7- proprietà elettr..

Capitolo 4
Proprietà elettrofisiologiche e sinaptiche dei neuroni derivati da NSC adulte
Capitolo 4:
Proprietà elettrofisiologiche e
sinaptiche dei neuroni derivati da
NSC adulte
Come già detto, il cervello mammifero adulto contiene precursori multipotenti e
indifferenziati chiamati cellule staminali neurali.
Queste, come spiegato nei protocolli precedenti, possono essere isolate, e coltivate in vitro
per un lungo periodo avendo la capacità di proliferare formando neurosfere che possono
essere dissociate e così via. Essendo progenitori multipotenti queste cellule staminali possono
differenziare se opportunamente stimolate e diventare neuroni, astrociti e oligodendrociti.
Ma la domanda può sorgere spontanea: queste cellule differenziate (neuroni e glia) “stem
cells-deriveded” hanno proprietà elettrofisiologiche caratteristiche di neuroni (e glia)?
Una cosa è certa, a livello proteico siamo sicuri che il differenziamento sia avvenuto in
quanto tecniche di immunostaining, come già detto, mostrano l’espressione selettiva dei 3
differenti marker: GALC per gli oligodendrociti, GFAP per gli atrociti e Tuj1 per i neuroni
(figura 1) [Westerlund03]. Ma elettrofisiologicamente?
figura 1: immunostaining
Il ”signaling” neuronale dipende da rapidi cambiamenti nel potenziale elettrico attraverso la
membrana neurale. Questi cambiamenti sono possibili grazie ai canali ionici che sono capaci
di condurre ioni attraverso il bilayer con un “rate” di più di 108 ioni/secondo. I canali hanno
tre obiettivi importanti:1) far passare gli ioni attraverso la membrana; 2) selezionare specifici
ioni; 3) aprire e chiudere i pori in risposta a specifici stimoli.
Sebbene la membrana delle cellule gliali classicamente fosse considerata contenente solo
canali k+ passivi, è stato stabilito che le gliali contengono anche altri canali ionici come per
esempio i canali Na+ voltaggio-dipendenti. Quindi un obiettivo differenziamento tra neuroni e
gliali può essere meglio spiegato elettrofisiologicamente.
I neuroni maturi, caratteristicamente, generano potenziali d’azione singoli e multipli che
sono “overshooting” (il potenziale va al di là di 0mV) e sono “short-lasting” (durano meno di
2 ms). La fase ascendente del potenziale d’azione è causata da una rapida inattivazione delle
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correnti Na+ che vengono bloccate dalla TTX, mentre la fase discendente del potenziale
d’azione dipende dai canali K+, specialmente il canale IA che è veloce ad inattivarsi in
presenza di 4-AP(4-aminopyridine) e il canale Ik che è lento ad inattivarsi in presenza di TEA
( tretraetyllammonium ).
Le cellule staminali differenziate (human svz), utilizzando il metodo patch-clamp a differenti
stadi di differenziamento, hanno mostrato i seguenti segnali:
 Cellule giovani neuron-like (day 7-11, passaggio=15) hanno mostrato un potenziale di
riposo di membrana di -49 +- 2 mV e una resistenza di input di 653 Mohm, e una carica di
membrana a tempo costante, di 30 +- 3 ms.
 Cellule mature neuron-like (day 16-25) mostrano un potenziale di membrana a riposo più
negativo (-58 +- 3mV) e una resistenza di input più bassa (396 +- 21). Inoltre queste
cellule tendono ad avere un certo “time costant” più piccolo (24 +- 2ms).
Questi risultati sono congruenti con le osservazioni fatte nel cervello in sviluppo.
Le cellule glial-like (day 16-25) differeriscono dalle cellule neuron-like per un potenziale di
riposo di membrana più negativo (-68 +- 3mV), una resistenza di input più bassa (84 +- 12
Mohm) e un tempo costante più veloce (8 +- 2ms).
Degli stimoli depolarizzanti possono essere evocati in alcune cellule “neuron-like day9” (fig.
2 sx)
figura 2: potenziali d’azione a 9, 12, 16 giorni
Pochi giorni dopo, gli impulsi depolarizzanti creano un singolo potenziale d’azione
immaturo (figura 2 centro) mentre in neuroni “day 16” si osservano potenziali d’azione più
maturi (figura 2 dx).
