Igiene degli Alimenti - Dr. Milena Villarini

22/03/2013
 Si limita a studiare il nesso causale tra una determinata
esposizione e l’insorgenza della malattia (tassi di incidenza,
prevalenza, mortalità) → rassegnarci ad attendere la malattia?
 I risultati ottenuti non tengono conto della interazione tra
gene/ambiente
 Spesso la stima dell’esposizione è affidata alle risposte di un
questionario (ed è quindi difficile verificarne la veridicità)
 Sono complessi e dispendiosi da condurre se l’esposizione
monitorata è di lieve entità o se la malattia non è abbastanza
frequente
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 Circa 20 anni fa è stato proposto un nuovo approccio
epidemiologico che risulta in un connubio tra il disegno
epidemiologico classico ed alcune tecniche di biologia molecolare
 Inizialmente il principale campo d’azione dell’epidemiologia
molecolare sono state le malattie neoplastiche
 Attualmente l’epidemiologia molecolare viene applicata anche
nell’ambito delle malattie infettive
 Nell’ambito delle malattie cronico-degenerative gli scopi
principali sono:
 migliorare la stima dell’esposizione
 identificare sottogruppi a più elevato rischio
 identificare marcatori intermedi nel decorso della malattia che
consentano l’evidenziazione precocemente degli effetti di una
esposizione
Esposizione
esterna
cancro
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 La parte visibile dell’iceberg è l’oggetto di studio
dell’epidemiologia tradizionale (morbosità o mortalità per
determinate malattie)
 La parte invisibile è oggetto di studio della epidemiologia
molecolare
 L’impostazione di uno studio di epidemiologia molecolare è del
tutto paragonabile a quella di uno studio di epidemiologia
tradizionale
 L’end-point che viene valutato non è più la malattia conclamata
(tassi di incidenza o prevalenza) o l’esito della malattia stessa
(tassi di mortalità), ma uno o più biomarcatori
BIOMARCATORE
indicatore che consente di rilevare un evento in un sistema biologico
(sia esso di carattere molecolare, biochimico, genetico, immunologico)
che possa influenzare o predire l’insorgenza o l’evoluzione di
una malattia
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 Per una corretta stima del rischio i biomarcatori andrebbero dosati
nel tessuto dell’organo bersaglio
 Generalmente il prelievo di tessuto dall’organo bersaglio non
risulta agevole per cui è necessario disporre di materiale
alternativo
 Il sangue rappresenta un ottimo tessuto surrogato:
 facilmente disponibile
 occupa un ruolo centrale nella diffusione di agenti esogeni ad organi e
tessuti
 Non solo il sangue viene
utilizzato come substrato per il
dosaggio di biomarcatori
 urine e feci (molti xenobiotici,
dopo metabolizzazione
vengono escreti con le urine)
 cellule delle vie aeree e della
mucosa del cavo orale
 saliva, sudore, lacrime,
espettorati
 unghie e capelli (che possono
immagazzinare metalli pesanti
nel corso del tempo)
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 Generalmente i biomarcatori vengono classificati in 3 grandi
categorie, biomarcatori di:
1.
esposizione (dose interna + dose biologica efficace)
2.
effetti biologici precoci
3.
suscettibilità genetica individuale
 Indicano la quantità reale di uno xenobiotico assorbito
dall’organismo in un determinato tempo
 Possono essere costituiti dall’agente esogeno stesso oppure da un
prodotto del suo metabolismo o, ancora, dall’attività specifica
dell’agente allo studio
 Esempi di biomarcatori di dose interna:
 concentrazione urinaria di aflatossina B1, indicatore di esposizione
alimentare a tale composto
 concentrazione urinaria di 1-idrossipirene indicatore di esposizione a
IPA
 cotinina, metabolita della nicotina del fumo di tabacco
 tioeteri urinari
 mutagenicità urinaria o fecale (Salmonella/microsomi test)
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Yoxall VR, Bishop J, Ioannides C.
Effect of black tea intake on the
excretion of mutagens in the urine of
volunteers taking a beef meal. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev. 2004
Dec;13(12):2196-202.
 Salmonella/microsomi test (Test di Ames)
 I ceppi di Salmonella sviluppati da Ames sono tutti auxotrofi per
l’istidina, in seguito ad una mutazione introdotta nell’operone che
codifica per questo aminoacido
 Il campione che si sta analizzando, se mutageno potrà determinare
una mutazione (reversione) nel gene compromesso permettendo così
al batterio di risintetizzare l'aminoacido essenziale (e quindi di
svilupparsi anche su terreni privi di istidina)
 Sono a disposizione dello sperimentatore numerosi ceppi di
S.
typhimurium auxotrofi per l’istidina in seguito a mutazione di tipo
diverso:

