Review n. 2 – Italus Hortus 12 (4), 2005: 3 - 16
Utilizzo dei geni rol in floricoltura: risultati conseguiti e prospettive future
Antonio Mercuri*, Laura De Benedetti, Simona Bruna e Tito Schiva
CRA - Istituto Sperimentale per la Floricoltura, Corso Inglesi 508, 18038 Sanremo (IM)
Ricevuto: 17 giugno 2005; accettato: 8 luglio 2005
Use of the rol genes in floriculture:
results and future perspectives
Abstract. Traditionally, new traits have been introduced into ornamental plants through classical breeding. However, genetic engineering now enables specific alterations of single traits in already successful
varieties. New or improved varieties of floricultural
crops can be obtained by acting on floral traits, such
as color, shape or fragrance, on vase life in cut-flower
species, and on rooting potential or overall plant
morphology. Overexpression of the rol genes of the Ri
plasmid of Agrobacterium rhizogenes in plants alters
several developmental processes and affects their
architecture. Both A. rhizogenes- and rol-transgenic
plants display the hairy-root phenotype, although specific differences are found among species and among
transgenic lines. In general, these plants show a
dwarfed phenotype, reduced apical dominance, smaller, wrinkled leaves, increased rooting, altered flowering and reduced fertility. Among the rol genes, termed rolA, B, C and D, rolC has been the most widely
studied because its effects are the most advantageous in terms of improving ornamental and horticultural traits. In addition to the dwarfness and the
increase in lateral shoots that lead to a bushy phenotype, rolC-plants generally display more and smaller flowers, and advanced flowering; surprisingly,
these plants may have better rooting capacity and
they show almost no undesirable traits. rolD, the least
studied among the rol genes, offers promising applications due to its promotion of flowering. Although
rolA and rolB require further study in this regard, they
are not recommended for introduction into ornamental
species, since with them, many abnormalities are
obtained. In the case of floricultural crops, molecular
regulation of flowering and floral traits, as well as alterations in plant shape, via the application of genes
such as rol genes, all contribute to the improvement of
the ornamental plants. Currently, the number of roltransgenic plants continues to increase, and in many
cases, beneficial traits are obtained. Thus, rol genes,
particularly rolC and the promising rolD, should be
introduced into more ornamental species, since they
may prove highly useful in yielding improved floricultural traits. However, further research is needed to
determine the effects of rol proteins and their interaction with other proteins, organs and environmental
factors, in order to understand all the different phe-
notypical and biochemical effects they may produce in
transgenic plants. Consequently, increased knowledge about the functions of these genes would greatly
benefit their application in both floriculture and horticulture. In the near future, molecular plant breeding
will complement classical breeding, with its obvious
shortcomings, for the improvement of commercial
species, and many rol transformed species may prove
useful in breeding programs to generate ornamentals
with new and improved traits.
Key words: Agrobacterium rhizogenes, hairy root,
genetic transformation, ornamental plants.
Introduzione
Nuove varietà vegetali ornamentali sono create dai
breeders in risposta alla continua domanda di nuovi
prodotti da parte dei consumatori. La morfologia ed i
colori alterati della pianta, la migliore fragranza del
fiore e la vita più lunga del fiore reciso, sono alcune
delle caratteristiche più ricercate. I coltivatori inoltre
preferiscono piante con caratteristiche agronomiche
migliorate, quali maggior resa produttiva, aumentata
resistenza agli agenti patogeni e/o agli erbicidi.
Tradizionalmente, il breeding classico è stato usato
per introdurre nuove caratteristiche e per generare
varietà originali in molte specie, compreso le ornamentali. Tuttavia, questo è un lungo lavoro, basato
sull’incrocio fra le specie simili o all’interno della
stessa specie e sulla selezione di progenie con caratteristiche promettenti. Le progenie selezionate, in molti
casi, sono mantenute tramite riproduzione vegetativa
per assicurare la produzione di piante geneticamente
identiche. Con il breeding classico il pool genetico
disponibile per le nuove caratteristiche è limitato al
background genetico dei genitori. Inoltre, l’alto livello
di eterozigosi in molte ornamentali importanti, come
rosa, crisantemo e garofano e la conoscenza limitata
del loro patrimonio genetico, ostacolano il loro
miglioramento genetico (Vainstein, 2002). Va anche
considerato che molte specie e varietà di piante ornamentali sono sterili.
*[email protected]
3
Mercuri et al.
Gli sviluppi recenti nell’ingegneria genetica, con i
relativi strumenti per il trasferimento dei geni esogeni
nelle piante, insieme ai progressi nell’identificazione e
nell’isolamento dei geni, hanno consentito alterazioni
specifiche di singoli caratteri nelle varietà già affermate. Queste tecniche permettono che il pool di geni
disponibile si estenda, poiché non soltanto i geni provenienti da altre specie possono essere inseriti nelle
piante ma addirittura quelli provenienti da altri regni,
quali i geni batterici o persino virali. Inoltre, i geni
endogeni possono essere overespressi o soppressi.
Negli ultimi anni, sia l’aumento nell’efficienza delle
procedure di trasformazione che nella rigenerazione
delle piante hanno permesso il miglioramento di
varietà ornamentali mediante breeding molecolare.
Attualmente sono disponibili molti geni utili per il
breeding delle ornamentali. Questi includono i geni
che interessano la fioritura e l’architettura del fiore,
geni relativi alla biosintesi di parecchi pigmenti fiorali
(colore), geni dalla via biosintetica del profumo e
quelli relativi alla durata post-raccolta del fiore reciso.
Un altro esempio è dato dai geni r o l i s o l a t i
dall’Agrobacterium rhizogenes, che hanno ampiamente dimostrato la loro utilità per migliorare determinate
caratteristiche agronomiche e perfino per produrre
nuove architetture di pianta. Il presente articolo presenta una dettagliata rassegna sull’importanza dei geni
rol in floricoltura.
I geni rol
L’introduzione di geni esogeni coinvolti nella sintesi dei fattori di crescita (fitormoni) e nello sviluppo
della pianta, possono modificare alcuni tratti fisiologici e morfologici. I fitormoni sono implicati nei processi di crescita e differenziazione cellulare nonché nel
determinismo dell’architettura della pianta e nel passaggio dalla fase vegetativa a quella riproduttiva.
A. rhizogenes è una delle più importanti fonti di
geni ormonali e per questo motivo è stato ampiamente
utilizzato nella trasformazione di piante. Esso è in
grado di indurre al sito di inoculo delle piante colpite
la formazione di radici avventizie (hairy roots, letteralmente radici pelose), cioè di indirizzare cellule più
o meno specializzate verso la morfogenesi radicale.
Questo fenomeno è dovuto al trasferimento nella
cellula vegetale di un frammento di DNA (T-DNA)
dal plasmide Ri (root inducing) contenuto nel batterio
(Zambryski et al., 1989). Questo T-DNA (transferred
DNA), che non è espresso nel batterio, si integra
covalentemente nel DNA eucariotico e viene trascritto
e tradotto: l’attivazione di questi geni causa, fra l’al4
tro, la neoplasia organogenetica che si manifesta sotto
forma di radici.