C’è comunque da dire che ci sono variazioni considerevoli nel rate di sviluppo. In generale,
lo sviluppo è più veloce in aree più popolate di cellule. 10 neuroni su 15 (67%) registrati in
“day 16-25” hanno un corretto equilibrio tra i canali per sostenere la generazione di potenziali
d’azione ripetitivi (figura 3 sx). la TTX che blocca i canali sodio elimina i potenziali d’azione
(figura 3 dx).
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figura 3: potenziali d’azione
Nel voltage clamp, impulsi depolarizzanti evocano una iniziale corrente interna breve (figura
3 inserto sx). La corrente è attivata da un potenziale di membrana di circa -60mV ed è stata
completamente bloccata dalla TTX (figura 3 inserto dx). Questo assomiglia alla classica
corrente di sodio INa .13 neuroni su 15 (87%) “day 16-25” testati esprimono queste correnti.
La veloce corrente interna è seguita da una corrente esterna che è stata analizzata dopo la
TTX. La corrente esterna è attivata tra i -50 e i -40 mV e incrementata nel range testato
(figura 4):
figura 4: corrente interna ed esterna
Questa ha una componenete transiente che fa un picco in 20 ms e scompare dopo il 4-AP.
(figura 4 centro). La corrente assomiglia alla corrente di potassio IA . la componente
lentamente inattivante che è rimasta dopo l’applicazione di 4-AP è stata quasi del tutto
bloccata da TEA (figura 4 basso). Questo assomiglia alla corrente Ik . 14 su 15 neuroni (97%)
testati esprimono sia correnti IA che correnti Ik. [Westerlund03]. Questo lavoro mostra come
cellule neurali differenziate da cellule staminali neurali maturino mostrando caratteristiche
elettrofisiologiche neurali classiche.
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Per quanto riguarda le sinapsi, un recente studio [Hiroki04] ha mostrato come cellule
staminali neurali adulte isolate dall’ippocampo di ratti (coltivate su un layer gliale) ,
differenziando ( tramite BDNF ) in neuroni, dimostrino di aver formato sinapsi ( pre- e post-)
glutamaerciche e GABAergiche (dell’acido gamma aminobutirrico) funzionali in vitro. Lo
studio è stato condotto utilizzando tecniche classiche di immunostaining e i seguenti anticorpi:
sinaptobrevina (C) e sinaptophisina (F) per marcare le vescicole sinaptiche e i bottoni
sinaptici:
figura 5:marcatura di vescicole sinaptiche e bottoni sinaptici
Come mostra la figura 5, entrambi gli anticorpi marcano vescicole e bottoni sinaptici
funzionali.
Inoltre è stata dimostrata l’esistenza di sinapsi in vitro anche mediante l’uso di tecniche
fisiologiche a supporto dell’apparenza morfologica (figura 6). I dati mostrano come la
maturazione neuronale avvenga in 18 giorni e come l’incremento nell’ampiezza delle correnti
dei canali di sodio e la comparsa dei potenziali d’azione suggeriscano che la funzionalità dei
canali avvenga gradualmente durante la cultura.
tabella 1: profili elettrofisiologici
Inoltre l’incremento nei potenziali a riposo di membrana suggerisce lo sviluppo di altre
componenti di canali ionici di membrana come canali di potassio e proteine trasportatrici,
che contribuiscono anche alla generazione dei potenziali d’azione maturi.
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figura 6: mPSCs
Le immagini sopra riportate ci mostrano come i mPSCs (micropotential sinaptic currents)
con cinetica rapida (6,3 ms) siano glutamaergici attraverso l’attivazione dei recettori
glutammaergici AMPA-type (exitatory mPSCs) perché vengono bloccati da 10 microM di
DNQX ( 6,7-dinitoquinoxalina-2,3-dione) ma non da 20microM di bicuculline. I mPSCs
rimanenti, ovvero quelli con cinetica più lenta (15,3 ms) sono GABAergici mediati da
recettori GABA (inibitory mPSCs) dato che vengono bloccati da 20microM di bicuculline ma
non da 10microM di DNQX
figura 7: trasmissione GABA ergica
In conclusione possiamo dire che c’è evidenza sperimentale dell’esistenza di sinapsi
funzionali in colture di cellule neurali derivate da cellule staminali neurali.
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