TA98 – mutazione frame-shift

TA100 – sostituzione di una coppia di basi
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 Oltre a questa mutazione, per aumentare la sensibilità ai mutageni nei
ceppi di S. typhimurium usati, sono state introdotte altre tre mutazioni:

rfa, interessa il lipopolisaccaride della parete cellulare, e conferisce ai batteri
una maggiore permeabilità verso numerose sostanze esogene

UVrB, riguarda i sistemi di riparazione per escissione del DNA che
intervengono in fase pre-replicativa. Bloccando questi ultimi, i ceppi batterici
presentano una maggiore frequenza di inducibilità di mutazione

introduzione nella cellula batterica di un particolare plasmide, il pkM101, che
contiene, oltre alla resistenza per l’ampicillina, dei geni codificanti per sistemi
di riparo del DNA error-prone (tipo il sistema SOS) in fase post-replicativa.
Questo sistema di riparo, che sembra venga attivato solo dopo saturazione
degli enzimi “privi di errore”, non è accurato e le polimerasi riparatrici
producono sequenze aberranti di DNA, con il risultato di dare origine a nuove
mutazioni
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 Il test così condotto il test
non permette di evidenziare
i procancerogeni in quanto,
per esercitare la loro attività
oncogena queste sostanze
necessitano dell'attivazione
metabolica che avviene
nel fegato di
organismi superiori
 Per sopperire a questa lacuna, il test di Ames è stato modificato,
introducendo nel medium di coltura delle salmonelle "reporter"
un estratto di enzimi microsomali epatici, responsabili
dell'attivazione di molti procancenrogeni
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 Misurano la quantità di composto esogeno assorbito o dei suoi
metaboliti che hanno interagito con macromolecole critiche nel
processo cancerogenetico (DNA) o con molecole surrogato (come
l’albumina o l’emoglobina) causando alterazioni reversibili
 Tra i marcatori di dose biologica efficace maggiormente utilizzati vi
sono
 addotti al DNA
 addotti alle proteine
 danno al DNA
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 La parola addotto deriva dalla traduzione dell’inglese di “adduct”,
acronimo di addiction product = prodotto di addizione covalente
 La reazione di molecole cancerogene con il DNA può portare alla
formazione di un legame covalente tra il composto genotossico
elettrofilo ed i siti nucleofili del DNA
• Molti studi hanno confermato che la
formazione di addotti al DNA è un
evento necessario, ma non sufficiente
per lo sviluppo di tumori da
cancerogeni chimici
 Studi condotti su modelli animali hanno dimostrato che molti
cancerogeni chimici formano indifferentemente addotti sia con il
DNA che con le proteine plasmatiche
 Gli addotti alle proteine presentano un emivita decisamente più
lunga:
 non vengono rimossi dall’azione di enzimi di riparo
 emivita dell’emoglobina è di 4 mesi, per cui studiando gli addotti a
tale molecola è possibile valutare esposizioni cumulative che si siano
verificate nell’arco di questo tempo
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 Danno al DNA: Test della cometa
 Biomarcatore aspecifico ma estremamente sensibile
 Viene valutato utilizzando il test della cometa condotto in condizioni
alcaline su linfociti di sangue periferico
 Principali lesioni evidenziabili con il test della cometa:

