Inibitori GST - Università di Catanzaro Facoltà di Farmacia

Università degli Studi “Magna Graecia” di Catanzaro
Facoltà di Farmacia
Scuola di Specializzazione in Farmacia Ospedaliera
Inibitori della glutatione-S-transferasi
Dott.ssa Teresa Cerchiara
Anno Accademico 2006-2007
Introduzione
Il successo terapeutico nel trattamento dei tumori spesso è limitato dallo sviluppo della resistenza al
farmaco. Generalmente la resistenza può essere di due tipi: intrinseca o acquisita. Diversi
meccanismi sono coinvolti nel processo di resistenza e questi includono alterazioni nel trasporto e
di conseguenza alterazioni nel metabolismo del farmaco [1].
L’enzima glutatione-S-transferasi (GST) è una delle molecole coinvolte nel fenomeno della
resistenza a diverse famiglie di chemioterapici e in particolar modo è coinvolto nella resistenza agli
agenti alchilanti. La sua azione fisiologica consiste nella coniugazione di diverse sostanze (farmaci,
metaboliti) al glutatione ridotto per la loro eliminazione dall’organismo.
Il tripeptide γ-glutamilcisteinglicina o glutatione (GSH) è, infatti, il regolatore non enzimatico più
importante dell’omeostasi redox intracellulare ed è presente ubiquitariamente in tutti i tipi di cellule
a concentrazioni millimolari [2]. Questo tripeptide (Fig. 1), contenente cisteina, esiste sia in forma
ridotta (GSH) che in forma ossidata (GSSG), meglio indicata come glutatione bisolfuro, e prende
parte alle reazioni redox grazie all’ossidazione reversibile dei suoi gruppi tiolici attivi [3, 4].
Fig. 1. Struttura chimica di GSH
Nella cellula, in condizioni redox normali, la maggior parte del GSH è in forma ridotta ed è
distribuito nel nucleo, nel reticolo endoplasmatico e nei mitocondri. Oltre che in forma libera, il
GSH, mediante un processo chiamato glutationilazione, può anche essere legato covalentemente a
proteine, regolandone la funzione o fungendo da coenzima in sistemi enzimatici antiossidanti [5]. Il
GSH può quindi agire direttamente da scavenger di radicali liberi e di xenobiotici elettrofili, oppure
da substrato per le glutatione perossidasi (GPxs) e glutatione S-transferasi (GSTs), durante i
processi di detossificazione del perossido di idrogeno, di idroperossidi lipidici e di composti
elettrofili.
Nell’uomo e nei mammiferi sono state identificate e caratterizzate 7 diverse classi di glutatione Stransferasi appartenenti ad un’unica famiglia di enzimi solubili citosolici e, solo recentemente, sono
state identificate altre due famiglie di enzimi a localizzazione rispettivamente mitocondriale e
microsomiale (MAPEG) [6]. Tutte le GSTs hanno la funzione di detossificare sostanze
2
xenobiotiche dannose, come sostanze chimiche cancerogene, sostanze inquinanti ambientali e
agenti antitumorali. Tali enzimi svolgono, inoltre, un’azione protettiva contro sostanze
potenzialmente tossiche prodotte nella cellula in seguito all’esposizione a contaminanti ambientali o
al consumo di cibi cotti alla brace o contaminati con micotossine o di acqua inquinata [6]. Le GSTs
esercitano queste azioni protettive grazie alla loro capacità di catalizzare la coniugazione del GSH
con i prodotti finali dell’ossidazione (Fig. 2).
L’attività sia della glutatione perossidasi (GPxs) che delle GSTs comporta un abbassamento del
livello totale del GSH intracellulare ed un aumento del GSSG. Questo aumento è potenzialmente
molto citotossico, in quanto porta alla formazione di ponti disolfuro nelle proteine cellulari. Al fine
di mantenere costante il rapporto GSH/GSSG, il GSSG viene rilasciato dalla cellula e degradato
nell’ambiente extracellulare. Durante le reazioni mediate dalle GST, inoltre, il GSH si coniuga a
varie sostanze elettrofile, e gli addotti così formati vengono secreti attivamente dalla cellula, con
ulteriore deplezione di GSH se la concentrazione della sostanza elettrofila è maggiore della capacità
di biosintesi [7]. Il GSH cellulare può essere rigenerato in seguito a riduzione del GSSG formatosi,
oppure sintetizzato ex novo.