L’induzione della patogenesi da parte degli
Agrobacterium (rhizogenes e tumefaciens hanno in
comune lo stesso meccanismo di infezione) rappresenta un caso unico in natura, che può essere ricondotto ad una sorta di parassitismo genetico.
I geni del T-DNA posseggono e riconoscono
segnali di tipo eucariotico e una volta entrati nella cellula superiore, si esprimono. Alcuni di essi producono
enzimi i quali portano alla modificazione di certi aminoacidi in molecole chiamate opine che il solo batterio infettante è in grado di metabolizzare come fonte
di carbonio e di azoto.
È evidente come ciò possa essere di vantaggio per
il batterio rispetto ad altri batteri del suolo suoi concorrenti e come la morfogenesi neoplastica incrementi
la fonte del prodotto nutritivo.
In molte specie, da radici hairy roots indotte da A.
rhizogenes è stato possibile ottenere, direttamente o
più spesso via coltura di tessuti, intere piante transgeniche contenenti il T-DNA trasformante. L’analisi
fenotipica di questi individui ha messo in evidenza
una serie di alterazioni morfologiche e fisiologiche
caratteristiche che sono state comprese nella dizione
fenotipo hairy root.
Seppure con alcune diversità tra le specie studiate,
queste piante rigenerate presentano in generale un
colore verde più intenso nelle foglie, una taglia più
bassa con accorciamento degli internodi, perdita della
dominanza apicale con maggior sviluppo delle
gemme ascellari, accartocciamento fogliare, una
accentuata rizogenesi con parziale perdita del geotropismo radicale (radici plagiotropiche), una riduzione
della fertilità e della produzione di seme (Schmülling
et al., 1988; Estruch et al., 1991) e in specie biennali
o poliennali una riduzione del periodo di vita (Limami
et al., 1998).
Una valutazione approssimativa di questo fenotipo
non faceva certo pensare ad una possibile utilizzazione di un gruppo di geni in grado di scatenare alterazioni così peggiorative della pianta. Il T-DNA di A.
rhizogenes, di cui si conosce la sequenza nucleotidica,
è però composto di 18 “Open Reading Frames”
(ORFs), cioè presumibilmente di 18 differenti funzioni geniche, la dissezione delle quali e il loro trasferimento in pianta offrivano la possibilità di mettere in
relazione singoli geni o combinazioni degli stessi con
una particolare modificazione fenotipica.
Seguendo questa strategia si è potuto appurare che
il fenotipo hairy root può essere indotto trasferendo
nella pianta solo 4 dei 18 geni presenti nel T-DNA.
Geni rol in floricoltura
Per ciò che riguarda gli altri geni del T-DNA, sembra
che questi abbiano effetti minori sul fenotipo delle
piante transgeniche, anche perché questo frammento
di DNA trasformante presenta casi di ridondanza
dovuta sia a geni duplicati che a geni con sequenze di
probabile origine comune.
Fondamentalmente quattro loci del T-DNA, indicati come rolA, rolB, rolC, e rolD (rol = root locus) o
ORFs 10, 11, 12 e 15, rispettivamente sono coinvolti
nell’induzione e nel mantenimento del fenotipo
hairy root (Cardarelli et al., 1987; Spena et al.,
1987). Questi loci agiscono in modo indipendente e
sinergico (Spena et al., 1987).
La trasformazione diretta con A. rhizogenes o con i
suoi geni rol (singoli o in varie combinazioni) inseriti
in A. tumefaciens è stata effettuata in parecchie piante
ornamentali per modificare la loro architettura, compreso le parti aeree e sotteranee e perfino per alterare
il processo di fioritura. Per questo motivo, nella
seguente rassegna le specie trasformate con A. rhizo genes e quelle nelle quali sono stati inseriti singolarmente o in varie combinazioni i geni rolA, rolB, rolC
e rolD, vengono trattate separatamente.
La trasformazione con A. rhizogenes
Molte specie sono state trasformate usando diversi
ceppi di A. rhizogenes. I tessuti vegetali infettati con
A. rhizogenes sviluppano le hairy roots, con la tipica
velocità di sviluppo, l’accestimento ed il plagiotropismo (sviluppo fuori dalla linea verticale). Da queste
radici, le piante transgeniche rigenerano facilmente. Il
fenotipo hairy-root può essere osservato in un certo
numero di specie, anche se con diversi gradi di variazione a seconda della specie o del clone all’interno
della stessa specie e può persino differire fra gli individui rigenerati dalla stessa radice (Tepfer, 1984). Il
fenotipo inoltre può essere ereditato, anche se in alcuni casi i germogli laterali delle piante hairy-root ritornano al fenotipo normale senza perdere il T-DNA
(Tepfer, 1984). Anche se alcuni effetti pleiotropici
(effetti multipli da una singola causa) possono parzialmente limitare l’applicazione pratica di tali piante trasformate (van der Salm et al., 1996), alcune delle
caratteristiche hairy-root possono essere utili nel
migliorare le piante da un punto di vista agronomico.
A. rhizogenes è stato usato per trasformare parecchie
specie ornamentali (tab. 1).
Angelonia salicariifolia è una pianta perenne coltivata per giardino o da vaso. Dopo l’infezione degli
espianti fogliari con A. rhizogenes., sono state ottenute le hairy roots (Koike et al., 2003). I germogli
avventizi sono stati rigenerati dalle hairy roots trasferendole su di un mezzo adatto. Queste piante A. rhizo genes-trasformate hanno esibito un fenotipo nano con
gli internodi più corti e più piccoli, ma senza foglie
raggrinzite. Le radici si sono sviluppate più velocemente e vigorosamente nelle talee delle linee trasformate rispetto alle talee di controllo. Il numero, la
dimensione e la forma dei fiori non sono stati alterati,
ma la fertilità del polline era ridotta nelle piante transgeniche.
La Rudbeckia hirta è una pianta ornamentale
perenne, usata sia per il giardino che come pianta da
paesaggio, le cui le radici possono controllare i nematodi. I segmenti fogliari della cv Highway Yellow
sono stati infettati con A. rhizogenes e dalle hairy
roots sono stati rigenerati numerosi germogli avventizi (Daimon e Mii, 1995). Le piante trasformate hanno
mostrato foglie raggrinzite, fiori più piccoli e abbondante ramificazione laterale delle radici. Il sistema
radicale così incrementato e con più tiofeni (composti
nematocidi), potrebbe migliorare l’abilità nematocida
di questa specie.
Nierembergia scoparia, pianta nativa dell’argentina, viene utilizzata in Giappone come ornamentale per
i suoi fiori azzurri e per il lungo periodo di fioritura.
Le piante trasformate con A. rhizogenes, con l’intento
di ottenere forme adatte alla coltivazione in vaso,
mostravano internodi molto corti e foglie che erano
più strette ed arricciate. Le piante transgeniche avevano inoltre molte radici plagiotropiche con vigorosa
crescita ed una notevole ramificazione. Nessuna differenza rispetto al controllo, fu osservata nel numero di
fiori e, contrariamente alle altre specie trasformate
con A. rhizogenes, nella fertilità del polline. Piante
nane furono ottenute anche nelle progenie (Godo et
al., 1997).
