9) microscopio-frazion-citofluor.pptx

28/03/17
Metodi blandi
Lisi cellulare con detergenti
Metodi vigorosi
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FRAZIONAMENTO CELLULARE
1. Centrifugazione preparativa
Centrifugazione preparativa
permette di separare i vari
elementi di un omogenato
cellulare
2. Ultracentrifugazione analitica
Centrifugazione analitica
utilizzata principalmente per
gli studi di macromolecole
purificate o di complessi
sovramolecolari isolati
FRAZIONAMENTO CELLULARE
Separazione su gradiente di densita’
Separazione su gradiente di densita’
Il campione viene fatto
stratificare su un gradiente preformato la cui densita massima
non deve superare quella delle
particelle piu dense da separare
campione
Campo
centrifugo
G
R
A
D
I
E
T
E
Microscopia
Nota: Gli organelli
subcellulari che hanno
densita differenti ma
dimensioni simili
non sono ben separati
con questo metodo
Particelle a bassa densita
Particelle ad alta densita
la corsa deve essere terminata prima che le
particelle raggiungano la base del tubo
Becker. Il mondo della cellula – VII edizione. Pearson
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SPETTRO ELETTROMAGNETICO
Proprietà del
microscopio ottico
composto
1)  Potere di risoluzione:
distanza minima alla quale due
punti sono distinti tra loro; max
0,2 micrometri
2)  Ingrandimento: max 1000 X
Microscopia: Principi
•  POTERE DI
RISOLUZIONE:
distanza focale:
1.  dipende da indice di rifrazione delle
lenti;
2.  dal mezzo in cui sono immerse;
3.  dalla loro forma
Ingrandimento è inverso della
distanza focale
Becker. Il mondo della cellula – VII edizione. Pearson
D = (K λ) / (N senα)
Migliore potere risolutivo se D è
valore piccolo
In che modo si può diminuire D?
- Diminuendo λ (blu, λ = 450nm)
- Aumentando N: indice rifrazione aria=1;
indice rifrazione dell olio da immersione 1,5
-Aumentando l apertura angolare
(max 70°, sen70° = 0,94)
D=(0,56x450nm)/(1,5x0,94)≈200nm=0,2µm
definito da D che
dipende da 3
parametri:
- Apertura angolare (α)
o semiangolo
del cono di luce che
penetra nell obiettivo
dal campione
-indice di rifrazione
(N) del mezzo situato
tra il campione e
l obiettivo
- La lunghezza d onda
(λ) della luce incidente
Apertura angolare indice della quantità di luce
che lascia il campione e passa attraverso le
lenti.
0,2µm = LIMITE RISOLUTIVO di un
microscopio ottico utilizzando
luce visibile
Anche se si utilizzano lenti che
permettono
un maggiore ingrandimento,
l immagine non è nitida
perché si va oltre il potere risolutivo
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IL LIMITE DI RISOLUZIONE
IL NOSTRO OCCHIO RIESCE A
PERCEPIRE
COME SEPARATI DUE PUNTI SE
DISTANO ALMENO 0.2 mm
IL VALORE DI 0.2 mm VIENE QUINDI
DEFINITO
COME IL LIMITE DI RISOLUZIONE
DELL OCCHIO UMANO
MICROSCOPIO OTTICO COMPOSTO
•  INGRANDIMENTO TOTALE:
prodotto ingrandimento obiettivo X ingrandimento oculare
MICROSCOPIO OTTICO COMPOSTO
ROVESCIATO – COLTURE CELLULARI
PREPARAZIONE CAMPIONI:
1.  FISSAZIONE CON ALCOOL O
FORMALDEIDE
(DISIDRATAZIONE)
(in alternativa, congelamento)
2.  INCLUSIONE IN PARAFFINA
3.  FORMAZIONE DI SEZIONI
SOTTILI AL MICROTOMO
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Microscopia ottica: Preparazione del campione;
fissazione e colorazione
Cosa osservo al microscopio
ottico:
Microscopia ottica in fluorescenza
Mitocondri e cloroplasti (1µm)
dovrebbero essere visibili ma
tutti i componenti cellulari assorbono
luce allo stesso modo quindi non sono
sempre distinguibili
Fase finale della preparazione
di un campione per microscopia ottica:
COLORAZIONE
Un composto chimico fluorescente
assorbe luce ad una certa lunghezza
d’onda
(λ di eccitazione)
ed emette luce ad una specifica lunghezza
d onda maggiore
(λ di emissione)
Nella microscopia a fluorescenza viene
visualizzata la luce emessa dal campione
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Spettri di fluorofori
MICROSCOPIA CONFOCALE
A SCANSIONE:
permette di visualizzare le molecole fluorescenti
su un solo piano focale, creando l immagine più
nitida perché di una sola sezione
Microscopio elettronico
Potere di risoluzione max 0,1 nanometri
PREPARAZIONE CAMPIONI:
1.  FISSAZIONE con glutaraldeide
(in alternativa, congelamento,
microscopia crioelettronica)
2. FORMAZIONE DI SEZIONI
SOTTILI con ULTRAMICROTOMO
(0,1µm)
Microscopia elettronica:
Preparazione del campione
Necessarie sezioni molto sottili; uso di metalli pesanti
come coloranti
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Microscopia elettronica a scansione:
consente di osservare le superfici di campioni
con sezionati – max potere risolutivo 10nm
Microscopia
elettronica: Tecnica
CITOFLUORIMETRO
dell ombreggiatura metallica;
vengono evidenziate le
caratteristiche superficiali
delle particelle.