La riduzione del GSSG a GSH è catalizzata dalla glutatione reduttasi (GRed), che utilizza come
agente riducente il NADPH, prodotto dal ciclo dei pentoso-fosfati, ed è quindi dipendente dalla
efficienza di tale via metabolica [8].
Il GSH può essere sintetizzato ex novo attraverso due reazioni sequenziali, ATP-dipendenti,
catalizzate rispettivamente dalla γ-glutamilcisteina sintetasi (γGCS), la cui attività limita la velocità
di sintesi, e dalla glutatione sintetasi. Altri fattori che intervengono nella regolazione della sintesi
del GSH sono la disponibilità di cisteina e la concentrazione stessa di GSH che funge, con un
meccanismo di feedback negativo, da inibitore dell’attività della γGCS [9].
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Fig. 2
Classificazione di GST
Nell’uomo e nei mammiferi, le GSTs sono state classificate come Alpha (α), Mu (μ), Pi (π), Kappa
(κ) e Theta (θ) per la sequenza simile dell’amminoacido N-terminale, per la specificità del substrato
e per la reattività [10, 11, 12, 13].
Le classi più nuove delle GSTs come Sigma (σ), Zeta (ζ) e Beta (β) sono state isolate e
caratterizzate prevalentemente da batteri, piante, insetti e pesci [12, 13].
La maggior parte degli studi sulle GSTs sono stati focalizzati sulla purificazione e sulla
caratterizzazione delle varie isoforme [14, 15, 16, 17].
Accanto alle quattro maggiori classi di GSTs studiate (α, θ, μ e π), le isoforme delle nuove GSTs
sono state studiate in dettaglio prevalentemente sugli insetti [18, 19]. Infatti si è visto che le GSTs
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di Schistosoma japonicum hanno una struttura simile alle GSTs citosoliche della classe μ, giocando
un ruolo importante nel sistema di difesa dei parassiti.
Chomilier et al. [20] hanno realizzato la struttura cristallografica della GST da Schistosoma
mansoni (Fig. 3)
Fig. 3. GST da Schistosoma mansoni.
Inibitori della glutatione S-transferasi (GST)
La GST svolge un ruolo importante nella difesa della cellula dagli insulti esterni, molti studi hanno
anche trovato un forte legame tra la resistenza al farmaco e gli enzimi GST, particolarmente quelli
appartenenti alla classe π ed α. In letteratura sono riportati un vasto numero di inibitori delle GST
con differenti gradi di specificità di isoenzima.
In particolare, l’acido etacrinico (EA), diuretico utilizzato in campo clinico, è stato ampiamente
studiato ed è stato trovato che inibisce efficacemente tutti gli isoenzimi GST [6] agendo sulla
reazione catalizzata da GST tra il clorambucile e GSH. Ciò conferma che gli inibitori delle GST
interferiscono con la reazione di coniugazione degli agenti alchilanti mediata da GST influenzando
l’efficacia dei farmaci [21].
Adang et al. [22] hanno sintetizzato una serie di analoghi del glutatione contenente un gruppo
sulfidrilico e il gruppo C-terminale della glicina è stato sostituito da diversi amminoacidi. Questi
composti sono stati usati come co-substrati nelle reazioni catalizzate sulle classi α e μ delle GST
con 1-cloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) come substrato elettrofilo.
Derivati alchilici del GSH sono stati sintetizzati da Procopio et al. [23]. E’ stato dimostrato che
queste molecole, il cui modello cristallografico è riportato nella figura 4, inibiscono le GST-π
umane, presenti in molti tipi di tumori.