Datura è un genere con specie arbustive ornamentali e piccoli alberi, alcuni dei quali hanno dei grossi
fiori a tromba, luminosi, di vario colore e con un
odore piacevole. Quando gli espianti fogliari di D.
arborea e di D. sanguinea venivano co-coltivati con
A. rhizogenes, producevano le tipiche hairy roots. Le
piante transgeniche spontaneamente rigenerate da
queste radici mostravano una riduzione di altezza
della pianta e lunghezza dell’internodo ed un aumento
nel numero degli internodi (Giovannini et al., 1997).
Il numero di foglie era aumentato ed esse risultavano
più piccole, più scure e dentate o arricciate, a secondo
del clone. I fiori di D. sanguinea erano più piccoli
nelle piante trasformate, mentre in D. arborea la fioritura era addirittura inibita.
5
Mercuri et al.
Tab. 1 - Specie ornamentali trasformate con Agrobacterium rhizogenes.
Tab. 1 - Ornamental species transformed with Agrobacterium rhizogenes.
Specie
Geni inseriti
Fenotipo
Angelonia
salicariifolia
T-DNA di A.
rhizogenes
Fenotipo nano con internodi più corti, foglie più piccole, talee con radici
più vigorose, numero forma e dimensione dei fiori inalterate, ridotta fertilità del polline
Koike et al., 2003
Rudbeckia
hirta
T-DNA di A.
rhizogenes
Foglie raggrinzite, abbondante accestimento radicale e fiori più piccoli
Daimon e Mii, 1995
Nierembergia
scoparia
T-DNA of A.
rhizogenes
Nanismo, internodi più corti, foglie più piccole, più strette e arricciate,
radici più sviluppate e fertilità normale
Godo et al., 1997
Datura
arborea
Datura
sanguinea
T-DNA di A.
rhizogenes
Piante con altezza ridotta, ridotta lunghezza e aumento degli internodi,
aumento nel numero delle foglie con dimensione ridotta, foglie verde
scuro dentate o arricciate, talee con maggiore attitudine alla radicazione e
fiori più piccoli quando la fioritura non era inibita
Giovannini et al., 1997
Gentiana sp.
T-DNA di A.
rhizogenes
Piante nane, internodi più corti ma più lunghi in una specie, ridotta dominanza apicale, steli ramificati, foglie più piccole, ellittiche, arrotolate o
raggrinzite radici più sviluppate, aumentato numero di fiori e in una specie fioritura precoce
Suginuma e Akihama,
1995; Hosokawa et al.,
1997; Momcilovic et
al., 1997
Hypericum
perforatum
T-DNA di A.
rhizogenes
Internodi più corti, maggiore accestimento, foglie più piccole, ridotta
dominanza apicale ed un più alto contenuto del principio attivo
Hypericina rispetto alle piante di controllo
Di Guardo et al., 2003
Eustoma
grandiflorum
T-DNA di A.
rhizogenes
Piante più basse, internodi più corti ed in numero maggiore, più branche
laterali, foglie piccole e raggrinzite, aumentata capacità di radicazione,
forma modificata della corolla, ridotta fertilità e in alcune progenie fillotassi alterata e fasciazioni
Handa, 1992b; Handa
et al., 1995; Giovannini
et al., 1996
Catharanthus
roseus
T-DNA di A.
rhizogenes
Internodi più corti, foglie raggrinzite, radici più sviluppate e in una cultivar cambiamento del colore del fiore
Choi et al., 2004
Pelargonium
sp.
T-DNA di A.
rhizogenes
Taglia ridotta, più internodi, più branche laterali, più foglie molto dentate
e con colore più scuro, migliore radicazione delle talee, fioritura inibita e
aumentata concentrazione di olii essenziali
Pellegrineschi et al.,
1994; Pellegrineschi e
Davolio-Mariani, 1996
Antirrhinum
majus
T-DNA di A.
rhizogenes
Nanismo, internodi corti, ridotta dominanza apicale con forte accestimento laterale, foglie più piccole ampie e corte, apparato radicale abbondante
ma in alcune piante scarso, fiori più piccoli ed in maggiore numero, fioritura ritardata, fertilità ridotta o inibita
Handa, 1992a; Senior
et al., 1995; Hoshino e
Mii, 1998
Al genere Gentiana appartengono piante perenni
erbacee di importanza ornamentale e medicinale, con i
fiori che sono usati prevalentemente per il prodotto
reciso. G. scabra è stata infettata con A. rhizogenes e
le piantine trasformate hanno mostrato gli internodi
elongati rispetto al fenotipo a rosetta delle piante non
trasformate, dominanza apicale ridotta, con vigorosa
emissione di rami laterali alla base dello stelo, foglie
raggrinzite ed aumentato sviluppo radicale con radici
plagiotropiche (Suginuma e Akihama, 1995).
Sorprendentemente, le piante transgeniche hanno esibito una precocissima fioritura e questa è l’unica specie ornamentale trasformata con A. rhizogenes a presentare questa caratteristica.
6
Bibliografia
La trasformazione con A. rhizogenes di G. trifora
x G. scabra effettuata usando espianti di stelo, ha originato piante con vari gradi di nanismo, ridotta dominanza apicale, steli fortemente ramificati con la fioritura più abbondante e foglie più piccole di forma ellittica (Hosokawa et al., 1997). La cospicua ramificazione e l’abbondante fioritura in queste genziane transgeniche rappresentano nuovi tratti ornamentali di notevole pregio. Germogli micropropagati di G. cruciata ,
G. purpurea, G. acaulis e G. lutea sono stati infettati
con due ceppi di A. rhizogenes per stabilire una coltura in vitro di radici aeree, dal momento che composti
attivi usati nell’industria farmaceutica sono estratti
dalle loro radici (Momcilovic et al., 1997). Solo le
Geni rol in floricoltura
hairy roots di G. cruciata e G. purpurea hanno rigenerato piante che esibivano il tipico fenotipo delle piante
trasformate con A. rhizogenes, con internodi corti e
con foglie più piccole e arrotolate piuttosto che le tipiche foglie raggrinzite.
Anche Hypericum perforatum ( f a m i g l i a
Clusiaceae), pianta ben nota per le sue proprietà antidepressive ed antivirali, è stata trasformata usando
due ceppi di A. rhizogenes (Di Guardo et al., 2003)
(fig. 1). Le piante spontaneamente rigenerate dalle
hairy roots (fig. 2) mostravano il tipico fenotipo con
internodi più corti, maggiore accestimento, foglie più
piccole, ridotta dominanza apicale ed in alcune linee
un più alto contenuto del principio attivo Hypericina
rispetto alle piante di controllo.
Fig. 1 - Capsula Petri con hairy root di Hypericum perforatum trasformato con A. rhizogenes. (Foto A. Giovannini).
Fig. 1 - Petri dish with hairy root of Hypericum perforatum transformed with A. rhizogenes. (Photo A. Giovannini).
Fig. 2 - Piantine di Hypericum perforatum rigenerate spontaneamente da hairy root. (Foto A. Giovannini).
Fig. 2 - Plantlets of Hypericum perforatum spontaneously regenerated from hairy root. (Photo A. Giovannini).
