
trattamenti radianti
geni
suscettibilità
scopo: terapia personalizzata
Ricerca “fenotipi intermedi”(endofenotipi) che possano correlare con il
fenotipo clinico (sopravvivenza clonogenica, aberrazioni cromosomiche,
pattern espressione mRNA, differenziazione, interazioni cellula-cellula,etc
Radiosensibilità
individuale
Geni legati alla
radiosensibilità e coinvolti
nei meccanismi di
segnalazione e riparazione
del danno al DNA.
Geni di
suscettibilità
•Più di 120 geni coinvolti nella riparazione
del danno al DNA
•Presenza di numerose varianti polimorfiche
Individual polymorphic genes profile
G2 radiosensitivity assay
Il G2 radiosensitivity assay
Enzima: Msp I
150
soggetti
Estrazione DNA da saliva e
genotipizzazione
XRCC1 Arg399Gln
213 bp
162 bp
51 bp
hom het
Selezione della popolazione
in base al genotipo di XRCC1
e XRCC3
wt hom het het
Enzima: Hsp 92 II
wt
hom wt
M
XRCC3 Thr241Met
215 bp
110 bp
PCR-RFLP
105 bp
wt
hom
wt
hom
het
wt
M
Dal danno primario al danno
cromosomico: G0 e G2 assays
G2 Phase RADIOSENSITIVITY ASSAY
• Saggio di radiosensibilità cromosomica utilizzato per la
valutazione della sensibilità alle radiazioni in vitro
• Analisi del danno cromosomico indotto da raggi X nella fase G2
del ciclo cellulare in linfociti di sangue periferico (PBL)
• Parametro di danno: G2 Phase Index
G2 phase index in soggetti sani e in pazienti Breast Cancer
3
*
2,5
2
healthysubjects
subjects
G2 Ph I healty
G2 Ph I patients
subjects
G2 Ph I* healthy
healty subjects
1,5
G2 Ph I* patients
1
0,5
0
G2 Ph I
HS
G2 Ph I
BC
G2 Ph I*
HS
G2 Ph I*
BC
G2 Ph
I
0,03
0,04
1,24
2,1
SD
0,02
0,04
0,34
0,7
* p<0.0001
G2 Ph I, G2 phase index in non-treated samples;
G2 Ph I *, G2 phase index in samples treated with 0,5 Gy of X-ray
HOMOLOGUS RECOMBINATION REPAIR (HRR)
BIOMARCATORI di EFFETTO
1. Test Micronuclei (Cytokinesis-Block MicroNucleus assay)
1a divisione mitotica
2. Test delle
Aberrazioni
Cromosomiche
G2 radiosensitivity assay
Il G2 radiosensitivity assay
PB
L
Selezione della popolazione
in base al genotipo di XRCC1
e XRCC3
N. soggetti
Totale
Sesso
41
Maschio
Femmina
Età
≤ 40
> 40
13
28
Età media (±SD)
Genotipo
XRCC1 codone 399
Arg/Arg
Arg/Gln
Gln/Gln
XRCC3 codone 241
Thr/Thr
Thr/Met
Met/Met
21
20
38(± 9)
19
7
15
19
11
11
Risultati
Frequenza del danno cromatidico per genotipo
Tabella 2
CtA (ν) ± SD
Non trattato
41
0,030 ± 0,019
1,202 ± 0,373*
1,165 ± 0,371*
•Arg399Arg (wt)
19
0,031 ± 0,017
1,336 ± 0,386
1,310 ± 0,386
•Arg399Gln (het)
7
0,031 ± 0,016
1,100 ± 0,305
1,057 ± 0,305
•Gln399Gln (hom)
15
0,030 ± 0,020
1,080 ± 0,346**
1,033± 0,331**
•Arg399Gln + Gln399Gln (var)
22
0,030 ± 0,019
1,086 ± 0,327*** 1,041 ± 0,316***
•Thr241Thr (wt)
19
0,029 ± 0,013
1,263 ± 0,410
1,226 ± 0,412
•Thr241Met (het)
11
0,035 ± 0,022
1,000 ± 0,261
0,964 ± 0,238
•Met241Met (hom)
11
0,029 ± 0,021
1,300 ± 0,352
1,264 ± 0,356
•Thr241Met + Met241Met(var)
22
0,032 ± 0,013
1,150 ± 0,339
1,114 ± 0,333
Totale
Trattato
G2 phase index
No. Soggetti
Genotipo
XRCC1
XRCC3
* p < 0.0001 differenza significativa con il non trattato (paired Student t-test).