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Fig. 4
Recentemente, particolare attenzione è stata rivolta alla GST π 1-1, che è uno degli isoenzimi GST
più ricchi in cisteina, infatti presenta 4 residui di cisteina localizzate in posizione 14, 47, 101 e 169.
Inoltre, è stato visto che la cisteina in posizione 47 è localizzata vicino al sito di legame del GSH
(sito G), ed è importante per l’attività catalitica mentre è una posizione critica per la conformazione
e la stabilità del sito G [24]. La cisteina in posizione 101 è, invece, localizzata all’interfaccia del
dimero e può formare ponti disolfuro con la cisteina in posizione 47, portando all’inattivazione
dell’enzima. Sia la cisteina in posizione 47 che quella in posizione 101 sono note per essere
accessibili alle molecole di solvente, mentre la cisteina in posizione 14 e 169 sono localizzate nella
parte idrofobica e sono, quindi, meno accessibili. Sulla base di queste osservazioni, Ang et al. [26]
hanno sintetizzato complessi organometallici di rutenio coniugati all’acido etacrinico e hanno
valutato l’attività inibitoria sulle GST (Fig. 5).
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Fig. 5
I complessi organometallici di rutenio come (η6-arene) rutenio imidazolo (Fig. 6) e i complessi di
(η6-arene) rutenio con 1,3,5-triazo-7-fosfatotriciclo[3.3.1.1]decano sono studiati come molecole
antitumorali.
Fig. 6
Nella figura 7 è riportata l’analisi cristallografica ai Raggi X del composto 2 dei complessi
organometallici del rutenio sintetizzato secondo lo schema riportato nella figura 6. Le caratteristiche
strutturali della molecola dell’acido etacrinico nel ligando acido etacrinico-imidazolo sono simili a
7
quelle degli altri ligandi dell’acido etacrinico. Inoltre, le distanze per Ru-cymene e Ru-Cl sono
rispettivamente 1.667 e 2.442 Ǻ e sono simili agli altri complessi del rutenio monosostituiti.
Fig. 7. Modello molecolare del composto 2. Si riportano lunghezza del legame [Ǻ] e gli angoli [°] (la deviazione
standard è riportata in parentesi): Ru1-Cav 2.192, Ru 1-cimene 1.667(4), Ru 1-Clav 2.442(6); Ru1-N1, 2.133(8); N1-C11,
1.310(13); N2-C11, 1.358(12); C12-C13, 1.365(14); Cl-Ru-Cl, 88.32(10).
Come l’acido etacrinico, i complessi organometallici di rutenio sono degli inibitori efficaci su GST
π 1-1, infatti l’attività inibitoria di questi complessi è stata studiata su GST π-positiva A2780 e
A2780cisR della linea cellulare del tumore ovarico.
Accanto agli inibitori di GST ottenuti per sintesi, esistono sostanze presenti in natura che
presentano tale attività. E’ il caso della curcumina e dell’acido ellagico, presenti in molti prodotti
naturali. Hayeshi et al. [26] ha, infatti, dimostrato che sia l’acido ellagico che la curcumina hanno
un’attività inibitoria tempo e concentrazione dipendente su GST μ 1-1, μ 2-2 e π 1-1.
Udenigwe et al. [27] hanno isolato e caratterizzato 5 composti dall’estratto alcolico della
Caesalpinia bonduc. L’attività inibitoria nei confronti di GST può essere attribuita alla reazione di
coniugazione del GSH formata dai composti secondo lo schema di Michaelis-Menten.
La caratterizzazione dei composti è stata limitata all’analisi H-NMR, poiché non è stato possibile
cristallizzare i composti per poter effettuare gli studi cristallografici ai raggi X.
Conclusioni
In letteratura esiste una vasta gamma di lavori sugli inibitori delle GSTs. E’ comunque importante
sottolineare che la maggior parte degli studi riportati è stata condotta in sistemi in vitro ed è quindi
8
necessario avere una conferma dei risultati con studi in vivo per un’eventuale impiego di tali
composti in campo farmaceutico.
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