Un’altra Genzianacea utilizzata per la produzione
di fiore reciso, Eustoma grandiflorum, meglio conosciuta come Lisianthus o genziana delle praterie, è
stata trasformata con A. rhizogenes con l’intento di
sviluppare cultivars con nuovi tratti quali steli più
accestiti e con fiori multipli, forma alterata della
corolla e piante nane adatte alla produzione da vaso
fiorito (Handa e Deroles 2001). I primi risultati in tal
senso furono raggiunti da Handa (1992b) che ottenne
piante transgeniche che mostravano nanismo, internodi di ridotta lunghezza, corolle a forma di coppa anziché di campana e ridotta fertilità. Alcuni cloni trasformati mostravano inoltre un più abbondante apparato
radicale. Anche le progenie di tali piante mostravano
nanismo, in alcuni casi un maggiore numero di getti
laterali, mentre alcune piante presentavano addirittura
foglie arrangiate in verticilli sui nodi dello stelo
(Handa et al., 1995). Anche Giovannini et al. (1996)
trasformarono il Lisianthus con A. rhizogenes ottenendo pressoché gli stessi risultati.
Alcune cultivars di Catharanthus roseus meglio
conosciuta come pervinca del Madagascar (comune
pianta da giardino), sono state trasformate con A. rhi zogenes. Le piante rigenerate da hairy roots mostravano un più abbondante apparato radicale ed internodi
più corti. Circa la metà delle piante trasformate avevano foglie raggrinzite mentre le altre erano morfologicamente normali. Sorprendentemente, il colore rosso
nella zona prossimale dei petali della varietà Cooler
apricot era bianco nei fiori trasformati (Choi et al.,
2004).
Pelargonium graveolens, il geranio che odora di
limone, trasformato con un ceppo di A. rhizogenes,
mostrava un miglioramento delle caratteristiche ornamentali ed una maggiore fragranza: le piante di questa
specie sono generalmente poco attraenti dal momento
che presentano internodi molto lunghi ed una crescita
disordinata. Le piante trasformate erano più corte, con
un maggiore numero di internodi ed un aumentato
accestimento dei getti laterali (Pellegrineschi et al.,
1994). I genotipi trasformati mostravano inoltre più
foglie, di colore più scuro, più dentate e resistenti
all’ingiallimento tipico di questa specie. Anche la
concentrazione di oli essenziali utilizzati in cosmetica
risultava maggiore. Risultati molto simili sono stati
ottenuti con altri gerani odorosi quali P. fragrans, P.
o d o r a t i s s i m u s e P. quercifolia (Pellegrineschi e
Davolio-Mariani, 1996).
La Bocca di Leone (Antirrhinum majus) è stata
anch’essa trasformata con A. rhizogenes. Sia la varietà
Floral carpet (Handa 1992a; Hoshino e Mii, 1998) che
la varietà Golden Monarch (Senior et al., 1995)
7
Mercuri et al.
Tab. 2 - Specie ornamentali trasformate con i geni rol di A. rhizogenes.
Tab. 2 - Ornamental species transformed with rol genes of A. rhizogenes.
Specie
Gene(i) inseriti
Bibliografia
Begonia
tuberhybrida
Rol
A+B+C
Piante nane, foglie raggrinzite, più scure ed in numero maggiore, fioritura
ritardata o inibita, petali raggrinziti
Kiyokawa et al., 1996
Lilium
longiflorum
Rol
A+B+C
Piante molto più basse con ridotta lunghezza degli internodi, foglie normali di dimensione ridotta, aumento dell’apparato radicale, fiori più piccoli e ridotti di numero, fioritura precoce in qualche linea e ridotta vitalità
del polline
Mercuri et al., 2003 b
Limonium sp.
Rol
A+B+C
Piante nane con ridotta lunghezza degli internodi, ridotta dominanza apicale, foglie più piccole arricciate o raggrinzite, abbondante apparato radicale, fioritura precoce e contemporanea con alta densità fiorale, fiori più
piccoli e ridotta vitalità del polline
Mercuri et al., 2001,
2003a
Rol
A+B+C
Piante erette, alto numero di branche più corte, maggiore radicazione in
vitro, aumentato numero di fiori con maggiore durata, fiori di dimensioni
più piccola e ridotta fertilità
Giovannini et al.,
1999b; Allavena et al.,
2000
rolA+B
Piante quasi erette, branche più corte, foglie verde scuro, abbondante radicazione in vitro, fioritura leggermente anticipata, leggero aumento del
numero dei fiori
Giovannini et al.,
1999b; Allavena et al.,
2000
Rol
A+B+C
Ridotta lunghezza dei germogli, ridotta dominanza apicale, foglie più piccole, arricciate e raggrinzite in un trasformante, aumentata capacità radicativa delle talee. Aumentata emissione di germogli laterali da nesti non
trasformati innestati su portainnesti rolABC
van der Salm et al.,
1997,1998
rolB
Riduzione dei germogli laterali (un solo trasformante)
van der Salm et al.,
1996, 1997
35S-rolC
Piante leggermente più basse con aumentato numero di germogli laterali,
migliore radicazione delle talee, aumentato numero di steli fioriti e fiori
più piccoli in una linea transgenica
Ovadis et al., 1999;
Zuker et al., 2001
Chrysanthemum
35S-rolC
morifolium
Piante molto basse con corti internodi, aumentato accestimento, foglie più
strette e più chiare, petali più ampi, steli fiorali più compatti con fiori più
numerosi ma più piccoli
Mitiouchkina e
Dolgov, 2000
Osteospermum
ecklonis
35S-rolC
Piante erette, foglie verde chiaro, fioritura anticipata, maggiore numero di
fiori con durata prolungata, fiori più piccoli con ridotta fertilità o sterili
Giovannini et al., 1999b;
Allavena et al., 2000
Salpiglossis
sinuata
rolC
Riduzione nell’altezza della pianta, più branche, foglie strette, fiori più
piccoli e sterilità del polline
Lee et al., 1996
Petunia
axillaries x
(P. axillaries
x P. hybrida)
35S-rolC
Piante nane per la diminuzione della lunghezza degli internodi, riduzione
della dominanza apicale con maggiore accestimento, foglie più grandi o
più piccole, fiori più piccoli, forte diminuzione della fertilità maschile e
femminile
Winefield et al., 1999
Pelargonium
x domesticum
35S-rolC
Fenotipo nano, riduzione dell’area fogliare, riduzione dell’area del petalo
e della dimensione dei fiori e fioritura anticipata
Boase et al., 2004
Rosa hybrida
rolC
Fenotipo nano, aumento dei getti laterali, foglie raggrinzite e clorotiche,
riduzione dell’apparato radicale, fiori più piccoli con riduzione della fertilità e cambiamenti di colore, moltissime spine
Souq et al., 1996
Osteospermum
ecklonis
Rosa hybrida
Dianthus
caryophyllus
8
Fenotipo
Geni rol in floricoltura
mostravano tutti i tratti tipici delle piante derivate da
hairy roots, anche se in Golden Monarch l’apparato
radicale delle piante trasformate risultava stranamente
ridotto.
A. rhizogenes non è usato esclusivamente come
fonte genetica per creare nuovi genotipi e fenotipi.