** p ≤ 0.05 differenza significativa confrontando i soggetti wt con i soggetti hom per XRCC1
(unpaired Student t-test).
*** p ≤ 0.05 differenza significativa confrontando i soggetti wt con i soggetti var per XRCC1
(unpaired Student t-test).
BER (BASE EXCISION REPAIR)
XRCC1 (chr.19q13.2)
HOMOLOGUS RECOMBINATION REPAIR (HRR)
Risultati
p-value
Trattato
G2 phase
index
XRCC1-XRCC3 → WT-WT vs VAR-WT
p ≤ 0.05
p ≤ 0.05
XRCC1-XRCC3 → WT-WT vs VAR-VAR
p ≤ 0.05
p ≤ 0.05
XRCC1 / XRCC3
2
XRCC1 / XRCC3
*
*
1,8
1,8
1,6
1,6
1,4
1,4
G2 phase index
G2 phase index
2
1,2
1
0,8
1,2
1
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0
0
wt-wt
var-wt
*p ≤ 0.05 differenza significativa (unpaired Student t-test)
wt-wt
var-var
Sindrome
Caratteristiche cliniche
Xeroderma
Pigmentosum
(XP)
Ipersensibilità alle radiazioni. Alta
incidenza di melanoma. Frequenti
anomalie neurologiche. Invecchiamento
precoce.
Fenotipo cellulare
Ipersensibilità ad UV e ad alcuni agenti chimici.
8 gruppi di complementazione
(da XPA a XPG e XPV).
Geni coinvolti
XPA, XPB
XPC, XPD
XPF, XPG
Sensibilità alla luce solare. Ritardo
mentale (microcefalia). Nanismo.
Ipersensibilità ad UV e a diversi agenti chimici.
Difetti nella trascrizione dopo esposizione a UV.
Alcuni pazienti hanno dei difetti nella trascrizione in
seguito a danno ossidativo.
CSA, CSB
XPB, XPD
XPG
Tricotiodistrofia (TTD)
Pelle sensibile. Fragilità dei capelli.
Frequente ritardo fisico e
mentale.
Deficienze nei sistemi di riparazione.
Risposta immunologia normale in risposta agli UV (al
contrario dei pazienti XP con mutazioni nello stesso gene).
XPB
XPD
Anemia di Fanconi (FA)
Alta incidenza di leucemia. Difetti
anatomici.
Alta
frequenza
di
aberrazioni
cromosomiche
spontanee.Forte attività di ricombinazione. Anormalità
nell’induzione dell’apoptosi.
FAA
FAC
Sindrome di Bloom (BS)
Ipersensibilità alla luce solare. Alta
incidenza di malignità. Ritardo della
crescita.
Instabilità cromosomica spontanea.
Crescita cellulare lenta.
Difetti nella replicazione del DNA.
BLM
Sindrome di Werner
(WS)
Invecchiamento precoce. Ritardo della
crescita.
Iper-ricombinazione. Difetti nell’inizio della sintesi del
DNA e nell’allungamento della catena.
WRN
Ataxia telangiectasia
(AT)
Ataxia cerebrale. Ritardo mentale.
Parziale immunodeficenza.
Predisposizione alla malignità.
Ipersensibilità alle radiazioni ionizzanti e ad alcuni
composti chimici. Aberrazioni cromosomiche spontanee.