Single-Strand Breaks (SSB)

Double -Strand Breaks (DSB)

Siti Alcali-Labili (SAL)

Pirimidine ossidate (EndoIII)

Purine ossidate (FPG)
Cellula inclusa nel
gel di agarosio
Membrana cellulare
Ci t opl a s ma
Membrana nucleare
Nucleo
Strato protettivo di
gel LMA 0,7%
A)
Measur e
Strato di gel LMA 0,7%
con incluse le cellule
Edit
Fr ozen
Live
Vetrino da microscopio
pretrattato con NMA 1%
B)
Delete
Head Le ngth 21 .97
Tail % intensity 1 8.53
Tail Moment 3.16
Lisi della membrana
cellulare e nucleare
C)
Idrolisi alcalina
delle proteine e
dell’RNA;
“denaturazione”
del DNA
D)
_
+
Migrazione
elettroforetica dei
frammenti di DNA
nelle maglie del gel
1 cell score d
Tail Leng th 47.60
Total Are a 63 9.3 6
To tal Intensity 4 7647 7.11
x50 (Olio immersion e)
He ad % intensity 8 1.47
Me an Grey Level 6 9.98
Ima ge is frozen
Tail Lenght (TL): lunghezza della coda (µm), misurata dal
centro della testa
Tail Intensity (TI): percentuale di fluorescenza (e quindi di
DNA) migrata nella coda della cometa
Tail Moment (TM): calcolato attraverso un algoritmo che
tiene conto sia della fluorescenza che della lunghezza della coda
della cometa
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 Varie situazioni che possono alterare i livelli di danno al DNA
rilevati dal test della cometa:
 sesso
 età anagrafica dei soggetti allo studio
 dieta
 attività fisica
 eventuali infezioni in atto
 esposizione ad inquinanti ambientali
 espressione di alcuni geni polimorfici
 Particolari attenzioni vanno riservate anche per quanto riguarda le
modalità di raccolta e trasporto dei campioni
 Rappresentano alterazioni irreversibili, funzionali o strutturali, a
carico del genoma
 Vengono distinti in:
 biomarcatori citogenetici
 alterazioni in “reporter genes”
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 L'analisi citogenetica consiste nello studio del numero e della
struttura dei cromosomi (cariotipo) presenti nelle cellule
dell'organismo umano
 I biomarcatori citogenetici
possono essere rilevati con:
 analisi in metafase
 aberrazioni cromosomiche
 analisi in interfase
 frequenza della
formazione
di micronuclei
 Storicamente le AC sono state il
primo indicatore di questa classe
ad essere utilizzato per
monitorare esposizioni a supposti
cancerogeni (uno dei primi studi è
stato condotto sopravvissuti al
bombardamento di Hiroshima e
Nagasaki)
 AC stabili o instabili in relazione
alla capacità di persistere o meno
nella progenie cellulare
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 Risultano dalla rottura di interi
cromosomi e dal successivo
riarrangiamento di questi in
forme abnormi
 Test del micronucleo
 I MN si formano, durante l’anafase della mitosi, dalla condensazione di
frammenti di cromosomi acentrici o da cromosomi interi che non
vengono incorporati nei nuclei principali delle cellule figlie
 Si ritrovano nelle cellule in interfase come corpuscoli
intracitoplasmatici liberi
 I MN possono generarsi attraverso vari meccanismi, riconducibili
essenzialmente:

all’azione di agenti clastogeni, che causano rotture cromosomiche dirette

a disfunzioni del fuso mitotico,
che possono essere generate da
agenti aneuploidizzanti