Esso può anche essere utilizzato come vettore nella
trasformazione genetica con relativi vantaggi e svantaggi se confrontato con il più utilizzato A. tumefa ciens. Poiché A. rhizogenes è in grado di co-trasferire
il T-DNA di un vettore binario, esso può essere utilizzato per produrre piante transgeniche recanti il gene
esogeno desiderato mediante una selezione così detta
marker-free, senza necessità di utilizzare geni per la
resitenza ad antibiotici o erbicidi, semplicemente
sfruttando la facilità di rigenerazione di piante trasformate da hairy roots.
In Verticordia, una pianta ornamentale apprezzata
per il brillante colore rosso del fiore, la trasformazione utilizzando A. rhizogenes con un vettore binario è
risultata più efficiente rispetto a quella operata usando
A. tumefaciens con lo stesso vettore binario (Stummer
et al., 1995). Ovviamente però le piante transgeniche
derivate da hairy roots oltre al gene desiderato mostravano anche il fenotipo alterato associato alla presenza
del T-DNA di A. rhizogenes.
Dal momento che l’inserzione del T-DNA di A.
rhizogenes e del T-DNA del vettore binario generalmente occorre su differenti cromosomi durante la cotrasformazione, la loro segregazione nelle progenie
può consentire il recupero di piante transgeniche con
un fenotipo normale.
Recenti lavori su Antirrhinum riportano l’utilizzo
dei geni rol in un sistema di trasformazione genetica
denominato MAT (multi-auto-transformation vector
system) (Cui et al., 2000; 2001). Questo sistema è
basato sui cambiamenti morfologici causati dagli
oncogeni di Agrobacterium (geni rol o ipt) che consentono di selezionare su base visiva le piante transgeniche rigenerate. Il vettore excide in un secondo
momento gli oncogeni dalle piante rigenerate e quindi
vengono ottenute delle piante recanti il gene di interesse e morfologicamente normali. Queste piante transgeniche marker-free sono prodotte senza bisogno di
incrocio e selezione delle progenie e consentono quindi un notevole risparmio di tempo e di costi soprattutto per le specie legnose.
Appare evidente da questa rassegna che tutte le
piante trasformate con A. rhizogenes mostrano modificazioni nella loro morfologia come la riduzione dell’altezza dovuta ad internodi molto più corti e numerosi; riduzione della dominanza apicale con aumentata
emissione di getti laterali; foglie in qualche caso più
numerose con dimensione ridotta arricciate o raggrinzite. Praticamente tutte le specie trasformate mostrano
un aumentata capacità di radicazione con radici generalmente più corte, più robuste e fortemente accestite.
In alcune specie il numero dei fiori è ridotto e/o la fioritura è ritardata o addirittura inibita. I fiori risultano
generalmente della stessa dimensione dei controlli
anche se in alcuni casi sono più piccoli e/o con forme
modificate ed in un caso con colore diverso. La fertilità è ridotta o addirittura persa anche se, sorprendentemente, in qualche caso è rimasta inalterata. Di particolare interesse sono i fenotipi nani che dovrebbero
essere presi in seria considerazione per la creazione di
nuove varietà da vaso, mentre la aumentata capacità di
radicare potrebbe essere utile per tutte le piante commerciali. Inoltre la capacità di produrre più fiori oppure il cambiamento di forma del fiore, come riportato
per alcune specie, è una modificazione desiderabile
per ogni pianta ornamentale.
La trasformazione con i geni rol
Le piante nel cui genoma sono presenti i soli geni
rolA, rolB e rolC, sono morfogeneticamente equivalenti a quelle che contengono l’intero T-DNA di A.
rhizogenes (Spanò et al., 1988). Alcuni studi sui geni
rol introdotti singolarmente o in combinazione nelle
piante sono stati condotti con l’intento di distinguere i
loro effetti nel causare la sindrome hairy root.
Piante transgeniche con rolABC
Begonia tuberhybrida è stata trasformata con
rolABC (Kiyokawa et al., 1996). Le piante rigenerate
mostravano il tipico fenotipo associato ai geni rol:
nanismo, aumentato numero di foglie di colore verde
scuro e raggrinzite, fioritura ritardata o inibita e petali
arrotolati. Una notevole variabilità fu riscontrata nei
fenotipi rol che furono classificati come semi-nani e
super-nani e ciò poteva essere dovuto non al numero
di copie inserite, bensì all’inattivazione del transgene
o alla posizione del transgene stesso su cromosomi
diversi.
Il lilium è una delle più importanti specie bulbose
ornamentali. Lilium longiflorum cv Snow queen è
stato recentemente trasformato con rolABC (Mercuri
et al., 2003b). Le piante trasformate mostravano una
maggiore capacità di radicazione con radici più numerose ed accestite. Alcuni lilium transgenici risultarono
cespugliosi, con crescita disordinata e con 6-7 steli
per pianta, mentre altri presentavano un aspetto desiderabile con uno o due steli per pianta e con una note9
Mercuri et al.
vole riduzione nella lunghezza degli internodi. Le
foglie di tutti i cloni trasformati presentavano una
forma normale senza arricciature o arrotolamenti e
con dimensione ridotta. Anche i fiori erano più piccoli, di forma normale e di numero ridotto. La vitalità e
la produzione di polline risultavano fortemente ridotte
e, specialmente quest’ultimo carattere, è altamente
desiderabile in questa specie dove la abbondantissima
produzione di polline che macchia qualunque cosa è
un carattere negativo. Alcuni cloni transgenici avevano inoltre una fioritura anticipata. I fenotipi ottenuti
possono essere sicuramente considerati un prodotto
innovativo (fig. 3).
Fig. 4 - Limonium gmelinii: differenti morfologie fogliari dopo
trasformazione con i geni rolABC. A = pianta di controllo non trasformata; B-C-D-E-F = genotipi trasformati. (Foto A. Mercuri).
Fig. 4 - Limonium gmelinii: different leaf morphology after transformation with rolABC genes. A = untransformed control plant;
B-C-D-E-F = transformed genotypes. (Photo A. Mercuri).
Fig. 3 - Lilium longiflorum: risultati ottenuti dopo trasformazione
con geni rolABC. (Foto A. Mercuri).
Fig. 3 - Lilium longiflorum: results obtained after transformation
with rolABC genes. (Photo A. Mercuri).
Al genere Limonium appartengono piante erbacee
perenni che sono coltivate per la produzione di steli
fioriti utilizzati tal quali o in composizioni floreali
come fiori freschi o essiccati. Piante di L116 (ibrido
sterile di L. otolepis x L. latifolium) e della specie selvatica L. gmelinii sono state trasformate con rol ABC.
I limonium transgenici mostravano una ampia varaiabilità fenotipica e in funzione del loro sviluppo furono
classificati come tipi super-compatti, compatti e semicompatti (Mercuri et al., 2001; 2003a). Le piante transgeniche presentavano una ridotta dominanza apicale,
una forte riduzione nelle lunghezza degli internodi,
foglie arricciate e/o raggrinzite con superficie ridotta
(fig. 4) ed un maggiore numero di radici rispetto alle
piante di controllo (fig. 5). I cloni selezionati mostravano inoltre un anticipo di fioritura e, nei tipi supercompatti e compatti, la stessa avveniva in modo pressochè contemporaneo e l’infiorescenza risultava nell’insieme densa e compatta determinando un effetto
visivo di notevole impatto. Nell’ibrido inoltre si ave10
Fig. 5 - Radicazione in vitro di Limonium gmelinii. A sinistra
piantine di controllo non trasformate, a destra un clone trasformato. (Foto A. Mercuri).