Cancro colorettale nonpoliposico (HNPCC)
Alta incidenza di cancro al colon
Difetti nel mismatch repair.
Aumento dell’instabilità dei microsatelliti.
Sindrome di Cornelia de
Lange (CDLS)
Ritardo mentale e della crescita.
Dismorfismo facciale Alterazione degli
arti superiori
Sindrome di Cockayne
(CS)
Sindrome di
Nijmegen(NBS)
Cancro alla mammella
ATM
hMSH2, hMLH1
hPMS1, hPMS2
NIPBL
SMC1, SMC3
Microcefalia. Ritardo della crescita.
Immunodeficenza. Predisposizione al
cancro
Sensibilità alle radiazioni. Traslocazioni cromosomi 7/14
Alta incidenza di cancro alla
Mammella
Cellule deficienti per uno di questi geni presentano
maggiore sensibilità alle radiazioni ionizzanti.
NBS1
BRCA1, BRCA2
G0
POSTER P-12
CsA tot v
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
G2
0
5
10
15
20
15
20
G2- phase assay
Dic
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
5
10
15
20
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
5
10
Breaks
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
5
10
15
20
G2 radiosensitivity assay
Analisi del danno
Il G2 radiosensitivity assay
150
soggetti
Estrazione DNA da saliva e
genotipizzazione
Tabella
Enzima:
Msp1I
XRCC1 Arg399Gln
213 bp
162 bp
51 bp
hom het
Selezione della popolazione
in base al genotipo di XRCC1
e XRCC3
wt hom het het
Enzima: Hsp 92 II
wt
hom wt
M
XRCC3 Thr241Met
215 bp
110 bp
PCR-RFLP
105 bp
wt
hom
wt
hom
het
wt
M
G2 radiosensitivity assay
Analisi del danno
Il G2 radiosensitivity assay
PB
L
Totale
Sesso
Selezione della popolazione
in base al genotipo di XRCC1
e XRCC3
Maschio
Femmina
Età
≤ 40
> 40
Età media (±SD)
Genotipo
XRCC1 codone 399
Arg/Arg
Arg/Gln
Gln/Gln
XRCC3 codone 241
Thr/Thr
Thr/Met
Met/Met
No. di soggetti
41
13
28
21
20
38(± 9)
19
7
15
19
11
11
BER (BASE EXCISION REPAIR)
XRCC1 (chr.19q13.2)
Proteina scaffold che interagisce con gli enzimi del BER- Pol β, Lig 3, PARPSNP
(esone 10)
399 CGA (Arg)
399 CAG (Gln)
CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC[A/G]GAGGTAAGGCCTCACACGCCAACCC
35% popolazione caucasica
•BER (BASE EXCISION REPAIR)
•Riparazione diretta SSBs
•DSBs
(Levy et al., 2006 Nucleic Acid Research)
Risultati
Frequenza del danno cromatidico per genotipo
Tabella 2
CtA (ν) ± SD
No. Soggetti 0,030
Non trattato
Trattato
±
Totale
41
0,019
1,202 ± 0,373*
G2 phase index
1,165 ± 0,371*
Genotipo
XRCC1
0,031 ±
0,017
0,031
±
1,336 ± 0,386
1,310 ± 0,386
1,100 ±± 0,305
1,080
0,346**
1,086
±
1,057 ± 0,305
•Arg399Arg (wt)
19
•Arg399Gln (het)
7
•Gln399Gln (hom)
15
0,016
0,030
±
0,020
0,030
±
•Arg399Gln + Gln399Gln (var)
22
0,019
XRCC3
•Thr241Thr (wt)
19
0,029 ±
0,013
0,035
±
•Thr241Met (het)
11
•Met241Met (hom)
•Thr241Met + Met241Met(var)
0,327***
1,033±±0,331**
1,041
0,316***
1,263 ± 0,410
1,226 ± 0,412
1,000 ± 0,261
0,964 ± 0,238
11
0,022
0,029
±
0,021
0,032
±
1,300 ± 0,352
1,264 ± 0,356
22
0,013
1,150 ± 0,339
1,114 ± 0,333
* p < 0.0001 differenza significativa con il non trattato (paired Student t-test).