alla combinazione di entrambi i
meccanismi
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 Criteri di selezione per le cellule da analizzare con il test del
micronucleo
 le cellule devono essere binucleate
 i due nuclei devono essere all'incirca delle stesse dimensioni, della
stessa intensità di colorazione e avere la membrana intatta
 il bordo del citoplasma (o membrana della cellula binucleata) deve
essere intatto e chiaramente distinto dal bordo citoplasmatico della
cellula adiacente
 il diametro dei MN nei linfociti umani generalmente varia tra 1/16 a
1/3 del diametro medio dei nuclei principali
 i MN hanno generalmente un'intensità di colore simile ai nuclei
principali, ma occasionalmente la colorazione può essere più intensa
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 Variante del test del MN: ibridazione in situ fluorescente (FISH)
 il principio su cui si basa l'ibridazione in situ è quello per cui una
qualunque sequenza di DNA è capace di legarsi alla sua sequenza
complementare in un DNA denaturato.
 se la sequenza “probe” viene opportunamente marcata renderà
evidenziabile la sequenza complementare
 la FISH con sonde marcate con fluorocromi per le sequenze
centromeriche comuni a tutti i cromosomi umani (sonde
pancentromeriche), applicata al test del micronucleo, consente di
valutare se i micronuclei contengono interi cromosomi oppure
frammenti acentrici, e dunque permette di rilevare l'eventuale
prevalenza di eventi di tipo clastogeno (micronuclei centromeronegativi) o aneuploidogeno (micronuclei centromero-positivi)
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http://cancerres.aacrjournals.org/cgi/reprint/58/18/4117
http://carcin.oxfordjournals.org/cgi/reprint/28/3/625
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 Mutazioni in geni correlati all’insorgenza di tumori
 mutazioni poco diffuse nella popolazione (frequenza <1%)
 altamente correlati all’evento clinico (penetranza elevata)
 geni deputati al controllo del differenziamento e del ciclo cellulare
 Polimorfismi metabolici
 mutazioni molto diffuse nella popolazione (frequenza 1-50%)
 scarsamente correlati all’evento clinico (penetranza bassa)
 geni che codificano per la produzione di enzimi del metabolismo delle
sostanze cancerogene
popolazione
polimorfica
popolazione
normale
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 Codificano per proteine coinvolte nella regolazione e
nell’induzione del ciclo cellulare, quali:
 fattori di crescita (FGF3, FGF4)
 fattori di trascrizione (JUN, FOS, MYC)
 protein chinasi (ABL-1, FES, RET)
 recettori di membrana per fattori di crescita (ERBB2, CSF1R)
 proteine deputate alla trasduzione del segnale (BRAF)
 I proto-oncogeni possono essere attivati ad oncogeni in seguito a
mutazioni puntiformi, riarrangiamenti cromosomici ed inserzione
virale
 In seguito alla loro attivazione si può avere:
 overproduzione di fattori di crescita
 incremento dei segnali di divisione cellulare
 Mutazioni nella sequenza nucleotidica di questi geni risultano in
una attivazione enzimatica che mantiene la cellula in un perenne
stato proliferativo ed in una inibizione della apoptosi
 Presentano un fenotipo dominante: basta che sia attivata una sola
copia dell’oncogene per produrre effetti cancerogenetici
 Sono necessarie più di una mutazione a carico dello stesso gene
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 Geni (APC, BRCA1, BRCA2, MEN1, NF1, RB1, TP53) altamente
conservati
 Codificano per proteine di membrana, citoplasmatiche, nucleari
che inibiscono la crescita e la divisione cellulare
 Mutazioni in geni oncosoppressori presentano a livello cellulare un
fenotipo recessivo: per avere il fenotipo tumorale devono essere
mutate entrambe le copie del gene
 Il gene TP53 codifica per la proteina p53 che svolge un ruolo
centrale nella inibizione della crescita di cellule con danni al DNA,
per cui la perdita di tale attività a seguito di mutazioni nel gene
TP53 causa la promozione della proliferazione di cellule con
genoma alterato
Le donne portatrici di una mutazione dei geni BRCA1 e BRCA-2 presentano il 50% di possibilità di
trasmettere la mutazione stessa alla prole
Il test per la ricerca delle mutazioni di BRCA-1 e
BRCA-2 viene eseguito sul DNA dei linfociti
Il risultato viene ottenuto nell’arco di quattro-sei
settimane
Il costo si aggira intorno ai 2500 dollari per il primo
componente della famiglia, intorno ai 300 dollari per
gli altri componenti, una volta evidenziata la
mutazione
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 Molti geni che codificano per
gli enzimi coinvolti nel
metabolismo degli xenobiotici
o per gli enzimi deputati alla
riparazione del DNA sono
polimorfici
 Esistono nella popolazione in
diverse forme alleliche dello
stesso gene
 A varianti alleliche
corrispondono attività
enzimatiche diverse
Metabolita
attivato
Fase I
funzionalizzazione
Sostanza
Fase II
coniugazione
esogena
Fase II
coniugazione
Derivato
idrosolubile
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Enzimi di Fase I
 In generale portano all'introduzione di gruppi funzionali, che
forniscono i siti per Ia coniugazione con unità fortemente polari,
catalizzata dagli enzimi di fase II
 Si tratta per la maggior parte di reazioni di ossidazione, catalizzate
da diverse classi di enzimi:
 monoossigenasi citocromo P450-dipendenti (CYP)
 monoossigenasi flavina-adenina-dinucleotide dipendenti (FMO)
 monoamminoossidasi (MAO)
 cicloossigenasi (COX)
Enzimi di Fase II
 Le reazioni di fase II comportano in generale un aumento
dell'idrofilicità degli xenobiotici e l'inattivazione delle loro
proprietà biologiche, anche se non sempre
 Le principali reazioni sono le reazioni di coniugazione o di sintesi
in cui intervengono:
 le glutatione-S-trasferasi (GST)
 le N-acetiltrasferasi (NAT)
 le UDP-glucuronosiltrasferasi (UGT)
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 Dal sequenziamento del DNA del genoma umano è risultato che
sono più di 115 i gene coinvolti nella sintesi di proteine addette ai
sistemi di riparazione del DNA, alcuni polimorfismi nelle proteine
codificate sono stati individuati ma, probabilmente molti altri
sono ancora sconosciuti

