Genetica dei Microorganismi ed Applicata a

Genetica dei Microorganismi ed Applicata a.a. 2011-13
(Biologia della Nutrizione)
- Chimica della sintesi del DNA, modelli per la replicazione del DNA ed esperimento di Meselson e
Stahl. Polimerasi I , II e III di E. coli e loro meccanismo d'azione (sito catalitico). Proteine associate
al DNA (primasi, elicasi, topoisomerasi, SSB) e ruolo di queste nella replicazione del DNA.
Meccanismo della replicazione nei batteri ed in lievito. Origini di replicazione (oriC e ARS).
- Genetica batterica. La trasformazione e la competenza naturale. Mappatura di geni mediante
trasformazione. La scoperta della coniugazione, esperimenti di Lederberg & Tatum ed tubo a U di
Davis, il fattore F, ceppi Hfr. Mappatura dei geni mediante coniugazione interrotta (esp. Wollman
& Jacob). Il fattore F' e la sexduzione. La scoperta della trasduzione (esperimento di Zinder e
Lederberg). La trasduzione generalizzata e specializzata. Meccanismo della trasduzione con
lambda.
- Esperimenti di K. Mullis, meccanismo della PCR, la Taq polimerasi, scelta dei primers e
specificità della PCR. Principali applicazioni della PCR.
- Le endonucleasi di restrizione. Scoperta del sistema modificazione-restrizione: Eco-k, Eco-B.
Generalità sugli enzimi di restrizione di tipo I, II e III. Uso delle endonucleasi di restrizione di tipo
II nellla manipolazione del DNA (estremità 5', 3' protrudine e blunt). Isoshizomeri. Definizione di
Unità e condizioni di taglio. Costruzione di una mappa di restrizione.
- Il codice genetico (generalità), esperimenti che hanno portato alla delucidazione del codice (esp. di
Nirenberg), uso del codice, le aminoacil-tRNA sintetasi, mutazioni missenso, nonsenso e
frameshift, tRNA soppressori.
- La Trascrizione (generalità), promotori batterici ed eucariotici, la RNA polimerasi batterica. Il
fattore sigma 70 e fattori alternativi. Elongazione e terminazione della trascrizione (terminatori
intrinseci e Rho dipendenti). Mutazioni polari.
- Il DNA ricombinante (cenni storici), mappe di restrizione, tecniche di blotting (Northern e
Southern bot). Marcatura del DNA (Random primer, Nick traslation e marcatura terminale mediante
fill-in e polinucleotide chinasi). Defosforilazione del DNA e reazione di ligasi. Clonaggio di un
cDNA ed uso dei linkers. Terminal trasferasi e saldatura prodotti di PCR. Plasmidi (pBR322,
pUC19), purificazione del DNA plasmidico (ultracentrifugazione su ClCs e lisi alcalina). Metodi di
sequenziamento del DNA (Maxam e Gilbert, Ranger), sistemi automatizzatiti di sequenziamento Le
procedure di ultima generazione per il sequenziamento di genomi (pirosequenziamento, 454,
Illumina). Tecniche di mutagenesi del DNA (geni artificiali, mutagenesi a cassetta, metodi basati su
primer extension e PCR). Vettori non plasmidici (lambda, M13 e derivati, cosmidi). Vettori per il
clonaggio grossi frammenti di DNA (PAC, BAC e YAC). Banche genoniche e di cDNA. Vettori di
espressione (pPL, PeT, pGEX, pBAD). Vettori per lo studio dell'espressione genica (pKK e test del
CAT). Tecniche per lo studio dell'interazione DNA-proteina (DNAse I footprints e EMSA) e per
l'identificazione di promotori (S1 mapping e primer extension).
La Real-Time PCR (generalità sullo strumento, la linea soglia ed il ciclo soglia, quantizzazione
relativa ed assoluta). Syrber Green, sonde taqman, molecular beacons e sonde di ibridizzazione.
Principali applicazioni della Real-Time PCR.
- Principali applicazioni della genetica. La genomica strutturale: dimensione dei genomi, il
paradosso C e la densità genica. Pietre miliari del sequenziamento di genomi. Confronto tra genomi.
Il progetto genoma umano (HGP): strategie adottate dal Consorzio Pubblico e dalla Celera
Genomics. Dati emersi dal sequenziamento del DNA umano. La genomica funzionale: DNA
miroarrays. DNA fingerprinting e marcatori genetici (test di paternità e in medicina legale), studio
malattie genetiche (RFLP per l’analisi dell’anemia falciforme, multiplex PCR per la distrofia
muscolare ed analisi prenatale). Ricerca OGM.
- Polimorfismi genetici e variabilità biologica. Significato biologico dei polimorfismi genetici e
definizioni. Polimorfismi genetici proteici e polimorfismi del DNA. Analisi genetica (genealogica)
del polimorfismo del gene PGM1-fosfoglucomutasi locus 1: esperimenti di HarrisHopkinson.Analisi dei polimorfismi del DNA. Gli RFLPS: Southern blotting a 2 alleli. Analisi del
linkage ed aplotipi ricombinanti. RFLPs con 2 e 3 siti variabili. VNTRs, STRPs, SNPs. Analisi del
linkage nel cromosoma X. Polimorfismo bilanciato per i geni Cy e Pm nel cromosoma 2 di
Drosophila, (genotipi omozigoti letali). Anemia falciforme e polimorfismo bilanciato: i genotipi
omozigoti hanno fitness diversa da zero. Analisi della trasmissione dell’ anemia falciforme e
svantaggio degli omozigoti. Studio del polimorfismo bilanciato HbA/S in una popolazione
Nigeriana.
Testi
1) Biologia Molecolare del Gene (Watson) - Zaniclelli.
2) Il Gene (seconda edz. compatta) (Lewin) - Zanichelli.
3) Ingegneria Genetica (Primarose) - Zaniclelli.
4) Biotecnologie Molecolari (Brown) – Zanichelli.
Si rende necessario un testo di Genetica Generale (1 o 2) ed un altro di Genetica Applicata (3 o 4)
E’ assolutamente necessario aver sostenuto l’esame di Genetica Generale in cui sono statti trattati
argomenti di base di Genetica Molecolare come mitosi, meiosi, struttura del DNA e dell’RNA.
Si consiglia inoltre di aver sostenuto gli esami di Chimica Generale, Organica e Biologica.