** p ≤ 0.05 differenza significativa confrontando i soggetti wt con i soggetti hom per XRCC1
(unpaired Student t-test).
*** p ≤ 0.05 differenza significativa confrontando i soggetti wt con i soggetti var per XRCC1
(unpaired Student t-test).
Risultati
P-value
XRCC1 → WT vs VAR
G2 phase index
p ≤ 0.05
p ≤ 0.05
XRCC3
2
XRCC1
2
*
1,8
1,8
1,6
1,6
1,4
1,4
1,2
1,2
CtA (ν)
CtA (ν)
Trattato
1
0,8
1
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0
0
C wt
C var
X-ray w t
X-ray var
*p ≤ 0.05 differenza significativa (unpaired Student t-test)
C wt
C var
X-ray w t
X-ray var
G2 radiosensitivity assay
Analisi del danno
Il G2 RADIOSENSITIVITY ASSAY
Colcemid
Inizio
coltura
0,4 Gray
PHA, 37°C
t71
t0
24 h
0h
200
metafasi/soggetto
100
Non trattato
Fissaggio
X-ray
100
Trattato
48 h
t72
72 h
t73
CONCLUSIONI
-XRCC1 exon 10 (G399A): i dati mostrano che gli individui omozigoti per l’allele variante
hanno un minore numero di rotture per cellula (al tempo 0’, 30’ e 60’), rispetto agli
individui wt. Inoltre mostrano una riduzione significativa del danno residuo dopo 60’;
-XPC exon 15 (A939C): i dati mostrano che gli individui eterozigoti per l’allele variante
hanno un minore numero di rotture per cellula a 60’ rispetto agli individui wt ed una
riduzione significativa del danno residuo a 60’;
- XRCC3 exon 7 (C241T) e OGG1 exon 7 (C326G): i dati non presentano differenze
significative tra individui con almeno un allele variante ed individui wt;
- L’analisi statistica per la combinazione delle diverse varianti polimorfiche non ha
prodotto risultati significativi.
Prospettive:
◊ Valutazione dell’influenza della combinazione di più genotipi;
◊ Correlare le varianti polimorfiche con l’eventuale modulazione della
funzione proteica.
2h
Colcemid
X-Ray
…DNA repair gene polymorphisms
XRCC1
27%
(chr.
chr.19q13.2)
SNP
399 CGA (Arg)
(esone 10)
399 CAG (Gln)
•BER (BASE EXCISION REPAIR)
•Direct repair of SSBs
•DSBs
(Levy et al., 2006 Nucleic Acid Research)
XRCC3
23%
241 ACG(Thr)
(Chr 14q32.3)
SNP
(esone 7)
241 ATG (Met)
•HOMOLOGUS RECOMBINATION REPAIR
(HRR)
Distribuzione frequenze
CsA tot v
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
5
G2- phase assay
10
15
20
15
20
15
20
Dic
3,5
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
0
5
10
15
5
10
20
Breaks
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
5
10
… previous results
XRCC1 gene seems to have a main role in DNA damage induction
Previous studies (collaboration with “RomaTRE” University)
XRCC1 variant showed a lower residual damage 60’ after X-ray treatment (2Gy)
COMET ASSAY
Wt BRCT1 domain
Polymorphic BRCT1 domain
“Monaco et al., Protein J, in press”
XRCC1 Arg399Gln polymorphism affects BRCT1 region, in which PARP, Lig3,
Pol β, PNK interact.