Sono ancora poche le indagini di epidemiologia molecolare che
hanno incluso nel proprio protocollo sperimentale lo studio di un
polimorfismo nei geni codificanti per i sistemi di riparo, tra questi, è
stato messo in evidenza che una variante allelica al gene XRCC1, che
codifica per una proteina deputata al riparo (base excision repair) di
danni al DNA indotti da radiazioni è associata con un incremento di
biomarcatori di effetto biologico precoce in soggetti fumatori
 Polimorfismi metabolici:
 combinazioni favorevoli / sfavorevoli
Esempio:
- Iperattivatore
- Lento eliminatore
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 Lo studio dei loci genetici codificanti può essere realizzato
applicando tecniche di PCR su qualsiasi tessuto biologico senza
esporre il soggetto ad alcuna indagine invasiva
 Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio Nobel 1993)
 Serve per ottenere una grande quantità di una specifica sequenza di
DNA in vitro
 Può amplificare un tratto di DNA per più di 1 milione di volte
 Non è una tecnica quantitativa
PCR
Parte di DNA con
possibile polimorfismo
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 Alla amplificazione può
seguire il trattamento con
enzimi di restrizione
 I prodotti di amplificazione vengono evidenziati attraverso
elettroforesi su gel di agarosio o di acrilammide e successiva
colorazione
268bp (-globina)
300bp
200bp
215bp (GSTM1)
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 Nuove tecniche di biologia molecolare
offrono la possibilità di sviluppare una nuova
serie di biomarcatori per valutare il rischio
genotossico
 Particolarmente attraenti sono tecniche come
il cDNA microarray (insieme di sequenze di
DNA a elica singola immobilizzate su una
superificie solida) per lo studio dei profili di
espressione genica

tale analisi consente di quantificare contemporaneamente
centinaia o migliaia di mRNA presenti in un determinato
campione mediante un unico esperimento
GENOMA