Fig. 5 - In vitro rooting of Limonium gmelinii. Untransformed
control plantlets on the left, a transformed clone on the right.
(Photo A. Mercuri).
vano fiori più piccoli (Mercuri et al., 2001) e in L.
gmelinii il polline presentava una ridotta vitalità ed
una scarsa capacità germinativa (Mercuri et al. ,
2003a). L’autore suggerisce che la diversità fenotipica
osservata non sarebbe dovuta al numero di copie dell’inserto, ma piuttosto alla posizione nei cromosomi
Geni rol in floricoltura
in cui il transgene si è inserito e ai livelli di trascritto e
delle relative proteine codificate.
I risultati ottenuti in questo lavoro suggeriscono
che la trasformazione genetica con i geni rol può
realmente migliorare alcuni tratti ornamentali in
Limonium. I tipi super-compatti potrebbero essere
sfruttati per la produzione da vaso fiorito ed il singolo
stelo reciso dei tipi compatti, brachizzato geneticamente, potrebbe essere utilizzato come un piccolo
bouquet pronto per l’uso senza bisogno di confezionamento (fig. 6). I nuovi caratteri ornamentali dei cloni
transgenici insieme alla lunga durata post-raccolta
tipica di questa specie, alla facilità di micropropagazione ed acclimatazione, sono ulteriori importanti elementi per il successo economico.
Fig. 6 - Limonium ibrido L116 (L. latifolium x L. caspia). A =
piante di controllo non trasformate. B = pianta fiorita del tipo
compatto (trasformazione con i geni rolABC). C = Stelo reciso del
tipo compatto. (Foto A. Mercuri).
Fig. 6 -Hybrid Limonium L116 (L. latifolium x L. caspia). A =
Untransformed control plants. B = Flowered plant of the compact
type (transformation with rolABC genes). C = Cut stem of the
compact type. (Photo A. Mercuri).
Osteospermum è una specie ornamentale tappezzante usata anche per fiore reciso e più recentemente
sono state costituite varietà adatte alla coltivazione in
vaso. Osteospermum ecklonis è stata trasformata con i
geni rol (Giovannini et al., 1999b; Allavena et al.,
2000). L’introduzione dei soli geni rolA e rolB non ha
causato nanismo. Queste piante transgeniche risultarono leggermente più erette dei controlli, con branche
raccorciate, con foglie di colore verde scuro e con un
più sviluppato apparato radicale. La fioritura risultò
anticipata di qualche giorno ed il numero di fiori, tutti
fertili, leggermente superiore. Quando rolA e rolB
venivano introdotti insieme a rolC, le piante divenivano completamente erette e con un elevato numero di
branche raccorciate. La fioritura era notevolmente
anticipata con un numero di fiori all’incirca doppio
rispetto al controllo e di maggiore durata. La dimensione e la fertilità dei fiori risultava ridotta. La combinazione di fenotipo cespuglioso, di pianta eretta e del
maggior numero di fiori per pianta, conferiva nell’insieme alle piante transgeniche, l’aspetto di nuove
piante ornamentali.
La rosa è la più importante specie ornamentale utilizzata sia per il fiore reciso che come pianta da giardino. In Rosa hybrida varietà Moneyway, utilizzata
come portainnesto, l’introduzione di rolABC risultava
di notevole giovamento alle talee che mostravano una
capacità di radicare di circa tre volte superiore alle
talee non trasformate (van der Salm et al., 1997). Le
piante trasformate, formavano radici avventizie alla
loro base, mostravano germogli più corti, ridotta
dominanza apicale e foglie più piccole a vari livelli e
solo un trasformante mostrava foglie raggrinzite e
arricciate. Quando una rosa non trasformata veniva
innestata su una talea trasformata con i geni rol, si
assisteva ad un aumento dei germogli laterali che si
formavano nel punto di innesto rispetto a quelli formati da portainnesti non trasformati. Questi risultati
indicavano che qualche segnale veniva trasportato dal
portainnesto alle gemme innestate (van der Salm et
al., 1998). Dal momento che lo sviluppo dei germogli
laterali è correlato con il numero finale di fiori, questi
portainnesti geneticamente modificati, presumibilmente, condurranno ad un incremento nella produzione di fiori.
Tutte le piante ornamentali trasformate con i geni
rolABC sono state ottenute tramite trasformazione
genetica mediata da A. tumefaciens contenente un vettore binario recante il frammento di restrizione EcoRI
15 dove sono ubicati gli ORFs (Open Reading
Frames) 10, 11 e 12 corrispondenti rispettivamente ai
geni rolA B C, escissi dal plasmide Ri di A. rhizoge nes ceppo pRi1855 o pRiA4 (fig. 7). In questa situazione i geni rol sono sotto il controllo del loro proprio
promotore. Le piante transgeniche rolABC in generale
Fig. 7 - Frammento di restrizione EcoRI 15 clonato nel plasmide
binario pBin19. Le freccie indicano la dimensione e l’orientamento dei geni rolABC. (Foto A. Mercuri).
Fig. 7 - Restriction fragment EcoRI 15 cloned in the binary plasmid pBin19. Arrows indicate dimension and orientation of
rolABC genes. (Photo A. Mercuri).
11
Mercuri et al.
mostrano dimensione ridotta, lunghezza diminuita
degli internodi e ridotta dominanza apicale con maggiore ramificazione laterale. Le foglie sono più piccole ed a volte raggrinzite o arricciate. La radicazione è
migliore sia nelle piante intere che nelle talee. In
generale, i fiori mostrano forma e dimensione normali
anche se a volte sono più piccoli. Il numero di fiori a
volte aumenta e la fioritura è spesso precoce. La fertilità è quasi sempre ridotta a causa della diminuita vitalità del polline. Analogamente alle piante trasformate
con A. rhizogenes, il nanismo o l’aumento del numero
di fiori in alcune specie ottenute con rolABC sono
caratteri di assoluto pregio per i breeders di piante
ornamentali.
Nonostante non si possa comparare l’effetto della
trasformazione con A. rhizogenes o con i geni rol in
specie differenti, gli effetti complessivi, indicati come
sindrome hairy root, sono ottenuti con entrambi i tipi
di trasformazione. Differenze specifiche, come la
modificazione della forma dei fiori, ottenute solo con
la trasformazione con A. rhizogenes, o il tempo di fioritura (generalmente ritardato o inibito con A. rhizoge nes; quasi sempre anticipato con i geni rol), sono probabilmente dovuti alla presenza/assenza di altri geni
del T-DNA e spesso agli effetti specie-specifici dei
geni rol.
L’introduzione separata dei singoli geni nelle piante può essere di aiuto nel discriminare i loro effetti
nella sindrome hairy-root.