Probably modulating XRCC1 scaffold activity during SSB or DSBs repair
NER
XPC
Nucleotide Excision Repair
XPC 939 Lys[A]-->Gln[C]
Esone N°:15
AGCTTCCCACCTGTTCCCATTTGAG[A/C]AGCTGTGAGCTGAGCGCCCACTAGA
Chr. Loc.: 3p25
refSNP ID: rs2228001
Organism:
human (Homo
sapiens)
Molecule Type:
Genomic
Created/Update
d in build:
98/123
Genome Build:
Allele
Variation
Class:
Alleles:
35.1
Ancestral
Allele:
SNP: single
nucleotide
polymorphism
A/C
Proteina che si lega a HR23B
per formare il complesso XPCHR23B, importante per
identificare le lesioni al DNA
T
Variation Summary:
Assay sample size (number of chromosomes):
532
Population data sample size (number of chromosomes): 1878
Total number of populations with frequency data:
7
Total number of individuals with genotype data:
363
Hardy-weinberg Probability:
Pr(chiSq= 0.146,df=1) = 0.752
0.437
Average estimated heterozygosity:
Average Allele Frequency:
A
C
0.678
0.322
BER (BASE EXCISION REPAIR)
XRCC1 (chr.19q13.2)
Proteina scaffold che interagisce con gli enzimi del BER- Pol β, Lig 3, PARPSNP
(esone 10)
399 CGA (Arg)
399 CAG (Gln)
CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC[A/G]GAGGTAAGGCCTCACACGCCAACCC
35% popolazione caucasica
•BER (BASE EXCISION REPAIR)
•Riparazione diretta SSBs
•DSBs
(Levy et al., 2006 Nucleic Acid Research)
DANNO AL DNA
CANCRO
REPLICAZIONE
RIPARAZIONE
DEL DNA
•Mutazioni
•Errori di replicazione
•Danno al DNA persistente
•Instabilità genomica
INVECCHIAMENTO
BER
XRCC1
Base Excision Repair
XRCC1 399 Arg[G]-->Gln[A]
Esone N°: 10
CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC[A/G]GAGGTAAGGCCTCACACGCCAACCC
Chr Loc.: 19q13.2
refSNP ID: rs25487
Organism:
human (Homo
sapiens)
Molecule Type:
Genomic
Created/Update
d in build:
71/121
Genome Build:
Allele
Variation
Class:
Alleles:
35.1
Ancestral
Allele:
SNP: single
nucleotide
polymorphism
A/G
Not available
Variation Summary:
Assay sample size (number of chromosomes):
1462
Population data sample size (number of chromosomes): 940
Total number of populations with frequency data:
8
Total number of individuals with genotype data:
702
Hardy-weinberg Probability:
Pr(chiSq= 0.819,df=1) = 0.371
0.402
Average estimated heterozygosity:
Proteina scaffold, che
interagisce con importanti
enzimi coinvolti nel BER
(DNA pol β, DNA lig 3,
PARP, etc.)
Average Allele Frequency:
G
A
0.721
0.279
BER
OGG1
Base Excision Repair
OGG1 326 Ser[C]-->Cys[G]
Esone N°: 7
CTGTTCAGTGCCGACCTGCGCCAAT[C/G]CCGCCATGCTCAGGAGCCACCAGCA
Chr loc : 3p26.2
refSNP ID: rs1052133
Organism:
human (Homo
sapiens)
Molecule Type:
Genomic
Created/Update
d in build:
86/125
Genome Build:
Allele
Variation
Class:
Alleles:
35.1
Ancestral
Allele:
SNP: single
nucleotide
polymorphism
Glicosilasi/AP Liasi che
taglia l’8-OH-G nel DNA.