Basi della citofluorimetria a flusso
q  Cellule in sospensione passano in
singola fila attraverso una camera di
flusso
q  Riflettono/rifrattono la luce ed
emettono fluorescenza
q  La luce emessa viene raccolta, filtrata e
convertita ad un valore digitale che viene
inviato ad un software
q  Il primo momento della analisi citofluorimetrica è rappresentato dal
passaggio delle cellule in sospensione attraverso il raggio laser, in fila.
q  Es. Analisi di una sospensione di globuli bianchi contenente linfociti,
monociti e granulociti
granulocito
linfocito
monocito
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Scatter Frontale
(Forward Angle Light Scatter, FALS)
q  Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantita’
granulocito
di LUCE “SCATTERATA” nella DIREZIONE FRONTALE
Sensore per il
FALS
Laser
(lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser)
viene raccolta nel canale del Forward Scatter
linfocito
monocito
q  L’intensita’ del Forward Scatter e’ proporzionale alla
Il semplice passaggio delle cellule attraverso il laser dà
DIMENSIONE, FORMA, ed OMOGENEITA’ OTTICA
origine ad un segnale captato dal sensore che raccoglie la
delle cellule (o delle altre particelle analizzate)
luce dello scatter frontale (forward), e
dà informazioni
sul volume cellulare.
Scatter Laterale
(90 Degree Light Scatter)
Laser
granulocito
linfocito
Sensore FALS
q  Quando si utilizza una sorgente laser, la quantita’ di
LUCE “SCATTERATA” LATERALMENTE
(perpendicolare all’asse attraverso cui viaggia la luce
monocito
Sensore per il 90O LS
Il passaggio delle cellule dà anche origine ad un secondo segnale che
viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello SCATTER
dà informazioni sulla
DENSITÀ/GRANULARITÀ (compreso il rapporto
nucleo/citoplasma) delle cellule che passano
attraverso il laser
LATERALE, a 90 gradi e che
Proprietà tipiche di “Forward” e “Side” Scatter
laser) viene raccolta nel canale del Side Scatter
q  Anche l’intensita’ del side scatter e’ proporzionale alla
dimensione, forma ed omogeneita’ ottica delle cellule (o
delle altre particelle analizzate)
Esempio di analisi dei leucociti e “gating”
elettronico
Leucociti del sangue periferico
si possono facilmente
identificare tre popolazioni:
- linfociti,
-  monociti
-  granulociti.
alle proprieta’ della superficie cellulare delle particelle e
pertanto puo’ essere usato per DISTINGUERE CELLULE
VIVE DA CELLULE MORTE
q  Il SIDE SCATTER tende ad essere piu’ sensibile alle
90 Degree Scatter
q  Il FORWARD SCATTER tende ad essere piu’ sensibile
inclusioni presenti all’interno della cellula e pertanto puo’
essere usato per distinguere CELLULE GRANULATE da
quelle NON-GRANULATE.
Forward Scatter
Si puo disegnare un
gate elettronico che
permetterà in seguito
l analisi del segnale di
fluorescenza proveniente
soltanto dalla popolazione
scelta
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SISTEMA OTTICO DEL CITOFLUORIMENTRO
I filtri dicroici, i bandpass filtri
permettono il passaggio della luce solo
ad una certa lunghezza d onda.
cella di flusso filtri dicroici
Fotomoltiplicatori
(PMT)
filtri bandpass
I fotomoltiplicatori, raccolgono ed amplificano il segnale luminoso filtrato e
ricevuto. In questo specifico caso, il PMT1 funziona come scatter a 90°, e
raccoglie la luce rifratta/diffratta ( scatterata ) dalle cellule.
Raccolta della fluorescenza da una popolazione
Laser
Fluorescence detectors
In questo esempio, riferito ad un paziente con infezione da HIV, sono
stati identificati i linfociti in base al Forward e Side scatter, e su
queste cellule è stata fatta l analisi delle sottopopolazioni con
anticorpi anti-CD3 (in FL1), anti-CD4 (in FL2) ed anti-CD8 (in FL3).
Il “Sorting cellulare”
FACS:
Fluorescence
Activated
Cell
Sorting
FALS sensor
Fluorescence detector
Piastre
cariche
elettricame
nte
Cellule singole
separate dentro
diverse provette
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