Piante transgeniche con rolA
Non ci sono al momento lavori che riguardano la
trasformazione di piante ornamentali con il solo gene
rolA. Le piante in cui è stato inserito hanno mostrato
effetti contrastanti come il raccorciamento o l’allungamento degli internodi, l’aumento o la diminuzione
della dimensione del fiore e del numero dei fiori per
pianta. L’unico carattere costantemente rilevato è
stato il mancato effetto sull’apparato radicale, che
rimaneva identico al controllo o addirittura risultava
impoverito.
Piante transgeniche con rolB
L’unica specie ornamentale nella quale è stato
inserito il gene rolB è la rosa (van der Salm et al.
1996, 1997). La formazione di germogli laterali
risultò fortemente diminuita, indicando che l’induzione di dominanza apicale manifestatasi in un solo fenotipo trasformato non poteva essere strettamente correlata al gene introdotto.
In generale nelle altre specie trasformate con rolB
si osservano foglie più ampie, dominanza apicale
12
ridotta o aumentata, fiori più grandi o più piccoli con
ridotta vitalità del polline. In qualche caso è stata
osservata la comparsa di fenotipi con taglia ridotta e
con incremento dell’apparato radicale (carattere tipicamente associato a questo gene tra i geni rol), per
cui, nelle ornamentali dove questi caratteri risultano
essere di pregio, l’inserimento di rolB dovrebbe essere certamente saggiato.
Piante transgeniche con rolC
Il garofano è tra le più importanti specie mondiali
coltivate per la produzione di fiore reciso. Dianthus
caryphyllus cv White Sim trasformato con rolC sotto
il controllo del promotore virale costitutivo 35S
mostrava un fenotipo leggermente ridotto nella taglia
senza nessuna alterazione nella morfologia fogliare
(Ovadis et al., 1999; Zuker et al., 2001). L’emissione
più abbondante di germogli laterali nelle piante rolC
consentiva la produzione di talee da stelo di oltre il
doppio rispetto alle piante non trasformate (Zuker et
a l., 2001). Tali talee avevano anche una migliore
emissione di radici. Inoltre le piante rolC producevano steli fioriti in misura 3 volte superiore alle piante
di controllo ed un fenotipo (sui 18 ottenuti) mostrava
fiori più piccoli. L’eventuale riduzione di fertilità
maschile non poteva essere riscontrata dal momento
che questa varietà è maschio-sterile. Questo aspetto
non è comunque rilevante in garofano poiché tutte le
piante di garofano commerciale sono moltiplicate
vegetativamente per talea. Risulta evidente come rolC
ha migliorato alcuni caratteri in questi piante di garofano.
Come il garofano, anche il crisantemo è una tra le
più importanti specie floricole mondiali da fiore reciso. Esso è disponibile in un grande assortimento di
colori e forme e recentemente è divenuto popolare
anche come pianta da vaso. Proprio per queste ragioni
è necessario manipolare la pianta per modificarne
l’architettura e la dimensione.
L’introduzione di rolC sotto il controllo del promotore virale costitutivo 35S nella varietà White
Snowdon di Chrisantemum morifolium causò, nell’unica linea transgenica ottenuta, drastici cambiamenti
nell’architettura della pianta e del fiore (Mitiouchkina
e Dolgov, 2000). Questa linea mostrava nanismo,
internodi molto raccorciati, dominanza apicale totalmente soppressa con forte ramificazione laterale che
conferiva alla pianta un aspetto cespuglioso. Le lamine fogliari erano più strette e più chiare, il numero di
fiori notevolmente aumentato e gli stessi risultavano
più piccoli rispetto al controllo. I petali erano più
ampi e con forma mutata. Le modificazioni ottenute
Geni rol in floricoltura
dopo l’inserimento di rolC corrispondevano alla pianta da vaso ideale descritta da Mol et al., (1995), con
un denso strato di fiori coprente le parti verdi della
pianta.
Anche Osteospermum ecklonis è stata trasformata
utilizzando il gene rolC sotto il controllo del promotore virale costitutivo 35S (Giovannini et al., 1999b;
Allavena et al., 2000). Le piante trasformate risultavano ad habitus eretto come accadeva con l’introduzione
di rolABC insieme ma con foglie di colore verde più
chiaro. Le piante 35S-rolC mostravano come le piante
rolABC, ma in modo più marcato, fioritura precoce
con un numero di fiori anche 3 volte superiore al controllo e con maggiore durata. La dimensione dei fiori
era ridotta e la fertilità maschile in qualche pianta era
addirittura inibita. Gli autori suggeriscono una correlazione tra il livello di espressione (proteina r o l C
codificata dall’omonimo gene) ed il fenotipo rolC più
o meno spinto.
Salpiglossis sinuata è una pianta annuale con fiori
a tromba simili alla petunia. Le piante transgeniche
per rolC sotto il controllo del promotore nativo erano
più corte, avevano più branche e quindi un aspetto più
compatto e presentavano foglie più strette e fiori più
piccoli rispetto alle piante non trasformate. Inoltre i
fiori erano maschio-sterili (Lee et al., 1996).
La petunia è una tra le ornamentali maggiormente
utilizzate come pianta da vaso. Petunia axillaris x (P.
axillaris x P. hybrida) cv Mitchell è stata trasformata
con rolC sotto il controllo del promotore virale costitutivo 35S (Winefield et al., 1999). Le piante trasformate presentavano diminuzione della lunghezza degli
internodi, riduzione della dominanza apicale con conseguente maggiore ramificazione laterale e nel complesso un aspetto cespuglioso. La superficie fogliare
risultò ridotta nei fenotipi più spinti e aumentata negli
altri con un maggior numero di foglie. L’antesi dei
fiori, più piccoli e numerosi nei cloni transgenici, si
ebbe alcuni giorni prima dei controlli. La vitalità del
polline e la fertilità femminile risultarono fortemente
ridotte. I nuovi tratti ottenuti (aspetto compatto e fioritura anticipata) potrebbero essere sfruttati per l’ottenimento di piante nane.
Il pelargonio regale Pelargonium x domesticum è
molto popolare come pianta da giardino. La varietà
Dubonnet è stata trasformata con rolC sotto il controllo del promotore virale costitutivo 35S (Boase et al.,
2004). Le linee transgeniche mostravano riduzione
nell’altezza delle piante e nella dimensione delle
foglie. Anche l’area dei petali ed il diametro dei fiori
risultavano ridotti. Le piante trasformate esibivano
inoltre fioritura anticipata ed un numero di fiori per
pianta 2-3 volte superiore al controllo.
Rosa hybrida varietà Madame G. Delbard, è stata
trasformata con rolC sotto il controllo del promotore
nativo (Souq et al., 1996). Le piante transgeniche
erano nane, qualche volta con foglie raggrinzite e con
steli multipli emergenti dalla base dello stelo principale. In qualche caso i fiori erano uguali a quelli di controllo ma con pistillo abnorme, le spine erano più piccole e numerose e le foglie clorotiche. In altre piante i
fiori erano più piccoli rispetto al controllo, sterili e
con diverso colore. Il sistema radicale di tutte le rose
rolC era ridotto, le piante erano altamente sensibili a
insetti e malattie e dopo potatura, i nuovi steli non
erano più in grado di fiorire. Molte piante inoltre presentavano un fenomeno di essiccamento superficiale
con conseguente morte.