Trascrizione
mRNA

GENOMICA
TRANSCRIPTOMICA
Tradotto
PEPTIDE

“Splicing”
PROTEINA

PROTEOMICA
Struttura/Attività
FENOTIPO
METABOLOMICA
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 Procedimento:
 si estrae l’RNA da un campione test che vogliamo esaminare
 si retrotrascrive l’mRNA in cDNA marcandolo con composti
fluorescenti
 si procede allo stesso modo con un campione di riferimento
marcandolo con un fluorocromo differente
 i due campioni vengono posizionati sul microarray
 si lasciano ibridare con le sonde
 si verifica il profilo dell’espressione genica del test rispetto al controllo
Microarray
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 I metodi classici per la ricerca di microrganismi richiedono
l’isolamento di colture pure seguito da test che analizzano alcune
caratteristiche fenotipiche, quali i caratteri biochimici e
morfologici
 I metodi classici presentano a volte alcuni inconvenienti:
 possono necessitare di complesse manipolazioni nella preparazione
del campione
 possono richiedere grandi quantità di campione
 possono richiedere di tempi lunghi per ottenere una risposta
 evidenziano solo quella frazione dei microrganismi che sono in grado
di svilupparsi sui comuni terreni di coltura utilizzati
 Si stanno mettendo a punto numerosi metodi molecolari in grado
di:
 ridurre i tempi di analisi
 semplificare l’iter diagnostico
 rendere più sicura l’identificazione
 stabile con certezza l’appartenenza o meno di ceppi diversi allo stesso
clone
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 In generale i metodi prevedono:
 l’estrazione del DNA dai campioni in studio
 la digestione del DNA con 1 o più enzimi di restrizione, che generano
centinaia di frammenti (il numero è in relazione all’enzima di
restrizione utilizzato che può essere a “taglio frequente” o a “taglio
non frequente”)
 la separazione dei frammenti attraverso elettroforesi
 Poiché ceppi dello stesso clone contengono sequenze di DNA
praticamente identiche, ugualmente identici saranno i siti di
restrizione, e alla elettroforesi forniranno profili di migrazione
sovrapponibili
 Le varie tecniche generano un
fingerprinting molecolare che
assume le sembianze di un codice a
barre, il numero delle quali
dipende dal tipo di tecnica
utilizzata
 L'identificazione di un isolato
batterico ignoto avviene mediante
confronto con il codice a barre
ottenuto con uno o più ceppi tipo
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 Premessa
 Molti studi di epidemiologia classica hanno indicato che una larga
percentuale di neoplasie sia il risultato della interazione di diversi
fattori di rischio ambientali
 Un comportamento alimentare corretto (consumo di frutta fresca e
verdure) potrebbe ridurre il rischio genotossico

Alti livelli di addotti al DNA potrebbe essere predittivi di un maggiore
rischio di sviluppo di una neoplasia
 Polimorfismi sfavorevoli potrebbero aumentare il rischio
Metodi dello studio
 Soggetti
 330 soggetti randomizzati tra i reclutati in Italia dallo studio EPIC
(European Prospective Investigation on Cancer and Nutrition)
 stratificati per età, sesso ed area geografica di provenienza (Nord,
Centro e Sud Italia)
 Questionario per abitudini alimentari e stile di vita
 Consenso informato
 Prelievo ematico
 addotti al DNA
 polimorfismi a GSTM1,GSTT1, CYP1A1 MspI,
NAT2 e MTHFR
 dosaggio plasmatico di micronutrienti
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Conclusioni
 Il danno al DNA può essere modulato sia da fattori genetici che
ambientali e nutrizionali
 Micronutrienti ad attività antiossidante sono associati ad una
ridotta frequenza di addotti al DNA
 Successivi studi sono necessari per verificare gli effetti degli
antiossidanti sul danno al DNA in associazione a polimorfismi
genetici
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