C/G
Not available
Variation Summary:
Assay sample size (number of chromosomes):
1203
Population data sample size (number of chromosomes): 742
Total number of populations with frequency data:
7
Total number of individuals with genotype data:
425
Hardy-weinberg Probability:
Pr(chiSq= 6.325,df=1) = 0.020
0.400
Average estimated heterozygosity:
Average Allele Frequency:
G
C
0.276
0.724
NER
XPC
Nucleotide Excision Repair
XPC 939 Lys[A]-->Gln[C]
Esone N°:15
AGCTTCCCACCTGTTCCCATTTGAG[A/C]AGCTGTGAGCTGAGCGCCCACTAGA
Chr. Loc.: 3p25
refSNP ID: rs2228001
Organism:
human (Homo
sapiens)
Molecule Type:
Genomic
Created/Update
d in build:
98/123
Genome Build:
Allele
Variation
Class:
Alleles:
35.1
Ancestral
Allele:
SNP: single
nucleotide
polymorphism
A/C
Proteina che si lega a HR23B
per formare il complesso XPCHR23B, importante per
identificare le lesioni al DNA
T
Variation Summary:
Assay sample size (number of chromosomes):
532
Population data sample size (number of chromosomes): 1878
Total number of populations with frequency data:
7
Total number of individuals with genotype data:
363
Hardy-weinberg Probability:
Pr(chiSq= 0.146,df=1) = 0.752
0.437
Average estimated heterozygosity:
Average Allele Frequency:
A
C
0.678
0.322
STUDI DI ASSOCIAZIONE
GENE POLIMORFISMO ASSOCIAZIONE
XRCC1
399 GÆA
OGG1
326 CÆG
XPC
XRCC3
939 AÆC
241 CÆT
Tumore alla vescica
Tumore al seno
Tumore alla pelle
Tumore all’esofago
Tumore al polomone
Tumore alla prostata
Tumore alla vescica
Tumore al polmone
Tumore alla pelle
REF.
Stern et al (2001); Matullo et al (2001)
Duell et al (2001)
Nelson et al (2002); Sturgis et al (1999)
Xing et al (2001)
Sugimura et al (1999) ; Wilkman et al (2000)
Xu et al (2002)
Sanyal S et al (2004)
Butkiewicz et al (2001)
Winsey et al (2000)
COMET ASSAY (SCGE) E RIPARAZIONE
Esistono diversi modi per valutare la riparazione del danno al DNA
con il COMET ASSAY Æ CELLULAR REPAIR ASSAY
Le cellule vengono trattate con
un agente che danneggia il
DNA, incubate, e la rimozione
del danno viene monitorata.
Misura delle rotture a singolo e
doppio
filamento
(COMET
ASSAY ALCALINO).
Misura di siti sensibili sul DNA
(passaggio di incubazione con
enzimi):
FPG; EndoIII; UV EndoV; AlkA
ANALISI DEI POLIMORFISMI
Polimorfismo
XRCC1(G Æ A)
OGG1(C Æ G)
XPC(A Æ C)
XRCC3(C Æ T)
Sequenza primer
F GCC CCT CAG ATC ACA CCT AAC
R CAT TGC CCA GCA CAG GAT AA
F CCC AAC CCC AGT GGA TTC TCATTG C
R GGT GCC CCA TCT AGC CTT GCGGCC CTT
F GAT GCA GGA GGT GGA CTC TCT
R GTA GTG GGG CAG CAG CAA CT
F GCT CGC CTG GTG GTC ATC
R CTT CCG CAT CCT GGC TAA AAA
T di annealing Enzima di restrizione Distribuzione genotipi Freq. allelica
61
MspI/ HpaII
60
Fnu4HI /ItaI
61
PvuII
63
Hsp92II/NiaIII
GG
23
CC
28
AA
10
CC
22
GA
22
CG
16
AC
24
CT
24
AA
5
GG
6
CC
16
TT
4
qA = 0,32
qG = 0,28
qC = 0,56
qT = 0,32
Schema sperimentale
Isolamento del
DNA dai
leucociti
50 soggetti sani
1 ml di sangue
Esposizione RX (2 Gy)
0’
RFLP-PCR:
30’ a 37 °C
XPC exon 15 (A939C)
60’ a 37 °C
XRCC1 exon 10 (G399A)
XRCC3 exon 7 (C241T)
Comet Assay
OGG1 exon 7 (C326G)
Lettura bande
ed assegnazione
genotipo
Misura del danno indotto: Tail Moment (TM);
Tail DNA (TD); Residual DNA Damage (RD)
Analisi statistica