Come si evidenzia da quanto riportato, gli effetti
generali dovuti all’inserimento di rolC si possono
riassumere in ridotta dimensione della pianta a causa
degli internodi più corti, riduzione della dominanza
apicale con sviluppo di germogli laterali che determinano un fenotipo con crescita compatta e vigorosa. Un
risultato particolarmente interessante è quello ottenuto
in garofano dove le talee mostrano una aumentata
capacità radicativa (Zuker et al., 2001). Questo carattere di estrema importanza in quelle specie che vengono moltiplicate per talea e generalmente assegnato a
rolB è stato recentemente messo in relazione anche
c o n r o l C in due specie da frutto (Kaneyoshi e
Kobayashi 1999; Koshita et al., 2002). L’aumento del
numero di fiori osservato solo in qualche caso nelle
p i a n t e r o l A B C è frequentissimo nelle piante r o l C
anche se in qualche caso ciò potrebbe essere un effetto
indiretto dovuto all’aumentato numero di branche
laterali come suggerito da Giovannini et al., (1999a).
Inoltre, la fioritura precoce osservata in qualche pianta
rolABC e spesso presente nelle piante rolC, non è mai
stata rilevata nelle piante transgeniche rolA e rolB, per
cui, questo carattere sembra essere correlato al gene
rolC. E’ evidente che tutti i nuovi tratti conferiti nell’insieme da rolC rendono questo gene un utilissimo
strumento per l’ottenimento di piante geneticamente
migliorate e commercialmente valide. Inoltre, effetti
pleiotropici indesiderati eccetto la ridotta fertilità,
sono assenti, a patto che un certo grado di riduzione
nella dimensione della pianta sia anche uno degli
obbiettivi. Questo è anche il motivo per cui tra i geni
rol, rolC sia il gene più ampiamente utilizzato per la
trasformazione di specie ornamentali.
Piante transgeniche con rolD
rolD è l’ultimo gene studiato della famiglia rol.
Nelle specie in cui è stato inserito (carota, tabacco,
pomodoro) ha portato ad un anticipo di fioritura ed un
13
Mercuri et al.
aumento del numero di fiori ed infiorescenze. Sembra
pertanto anch’esso correlato al carattere fioritura.
Anche rolD potrebbe quindi essere usato nel miglioramento delle specie ornamentali, ma i suoi effetti nelle
varie specie necessitano di ulteriori studi e di una più
ampia caratterizzazione.
Ricadute pratiche
La trasformazione delle piante ornamentali con una
combinazione di geni r o l porta all’ottenimento di
caratteri di notevole pregio nel campo floricolo come
piante compatte e fenotipi cespugliosi. Questi nuovi
tratti permettono la creazione di nuove varietà come ad
esempio piante da vaso a partire da piante molto più
grandi, mentre l’accresciuta capacità di radicare è un
carattere utile per qualsiasi specie commerciale specialmente per molte ornamentali legnose recalcitranti
alla radicazione. I geni rol possono essere utilizzati
non soltanto per modificare la morfologia di una pianta, ma anche per influenzare il processo di fioritura.
L’aumento del numero di fiori e l’anticipo della fioritura sono tra i caratteri maggiormente ricercati in floricoltura e possono essere ottenuti tramite l’introduzione
di rolC e molto probabilmente di rolD. Inoltre anche il
cambiamento nella forma del fiore è ricercato dai breeders per produrre nuove varietà. Deve essere comunque ricordato che in qualche caso possono essere ottenuti degli effetti indesiderati come la riduzione della
fertilità. Questo fatto però non influenza le piante che
sono propagate vegetativamente in vivo e/o in vitro e,
la moltiplicazione delle piante propagate per seme, con
ad esempio sterilità maschile e non femminile, potrebbe essere comunque ottenuta impollinando le piante
transgeniche con il polline di piante non trasformate.
Appare evidente come i geni rol siano un potente
strumento per ottenere specifiche caratteristiche in
una pianta. Il gene rolC è sicuramente il più consigliabile, dal momento che molte caratteristiche di pregio
sono state ottenute nelle specie studiate e anche rolD
prospetta promettenti applicazioni. Per quanto riguarda rolA e rolB non è consigliabile la loro introduzione
nelle specie ornamentali poiché numerose anormalità
sono state ottenute nelle specie trasformate.
Prospettive
Dal 1987, quando la petunia è stata segnalata come
il primo fiore trasformato (Meyer et al., 1987), più di
30 specie ornamentali sono state trasformate con successo, compreso quelle commercialmente i più importanti come rosa, garofano e crisantemo. Però, mentre
14
alcune specie per uso alimentare e industriale e geneticamente trasformate sono state introdotte in commercio, tra le ornamentali solo i garofani con fiore
violetto-blu ottenuti e prodotti dall’Australiana
“Florigene” sono attualmente sul mercato.
Nelle colture floricole, sia la regolazione molecolare della fioritura ed i caratteri ad essa collegati, che
l’alterazione della morfologia della pianta, ottenibili
mediante l’uso dei geni rol contribuiscono al miglioramento delle piante ornamentali. Al momento, il
numero delle piante “rol-transgeniche” continua ad
aumentare e, in molti casi, risultati importanti sono
stai ottenuti. E’ necessario sottolineare però che la
conoscenza delle sequenze nucleotidiche non è stata
di aiuto, in quanto i polipeptidi dedotti non sono associabili ad alcuna proteina di cui a tutt’oggi sia nota la
sequenza per cui, ulteriori ricerche necessitano per
determinare la funzione delle proteine codificate dai
geni rol nell’interazione con altre proteine, organi e
fattori ambientali, per cercare di chiarire definitivamente tutti i differenti effetti fenotipici e biologici che
esse possono produrre nelle piante transgeniche. Di
conseguenza, l’aumentata conoscenza sulle funzioni
di questi geni sarebbe di grande beneficio per la loro
applicazione sia in floricoltura che in orticoltura
(Casanova et al., 2005).
Le biotecnologie applicate alle piante, almeno in
un futuro prossimo, non sostituiranno il breeding classico (anche se esso è empirico piuttosto che basato su
una comprensione dei processi fisiologici e molecolari) ma lo completeranno, per cui entrambi i metodi
continueranno ad essere usati (Vainstein, 2002;
Morandini e Salamini, 2003). In quest’ottica, molte
specie trasformate con i geni rol potranno risultare
utili nei programmi di breeding per ottenere piante
ornamentali con caratteri nuovi e migliorati.
Riassunto
L’espressione nelle piante dei geni rol presenti nel
plasmide Ri di Agrobacterium rhizogenes, altera alcuni dei processi di sviluppo della pianta ed influenza la
sua architettura. Le piante ornamentali nel cui genoma
sono stati inseriti questi geni mostrano il fenotipo
hairy-root con specifiche differenze tra specie e tra
linee transgeniche. In generale queste piante mostrano
un fenotipo nano, ridotta dominanza apicale, foglie
più piccole e arrotolate, aumentata capacità a radicare,
fioritura alterata e ridotta fertilità. Tra i geni rol, rolC
è il più utilizzato poichè i suoi effetti sono i più vantaggiosi in termini di miglioramento dei caratteri
agronomici ed ornamentali.
Geni rol in floricoltura
Parole chiave: Agrobacterium rhizogenes, trasformazione genetica, piante ornamentali.
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